Изучение механизмов резистентности клеток меланомы человека к противоопухолевой терапии

Кондрашева, Ирина Григорьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение механизмов резистентности клеток меланомы человека к противоопухолевой терапии
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов резистентности клеток меланомы человека к противоопухолевой терапии"

На правах рукописи

Кондрашева Ирина Григорьевна

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ РЕЗИСТЕНТНОСТИ КЛЕТОК МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА К ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

? с ~ Г.~,3

Москва-2008

003454112

Диссертация выполнена в Государственном учреждении здравоохранения г. Москвы "Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии" Департамента здравоохранения г. Москвы

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Москалева Елизавета Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Белушкина Наталья Николаевна

доктор биологических наук, Берман Альберт Ефимович

Ведущая организация

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита состоится "11" декабря 2008 г. в/^-^часов на заседании Диссертационного совета Д 001.010.01. при ГУ НИИ БМХ РАМН по адресу: 119121, Москва, ул. Погодинская, д.10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ БМХ РАМН.

Автореферат разослан" ^ " 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук "ЪаЛ Е.А. Карпова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Меланома - чрезвычайно злокачественная опухоль, развивающаяся из меланоцитов и характеризующаяся высокой природной устойчивостью к противоопухолевым препаратам, биохимические механизмы которой не известны (Serrone L. et al., 1999; Helmbach H. et al., 2003).

Действие большей части противоопухолевых препаратов приводит к индукции апоптоза в опухолевых клетках в результате повреждения молекулы ДНК или других внутриклеточных мишеней (Zhivotovsky В. et al., 2003). Кроме того, важную роль при действии и химиотерапевтических средств и опухолеспецифических цитотоксических лимфоцитов (ЦГЛ) играет Fas-зависимый путь индукции апоптоза (Friesen С. et al., 1999, Classen С. et al., 1999). В тоже время существуют метаболические системы, препятствующие повреждению клеток. Это процессы, формирующие уровень внутриклеточных антиоксидантов; системы репарации ДНК; генетические особенности, приводящие к блокированию индукции и ингибированию процессов апоптоза; белки теплового шока, в частности Hsp70, и АТФ-зависимые транспортеры, обеспечивающие выброс токсических веществ из клеток, и тем самым препятствующие образованию их эффективных концентраций. В клетках меланомы обнаружены гены АВС-транспортеров (ABC - ATP-binding cassette) АВСВ1 (MDR1), ABCB5, ABCC1 (MRP1) и ABCG2 (BCRP), кодирующие белки, которые осуществляют АТФ-зависимый транспорт как гидрофобных, так и некоторых гидрофильных соединений из клеток в среду (Gottesman М.М. et.al., 2002; Choi С.Н., 2005; Frank N.Y. et.al., 2005; Monzani E. et.al., 2007). Вариабельность активности каждой из названных систем может приводить к формированию различных механизмов резистентности клеток меланомы к противоопухолевой терапии.

В связи с этим пелью работы явилось исследование биохимических механизмов устойчивости клеток меланомы человека различных линий к действию противоопухолевых препаратов и новых подходов к ее снижению.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

- изучение чувствительности клеток меланомы человека различных линий к противоопухолевым препаратам с разным механизмом действия и к новому препарату N1 ,Ы6-бис[2,2,6,6-тетракис(трифторметил)-3,6-дигидро-2Н-1,3,5-оксадиазин-4-ил]-1,6-гександиамину (БТОГ);

- изучение содержания белка MDR1 на мембране клеток разных линий меланомы человека и его связи с устойчивостью клеток к противоопухолевым препаратам;

- исследование накопления Rho-123 клетками меланомы и скорости его выхода для оценки функциональной активности АВС-транспортеров;

- изучение содержания белка Hsp70 в клетках меланомы человека как фактора устойчивости к противоопухолевым препаратам;

- анализ содержания белков Fas и FasL в клетках меланомы человека различных линий и их связи с чувствительностью клеток меланомы к действию противоопухолевых препаратов и ЦТЛ;

- исследование влияния рекомбинантного белка MIS человека (rhMIS) на выживаемость клеток меланомы человека и их чувствительность к дакарбазину.

Научная новизна работы. Впервые показано, что новый препарат БТОГ обладает высокой противомеланомной активностью, которая не зависит от содержания белка MDR1 в опухолевых клетках.

Впервые обнаружено, что в клетках меланомы человека с фенотипом МПЖГпроисходит быстрое выведение Rho-123, чувствительное к верапамилу.

Впервые показано, что верапамил повышает чувствительность клеток меланомы человека с фенотипом MDR1' к действию доксорубицина, дакарбазина и препарата БТОГ.

Впервые показано, что все линии меланомы человека содержат значительную фракцию клеток, не включающих Rho-123, размер которой не зависит от действия вераламила (за исключением линии MDR1+) и возрастает

при действии противоопухолевых препаратов.

Впервые показано, что обнаруженный в клетках меланомы человека высокий уровень содержания белка 1Ьр70 коррелирует с их устойчивостью к противоопухолевым препаратам.

Впервые показано, что гЬМ18 сенсибилизирует клетки меланомы человека к действию дакарбазина, а повторная обработка клеток белком гЫуПБ приводит к усилению его антипролиферативного и сенсибилизирующего действия.

Практическая значимость исследования. Обнаруженная высокая противомеланомная МОШ-независимая активность нового препарата бис[2,2,6,6-тетракис-(три-фторметил)-3,6-дигидро-2Н-1,3,5-оксадиазин-4-ил]-1,6-гександиамина (БТОГ) позволяет рекомендовать этот препарат для проведения доклинических испытаний на животных.

Выявленное повышение чувствительности клеток меланомы человека к дакарбазину в присутствии верапамила может быть использовано в клинической практике при лечении меланомы.

Обнаруженное снижение выживаемости клеток меланомы человека в присутствии белка гЬШБ, и его способность сенсибилизировать клетки меланомы к действию дакарбазина, позволяют рекомендовать этот белок для клинических исследований.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на Всероссийском форуме с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге " (2004 г, Санкт-Петербург), П Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (2004 г, Москва), XIV Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (2007 г., Москва), XI Российском Онкологическом конгрессе с международным участием (2007 г., Москва), Российской конференции по меланоме совместно со Всемирной рабочей группой по меланоме и Европейской школой онкологии (2008 г., Москва).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ: 4 статьи, из них 3 опубликованы в журналах, состоящих в перечне ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК и 6

публикаций представленных материалами конференций. Структура диссертации. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы и список цитированной литературы, включающий 189 источников. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 16 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Культивирование клеток мсланомы человека. Клетки перевиваемых линий меланомы человека Вго-В19 и MS культивировали в среде DMEM, а Mel-3 - Mel-Ю - в полной культуральной среде, состоящей из смеси сред RPMI-1640 и DMEM в соотношении 1:1, содержащей 10% сыворотки плодов крупного рогатого скота (СПК) и 50 мкг/мл гентамицина в пластиковых культуральных флаконах в С02-инкубаторе при +37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% С02.

2. Определение цитотоксической активности различных препаратов in vitro. Выживаемость клеток после инкубации с исследуемыми соединениями в различных концентрациях в течение 72 часов в 96-луночных планшетах определяли с помощью МТТ-теста по методу Mossman (1983). Для этого за 3 часа до окончания инкубации в каждую лунку добавляли раствор МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил-тетрозолий бромид). Затем среду удаляли, кристаллы формазана растворяли в ДМСО и измеряли интенсивность окраски. Выживаемость клеток оценивали в процентах от соответствующего контроля и по кривым выживаемости рассчитывали IC50 - концентрацию препарата, при которой наблюдается гибель 50% клеток.

3. Исследование содержания белка MDR1 на мембране клеток проводили с использованием моноклональных антител (МкАт) к белку MDR1, меченных фикоэритрином (клон UIC2), в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Анализировали интенсивность флуоресценции с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL и определяли значение средней интенсивности флуоресценции (MFI).

4. Исследование накопления флуоресцентного красителя Rho-123 клетками меланомы человека и скорости его выхода из клеток. К

суспензии клеток в бессывороточной среде добавляли Rho-123 (0,1 мкг/мл), и инкубировали их 60 мин при +37°С. Для исключения погибших клеток, в пробу добавляли раствор йодистого пропидия (2 мкг/мл) непосредственно перед цитофлуориметрией. Флуоресценцию клеток измеряли с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL в красной и зеленой области спектра при длине волны возбуждения 488 нм и полосой пропускания для зеленой области спектра - 525 нм (FL1), а для красной — 620 нм (FL3). Анализировали 50 ООО тыс. клеток.

5. Внутриклеточное окрашивание клеток МкАт к Hsp70. Клетки меланомы промывали ФСБ с 1% БСА и 0,1% NaN3 и фиксировали в 2% параформальдегиде. Клетки пермеабилизировали в течение 5 минут при комнатной температуре в буфере для пермеабилизации (отмывочный буфер, содержащий 0,5% сапонина и 1% инактивированной сыворотки человека). Пробы инкубировали с ФИТЦ-меченными МкАт к Hsp70 клон ЗАЗ ("НуTest", Финляндия) в течение 1 часа при +4°С, отмывали, фиксировали 2% параформальдегидом и измеряли их флуоресценцию на цитофлуориметре EPICS-XL ("Coulter Electronics", США).

6. Иммуноблотинг проводили по стандартному протоколу Towbin et al. (1979). После фракционирования лизатов клеток с помощью Ds-Na-ПААГ-электрофореза по Laemmli, переносили белки на мембрану с использованием установки для электропереноса (Hoefer ТЕ 70 series, "Amersham Pharmacia Biotech"). Мембрану инкубировали с первичными МкАт к Hsp70 (клон ЗАЗ) и к р-акткну, после чего проводили инкубацию со вторичньми антителами, меченными пероксидазой хрена. Иммунные комплексы на мембране проявляли, используя субстрат, содержащий 3,3-диаминобензидин, хлорнафтол и НгО>

7. Исследование содержания белков Fas и FasL в опухолевых клетках

проводили с помощью иммуноцитохимического метода при окрашивании клеток, фиксированных на стеклах 4% параформальдегидом, с

использованием непрямого стрептавидин-биотин-пероксидазного метода. Использовали антитела к Fas клон UT2 ("Сорбент") и к FasL клон G247-4 ("Pharmingen") при визуализации специфического связывания с помощью световой микроскопии и цифровой камеры DXM 1200 ("NIKON").

8. Приготовление лимфоцитов и дендритных клеток (ДК). Лимфоциты выделяли из фракции мононуклеарных лейкоцитов периферической крови после отделения моноцитов с помощью адгезии. ДК получали из моноцитов с использованием цитокинов ГМ-КСФ и ИЛ-4, нагружали лизатом опухолевых клеток и индуцировали созревание ДК, добавляя "Лейкинферон" и ФНОальфа. Опухолевые клетки лизировали при замораживании-оттаивании суспензии клеток в фосфатно-солевом буфере (ФСБ).

9. Индукция меланомаспецифических ЦТЛ с помощью ДК. Для индукции ЦТЛ 2х10б лимфоцитов и 100x105 ДК, обработанных опухолевыми антигенами, инкубировали в питательной среде IMDM с 10% СПК в 24-луночных платах. На следующий день и дважды в неделю в последующем к культурам добавляли 30 ед/мл ИЛ-2. Раз в неделю культуры рестимулировали нагруженными лизатом ДК. После двух рестимуляций лимфоциты использовали для анализа цитотоксической активности (ЦТА).

10. Определение ЦТА лимфоцитов человека. К опухолевым клеткам-мишеням в 96-луночном планшете добавляли суспензию лимфоцитов в соотношении клетки-мишени:клетки-эффекторы, равном от 1:1 до 1:40. Через 72 ч инкубации лимфоциты отмывали, опухолевые клетки окрашивали МТТ по методу Mossman (1983) и измеряли количество выживших клеток. ЦТА лимфоцитов расчитывали по формуле: ЦТА = [Амишень - Ам„шень+ЭффС1сгор]: АМИШе„ьх100%, где А^вшень+эффектор) и А(миш(:нь) - оптическая плотность проб, где инкубировались опухолевые клетки-мишени с клетками-эффекторами и только клетки-мишени, соответственно.

11. Исследование связывания rhMIS с поверхностной мембраной клеток проводили с использованием rhMIS-ФИТЦ при его инкубации с клетками при +4°С в течение 1 часа. После отмывания клетки фиксировали 2% параформальдегидом. Выявление MIS-связывающего белка внутри клеток

проводили, как описано в п. 8 при внутриклеточном окрашивании МкАт к Hsp70. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью проточного цитофлуориметра EPICS-XL.

12. Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов по методу Стьюдента и корреляционный анализ проводили с использованием компьютерной программы "Origin".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ. 1. Исследование чувствительности клеток меланомы человека к противоопухолевым препаратам с различным механизмом действия и -тетракис- (трифторметил)-3,6-дигидро-2Н-1,3,5-оксади-азин-4-ил]-1,6-гександиамину (БТОГ).

Исследование проведено при использовании двух известных перевиваемых линий меланомы человека из международных коллекций - MS и Вго-В19 и восьми новых линий, полученных из фрагментов опухолей. Значения IC50 дакарбазина, паклитакселя, доксорубицина и БТОГ определяли в параллельных экспериментах (табл.1). Непролиферирующие (нестимули-рованные) лимфоциты человека были достаточно устойчивы к исследованным препаратам, но среди меланом 1 из 10 линий была более устойчива к дакарбазину, чем лимфоциты (Mel-7), 1 из 10 - к доксорубицину (Ме1-8) и 1 из 10 к паклитакселю (Ме1-7). При сравнении меланом с пролиферирующими лимфоцитами обнаружено, что из 10 линий 5 были более устойчивы, чем лимфоциты к дакарбазину, 8 - к доксорубицину и 5 к паклитакселю. Таким образом, клетки меланомы человека различных линий устойчивы к действию противоопухолевых препаратов по сравнению с пролиферирующими и даже покоящимися нормальными клетками человека и чувствительность отдельных линий значительно варьирует.

При исследовании нового препарата БТОГ обнаружено, что 2 из 10 линий меланом более устойчивы к этому препарату, чем покоящиеся лимфоциты и 4 из 10 линий меланом более устойчивы, чем стимулированные конканавалином А лимфоциты. Препарат БТОГ, так же как и дакарбазин, в отличие от доксорубицина и паклитакселя, был высоко активен как

Таблица 1. Чувствительность клеток различных линий меланомы и лимфоцитов человека к противоопухолевым препаратам с разным механизмом действия.

Линия клеток Дакарбазкн Доксорубицин I Паклитаксель БТОГ

IC50, мМ IC50, мкМ

Вго-В19 0Д4±0,08 0,08±0,01 0,04±0,02 0,38±0,04

MS 0Д2±0,01 0,08±0,02 0,05±0,01 0,50±0,04

Mel-3 2,07±0Д9 0,13±0,01 0,3±0,12 0,76±0,08

Mel-4 0,12±0,02 0,63±0Д5 3,64±0,09 0,51±030

Mel-5 0,15±0,05 0,15±0,07 5,65±0,35 0,70±0,15

MeI-6 2,30±0,15 0,14±0,03 56,30±0,41 1,28±0,27

Mel-7 5,90±0,24 0,64±0,08 >150 3,64±0,10

MeI-8 0,Ш0,07 4,53±0,30 2,76±0,02 0,67±0,08

Mel-9 2г30±0Д8 2,80±0,25 0,17±0,01 4,25±0Г32

Mel-10 U7±0,45 039±0,01 0,05±0,01 1,40±0,15

Нестимулирован-пые лимфоциты 3,47±0,32 2,90±0,28 >100 1,82±0,14

Стимулированные КонА лимфоциты 0,32*0,03 0,10±0,01 1,58±0,21 0,68±0,05

Доксорубицин Паклитаксель

Рис.1. Чувствительность клеток исходной (1) и резистентной Ш)Ш+ (2) линии хронической миелогенной лейкемии человека К562 к противоопухолевым препаратам.

в отношении исходных клеток линии К562, так и в отношении резистентных клеток K562Adr с высоким уровнем белка MDR1 (рис.1).

Таким образом, препарат БТОГ обладает высокой противомеланомной активностью и обращает множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток, обусловленную MDR1.

2. Исследование содержания белка MDR1 в клетках разных линий меланомы человека и его связь с устойчивостью клеток к противоопухолевым препаратам.

Данные, полученные при исследовании содержания белка MDR1 на

поверхностной мембране клеток, позволили разделить изученные линии на

две группы: с фенотипом MDR1" и MDR1+. Группу MDR1" составили клетки

6 из 10 линий, в которых присутствовало от 0,2 до 3,3% MDR1+ клеток с

очень низким содержанием этого белка. Группу MDR1+ составили 4 из 10

линий клеток, в которых доля MDR1+ клеток составляла от 17,8 до 72,5% с

высоким содержанием белка MDR1. Значение MFI для клеток этих линий

меланомы составляло от 2,3 до 9,0 усл. ед. Результаты исследования

чувствительности линий меланом человека с фенотипом MDR1" и MDR1+ к

различным противоопухолевым препаратам представлены в таблице 2.

Таблица 2. Чувствительность MDR1* и MDR1+ линий меланом человека к различным противоопухолевым препаратам.

Название препарата IC50, мкМ

MDR1" MDR1+

Bro-B19, MS, Ме1-5 - 7, -10 MeI-3, -4, -8, -9

Дакарбазип 1460±950 1150±600

Доксорубицин 0,24±0,09 2,б5±1,01*

БТОГ 1,32±0,49 1,54±0,90

*р<0,005

Полученные результаты свидетельствуют о том, что цитотоксическое действие дакарбазина и препарата БТОГ не зависит от присутствия \1DR1 на клеточной мембране меланом. По данным табл.1 можно заключить, что MDR1+ линии меланом были более устойчивы и к паклитакселю, но чувствительность отдельных линий клеток к паклитакселю сильно

варьировала, что не позволило использовать средние значения IC50 для сравнения чувствительности MDR1" и MDR1+ линий.

Присутствие даже небольшой доли МОЯГ-клеток среди клеток меланом отдельных линий свидетельствует о том, что при химиотерапии препаратами аналогичными доксорубицину существует высокая вероятность быстрого развития множественной лекарственной устойчивости меланом и что природная устойчивость клеток меланом различных линий к химиотерапевтическим препаратам обусловлена иными механизмами, не связанными с функционированием белка MDR1.

3. Исследование накопления родамина-123 и скорости его выхода из клеток меланом человека с фенотипом MDR1* и MDR1+.

Накопление Rho-123 клетками меланом разных линий и скорости его выхода для оценки функциональной активности белков-транспортеров исследовали с использованием проточной цитофлуориметрии. Для регистрации накопления Rho-123 флуоресценцию измеряли одновременно в зеленой (525 нм) и красной (620 нм) области спектра (рис.2А, Б) или только в зеленой области (рис.2В, Г). При изучении клеток меланом человека разных линий оказалось, что все проанализированные линии содержали как клетки, активно накапливающие Rho-123, так и клетки, не накапливающие Rho-123 и образующие по этому признаку побочную популяцию - side population - SP (рис.2, табл.3, 4).

Клетки разных линий значительно отличались по способности накапливать Rho-123 (табл.3). Накопление красителя клетками MDR1" было достоверно и существенно более высоким, чем накопление Rho-123 клетками MDR1+, что свидетельствует об активном участии белка MDR1 в выбросе красителя из таких клеток. Обработка клеток ингибитором белка MDR1 верапамилом приводила к классическому увеличению накопления красителя только в линии Ме1-8 с высоким уровнем MDR1. В остальных линиях клеток воздействие VP вызывало даже снижение накопления Rho-123 (табл.3).

Для анализа скорости выхода Rho-123 клетки после инкубации с красителем отмывали и инкубировали в растворе Хенкса в присутствии и без

VP в течение 60 мин и измеряли интенсивность флуоресценции клеток.

Рис.2. Исследование накопления 1*110-123 клетками мелано-мы человека линии Вго-В19 с помощью проточной цитофлуо-риметрии при анализе флуоресценции в красной и в зеленой области спектра (А, Б) или только в зеленой области (В, Г). А, В - аутофлуоресценция клеток, Б, Г - флуоресценция клеток после инкубации с Шю-123. А, Б - по оси абсцисс интенсивность зеленой флуоресценции, по оси ординат - красной флуоресценции, усл.ед; В, Г - по оси абсцисс - интенсивность зеленой флуоресценции, усл.ед, по оси ординат - количество клеток, усл.ед., 1 - аутофлуоресценция клеток, 2 — клетки, накапливающие Шю-123, 3 - клетки, не накапливающие Юю-123 (ЭР).

Таблица 3. Накопление ИЬо-123 клетками различных линий меланомы человека без и в присутствии ингибитора активности ]УШШ верапамила (УР). Приведены средние значения трех независимых экспериментов или данные отдельных экспериментов. МИ — средняя интенсивность флуоресценции окрашенных Шю-123 клеток.

Линия клеток Фенотип MDR1 MFI, усл. ед.

Без VP В присутствии VP

Вго-В19 MDR1 69,6±19,4 27,3±2,0

MS 28,4 21,5

Mel-5 90,8 79,7

Mel-10 61,6±13,5 39,3±4,1

Mel-8 MDR1+ 4,5±0,1* 18,4±6,0**

*р<0,005 для клеток линий с фенотипом MDR1+ и MDR1'; ** р<0,005 для клеток одной линии без и с верапамилом.

Показано, что клетки меланом различных линий существенно различались по способности выбрасывать Юю-123 и по чувствительности этого процесса к УР. Так скорость выхода составила 3,5; 20,4; 22,0; 39,0 и 19,4 % от исходного уровня Шю-123 за час, а степень ингибирования выхода

Rh о gr<?t>ji

к!н> реея

Юю-123 в присутствии УР составила 60,0; 50,1; 61,8; 78,7 и 27,3% для линий Вго-В19, МБ, Ме1-5, Ме1-8 и Ме1-10, соответственно.

Белок МОЮ в линиях с фенотипом МЭН. Г может присутствовать в следовых количествах, но, как следует из данных по накоплению Ию-123 в присутствии УР (табл.3), УР не влияет на накопление красителя в таких клетках. В то же время, как сказано выше, УР ингибировал выход Ию-123 из клеток меланом всех МОШ" линий. Это позволяет предположить, что в клетках меланом присутствует другой транспортер, способный активно выводить Ию-123 из клеток, и также как МОШ чувствительный к УР.

Для определения вклада в устойчивость клеток меланомы с фенотипом МОЯ Г процессов, чувствительных к УР, на примере линии МеМО исследовали чувствительность клеток данной линии к противоопухолевым препаратам в присутствии УР.

Обнаружено, что в присутствии УР чувствительность клеток повышается ко всем исследованным препаратам. В случае совместного действия доксорубицина и УР чувствительность возрастает почти в 4 раза (1С50 снижается с 0,3 до 0,08 мкМ); в случае дакарбазина - почти в 3 раза (1С50 снижается с 2,0 до 0,7 мМ) и в 1,5 раза при действии БТОГ (1С50 снижается с 3,0 до 2,1 мкМ).

В предыдущих экспериментах было показано (табл.2), что цитотоксическое действие препаратов дакарбазин и БТОГ не зависит от присутствия белка \1DR1. Однако, полученные данные по сенсибилизирующему действию УР для этих препаратов в линии с фенотипом М011Г, подтверждают предположение о присутствии в клетках меланомы линии МеМО другого переносчика, отличного от МБЮ, но также чувствительного к специфическому для МОШ ингибитору УР. Для такого переносчика(ов), по-видимому, субстратом является не только доксорубицин, но и дакарбазин и этот переносчик также обуславливает устойчивость клеток не только к доксорубицину, но и к дакарбазину.

Величина БР в разных линиях колебалась от 0,9% (МеМО) до 2,7% (Мв), а в линии Ме1-8 достигала 65,1% (табл.4). При анализе влияния УР на размер

БР оказалось, что ее снижение в присутствии ингибитора обнаруживается только для клеток линии Ме1-8 с высоким уровнем белка МОГИ. Полученные результаты позволяют однозначно считать, что если белок \1DR1 присутствует в значительном количестве на плазматической мембране клеток, то он имеет определяющее значение в формировании ЯР, как в случае линии Ме1-8. После ннгибирования МГЖ1 верапамилом в этой линии БР сохраняется, но ее размер снижается в среднем до 4%, что свидетельствует о присутствии и участии в формировании БР и других транспортеров, отличных от МОЯ1 В остальных исследованных линиях размер 8Р не зависел от присутствия МОЯ!, т.к. обработка УР клеток других линий меланомы с фенотипом МОКГ не влияла на размер БР (табл.4).

Чтобы оценить влияние на размер ЭР обработки клеток меланомы противоопухолевыми препаратами, были поставлены эксперименты с клетками линий МБЯГ и МОШ+, которые обрабатывали препаратами в концентрации 1С50 и через 72 часа исследовали размер ЯР.

Таблица 4. Размер ЭР в различных линиях меланомы человека после инкубации с Шю-123 без и в присутствии ингибитора активности .\1DR1 верапамила (УР).

Линия клеток Фенотип MDR1 Доля неокрашенных клеток (вР), %

Без VP В присутствии VP

В го-В 19 MDR1' 1,5±0,6 2,5±0,3

MS 2,7±0,2 2,3±0,3

Ме1-5 2,0±1,2 0,5' 0,6"

Ме1-10 0,9±0,3 0,9±0,5

Ме1-8 MDR1+ 65,1±4,0 4,1±1,1*

*- р<0,005 при действии VP; • - данные одного эксперимента

Показано, что в ШЖ1" клетках в указанных условиях наблюдали увеличение БР при действии доксорубицина во всех трех исследованных линиях, а при действии дакарбазина - только в двух, а в линии Ме1-10 наблюдали снижение размера ЯР (рис.ЗА).

В клетках линии Ме1-8 Ж)Щ+, как следует из рис.ЗБ, ни один из двух

исследованных препаратов не снижал размер БР, более того, при действии всех препаратов отмечено увеличение размера БР. При измерении ЭР в обработанных доксорубицином клетках линии Ме1-8 в присутствии "УР обнаружено, что размер ЭР возрастал с 2,7% в контроле до 50,1%. При измерении 8Р в тех же условиях после действия дакарбазина наблюдали снижение размера 8Р по сравнению с размером 8Р контрольных клеток, обработанных УР, с 2,7 до 1,5%. Полученные результаты свидетельствуют о том, что после обработки клеток доксорубицином, но не дакарбазином, в составе БР возрастает доля клеток, устойчивых к действию УР, что может быть связано с индукцией в этих условиях других АВС-транспортеров, отличных от М1Ж1.

12,5 Г I Контроль 1

ВДоксорубицин ИДакарбазин

50,1

____I__

УР- ур+ УР- \/Р+ УР- УР+ Контроль Даксорубицин Дакарбаэин

Рис.3. Содержание 8Р в линиях меланомы человека с фенотипом >ПЖГ (А) и в линии Ме!-8 с фенотипом \IDRI (Б) через 72 часа после обработки противоопухолевыми препаратами в концентрации 1С50. Размер 8Р исследовали: А -без УР, Б - без УР (УР-) и в присутствии УР (УР+).

Таким образом, все исследованные линии меланом человека содержат ЭР, размер которой составляет в линиях \ПЖГ от 0,9 до 2,7% и не изменяется при исследовании накопления ЯЬо-123 в присутствии ингибитора активности белка МОН.1 верапамила. Формирование 8Р в этих клетках определяется транспортерами, отличными от МОШ. При высоком содержании и активности этого белка размер ЯР может достигать 65% (Ме1-8).

Присутствие в меланомах фракции высоко резистентных клеток, образующих ЯР, свидетельствует о том, что именно они могут сохраняться при химиотерапии и определять рецидивирование опухоли и развитие

множественной лекарственной устойчивости благодаря высокой активности как белка МОШ, так и белков-транспортеров, отличных от МОК 1, природу которых предстоит выяснить.

4. Содержание белка Шр70 в клетках меланомы человека как фактор устойчивости к противоопухолевым препаратам.

В клетках меланомы человека различных линий исследовали содержание белка Нзр70 в стандартных условиях (НБр70) и после индукции при тепловом стрессе при прогревании до +42°С в течение 1 часа и последующего культивирования в стандартных условиях (Нзр701). На рис.4 приведены гистограммы интенсивности флуоресценции клеток меланомы различных линий после внутриклеточного иммунофлуоресцентного окрашивания Нзр70 ФИТЦ-меченными МкАт. Из приведенных данных видно, что белок НБр70 был обнаружен во всех линиях меланом, но содержание этого белка значительно варьировало в клетках различных линий. Необходимо отметить, что среди клеток некоторых линий (Ме1-4, Ме1-6) обнаруживается высокая гетерогенность клеток по содержанию Нвр70.

Динамика изменения уровня Нзр70( после воздействия теплового шока отличалась в клетках меланом различных линий: у линий с низким исходным уровнем НБр70 (М8 и Вго-В19) уровень Нзр70( возрастал только через 24 часа после теплового шока, В клетках линии Ме1-6 с наиболее высоким исходным уровнем Шр70 уровень Нзр701 незначительно повышался через 5 часов и возвращался к исходному значению через 24 часа. Высокое содержание этого белка в клетках меланомы человека может быть отражением стрессового состояния этих клеток. Действительно, при индукции Нзр70 с помощью теплового шока дополнительное повышение его содержания было незначительным. Для оценки вклада Нзр70 в развитие устойчивости клеток меланомы человека анализировали связь между содержанием НБр70 и чувствительностью опухолевых клеток к противоопухолевым препаратам. При анализе корреляции устойчивости клеток меланомы к препаратам паклитаксель, доксорубицин, БТОГ и дакарбазин с уровнем Нзр70 обнаружена прямая корреляция между

Вго-ВД9

устойчивостью клеток меланомы человека к дакарбазину (11=0,77), паклитакселю (11=0,83) и БТОГ (11=0,89). В случае паклитакселя и БТОГ

корреляция была статистически значимой (р<0,05). Корреляции между уровнем Шр70 и устойчивостью клеток меланомы к доксору-бицину не выявлено, но клетки с низким содержанием Нэр70 (линии Вго-В19 и МБ) были достоверно более чувствительны к доксо-рубицину, чем линии с его высоким содержанием.

В'

МЫ-4

Мс1-3

Ме1-5

Мс!-б

Рис.4. Шр70 в клетках меланом при внутриклеточном окрашивании ФИТЦ-меченными антителами к Шр70.

Левый пик - аутофлуоресценция клеток; правый - флуоресценция при внутриклеточном окрашивании По оси абсцисс -интенсивность флуоресценции, усл.ед; по оси ординат -количество клеток, уел ед

Полученные результаты позволяют заключить, что уровень НБр70 в клетках меланомы вносит значительный вклад в их устойчивость к противоопухолевым препаратам.

5. Исследование содержания белков Fas и FasL в клетках меланомы человека различных линий: связь с чувствительностью к противоопухолевым препаратам и к действию ЦТЛ.

При исследовании содержания белков Fas и FasL с помощью иммуноцитохимического анализа выявлены значительные различия в содержании этих белков в клетках различных линий меланомы человека. В двух линиях - Вго-В19 и Ме1-4 - обнаружено отсутствие белка Fas, в трех линиях его содержание было низким, в четырех - высоким. Белок Fas обнаруживался в цитоплазме и на мембране клеток. FasL обнаружен во всех исследованных линиях, кроме Ме1-7. В четырех линиях обнаружен высокий уровень белка FasL. FasL был выявлен на мембране и в перинуклеарной области клеток. В линиях Mel-5, Ме1-8 и Ме1-9 при этом одновременно отмечено присутствие и FasL и Fas, что позволяет предполагать существование дефектов в системе проведения сигнала индукции апоптоза через рецептор Fas в этих линиях, и, следовательно, устойчивость таких клеток к Fas-зависимому апоптозу.

При сравнении чувствительности клеток меланом к противоопухолевым препаратам с уровнем белков Fas и FasL статистически значимой связи между этими показателями не обнаружено.

Для исследования роли белка Fas в чувствительности клеток меланомы человека к действию меланомаспецифических ЦТЛ использовали ЦТЛ, индуцированные с помощью ДК. Для нагрузки ДК опухолеспецифическими антигенами их инкубировали либо с лизатом клеток меланомы-мишени, либо со смесью лизатов нескольких меланом для использования одинаковых для всех линий опухолеспецифических антигенов. В этих экспериментах были использованы три линии клеток меланомы человека: MS и Mel-5 - Fas+ линии и Вго-В19 - Fas" линия. Результаты этих экспериментов, представленные на рис.5, свидетельствуют, о том, что исследованные клетки меланом различаются по чувствительности к ЦТЛ: высоко устойчивой оказалась линия Вго-В19, а чувствительными - линии MS и Mel-5. При этом линия Вго-В19 была устойчива к действию ЦТЛ, индуцированных при нагрузке ДК как

лизатом клеток линии Bro-B 19. так и смесью лизатов трех меланом, т. е. при использовании общих антигенов для всех линий. Высокая устойчивость клеток Fas" линии Вго-В19 к действию меланомаспецифических ЦТЛ, подтверждает важную роль Fas-зависимого пути индукции апоптоза опухолевых клеток под действием ЦТЛ. Отсутствие этого белка в клетках меланомы может быть причиной их устойчивости к индукции апоптоза. Приводить к устойчивости к действию ЦТЛ могут и дефекты в системе проведения сигнала индукции апоптоза. предполагаемые в клетках меланомы из-за одновременного присутствия белков Fas и FasL.

■ ЦТЛ 1 В ЦТЛ 2

Рис.5. Чувствительность клеток Fas" и Fas+ меланомы человека к меланомаспеци-фическим ЦТЛ, индуцированным ДК, нагруженными лиза-тами клеток мелано-мы-мишени (ЦТЛ 1) или смесью лизатов меланом (ЦТЛ 2).

Bro-B19/Fas-

MS/Fas+

Таким образом, в клетках меланомы различных линий содержание белков Fas и FasL не может служить маркером устойчивости этих клеток к действию противоопухолевых препаратов. В тоже время как отсутствие белка Fas, так и высокий уровень белка FasL свидетельствуют об устойчивости таких опухолевых клеток к действию опухолеспецифических ЦТЛ, а, следовательно, и об устойчивости таких опухолей ко многим методам клеточной иммунотерапии.

7. Исследование влияния рекомбинантного белка MIS человека на выживаемость клеток меланомы человека и их чувствительность к дакарбазину.

При изучении связывания ФИТЦ-меченного rhMIS с культивируемыми

опухолевыми клетками меланомы различных линий показано, что rhMIS связывается с поверхностной мембраной опухолевых клеток (за исключением линии Ме1-8), и что все опухолевые клетки содержат рецептор MIS внутри клеток. Содержание рецепторов MIS на клеточной мембране было пропорционально их количеству в клетке (г=0,74, р=0,05).

Показано, что выживаемость клеток в присутствии rhMIS снижалась в тех линиях клеток, где этот рецептор обнаруживался на клеточной мембране. Повторное добавление rhMIS к опухолевым клеткам приводило к усилению их гибели. Показано, что однократная обработка клеток линии MS препаратом rhMIS за 30 мин до добавления дакарбазина повышала их чувствительность к действию этого противоопухолевого препарата, и значение IC50 снижалось с 0,61 до 0,40 мМ. Повторная обработка клеток меланомы rhMIS усиливала его сенсибилизирующее действие: значение IC50 снижалось до 0,24 мМ. Полученные результаты позволяют заключить, что белок rhMIS может служить эффективным модификатором биологического ответа клеток меланомы человека на дакарбазин - наиболее эффективный при этом заболевании противоопухолевый препарат.

ВЫВОДЫ.

1. Обнаружена высокая MDR1-независимая цитотоксическая активность нового препарата Н1,Ыб-бис[2,2,6,6-тетракис(трифторметил)-3,6-дигидро-2Н-1,3,5-оксадиазин-4-ил]-1,6-гександиамин (БТОГ) в отношении клеток меланомы человека.

2. Белок MDR1 определяет природную устойчивость клеток меланомы человека только в отдельных случаях (в 4 из 10 линий) и только к доксорубицину, но не к дакарбазину и препарату БТОГ.

3. В клетках меланомы человека с фенотипом MDR1" обнаружено быстрое и чувствительное к верапамилу выведение Rho-123 и сенсибилизирующее действие верапамила в отношении не только доксорубицина, но и дакарбазина и препарата БТОГ.

4. Обнаружено, что все линии меланомы человека содержат значительную фракцию клеток, не включающих Rho-123, размер которой не зависит от действия верапамила (за исключением линий MDR1+) и возрастает при действии противоопухолевых препаратов.

5. В клетках меланомы человека обнаружен высокий уровень содержания белка Hsp70, который коррелирует с их устойчивостью к противоопухолевым препаратам.

6. В клетках меланомы человека различных линий обнаружены нарушения в системе Fas/FasL в виде отсутствия белка Fas и/или высокого уровня белка FasL. При отсутствии Fas обнаружена устойчивость клеток к действию опухолеспецифических ЦТЛ.

7. Белок rhMIS обладает антипролиферативной активностью в отношении клеток меланомы человека, имеющих рецепторы к этому белку, и сенсибилизирует их к действию дакарбазина. Повторная обработка клеток белком rhMIS приводит к усилению его противоопухолевого и сенсибилизирующего действия.

Рекомендации по практическому использованию результатов диссертации.

1. Целесообразно проведение доклинических испытаний нового препарата БТОГ на животных для изучения возможности его применения в клинической практике в качестве противомеланомного препарата.

2. Рекомендуется проведение доклинических испытаний сенсибилизирующего действия верапамила при использовании дакарбазина для лечения меланомы.

3. Рекомендуется проведение клинических исследований совместного действия белка rhMIS и дакарбазина для повышения эффективности химиотерапии при меланоме.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Кондрашева И.Г., Филатов A.B., Москалева Е.Ю., Попова О.Н., Северин Е.С.. Северин С.Е. Характеристика моноклональных ашигел UT1 и UT2 к белку Fas и исследование экспрессии белков Fas и FasL и Fas-зависимого апоптоа в опухолевых клетках человека различных линий //Иммунология. - 2004. - Т. 2. - С. 68-72.

2. Кутняк О.В., Кондрашева И.Г., Гукасова Н.В., Кешелава В В., Корженевский Д.А., Коростелев С.А., Северин С.Е., Северин Е.С. Индукция меланомаспецифических ЦТЛ с помощью дендритных клеток, нагруженных смесью лизатов клеток различных линий меланомы человека/Материалы конференции "Дни иммунологии в Санкг-Пегфбурге-2004". - Медицинская иммунология. - Санкт-Петербург, 2004. - Т. 6(3-5). - С. 458-459.

3. Кондрашева И.Г., Хомякова A.B., Москалева Е.Ю. Индукция апоптоза лимфоцитов человека при их взаимодействии с опухолевыми клетками in vitroy/Гезисы П Всемирного конгресса по иммунопатологии и аллергии. - Аллергология и иммунология. -Москва, 2004.-Т. 5, №1. - С. 35.

4. Кутняк О.В., Кондрашева И.Г., Гукасова Н.В., Кешелава В.В., Корженевский Д.А., Коростелев С.А., Северин С.Е., Северин Е.С Сравнение эффективности индукции меланомаспецифических ЦТЛ с помощью дендритных клеток, нагруженных лизатом сингенных и смесью аллогенных опухолевых клеток//Физиология и патология иммунной системы. - 2005. -№7. -С. 25-31.

5. Кондрашева И.Г., Москалева Е.Ю., Крюкова Л.Ю., Крюков Л.Н., Северин С.Е. Противомеланомная активность полифторсодержащего производного 1,3,5-оксадиазина//Материалы XIV Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство". - Москва, 2007. - С. 616.

6. Северин С.Е., Крюкова Л.Ю., Крюков Л.Н., Посыпанова Г.А., Кондрашева И.Г., Москалева Е.Ю., Северин Е.С. Полифторсодержащие производные 1,3,5-оксадиазина как новый класс потенциальных противоопухолевых соединений/ТМатериалы XI Российского Онкологического конгресса. -Москва, 2007. - С. 239-240.

7. Кондрашева И.Г., Гукасова Н.В., Москалева Е.Ю., Попова О.Н., Макаров В.А., Морозова Н.С., Северин С.Е., Северин Е.С. Вклад белка gpl70 и белка теплового шока Hsp70 в устойчивость клеток меланомы человека к противоопухолевым препаратам//Материалы XI Российского Онкологического конгресса. -Москва, 2007. - С. 171-172.

8. Родина A.B., Гукасова Н.В., Макаров В.А., Кондрашева И.Г., Хомякова A.B., Попова О.Н., Москалева Е.Ю., Северин С.Е. Антипролиферативная активность rhMIS человека и локализация его рецептора в различных линиях опухолевых клеток человека//Материалы XI Российского Онкологического конгресса. - Москва, 2007. - С. 239.

9. Родина A.B., Гукасова Н.В., Макаров В.А., Кондрашева И.Г., Хомякова A.B., Попова О.Н., Москалева Е.Ю., Северин С.Е. Локализация рецепторов, связывающих MIS, в различных линиях опухолевых клеток человекаУ/Биохимия. - 2008 - Т. 73. - Вып. 7. - С. 989-998.

10. Кондрашева И.Г., Москалева Е.Ю., Крюкова Л.Ю., Крюков Л.Н., Попова О.Н., Северин С.Е., Северин Е.С. Чувствительность клеток меланомы человека к новому полифторсодержащему производному 1,3,5-оксадиазина в сравнении с известными химиотерапевтическими препаратами//Молеку-лярная медицина. - 2008. - №2. - С. 28-33.

Подписано в печать 07.10.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 1091 Тираж. 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кондрашева, Ирина Григорьевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Характеристика меланомы.

1.2. Механизмы формирования резистентности опухолевых клеток.

1.2.1. Введение.

1.2.2. Механизмы индукции и регуляции апоптоза в опухолевых клетках.

1.2.3. Механизмы, обеспечивающие эффективный выброс токсических веществ из опухолевых клеток и определяющие wc устойчивость к химиотерапевтическим препаратам.

1.3. Белок MIS - свойства и противоопухолевая активность.

1.3.1. Структура и свойства белка MIS.

1.3.2. Антипролиферативный эффект MIS в отношении опухолевых клеток.

1.3.3. Молекулярный механизм противоопухолевого действия MIS.

ГЛАВА 2. Материалы и методы.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Исследование чувствительности клеток меланомы человека к противоопухолевым препаратам с различным механизмом действия и новому препарату - производному 1,3,5 - оксадиазина.

3.2. Исследование содержания белка MDR1 на мембране клеток разных линий меланомы человека и его связь с устойчивостью клеток к противоопухолевым препаратам.

3.3. Исследование накопления родамина-123 клетками меланомы человека.

3.3.1. Оптимизация метода проточной цитофлуориметрии для выявления клеток ненакапливающих Rho-123 (SP) и количественной оценки его накопления в HeSP-клетках. 66^

3.3.2. Исследование накопления родамина-123 клетками меланомы человека с фенотипом MDR1' и MDR

3.3.3 Исследование скорости выхода Rho-123 из клеток меланомы человека различных линий и влияние верапамила на этот процесс.

3.3.4. Выявление и характеристика клеток, не включающих родамин-123, в различных линиях меланомы человека.•.

3.3.5. Исследование влияния противоопухолевых препаратов на размер

SP в различных линиях меланомы человека.

3.4. Содержание белка Hsp70 в клетках меланомы человека как фактор устойчивости к противоопухолевым препаратам.

3.4.1. Исследование содержания белка Hsp70 в клетках меланомы человека и его индукции при прогревании (Hsp70t).

3.4.2. Исследование связи между содержанием HsplQ и чувствительностью опухолевых клеток меланомы к противоопухолевым препаратам с разным механизмом действия.

3.4.3. Исследование связи между содержанием индуцированного Hsp70t и чувствительностью опухолевых клеток меланомы к противоопухолевым препаратам с разным механизмом действия.

3.5. Исследование содержания белков Fas и FasL в клетках меланомы человека различных линий: связь с чувствительностью клеток к противоопухолевым препаратам и к действию дитотоксических лимфоцитов.

3.5.1. Характеристика МкАт к белку Fas клонов UT1 и UT2 в сравнении с МкАт клона DX2.

3.5.2. Исследование уровня белков Fas и FasL в клетках меланомы человека различиых линий.

3.5.3. Анализ связи между уровнем экспрессии белков Fas и FasL и устойчивостью клеток меланомы к противоопухолевым препаратам.

3.5.4. Исследование чувствительности Fas+ и Fas' меланом к действию цитотоксическш лимфог^итов (ЦТЛ).

3.6. Исследование влияния рекомбинантного белка MIS человека на выживаемость клеток меланомы человека и их чувствительность к дакарбазину.

3.6.1. Исследование связывания rhMIS с плазматической мембраной различных опухолевых клеток и с его внутриклеточными рецепторами.

3.6.2. Исследование влияния rhMIS на выживаемость опухолевых клеток. Связь с уровнем содержания рецепторов MIS.

3.6.3. Исследование влияния повторного действия rhMIS на выживаемость клеток меланомы человека.

3.6.4. Исследование влияния rhMIS на чувствительность клеток меланомы линии MS к дакарбазину.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизмов резистентности клеток меланомы человека к противоопухолевой терапии"

Актуальность проблемы.

Меланома - чрезвычайно злокачественная опухоль, развивающаяся из меланоцитов и характеризующаяся высокой природной устойчивостью к действию противоопухолевых препаратов, биохимические механизмы которой не известны. Заболеваемость меланомой в России составляет до 10% от выявляемых опухолей кожи, и продолжает расти (Чиссов В.И., Дарьялова C.JI., 2006). У каждого десятого больного меланому выявляют в IV стадии, когда уже имеет место инвазия и метастазирование, и основным методом лечения является химиотерапия с использованием дакарбазина, производных нитрозомочевины и платины (Егоров Г.Н., 2005). Эффективность такой терапии остается низкой из-за высокой резистентности клеток меланомы и/или быстрой индукции множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) при воздействии противоопухолевых препаратов (Serrone L. et al., 1999; Helmbach H. et al., 2003).

Действие большей части противоопухолевых препаратов приводит к индукции процесса апоптоза в опухолевых клетках в результате повреждения молекулы ДНК или других внутриклеточных мишеней (Zhivotovsky В. et al, 2003). Кроме того, важную роль при действии и химиотерапевтических средств и опухолеспецифических цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) играет Fas-зависимый путь индукции апоптоза (Friesen С. et al.,1999, Classen С. et al., 1999). В тоже время, существуют метаболические системы, препятствующие повреждению клеток. Это процессы, формирующие уровень внутриклеточных антиоксидантов; системы репарации ДНК; генетические особенности, приводящие к ингибированию процессов апоптоза; АТФ-зависимые транспортеры, обеспечивающие выброс токсических веществ из клеток, и тем самым препятствующие формированию их эффективных концентраций в клетке. В частности, в клетках меланомы обнаружены гены АВС-транспортеров (ABC - ATP-binding cassette) АВСВ1, ABCB5, ABCC1 и ABCG2, кодирующие белки, которые осуществляют АТФ-зависимый транспорт как гидрофобных, так и некоторых гидрофильных соединений из клеток в среду, в том числе выброс красителей Хехст 33342 и родамин-123 (Gottesman М.М. et al., 2002; Choi С.Н., 2005; Frank N.Y. et al., 2005; Monzani E. et al., 2007).

Вариабельность активности каждой из названных систем может приводить к формированию различных механизмов резистентности клеток меланомы к действию противоопухолевых препаратов.

В связи с этим целью работы явилось исследование биохимических механизмов устойчивости клеток меланомы человека различных линий к действию противоопухолевых препаратов и новых подходов к ее снижению. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

- исследование чувствительности клеток меланомы человека различных линий к противоопухолевым препаратам с разным механизмом действия и к новому препарату М1,Кб-бис[2,2,б,6-тетракис(трифторметрш)-3,б-дигидро-2Н-1,3,5-оксадиазин-4-ил]-1,6-гександиамину (БТОГ);

- анализ содержания белков Fas и FasL в клетках меланомы человека различных линий и связь его с чувствительностью клеток меланомы к действию цитотоксических лимфоцитов;

Научная новизна работы.

Впервые показано, что новый препарат БТОГ обладает высокой противомеланомной активностью, которая не зависит от содержания белка MDR1 в опухолевых клетках.

Впервые обнаружено, что в клетках меланомы человека с фенотипом 1УПЖГпроисходит быстрое выведение Rho-123, чувствительное к верапамилу.

Впервые показано, что верапамил повышает чувствительность клеток меланомы человека с фенотипом MDR1" к действию доксорубицина, дакарбазина и препарата БТОГ.

Впервые показано, что все линии меланомы человека содержат значительную фракцию клеток, не включающих Rho-123, размер которой не зависит от действия верапамила (за исключением линии MDR1+) и возрастает при действии противоопухолевых препаратов.

Впервые показано, что обнаруженный в клетках меланомы человека высокий уровень содержания белка Hsp70 коррелирует с их устойчивостью к противоопухолевым препаратам.

Впервые показано, что rhMIS сенсибилизирует клетки меланомы человека к действию дакарбазина, а повторная обработка клеток белком rhMIS приводит к усилению его антипролиферативного и сенсибилизирующего действия.

Практическая значимость исследования.

Обнаруженная высокая противомеланомная MDR1-независимая активность нового препарата -тетракис-(три-фторметил)-3,6дигидро-2Н-1,3,5-оксадиазин-4~ил]-1,6-гександиамина (БТОГ) позволяет рекомендовать этот препарат для проведения доклинических испытаний на животных.

Продемонстрированное снижение выживаемости клеток меланомы человека, имеющих рецепторы к белку rhMIS, в присутствии этого белка, и его способность сенсибилизировать клетки меланомы к действию дакарбазина, позволяют рекомендовать его для клинических исследований.

Апробация работы.

Результаты исследований были доложены на Всероссийском форуме с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге " (2004 г., Санкт-Петербург), П Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (2004 г., Москва), XIV Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (2007 г., Москва), XI Российском Онкологическом конгрессе с международным участием (2007 г., Москва), Российской конференции по меланоме совместно с Всемирной рабочей группой по меланоме и Европейской школой онкологии (2008 г., Москва).

Апробация работы состоялась на расширенном семинаре отдела медицинской химии ГУЗ "Московский НИИ медицинской экологии" 18 сентября 2008 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 3 статьи опубликованы в журналах, состоящих в перечне ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, утвержденном ВАК.

Структура диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кондрашева, Ирина Григорьевна

Выводы.

1. Обнаружена высокая MDR1-независимая цитотоксическая активность нового препарата Н1,Кб-бис[2,2,6,6-тетракис(трифторметил)-3,6-дигидро-2Н-1,3,5-оксадиазин-4-ил]-1,6-гександиамин (БТОГ) в отношении клеток меланомы человека.

Рекомендации по практическому использованию результатов диссертации.

Заключение.

В результате проведенных исследований с использованием 10 линий клеток меланомы человека показано, что эти клетки по сравнению с нормальными пролиферирующими клетками, в качестве которых исследовали стимулированные конканавалином А лимфоциты, обладают высокой устойчивостью к действию противоопухолевых препаратов с различным механизмом действия.

Новый исследованный препарат М'^-бисР^Дб-тетраки^трифтор-метил)-3,6-дигидро-2Н-1,3,5-оксадиазин-4-ил]-1,6-гександиамин (БТОГ) -производное 1,3,5-оксадиазина обладал в наших экспериментах in vitro высокой противомеланомной активностью (табл.4). Его цитотоксическая активность коррелировала с активностью дакарбазина и паклитакселя (рис.7), что позволяет допускать близкий механизм действия этих препаратов. Общим с дакарбазином может быть механизм, связанный со способностью обоих препаратов к реакциям нуклеофильного присоединения. Действительно, соединение БТОГ способно к таутомерным превращениям с образованием пергидро-1,3,5-оксадиазина. Последний характеризуется наличием боковой азометиновой связи, делающей его активным в отношении нуклеофильных фрагментов биомолекул (белков, нуклеиновых кислот и др.), что, по-видимому, и определяет его цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток [168]. Общим в механизме действия БТОГ и паклитакселя может быть внутриклеточная мишень действия этих препаратов - белки микротрубочек.

Клетки многих линий были одновременно устойчивы к действию нескольких противоопухолевых препаратов, то есть характеризовались множественной лекарственной устойчивостью (табл.4). Так линия Ме1-7 была устойчива ко всем исследованным препаратам - доксорубицину, дакарбазину, паклитакселю и новому препарату БТОГ. Линии Ме1-4 и Ме1-8 были устойчивы к доксорубицину и паклитакселю, Ме1-9 - к доксорубицину, дакарбазину и БТОГ.

До недавнего времени наиболее хорошо изученным белком, активность которого определяет множественную лекарственную устойчивость в отношении доксорубицина и паклитакселя, был белок MDR1. Однако во многих исследованиях, касающихся изучения биохимических механизмов высокой устойчивости клеток меланом к противоопухолевым препаратам, было показано, что этот белок обнаруживается лишь в небольшом числе случаев [123, 124, 186]. В нашем исследовании повышенный уровень белка MDR1 был обнаружен в четырех из 10 линий - Mel-3, Mel-4, Mel-8 и Ме1-9 (табл.6, рис.10) и именно эти линии были высоко устойчивы к доксорубицину (за исключением Mel-З) и паклитакселю. Линия Ме1-9 была, кроме того, устойчива к дакарбазину и новому препарату БТОГ. В остальных линиях было обнаружено лишь очень незначительное количество МЕЖ+-клеток, количество белка MDR1 на мембране которых было очень низким (табл.6, рис.10) и не может, поэтому определять их устойчивость, но может быть причиной быстрого развития множественной лекарственной устойчивости при химиотерапии препаратами, близкими по своим свойствам доксорубицину.

Следует отметить, что в специальных экспериментах с использованием исходной линии клеток миелолейкоза человека K562wt и ее сублинии K562Adr, полученной при селекции по устойчивости к доксорубицину и характеризующейся высоким содержанием белка MDR1, клетки K562Adr были резистентны и к доксорубицину и к паклитакселю (рис.9, табл.5). При меланоме MDR1 "-клетки также были устойчивы и к доксорубицину и к паклитакселю. Однако, кроме того, необходимо отметить, что несколько линий с фенотипом MDR1" (Mel-6, Ме1-7) отличались чрезвычайно высокой устойчивостью только к паклитакселю (табл.7), что свидетельствует о присутствии в клетках этих линий других, отличных от MDR1 механизмов устойчивости, не связанных с ABC-транспортерами, которые могут иметь, как известно, различную природу [187]. Эти же линии оказались устойчивыми к БТОГ и дакарбазину.

Ill

Важно отметить, что новый исследованный препарат БТОГ, также как и дакарбазин, был одинаково эффективен как в отношении и K562wt и K562Adr клеток (табл.5), так и в отношении клеток меланом с фенотипом и MDR1" и MDR1+ (табл.4, 7).

Таким образом, белок MDR1 в значительном количестве присутствует только в клетках отдельных линий меланомы человека и не является универсальным фактором, определяющим устойчивость клеток меланом человека к противоопухолевым препаратам, но если он присутствует в клетках, то однозначно определяет их высокую резистентность к доксорубицину и паклитакселю, но не к дакарбазину и БТОГ.

В высокую устойчивость клеток меланом человека помимо белка MDR1 значительный вклад могут вносить и другие белки из семейства ABC-транспортеров - MRP (Multidrug-related protein, семейство АВСС) и LRP (Lung resistance protein, семейство АВСА). Белок MRP обнаружен в клетках 40 линий меланомы человека [125]. В тоже время при увеальной меланоме обнаружен низкий уровень и MRP и MDR1, но высокий уровень LRP [124]. В другом исследовании при злокачественной меланоме MRP был выявлен в 4, a LRP в 8 из 10 исследованных линий [186]. Интегральным показателем активности разных ABC-транспортеров в клетке может быть уровень накопления (и/или скорости выхода) флуоресцентных красителей Хехст 33342 и Rho-123, которые также являются субстратами АВС-транспортеров [109, 169, 188].

При исследовании накопления Rho-123 клетками меланом различных линий с помощью проточной цитофлуориметрии обнаружено, что основная часть клеток всех исследованных линий меланом с фенотипом MDR1" интенсивно накапливала этот краситель, но при этом во всех линиях обнаруживалась небольшая фракция клеток, которые не накапливали Rho-123 (SP).

Остановимся на данных, полученных в отношении клеток основной популяции — HeSP. Поскольку во всех линиях при окрашивании моноклональными антителами были обнаружены следовые количества белка

MDR1, одновременно было исследовано влияние VP - ингибитора MDR1 - на накопление Rho-123. Анализируя накопление Rho-123 в клетках с фенотипом MDR1", мы не обнаружили связи между накоплением красителя (табл.8, рис.12) и незначительными различиями в чувствительности клеток к исследованным противоопухолевым препаратам (табл.4). В тоже время накопление Rho-123 в резистентных клетках с фенотипом MDR1+ было значительно и достоверно ниже, чем в клетках с фенотипом MDR1" и достоверно возрастало при действии VP (табл.8, рис.13). При действии VP на MDR1" клетки увеличения накопления Rho-123 не обнаруживали, что свидетельствует об отсутствии активного белка MDR1 в клетках этих линий.

Неожиданным оказалось действие VP на уровень накопления Rho-123 в клетках меланом с фенотипом MDR1": во всех исследованных линиях было обнаружено снижение накопления Rho-123 в присутствии VP в отличие от MDRl+-KneTOK, в которых, как отмечено выше, также в присутствии VP накопление красителя существенно возрастало.

При исследовании влияния VP на выход Rho-123 из клеток меланомы различных линий во всех линиях обнаружено ингибирование выхода красителя, которое было наиболее значительным в ШЖ1+-клетках (рис.14). Поскольку белок MDR1 в клетках меланом с фенотипом MDR1" практически отсутствовал, и, как следует из данных о влиянии VP на накопление Rho-123, активность MDR1 в этих клетках отсутствовала (табл.8), было высказано предположение о присутствии в клетках меланомы другого, отличного от MDR1, транспортера, активность которого также ингибируется VP. Тогда VP должен оказывать сенсибилизирующее действие и на клетки меланомы с фенотипом MDR1".

Экспериментальная проверка этого предположения подтвердила сенсибилизирующее действие VP в отношении клеток меланомы Mel-10 с фенотипом MDR1" (рис.15). При этом оказалось, что VP сенсибилизировал эти клетки не только к доксорубицину, но и к дакарбазину и к препарату БТОГ. Это позволяет считать, что субстратная специфичность предполагаемого переносчика(ов) отличается от специфичности белка MDR1. Обнаруженная сенсибилизирующая активность VP в отношении клеток меланомы при действии дакарбазина может иметь практическое значение и нуждается в дальнейшем изучении.

Сообщения в ряде литературных источников свидетельствуют о том, что в клетках меланомы помимо АВСВ1 (MDR1), АВСС1 (MRP1) и АБСА (LRP) [189] обнаружены транспортеры ABCG2 [170] и АВСВ5 [126]. Известно, что активность ABCG2 не снижается в присутствии VP [171]. Сведения о чувствительности АВСВ5 к VP пока отсутствуют, но, учитывая его высокую структурную гомологию с транспортером АВСВ1, способность использовать Rho-123 и доксорубицин в качестве субстратов, транспортировать их из клеток и вносить вклад в формирование устойчивости к различным препаратам, можно полагать, что именно этот белок может определять обнаруженные нами свойства клеток MDR1" меланомы человека. Важно также отметить, что АВСВ5+-клетки, несмотря на способность интенсивно выбрасывать субстраты, за короткий промежуток времени (90 мин) более эффективно, чем АВСВ5 -клетки накапливают доксорубицин. Это определяется влиянием АВСВ5 на мембранный потенциал клеток. При дальнейшей инкубации превалирует выведение препаратов из клеток и в результате, уже через 24 часа, их содержание в АВСВ5+-клетках оказывается существенно более низким, что и определяет их устойчивость [126]. Описанные свойства АВСВ5 как нельзя лучше объясняют полученные нами результаты по влиянию VP на накопление Rho-123 и на скорость его выброса из клеток.

Еще раз подчеркнем, что все сказанное выше относится к неБР-клеткам меланомы, составляющим основную часть клеточной популяции. Именно чувствительность этих клеток мы исследуем при использовании МТТ-теста. Теперь остановимся на данных, касающихся клеток, составляющих SP -потенциально опухолевых стволовых клетках.

Во всех исследованных линиях меланом человека обнаружена фракция клеток, составляющих SP, размер которой в линиях с низким содержанием MDR1 колеблется от 0,5 до 2,7% и не изменяется в присутствии ингибитора активности белка MDR1 VP (табл.9). Для линии с высоким содержанием и активностью этого белка размер SP может достигать 65% (но не образует отдельную популяцию), и, хотя после ингибирования MDR1 верапамилом SP в линии Ме1-8 сохраняется, ее размер снижается до 4,1% от всей популяции клеток. Из полученных результатов следует, что в клетках различных линий меланомы человека MDR1" присутствует SP, но ее формирование определяется другими транспортерами, отличными от MDR1. Обнаруженный размер SP в меланомах представляется весьма значительным, если учесть, что SP в костном мозге составляет только 0,15% [172] - 0,17% [173], при раке молочной железы -0,22% [173] - 0,18% [174], при раке яичников человека 0,01-0,69% [175].

Однако, без проведения специальных экспериментов по исследованию способности клеток SP исследуемых линий меланом индуцировать опухоль после их трансплантации иммунодефицитным животным нельзя считать доказанным, что эти клетки являются ОСК, хотя по своим свойствам они соответствуют именно ОСК.

Высокое содержание таких клеток в меланомах может быть одной из важнейших причин большой частоты рецидивирования меланом и короткого периода ремиссии. С другой стороны, присутствие большой фракции клеток со свойствами SP, способных выбрасывать различные препараты из клеток в межклеточную среду, свидетельствует о том, что именно они могут определять устойчивость меланомы ко многим химиотерапевтическим препаратам благодаря высокой активности как белка MDR1, так и белков транспортеров, отличных от MDR1, природу которых предстоит выяснить. Действительно, при действии доксорубицина на клетки меланомы наблюдали увеличение размера SP во всех исследованных линиях меланом человека, что позволяет объяснить очень высокую устойчивость меланом к этому препарату. В тоже время при действии дакарбазина в одной из трех исследованных линий при действии дакарбазина наблюдали снижение размера SP.

Важно подчеркнуть, что использованный в работе общепринятый метод оценки влияния противоопухолевых препаратов на выживаемость клеток меланомы с использованием витального красителя МТТ не позволяет учитывать их действие на клетки SP. Такое действие препаратов может быть оценено только после выделения обогащенной фракции клеток SP с помощью проточной цитофлуориметрии и использования метода клонирования клеток для оценки их выживаемости и является отдельной самостоятельной задачей. Поиск препаратов или цитокинов, которые могли бы избирательно по отношению к нормальным клеткам, в том числе к нормальным стволовым клеткам, повреждать или блокировать клетки, составляющие SP, имеет большое значение для клинической практики.

Белок Hsp70 является, как показано в главе 3.4, важным защитным белком в клетке. Мишенью действия этого белка являются как поврежденные белки, так и отдельные этапы процесса апоптоза клетки, в которых Hsp70, связываясь с отдельными белками, выполняет регуляторные функции (рис.4). Белок Hsp70 обнаружен во всех проанализированных линиях меланом, но его содержание значительно варьировало в клетках различных линий (рис.18). Кроме того, необходимо отметить, что среди клеток некоторых линий (Mel-4, Ме1-6) обнаруживается высокая гетерогенность клеток по содержанию белка Hsp70. Следует подчеркнуть, что максимальный уровень Hsp70 был отмечен в клетках первичной линии меланомы Ме1-6, полученной из метастатического очага меланомы. Наше исследование проведено с использованием для внутриклеточного окрашивания клеток моноклональных антител к индуцибельному белку теплового шока Hsp70 (Hsp72). Поэтому высокое содержание этого белка в клетках меланомы человека может быть отражением стрессового состояния этих клеток. Действительно, при индукции Hsp70 с помощью теплового шока дополнительное повышение его содержания было очень незначительным (рис.19). Близкие данные относительно уровня Hsp70 и Hsp70t в клетках меланом описаны в ряде работ [178, 179].

В результате проведенного исследования обнаружена прямая корреляции устойчивости клеток меланомы человека к дакарбазину, паклитакселю, БТОГ, но корреляции между уровнем Hsp70 и устойчивостью клеток меланомы к доксорубицину не выявлено. В тоже время линии меланом с низким содержанием Hsp70 были более чувствительны к доксорубицину. Полученные результаты позволяют заключить, что уровень Hsp70 в клетках меланомы вносит значительный вклад в их устойчивость ко всем исследованным противоопухолевым препаратам.

Нами была исследована также связь устойчивости меланом различных линий с содержанием нескольких белков, участвующих в индукции и регуляции апоптоза клеток, - белков системы Fas/FasL и белка теплового шока Hsp70. При сравнении устойчивости клеток меланом к противоопухолевым препаратам, оцениваемой по величине IC50, с уровнем белков Fas и FasL (табл.13, 14) статистически значимой связи между устойчивостью изученных клеток к доксорубицину, паклитакселю, БТОГ и дакарбазину и уровнем белков Fas и FasL не обнаружили.

В тоже время следует отметить, что только в клетках одной линии - Ме1-7 - отсутствовал белок FasL. В других линиях меланом он был обнаружен, причем в клетках нескольких линий в очень большом количестве. Одновременное присутствие на мембране клеток и Fas и FasL при отсутствии признаков повышенного уровня спонтанного апоптоза в культуре клеток свидетельствует о нарушении проведения сигнала индукции клеточной гибели при связывании Fas с FasL. Такой косвенно выявляемый дефект может быть причиной того, что мы не обнаруживаем связи между уровнем белка Fas и чувствительностью клеток меланом к противоопухолевым препаратам.

Кроме того, известно, что высокий уровень белка FasL на клеточной мембране, в том числе и при меланоме, - один из известных механизмов формирования иммунопривилегированных ниш в организме [185]. Поэтому наши данные о высоком уровне экспрессии белка FasL в клетках меланом человека различных линий полностью подтверждают присутствие этого механизма ускользания от иммунного ответа клеток при меланоме. Следует отметить также, что клетки двух из четырех Fas+ и трех из четырех FasL+ линий содержали высокий уровень белка MDR1, что, как показано выше, безусловно, является важнейшим фактором устойчивости клеток ко многим противоопухолевым препаратам и может искажать вклад белков системы Fas/FasL в формирование устойчивости клеток меланомы, в частности, к доксорубицину и паклитакселю.

В тоже время нельзя не отметить присутствие среди изученных линий двух линий меланом, - Вго-В19 и Ме1-4 - у которых белок Fas отсутствует. Отсутствие белка Fas на клеточной мембране клеток-мишеней также является одним из механизмов ускользания опухолевых клеток от иммунного надзора, т.к. этот белок необходим для индукции апоптоза под действием опухолеспецифических ЦТЛ. Активированные ЦТЛ содержат высокий уровень белка FasL, и индукция апоптоза клеток-мишеней в значительной степени определяется именно взаимодействием FasL на клеточной мембране ЦТЛ с белком Fas на поверхности опухолевой клетки. Действительно, в специальной серии экспериментов было показано (табл.15), что в клетках меланомы линии Вго-В19, в которых отсутствует белок Fas, не удается индуцировать апоптоз с участием ЦТЛ. Причиной устойчивости клеток меланомы к индукции апоптоза могут быть и дефекты в системе проведения сигнала индукции апоптоза, предполагаемые в этих клетках, как отмечено выше, из-за одновременного присутствия белков Fas и FasL. Другими механизмами лизиса опухолевых клеток под действием ЦТЛ является система TRAILR/TRAIL и перфорин-гранзимовый механизм. Оба эти пути индукции апоптоза опухолевых клеток развиваются с использованием общих элементов с системой Fas/FasL в формировании DISC, в случае TRAILR/TRAIL (рис.2), и проведении сигнала апоптоза [34, 35, 36]. Поэтому полное отсутствие ЦТ А опухолеспецифических ЦТЛ в отношении Fas" линии Вго-В19 подтверждает предположение о присутствии дефектов в системе проведения сигналов индукции апоптоза по внешнему пути или высокой активности ингибиторов этого пути развития апоптоза.

Таким образом, в меланоме содержание белков Fas и FasL не может служить маркером устойчивости этих клеток к действию противоопухолевых препаратов. В тоже время как отсутствие белка Fas, так и высокий уровень белка FasL свидетельствуют об устойчивости таких опухолевых клеток к действию опухолеспецифических ЦТЛ, а, следовательно, и об устойчивости таких опухолей ко многим методам клеточной иммунотерапии. Поэтому иммуноцитохимическое выявление этих белков в опухолевой ткани может иметь прогностическое значение при выборе в качестве метода лечения меланомы иммунотерапии.

Следует отметить, что клетки отдельных линий меланомы, полученных от разных больных, существенно различались по многим изученным показателям. Это является отражением значительных особенностей клеток меланомы у конкретных пациентов и требует разработки индивидуального подхода в выборе лечения этого тяжелого заболевания. Наряду с противоопухолевыми препаратами, используемыми при химиотерапии, в индукции гибели клеток меланомы важную роль могут играть биологически активные препараты, регулирующие рост или индукцию апоптоза опухолевых клеток. К числу последних относится рекомбинантный цитокин MIS человека, который выделен и очищен в ГУЗ МНИИМЭ.

В нашем исследовании при использовании меченного ФИТЦ rhMIS показано, что этот белок связывается с поверхностью клеточной мембраны опухолевых клеток и уровень рецепторов MIS на клеточной мембране пропорционален содержанию этого белка в клетке.

При сопоставлении выживаемости этих клеток с уровнем связывания rhMIS-ФИТЦ с плазматической мембраной опухолевых клеток человека обнаружена обратная, статистически значимая корреляция выживаемости клеток в присутствии rhMIS с уровнем связывания rhMIS на клеточной мембране (рис.25А). Полученные результаты позволили заключить, что rhMIS обладает антипролиферативной активностью в отношении клеток меланомы человека, имеющих рецепторы к этому белку, при этом повторная обработка клеток этим препаратом повышает его антипролиферативное действие. При исследовании совместного действия белка rhMIS и основного противомеланомного препарата дакарбазина обнаружено, что rhMIS сенсибилизирует клетки меланомы к действию дакарбазина при добавлении к клеткам за 30 минут до внесения противоопухолевого препарата. Повторная обработка клеток белком rhMIS приводит к усилению его сенсибилизирующего действия. Полученные результаты позволяют заключить, что белок rhMIS может служить эффективным модификатором биологического ответа клеток меланомы человека на дакарбазин - наиболее эффективный при этом заболевании противоопухолевый препарат.

Заключая анализ результатов изучения биохимических механизмов формирования высокой устойчивости клеток меланомы человека к противоопухолевым препаратам следует отметить, что наиболее значимым универсальным фактором устойчивости представляется высокий уровень белка Hsp70, количественное определение которого может иметь прогностическое значение. Высокий уровень белка MDR1 не влияет на чувствительность клеток к дакарбазину - наиболее широко используемому при меланоме препарату. Поэтому этот белок будет иметь прогностическое значение только в случае использования препаратов, являющихся субстратами этого транспортера. Обнаруженный в клетках меланом интенсивный VP-зависимый выброс Rho-123, отражающий активность не идентифицированных белков-транспортеров, является важным компонентом механизма их природной устойчивости. Изученные препараты БТОГ, цитокин rhMIS в сочетании с дакарбазином и использование VP для сенсибилизации меланом к дакарбазину являются новыми подходами, позволяющими повысить эффективность химиотерапевтических средств в отношении клеток меланомы. Однако важнейшим фактором устойчивости клеток меланом различных линий является присутствие значительной фракции высокорезистентных клеток, составляющих SP. Важнейшей задачей будущих исследований должен стать поиск способов элиминации или блокирования этих клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кондрашева, Ирина Григорьевна, Москва

1. Dupin Е, Le Douarin NM Development of melanocyte precursors from the vertebrate neural crest//Oncogene. 2003. - Vol. 22(20). - P. 3016-3023.

2. Кошевенко Ю.Н. Кожа человека. M.: Медицина. - 2006. - Т. 1.- 357с.

3. Клинические рекомендации//Под ред. Чиссова В.И., Дарьяловой C.JI. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 720 с.

4. Chin L., Garraway L.A. and Fisher D.E. Malignant melanoma: genetics and therapeutics in the genomic era//Genes Dev. 2006. Vol. 20(16). - P. 2149-2182.

5. Онкология/под ред. Чиссова В.И., Дарьяловой C.JI. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 560 с.

6. Клиническая диагностика меланомы кожи /Avril M.F., Cascinelli N. et al.; под ред. Л.В.Демидова. 2007. - 360 с.

7. Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний/Егоров Г.Н; под ред. Н.И. Переводчиковой. М.: Практическая медицина, 2005. - с. 177182.

8. Balch С.М. Cutaneous melanoma: prognosis and treatment results worldwide//Semin. Surg. Oncol. 1992. - Vol. 8. - P. 400-414.

9. Северин С.Е., Москалева Е.Ю. Новые методы клеточной противоопухолевой терапии//Вестник НИИ молекулярной медицины. М.: "Издательский дом "Русский врач", 2007. - Выпуск 7. - С. 51-76.

10. Serrone L, Hersey P. The chemoresistance of human malignant melanoma: an update//Melanoma Res. 1999. - Vol. 9(1). - P. 51-58.

11. Helmbach H, Sinha P, Schadendorf D. Human melanoma: drug resistance/ZRecent Results Cancer Res. 2003. - Vol. 161. - P. 93-110.

12. Жестянников В.Д. Репарация ДНК и ее биологическое значение.- Л.: Наука.-1979. С. 285.

13. Москалева Е.Ю., Илюшина Н.А. Повреждения ДНК при действии ионизирующих излучений и их репарация.- М.: Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Радиационная биология. 1990. - Т. 9. - С. 3-113.

14. Белушкина Н.Н., Белецкий И.П., Молекулярно-медицинские аспекты клеточной гибели. В книге "Введение в молекулярную медицину"//под ред. М.А. Пальцева, М.: Медицина. 2004. - с. 414-444.

15. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза//УРСС. Москва. - 2002. - 320 с.

16. Москалева Е.Ю., Северин С.Е. Возможные механизмы адаптации клетки к повреждениям, индуцирующим программируемую гибель. Связь с патологией./ЛТатологическая физиология. 2006. - №2. - С. 5-12.

17. Ashkenasi A., Dixi V.M. Death receptors: signalling and modulation//Science. 1998. -Vol. 281.-P. 1305-1308.

18. Beyaeit R. VLG, Heyninck K, Vandenabeele P. Signaling to gene activation and cell death by tumor necrosis factor receptors and Fas//Int. Rev. Cyt. 2002. -Vol. 214.-P. 225-272.

19. Boldin M.P., Goncharov T.M., Goltsev Y.V., Wailad D. Involvement of MACH, a novel MORTl/FADD-imeracting protease, in Fas/APO-1- and TNF receptor-induced cell death//Cell. 1996. - Vol. 85. - P. 803-815.

20. Strasser A, Harris A.W., Huang D.C., Krammer P.H., Cory S. Bcl-2 and Fas/APO-1 regulate distinct pathways to lymphocyte apoptosis//EMBO J. — 1995. -Vol. 14.-P. 6136-6147.

21. Karin M., Lin A. NF-/cB at the crossroads of life and death//Nature immunol. 2002. - Vol. 3. - P. 221-227.

22. Ashkenazi A., Pai R.C., Fong S. et al/ Safety and antitumor activity of recombinant soluble Apo-2 ligand//J. Clin. Invest. 1999. - Vol. 104. - P. 155162.

23. Scaffidi C., Fulda S., Srivivisan et al. Two CD95(APO-l/Fas) signalling pathways//EMBО J. 1998. - Vol. 17. - P. 1675-1687.

24. Fulda S., Meyer E., Friesen C. et al. Cell type specific involvment of death receptors and mitochondrial pathways in drug-induced apoptosis//Oncogene. — 2001. Vol. 20. -P. 1063-1075.

25. Memon S.A, Moreno M.B, Petrak D, Zacharchuk C.M. Bcl-2 blocks glucocorticoid- but not Fas- or activation-induced apoptosis in a T-cell hybridoma//Jmmunol. 1995. - Vol. 155. - P. 4644-4652.

26. Lacronique V, Mignon A, Fabre M, Viollet B, Rouquet N, Molina T, Porteu A, Henrion A, Bouscary D, Varlet P, Joulin V, Kahn A: Bcl-2 protects from lethal hepatic apoptosis induced by an anti-Fas antibody in mice//Nat. Med. 1996. -Vol. 2.-P. 79-86.

27. Friesen C, Fulda S, Debatin K.M. Cytotoxic drugs and the CD95 pathway//Leukemia. 1999. - Vol. 13(11). - P. 1854-1858. Review.

28. Fulda S, Friesen C, Debatin K.M. Molecular determinants of apoptosis induced by cytotoxic drugs//Klin. Padiatr. 1998. - Vol. 210(4). - P. 148-152.

29. Fulda S, Los M, Friesen C, Debatin K.M. Chemosensitivity of solid tumor cells in vitro is related to activation of the CD95 system//Int. J. Cancer. 1998. -Vol. 76(1).-P. 105-114.

30. Los M, Hen-1, Friesen C, Fulda S, Schulze-Osthoff K, Debatin K.M. Cross-resistance of CD95- and drug-induced apoptosis as a consequence of deficient activation of caspases (ICE/Ced-3 proteases)//Blood. 1997. - Vol. 90(8). - P. 3118-3129.

31. Friesen C, Fulda S, Debatin K.M. Deficient activation of the CD95 (APO-1/Fas) system in drug-resistant cells/ZLeukemia. 1997. - Vol. 11(11). - P. 18331841.

32. Tolomeo M., Dusonchet L., Meli M., Grimaudo S., D'Alessandro N., Papoff G., Ruberti G., Rausa L. The CD95/CD95 ligand system is not the major effector in anticancer drug-mediated apoptosis//Cell Death Differ. 1998. - Vol. 5(9). - P. 735-742.

33. Tomas W.D., Hersey P. CD4 T cells kill melanoma cells by mechanisms that are independent of Fas(CD95)//Int. J. Cancer. 1998. - Vol. 75(3). - P. 384-390.

34. Rivoltini L. Human melanoma-reactive CD4+ and CD8+ CTL clones resist Fas ligand- induced apoptosis and use Fas/FasL-independent mechanisms for tumor killing//J. Immunol. 1998. - Vol. 161(3). - P. -1220-1230.

35. Shukuwa Т., Katayama I., Takehiko K. Fas-mediated apoptosis of melanoma cells and infiltrating lymphocytes in human malignant melanomas//Mod. Pathol. 2002. - Vol. 15(4). - P. 387-396.

36. Rivoltini L., Carraba M., Huber V., Castelly C., Novellino L., Dalerba P., Mortarini R., Arancia A., Immunity to cancer: attack and escape in T lymphocyte-tumor cell interaction//Immunol. Rewiews. 2002. - Vol. 188. - P. 97-113.

37. Classen C.F., Fulda C., Debatin K.M. Decreased sensitivity of drug-resistant cells towards T cell cytotoxicity//Leukemia. 1999. - Vol. 13(3). - P. 410-418.

38. Owen-Schaub L, Chan H, Cusack JC, Roth J, Hill LL Fas and Fas ligand interactions in malignant disease/Ant. J. Oncol. 2000. - Vol. 17(1). - P. 5-12.

39. Micheau O., Solary E., Hammann A., Dimanche-Boitrel M.T. Fas-ligand independent, FADD-mediated activation of the Fas death pathway by anticancer drugs//J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 7987-7992.

40. Landovski Т.Н., Qu N., Buyksal I. et al. Mutations in Fas antigen in patients with multiple mieloma//Blood. 1997. - Vol. 90. - P. 4266-4270.

41. Tschopp J., Irmler M., Thome M. Inhibition of Fas death signals by FLIPs//Curr. Opin. Immunol. 1998. - Vol. 10. - P. 552-558.

42. Xiao C., Yang B.F, Asadi N et al. TRAIL-induced death inducing signaling complex and its modulation by c-FLIP and PED/PEA-15 in glioma cells//J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 25020-25025.

43. Adams J.M, Cory S. Apoptosomes: Engines for caspase activation//Curr. Opin. Cell Biol. 2002. - Vol. 14. - P. 715-720.

44. Zou H, Henzel WJ, Liu X, Lulschg A, Wang X: Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3//Cell. 1997. - Vol. 90. - P. 405-413.

45. Jiang X, Wang X: Cytochrome promotes caspase-9 activation by inducing nucleotide binding to Apaf-1//J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. - P. 3119931203.

46. Stennieke H.R, Devcraux Q.L, Humke E. et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing//J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 8359-8362.

47. Slee E.A, Harte M.T, Kluclc R. et al. Ordering the cytochrome С initiated caspase cascade: Hierarchical activation of caspases-2,-3,-6,-7,-8 and-10 in a caspase-9 - dependent manner//! Cell Biol. - 1999. - Vol. 144. - P. 281-292.

48. Susin S.A, Lorenzo H.K, Zamzami N. et al. Molecular characterization of mitochondria apoptosis inducing factor//Nature. 1999. - Vol. 397. - P. 441-446.

49. Susin S.A, Daugas E, Ravagnan L. et al. Two distinct pathways leading to nuclear apoptosis//J. Exp. Med. 2000. - Vol. 192. - P. 571-580.

50. Li L.Y, Luo X, Wang X: Endonuclease G is an apoptotic DNase when released from mitochondria.//Nature. 2001. - Vol.412. - P. 95-99.

51. Van Loo G, Schotte P, van Gurp M. et al. Endonuclease G: A mitochondria protein released in apoptosis and involved in caspase-independent DNA degradation//Cell Death. Differ. 2001. - Vol. 8. - P. 1136-1142.

52. Widlak P, Li L.Y, Wang X, Garrard W.T Action of recombinant human apoptotic endonuclease G on naked DNA and chromatin substrates: Cooperation with exonuclease and DNase I//J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 4840448409.

53. Verhagen A.M., Ekert P.G., Pakusch M. Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing TAP proteins//Cell. 2000. - Vol. 102. - P. 43-53.

54. Du C., Fang M., Li Y. et al. Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition//Cell. 2000. - Vol. 102. - P. 33-42.

55. Huang H, Joazeiro C.A, Bonfoco E, et al. The inhibitor of apoptosis, cIAP2, functions as a ubiquitin-protein ligase and promotes in vitro monoubiquitination of caspases-3 and 7//J. Biol. Chem. -2000. Vol. 275.-P. 26661-26664.

56. Gray C.W, Ward R.V, Karran E. et al. Characterization of human HtrA2, a novel serine protease involved in the mammalian cellular stress response//Eur. J. Biochem. 2000. - Vol. 267. - P. 5699-5710.

57. Martins L.M, Laccarino I, Tenev I. et al. The serine protease Omi/HtrA2 regulates apoptosis by binding XIAP through a reaper-like motif//J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 439-444.

58. Faccio L, Fusco C, Chen A. et al. Characterization of a novel human serine protease that has extensive homology to bacterial heat-shock endoprotease HtrA and is regulated by kidney ischemia//J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275. - P. 2581-2588.

59. Dohi Т., Beltrami E., Wall N.R., et al. Mitochondrial surviving inhibits apoptosis and promotes tumorigenesis//J. Cli. Invest. 2004. - Vol. 114(8). - P. 1117-1127.

60. Narita M, Shimizu S, Ito T. et al. Bax interacts with the permeability transition pore to induce permeability transition and cytochrome с release in isolated mitochondria//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol.'95. - P. 14681-14686.

61. Marzo I, Brenner C, Zamzanii N. Bax and adenine nucleotide translocator cooperate in the mitochondrial control of apoptosis//Science. 1998. - Vol. 281. -P. 2027-2031.

62. Schendel S.L, Azimov R, Pawlowski K. Ion channel activity of the only Bcl-2 family member, BID//J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 21932-21936.

63. Kudla G, Montessuit S, Eskes R. et al. The destabilization of lipid membranes induced by the C-terminal fragment of caspase-8-cleaved bid is inhibited by the N-terminal fragment/Л. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275. - P. 22713-22718.

64. Woo R.A., McLure K.G, Lees Miller S.P et al. DNA-dependent kinase acts upstreem of p53 in response to DNA damage//Nature. 1998. - Vol. 394. - P. 700-704.

65. Morrison С., Sonoda E., Takano N et al. The controlling role of ATM in homologous recombinational repair of DNA damage//EMBO J. 2000. - Vol. 19. -P. 463-471.

66. Canman Ch.E., Kastan M.B. Role p53 in apoptosis//Advances in pharmacol.- 1997. Vol. 41. -P. 429-460.

67. Oda E, Ohki R, Murasawa H.et al. Noxa, a ВНЗ-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis/VScience. 2000. -Vol. 288.-P. 1053-1058.

68. Nakano K, Vousden K.H. PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced by p53//Mol. Cell. 2001. - Vol. 7. - P. 683-694.

69. Cox L.S., Hupp Т., Midgley C.A., Lane D.P. A direct effect of activated human p53 on nuclear DNA replication//EMBO J. 1995. - Vol. 14. - P. 20992105.

70. Wang X.W., Forrester K., Yeh H. et al. Hepatitis В virus X protein inhibits p53 sequence-specific DNA binding, transcriptional activity, and association with transcription factor ERC3//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 2230-2234.

71. Wang X.W., Vermeulen W., Coursen J.D. et al. The X PB and X PD helicases are components of the p53-mediated apoptosis pathway//Genet. Dev. -1996.-Vol. 10.-P. 1219-1232.

72. Blagosklonny M.V, El-Dairy W.S., Acute overexpression in wt p53 facilitates anticancer drug-inducer death of cancer and normal cells/Tint. J. Cancer.- 1998. Vol. 75. - P. 933-940.

73. Komarov P.G, Komarova E.A., Kondratov R.V. et al. A chemical inhibitor of p53 that protects mice from the side effects of cancer therapy//Science. 1999. -Vol. 285.-P. 1733-1737.

74. Zhivotovsky B, Orrenius S. Defects in the apoptotic machinery of cancer cells: role in drug resistance//Semin. Cancer Biol. — 2003. Vol. 13(2). - P. 125134.

75. Marimoto R.I. Cells in stress: transcriptional activation of heat shock genes//Science. 1993. - Vol. 259. - P. 1409-14100.

76. Frydman J. Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones//Ann. Rev. Biochem. 2001. - Vol. 70. - P. 603-647.

77. Solary E., Droin N., Sordet O. et al. Cell death pathways as targets for anticancer drugs/Яп "Anticancer Drug Development" Academic Press. 2002. -P. 55-76.

78. Samali A., Cai J., Zhivotovsky В., et al. Presence of a proapoptotic complex of procaspase-3, Hsp60 and Hsp 10 in the mitochondrial fraction of Jurlcat cells//EMBO J. 1999. - Vol. 18. - P. 2040-2048.

79. Xanthoudakis S., Roy S., Rasper D. et al. Hsp60 accelerates the maturation of pro-caspase-3 by upstream activator proteases during apoptosis//EMBO J. -1999. Vol. 18. - P. 2049-2056.

80. Gabai V.L., Meriin A., Mosser A.B., et al. Hsp70 prevents activation of stress kinases. A novel pathway of cellular thermotolerance//J. Biol. Chem. -1997.-Vol. 272.-P. 18033-18037.

81. Jaattela M. Heat shock proteins as cellular lifeguards//Ann. Med.-- 1999. -Vol. 31.-P. 261-271.

82. Jaattela M., Wissing D., Kokholm K., et al. Hsp70 exerts its anti-apoptotic function downstream of caspase-3-like proteases//EMBO J. 1998. - Vol. 17. -P. 6124-6134.

83. Mehlen P., Schulze-Osthoff K., Arrigo A.P. Smoll stress proteins as novel regulators of apoptosis. Heat shock protein 27 blocks Fas/APO-1- and staurosporine-induced cell death//! Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. - P. 16510 -16514.

84. Garido C., Ottavi P., Fromentin A. et al. HSP27 as a mediator of confluence-dependent resistance to cell death induced by anticancer drugs//Cancer Res.1997.-Vol. 57.-P. 2661-2667.

85. Garido C., Fromentin A., Bonnote В., et al. Heat shock protein 27 enhances the tumorigenicity of immunogenic rat colon carcinoma cell clones//Cancer Res.1998. Vol. 58. - P. 5495-5499.

86. Garido C., Bruey J., Fromentin A. et al. HSP27 inhibits cytochrome с -dependent activation of procaspase-9//FASEB J. 1999. - Vol. 13. - P. 20612070.

87. Schmitt E, Gehrmann M, Brunet M, Multhoff G, Garrido C. Intracellular and extracellular functions of heat shock proteins: repercussions in cancer therapy/Л. Leukoc. Biol. 2007. - Vol. 81(1). - P. 15-27.

88. Parcellier A, Gurbuxani S, Schmitt E, Solary E, Garrido C. Heat shock proteins, cellular chaperones that modulate mitochondrial cell death pathways/ZBiochem. Biophys. Res. Commun. 2003. - Vol. 304(3). - P. 505-512.

89. Grossman D, Altieri DC. Drug resistance in melanoma: mechanisms, apoptosis, and new potential therapeutic targets//Cancer Metastasis Rev. 2001. -Vol. 20.-P. 3-11.

90. Bradbury P.A., Middleton M.R. DNA repair pathways in drug resistance in melanoma//Anticancer Drugs. 2004. - Vol. 15(5). - P. 421- 426.

91. Zhang XY, Zhang XD, Borrow JM, Nguyen T, Hersey P Translational control of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand death receptor expression in melanoma cells//J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279(11). - P. 1060610614.

92. Piras F, Perra MT, Murtas D, Minerba L, Floris C, Maxia C, Demurtas P, Ugalde J, Ribatti D, Sirigu P. Combinations of apoptosis and cell-cycle control biomarkers predict the outcome of human melanoma//Oncol. Rep. 2008. - Vol. 20(2).-P. 271-277.

93. Liu T, Biddle D, Hanks AN, Brouha B, Yan H, Lee RM, Leachman SA, Grossman D. Activation of dual apoptotic pathways in human melanocytes and protection by surviving//J. Invest. Dermatol. 2006. - Vol. 126(10). - P. 22472256.

94. Lazaris AC, Theodoropoulos GE, Aroni K, Saetta A, Davaris PS. Immunohistochemical expression of C-myc oncogene, heat shock protein 70 and HLA-DR molecules in malignant cutaneous melanoma.//Virchows Arch. 1995. -Vol. 426(5).-P. 461-467.

95. Ricaniadis N, Kataki A, Agnantis N, Androulakis G, Karakousis CP. Long-term prognostic significance of HSP-70, c-myc and HLA-DR expression in patients with malignant melanoma//Eur. J. Surg. Oncol. 2001. - Vol. 27(1), - P. 88-93.

96. Kalogeraki A, Garbagnati F, Darivianaki K, Delides GS, Santinami M, Stathopoulos EN, Zoras O. HSP-70, C-myc and HLA-DR expression in patients with cutaneous malignant melanoma metastatic in lymph nodes//Anticancer Res. 2006. -Vol. 26. - P.3551-3554.

97. Choi Ch.-H. ABC transporters as multidrug resistance mechanisms and the development of chemosensitizers for their reversal//Cancer Cell International. -2005.-Vol. 5.-P. 30-43.

98. Dean M. The genetics of ATP-binding cassette transporters//Methods Enzymol. 2005. - Vol. 400. - P. 409-429.

99. Dean M, Hamon Y, Chimini G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily//J. Lipid Res. 2001. - Vol. 42(7). - P. 1007-1017.

100. Gottesman M.M., Fojo Т., Bates S.E. Multidrug resistance in cancer: role of ATP-dependent transporters//Nat. Rev. Cancer. 2002. - Vol. 2. - P.48-58.

101. Goodell M.A., Rosenzweig M., Kim H., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species//Nat. Med. 1997. - Vol. 3. - P. 1337-1345.

102. Reya Т., Morrison S.J., Clarke M.F., Weissman I.L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells//Nature. 2001. - Vol. 414. - P.105-111.

103. Sell S. Stem cell origin of cancer and differentiation therapy//Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2004. - Vol.51. - P. 1-28.

104. Bjerkvig R., Tysnes B.B., Aboody K.S., et al. The origin of the cancer stem cell: current controversies and new insights//Nat. Rev. Cancer. 2005. - Vol. 5. -P.899-904.

105. Dalerba P., Cho R.W., Clarke M.F. Cancer stem cells: models and concepts//Annu. Rev. Med. 2007. - Vol. 58. - P.267-284.

106. Zhou S., Schuetz J.D., Bunting K.D. et al. The ABC transporter Bcrpl/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype//Nat. Med. 2001. - Vol. 7. - P. 1028-1034.

107. Hirschmann-Jax C., Foster A.E., Wulf G.G. et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - Vol. 101. - P. 14228-14233.

108. Wang J., Guo L.P., Chen L.Z. et al. Identification of cancer stem cell-like side population cells in human nasopharyngeal carcinoma cell line//Cancer Research.- 2007. Vol. 67. - P.3716-3724.

109. Zen Y., Fujii Т., Yoshikawa S. et al. Histological and culture studies with respect to ABCG2 expression support the existence of a cancer cell hierarchy in human hepatocellular carcinoma//Am. J. Pathol. 2007.- Vol. 170. - P.1750-1762.

110. Raghu G., Park S.W., Roninson I.B., Mechetner E.B. Monoclonal antibodies against P-glycoprotein, an MDR1 gene product, inhibit interleukin-2 release from PHA-activated lymphocytes//Exp. Hematol. 1996. - Vol. 24. - P. 1258-1264.

111. Drach J., Gsur A., Hamilton G. et al. Involvement of P-glycoprotein in the transmembrane transport of interleukin-2 (IL-2), IL-4, and mterferon-7 in normal human T lymphocytes//Blood. 1996. - Vol. 88. - P.1747-1754.

112. Dean M., Fojo Т., Bates S. Tumour stem cells and drug resistance//Nat. Rev. Cancer. 2005. - Vol. 5. - P.275-284.

113. Berger W, Hauptmann E, Elbling L, Vetterlein M, Kokoschka EM, Micksche M. Possible role of the multidrug resistance-associated protein (MRP) in chemoresistance of human melanoma cells/Ant. J. Cancer. 1997. - Vol. 71(1). -P. 108-115.

114. Frank N.Y., Margaryan A., Huang Y. ABCB5-mediated doxorubicin transport and chemoresistance in human malignant melanoma//Cancer Res. -2005. Vol. 65. - P.4320-4333.

115. Duelli D., Lazebnik Y. Cell fusion: a hidden enemy?//Cancer Cell. 2003. -Vol. 3. - P.445-448.

116. Aleman C., Annereau J.P., Liang X.J. et al. P-glycoprotein, expressed in multidrug resistant cells, is not responsible for alterations in membrane fluidity or membrane potential//Cancer Res. 2003. - Vol. 63. - P.3084-3091.

117. Donnenberg VS, Donnenberg AD. Multiple drug resistance in cancer revisited: the cancer stem cell hypothesis//J. Clin. Pharmacol. 2005. - Vol.45(8). -P. 872-877.

118. La Porta C.A. Drug resistance in melanoma: new perspectives//Curr. Med. Chem. 2007. - Vol. 14(4). - P. 387-391.

119. Lee CH. Reversing agents for ATP-binding cassette (ABC) transporters: application in modulating multidrug resistance (MDR)//Curr. Med. Chem. Anticancer Agents. 2004. - Vol. 4(1). - P. 43-52.

120. Limtrakul P. Curcumin as chemosensitizer//Adv. Exp. Med. Biol. 2007. -Vol. 595. - P. 269-300.

121. Lane A.H., Donahoe P.K. New insights into Mullerian inhibiting substance and its mechanism of action//J. Endocrinol. 1998. - Vol. 158. - P. 1-6.

122. Jost A. Problems of fetal endocrinology: the gonadal and hypophyseal hormones/ZRecent Prog. Horm. Res. 1953. - Vol. 8. - P. 379-418.

123. Barbie T.U., Barbie D.A., MacLaughlin D.T. et al. Mullerian Inhibiting Substance inhibits cervical cancer cell growth via a pathway involving pi30 and pl07//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100, N 26. - P. 15601-15606.

124. Fuller A.F., Budzik G.P., Krane I.M., Donahoe P.K. Mullerian inhibiting substance inhibition of a human endometrial carcinoma cell line xenografted in nude mice//Gynecol. Oncol. 1984. - Vol. 17. - P. 124-132.

125. Ha T.U., Segev D.L., Barbie D. et al. Mullerian inhibiting substance inhibits ovarian cell growth through an Rb-independent mechanism//J. Biol. Chem. -2000. Vol. 275. - P. 37101-37109.

126. Segev D.L., Ha T.U., Tran T.T. et al. Mtillerian Inhibiting Substance Inhibits Breast Cancer Cell Growth through an NF/cB-mediated Pathway//! Biol. Chem. -2000. Vol. 275, N 37. - P. 28371-28379.

127. Segev D.L., Hoshiya Y., Hoshiya M. et al. Mullerian-inhibiting substance regulates NF-кВ signaling in the prostate in vitro and in vivo//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - Vol. 99. - P. 239-244.

128. Гукасова H.B., Северин C.E. Белок MIS структура, регуляция экспрессии и молекулярный механизм действия//Вопр. биол. мед. и фарм. химии. - 2005. - № 4. - С. 3-9.

129. Гукасова Н.В., Северин С.Е. Биологические функции белка MIS, его противоопухолевая активность и перспективы клинического применения//Вопр. биол. мед. и фарм. химии. 2006. - № 1. - С. 3-9.

130. Cate R.L., Donahoe Р.К., MacLaughlin D.T. Mullerian inhibiting substance//Peptide Growth Factors and Their Receptors II//Eds. Sporn M.B., Roberts A.B. Berlin: Springer- Verlag. - 1990. - P. 179-210.

131. Cate R.L., Mattaliano R.J., Hession C. et al. Isolation of the bovine and human genes for Mullerian inhibiting substance and expression of the human gene in animal cells//Cell. 1986. - Vol. 45. - P. 685-698.

132. Lorenzo H.K., Teixeira J., Pahlavan N. et al. New approaches for high-yield purification of Mullerian inhibiting substance improves its bioactivity//J. Chromatogr. 2002. - Vol. 766. - P. 89-98.

133. Ragin R.C., Donahoe P.K., Kenneally M.K. et al. Human Mullerian inhibiting substance: enhanced purification imparts biochemical stability and restores antiproliferative effects//Protein. Expr. Purif.- 1992. -Vol. 3. P.236-245.

134. Teixeira J., Maheswaran S., Donahoe P.K. Mullerian inhibiting substance: an instructive developmental hormone with diagnostic and possible therapeutic applications/ZEndocr. Rev. 2001. - Vol. 22. - P.657-674.

135. Massague J. TGF-B signal transduction//Annu. Rev. Biochem. 1998. - Vol. 67. - P.753-791.

136. Wrana J.L. Regulation of Smad activity//Cell. 2000. - Vol.100.- P. 189-192.

137. Massague J., Wotton D. Transcriptional control by the TGF-B/Smad signaling system // EMBO J. 2000. - Vol. 19. - P. 1745-1754.

138. Clemente N. Di, Josso N., Gouedard L., Belville C. Components of the anti-Mullerian hormone signaling pathway in gonads // Mol. Cell. Endocrinol. 2003. -Vol. 211.-P. 9-14.

139. Visser J.А. АМН signaling: from receptor to target gene//Mol. Cell. Endocrinol. 2003. - Vol. 211. - P.65-73.

140. Teixeira J., He W.W., Shah P.C. et al. Developmental expression of a candidate Miillerian inhibiting substance type II receptor//Endocrinology. 1996. -Vol. 137.-P. 160-165.

141. Segev D.L., Hoshiya Y., Stephen A.E. et al. Miillerian Inhibiting Substance Regulates NF-/cB Signaling and Growth of Mammary Epithelial Cells in Vivo//J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276, N 29. - P. 26799-26806.

142. Hoshiya Y., Gupta V., Segev D. L. et al. Mullerian Inhibiting Substance induces NFkB signaling in breast and prostate cancer cells//Mol. Cell. Endocrinol. -2003.-Vol. 211.-P. 43-49.

143. Parry R. L., Chin T. W., Epstein J. et al. Recombinant human mullerian inhibiting substance inhibits human ocular melanoma cell lines in vitro and in vivo//Cancer Res. 1992. - Vol. 52. - P. 1182-1186.

144. Chin Т., Parry R. L., Donahoe P. K. Human Mullerian inhibiting substance inhibits tumor growth in vitro and in vivo//Cancer Res. 1991. - Vol. 51. -P.2101-2106.

145. Stephen A. E., Pearsall L. A., Christian B. P. et al. Highly Purified Mullerian Inhibiting Substance Inhibits Human Ovarian Cancer in Vivo//Clinical Cancer Res. 2002. - Vol. 8. - P. 2640-2646.

146. Stephen A.E., Masiakos P.T., Segev D.L. et al. Tissue-engineered cells producing complex recombinant proteins inhibit ovarian cancer in vivo//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - Vol. 98. - P. 3214-3219.

147. Fuller A. F., Krane I. M., Budzik G. P., Donahoe P. K. Miillerian inhibiting substance reduction of colony growth of human gynecologic cancers in a stem cell assay//Gynecol. Oncol. 1985. - Vol. 22. - P. 135-148.

148. Hoshiya Y., Gupta V., Kawakubo H. et al. Mullerian Inhibiting Substance Promotes Interferon 7-induced Gene Expression and Apoptosis in Breast Cancer Cells//J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278, N 51. - P. 51703-51712.

149. Mossman Т. Rapid colorimetric assay for cellular growth and cytotoxicity assays//J. Immunol. Meth. 1983. - Vol. 65. - P. 55-63.

150. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications//Proc Natl Acad Sci USA. 1979. - Vol. 76. - P. 4350-4354.

151. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

152. Родина A.B., Москалева Е.Ю., Беляев Д.Л. и др. Получение функционально активных дендритных клеток человека с использованием препарата лейкинферон в качестве индуктора созревания//Аллергия, астма и клиническая иммунология. 2003. - № 9 - 19-27.

153. Goodell M.A., Brose К., Paradis G. et al. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo//J. Exp. Med. -1996.- V.183. P.1797-1806.

154. Monzani E., Facchetti F., Galmozzi E. et al. Melanoma contains CD 133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential//Eur. J. Cancer. -2007.-Vol. 43.-P. 935-946.

155. Robey R.W., Steadman K., Polgar O., Morisaki K., Blayney M., Mistry P., Bates S.E. Pheophorbide a is a specific probe for ABCG2 function and inhibition/ZCancer Res. 2004. - Vol. 64. - P. 1242-1246.

156. Kruger J.A., Kaplan C.D., Yunping Luo, He Zhou, Markowitz D., Xiang R. and Reisfeld R.A. Characterization of stem cell-like cancer cells in immune-competent mice//Blood. 2006. - Vol. 108. - P. 3906-3912.

157. Wang S., Diller K.R., Aggarwal S.J. Kinetics Study of Endogenous Heat Shock Protein 70 Expression//Journal of Biomechanical Engineering. 2003. -Vol. 125.-P. 794-797.

158. Welch W.J., Suhan J.P. Cellular and biochemical events in mammalian cells during and after recovery from phisiological stress//J. Cell. Biol. 1986. - Vol. 103.-P. 2035-2052.

159. Blom D.J., De Waard-Siebinga I., Apte R.S. et al. Effect of hyperthermia on expression of histocompatibility antigens and heat-shock protein molecules on three human ocular melanoma cell lines//Melanoma Res. — 1997. Vol. 7(2) - P. 103-109.

160. Dressel R., Johnson J.P., Gunther E. Heterogeneous patterns of constitutive and heat shock induced expression of HLA-linked HSP70-1 and HSP70-2 heat shock genes in human melanoma cell lines//Melanoma Res. 1998. — Vol. 8(6) -P.482-92.

161. Ahmad S., Ahuja R., Venner T.J., Gupta R.S. Identification of a protein altered in mutants resistant to microtubule inhibitors as a member of the major heat shock protein (hsp70) family//Mol. Cell Biol. 1990. - Vol. 10(10). - P. 5160-5165.

162. Abe Т., Konishi Т., Hirano T. et al. Possible correlation between DNA damage induced by hydrogen peroxide and translocation of heat shock 70 protein into the nucleus/ZBiochem. Biophys. Res. Commun. 1995. - Vol. 206. - P.548-555.

163. Ciocca D.R., Fuqua S.A.W., Lock-Lim S. et al. Response of human breast cancer cells to heat shock and chemotherapeutic drugs // Cancer Res. 1992. -Vol. 52.-P. 3648-3654.

164. Mosser D.D., Caron A.W., Bourget L. et al. Role of the human heat shock protein hsp70 in protection against stress-induced apoptosis // Mol Cell Biol. -1997. Vol. 17. -P. 5317-5327

165. Valavanis C., Y.Hu, Y.Yang et al. Model cell lines for the study of apoptosis in vitro//Methods in cell biology. 2001. - Vol. 66. - P. 417-436.

166. Eisen M., Leibson P.J. The Fas pathway in apoptosisZ/Advances in Pharmacol. 1997. Vol. 41. - P. 107-132.

167. Schadendorf D, Makki A, Stahr C, van Dyck A, Wanner R, Scheffer GL, Flens MJ, Scheper R, Henz BM. Membrane transport proteins associated with drug resistance expressed in human melanoma.//Am. J. Pathol. 1995. - Vol. 147(6).-P. 1545-1552.

168. Yusuf RZ, Duan Z, Lamendola DE, Penson RT, Seiden MV. Paclitaxel resistance: molecular mechanisms and pharmacologic manipulation//Curr. Cancer Drug Targets. 2003. - Vol. 3(1). - P. 1-19.

Информация о работе

Кондрашева, Ирина Григорьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Изучение механизмов резистентности клеток меланомы человека к противоопухолевой терапии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы