Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ингибирования ММП-9 и ММП-13 в TGF-β-опосредованных механизмах опухолевой прогрессии клеток меланомы кожи in vivo

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Роль ингибирования ММП-9 и ММП-13 в TGF-β-опосредованных механизмах опухолевой прогрессии клеток меланомы кожи in vivo"

На правах рукописи

ПАЛКИНА Надежда Владимировна

РОЛЬ ИНГИБИРОВАНИЯ ММП-9 И ММП-13 В TGF-P-ОПОСРЕДОВАННЫХ МЕХАНИЗМАХ ОПУХОЛЕВОЙ ПРОГРЕССИИ КЛЕТОК МЕЛАНОМЫ КОЖИ IN VIVO

03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

~7 ОКТ 2015

НОВОСИБИРСК - 2015

005563106

005563106

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Рукша Татьяна Геннадьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, Вавилин Валентин Андреевич руководитель лаб. метаболизма лекарств и фармакокинетики ФГБНУ «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики»

доктор медицинских наук, профессор, Агеева Татьяна Августовна

ГБОУ ВПО «Новосибирский

государственный медицинский

университет» Минздрава России,

кафедра патологической анатомии

Ведущая организация: ФГБНУ «Институт молекулярной патологии и патоморфологии» (Новосибирск)

Защита состоится 17 ноября 2015 г. на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 при ФГБНУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины» по адресу: ул. Тимакова, 2, г. Новосибирск, 630117 Тел/факс: 8(383) 333-64-56

http://centercem.ru/nauchnaya_deyatelnost/dissertacionnyj_sovet/ С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭКМ

Автореферат разослан <<

1015-г.

Учёный секретарь диссертационного совета д.б.н.

Пальчикова Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Меланома - злокачественное новообразование кожи, возникающее вследствие трансформации меланоцитов, которое является самым смертоносным среди злокачественных новообразований кожи (Chin L. et al., 2006).

Заболеваемость и смертность от меланомы неуклонно растут как в Российской Федерации, так и в других странах мира со светлокожим населением (Каприн А.Д. и др., 2015; Karim-Kos Н.Е. et al, 2008). Также за последние несколько лет отмечен рост заболеваемости меланомой у лиц молодого возраста (Bleyer A. et al., 2009; Berk D.R. et al., 2010). Меланома ассоциирована с низкими показателями продолжительности жизни пациентов, однако в течение последних десятилетий наблюдается небольшая положительная динамика в этом отношении, что может быть обусловлено оптимизацией ранней диагностики с последующей хирургической резекцией первичной опухоли (Perrot С.Y. et al., 2013). Вместе с тем, прогноз для жизни при метастатической меланоме крайне неутешителен, 5-летняя выживаемость таких пациентов составляет лишь менее 12%, а способы лечения диссеминированной формы меланомы крайне ограничены (Tas F., 2012).

До недавнего времени для лечения метастатической меланомы в составе стандартной химиотерапии применялся только дакарбазин, но благодаря новым экспериментальным данным в современной онкологической практике появилось два препарата, одобренных для клинического применения - вемурафениб и ипилимумаб (Kudchadkar R.R., 2013). Вемурафениб является препаратом выбора для лечения меланомы у пациентов, имеющих мутацию в гене BRAF, в то время как ипилимумаб является моноклональным антителом против антигена CTLA-4 цитотоксических Т-лимфоцитов, экспрессия которого на поверхности активированных Т-клеток связана с блокированием противоопухолевого иммунного ответа (Харкевич Г.Ю. и др., 2012).

Но, несмотря на ранний терапевтический эффект этих препаратов, характеризующийся развитием быстрой и эффективной регрессии опухоли, быстро наступает лекарственная устойчивость, в частности, к BRAF-ингибиторам. Иммунопрепараты, применяющиеся в терапии меланомы кожи, характеризуются серьезными побочными эффектами, а также не имеют маркеров для выбора пациентов, чувствительных к ним. Поэтому актуальным направлением в дерматоонкологии является выявление молекулярных механизмов опухолевой прогрессии с целью поиска новых молекулярных мишеней и использование полученных данных в качестве основ для создания новых молекулярно-нацеленных препаратов терапии диссеминированной меланомы.

Степень разработанности темы исследования. Меланома характеризуется высокой гетерогенностью, ее генетический и

з

иммунологический «портрет» не является однозначным и статичным. Исследования, проводимые in vitro, показывают, что культивируемые клеточные линии меланомы производят повышенные уровни цитокинов и факторов роста с плейотропными биологическими функциями (Lazar-Molnar Е. et al., 2000), к которым относится TGF-p, являющийся прототипом молекулы многофункциональной сигнализации, то есть элементом нескольких систем сложных биологических сигналов, обеспечивающих основу для внутриклеточных и межклеточных связей клеток высших организмов, а также поддержания жизнедеятельности клетки (Verrecchia F. et al., 2002). В опухолевой ткани работа TGF-p-пути сигнальной трансдукции связана с реализацией важнейших клеточных процессов, включая рост опухоли, инвазию, уклонение от иммунного надзора, ангиогенез и метастазирование (Border W. et al., 1994).

Важную роль в биологии опухоли, начиная от инициации, васкуляризации, диссеминации до метастазирования и регуляции противоопухолевого иммунологического надзора играют также и матриксные металлопротеиназы (ММП) (Farina A.R. et al., 2014). Традиционно считалось, что ММП функционируют лишь в качестве протеолитических ферментов, воздействуя на основные компоненты экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ), но последние исследования показали, что ММП могут функционировать в качестве регуляторов путей сигнальной трансдукции, путем прямого протеолиза и косвенного регулирования других протеаз, через расщепление и инактивацию ингибиторов протеаз, и, таким образом, оказывать влияние на сигнальные молекулы, в том числе и TGF-p (Bhoopathi P. et al., 2008; Григорьева И.Н., 2010; Farina A.R. et al., 2014).

В этой связи является актуальным исследование взаимоотношение ряда модуляторов опухолевого роста и прогрессии и, в частности, функционирование ММП в качестве регуляторов активации TGF-p-пути сигнальной трансдукции на модели меланомы кожи in vivo, с целью разъяснения механизмов меланомагенеза, что может быть использовано в дальнейшем для выработки новых подходов в терапии меланомы кожи.

Цель исследования. Исследовать роль ингибирования матриксных металлопротеиназ-9/13 на экспрессию TGF-p и ассоциированных с ним особенностей опухолевой прогрессии на модели меланомы кожи in vivo.

Задачи исследования:

1. Исследовать изменение экспрессии TGF-p 1 и Twist 1 при селективном ингибировании ММП-9 и сочетанном ингибировании ММП-9 и ММП-13, в динамике опухолевого роста в клетках меланомы кожи in vivo, а также в клетках нормальной кожи.

2. Оценить морфометрические показатели опухолевого роста, особенности показателей динамики опухолевого роста, пролиферации клеток и лимфоцитарной инфильтрации в очагах первичной меланомы при селективном ингибировании ММП-9 и сочетанном ингибировании ММП-9 и ММП-13.

3. Определить характер экспрессии онко-микроРНК miR-21 и miR-let-7b в клетках меланомы при селективном ингибировании ММП-9 и сочетанном ингибировании ММП-9 и ММП-13 in vivo.

4. Выявить механизмы развития меланомы кожи, ассоциированные с изменениями функционирования ММП-9/13.

Научная новизна:

1. Впервые в клетках меланомы кожи in vivo проведена оценка влияния селективного ингибирования ММП-9 и сочетанного ингибирования ММП-9 и ММП-13 на уровни экспрессии TGF-pi, транскрипционного фактора Twist 1, микроРНК miR-21 и miR-let7b, на лимфоцитарную инфильтрацию первичной опухоли, установлено, что селективное ингибирование ММП-9 в клетках меланомы кожи in vivo не оказывает влияния на экспрессию TGF-p и реализацию его эффектов в клетках меланомы, а сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 снижает экспрессию данного фактора роста, а также способствует снижению Twistl-опосредованных процессов ЭМТ, повышению иммуногенности опухоли за счет увеличения лимфоцитарной инфильтрации первичных опухолевых узлов и снижению экспрессии онко-микроРНК miR-21.

2. Установлено, что при снижении экспрессии TGF-P, посредством сочетанного ингибирования ММП-9 и ММП-13 в клетках меланомы кожи in vivo, не происходит изменений опухолевого роста, клеточной пролиферации, однако снижается уровень экспрессии онкосупрессорной микроРНК miR-let-7b.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные об изменении экспрессии TGF-p и реализации его основных канцерогенных эффектов в клетках меланомы кожи in vivo при ингибировании активности ММП-9 и ММП-13 могут быть использованы для разъяснения патогенеза меланомы кожи, а также учитываться при разработке новых препаратов для лечения меланомы, основанных на нацеленном воздействии на определенные молекулярные мишени.

Положения, выносимые на защиту:

1. Селективное ингибирование ММП-9 в клетках меланомы кожи in vivo не оказывает влияния на экспрессию TGF-P и его эффекты - опухолевый рост первичных опухолевых узлов, клеточную пролиферацию меланомы, процессы ЭМТ, сопряженные с эффектами транскрипционного фактора Twist 1, иммуноактивность опухолевых клеток, экспрессию микроРНК.

2. Сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 в клетках меланомы кожи in vivo снижает экспрессию TGF-pi и, таким образом, обусловливает противоопухолевые эффекты - снижение Twist 1-опосредованных процессов ЭМТ, модификацию иммуноактивности меланомы за счет увеличения лимфоцитарной инфильтрации первичных опухолевых узлов, снижение экспрессии онко-микроРНК miR-21, а также имеет проопухолевый потенциал вследствие снижения экспрессии онкосупрессорной микроРНК miR-let-7b.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре патологической физиологии им. проф. В.В. Иванова ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого.

Апробация работы. Материалы и результаты исследований доложены и обсуждены на городском этапе «Конкурса научно-технического творчества молодежи», г. Красноярск, 2013г., «Конференции молодых ученых НИИ онкологии имени H.H. Петрова», г. Санкт-Петербург, 2014 г. Результаты исследований также представлены в материалах российской научно-практической конференции с международным участием «Новые методы в онкологической практике», г. Барнаул, 2013г., в материалах всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Научно-практические аспекты современной онкологии», г. Красноярск, 2013г., в материалах научно-практической конференции дерматовенерологов и косметологов Центрального федерального округа Российской Федерации «Актуальные вопросы дерматовенерологии, дерматоонкологии и косметологии», г. Москва, 2014 г.

Данная диссертационная работа поддержана грантом российского фонда фундаментальных исследований «Посттранскрипционные механизмы регуляции метастазирования при меланоме кожи» № 13-04-01381, 2013 г., грантом российского научного фонда «Экспрессия и роль микроРНК при меланоме кожи» № 7-15-00074, 2013 г., грантом Красноярского краевого фонда поддержки научной и научно-технической деятельности «Конкурс научно-технического творчества студентов и аспирантов» №11/14, 2014 г., грантом частного благотворительного фонда Михаила Прохорова «Академическая мобильность» 2014 г., на средства которого была осуществлена научная стажировка в исследовательской лаборатории дерматологического отделения университетской клиники г. Хайдельберг, Германия, с целью получения необходимых теоретических и практических навыков овладения современными методами молекулярно-биологических исследований.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для публикации результатов диссертационных исследований.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 242 работы, из них - 20 отечественных и 222 зарубежных, иллюстрирована 5 таблицами и 23 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальное моделирование меланомы кожи in vivo

Исследование выполняли на базе ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого».

Эксперимент проводили на лабораторных мышах линии C57BI6, полученных из вивария ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук». Перед проведением экспериментальной работы с животными было получено разрешение локального этического комитета и биоэтической комиссии ГБОУ ВПО Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого (№ 44/2012 от 15.11.12). Все исследования проводили в соответствии с требованиями и условиями, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» и приказом Минздрава РФ № 708н от 23.08.10 «Об утверждении правил лабораторной практики».

В эксперименте использовали мышей - половозрелых самок линии С57В16 в возрасте 8-10 недель, массой от 19 до 26 г. Животных содержали при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище. Для создания сингенной модели меланомы использовали клеточную культуру меланомы В16. Культура клеток была любезно предоставлена ФГБНУ «НИИ фундаментальной и клинической иммунологии».

Клеточную культуру меланомы В16 сохраняли методом криоконсервации в жидком азоте. Двум самкам была проведена имплантация опухолевых клеток путем подкожного введения в боковую поверхность живота 0,5 мл взвеси, содержащей 60 000 жизнеспособных клеток, что соответствует минимальной туморогенной дозе на одно животное. На 22-е сутки после имплантации опухоли у мышей при пальпации достигли около 20 мм в диаметре.

Далее животных подвергли эвтаназии методом цервикальной дислокации под хлороформным наркозом. Проводили вскрытие, выделение опухолевого узла в стерильных условиях, промывание опухоли стерильным раствором питательной среды-199 Medium 199 Modiflcatum Fluidum (ГНЦ ВБ «Вектор», Россия), освобождение от капсулы, некротических участков. После этого опухолевую ткань гомогенизировали и готовили 10% опухолевую взвесь, путем добавления рассчитанного ранее количества среды 199 (на 1 г опухолевой ткани - 1 мл питательной среды). Трансплантацию опухолевой взвеси лабораторным животным (п=39) проводили путем инъекционного подкожного введения в боковую поверхность туловища приготовленной опухолевой взвеси в количестве 1 мл.

Животным, в количестве п=8, трансплантацию меланомы-В16 не осуществляли, из этих животных была сформирована контрольная группа здоровых животных.

Перевиваемая меланома дала положительный опухолевый рост у 37 животных. Этих животных случайным образом поделили на четыре группы -контрольная группа, не получающая воздействие ингибитором (п=11), подопытная группа №1, животным из которой проводили селективное ингибирование ММП-9 (п=8), подопытная группа №2 (п=8), животным из которой проводили сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13, подопытная группа №3 (п=10), необходимая для оценки исследуемых параметров в динамике опухолевого роста, не получающая терапию ингибитором, но выведенная из эксперимента на 10 суток позднее, чем животные в группе «контроль» и подопытных группах №1, №2. Дизайн исследования представлен в виде блок-схемы (рис. 1.)

Воздействие ингибитором матриксных металлопротеиназ

На 10 сутки после трансплантации опухолевой ткани проводили ингибирование ММП-9 и ММП-13, используя ММР-9 Inhibitor I (Calbiochem Biochemicals, США). Молекулярная формула: C27H33N305S.

В концентрации 5 нМоль/л данный ингибитор проявляет селективные свойства и применялся у животных подопытной группы №1, в концентрации 113 нМоль/л ингибитор оказывает сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13, в данной концентрации он применялся у животных подопытной группы №2. В качестве растворителя был использован 1% DMSO (Dimethylsulfoxide) в соотношении 10 мг/мл. Необходимую дозу ингибитора вводили животным из подопытных групп №1, №2 путем инъекционного введения в бедренную мышцу 1 раз в день в течение 7 дней, контрольная группа воздействие ингибитором не получала.

Исследование динамики опухолевого роста in vivo

Оценку динамики увеличения роста опухолевого узла у животных с перевитой меланомой проводили вычислением объема опухолевого узла 1 раз в трое суток с 5-го дня трансплантации меланомы и вплоть до окончания воздействия ингибитором, путем измерения линейных размеров опухоли.

Линейные размеры опухоли измеряли в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Приблизительный объем опухоли рассчитывали по формуле: (длина, мм х ширина2, мм)/2.

Исследование морфометрических показателей

После 7-дневного воздействия ингибитором ММП, животных из подопытных групп №1 и №2, получивших ингибитор, а также животных из контрольной группы вывели из эксперимента путем эвтаназии методом цервикальной дислокации под хлороформным наркозом.

Умерщвленное животное укладывали в стерильный лоток,

Мыши линии С57В16 - половозрелые самки в возрасте 8-10 нед., массой от 19

до 26 г.

-IV

Трансплантация опухолевых клеток меланомы-В16

* Г Ч> Ч> 4> -Л-

Контрольная группа здоровых животных, п=8

Контрольн ая группа, п=11

Подопытн ая группа №1,п=8

Подопьггн ая группа №2, п=8

Подопытна я группа №3, п=10

Воздействие Воздействие

ингибитором ММП - ингибитором ММП -

селективное сочетанное

ингибирование ММП-9 в течение 7 ингибирование ММП-9 и ММП-13 в

дней течение 7 дней

ЧУ Г

Наблюдение и уход за животными, взвешивание животных,

измерение объемов опухолевых узлов

Уход за животными

Эвтаназия мышей

Образц ы кожи

Ж

Эвтаназия мышей в контрольной и подопытных группах №1 и №2 после 7-дневного воздействия ингибитором, на 17-е сутки с момента трансплантации

НЕ

ЗЕ

Эвтаназия мышей

в подопытной группе №3 на 28-е сутки с момента трансплантации

Оценка морфометрических показателей опухолевых узлов, взятие материала для дальнейших исследований

-тр-

тг

Ж

ПЦР в реальном времени -определение

уровней экспрессии ТутИ.ТСР-|31 во всех группах

ТГ

Иммуногистохимическое исследование -определение уровня экспрессии РСЫ А, а также ПЦР в реальном времени с

целью определения уровней экспрессии онко-микроРНК в контрольной группе, подопытных группах №1 и №2

зе

Исследование лимфоцитарно й

инфильтрации опухолевых

узлов в контрольной

группе и подопытных группах №1, №2 ,№3

Зимограф ияММП-9 в

контрольн

ой и подопытн ой группе №1

ЗЕ

Статистическая обработка, анализ и интерпретация результатов

Рис. 1. Дизайн эксперимента. 9

фиксировали за конечности. Тампоном, смоченным дезинфицирующим раствором, обрабатывали шерсть на местах будущих разрезов, проводили выделение опухолевого узла вместе с капсулой, определяли массу и объем узла. Объем выделенного опухолевого узла определяли путем измерения трех взаимоперпендикулярных линейных размеров и рассчитывали по формуле: А, мм х В, мм х С, мм, где А, В, С - взаимно перпендикулярные линейные размеры. Далее опухолевый узел делили на части для дальнейших исследований - одну часть узла помещали в 10% нейтральный формалин для изготовления гистологических препаратов, другие части подвергались криоконсервации в жидком азоте.

Зимография

Образцы ткани меланомы подвергали шестикратному замораживанию — оттаиванию, затем опухолевую ткань массой 50 мг гомогенизировали и получали супернатанты. В супернатантах определяли количество белка по методу Бредфорд (Bradford М., 1976). Образцы выравнивали по концентрации белка и проводили SDS-электрофорез в 6% полиакриламидном геле с 0,1% желатином.

В лунку наносили супернатант в объеме, содержащем 50 мкг белка, добавляя равное количество буфера для образцов, содержащего 0,125М Tris-Hcl, pH 6,8, 4% SDS, 0,01% бромфеноловый синий и 20% глицерол. После электрофореза SDS дважды вымывали из геля в растворе 2,5 % Triton-X. Далее гель погружали в раствор инкубационного буфера, содержащий 50мМ Tris-HCl, 0,2М NaCl, ЮмМ СаС12, pH 7,5, инкубировали в термостате при t +37°С в течение 16 часов.

Гель промывали в дистиллированной воде и погружали в раствор, содержащий 0,01% Кумасси G-250, 30% изопропанол, 10% ледяную уксусную кислоту, выдерживали в течение 1 часа, затем гель отмывали в растворе, содержащем 10% метиловый спирт, 5% ледяную уксусную кислоту в течение нескольких минут, а затем дистиллированной водой. Эффективность протеолиза оценивали с помощью гель-документирующей системы ChemiDocTM XRS+ ("Bio-Rad Laboratories", США) с программным обеспечением Image Lab™. Окрашенную зимограмму сканировали, на изображении определяли яркость и площадь лизиса.

Активность ММП-9 (усл. ед.) определяли путем произведения площади лизиса на зимограмме при сканировании на яркость изображения лизированной зоны (пике.).

Данную методику осуществляли в двух технологических повторах.

Иммуногистохнмнческое исследование

Данный метод использовался для определения уровня экспрессии ядерного маркера клеточной пролиферации - PCNA в контрольной группе и группах, получивших экспериментальное воздействие ингибитором.

Из образцов ткани опухолевого узла, зафиксированных в 10% нейтральном формалине и заключенных в парафин, изготавливали гистологические срезы толщиной 4 мкм. Иммуногистохимическое окрашивание срезов проводилось с использованием набора для осуществления иммуногистохимического окрашивания Mouse and Rabbit Specific HRP/AEC detection IHC kit (Abeam, США) по прилагаемому протоколу. Первичные антитела к PCNA (Novocastra, США) наносили в разведении 1:200 и инкубировали на срезах в течение 1 часа во влажной камере при комнатной температуре. Для визуализации продукта реакции в качестве хромогена применяли АЕС (3-Amino-9-ethylcarbazol) (Abeam, США), раствор наносили на стекла на 10 минут, в результате образовывался окрашенный в красно-коричневый цвет конечный продукт реакции, который был локализован в ядрах пролиферирующих клеток меланомы. Подсчёт клеток, имеющих положительно окрашенные ядра, проводили при увеличении х400 с помощью микроскопа «Olympus ВХ-41» с видеонасадкой «Olympus U-CMAD3» и программного обеспечения «Infinity Capture».

Проводили подсчет среднего количества опухолевых клеток и среднего количества пролиферирующих опухолевых клеток, имеющих положительно окрашенные ядра при увеличении х400 в 10 случайных полях зрения. Уровень экспрессии PCNA для каждого образца определяли путем вычисления процента пролиферирующих клеток.

В качестве негативного контроля использовали изложенную выше методику окрашивания, но без нанесения первичных антител к PCNA. Вместо первичных антител на срезы наносили фосфатно-солевой раствор.

Выделение РНК и постановка ПЦР в реальном времени

Опухолевую ткань и кожу в количестве 30 мг из каждого образца гомогенизировали и осуществляли выделение РНК с помощью комплекта реагентов «Рибо-золь В» (AmpliSens, Россия) по прилагаемому протоколу.

Далее переходили к постановке реакции обратной транскрипции с помощью комплекта реагентов «РЕВЕРТА» (AmpliSens, Россия) по прилагаемому протоколу при 137°С в течение 30 минут.

Для образцов, которые предназначались для определения уровней экспрессии микроРНК, при постановке реакции обратной транскрипции с использованием набора «РЕВЕРТА» (AmpliSens, Россия), «рендом-праймеры» были заменены на специфичные для каждого вида микроРНК 5х-праймеры (Applied Biosystems, США) для обратной транскрипции, а также специфичные 5х-праймеры для малой некодирующей РНК U-6 - эндогенного контроля для микроРНК.

Постановку ПЦР в реальном времени проводили с использованием специфичных праймеров для фактора транскрипции Twist 1: Assay ID Mm04208233_gl, каталожный № 4331182 (Applied Biosystems, США), для TGF-ßl: Assay ID MmOl 178820_ml, каталожный № 4331182 (Applied Biosystems, США), а также, используя специфичные 20х-праймеры для

исследуемых микроРНК (Applied Biosystems, США) - для miR-let-7b: miRBase ID mmu-let-7b-5p, Assay Name - hsa-miR-let-7b, каталожный № 4427975, для miR-21: miRBase ID - mmu-miR-21a-5p, Assay Name - hsa-miR-21, каталожный № 4427975. В качестве эндогенного контроля для Twist 1 и TGF-ßl ставили реакцию с использованием прайм еров к мышиному ß-актину, Assay ID Mm00607939_sl, каталожный № 4453320 (Applied Biosystems, США), а в качестве эндогенного контроля для микроРНК -специфичные 20х-праймеры к малой некодирующей РНК U6: Assay Name -U6 snRNA, Product Type - Control miRNA Assay, каталожный № 4427975 (Applied Biosystems, США).

Для постановки реакции использовали реакционную смесь TaqMan® Universal Master Mix II no UNG (Applied Biosystems, США).

Реакционная смесь для одной лунки в объеме 20 мкл для исследования Twist 1, TGF-ßl и ß-актина содержала: смеси Universal Master Mix II no UNG - 10 мкл, раствора специфичных праймеров и зонда - 1 мкл, полученной кДНК - 3 мкл и деионизованной воды для ПЦР (БиоЛинк, Россия) - 6 мкл.

Реакционная смесь для одной лунки в объеме 20 мкл для исследования микроРНК и эндогенного контроля - U6 snRNA содержала: смеси Universal Master Mix II no UNG - 10 мкл, раствора специфичных праймеров и зонда - 1 мкл, полученной кДНК - 1,33 мкл и деионизованной воды для ПЦР (БиоЛинк, Россия) - 7,67 мкл.

Программа термоциклирования выполнялась при следующих условиях: 50°С - 2 минут, 95°С - 10 минут, 40 циклов: 95°С - 15 секунд, 60°С - 1 минута. ПЦР в реальном времени осуществляли на приборе StepOne™ RealTime PCR System (Applied Biosystems, США).

Относительные уровни экспрессии исследуемых маркеров рассчитывали по формуле: RQ = 2"дст, где RQ (relative quantitation) -относительный уровень экспрессии, CT - пороговые циклы образцов, при которых кривая флюоресценции пересекала заданный уровень фона, а

ACT (CT исследуемого маркера~СТ эндогенного контроля для данного маркера)*

Каждый эксперимент выполняли в двух технологических повторах с дальнейшим расчетом среднего значения.

Исследование лимфоцитарной инфильтрации первичных опухолевых узлов

Степень выраженности лимфоцитарной инфильтрации определяли путем подсчета среднего числа лимфоцитов в полях зрения опухолевой ткани гистологического препарата первичного опухолевого узла, окрашенного гематоксилином-эозином, для каждого образца. Подсчет в каждом случае проводили в 15 полях зрения при увеличении х200 с помощью микроскопа «Olympus ВХ-41» с видеонасадкой «Olympus U-CMAD3» и программного обеспечения «Infinity Capture».

Статистическая обработка

Статистический анализ полученных данных был проведен с использованием пакета программного обеспечения 81а11зиса 6.1 (81а1зоП, Россия). Результаты исследования проверяли на нормальность распределения с использованием критерия Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефортса. Так как все исследуемые выборки не подчинялись нормальному распределению, то при статистической обработке были применены методы непараметрической статистики.

Сравнение динамики объема опухолевого узла в каждой группе по дням проводили с использованием непараметрического дисперсионного анализа Фридмана. При получении р<0,05 переходили к парным сравнениям для зависимых групп, используя критерий Вилкоксона с поправкой Бонферрони. Межгрупповые сравнения по каждому дню наблюдения проводили с помощью непараметрического дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса, при получении р<0,05 переходили к многогрупповым сравнениям. Различия между сравниваемыми показателями считали статистически значимыми при р<0,05.

При сравнении остальных исследуемых показателей использовали непараметрические методы вариационной статистики - для парных выборок - 11-тест Манна-Уитни, для трех и более независимых выборок -дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса, при получении р<0,05 переходили к многогрупповым сравнениям. Различия между сравниваемыми показателями при всех методах считали статистически значимыми при р<0,05.

Корреляционный анализ проводили, используя непараметрический анализ корреляционных взаимосвязей по Спирмену. Корреляционную взаимосвязь считали статистически значимой при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка результатов трансплантации опухолевых клеток меланомы-В16

Трансплантацию опухолевой взвеси меланомы В-16 провели лабораторным животным в количестве 39 шт.

Из 39 животных опухоль развилась у 37 мышей, и, таким образом, перевиваемость меланомы В-16 в нашем эксперименте составила 94,9%.

Оценка динамики опухолевого роста

При оценке объемов первичных опухолевых узлов в экспериментальных группах получены статистически значимые различия объемов опухолевых узлов по каждому дню наблюдения в каждой группе, однако значимых различий в объемах опухоли на каждый день наблюдения при межгрупповых сравнениях не получено, в том числе и после начала воздействия ингибитором (рис. 2.).

1 „ 5 8 11 14 17

Сутки с момента трансплантации клеток меланомы

♦ Контроль__1У1МП-9 ингибитор •"■** ММП-9/13 ингибитор

Рис. 2. Динамика изменения объемов опухоли в исследуемых группах. *, #, §- различия статистически значимы по сравнению с 5 сутками с момента трансплантации клеток меланомы в группе «ММП-9 ингибитор», «Контроль» и «ММП-9/13 ингибитор» соответственно, р<0,05.

Таким образом, как селективное ингибирование ММП-9, так и сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 по результатам нашего исследования не оказывают статистически значимого влияния на динамику роста первичных опухолевых узлов.

Оценка морфометрических показателей первичных опухолевых узлов при вскрытии

При сравнении исследуемых групп по массам и объемам первичных опухолевых узлов при вскрытии нами не выявлено статистически значимых различий между анализируемыми показателями в данных группах (рис.3.).

Контроль MVTt-9/13 ингибитор

MVT1-9 ингибитор Ш 25%-75%

~г~ Мин,-макс.

Рис. 3. Показатели массы и объемов первичных опухолевых узлов в исследуемых группах.

Таким образом, селективное ингибирование ММП-9 и сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 не оказывают влияния на показатели опухолевого роста (массы и объемы первичных опухолевых узлов) перевиваемой меланомы В-16 in vivo.

Оценка результатов зимографии

При оценке эффективности ингибирования ММП в исследуемых группах методом субстратспецифичной зимографии, было получено, что активность ММП-9 в образцах опухолевой ткани группы селективного ингибирования ММП-9 статистически значимо ниже активности данного фермента в опухолевой ткани образцов контрольной группы в 3,2 раза (рис. 4-А.). На зимограмме это выражено менее интенсивным свечением и меньшей площадью зон специфического протеолиза на уровне метки 92 кДа образцов опухолевой ткани группы, получившей воздействие ингибитором в концентрации селективного ингибирования ММП-9 по сравнению с образцами опухолевой ткани контрольной группы (рис. 4-Б.) Ингибирование ММП-13 в группе сочетанного ингибирования ММП-9 и ММП-13 принимали эффективным при подтверждении эффективности ингибирования ММП-9, так как у используемого ингибитора имеется строгий дозозависимый эффект в отношении селективности ингибирования.

1УМП-9 ингибитор

а Медиана Мин -№кс

Рис. 4. А - Активность фермента ММП-9 в исследуемых группах по результатам зимографии, * - статистически значимо по отношению к группе

«Контроль».

Б - Зимограмма. Зоны специфического протеолиза образцов из группы «Контроль» - 1, 2, из группы селективного ингибирования ММП-9 - 3, 4.

Оценка уровней клеточной пролиферации опухолевых клеток

Исследуя пролиферативную активность клеток меланомы в экспериментальных группах, было выявлено значимое снижение клеточной пролиферации опухолевых клеток в группе мышей, получивших сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 по сравнению с группой, в которой ингибировапи только ММП-9, однако уровни клеточной пролиферации в обеих подопытных группах значимо не различаются с контролем (рис. 5.).

Рис. 5. А - Уровни клеточной пролиферации в исследуемых группах, * - статистически значимо по отношению к группе ММП-9.

Б - Иммуногистохимическое окрашивание ткани опухолевого узла на маркер клеточной пролиферации PCNA, ув. х400, ядра пролиферирующих клеток окрашены в коричневый цвет в образце опухолевой ткани из группы селективного ингибирования ММП-9, В - в образце опухолевой ткани из группы сочетанного ингибирования ММП-9 и ММП-13.

Таким образом, селективное ингибирование ММП-9 и сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 in vivo не оказывает статистически значимого влияния на пролиферативную активность клеток перевиваемой меланомы кожи В-16.

Оценка лимфоцитарной инфильтрации первичных опухолевых узлов меланомы

Анализ инфильтрации опухолевой ткани лимфоцитами показал статистически значимое увеличение выраженности лимфоцитарной инфильтрации первичных опухолевых узлов, заключающееся в увеличении количества интраопухолевых лимфоцитов у мышей с сочетанным ингибированием ММП-9 и ММП-13 по сравнению с контрольной группой, а также с группой, животные которой получили воздействие ингибитором в концентрации селективного ингибирования ММП-9 (рис. 6.). В группе сочетанного ингибирования ММП-9 и ММП-13 количество интраопухолевых лимфоцитов было в 10,0 раз больше, чем в контрольной группе и группе животных, получивших селективное ингибирование ММП-9.

У животных с селективным ингибированием ММП-9 интенсивность лимфоцитарной инфильтрации не имела статистически значимых различий с лимфоцитарной инфильтрацией первичных опухолевых узлов животных из контрольной группы (рис. 6.).

Рис. 6. А - Уровни лимфоцитарной инфильтрации первичных опухолевых узлов в исследуемых группах, * - статистически значимо по отношению к контрольной группе и группе селективного ингибирования ММП-9. Б - Интраопухолевые лимфоциты, окр. Г+Э, ув.400, немногочисленные лимфоциты по краю опухоли в контрольной группе, В - умеренно выраженная инфильтрация опухоли лимфоцитами в группе сочетанного ингибирования ММП-9 и ММП-13.

При оценке лимфоцитарной инфильтрации в динамике опухолевого процесса - на 17 сутки и 28 сутки с момента трансплантации опухолевых клеток меланомы соответственно, было выявлено, что в динамике количество интраопухолевых лимфоцитов увеличилось в 2,8 раза (рис.7.)

Рис. 7. Количество интраопухолевых лимфоцитов на разных этапах опухолевого роста с момента трансплантации опухолевых клеток, * - статистически значимо по отношению к группе животных, умерщвленных на 17 сутки с момента трансплантации клеток меланомы.

Таким образом, селективное ингибирование ММП-9 не оказывает влияния на количество интраопухолевых лимфоцитов первичных опухолевых узлов перевиваемой меланомы кожи in vivo, а сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 значимо увеличивает иммуногенность перевиваемой меланомы В-16, заключающуюся в увеличении лимфоцитарной инфильтрации первичной опухоли, в 10 раз. В динамике опухолевого роста иммуногенность перевиваемой меланомы кожи in vivo также возрастает в 2,8 раза.

Оценка уровней экспрессии микроРНК ппК-21 и ппК-1е1-7Ь

При сравнении уровней экспрессии онкогенной микроРНК гш!1-21и онкосупрессорной микроРНК гт11-1е1-7Ь в исследуемых группах было выявлено, что у животных в группе селективного ингибирования ММП-9 уровни экспрессии данных микроРНК не имеют статистически значимых различий с контролем (рис 8-А, 8-Б). Сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 статистически значимо снижает уровень экспрессии онкогенной гшЯ-21 по сравнению с контролем в 19,3 раза и по сравнению с группой селективного ингибирования ММП-9 в 7,3 раза (рис. 8-А.).

Также определено, что в группе сочетанного ингибирования ММП-9 и ММП-13 статистически значимо снижается уровень экспрессии и онкосупрессорной тШ.-1е1:-7Ь в 26,1 раз по сравнению с контролем, но не имеет значимых различий с группой селективного ингибирования ММП-9 (рис. 8-Б.)

и

5 . о.ооз

х 5

01 с

ш а

о >< пппч

5 Е

I

Контроль Mvri-9/13 ингибитор М.Т1-Э ингибитор

Рис. 8. А - Относительные уровни экспрессии микроРНК пйН.-21 в исследуемых группах, * - статистически значимо по отношению к контрольной группе и группе селективного ингибирования ММП-9. Б - Относительные уровни экспрессии гшЯ-1еЬ7Ь в исследуемых группах, * - статистически значимо по отношению к контрольной группе.

Таким образом, селективное ингибирование ММП-9 на модели меланомы кожи in vivo не влияет на экспрессию микроРНК - miR-21 и miR-let-7b, а сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 имеет противоопухолевый эффект, заключающийся в снижении уровня экспрессии онкогенной микроРНК miR-21, но наряду с этим, сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 способно оказывать также проопухолевый потенциал посредством снижения уровня экспрессии онкосупрессорной микроРНК -miR-let-7b.

Оценка уровня экспрессии транскрипционного фактора Twistl

Twistl является высоко консервативным транскрипционным фактором, который ассоциирован с развитием меланомы посредством регуляции ЭМТ. Анализ уровней экспрессии транскрипционного фактора Twistl в клетках меланомы первичных опухолевых узлов у животных в экспериментальных группах показал статистически значимое снижение экспрессии данного фактора в 12,9 раз в группе сочетанного ингибирования ММП-9 и ММП-13 по сравнению с контролем, но значимых различий в экспрессии Twistl в группе селективного ингибирования ММП-9 по сравнению с контролем вновь не выявлено. Между подопытными группами различий в экспрессии Twist 1 нами также не выявлено (рис. 9-А.).

При оценке уровня экспрессии Twistl в динамике опухолевого процесса - на 17-е сутки и 28-е сутки с момента трансплантации опухолевых клеток соответственно, не было выявлено значимых изменений уровня экспрессии данного фактора транскрипции (Рис. 9-Б.).

щ

и. 006

S

§ 0.005

О. с

g 0,004 П гт

X 3

01 q 0,003

о I

.íi »да

Л К §

S

§ 0,000 5

■0,001

Рис. 9. А - Относительные уровни экспрессии транскрипционного фактора Twistl в исследуемых группах, * - статистически значимо по отношению к группе «Контроль». Б - Относительные уровни экспрессии Twistl на разных этапах опухолевого роста с момента трансплантации опухолевых клеток.

Контроль ММП-Э/13 ингибитор ММП-9 ингибитор

Сравнивая уровни экспрессии Twist 1 в коже здоровых мышей с уровнем экспрессии Twist 1 в опухолевой ткани мышей контрольной группы, было получено, что экспрессия данного фактора транскрипции в коже здоровых животных выше в 451,3 раза, чем в опухолевой ткани (Табл. 1.).

Таблица 1.

Относительные уровни экспрессии Twist 1 коже здоровых животных и _опухолевой ткани меланомы_

Относительные уровни экспрессии Twistl, усл. ед.

Медиана [25%; 75%1

Здоровая кожа Опухолевая ткань Р

0,3610 ГО,2611; 0,76881 0,0008 f0,0002; 0,00111 0,001

Таким образом, селективное ингибирование ММП-9 на модели меланомы кожи in vivo не оказывает влияния на экспрессию транскрипционного фактора Twistl, а сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 значимо снижает экспрессию в опухолевой ткани данного фактора транскрипции, ассоциированного с процессами ЭМТ и метастазирования при меланоме в 12,9 раз и, таким образом оказывает противоопухолевый эффект.

Уровень экспрессии Twistl в динамике опухолевого роста не изменяется, что говорит о стабильности патофизиологических механизмов, связанных с экспрессией данного фактора транскрипции.

В коже по сравнению с опухолевой тканью экспрессия Twistl значительно выше, что подтверждает данные о дифференцированной роли данного маркера в норме и патологии и свидетельствует о том, что модуляция экспрессии данного фактора транскрипции должна осуществляться лишь в строгом биологическом контексте.

Оценка уровня экспрессии TGF-pi

При оценке уровней экспрессии TGF-p 1 - наиболее распространенной изоформы цитокина TGF-P и являющейся прототипом семейства TGF-P, в опухолевой ткани у животных исследуемых групп, было выявлено, что сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 статистически значимо снижает уровни экспрессии TGF-pi в 50,9 раз по сравнению с контролем. Селективное ингибирование ММП-9 не оказывает влияния на экспрессию TGF-p 1, и уровни экспрессии этого маркера значимо не различаются с контролем. Значимых различий в экспрессии TGF-pi между подопытными группами нами также не выявлено (рис. 10-А.).

Анализируя уровни экспрессии TGF-pi в опухолевых клетках первичных опухолевых узлов у животных в динамике опухолевого процесса - на 17-е сутки и на 28-е сутки с момента трансплантации опухолевых клеток соответственно, не было выявлено статистически значимых изменений уровня экспрессии TGF-pi (рис. 10-Б.).

17 cyr. 28 суг.

Медиана В 25%-75% ~ Мин -Макс

Рис. 10. А - Относительные уровни экспрессии транскрипционного фактора ТОР-р 1 в исследуемых группах.

* - Статистически значимо по отношению к группе «Контроль».

Б - Относительные уровни экспрессии ТвР-р 1 на разных этапах опухолевого роста с момента трансплантации опухолевых клеток.

При исследовании и сравнении уровней экспрессии ТОР'-р 1 в коже мышей у животных здоровой группы с уровнем экспрессии ТвР-р 1 опухолевой ткани мышей контрольной группы, было определено, что экспрессия данного цитокина в коже статистически значимо выше в 33,3 раза чем в опухолевой ткани (Табл. 2.).

Таблица 2.

Относительные уровни экспрессии ТвБ-р! в коже здоровых животных и

Относительные уровни экспрессии TGF-p 1, усл. ед.

Медиана |25%; 75%1

Здоровая кожа Опухолевая ткань Р

0,100 [0,026; 0,132] 0,003 [0,002; 0,006] 0,001

Таким образом, по результатам анализа экспрессии TGF-|3, получены результаты, демонстрирующие аналогичную тенденцию, что и при анализе экспрессии Twist 1: селективное ингибирование ММП-9 не оказывает влияния на экспрессию данного цитокина, а сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 значимо снижает экспрессию данного цитокина в опухолевой ткани меланомы В-16 в 50,9 раз. В динамике опухолевого роста экспрессия TGF-p также не изменяется, а в коже она значимо выше, чем в опухолевой ткани, что также указывает на разные функциональные роли этого цитокина в физиологических и патологических процессах в клетках.

Анализ корреляционной взаимосвязи между исследуемыми параметрами

Нами было проведено корреляционное исследование следующих параметров: процента пролиферирующих клеток меланомы, количества интраопухолевых лимфоцитов, уровня экспрессии Twistl, уровня экспрессии TGF-pi, а также уровней экспрессии микроРНК miR-21 и miR-let-7b в опухолевой ткани между собой в контрольной группе, а также в подопытных группах, получивших воздействие ингибитором ММП в различных концентрациях. У животных контрольной и подопытных групп исследуемые показатели не имели статистически значимой корреляционной взаимосвязи между собой.

ВЫВОДЫ

1. Сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 в клетках меланомы кожи in vivo снижает уровень экспрессии молекул, ассоциированных с опухолевой прогрессией меланомы кожи - экспрессию TGF-pi в 50,9 раз по сравнению с уровнем экспрессии данного фактора роста в клетках меланомы у животных контрольной группы, а также снижает уровень экспрессии Twistl в 12,9 раз по сравнению с уровнем экспрессии данного фактора транскрипции в клетках меланомы у животных контрольной группы. В динамике роста первичной опухоли меланомы экспрессия TGF-pl и Twistl статистически значимо не изменяется, что свидетельствует об устойчивости процессов канцерогенеза, ассоциированных с экспрессией данных молекул. В опухолевой ткани уровни TGF-pi и Twistl ниже, чем в нормальной коже, что подтверждает различную функциональную роль указанных выше молекул в нормальных и опухолевых клетках кожи.

2. Селективное ингибирование ММП-9 и сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 в клетках меланомы кожи in vivo не оказывают влияния на опухолевый рост и пролиферацию клеток меланомы. Сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 способствует увеличению количества интраопухолевых лимфоцитов в 10 раз по сравнению с контрольной группой и группой селективного ингибирования ММП-9, что свидетельствует об увеличении иммуногенности клеток меланомы кожи.

3. Сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 в клетках меланомы кожи in vivo сопряжено со снижением уровня экспрессии онкогенной микроРНК miR-21 в 19,29 раз по сравнению с уровнем экспрессии этой онко-микроРНК в клетках меланомы у животных контрольной группы, а также в 7,29 раз по сравнению с уровнем экспрессии miR-21 в клетках меланомы у животных, получивших селективное ингибирование ММП-9. Сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 сопряжено со снижением уровня экспрессии также и онкосупрессорной микроРНК miR-let-7b в клетках меланомы в 26,1 раз по сравнению с уровнем экспрессии данной микроРНК в клетках меланомы контрольной группы.

4. Сочетанное ингибирование ММП-9 и ММП-13 в клетках меланомы кожи in vivo способно оказывать противоопухолевые эффекты благодаря снижению экспрессии TGF-ßl и, вследствие этого, снижению активации TGF-ß-пути сигнальной трансдукции и реализации его эффектов -Twist 1-опосредованной ЭМТ, иммунологической резистентности опухолевой ткани, снижению экспрессии онко-микроРНК miR-21, а также имеет проопухолевый потенциал вследствие способности снижать экспрессию онкосупрессорной микроРНК miR-let-7b.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Палкина, Н. В. Антипролиферативное действие матриксных металлопротеиназ 9 и 13 на модели меланомы кожи in vivo / Н. В. Палкина, Т. Г. Рукша // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2014. -№ 2. - С. 60-64. (Из списка ВАК)

2. Палкина, Н. В. Ингибирование матриксных металлопротеиназ 9-го и 13-го типов влияет на выраженность лимфоцитарной инфильтрации и уровни экспрессии микроРРПС miR-21 и miR-let-7b в клетках меланомы in vivo / Н. В. Палкина, 10. И. Швецова, А. К. Кириченко, Т. Г. Рукша // Архив патологии. - 2015. - Т. 77, № 1. - С. 41-47. (Из списка ВАК)

3. Палкина, Н. В. Матриксные металлопротеиназы-9 и -13 регулируют экспрессию трансформирующего фактора роста-ß и транскрипционного фактора Twist 1 в клетках меланомы in vivo / Н. В. Палкина, Ю. И. Швецова, Т. Г. Рукша / Вестник ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина». -2015. - Т. 26. С. 41-46. (Из списка ВАК)

4. Палкина, Н. В. Зимография желатиназ для оценки эффективности ингибирования ММП-9 на модели меланомы кожи in vivo / Н. В. Палкина, Т. Г. Рукша // Сибирск. журн. дерматол. и венерол. - 2013. - № 14. - С. 56-58.

5. Палкина, Н. В. Анализ эффективности ингибирования матриксных металлопротеиназ: оценка изменений объемов первичных опухолевых узлов при селективном ингибировании ММП-9 и неселективном ингибировании ММП-9 и ММП-13 на модели меланомы кожи in vivo / Н. В. Палкина, Т. Г. Рукша // Новые методы в онкологической практике : материалы Российской научно-практической конференции с международным участием 25-26 июня 2013 года г. Барнаул / под. ред. д.м.н., проф. А. Ф. Лазарева. -Барнаул: АЗБУКА, 2013. - С. 220-221.

6. Палкина, Н. В. Характер изменения роста меланомы кожи in vivo при селективном ингибировании ММП-9 и неселективном ингибировании ММП-9 и ММП-13 / Н. В. Палкина, Т. Г. Рукша // Новые методы в онкологической практике: материалы Российской научно-практической конференции с международным участием 25-26 июня 2013 года г. Барнаул / под. ред. д.м.н., проф. А. Ф. Лазарева. - Барнаул: АЗБУКА, 2013. - С. 218220.

7. Панкина, Н. В. Особенности клеточной пролиферации и опухолевого роста меланомы В-16 при ингибировании матриксных металлопротеиназ -9 и -13 in vivo / Н. В. Панкина, Т. Г. Рукша // Научно-практические аспекты современной онкологии : материалы Всеросс. науч.-практ. конф. (31 окт. 2013г.). - / отв. ред. д.м.н., проф. Ю. А. Дыхно. -Красноярск : тип. «Агурец», 2013. - С. 112-116.

8. Палкина, Н. В. Особенности биологического поведения меланомы кожи in vivo в условиях ингибирования матриксных металлопротеиназ 9 и 13 / Н. В. Палкина // Сборник научных трудов: Конференция молодых ученых 26 марта 2014г.- Санкт-Петербург, 2014. - С.

9. Палкина, Н. В. Особенности моделирования меланомы кожи in vivo / Н. В. Палкина, А. С. Коваль, М. С. Собянина // 77-я итоговая студенческая научно-практическая конференция с международным участием, посвященная 90-летию со дня рождения профессора П. Г. Макарова и 90-летию со дня рождения доцента Б. М. Зельмановича, Красноярск, 23-26 апреля 2013 г.: Сб. материалов / отв. ред. И. П. Артюхов. - Красноярск : тип. КрасГМУ, Версо, 2013. - С. 460-461.

10. Палкина, Н. В. Влияние матриксных металлопротеиназ 9/13 in vivo на экспрессию транскрипционного фактора TWIST 1 в клетках меланомы / Н. В. Палкина, Ю. И. Швецова, Т. Г. Рукша // Актуальные вопросы дерматовенерологии, дерматоонкологии и косметологии: Научно-практическая конференция дерматовенерологов и косметологов Центрального федерального округа Российской Федерации 2-3 июня 2014 года г. Москва.: Сб. статей. - Москва, 2014. - С. 86-88.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ММП - матриксная металлопротеиназа;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ЭМТ - эпителиально-мезенхимальная трансформация;

miR-21 - микроРНК-21;

miR-let-7b - MHKpoPHK-let-7b;

TGF-p (transforming growth factor-P) - трансформирующий фактор роста-Р;

Twistl - транскрипционный фактор семейства «спираль-петля-спираль».

35-37.

Соискатель

Подписано к печати 24 сентября 2015 г. Формат 210x148 1/25. печ. л. 1,0 Заказ № 0542. Тираж 100 экз.

Отпечатано в компании «Печатный двор» г. Красноярск, ул. Марковского, 19 тел.: 266-12-90