Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фракционный и субфракционный состав липопротеинов сыворотки крови при экспериментальной липемии мышей, вызванной полоксамером 407 и тритоном WR 1339

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фракционный и субфракционный состав липопротеинов сыворотки крови при экспериментальной липемии мышей, вызванной полоксамером 407 и тритоном WR 1339"

На правах рукописи

ЛОГИНОВА Виктория Михайловна

ФРАКЦИОННЫЙ И СУБФРАКЦИОННЫЙ СОСТАВ ЛИПОИРОТЕИНОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЛИПЕМИИ МЫШЕЙ, ВЫЗВАННОЙ ПОЛОКСАМЕРОМ 407 И ТРИТОНОМ 1339

03.01.04 - биохимия

7 НОЯ 2013

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 2013 005537222

005537222

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФБГУ "НИИ ФФМ" СО РАМН)

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор КОРОЛЕНКО Татьяна Александровна

Официальные оппоненты:

КОЛПАКОВ Аркадий Ростиславович доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ "НИИ биохимии" СО РАМН, в.н.с. лаборатории молекулярной биологии клетки

БЕЛИЧЕНКО Виктор Михайлович доктор биологических наук, ФГБУ "НИИ ФФМ" СО РАМН, в.н.с. лаборатории функциональной морфологии и патофизиологии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт терапии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится г. в 10.00 часов на заседании дис-

сертационного совета Д 001.034.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт биохимии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2; тел.: 8-383-33354-81).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения "Научно-исследовательский институт биохимии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2).

Автореферат разослан Мо/УУЗ&Я 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Русских Галина Сергеевна

Общая характеристика диссертации

Актуальность исследования. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) в конце XX - начале XXI веков приняли характер эпидемии, охватившей все высокоразвитые страны. В России ежегодно более 1 млн. человек умирают от ССЗ, из них половина - от ишемической болезни сердца (ИБС) и еще 40% от поражения мозговых сосудов (Кухарчук, 2007; Демидова и др., 2011). Несомненно, в основе профилактики ССЗ лежат меры, направленные на коррекцию основных факторов риска: низкой физической активности, курения, повышенного артериального давления, ожирения и липидных нарушений (Оганов, 2004; Нечаева и др., 2010).

Одним из важнейших факторов риска развития атеросклероза и ССЗ является липемия. Высокое содержание липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), низкий уровень липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и повышение активности матриксных металлопротеиназ (МПП) сыворотки крови у человека являются общепринятыми факторами риска атеросклероза (Рагино и др., 2008).

Изучение характера нарушений липидного обмена проводится на различных моделях, воспроизводящих липемию (диетические, генетические, химические) (Paigen et al., 1985; Ishibashi et al., 1993; Harada et al., 1996; Jawieñ et al., 2004; Pan et al., 2006).

Для воспроизведения модели липемии у мышей используется тритон WR 1339 (Ruger Chemical Co., USA). Важным фармакологическим свойством тритона WR 1339 является способность вызывать гипертриглицеридемию и гипер-холестеринемию в течение нескольких часов после однократного введения детергента (Millar et al., 2005).

При очевидных преимуществах модели воспроизведения липемии с помощью тритона WR 1339 отмечают свойство детергента - повреждать клеточные мембраны, как недостаток, особенно при повторном использовании высоких доз (Millar et al., 2005). В связи с этим, с 1995 года предложен препарат -

полоксамер 407 (Pluronic F-127) - для воспроизведения липемии. Как и тритон WR 1339, он является детергентом, но не обладает свойствами повреждать клеточные мембраны (Millar et al., 2005).

Модель липемии, воспроизводимая на экспериментальных животных при введении полоксамера 407, перспективна для изучения механизма развития атеросклероза (Johnston et al., 2003; Johnston, 2009). Преимуществом данной модели является простота воспроизведения, низкая токсичность полоксамера 407 (отсутствие повреждающего свойства на клеточные мембраны). Полоксамер 407 может использоваться как для воспроизведения острой липемии, так и атеросклероза, при повторном введении детергента у мышей (Johnston et al., 2001; Korolenko et al., 2012). Выявлен дозозависимый эффект полоксамера 407 при воспроизведении различной степени выраженности липемии у экспериментальных животных с помощью данной модели (Millar et al., 2005).

Модель может быть использована для тестирования гиполипидемических препаратов (статинов и фибратов) (Johnston et al., 2001). Возрастающий интерес к статинам объясняется недостаточной изученностью их свойств. Механизм защитного влияния аторвастатина на модели липемии изучается и представляет значительный интерес. Аторвастатин, как и другие статины, угнетает синтез холестерина в печени на стадии мевалоновой кислоты, вследствие обратимого ингибирования ключевого фермента З-гидрокси-З-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы (ГМК-КоА-редуктазы) и увеличения числа и активности печеночных ЛПНП-рецепторов клеток, что способствует усилению захвата и катаболизма ЛПНП (Corsini et al., 1999; Assmann and Nofer, 2003). Полагают, что применение статинов, благодаря их плеойотропному эффекту, помимо гиполипи-демического влияния, вызывает снижение активности ММП в атеросклероти-ческих бляшках (Озова и др., 2007).

Р-гликаны, также представляют особый интерес, благодаря своим гипо-липидимическим свойствам (Vetvicka and Vetvickova, 2009). В процессе разви-

тия атеросклероза макрофаги преобразуются в пенистые клетки, накапливающие окисленные ЛПНП. Предполагается, что карбоксиметштированный-Р-1,3-D-гликан (КМГ) способен конкурировать с окисленными ЛПНП за образование связи с рецепторами "мусорщиками" in vivo и in vitro (Dushkin et al., 1996; van Oosten et al., 1998; Душкин, 2012).

Механизм развития экспериментальной липемии при введении полоксамера 407 исследован недостаточно. Остаются неясными соотношения различных фракций и субфракций липопротеинов (ЛП): липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП), ответственных за атерогенный эффект, а также липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) с защитным антиатерогенным эффектом. Поэтому представляется актуальным изучение изменений липидных показателей (фракций и субфракций ЛП) сыворотки крови при экспериментальной липемии у мышей и влияния на эти показатели аторвастатина и КМГ.

Цель работы: исследовать фракционный и субфракционный состав липопротеинов сыворотки крови мышей на моделях острой липемии, вызванных тритоном WR 1339 и полоксамером 407 и их изменение под влиянием аторвастатина и карбоксиметилированного-Р-1,3-0-гликана (КМГ).

Задачи исследования:

1. Изучить фракционный и субфракционный состав ЛП сыворотки крови у мышей при развитии острой липемии, вызванной с помощью однократного введения животным полоксамера 407 в высокой дозе (1000 мг/кг).

2. Оценить фракционный и субфракционный состав ЛП сыворотки крови у мышей при развитии острой липемии, вызванной с помощью однократного введения животным тритона WR 1339 и полоксамера 407 в одинаковой дозе (500 мг/кг).

3. Исследовать морфометрические показатели макрофагов печени животных при однократном введении тритона WR 1339 и полоксамера 407.

4. Выявить влияние аторвастатина на фракционный и субфракционный состав ЛП и активность ММП сыворотки крови мышей при острой липемии, вызванной введением полоксамера 407 (500 мг/кг) и тритона 1339 (500 мг/кг).

5. Изучить влияние карбоксиметилированного-Р-1,3-Р-гликана (КМГ) на липемию у мышей, вызванную введением полоксамера 407 (500 мг/кг) в

сравнении с аторвастатином.

Научная новизна. При острой липемии у мышей, вызванной полоксаме-ром 407 и тритоном WR 1339, впервые выявлены нарушения субфракционного состава атерогенных и антиатерогенных фракций ЛП сыворотки крови. Впервые проведен сравнительный анализ моделей острой липемии, вызванных тритоном ШЯ 1339 и полоксамером 407, на уровне изменения содержания фракций и отдельных субфракций ЛП сыворотки крови. На модели липемии, вызванной полоксамером 407, продемонстрированы более выраженные нарушения атерогенных фракций ХС-ЛПОНП (субфракции ХС-ЛПОНП,.2) и ХС-ЛПНП, фракции ТГ-ЛПОНП (субфракции ТГ-ЛПОНП,.2) и ТГ-ЛПНП (субфракции ТГ-ЛПНП|.3) по сравнению с тритоном 1339.

Показано гиполипидемическое влияние аторвастатина при развитии острой липемии у мышей, вызванной тритоном АУЯ 1339 за счет снижения общего ХС-ЛП и проатерогенной фракции ХС-ЛПОНП (за счет субфракции ХС-ЛПОНП3-5), ХС-ЛПНП (за счет субфракции ХС-ЛППП), снижения содержания общих ТГ-ЛП, фракции ТГ-ЛПОНП (за счет субфракции ХС-ЛПОНП3.5), ате-рогенной фракции ТГ-ЛПНП (субфракции ЛППП).

Аторвастатин обладал менее выраженным гиполипидемическим действием при острой липемии, вызванной полоксамером 407, по сравнению с тритоном 1339, вызывая снижение общего ХС-ЛП и атерогенной фракции ХС-ЛПНП (субфракции ЛПНП1.3), фракции ТГ-ЛПНП (субфракции ЛПНП,.3) в сыворотке крови животных.

Установлен характер взаимосвязи гиполипидемического эффекта аторва-статина с изменением активности ММП в сыворотке крови на модели экспериментальной липемии, вызванной полоксамером 407 (500 мг/кг). Гиполипидеми-ческое действие аторвастатина сопровождалось увеличением активности ММП в результате плейотропного эффекта аторвастатина в высокой дозе.

Научно-практическая значимость. Выявленные изменения содержания фракций и отдельных субфракций ЛП сыворотки крови у мышей позволяют использовать модель липемии, вызываемую полоксамером 407, для изучения факторов риска развития атеросклероза. Изменения состава ЛП сыворотки крови на модели липемии у мышей, вызванной введением полоксамера 407, как и тритона WR 1339, сходны с изменениями при дислипопротеинемиях IIa/Мб, III типа у человека и могут рассматриваться как модели этих типов дислипопроте-инемий. Модель липемии, вызываемая полоксамером 407, перспективна для изучения роли изменений фракционного и субфракционного состава липопро-теинов крови в патогенезе экспериментального атеросклероза (при длительном использовании полоксамера 407), а также для тестирования гиполипидемиче-ских препаратов, в том числе, снижающих гипертриглицеридемию.

Полученные результаты работы могут быть использованы в разработке лекций и учебно-методических пособий для биологических и медицинских специальностей в ВУЗах.

Положения, выносимые на защиту:

1. Особенностью модели липемии с полоксамером 407 является многократное увеличение содержания атерогенных фракций ЛПНП, ЛПОНП и их субфракций в сыворотке крови.

2. Модель с полоксамером 407 демонстрирует более выраженный эффект острой липемии, по сравнению с тритоном WR 1339.

3. Гиполипидемическое действие аторвастатина при липемии, вызванной тритоном WR 1339, выражается в снижении показателей общего холестерина (ХС) и триглицеридов (ТГ), а также снижении содержания общего ХС-ЛП и

проатерогенной фракции ХС-ЛПОНП (за счет субфракции ХС-ЛПОНП3.5), ХС-ЛПНП (за счет субфракции ХС-ЛППП), снижения содержания общих ТГ-ЛП, фракции ТГ-ЛПОНП (за счет субфракции ХС-ЛПОНП3.5), атерогенной фракции

ТГ-ЛПНП (субфракции ЛГ1ПП).

4. Введение аторвастатина при липемии, вызванной полоксамером 407, вызывает снижение показателей общего ХС и ТГ, а также уменьшения содержания общего ХС-ЛП и атерогенной фракции ХС-ЛПНП (субфракции ЛПНП,. з), атерогенной фракции ТГ-ЛПНП (субфракции ЛПНП,.3) в сыворотке крови животных.

5. КМГ по сравнению с аторвастатином, оказал менее значительный ги-полипидемический эффект при липемии, вызванной полоксамером 407.

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены: на V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Здоровье - основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения" (Санкт-Петербург, 24-27 ноября 2010 г.); на 11 Съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2-3 ноября 2010 г); на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Вопросы патогенеза типовых патологических процессов" (Новосибирск, 23-24 марта 2011 г.); на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Здоровье - основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения" (Санкт-Петербург, 24-26 ноября 2011 г.); на VII Сибирском съезде физиологов (Красноярск, 27-29 июня, 2012 г.); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Сахарный диабет, метаболический синдром и сердечно-сосудистые заболевания: современные подходы к диагностике и лечению" (Томск, 25-26 октября2012 г.); 18thWorld Congress On Heart Disease Annual Scientific Sessions (2013 Vancouver, Be, Canada, July 26-29), 19th ESGLD Workshop, 26-29 September 2013, Seggau Castl, Austria.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 3 статьи в рекомендуемых ВАК журналах и 3 - в иностранных журналах.

Объем и структура диссертации. Материал диссертации изложен на121 страницах машинописного текста, содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Диссертация содержит 11 таблиц и 22 рисунка. Список цитируемой литературы включает 199 источников, в том числе 59 отечественных и 140 зарубежных авторов.

Настоящая работа выполнена в рамках НИР лаборатории клеточной биохимии и физиологи ФГБУ "НИИ ФФМ" "Клеточные и молекулярные механизмы функционирования протеаз и их ингибиторов в норме и при воспалительных и опухолевых процессах" (045), № гос. регистрации 01.2.00950889; руководитель-д.м.н. Короленко Т.А., 2009-2012 гг.

Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю д.м.н., проф. Короленко Т.А. за методическую помощь, поддержку и консультации. Выражает благодарность сотруднику Института цитологии и генетики СО РАН, к.б.н. Каледину В.И. и сотруднику ФГБУ "НИИ ФФМ" СО РАМН, к.б.н. Филюшиной Е.Е. за помощь в работе и

критические замечания.

Материалы и методы исследования

В работе использовали 252 самца мышей линии ICR, массой 20-25 г (виварий Института цитологии и генетики СО РАМН, г. Новосибирск).

В качестве моделей липемии использовали введение животным тритона WR 1339 (Ruger Chemical Co., USA) и полоксамера 407 (Sigma, USA). Тритон WR 1339 - неионный детергент, изооктил-полиоксиэтилен фенол с общей формулой С|7Н2803. Полоксамер 407 (Pluronic F-127, Сигма, США) - неионный детергент, блок-сополимеров - полиоксиэтилен-полиоксипропилен), с общей формулой: Н0(С2Н40)а(СЗН60)Ь(С2Н40)аН, где а=100, Ь=65.

Проведено четыре серии экспериментов.

В первой серии экспериментов для воспроизведения липемии у мышей использовали полоксамер 407, который вводили мышам однократно, внутри-брюшинно, в дозе 1000 мг/кг массы тела животных (Palmer et al., 1998). Забой животных производили спустя 24, 48 ч (максимальное развитие гиперлипе-мии), 4, 5, 7, 12, 14 суток после однократного введения детергента (постепенное восстановление показателей).

Во второй серии экспериментов выделяли следующие группы животных:

1. Контроль (интактные животные).

2. Аторвастатин (Аторис, КРКА, Словения) вводили через эндогастральный зонд в дозе 75 мг/кг массы тела животных, в виде взвеси в 3% крахмальном геле, двукратно, за 24 ч и 3 ч до введения тритона WR 1339 в 4 ои группе (данной группе тритон WR 1339 не вводился).

3. Тритон WR 1339 вводили в дозе 500 мг/кг массы тела животных, однократно, внутрибрюшинно (Millar et al., 2005).

4. Аторвастатин вводили через эндогастральный зонд в дозе 75 мг/кг массы тела животных, в виде взвеси в 3% крахмальном геле, двукратно, за 24 ч и 3 ч до введения тритона WR 1339 (Eliot and Jamali, 1999).

Животных выводили из эксперимента декапитацией спустя 24 ч после введения тритона WR 1339.

В третьей серии экспериментов выделяли следующие группы животных:

1. Контроль (интактные животные).

2. Аторвастатин вводили через эндогастральный зонд в дозе 75 мг/кг массы тела животных, в виде взвеси в 3% крахмальном геле, двукратно, за 24 ч и 3 ч до введения полоксамера 407 в 4 ой группе (данной группе полоксамер 407 не вводили).

3. Полоксамер 407 вводили в дозе 500 мг/кг массы тела животных однократно, внутрибрюшинно (Johnston, 2004).

4. Аторвастатин вводили через эндогастральный зонд в дозе 75 мг/кг массы тела животных, в виде взвеси в 3% крахмальном геле, двукратно, за 24 ч и 3 ч до введения полоксамера 407 (Eliot and Jamali, 1999).

В четвертой серии экспериментов выделяли следующие группы животных:

1. Контроль (интактные животные).

2.Карбоксиметилированный-р-1,3-0-гликан (КМГ, Институт химии Словацкой АН, Братислава, Словакия) вводили двукратно, внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг массы тела животных, за 72 и 24 часа до введения полоксамера 407 в 4е" группе (данной группе полоксамер 407 не вводили).

3. Полоксамер 407 в дозе 500 мг/кг массы тела животных однократно, внутрибрюшинно (Johnston, 2004).

4.Карбоксиметилированный-Р-1,3-0-гликан вводили двукратно, внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг массы тела животных, за 72 и 24 часа до введения полоксамера 407.

Животных выводили из эксперимента декапитацией спустя 24 ч после введения полоксамера 407.

Для морфологического исследования образцы ткани печени фиксировали в смеси 2% параформальдегида и 2,5% глютарапьдегида на 0,1 M фосфатном буфере, дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия и заключали в эпон-аралдит по общепринятой схеме. Полутонкие, толщиной 1 мкм, срезы ткани готовили на ультрамикротоме LKB-8800-V (Швеция). На полутонких срезах, окрашенных толуидиновым синим, под световом микроскопом определяли численную плотность макрофагов (число клеток на 1 мм2). Исследованию подвергали не менее 50 полей зрения при увеличении микроскопа АХЮ STAR (Carl Zeiss, Германия) х640.

Ультраструктурные изменения в клетках печени изучали с помощью электронного микроскопа JEM-1400 (Япония) при увеличении х20000. Измерения клеток проводили с помощью программы Motic Images 2000.

Определение концентрации общего ХС и ТГ в сыворотке крови производилось с помощью коммерческого набора «Новохол» (Вектор-Бест, Россия) ферментативным колориметрическим методом. Концентрацию ХС-ЛПВП про-водилис использованием коммерческого набора реагентов «ЛВП - Холестерин-Ново» (Вектор-Бест, Россия). Концентрацию ХС-ЛПНП рассчитывали по формуле Фридвальда. Значения указанных показателей выражали в мг/дл.

Фракционный и субфракционный составы ЛП сыворотки крови определяли методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) с использованием дифрактометра фирмы Siemens (Германия). Исследование проведено на базе Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН совместно с проф. Тузиковым Ф.В.

Активность ММП определяли флюориметрически по методу Knight et'al. (Knight et al., 1992) при рН 7,5, используя субстрат MCA-Pro-Leu-Gly~Leu-Dpa-AIa-Arg-NH2 (American Peptide Company Inc., США) в концентрации 1,6 мкмоль/л, где MCA - 7-метоксикумарин-4-ацетил, Dpa - N-3-(2,4-динитрофенил)-Ь-а,р-диаминопропионил - гаситель флюоресценции (Knauper et al., 1996; Will etal., 1996). Активность ММП выражали в мкмоль МКА/г белка в час для гомогенатов и в мкмольМКА/л в час для сыворотки крови, где

МКА - метилкумариламид.

При проведении статистической обработки результатов использовался пакет программ Statistica 6.0. В зависимости от характера распределения (Колмогорова-Смирнова), значимость различия средних оценивали параметрическим методом с помощью t - критерия Стьюдента и непараметрическим методом Kruskal-Walles. При сравнении моделей липемии абсолютные значения ХС-ЛП и ТГ-ЛП каждой фракции выражали в мг/дл, результаты рассчитывали и представляли как соотношение абсолютных значений каждой фракции, отнесенной к соответствующему контролю (в процентах). Различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Липемия у мышей, вызванная полоксамером 407 (1000 мг/кг) Концентрация ХС сыворотки повышена в 20 раз через 24 ч, в 10 раз спустя 48 ч и в 3 раза спустя 4 сут после введения полоксамера 407, концентрация ТГ - соответственно в 30, в 6 и в 3 раза (рис.1). Таким образом, введение полоксамера 407 мышам воспроизводит признаки гипертриглицеридемии и ги-перхолестеринемии на 24 и 48 ч с последующей нормализацией показателей к 5 сут.

Полоксамер 407. 1000 мг/кг

Рис.1 Влияние полоксамера 407 на концентрацию ХС и ТГ в сыворотке крови мышей (мг/дл). Примечание: число животных в группе - 7; **р<0,01; ***р<0,001 - по сравнению с интактными животными (контроль)

Обнаружено увеличение ХС-ЛП спустя 24, 48 ч и 4 сут.: атерогенных ХС-ЛПОНП и их субфракций: ЛПОНП,.2 и ЛПОНП 3.5, атерогенных ХС-ЛПНП, ХС-липопротеинов промежуточной плотности (ХС-ЛППП), а также выражен-

ное в меньшей степени повышение антиатерогенных ХС-ЛПВП (только спустя 24 и 48 ч) (табл.1).

Гиперхолестеринемия, вызываемая полоксамером 407, обусловлена увеличением активности З-гидрокси-З-метилглутарил коэнзим А-редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы), синтезируемой в печени, а также с уменьшением активности ЛПНП-рецепторов, связывающих ЛПНП (Leon et al, 2006). Гипертриглицери-демия связана с подавлением гидролиза ТГ, предположительно, за счет ингиби-рования липопротеинлипазы (Dumortier et al., 2006).

Изменение концентрации фракции ТГ-ЛП было подобно ХС-ЛП.

Таблица 1.

Концентрация фракций и субфракций ХС-ЛП в сыворотке крови мышей при введении полоксамера 407 (1000 мг/кг)

ЛП, мг/дл Контроль (интактные) (п=10) Полоксамер 407, 24 час. (п=Ю) Полоксамер 407, 48 час. (п=8) Полоксамер 407, 4 сут. (п=5)

ХС-ЛПобщ. 107,4±8,84 662,9±82,40*** 599,7±104,11** 727,2±87,2***

хс-лпонп 6,5±1,85 345,8±46,90*** 271,3±73,02** 134,4±46,23**

ХС-ЛПОНП|.2 0,3±0,07 16,7±2,13*** 12,8±4,70** 8,9±4,И

ХС-ЛПОНПз-5 6,0±1,71 329,1±45,54*** 258,5±70,44** 125,5±42,43**

ХС-ЛПНП 43,1±7,67 106,9±24,15** 201,0±34,38*** 247,3±31,52***

хс-лппп 1,9±1,61 40,3±11,13** 54,9±27,45 34,9±13,32*

ХС-ЛПНП,.3 41,2±8.61 66,6±25,54 146,1±32,68** 212,4±35,56**

ХС-ЛПВП 57,9±9,75 210,2±48,36** 127,4±41,93 45,4±13,30

ХС-ЛПВП2 43,1±10,02 166,5±38,70** 91,9±47,31 16,9±8,55

ХС-ЛПВПз 14,7±3,55 3,7±20,21 35,5±8,94 28,5±9,23

**р< 0,01; ***р < 0,001 vs контроль

Показано, что спустя сутки после введения полоксамера 407 в печени расширены синусоиды, численная плотность макрофагов значительно увеличена (почти в 2 раза), по сравнению с интактными (табл.2).

Таблица 2.

Влияние полоксамера 407 на численную плотность макрофагов печени

мышей

Группы и число животных Численная плотность макрофагов печени, на мм'

1.Интактные (контроль) (5) 1277,4 ± 36,86

2. Полоксамер, 24 ч. (5) 2002,6 ±36,58 р< 0,01

3. Полоксамер, 5 сут. (5) 844,6 ±28,74 р<0,01

Примечание: в скобках - число животных в группе

Спустя 5 суток в печени по данным морфометрии удельная численная плотность макрофагов ниже, не только по сравнению с предыдущим показателем, но и по отношению к контролю (табл.2).

Липемия у мышей, вызванная тритоном ЬУЯ 1339 (500мг/кг) и гиполипидеми-

Подобно полоксамеру 407, тритон 1339,. после введения вызывает появление в печени макрофагов, заполненных гранулами, что придает цитоплазме пенистый вид (спустя 1сут., рис.2)

Рис. 2. Электронограмма среза печени мыши. Тритон 1339 (500 мг/кг), спустя 1 сут. В просвете печеночного синусоида расположена крупная макрофагальная клетка, цитоплазма которой заполнена большим количеством крупных светлых гранул (Гр.); увеличение ><20000

Липемия у животных характеризовалась резким повышением спустя 24 ч после введения тритона 1339 содержания в сыворотки крови общего ХС и особенно ТГ - в 14 раз (рис. 3). Показан гиполипидемический эффект аторва-статина: его введение мышам на фоне тритона "МЯ 1339 приводило к снижению концентраций общего ХС и ТГ (рис. 3).

При липемии, вызванной тритоном ШЯ 1339 отмечено увеличение общей концентрации ХС-ЛП (табл.3). Наиболее резко, почти в 20 раз, повышено содержание проатерогенной фракции ХС-ЛПОНП и ее обеих субфракций - ХС-ЛПОНП,_2 и ХС-ЛПОНП3_5 • Увеличено содержание общего ХС-ЛПНГ1, субфракции ХС-ЛППП. Концентрация антиатерогенной фракции ХС-ЛПВП оставалась схожей со значением у интактных животных. Обнаружено увеличение

ческое влияние аторвастатина

содержания ее субфракции ХС-ЛПВП, (табл.3). Гиполипидемический эффект аторвастатина выражался в уменьшении концентрации ХС-ЛП (табл.4). Умеренное снижение концентрации проатерогенного ХС-ЛПОНП наблюдалось за

счет субфракции ХС-ЛПОНП3_5.

Выявлено резкое снижение содержания атерогенного ХС-ЛПНП, обусловленное снижением концентрации субфракции ХС-ЛППП. Отмечено повышение содержания антиатерогенного ХС-ЛПВП за счет субфракции ХС-ЛПВП3, что свидетельствует о защитном эффекте аторвастатина (табл.3).

2000

Рис 3 Влияние аторвастатина на концентрацию ХС и ТГ в сыворотке крови у мышеи при ли-пемии вызванной тритоном WR 1339 (500 мг/кг). Примечание: число животньгх в группах -15- *р < 0 001 в сравнении с контролем; # р < 0,001 в сравнении с тритоном WR 1339; ато-рвастатин (75 мг/кг), вводили двукратно, за 24 ч и 3 ч до введения тритона WR 1339 (Eliot and Jamali, 1999)

Введение аторвастатина интактным мышам не вызывало изменения общей концентрации ХС-ЛП (табл.3). Концентрация атерогенной фракции ХС-ЛПОНП и ее субфракции ХС-ЛПОНП3.5 снизились. В то время как,

концентрация антиатерогенной фракции ХС-ЛПВП и ее субфракции ХС-ЛПВП2, наоборот, повысились.

Аторвастатин, при предварительном введении мышам с липемией (тритон 1339) снижал концентрацию фракций и субфракций ТГ-ЛП, которые были аналогичны нарушениям ХС-ЛП, описанным выше. Установлена положительная корреляционная связь между концентрациями ХС-ЛПОНП и ТГ-ЛПОНП (г = 0,943, Р <0,05) и ХС-ЛПНП и ТГ-ЛПНП (г = 0,942, Р <0,05).

Таблица 3.

Влияние аторвастатина на концентрацию фракций и субфракций ХС-ЛП

сыворотки крови мышей при экспериментальной липемии, _вызванной тритоном \¥11 1339 (500 мг/кг)__

Фракции и субфракции ЛП (мг/дл) Контроль, (интактные) (п=8) 1 Аторвастатин, 75 мг/кг, двукратно (п=8) 2 Тритон \yR1339, 24 час (п = 8) 3 Аторвастатин +тритон \VR1339, 24 час. (п = 8) 4

Общий ХС-ЛП 83,0± 6.32 103,8 ±11.00 371,8± 52.16** 237,0 ± 17,54** Рз-4 < 0,05

ХС-ЛПОНП 11,9±1.72 4,8± 0,73* 237,3 ±40,97** 169,4 ± 18,03*

ХС-ЛПОНП,_2 0,5±0,12 0,4±0,06 3,5 ± 1,02* 1,4 ±0,23*

ХС-ЛПОНПз.з 11,3±1,63 4,4± 0,68* 296,0 ±41,66* 148,7 ±22,71** Р3-4< 0,01

ХС-ЛПНП 4,4 ±1,31 3,8±1,16 38,5 ± 10,58* 4,1 ±0,89 Р3-4<0,01

ХС-ЛППП 1,8±0,57 1,9 ±0,48 24,7 ±6,01** 1,9 ± 0.82 Р3-4< 0,01

ХС-ЛПНП |.з 2.6 ± 0,82 2,5 ± 1,85 4,9 ± 0,96* 2,8 ±0,45

ХС-ЛПВП 66,9 ± 6,75 96,7 ± 9,74* 72,2 ±7,85 90,8 ±6,72*

ХС-ЛПВП2 60,2 ±5,82 87,6 ±8,86* 39,8 ± 11,11 45,6 ± 6,32

ХС-ЛПВПз 6,7±1,18 8,6 ±2,63 36,4 ± 5,19 ** 45,2±7,75**

* р< 0,05; **р< 0,01 Ув контроль; р3-4 - Аторвастатин +Тритон \VR1339 в сравнении с Тритоном 1339

Введение аторвастатина мышам с гиперлипемией, вызванной тритоном 1339 приводило к увеличению активности ММП сыворотки (рис. 4). При этом значение активности ММП превышало данный показатель у контрольных мышей (рис. 4).

700 § « 600

§¿5 500 5 2 400

300

I О 200 ш г

I I 100 < о

Интакт. (контроль) Тритон 1339. Аторвастатин, 7а, Аторвастатин 500 мг/кг мг/кг, двухрат -»Тритон МР? 1339.

500 мг/кг

Рис.4 Влияние аторвастатина на активность ММП сыворотки у мышей при липемии, вызванной тритоном WR 1339 (500 мг/кг). Примечание: число мышей в группах - 9-10; ** р< 0,01 Ув контроль

В эксперименте с липемией, вызванной тритоном 1339 (500 мг/кг), при введении аторвастатина установлена обратная корреляционная связь между концентрацией ХС сыворотки и активностью ММП (г =-0,632; Р<0,01), и концентрацией ТГ сыворотки и активностью ММП (г =-0,780; Р <0,01).

Липемия у мышей, вызванная полоксамером 407(500 мг/кг) и гиполипидемическое влияние аторвастатина Показано, что гиперлипемия, вызываемая полоксамером 407 у мышей, характеризовалась значительным подъемом общего ХС и, особенно, ТГ в сыворотке крови животных (рис.5). Введение аторвастатина мышам вызывало снижение концентрации общего ХС и ТГ в сыворотке крови животных (рис.5).

Электронно-микроскопические исследования печени мышей при введении полоксамера 407 (500 мг/кг), подобно тому, как это показано с большей дозой этого препарата - 1000 мг/кг, продемонстрировали, что синусоиды печени значительно расширены, численная плотность макрофагов значительно увеличена. Макрофаги заполнены гранулированным материалом (рис.6).

Контроль Аторвастатин Полоксамер 407 Аторвастатнн+

полоксамер 407

Рис. 5 Влияние аторвастатина на липемию у мышей, вызванную полоксамером 407 (500 мг/кг). Примечание: по оси абсцисс - группы животных (число животных в группе - 10); по оси ординат - концентрация ХС и ТГ в сыворотке крови мышей (мг/дл); *р<0,001 в сравнении с контролем; # р<0,001 в сравнении с полоксамером 407

Рис. бЭлектронограмма среза печени мыши. Полоксамер, 500 мг/кг, 1 сут. Гранулы (звездочки) в клетках Купфера (МФ), гепатоциты (ГЦ), синусоидное пространство (СП). Увеличение х20000

У мышей с липемией, вызванной полоксамером 407 отмечено повышение ХС-ЛП - (табл.4), проатерогенной фракции ЛПОНП, особенно субфракции -ЛПОНП|_2 , атерогенной фракции ЛПНП, за счет субфракции - ЛППП (в 140 раз). Наименее выражено повышение концентрации антиатерогенной фракции ЛПВП за счет субфракции - ЛПВП2.

При введении аторвастатина изменение фракционного и субфракционного составов ХС-ЛП выражалось в снижении общего ХС-ЛП и атерогенной фракции ЛПНП (за счет субфракции ЛПНП,.3). Однако, это снижение не достигало значений соответствующих показателей у интактных мышей (табл.4). Изменения во фракциях и субфракциях ТГ-ЛП были подобны тенденциям, наблюдаемым в изменениях во фракциях и субфракциях ХС-ЛП, описанных выше.

Таблица 4.

Влияние аторвастатина на концентрацию фракций и субфракций ХС-ЛП

сыворотки крови мышей при экспериментальной липемии, _вызванной полоксамером 407 (500 мг/кг) ____

Фракции и субфракции ЛП (мг/дл) Интактные (контроль) (п=7) 1 Аторвастатин, (двукр. 75 мг/кг)(п=8) 2 Полоксамер 407,24 час.(п=8) 3 Аторвастатин + Полоксамер 407,24 час. (п=7) 4

ХС-ЛПВПз 50,98±б,57 42,31±4,13* 58,90±9,63 52,18±5,45

ХС-ЛПВП2 23,74±4,14 26,74±4,13 61,10±9,30* 43,82±3,47*

ХС-ЛПВП 74,71 ±4,42 69,04±2,45* 120,00±8,25* 96,00±4,59* р3.4<0,05

ХС-ЛП НП,.3 15,05±4,03 16,82±5,47 273,57±28,43* 216,29±37,55* р3.4<0,05

ХС-ЛППП 0,20±0,05 0,20±0,02 28,74±7,74* 34,21±7,09*

ХС-ЛПНП 15,23±4,03 16,99±5,47 302,31±31,26* 250,50±43,87* р3.4<0,05

ХС-ЛПОНПз-5 2,39±0,43 0,66±0,18* 15,17±2,77* 10,99±2,68*

ХС-ЛПОНП|.2 0,34±0,06 0,36±0,14 10,64±1,78* 8,16±1,28*

ХС-ЛПОНП 2,73±0,43 1,02±0,23* 25,40±3,11* 19,М±3,30*

ХС-ЛП (общ.) 92,48±6,64 86,85±6,08 447,68±40,14* 365,63±50,25* Рз-4<0,05

*р< о,05; уб контроль; рз-4 - Аторвастатин + Полоксамер 407 в сравнении с Полоксамер 407

Влияние аторвастатина при гиперлипемии у мышей сопровождалось увеличением активности ММП сыворотки (рис. 7). Подобная тенденция наблюдалась у контрольных мышей, которым вводили аторвастатин. Увеличение активности ММП сыворотки отражает плейотропный эффект статина при использовании в высокой дозе.

В экспериментальной группе с гиперлипемией, вызванной полоксамером 407, установлены следующие положительные корреляции между показателями:

активностью ММР и концентрацией общего ХС сыворотки (г=0,84, р< 0,05), и между активностью ММР и концентрацией ТГ сыворотки (г=0,69, р < 0,05).

В группе контрольных мышей, которым вводили аторвастатин отмечена отрицательная корреляция между активностью ММП и концентрацией ХС-ЛПВП сыворотки (г=-0,88, р< 0,05). В группе контрольных мышей установлена положительная корреляция между концентрацией ХС-ЛПНП и ТГ сыворотки (г=0,91, р< 0,05).

350

Контроль Аторвастатин Полоксамер Аторвастатин

407 + полоксамер

407

Рис. 7 Влияние аторвастатина на активность ММП сыворотки у мышей при липемии, вызванной полоксамером (500 мг/кг). Примечание: количество животных в каждой группе - 910; **р< 0,01; ***р < 0,001 - по сравнению с контролем (интактные животные), # р<0,05 (при сравнении соответствующих показателей - полоксамер 407)

Сравнительная характеристика моделей липемии у мышей, вызванных введением тритона №Я 1339 и полоксамера 407

Полоксамер 407 и тритон 1339 в одинаковой дозе вызывали резкое увеличение концентрации общего ХС и ТГ сыворотки крови, более значительное при введении полоксамера 407 (рис. 8), причем гипертриглицеридемия была более выраженной, чем гиперхолестеринемия. При введении полоксамера 407, гиперхолестеринемия и гипертриглицеридемия выражены более значительно, чем при тритоне 1339 (рис. 8).

Среди атерогенных фракций концентрации ХС-ЛПОНП (субфракции ХС-ЛПОНПи) и ХС-ЛПНП, повышены более значительно при воздействии полоксамера 407 по сравнению с тритоном ШЯ 1339 (рис. 9).

Рис.8 Концентрация ХС и ТГ в сыворотке крови мышей с введением тритона \УЯ 1339 (500 мг/кг) и полоксамера 407 (500 мг/кг). Примечание: количество животных в каждой группе -10; *р< 0,001 по сравнению с контролем (интактные животные); # р<0,01 (при сравнении соответствующих показателей опытных групп - тритон 1339 и полоксамер 407)

Рис 9 Соотношение концентраций ХС-ЛП фракций и субфракций сыворотки крови мышей при введении тритона WR 1339 (500 мг/кг) и полоксамера 407 (500 мг/кг) (М±т). Примечание: по оси абсцисс - фракции и субфракции ХС-ЛП; по оси ординат - соотношение концентраций каждой фракции и субфракции ХС-ЛП при введении тритона WR 1339 и полоксамера 407 (относительно контроля, в %); *р< 0,05; **р<0,01 (тритон WR 1339 и полоксамер 407)

При введении полоксамера 407 по сравнению с тритоном 1339 также более выражено увеличение фракции ТГ-ЛПОНП (субфракции ТГ-ЛПОНП,.2) и фракции ТГ-ЛПНП (субфракции ТГ-ЛПНП,.3) (рис. 10).

Рис 10 Соотношение концентраций ТГ-ЛП фракций и субфракций сыворотки крови мышей при введении тритона WR 1339 (500 мг/кг) и полоксамера 407 (500 мг/кг) (М±т). Примечание по оси абсцисс - фракции и субфракции ТГ-ЛП; по оси ординат - соотношение концентраций каждой фракции и субфракции ТГ-ЛП при введении тритона WR 1339 и полоксамера 407 (относительно контроля, в %); * р< 0,05; **р<0,01 (тритон WR 1339 и полоксамер 407)

На исследованных моделях липемии нами показано, что концентрации субфракций ХС-ЛППП и ТГ-ЛППП достигали максимальных значений по сравнению с другими субфракциями (рис. 9, 10). ЛППП являются самыми нестабильными частицами ЛП, которые образуются из ЛПОНП. Часть ЛППП захватывается ЛПНП-рецепторами печени, скевенджер-рецепторами, а часть гид-ролизуется и превращается в ЛПНП (Tuzikov et а!., 2002).

Особенностью модели липемии, вызываемой полоксамером 407, было повышение концентраций антиатерогенных фракций ХС-ЛПВП (субфракций ХС-ЛПВП2) и ТГ-ЛПВП (субфракций ТГ-ЛПВП2) (рис. 9, 10).

Действие карбоксиметилированиого-/1-1,3-0-гликана (КМГ) на липемию у мышей, вызванную полоксамером 407 (500 мг/кг)

Введение КМГ мышам сопровождалось существенным повышением активности макрофагов печени. По данным морфометрии отмечалось увеличение численной плотности макрофагов в 1,5 раза (р<0,001), одновременно, уменьшение числа первичных лизосом в 3,5 раз (р<0,001), увеличение числа вторичных лизосом в 6 раз (р<0,001). Увеличение численной плотности макрофагов печени и числа вторичных лизосом указывают на признаки стимуляции макрофагов при введении КМГ (Korolenko et al., 2012). В сравнении с контролем, в структуре макрофагов печени отмечалась их высокая функциональная активность: увеличен размер клеток, многие из которых имели впячивания цитоплазм этической мембраны, большое количество гранул различных размеров в цитоплазме, развитый эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи.

В целом, по сравнению с аторвастатином гиполипидемический эффект КМГ менее выражен (рис.11). КМГ обнаружил лишь тенденцию к уменьшению атерогенного ХС-ЛПНП (рис. 11).

Полоксамер 407

Рис. 11 Влияние КМГ на липемию у мышей, вызванную полоксамером 407 (500 мг/кг) Примечание: число животных в контрольной группе - 21; в группах с КМГ и полоксамером 407 - 15; V ,р< 0,05: *, р< 0,01 в сравнении с контролем; р< 0,05 в сравнении с полоксамером 407; КМГ (25 мг/кг), вводили двукратно (¡.р.), за 72 и 24 часа до введения полоксамера 407. Животных выводили из эксперимента спустя 24 ч после введения полоксамера 407

выводы

1. Модели липемии, воспроизводимые введением как полоксамера 407, так и тритона \УЯ 1339, характеризовались значительным подъемом общего ХС липопротеинов и ТГ липопротеинов, причем гипертриглицеридемия более выражена, чем холестеринемия; концентрации атерогенных субфракций ХС-ЛППП и ТГ-ЛППП достигали максимальных значений по сравнению с контролем.

2. Модель липемии, вызванная полоксамером 407, выявила более значительное повышение концентраций общего ХС, ТГ и атерогенных фракций и субфракций ХС-ЛП и ТГ-ЛП по сравнению с тритоном У/Я 1339. Атерогенные фракции ХС-ЛПОНП (субфракции ХС-ЛПОНП,,2) и ХС-ЛПНП, фракции ТГ-ЛПОНП (субфракции ТГ-ЛПОНП,.2) и фракции ТГ-ЛПНП (субфракции ТГ-ЛПНП,.3) повышены более значительно при воздействии полоксамера 407 (500 мг/кг) по сравнению с тритоном \УЯ 1339.

3. Гиполипидемический эффект аторвастатина более выражен на модели липемии, вызванной тритоном \УЯ 1339, по сравнению с полоксамером 407 и связан со снижением содержания атерогенных фракций ХС-ЛПНП (субфракции ХС-ЛППП) и ХС-ЛПОНП (субфракции ХС-ЛПОНПз.5)- Одновременно, аторвастатин оказывал положительное влияние при гипертриглицеридемии, снижая содержание атерогенных фракций ТГ-ЛПНП (субфракции ТГ-ЛППП) и ТГ-ЛПОНП (субфракции ТГ-ЛПОНП3.5). .,

4. На фоне гиполипидемического действия аторвастатина на липемию; вызванную полоксамером 407 и тритоном У/Я 1339, активность ММП сыворотки крови у мышей увеличивалась. Увеличение активности ММП сыворотки отражает плейотропный эффект статина при использовании в высокой дозе.

5. Карбоксиметилированный-Р-1,3 -Э-гликан (КМГ) по сравнению с ато-рвастатином проявлял гиполипидемический эффект только в отношении концентрации триглицеридов, не влияя на содержание холестерина при липемии, вызванной полоксамером 407.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Логинова В.М., Тузиков Ф.В., Тузикова H.A., Филюшина Е.Е., Ясакова Н.Т., Савченко Н.Г., Короленко Т.А. Влияние полоксамера 407 на фракционный и субфракционный состав липопротеинов сыворотки крови мышей И Бюллетень СО РАМН.- 2010,- Т. 30.- № 5.- С.70-75.

2. KorolenkoT.A., TuzikovF.V., Tuzikova N.A., Filjushina V.M., Loginova V.M., Savchenko N.G. Influence of poloxamer 407 on fractional and subfractional composition of serum lipoproteins of mice // Health.- 2010 - 2(7). - P. 391-399.

3. Логинова B.M., Тузиков Ф.В., Тузикова H.A., Филюшина E.E, Короленко Т.А. Влияние аторвастатина на фракционный и субфракционный состав липопротеинов сыворотки крови мышей при экспериментальной липемии, вызванной тритоном WR 1339 // Здоровье - основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения: Труды V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - СПб.- 2010.- С.363-364.

4. Логинова В.М., Тузиков Ф.В., Тузикова H.A., Филюшина Е.Е., Савченко Н.Г., Гончарова И.А., Короленко Т.А. Влияние полоксамера 407 на фракционный и субфракционный состав липопротеинов сыворотки крови мышей // II Съезд терапевтов Сибири и Дальнего Востока: Сб. Материалов: 2-3 ноября 2010 года, г. Новосибирск. - Новосибирск. - 2010. - С.75.

5. Логинова В.М., Тузиков Ф.В., Тузикова H.A. Черканова М.С., Филюшина М.Е., Короленко Т.А. Влияние аторвастатина на липиды сыворотки крови мышей при экспериментальной липемии // Бюллетень СО РАМН,- 2011.- Т.31.-№ 2.- С.133-137.

6. Korolenko Т.А., Cherkanova M.S., Tuzikov F.V., Johnston T.P., Tuzikova N.A, Loginova V.M. and Kaledin V.I Influence of atorvastatin on fractional and sub-fractional composition of serum lipoproteins and MMP activity in micewith Triton WR 1339-induced lipaemia // Journal of Pharmacy and Pharmacology. - 2011. - 63.-P. 833- 839.

7. Логинова B.M., Тузиков Ф.В, Тузикова Н.А, Черканова М.С., Короленко Т.А. Влияние аторвастатина на фракционный и субфракционный состав липопротеинов сыворотки крови мышей при липемии, вызванной полоксамером 407 // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Труды III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. -Новосибирск.-2011.-С.152-154.

8. Логинова В.М., Тузиков Ф.В., Тузикова H.A., Короленко Т.А. Модели липемии, вызываемые у мышей введением тритона WR 1339 и полоксамера 407 // Здоровье - основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения: Труды VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - СПб: Изд-во Политехи. Ун-та.- 2011.- С.174-175.

9. Логинова В.М., Тузиков Ф.В., Тузикова Н.А, Черканова М.С., Короленко Т.А. Влияние аторвастатина на липемию, вызванную введением мышам тритона WR 1339 и полоксамера 407 // VII Сибирский съезд физиологов. Материа-

лы съезда / Под ред. Л.И. Афтанаса, В.А. Труфакина, В.Т. Манчука, И.П. Ар-тюхова. - Красноярск. - 2012. - С. 303-304.

10. Korolenko Т.А., Tuzikov F.V., Cherkanova M.S., Johnston T.P., Tuzikova N.A., Loginova V.M., Filjushina E.E., Kaledin V.I. Influence of atorvaslatin and car-boxy methylated glucan on the serum lipoprotein profile and MMP activity of mice with lipemia induced by poloxamer 407 // Can. J. Physiol. Pharmacol.- 2012.- (90).-p.141- 153.

11. Логинова B.M., Тузиков Ф.В., Тузикова H.A., Короленко Т.А. Характеристика моделей липемии, вызванной у мышей введением тритона\УЯ 1339 и полоксамера 407 // Труды Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Сахарный диабет, метаболический синдром и сердечно-сосудистые заболевания: современные подходы к диагностике и лечению» Томск.-2012. - С.110-112.

12. Логинова В.М., Тузиков Ф.В., Тузикова Н.А.,Короленко Т.А. Сравнительная характеристика моделей липемии у мышей, вызываемых введением тритона WR 1339 и полоксамера 407// Бюл. Эксперим. Биол и мед.- 2013. -Т.155.- №2. - С.255-258.

13.Loginova V.M., Korolenko Т.А., Johnston Т.Р., Tuzikov F.V., Zhanaeva S.Y., Goncharova N.V. Lipoprotein fractions and subtractions and heart proteases in acute lipemia and murine model of atherosclerosis // 18,h World Congress on Heart Disease Annual Scientific Sessions (2013 Vancouver, B.C, Canada, July 26-29). -p.376.

M.Korolenko T.A., Johnston T.P., Tuzikov F.V., Pisareva E.E, Filjushina E.E., Loginova V.M. Poloxamer 407-induced lipidosis in mice and involvement of li-sosomes // 19th ESGLD Workshop, 26-29 September 2013, Seggau Castle, Austria, -p.70.

Подписано к печати 23.10.2013 формат - 60x84 1/8, Усл. печ. л. 1 Бумага: офсетная Печать: трафаретная Тираж: 100 экз. Номер заказа № 667 ООО " Типография ЮГУС", ИНН 5402548639, г. Новосибирск, ул. Залесского, 4, тел.: (383) 226-14-56,225-04-47

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Логинова, Виктория Михайловна, Новосибирск

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

0420145664*1

Логинова Виктория Михайловна

Фракционный и субфракционный состав липопротеинов сыворотки крови при экспериментальной липемии мышей, вызванной полоксамером 407 и тритоном \¥Я 1339

03.01.04 - биохимия Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Короленко Т.А.

На правах рукописи

Новосибирск-2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..............................................................6

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................7

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................15

1.1 Липопротеины и атеросклероз......................................................15

1.2 Экспериментальные модели атеросклероза на различных животных.......18

1.2.1 Диетические (холестериновые) модели атеросклероза.......................18

1.2.2 Генетические модели атеросклероза..............................................21

1.2.3 Химические модели атеросклероза...............................................24

1.2.3.1 Тритон 1339....................................................................25

1.2.3.2 Полоксамер 407........................................................................28

1.3 Гиполипидемические препараты.....................................................32

1.3.1 Статины.................................................................................32

1.3.2 (3- Гликаны............................................................................39

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................47

2.1. Лабораторные животные..........................................................................47

2.2 Модели липемии и гиполипедимическая терапия у мышей...................47

2.3. Препаративные процедуры...........................................................50

2.3.1. Получение сыворотки крови......................................................50

2.3.2. Получение гомогената печени и его подготовка к исследованию активности ферментов.....................................................................50

2.4. Методы лабораторных исследований..............................................51

2.4.1. Определение общей активности матриксных металлопротеаз (ММП)...51

2.4.2. Определение активности аланинаминотрансферазы (АЛТ).................52

2.4.3. Определение концентрации общего холестерина (ХС) в сыворотке крови...........................................................................................52

2.4.4. Определение концентрации триглицеридов (ТГ) в сыворотке крови.....53

2.4.5.0пределение концентрации холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛПВП) в сыворотке крови.............................................53

2.4.6. Расчет содержания холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛПНП) в сыворотке крови................................................................54

2.4.7. Определение концентрации фракций и субфракций холестерина липопротеинов (ХС-ЛП) и триглицеридов липопротеинов (ТГ-ЛП) в сыворотке крови.............................................................................54

2.5. Морфологические исследования образцов ткани печени мышей.........................................................................................57

2.6. Статистическая обработка результатов............................................57

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..................................58

3.1 Липемия у мышей, вызванная полоксамером 407 (1000 мг/кг).........58

3.1.1 Изменение относительной массы печени и селезенки у мышей при однократном введении полоксамера 407 (1000 мг/кг)..............................58

3.1.2 Изменение морфометрических показателей макрофагов печени и состава лейкоцитов периферической крови мышей при введении полоксамера 407 (1000 мг/кг)..............................................................................59

3.1.3 Влияние полоксамера 407 (1000 мг/кг) на концентрацию ХС и ТГ в сыворотке крови мышей..................................................................62

3.1.4 Влияние полоксамера 407 (1000 мг/кг) на фракционный и субфракционный состав ХС-ЛП сыворотки крови мышей........................63

3.1.5 Влияние полоксамера 407 (1000 мг/кг) на фракционный и субфракционный состав ТГ-ЛП сыворотки крови мышей........................64

3.2 Липемия у мышей, вызванная тритоном \\П 1339 (500 мг/кг) и гиполипидемическое влияние аторвастатина...................................66

3.2.1 Изменение морфометрических показателей макрофагов печени мышей при введении тритона 1339 (500 мг/кг)..........................................66

3.2.2 Гиполипидемическое влияние аторвастатина на липемию у мышей, вызванную тритоном 1339 (500 мг/кг)...........................................67

3.2.3 Влияние аторвастатина на концентрацию фракций и субфракций ХС-ЛП сыворотки крови мышей при экспериментальной липемии, вызванной тритоном 1339 (500 мг/кг)...........................................................68

3.2.4 Влияние аторвастатина на концентрацию фракций и субфракций ТГ-ЛП сыворотки крови мышей при экспериментальной липемии, вызванной тритоном 1339 (500 мг/кг)...........................................................70

3.2.5 Влияние аторвастатина на активность ММП сыворотки и печени у мышей при липемии, вызванной тритоном 1339 (500 мг/кг)................72

3.3 Липемия у мышей, вызванная полоксамером 407 (500 мг/кг) и гиполипидемическое влияние аторвастатина.....................................74

3.3.1 Изменение морфометрических показателей макрофагов печени мышей при введении полоксамера 407 (500 мг/кг)...........................................74

3.3.2 Гиполипидемическое влияние аторвастатина на липемию у мышей, вызванную полоксамером 407 (500 мг/кг)..........................................76

3.3.3 Влияние аторвастатина на концентрацию фракций и субфракций ХС-ЛП сыворотки крови мышей при экспериментальной липемии, вызванной полоксамером 407 (500 мг/кг)............................................................77

3.3.4 Влияние аторвастатина на концентрацию фракций и субфракций ТГ-ЛП сыворотки крови мышей при экспериментальной липемии, вызванной полоксамером 407 (500 мг/кг)............................................................78

3.3.5 Влияние аторвастатина на активность ММП сыворотки и печени у мышей при липемии, вызванной полоксамером 407 (500 мг/кг)..........................................................................................79

3.4 Действие карбоксиметилироваиного-р-1,3-0-гликана (КМГ) на липемию, вызванную у мышей полоксамером 407 (500 мг/кг)...............82

3.5 Сравнительная характеристика моделей липемии у мышей, вызванных введением тритона 1339 (500 мг/кг) и полоксамера 407 (500 мг/кг)....................................................................................87

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ....................................91

ВЫВОДЫ....................................................................................97

ЛИТЕРАТУРА..............................................................................99

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЛТ - аланинаминотрансфераза Ацетил-КоА - ацетил-коэнзим А ДЛП - дислипопротеинемия ГЛП - гиперлипопротеинемия

ГМГ-КоА - З-гидрокси-З-метилглутарил-коэнзим А ГМГ-Ко А-редуктаза - 3 -гидрокси-3 -метилглутарил-коэнзим- А-редуктаза ИБС - ишемическая болезнь сердца ЛП - липопротеины

ЛПВП - липопротеины высокой плотности ЛПНП - липопротеины низкой плотности ЛППП - липопротеины промежуточной плотности ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности

КМГ - карбоксиметилированный-|3-1,3-0-гликан

МКА - метилкумариламид

ММП - матриксные металлопротеазы

МУФ - метилумбиллиферон

СРБ - С-реактивный белок

СРБ-Ьб — С-реактивный белок («высокочувствительный» СРБ) ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания ТГ - триглицериды ХС - холестерин

ТИБ-а - фактор некроза опухолей а

ВВЕДЕНИЕ

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) в конце XX - начале XXI веков приняли характер эпидемии, охватившей все высокоразвитые страны. В России ежегодно более 1 млн. человек умирают от ССЗ, из них половина - от ишемической болезни сердца (ИБС) и еще 40% от поражения мозговых сосудов (Кухарчук, 2007; Демидова и др., 2011). Несомненно, в основе профилактики ССЗ лежат меры, направленные на коррекцию основных факторов риска: низкой физической активности, курения, повышенного артериального давления, ожирения и липидных нарушений (Оганов, 2004; Нечаева и др., 2010).

Одним из важнейших факторов риска развития атеросклероза и ССЗ является липемия. Высокое содержание липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), низкий уровень липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и повышение активности матриксных металлопротеиназ (MI111) сыворотки крови у человека являются общепринятыми факторами риска атеросклероза (Рагино Ю.И. и соавт., 2008).

Изучение характера нарушений липидного обмена проводится на различных моделях, воспроизводящих липемию (диетические, генетитические, химические). Для воспроизведения модели химической липемии у мышей используется тритон WR 1339 (Ruger Chemical Co., USA). Важным фармакологическим свойством тритона WR 1339 является способность вызывать гипертриглицеридемию и гиперхолестеринемию в течение нескольких часов после однократного введения детергента (Millar et al., 2005).

При очевидных преимуществах модели воспроизведения липемии с помощью тритона WR 1339 отмечают свойство детергента - повреждать клеточные мембраны, как недостаток, особенно при повторном использовании высоких доз (Millar et al., 2005). В связи с этим, с 1995 года

предложен препарат - полоксамер 407 (Pluronic F-127) - для воспроизведения липемии. Как и тритон WR 1339, он является детергентом, но не обладает свойствами повреждать клеточные мембраны (Millar et al., 2005).

Модель липемии, воспроизводимая на экспериментальных животных при введении полоксамера 407, перспективна для изучения механизма развития атеросклероза (Johnston et al., 2003; Johnston, 2009). Преимуществом данной модели является простота воспроизведения, низкая токсичность полоксамера 407 (отсутствие повреждающего свойства на клеточные мембраны). Полоксамер 407 может использоваться как для воспроизведения острой липемии, так и атеросклероза, при повторном введении детергента у мышей (Johnston et al., 2001; Korolenko et al., 2012b). Выявлен дозозависимый эффект полоксамера 407 при воспроизведении различной степени выраженности липемии у экспериментальных животных с помощью данной модели (Millar et al., 2005).

Модель может быть использована для тестирования гиполипидемических препаратов (статинов и фибратов) (Johnston et al., 2001). Возрастающий интерес к статинам объясняется недостаточной изученностью их свойств. Механизм защитного влияния аторвастатина на модели липемии изучается и представляет значительный интерес. Аторвастатин, как и другие статины, угнетает синтез холестерина в печени на стадии мевалоновой кислоты, вследствие обратимого ингибирования ключевого фермента 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы (ГМК-КоА-редуктазы) и увеличения числа и активности печеночных ЛПНП-рецепторов клеток, что способствует усилению захвата и катаболизма ЛПНП (Corsini et al., 1999; Assmann and Nofer, 2003). Полагают, что применение статинов, благодаря их плеойотропному эффекту, помимо гиполипидемического влияния, вызывает снижение активности ММП в атеросклеротических бляшках (Озова и др., 2007).

(3-гликаны, также представляют особый интерес, благодаря своим гиполипидимическим свойствам (Vetvicka and Vetvickova, 2009). В процессе развития атеросклероза макрофаги преобразуются в пенистые клетки, накапливающие окисленные ЛПНП. Предполагается, что карбоксиметилированный-Р-1,3-0-гликан (КМГ) способен конкурировать с окисленными ЛПНП за образование связи с рецепторами "мусорщиками" in vivo и in vitro (Dushkin et al., 1996; Vereschagin et al., 1998; van Oosten et al., 1998).

Механизм развития экспериментальной липемии при введении полоксамера 407 исследован недостаточно. Остаются неясными соотношения различных фракций и субфракций липопротеинов (ЛП): липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП), ответственных за атерогенный эффект, а также липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) с защитным антиатерогенным эффектом. Поэтому представляется актуальным изучение изменений липидных показателей (фракций и субфракций ЛП) сыворотки крови при экспериментальной липемии у мышей и влияния на эти показатели аторвастатина.

Цель работы - исследовать фракционный и субфракционный состав липопротеинов сыворотки крови мышей на моделях острой липемии, вызванных тритоном WR 1339 и полоксамером 407 и их изменение под влиянием аторвастатина и карбоксиметилированного-(3-1,3-D-гл икана (КМГ).

В соответствии с этой целью поставлены следующие задачи:

1. Изучить фракционный и субфракционный составы ЛП сыворотки крови у мышей при развитии острой липемии, вызванной с помощью однократного введения животным полоксамера 407 в высокой дозе (1000 мг/кг).

2. Оценить фракционный и субфракционный составы ЛП сыворотки крови у мышей при развитии острой липемии, вызванной с помощью однократного введения животным тритона WR 1339 и полоксамера 407 в одинаковой дозе (500 мг/кг).

3. Исследовать морфометрические показатели макрофагов печени животных при однократном введении тритона 1339 и полоксамера 407.

4. Выявить влияние аторвастатина на фракционный и субфракционный составы ЛП и активность ММП сыворотки крови мышей при острой липемии, вызванной введением полоксамера 407 (500 мг/кг) и тритона 1339 (500 мг/кг).

5. Изучить влияние карбоксиметилированного-(3-1,3-0-гликана (КМГ) на липемию у мышей, вызванную введением полоксамера 407 (500 мг/кг) в сравнении с аторвастатином.

Научная новизна

При острой липемии у мышей, вызванной полоксамером 407 и тритоном 1339, впервые выявлены нарушения субфракционного состава атерогенных и антиатерогенных фракций ЛП сыворотки крови. Впервые проведен сравнительный анализ моделей острой липемии, вызванных тритоном 1339 и полоксамером 407, на уровне изменения содержания фракций и отдельных субфракций ЛП сыворотки крови. На модели липемии, вызванной полоксамером 407, продемонстрированы более выраженные нарушения атерогенных фракций ХС-ЛПОНП (субфракции ХС-ЛПОНП1.2) и ХС-ЛПНП, фракции ТГ-ЛПОНП (субфракции ТГ-ЛПОНП,_2) и ТГ-ЛПНП (субфракции ТГ-ЛПНП1.3) по сравнению с тритоном 1339.

Показано гиполипидемическое влияние аторвастатина при развитии острой липемии у мышей, вызванной тритоном 1339 за счет снижения общего ХС-ЛП и проатерогенной фракции ХС-ЛПОНП (за счет субфракции ХС-ЛПОНП3.5), ХС-ЛПНП (за счет субфракции ХС-ЛППП), снижения

содержания общих ТГ-ЛП, фракции ТГ-ЛПОНП (за счет субфракции ХС-ЛГТОНП3.5), атерогенной фракции ТГ-ЛПНП (субфракции Л111111).

Аторвастатин обладал менее выраженным гиполипидемическим действием при острой липемии, вызванной полоксамером 407, по сравнению с тритоном WR 1339, вызывая снижение общего ХС-ЛП и атерогенной фракции ХС-ЛПНП (субфракции ЛПНП1.3), фракции ТГ-ЛПНП (субфракции ЛПНП^з) в сыворотке крови животных.

Установлен характер взаимосвязи гиполипидемического эффекта аторвастатина с изменением активности ММП в сыворотке крови на модели экспериментальной липемии, вызванной полоксамером 407 (500 мг/кг). Гиполипидемическое действие аторвастатина сопровождалось увеличением активности ММП в результате плейотропного эффекта аторвастатина в высокой дозе.

Научно-практическая значимость работы

Выявленные изменения содержания фракций и отдельных субфракций ЛП сыворотки крови у мышей позволяют использовать модель липемии, вызываемую полоксамером 407, для изучения факторов риска развития атеросклероза. Изменения состава ЛП сыворотки крови на модели липемии у мышей, вызванной введением полоксамера 407, как и тритона WR 1339, сходны с изменениями при дислипопротеинемиях IIa/116, III типа у человека и могут рассматриваться как модели этих типов дислипопротеинемий. Модель липемии, вызываемая полоксамером 407, перспективна для изучения роли изменений фракционного и субфракционного состава липопротеинов крови в патогенезе экспериментального атеросклероза (при длительном использовании полоксамера 407), а также для тестирования гиполипидемических препаратов, в том числе, снижающих гипертриглицеридемию.

Полученные результаты работы могут быть использованы в разработке лекций и учебно-методических пособий для биологических и медицинских специальностей в ВУЗах.

Положения, выносимые на защиту:

1. Особенностью модели липемии с полоксамером 407 является многократное увеличение содержания атерогенных фракций ЛПНП, ЛПОНП и их субфракций в сыворотке крови.

2. Модель с полоксамером 407 демонстрирует более выраженный эффект острой липемии, по сравнению с тритоном ^/Я 1339.

3. Гиполипидемическое действие аторвастатина при липемии, вызванной тритоном WR 1339, выражается в снижении показателей общего холестерина (ХС) и триглицеридов (ТГ), а также снижении содержания общего ХС-ЛП и проатерогенной фракции ХС-ЛПОНП (за счет субфракции ХС-ЛПОНП3.5), ХС-ЛПНП (за счет субфракции ХС-ЛППП), снижения содержания общих ТГ-ЛП, фракции ТГ-ЛПОНП (за счет субфракции ХС-ЛПОНП3.5), атерогенной фракции ТГ-ЛПНП (субфракции ЛППП).

4. Введение аторвастатина при липемии, вызванной полоксамером 407, вызывает снижение показателей общего ХС и ТГ, а также уменьшения содержания общего ХС-ЛП и атерогенной фракции ХС-ЛПНП (субфракции ЛПНП1.3), атерогенной фракции ТГ-ЛПНП (субфракции ЛПНП1.3) в сыворотке крови животных.

5. КМГ по сравнению с аторвастатином, оказал менее значительный гиполипидемический эффект при липемии, вызванной полоксамером 407.

Апробация работы

Основные материалы диссертации представлены: на V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Здоровье -основа человеческого потенциала: проблемы и пути их решения" (Санкт-

Петербург, 24-27 ноября 2010 г.); на II Съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2-3 ноября 2010 г); на III Всероссийской на