Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ биологических наноструктур в системах метаболизма белков и липидов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Анализ биологических наноструктур в системах метаболизма белков и липидов"

На правах рукописи

Тузиков Федор Васильевич

АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ НАНОСТРУКТУР В СИСТЕМАХ МЕТАБОЛИЗМА БЕЛКОВ И ЛИПИДОВ: СТРОЕНИЕ, ДИСПЕРСНЫЙ СОСТАВ И МЕХАНИЗМЫ РАВНОВЕСНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ МАКРОМОЛЕКУЛ

03.00.04 - биохимия 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск - 2005

Работа выполнена в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии "Вектор" МЗ РФ и в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН, г. Новосибирск

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Панин Л.Е.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Колпаков А.Р.

доктор биологических наук Беклемишев А.Б.

доктор биологических наук Груздев А.Д.

Ведущая организация:

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино, Московской области

Защита диссертации состоится " 20 " _2005 г. в 10 часов

на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. академика Тимакова, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН

Автореферат разослан " 1& " ОлаЛУ_2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Г.С. Ру сских

jj

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия значительно возрос интерес к изучению частиц нанометрового (1 нм = 10 А) диапазона размеров с молекулярными массами более 1000 Да, участвующих во многих химических, каталитических и биологических процессах в живой и неживой природе. Связано это, во-первых, с открытием во второй половине XX века большего числа природных явлений, в которых такие наноструктуры играют ведущие роли, а, во-вторых, с разработкой новых информативных физико-химических методов исследований и расширением возможностей детального анализа наночастшд В частности, благодаря выходу на наноструктурный уровень исследований появилась молекулярная биология, а в наши дни зарождается молекулярная медицина [Марри Р. и соавт. 1993].

К биологическим наноструктурам относятся все простые и сложные белки, нуклеиновые кислоты и их разнообразные комплексы вплоть до вирусов. С участием макромолекул и комплексов происходят все важнейшие биохимические и молекулярно-биологические процессы в живых организмах. Поэтому особенности поведения всех без исключения биологических макромолекулярных систем необходимо рассматривать на основе взаимодействия их наноструктурных элементов Подобные подходы могут быть чрезвычайно плодотворными при исследовании молекулярных систем нуклеинового обмена, таких, как система рестрикции - модификации и система каталитического ацили-рования тРНК, участвующих в процессах экспрессии генов, транскрипции, репликации, репарации ДНК, а также биосинтеза и катаболизма белков. В этих процессах, происходящих с помощью ферментов ДНК-метилтрансфераз, рестриктаз, аминоацил-тРНК-синтетаз, важнейшим является определение структуры и стехиометрии каталитически компетентных фермент-субстратных комплексов, стадийности, термодинамических характеристик и наноструктурных изменений при их образовании. Поэтому развитие аналитических методов и изучение механизмов ферментативного катализа метилирования ДНК и аминоацилирования тРНК остаются одними из приоритетных направлений в биохимии и биофизике.

В частности, ранее было показано, что каталитически активной формой большинства рестриктаз является димер, а в случае ДНК-метилтрансфераз известно лишь, что эти ферменты имеют мономерную субъединичную структуру в свободном состоянии. Наличие симметрии в обеих цепях участка узнавания ДНК этими ферментами, очевидно, должно отражаться и на структуре ферментов [Modrich Р 1982; Malygin B.G., Zinoviev V.V. 1989]. Но в первичных структурах таких ферментов, как метилгрансферазы EcoDara, T2Dam и T4Dara, не было обнаружено достаточно длинных повторов [Kossykh V.G. et al. 1995]. Это указывает па необходимость поиска симметрии в структурах более высокого порядка, например, в комплексах ферментов с ДНК, образующихся при их взаимодействии в акте биокатализа Аминоацил-тРНК-синтетазы отвечают за катализ процесса аминоацилирования специфических молекул тРНК [Малыгин Э.Г., Киселев Л Л. 1984; Киселев Л .Л. и соавт. 1984; Meinnel Т. et al. 1995] Несмотря на наличие большого количества работ, связанных с изучением механизмов взаимодействия этих ферментов с субстратами, к началу проведения данной работы остро недоставало прямой информации о структуре и характере взаимодействий, например, ферментов с тРНК на каждой из стадий. Так, в частности, для фенилаланил-тРНК-синтетазы и тРНК"1* имелись противоречивые данные о с груктуре фермент-субстратных комплексов и о наличии конформационных изменений в макромолекуле фермента при взаимодействии с тРНК"1* [Pilz I. et а]. 1979, Holler Б. et al. 1981; Dessen P. et al. 1983].

Известно, ЧТО С белковым метаболизмом В "Ргятгунп f-гмтрамгем питршный обмен [Марри Р и соавт. 1993] Основной транспорт эй»ОД1>№ЩМ0 в водной

БИБЛИС Cn»rei 09 Ж

среде липидов являются липопротеины (Jill) крови, коюрыс представляют собой очень гетерогенный класс белково-липидных наноструктур размером от альбумина до средних вирусов [Климов А Н и соавт 1999]. ЛП делятся на четыре основных фракции, каждая из которых, в свою очередь, состоит из 4-5 субфракций со своими индивидуальными функциями При различных патологических состояниях (атеросклерозе, диабете, гепатите и др.) отмечены изменения в содержании и химическом составе различных классов ЛП крови [Gotto A.M. et al. 1986; Липовецкий Б.М. 2000] Проблемы профилактики и лечения болезней, связанных с нарушениями липидного обмена, в последние десятилетия стали важнейшими [Климов АН и соавт. 1995; Липовецкий Б.М. 2000]. Осложнения атеросклероза и связанных с ним заболеваний (ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, инсульт головного мозга, тромбозы) являются сегодня наиболее частой причиной инвалидности и высокой смертности людей в зрелом возрасте.

Сегодня известно, что сывороточные ЛП крови являются транспортной формой не только липидов, но и витаминов, гормонов, различных ксенобиотиков [Марри Р и соавт. 1993]. Не менее важными являются регуляторные свойства ЛП крови Так, например, в работах [Панин Л.Е. и соавт. 1986, 1987, 1992] выявлено комплексное участие ЛПВП и глюкокортикоидов в активации экспрессии генов в клетках гепатоцитов. Но дезальныс спектры дисперсною и компонентного состава сывороточных ЛП и характер их изменений остаются практически не исследованными как в норме, так и при дислипопротеине-миях (ДЛП) [Климов А.Н. и соавт. 1999]. Поэтому необходимо дальнейшее углубленное комплексное изучение состава, структуры и функций ЛП крови, а также их роли в развитии патологических состояний.

В настоящее время для анализа ЛП крови и диагностики нарушений липидного обмена применяют целый ряд аналитических методов, но стандартным клиническим набором анализов до сих нор остается определение общих (суммарных) ТГ, общего ХС и ХС-ЛГ1ВП [Mills G L et al. 1984; Камышников B.C. 2003]. В большинстве случаев эти методы не дают прямой и детальной информации о фракционном составе ЛП крови и при этом или требуют большого количества крови для анализа, или очень трудоемки, или длительны Поэтому очевидно, что для целей диагностики и профилактики заболеваний людей, а также для определения эффектов лечения имеется острая потребность в точных и экспрессных методах определения полного субфракционного и компонентного состава сывороточных ЛП крови - специфических маркеров состояния липидного обмена в организме Их дефицит сильно затрудняет диагностику сердечно-сосудистых и многих других заболеваний, а также контроль за эффективностью коррегирующей терапии

Одним из эффективных методов для получения прямой структурной и дисперсной информации о биологических наноструктурах является дифракционный метод - малоугловое рентгеновское рассеяние (МУРР), который уступает РСА в разрешении, но позволяет исследовать макромолекулы и комплексы непосредственно в растворе [Свергун Д И., Фейгин Л.А. 1986]. Перспективным оказалось использование этого метода для изучения биологических макромолекул не только в монодисперсных состояниях, но и в условиях термодинамического равновесия с их комплексами Однако до начала данной работы опыт применения метода МУРР для анализа полидисперсных и равновесных молекулярных систем ограничивался единичными случаями [Dessen Р et al. 1983; Baumstark M.W 1990] Отсутствие решений ряда теоретических и методических задач не позволяло использовать этот высокоинформативный метод для анализа механизмов многостадийных макромолекулярных взаимодействий и таких сложных, гетерогенных по составу и строению наноструктур, как сывороточные ЛП крови. Поэтому дальнейшее развитие методических подходов и методик анализа биологических наноструктур актуально не только для научных, но и практических целей, например, для клинической медицины и биотехнологии.

Цель работы - комплексный анализ строения, дисперсного состава и роли наност-руктурных изменений в механизме равновесных взаимодействий биологических макромолекул некоторых систем модификации ДНК, активации экспрессии генов, метаболизма белков и липидов по данным дифракционных методов

Задачи исследования:

1) Развить теоретические и методические подходы для структурно-дисперсного и равновесною анализа биологических макромолекул и их комплексов дифракционными методами.

2) Изучить молекулярные механизмы равновесных взаимодействий некоторых важнейших ферментов биосинтеза белка (ДНК-метилтрансфераз и аминоацил-тРНК-синтетаз) с синтетическими и природными субстратами.

3) Исследовать равновесные взаимодействия белка anoAI с глюкокортикоидами и их комплексов, как ключевых элементов в молекулярном механизме активации экспрессии генов, с эукариотической ДНК, с олигонуклеотидами и ДНК-зависимой РНК-полимеразой

4). Разработать формальную математическую модель, описывающую компонентный состав и строение сывороточных липопрогеинов крови всех классов и их промежуточных форм.

5). Используя модель строения ЛП, разработать новую методику определения субфракционного и компонентного состава общих и модифицированных липопротеиков в плазме или сыворотке крови по данным дифракционных методов и оценить ее эффективность в условиях клиники и эксперимента.

6) Развить аппаратные методики измерений дифрактограмм и усовершенствовать научную аппаратуру (новые конструкции блоков рентгеновских малоугловых дифрак-тометров).

Научная новизна работы. Разработан теоретический и методический подход к исследованию равновесных взаимодействий макромолекул дифракционными методами, который впервые был применен для изучения механизмов комплексообразования макромолекул происходящих в несколько равновесных стадий с образованием промежуточных комплексов.

Показано, что равновесное взаимодействие фермента (Е) ДНК-метилтрансферазы (МТачы) EcoDam (из Е coli) со специфическими олигонуклеотидами (S) происходит в две стадии с образованием комплексов ES и E2S, а ферментов МТаз T2Dam и T4Dam (из Т-четных бактериофагов) - в три стадии с образованием комплексов Е2, ES и EjS При этом присоединение второй молекулы фермента к комплексу ES у МТаз происходит с высокой положительной кооперативностью (х > 10), что, по-видимому, и обеспечивает кооперативное взаимодействие субьединиц фермента с ДНК в каталитическом акте метилирования остатков аденина.

Установлено, что равновесное взаимодействие фенилаланил-ТРНК-синтетазьт (Е) (из Е coli) со специфической тРНКрЬе (S) происходит в две стадии с образованием комплексов ES и ES2. Присоединение второй молекулы субстрата (S) к комплексу ES происходит антикооперативно, а в процессе комплексообразования ФРС с тРНКрЬе конформация фермента изменяется: уменьшается асимметрия в комплексе ES и восстанавливается в комплексе ES2. Установлено, что в условиях in vitro эукариотическая триптофанил-тРНК-синтетаза (ТРС) представляет собой полидисперсную олигомерную систему, состояние которой зависит от температуры и времени инкубации Выдвинуто предположение, что олигомеризация ТРС может быть частью молекулярного механизма формирования субклеточных секреторных гранул при регуляции биосинтеза белков в эукарио-тических клетках.

Показано, что при равновесных взаимодействиях белка апоА1 с ппококортикоидами (ТГК, ДГЭСС, ДГЭС) образуются специфические комплексы со стехиометрией 1 1 или 12, которые при взаимодействии с нативной эукариотической ДНК (М - 26 ООО кДа) связываются с ней (стехиометрия ~ 6 1) и образуют однонитевые участки. Специфическое свяшвание комплексов апоАГ-ТГ К с короткими димерными олигонуклео!идами (стехиометрия 1 1), имеющими структуру СС(ОССЬ в одной цепи, приводит к равновесному распаду дуплексов на мономеры и свидетельствует о соответствии или близости сайтов связывания этих комплексов в цельной ДНК структурам типа (ОСС)„

Разработана единая математическая модель, описывающая состав, строение всех сывороточных ЛП крови человека и хорошо соответствующая литературным данным о ЛТТ На основе модели строения ЛП разработана высокоинформативная методика определения фракционного и компонентного состава общих и модифицированных ЛП в плазме и сыворотке крови по данным МУРР. Впервые получены результаты детального феноти пирования липопротеинемий в норме и при некоторых заболеваниях Средний уровень степени модификации ЛП у здоровых людей составил 41 %, у больных РА 59 %, у больных БА - 56 % Наименее подвержена модификации оказалась подфракция ЛПН1Ь (22 - 36 %) а наиболее - подфракция ЛППП (62 - 82 %) Получены оценки эффектов лечений липидкорректирующими препаратами у пациентов с ГХС Исследование состояния здоровья в популяции жителей одного из экологически неблагополучных регионов России (ЯНАО), показало, что нормолипопротеинемии соответствуют плазмы и сыворотки крови только 10 %, а у 90 % выборки жителей ЯНАО имеется тот или иной тип ДЛП.

Впервые показано, что наноструктуры ЛПВ11 обладают термоустойчивостью и способны выдерживать, не денатурируя, кратковременное (до 10 минут) повышение температуры до 95°С.

Разработаны новые конструкционные схемы блоков малоуглового ренпеновского дифрактометра и аппаратные методики введения концентрационных поправок в малоугловые дифрактограммы.

Теоретическая и практическая значимость работы Комплексное определение параметров структуры, олигомерного состава, стадийности, стехиометрии образующихся комплексов и наноструктурных изменений при взаимодействий ДНК-метилтрансфераз (ЕсоОат, Т20ат, Т41)ат) и аминоацил-тРНК-синтетаз (ФРС, ТРС) с их субстратами и лигандами расширяет имеющиеся представления о молекулярных механизмах модификации ДНК, биосинтеза белка и позволяет разрабатывать новые подходы к регуляции белкового метаболизма в целом.

Установление фактов, что взаимодействие комплексов апоА1-глюкокортикоид с нативной эукариотической ДНК приводит к разрыву водородных связей между комплементарными парами азотистых оснований и образованию однонитевых участков в структуре ДНК, а также, что связывание комплексов ТГК-апоА1 происходит с участками цепи ДНК, имеющими структуру типа (ОСС)„, существенно расширяет знание об открытом недавно молекулярном механизме активации экспрессии генов, ключевую роль в котором играет апоА1 и его комплексы с восстановленными формами глюкокортикои-дов.

Разработанная формальная математическая модель, описывающая состав, строение сывороточных ЛП крови человека представляет практическую и теоретическую значимость Она является описанием того факта, что между компонентами сывороточных ЛП крови всех классов поддерживается устойчивое термодинамическое равновесное состояние, смешенное в сторону образования ЛП комплексов, которое и стабилизирует их структуры Модель строения ЛП крови была практически использована при разработке высокоинформативной методики, позволяющей из данных МУРР определять полный

фракционный и компонентный состав общих и модифицированных ЛП в плазме и сыворотке крови Применение новой методики анализа ЛП в условиях клиники и эксперимента показало, что она может эффективно использоваться для проведения клинических испытаний лекарственных препаратов, а результаты детального фенотипирования ряда лтгпопротеинемий могут быть полезны в целях уточнения диагностики заболеваний и изучения их механизмов на молекулярном уровне.

В экспериментах на лабораторных животных показано, что факторы холодового воздействия могут найти применение в клинической медицине при разработке способов коррекции нарушений ЛП спектра в сторону нормализации у больных с артериальной гипертензией Обнаруженные термоустойчивые свойства ЛПВП позволили предложить эффективный способ препаративного выделения этой фракции из плазм или сывороток крови [Патент РФ № 2211040. Бюлл. изобретений № 24 от 27.08.2003]

Развитое теории и разработка новой аппаратной методики введения концентрационных поправок позволяет корректно устранять концентрационные искажения в малоугловых дифрактограммах при минимуме затрат на измерения. Показано, что высокоинформативный и многофункциональный аналитический метод МУРР может использоваться не только в научных, но и в технологических целях, например, в клинической медицине Новые конструкции блоков малогабаритного дифрактометра и прибора в целом позволят повысить аналитические возможности приборов этого класса и уменьшить их габариты, массу и стоимость. В конструкции используются оригинальные технические решения и современные подходы к измерению и анализу экспериментальных данных на основе эффективного программного обеспечения и возможностей персональных ЭВМ

На защиту выносятся следующие основные положения:

1 Развитые методики анализа дифракционных данных позволяют эффективно исследовать строение, дисперсный состав и наноструктурные изменения в механизме равновесных многостадийных взаимодействий биологических макромолекул и комплексов

2 Равновесное взаимодействие фермента (Е) ДНК-метилтрансферазы (МТазы) FcoDam (из Е coli) с олигонуклеотидами (S) происходит в две стадии с образованием комплексов ES и E2S, МТаз T2Dam и T4Dam (из Т-четных бактериофаюв) - в три стадии с образованием комплексов Ег, ES и E2S, а фенилаланил-тРНК-синтетазы (Е) (из Е coli) со специфической тРИК^ (S) происходит в две стадии с образованием комплексов ES и ES2.

3. Взаимодействие комплексов апоА1-глюкокортикоид (ТГК и др.) с нативной эука-риотической ДНК (М ~ 26 000 кДа) приводит к разрыву водородных связей между комплементарными парами азотистых оснований и образованию однонитевых участков в структуре ДНК, способных к связыванию с ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Специфическое связывание комплексов anoAI-ТГК с короткими олигонуклеотидными диме-рами, имеющими структуру CC(GCC)s, приводит к равновесному распаду дуплексов на мономеры

4. Разработанная формальная математическая модель, описывающая состав и строение сывороточных ЛП крови человека, хорошо соответствует литературным данным о структуре и компонентном составе ЛП и позволяет определять компонентный состав всех субфракций ЛП

5. Разработанная на основе модели строения ЛП новая методика анализа ЛП по данным МУРР информативна и позволяет определять полный субфракционный и компонентный состав общих и модифицированных ЛП в плазме или сыворотке крови в условиях клиники и эксперимента

Апробация результатов работы. Основные положения и материалы диссертации были представлены и доложены на следующих научных конференциях и симпозиумах: на Всесоюзном рабочем совещании «Применение детекторов рентгеновского излучения

в исследовании структуры биополимеров» (Пущино, 1985); на Международном семинаре «Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и нейтронов» (Пущино, 1985); на VI Всесоюзном симпозиуме по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1985); на V Всесоюзном симпозиуме «Сгруктура биологических макромолекул» (Звенигород, 1987); на IV Всесоюзной конференции «Биосинтез ферментов микроорганизмами» (Ташкент, 1988); на Всесоюзном симпозиуме «Ферменты рестрикции-модификации ДНК: от генов до белков» (Вильнюс, 1989); на Международном симпозиуме «Molecular organization ofbiological structures» (Москва, 1989); на Международной конференции «Restriction Endonucleases and Modification» (Vermont, USA, 1993); на Международном симпозиуме «French-Russian Symposium on Régulation of Gene Expression» (Новосибирск, 1995); на Международной конференции «Annual Meeting of the American Cristallographie Association» (St Louis. USA, 1997); на Международной конференции «71 European Atherosclerosis Society» (Coustasy, Greece, 1999); на IV Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище: XXI век» (Санкт-Петербург, 2000); на Международном Симпозиуме «Пумпан - перспективы применения при атеросклерозе» (Новосибирск, 2000); на VI Конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Новосибирск, 2000); на «First International Symposium on PPARs: From Basic Science to Clinical Applications» (Florence, Italy, 2001); на IV Международном семинаре фонда МНТЦ «Basic Science in ISTC activities» (Новосибирск, 2001); на «72 European Atherosclerosis Society Congress» (Glasgow, UK, 2001); на Научно-практической конференции «Инновации в охране здоровья людей» в рамках региональной отраслевой выставки «ЗдравЭкспо - Сибирь 2001» (Новосибирск, 2001); на «International Conférence of Emergency Radiation Situations» (Москва, 2002); на Международной конференции «Targeting RNA' Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interférence» (Новосибирск, 2003); на IV Национальной конференции «Применение рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (РСНЭ-2003)» (Москва, 2003); на Международной конференции «Chemical & Biological Problème of Рго-teomics (CBPP-2004)» (Новосибирск, 2004); на XV Международной конференции но использованию синхротронного излучения. (СИ-2004) (Новосибирск, 2004).

Кроме того, материалы работы в период с 1982 по 2005 г обсуждались на отчетных сессиях и на межлабораторных семинарах: Института молекулярной биологии ГНЦ ВБ «Вектор» МЗ РФ (Кольцово, НСО); Института биохимии СО РАМН (Новосибирск); Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино); Института белка РАН (Пущино); Института кристаллографии РАН (Москва); Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино); Института биофизики СО РАН (Красноярск); University of Rochester (Rochester, NY, USA); Института патологии кровообращения МЗ РФ (Новосибирск); Института терапии СО РАМН (Новосибирск); Института общей патологии и клинической медицины СО РАМН (Новосибирск); Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск); Института физиологии СО РАМН (Новосибирск); Института клинической иммунологии СО РАМН (Новосибирск) и др.

Апробация диссертации состоялась на совместном межинститутском семинаре Института биохимии СО РАМН и ГНЦ ВБ "Вектор" 4 мая 2005 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 62 научных работы, в том числе 32 статьи, 6 патентов РФ и 24 тезисов докладов на конференциях и симпозиумах

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 364 страницах и состоит из введения, четырех глав, включая обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, а также из выводов и приложений Список литературы из 375 публикаций включает 160 публикаций отечественных авторов Работа иллюстрирована 67 таблицами и 58 рисунками.

Диссертация выполнена в соответствии с планами тем научно-исследовательских работ Института молекулярной биологии ГНЦ В Б "Вектор" и Института биохимии СО РАМН, а также по проектам Международного научного фонда "International Human Frontier Science Program Organization" (HFSPO - 1994), Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ №95-04-12671-а; №00-04-49261; №01-04-49759; №01-0449761; №04-04-48926-а) и федеральной целевой научно-технической программы "Атеросклероз" (№ 01 97.000 5916)

Автор выражает искреннюю благодарность директору ГУ Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН, академику РАМН Панину Льву Евгеньевичу за консультативную помощь, оказанную при выполнении диссертационной работы; Тузи-ковой Н А , Галимову Р В , Самотяжко В Г, проф. Невинскому Г А, проф Полякову Л М , к б н Гимаутдиновой О И за помощь и творческое участие в работе; проф Малыгину Э Г., к х и Зиновьеву В В , академику РАМН Никитину Ю П , академику РАМН Козлову В А , д м.н. Рагино Ю И., к б.н Косых В Г , проф Хаттману С., д-ру Шлагману С , к ф -м н Вазиной А А , Мистюрину ГО Н , Богомолову Ю Б за помощь и поддержку на отдельных этапах работы; д м н Воеводе М И., к б.н. Осиповой Л П., Могельницкому А С., Доронину Б.М. и Коненковой Л П за предоставление образцов сывороток крови пациентов Автор сердечно благодарит всех своих коллег, прямо или косвенно принимавших участие в работе

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение и характеристика белков, ДНК, тРНК, синтетических полипептидов

и олигонуклеотидов.

Выделение и очистка препарата фермента ДНК-метилтрансферазы (МТазы) EcoDam (из Е colt В-834) проводилась Нестеренко В Ф, как в работе [Бурьянов Я И и соавт. 1981] Выделение и очистка препаратов МТаз T2Dam и T4Dam (из Т-четных бактериофагов) проводилась Косых В Г., как в работе [Kossykh V G et al 1995] Выделение и очистку препаратов фенилаланил-тРНК-сиитетазы (ФРС) (из Е coli MRE-600) проводили Анкилова В Н и Moop Н.А., как в работе [Анкилова В Н и соавт 1984] Препараты суммарной тРНК и тРНКрЬе с акцепторной активностью ~ 1300 пМоль Phe/Агбо были получены от фирмы "Boehringer Mannheim" Триптофанил-тРНК-синтетазу (ТРС) (из поджелудочной железы быка) выделяли Заргарова Т А и Судомоина М.А , как описано в работе [Kisselev L L et al 1979] Белок anoAI выделялся Поляковым Л М из подфрак-ции ЛПВПз сывороток крови крыс линии Вистар, как описано в [Поляков Л М. и соавт 1991] Фиксированные комплексы глюкокортикоидов с anoAI получали, выдерживая их смеси в молярном соотношении 21 в 0 05 М калий-фосфатном буфере (рН 7 4) в течение 5 мин при комнатной температуре Для анализа использовали коммерческий человеческий инсулин фирмы «Actrapid НМ Penfill» (Novo Nordisk, Дания). ДНК из печени крыс линии Вистар выделяли, как описано в [Gottesfeld С. et al. 1976]. Синтез всех используемых одноцепочечных дезоксирибоолигонуклеотилов (далее - олигонуклеотидов), кроме I и II, осуществлялся фосфотриэфирным методом [Hirose Т. et al 1978] Олигонуклеоти-ды I и П синтезировались Горбуновым Ю.А. с использованием синтезатора Bio-Starch Model 3810 (США) Дуплексы получали отжитом смеси комплементарных олигонуклеотидов от 90°С до 20°С в течение 7-12 часов Синтез полипептидов инсулина проводился Сабировым АII, как описано в работе [Самуков В.В. и соавт. 1996]

Концентрации белков, ферментов, ДНК, тРНК и олигонуклеотидов в препаратах определяли спектрофотометрически на микроспектрофотометрах «Миллихром» (Россия) и U-1100 фирмы Hitachi (Япония), используя молярные коэффициенты экстинкции Кон-

нентрации белков и ферментов для контроля проверяли независимо методом Лоури [Lowry О.Н. 1951] сотрудники лабораторий, участвующие в совместных работах. Разница в определении концентраций белков разными методами в основном не превышала 10 % Иммуноферметный анализ антигенов и антител на твердой фазе проводился Поте-ряевой О.Н в полистироловых планшетах Nunk (Дания)

Препараты плазм в сывороток крови.

Сыворотки крови для анализа от больных с достоверно установленными диагнозами получали из: Клиники Института терапии СО РАМН (нормолипемия, КА); Института биохимии СО РАМН (СД-П); Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (СД-1 и СД-II); Клиники Института клинической иммунологии СО РАМН (РА, БА). Сыворотки крови больных PC, СКВ и КЭ были любезно предоставлены A.C. Могельнинким (Новосибирский военный клинический госпиталь), Б М. Дорониным (Медицинская академия, г. Новосибирск) и Л П Коненковой (Институт клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск). 374 препарата плазм и сывороюк крови из выборки жителей ЯНАО были организованно получены под руководством к.б н. Оси-повой J7 ТТ. (Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск) за период специальных экспедиций в ЯНАО в 1999-2001 гг.

Контрольную группу (нормолипопротеинемия) составили условно здоровые люди в возрасте от 36 до 59 лет. Эта группа представляла собой популяиионную выборку людей без факторов риска из неорганизованного населения Октябрьского района г 11овосибир-ска при проведении скрининга, который проводила бригада врачей (сотрудников ГУ НИИ терапии СО РАМН), прошедших специальную подготовку (руководитель скрининга д м.н. Малютина С.К. У больных ИБС и КА в возрасте от 38 до 69 лет диагнозы устанавливались с использованием результатов коронароангиографии Длительность заболевания у пациентов была от 3 до 22 лет (руководитель исследования д.м н Воевода М.И (Институт терапии СО РАМН)) Всего при фенотипировании различных типов ДЛП с определением ФКС ЛП использовалось более 1000 сывороток крови, полученных от здоровых и больных людей - жителей г. Новосибирска и ЯНАО РФ

Кровь для анализов брали лаборанты клинических лабораторий по стандартным методикам [Камышников В С. 2003] из локтевой вены пациентов утром натощак через 1416 ч после последнего приема пищи в пробирки, содержащие 1 мг/мл сухого ЭДТА Концентрации OTT, ОХС и ХС-ЛПВП (после осаждения ЛПНП и ЛГТОНП гепарином и МпС1г) в сыворотках крови определялись энзиматическим методом с использованием стандартных реактивов Biosub Chol, Biosub TG, Chol-HDL (Herbos diagnostica) и методом "сухой химии" на автоанализаторах Cholestech и Technicon (США) Ивановой М.В. Для контроля точности анализа сывороточных ЛП методом МУРР использовали стандартные образцы сывороток крови фирм "Промикс" и "Вектор-Бест" (Россия) с известными значениями концентраций ОХС, ОТГ и ХС-ЛПВП. Холестериновый индекс атеро-геиности определяли как отношение суммарной концентрации ХС-ЛПНП и ХС-ЛПОНП к концентрации ХС-ЛПВП [Климов А.Н. и соавт. 1999].

Используя метод МУРР, было проанализировано 239 сывороток крови пациентов с ГХС в возрасте от 35 до 73 лет, в том числе 101 человек с изолированной ГХС (61 мужчины и 40 женщин) в возрасте 35-70 лет (средний возраст 58 ± 4 лет) и 129 пациентов с ГХС в комбинации с ГТГ (комбинированной ГХС) (42 мужчины и 87 женщин) в возрасте 35-73 лет (средний возраст 60 ± 5 лет) [Рагино Ю.И. 2002]. У пациентов с изолированной ГХС содержание ОХС было выше 5,4 ммоль/л (210 мг/дл), ХС-ЛПНП - выше 3,4 ммоль/л (130 мг/дл), а ОТГ - ниже 2,2 ммоль/л (200 мг/дл) Анализы сывороток крови пациентов биохимическими методами и методом «сухой химии» проводились М.В Ивановой. Статистическая обработка полученных методом МУРР данных по результатам лечения пациентов с ГХС и I "I I был выполнен Рагино Ю.И

В экспериментах также использовались крысы линий Вистар (нормотензивные животные) и НИСАГ - животные с наследственной стрессиндуцированной гипертеизией). Крысы линии НИСАГ выведены в Институте цитологии и генетики СО РАН [Kozyreva Т V, Eliseeva L S 2002] Холодовое воздействие на животных производилось под нем-буталовым наркозом, чтобы исключить эмоциональную компоненту стрессорного воздействия Кровь для определения ФКС ЛП брали после декапитации животных на 5-й день после холодового воздействия. Все работы с лабораторными крысами, включая забор крови и приготовление плазм проведены Ломакиной C.B. Получение фракций сывороточных липопротеинов крови.

Отдельные фракции ЛП из плазм и сывороток крови выделяли из сывороток крови с помощью препаративного изоплотностного УЦ в растворах КВг после освобождения от ХМ, как описано в работах [Hatch F Т, Lees R S. 1968] Фракционирование начиналось в день взятия крови Центрифугирование проводили в ультрацентрифуге L5-75 «Beckman» (США) (ротор 75-Ti) в течение 18 - 20 ч при 40 ООО об/мин. Первую фракцию составляли ЛПОНП с р < 1,006 г/см3, вторую - ЛПНП с р = 1,006 - 1,063 г/см3, третью - ЛПВП с р = 1,063 - 1,250 г/см3 Полученные ЛП диализовали при 4°С в течение 24 ч против 0,15 M раствора NaCl, содержащего 0,3 мМ EDTA Все работы, связанные с выделением, очисткой и концентрированием ЛП проводились Крыловой И H и Поляковым Л M

Для электронной микроскопии (ЭМ) использовали препараты ЛП, полученные с помощью препаративного УЦ' суммарные ЛП, ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП Образцы готовили путем окрашивания ЛП частиц 2 % раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты и нанесения препаратов на сетки с формваровой подложкой [Forte Т M , Nordhausen R.W. 1986] ЭМ ЛП фракций была выполнена Чешенко И.О (ГНЦ ВБ «Вектор») на электронном микроскопе "Jeol" (Япония)

Для препаративного выделения модифицированных ЛП из сывороток крови использовали полиэтиленгликоль ПЭГ-6000 и процедуру преципитации, как описано в [Кан-ская Н.В. и соавт 1987, 1992] После добавления в сыворотки крови ПЭГ с концентрацией 8 % и последующего перемешивания образцы в пробирках инкубировались в холодильнике при +8°С в течение 18 ч Далее смеси центрифугировали на центрифуге Т-51 (Германия) при 1500 об/мин в течение 30 мин, а надосадочную жидкость удаляли. Процедуру отмывки образцов от немодифицированных ЛП повторяли 3 раза

Буферные растворы. Плотность растворителей в исследуемых жидких образцах. Для исследования взаимодействий ДНК-метилтрансферазы Ecodam с олигонуклео-тндами использовали буферную смесь- 0,01 M фосфат калия, pH 7,0; 0,01 M 2-меркаптоэтанол, 0,001 M ЕДТА, 12,5 % глицерин При исследовании взаимодействий фенилаланил-тРНК-синтегазы с тРИК^ использовали две буферные смеси следующего состава-1 0,02 M калий фосфат (pH 7,5); 0,01 M MgCl2; П. 0,05 M калий фосфат (pH 7,5); 0,005 M MgCh, 20 % глицерин Для изучения молекулярных взаимодействий ДНК-метилтрансфераз T2Dam и T4Dam с SAM, SAH и олигонуклеотидами использовали буфер, содержащий 100 мМ Трис-HCl (pH 8 0), 1 мМ ЭДТА, 5 % глицерин, 1 мМ ДТТ Для анализа взаимодействий эукариотической ДНК с белком anoAI, глюкокортикоидами и с РНК-полимеразой использовали физраствор и 0 05 M калий-фосфатный буфер с pH 7,4

Для получения растворов с заданной плотностью растворителя использовали нейтральные вещества-контрастеры, в частности, сухие сахарозу, NaN03 и NaBr. Необходимую плотность растворителей в исследуемых жидких образцах обеспечивали с помощью расчетной формулы: m = V • (ро - рс) • р /(pk - pj, где V, ро - объем и требуемая конечная плотность растворителя в жидком образце (сыворотке или буфере); рс - исходная плотность жидкого образца; m, рк - масса и плотность используемого сухого вещества-контрастера. Плотность растворителей контролировали пикнометрически

Научные приборы и оборудование.

Для проведения исследований и анализов использовали следующие методы' малоугловое рентгеновское рассеяние (МУРР), флуоресцентная спектроскопия (ФЛС), светорассеяние (CP), электронная микроскопия (ЭМ), ультрацентрифугирование (УЦ), электрофорез (ЭФ), биохимические методы для определения концентраций ХС и ТГ [Камышников B.C. 2003]. Основная экспериментальная часть работы проводилась с использованием малоугловою рентгеновского дифрактометра фирм Siemens (Германия) и AnIon Paar (Австрия). Источником рентгеновского излучения являлась рент! еновская трубка мощностью 2,7 кВт с антикатодом из Си, имеющая острый фокус (0,2 х 12 мм2). Длина волны (Я) используемого излучения 1,54 Â.

Измерения интенсивностей CP и спектров флуоресценции от исследуемых препаратов проводили на лазерном дифракционном анализаторе SALD-201 фирмы Shimadzu (Япония) и на спектрофлуориметрах Perkin-Elmer MPF 44А (Германия) и SPEX DM-3000 (США). При использовании ФЛС ширина щели для возбуждающего пучка была 6 нм, а для пучка эмиссии - 14 нм. Длина волны возбуждения была выбрана равной 295 нм, чтобы уменьшить вклад в спектр флуоресценции остатков тирозина Спектры испускания измеряли в интервале длин волн 310-400 нм и корректировали с учетом эффекта внутреннего фильтра, разбавлений фермента и интенсивностей рамановского рассеяния [Ла-кович Дж. 1986].

Методики измерений и обработка экспериментальных данных.

Измерения интенсивностей МУРР проводили при температурах 120 - 42°С. Малоугловые рентгенограммы измеряли в угловом диапазоне' h = 0.0013 - 0.522 Â ', где h = 4 ■ л ■ sin(8)/A.; 26 - угол рассеяния. Для монохроматизации излучения (ХсиКа = 1,54 А) использовали стандартный фильтр из Ni фольги юлщиной 20 мкм и дискриминацию импульсов по амплитуде. Индикагрисы CP (зависимости интенсивности рассеяния света от угла (26)) измеряли в диапазоне углов 26 = 56,25 - 90° (h = 0,00137 - 0.00206 À"!, где h = 4 • я п • sin(0)/X; п - показатель преломления буферного раствора). Длина волны (X) используемого светового (монохроматического) излучения была 4300 А В ФЛС использовали кварцевые кюветы 1x1 см. Эффект "обесцвечивания" исключали с помощью стандартных контрольных экспериментов, в которых вместо лиганда добавляли буферный раствор [Лакович Дж 1986] В рентгенограммы вносились поправки на фоновое рассеяние, поглощение, коллимацию, проводилось сглаживание. Первичная математическая обработка экспериментальных данных МУРР и вычисление функций распределения сферических частиц по размерам выполнялись на ЭВМ PC по алгоритмам, описанным в [Свергун Д.И., Фейгин Л.А. 1986], а также с использованием процедур оптимизации [Гилл Ф. и соавт. 1985]. Для этого были составлены специальные вычислительные программы на языках BASIC и DELPHI. Кроме того, использовались также стандартизованные программные комплексы: программы "ITP" и "Сирена",

Для определения значений параметров 1(0) (интенсивность рассеяния в нулевом угле (h = 0)) и Rg (объемный радиус инерции рассеивающих частиц) из данных CP и МУРР использовали формулу Гинье [Guinier А , Fournet G 1955] Функции распределений частиц по размерам (D„(R)) из данных МУРР вычисляли с использованием решений задач на основе обратных Фурье-преобразований [Свергун Д И. и соавт 1986].

Теоретический анализ структурно-функциональной организации молекулы инсулина и компьютерные поиски по базам данных выполнялся акад РАМН Паниным Л.Е. и Максютовым А.З Статистические резулыаты обрабатывались методом вариационной статистики из пакета программ Statiblica с применением t-критерия Стьюдента для средних арифметических. Обработку результатов анализа ФКС ЛП сывороток крови жителей ЯНАО проводили Коровкина Е.С. и Гармашова Н.В. Достоверность полученных результатов оценивали при уровнях значимости Р < 0,05 и Р < 0,01.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. РАВНОВЕСНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ И КОМПЛЕКСОВ В СИСТЕМАХ МОДИФИКАЦИИ ДНК, БИОСИНТЕЗА БЕЛКА И ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

Биохимические процессы в клетках организма, связанные с молекулярными системами модификации ДНК, биосинтеза белка и экспрессии генов, являются определяющими в регуляции метаболизма белков в целом Функционирование всех молекулярных систем осуществляется, как правило, через взаимодействие молекул различного типа между собой В молекулярных системах типа "фермент-субстрат" важнейшая роль принадлежит белок-белковым и белок-нуклеиновым взаимодействиям, когда белки, РНК, ДНК, липиды, полисахариды и их аналоги являются лигандами или субстратами ферментов Изучение механизмов макромолекулярных взаимодействий принципиально важно для понимания всех биохимических процессов, происходящих в клетке, и, в частности, для объяснения патологий различных заболеваний на молекулярном уровне.

1.1. Анализ равновесных молекулярных взаимодействий биофизическими методами. При исследовании макромолекулярных взаимодействий типа "фермент-субстрат" исполыуются различные биофизические методы, в том числе, такой дифракционный метод, как малоугловое рентгеновское рассеяние (МУРР) Перспективным показал себя анализ интенсивностей МУРР от бинарных смесей взаимодействующих макромолекул, например, фермента и субстрата или лиганда, находящихся в состоянии термодинамического равновесия с их комплексами [Osterberg R et al 1975, 1979, 1983]

Для развития методик анализа взаимодействующих макромолекулярных наноструктур на первом э гапе предполагается получение оценок максимальной стехиометрии образующихся комплексов в высококооперативной схеме, состоящей из одной стадии (модель 1), когда m молекул фермента (Е) связываются с п молекулами субстрата (S)-Кяш

m • Е + п ■ S «- EmSn (1 1)

и, соответственно, последней стадии во взаимодействиях макромолекул, после чего определяются промежуточные стадии Используя известное выражение для константы диссоциации Kmn и уравнения материального баланса, можно получить выражения для экспериментальной (AI(h)) и теоретической (A 1(b)) разностных интенсивностей МУРР' AI(h) - 1(h) - [Е„] ]е(Ы) - [S„] ■ Js(h) (12)

MÖÜ = [EmSn] • (Wh) - m ■ JE(h) - n • Js(h), (1.3)

при концентрациях [E0] и [S„] в смеси. Уже на начальных этапах анализа равновесных даттых МУРР из областей насыщения кривых титрования можно получить прямую информацию о комплексах с максимальной стехиометрией, а именно, оценки отношений параметров стехиометрии m/n:

m/n = ([E0]s»e AI(h)e»s(h))/(rSolE»s • AI(h)s»E(h)), где (1 4)

В случае одностадийной высококооперативной схемы (1 1) отношение (1 4) почти строго соответствует истинному отношению параметров стехиометрии, а для многостадийных равновесных схем выражение (1 4) позволяет получить близкие к истинным отношения параметров максимальной стехиометрии комплексов При этом для получения оценок типа (1 4) не обязательно иметь полные кривые титрования, а достаточно использовать для бинарных смесей две точки со значительно отличающимися концентрациями компонентов смесей Но для более строгого определения параметров m, n, К„ш мы использовали также численную оптимизацию с применением ЭВМ, а в качестве критерия минимизации (Ri) применяли выражение вида:

R,(m, = 2 II П„ absffij - F„]/(p • (p-1)), (1 5)

где FM(h) - AI,Oi)/AIj(h), f4(h) - М^/ДЩ), Пч - статистические веса (£2,, - l/o2 = 2/(fg + F,j)), p - количество смесей Иногда с помощью аппроксимации удается определить экспериментальные интенсивности МУРР в нулевом угле (1(0)). В этом случае в качестве критерия минимизации при определении параметров m, п, Кто использовали выражение-R2(m, п, К™) = IП, ■ abs[Al,(0) - АШЦ/р (1 6)

Можно показать, что этот подход может успешно использоваться при анализе молекулярных взаимодействий и другими методами, например, методом ФЛС В этом случае изменения интенсивности флуоресценции (AF) при образовании комплекса (EL) фермента (Е) с лигандом (L) в схеме взаимодействия, аналогичной (1.1): Е + L <-> EL (1.7)

в рамках теорий динамического и статического тушения соответствует уравнениям [Ла-ковичДж. 1986]:

F„/AF = 1/fi + l/(Kq • fi • [Q]), (динамическое тушение) (1.8)

AF = f0 • [E0] - fo • fE] - Tel ■ [EL], (статическое тушение) (1.9)

Здесь F,„ F - интенсивности флуоресценции растворов макромолекул в отсутствие и в присутствии в них тушителя флуоресценции; AF - F„ - F; К,, - константа тушения фермента тушителем; f\ - доля флуорофоров, доступная для тушителя, [Е0] - исходная концентрация фермента, f0 и ffci. - молярные интенсивности флуоресценции свободного фермента [Е] и комплекса [EL], соответственно, где [Q] я [Q0], т к. [E0]«[Q0] Уравнение (1.8) с учетом выражений:

K<i= [Е] • [L] / [EL] и [Е„] = [К] + [EL] (1.10)

преобразуется в уравнение:

F0/AF - l/f,+ Kd/(fa- [L]), (1 11)

где fa= (fQ- fEL)/fo - доля начальной флуоресценции фермента (Е), доступная для тушения лигандами (L) в равновесных комплексах [EL], K<j - константа диссоциации комплекса фермента с лигандом.

Однако известно, что механизмы и соответствующие им схемы взаимодействий молекул могут быть очень сложными и состоять из нескольких стадий Простейшей многостадийной схемой является двухстадийная линейная схема вида (модель 2): к, к2

E + S-*ES; ES + S*-ES2, (1.12)

где ki, к2 - константы равновесия стадий, которые связаны между собой статическими эффектами и явлением кооперативное™:

ki = k/2; k2 = 2 ■ k/x- (1.13)

Здесь k - константа диссоциации; х - коэффициент кооперативное™ В двухстадийном взаимодействии, представленном на схеме (1.12), участвуют частицы Е, S, ES и ES2 Их концентрации связаны условиями равновесия:

k, = [Е] ■ [S]/[ES], (1.14)

k2 = [ES][S]/[ES2]

и уравнениями материального баланса. Для определения значений равновесных концентраций комплексов в многостадийных схемах необходимо решать сиыемы, нелинейных уравнений типа (1.14). Оптимизационный метод с применением ЭВМ остается универсальным методом поиска решений, сложных нелинейных уравнений и систем уравнений [Шеннон Р 1978; Шахтахтинский Т Н и соавт. 1985] Однако в некоторых частных случаях, как, например, для схемы (1.12) и аналогичной ей симметричной схемы с образованием комплекса E2S, удается получить явный вид математических выражений В качестве критерия оптимизации при определении параметров k, х в схеме (1 12) использовали выражение вида.

R3(k,x) = I£Vabs[AI,(0) AI,(0Wp. 1де (1.15)

Q, = 2/(AIj(0) t ДЩ)), Alj£0) определяли при h = 0; AI,(0) - значение j-й разностной экспериментальной интенсивности МУРР, используемой при анализе.

Однако, как только становятся известными стехиометрии и концентрации комплексов, то появляется возможность определения молярных интенсивностей рассеяния отдельно каждым из типов комплексов, а, значит, и значений структурных параметров комплексов, их форм и размеров В этом заключается уникальная возможность метода МУРР, применяемого для исследования равновесных макромолекулярных взаимодействий в растворе' изучение структуры комплексов, образующихся непосредственно во время функционирования макромолекул, через предварительное определение этим же методом стадийности механизма их взаимодействия и стехиометрии образующихся комплексов Можно показать, что из сочетаний пар экспериментальных кривых с последующим усреднением и сглаживанием вычисленных значений возможно получение молярных интенсивностей рассеяния от каждого из комплексов схем типа (1.12).

Для получения оценок точности и однозначности восстановления значений параметров моделей из данных МУРР использовали метод имитационного моделирования, исследуя влияние статистических и систематических ошибок во входных данных На 3 модельных примерах было показано, что с использованием методики анализа (1 1) - (1.15) возможно точное восстановление значений параметров в одно- и в двух стадийных схемах взаимодействия макромолекулярных наноструктур (условно фермента и субстрата). Из модельных примеров следует, что функционалов Rj, Rj, R3 устойчивы к статистическим ошибкам во входных данных Была также исследована информативность различных планов экспериментов титрования.

Разработанный подход к анализу экспериментальных данных был применен нами для анализа и изучения ряда реальных молекулярных систем различными биофизическими методами

1.2. Равновесные взаимодействия ДНК-метилтрансфераз с олигонуклеотилами и лигандами Важная роль ДНК-метилтрансфераз (МТаз) для многих внутриклеточных процессов определила растущий интерес к исследованию их биологических функций и установлению молекулярных механизмов действия А ставшие доступными в последние десятилетия высокоочищенные препараты МТаз позволили приступить к детальной ха-рактеризации их взаимодействий с субстратами, аналогами и лигандами, что необходимо для построения равновесных моделей и понимания действия молекулярных каталитических механизмов Для изучения равновесного взаимодействия между МТазами и специфическими лигандами мы использовали методы МУРР и ФЛС (методики тушения флуоресценции белков при взаимодействии с субстратами и лигандами)

Фермент МТаза FxoDam (КФ 2 1 1) из Е coli (штамм В-834) состоит из одной субъединицы (М = 27,5 кД) [Бурьянов Я И. и соавт. 1981; Mödlich Р 1982]. В качестве ДНК-субстратов в неполных реакционных системах использовали четыре синтетических оли-гонуклеотида с различной первичной структурой, содержащих полный и неполный сайты узнавания МТазой EcoDam участка ДНК (GATO, которые располагались в центре цепей первичных структур олигонуклеотидов Для анализа использовали растворы МТа-зьт EcoDam, субстратов (олигонуклеотидов), а также их смесей в неполных реакционных системах (без S AM) (табл 1)

На рис 1 приведены полученные в экспериментах молярные интенсивности МУРР МТазой EcoDam и олигонуклеотидом после введения поправок на фон, концентрацию и коллимацию, а также процедур сглаживания, а в табл 1 - исходные концентрации фермента и субстрата в смесях и разностные интенсивности МУРР (Д1(0)) от смесей МТазы EcoDam с синтетическим олигонуклеотидным дуплексом из 20 пар оснований

Рис. 1. Молярные интенсивности МУРР от растворов МТазы КсоОат (3,8 мг/мл) и субстрата (синтетического двухцепочечного олигонуклеотида) (6,7 мг/мл) (а) и экспериментальные интенсивности МУРР смесями (1 - 6) МТазы Есо<1ат с олигонуклеотидом (б) Концентрации фермента и субстрата в смесях приведены в табл. 1

Значение полученной оценки (т/п ~ 2,2) указало на максимальную стехиометрию образующихся в результате взаимодействия МТазы ЕсоОат с олигонуклеотидом комплексов, как 2:1. Анализ значений критериев 1^2 и их комбинаций, рассчитанных по экспериментальным данным МУРР, также показал, что точка минимума приходится на значения т = 2, п = 1. Все это позволило определить комплекс с максимальной стехиометрией в исследуемой молекулярной системе, как ЕгБ

Таблица 1. Разностные интенсивности МУРР (ЛГ(0)) от смесей МТазы EcoDam с олиго-нуклеотидом._

№ Исходные концентрации Разностные интенсивности Д1(0),

смеси имп • с'1 • мкМ 1

ГЕо|, мкМ rS„l, мкМ Эксперимент Модель

1 125,0 7,5 12,8 12,8

2 125,0 21,4 35,8 35,6

3 125,0 44,0 63,7 63,4

4 125,0 75,0 83,4 83,1

5 125,0 137,5 93,2 92,8

6 125,0 250,0 95,3 94,6

Тогда на основании полученных оценок можно представить взаимодействие МТазы EcoDam (Е) из Е coli В-834 с двадцатичленным синтетическим олигонуклеотидом (S) в виде:

kl 1с2

Е + S <-► ES; ES + Е <-> E2S, (1 16)

В результате процедур минимизации были определены значения термодинамических параметров взаимодействия МТазы EcoDam с олигонуклеотидом: к = (79 ± 2) • 10"® М; * = 11,5 ± 1,5; (ki = 38 10"6 М; кг = 14 106 М), рассчитаны молярные интенсивности МУРР фермент-субстратными комплексами ES и E2S и вычислены значения структурных па-

рамстров фермента, субстратов и их комплексов- радиус инерции частиц; радиус инерции поперечного сечения (1^); объем (V); максимальный размер в частице СПщж); молекулярная масса (М) и оси эллипсоидов Значения параметров - инвариантов рассчитывались 8 однородном приближении, а значения осей (2а, 2Ь, 2с) эквивалентных эллипсоидов находили путем их оптимизации при сравнении измеренных (табл. 2) и вычисленных по специальным формулам [Свергун Д.И , Фейгин Л.А 1986].

Таблица 2. Значения структурных параметров МТазы ЕсоПат (Е), олигонуклсотида 3 (5) и их комплексов, определенные по данным МУРР._

Параметр Частицы

е s es e2s

R*,A 27,9 18,8 34,3 47,7

Re, А 18,6 7,1 22,1 18,2

2а, А 25,0 18,5 21,1 21,3

2b, А 70,0 21,6 85,8 71,9

2с, А 104,4 74,8 126,9 195,3

с : b : а 1 : 0,67 : 0,24 1 : 0,29 : 0,25 1 : 0,68 : 0,17 1 : 0,37 : 0,11

V103, А3 70 28 130 190

Dm«* А. 105 75 125 190

М, к Да 32 12 48 77

Примечание: Погрешность определения значений параметров 10- 15 %.

Из табл. 2 видно, что значения некоторых параметров увеличиваются для комплекса ЕЯ, а при образовании комплекса Е2в практически совпадают с их значениями для свободного фермента. При образовании комплекса Егв происходит увеличение большой оси 2с эквивалентного эллипсоида примерно в два раза (195 А) по сравнению с ее значением для фермента (104 А). Об этом же свидетельствуют значения максимальных межатомных расстояний (Ошах) в частицах.

Рис. 2. Модель структурной схемы взаимодействия МТазы EcoDam (Е) с олигонуклео-тидом (S), полученная по данным МУРР.

В итоге полученные в настоящей работе данные о механизме взаимодействия МТазы EcoDam с ДНК можно интерпретировать следующим образом. На первой стадии после случайного присоединения мономера EcoDam к ДНК происходит образование начального комплекса. К эюму комплексу с существенно более высоким сродством идет присоединение еще одной субъединицы фермента до образования структуры "EcoDam - субстрат - EcoDam" (этап несггецифического взаимодействия). При попадании димера на симметричный участок узнавания обеспечивается единое кооперативное взаимодействие субьединиц фермента с субстратами ДНК (этап специфического взаимодействия) и метилирование остатков аденина (рис 2) Полученные результаты согласуются с выдвинутым авторами [Malygin E.G., Zinoviev V.V. 1989] предположением о симметричном характере взаимодействия этого фермента с ДНК. Прямых данных об атомной структуре фермента МТазы EcoDam и его комплексов с ДНК до настоящего времени не получено.

МТазы T2Dam и Т4 Dam (из Т-четных бактериофагов^. В геноме бактериофагов Т2 и Т4 имеется ген Dam-метилтрансферазы, которая как и EcoDam узнает сайт GATC в макромолекулах ДНК и обеспечивает перенос метальной группы на аденин при каталитической модификации ДНК. Известно, что эти метилазы отличаются между собой всего несколькими аминокислотными остатками [Schlagman S.L., Hattman S 1989; Kossykh V G. et al. 1995]. T2 и T4-Dam-reHbi, кодирующие эти метилгрансферазы были клонированы авторами [Hattman S. 1983; Schlagman S I,., Hattman S 1989] в экспрессирующем векторе. Полученные суперпродуиенты были использованы этими авторами для получения гомогенных препаратов ферментов, что и позволило приступить к детальному изучению их физико-химических и биологических свойств. В качестве субстратной ДНК, как и в случае с МТазой EcoDam, использовали 20-членные олигонуклеотидные дуплексы (оли-гонуклеотид), содержащие в центре цепи полный и неполный симметричные сайты GATC (табл. 3).

Таблица 3. Первичные структуры используемых в работе олигонуклеотидов.

Обозначение Структура олигонуклеотидов

I 5' - CGGCGCCAGATCACCGCGGT - 3' 3' - GCCGCGGTCTAGAGGCGCCA - 5'

II 5' - CGGCGCCAGGCCACCGCGGT- 3' 3' - GCCGCGGTCCGGTGGCGCCA - 5'

Полученные методами МУРР и ФЛС экспериментальные данные показали, что мак-ромолекулярные механизмы взаимодействия МТаз Т20аш и Г4Пат с олигонуклеотид-ными дуплексами очень близки В обоих случаях, как и для МТазы ЕсоОаш, происходит специфическое связывание двух субъединиц ферментов с 20-членными олигонуклео-тидными дуплексами. Характерным для МТазы Т2йат и Т40ат оказалось наличие частичной равновесной димеризации этих ферментов уже в исходных растворах. Необычный вид экспериментальных данных титрования МТаз Т20ат и Т4Пат специфическими дуплексами олигонуклеотидов удалось удовлетворительно описать только в трехста-дийных моделях с учетом стадии димеризации ферментов. Оптимальное описание данных титрования было получено для схемы:

к1 кг к4 к3

Е + 8 Е8; Ев + в <-» Е^; Е + Е <-«• Е2; Е2 + в Е28, (1.17)

где (к, • кг)/(к3 • к,) = 1.

Таблица 4 Значения структурных параметров МТазы Т40ат (Е), олигонуклеотида I (8) и их комплексов, определенные по данным МУРР._

Параметр Частицы

S Е Е2 ES E2S

R*A 16,8 18,1 31,6 23,4 34,1

Re, А 8,3 11,2 18,3 13,4 22,7

2а, А 22,3 28,1 44,1 30,3 60,1

2Ь, А 24,6 34,9 58,4 44,1 68,0

2с, А 72,1 61,3 92,1 71,3 94,7

с: b : а 1 : 0,4 • 0,3 1 : 0,6 : 0,4 1 : 0,6 : 0,5 1 • 0,6 : 0,4 1 : 0,7 : 0,6

V ■ 10~J, AJ 15,0 39,7 80,4 55,6 95,8

I^max» А 71 63 94 73 97

М, кДа 14 31 63 45 73

Примечание: Погрешность определения значений параметров 10 - 15 %.

Из полученных значений констант равновесия стадий (ki = 0,202; кг = 0,061 (для T2Dara) и к[ = 0,182; кг - 0,068 (для T4Dam)) следует, что присоединение второй молекулы МТаз к комплексам ES происходит с высокой положительной кооперативностью (к - 0,81; х = 13,2 (для T2Dam) и к = 0,73; % = 10,7 (для T4Dam)), т.к. в обоих случаях % > 10 Найденные из данных МУРР значения структурных параметров МТазы T4Dam и его комплексов с олигонуклеотидом I (табл 4) в пределах погрешностей определения соответствуют параметрам родственной ей молекулярной системы МТазы T2Dam - олиго-нуклеотид. Индуцируемая связыванием с олигонуклеотидным субстратом димеризация и способность МТазы T4Dam образовывать димерные формы в условиях повышенных концентраций фермента была позже подтверждена методами гель-фильтрации, УЦ, сшивки белковых субъединиц глутаровым альдегидом и флуоресценции в работах [Зиновьев В В и соавт 1996; Овечкина Л.Г. и соавт. 2000; Евдокимов А А и соавт., 1999].

Для МТазы T4Dam методом тушения флуоресценции была получена дополнительная информация. Определение значений параметров fa и Kj для спектральных данных по тушению флуоресценции МТазы T4Dam олигонуклеотидами I и П, содержащих полный сайт GATC (1) и неполный GGCC (II) (табл. 3), показало, что обе зависимости плохо описываются уравнением (3 15) для одностадийной схемы взаимодействия МТазы T4Dam с олигонуклеотидами (Ri >15 %), что может являться дополнительным подтверждением образования комплексов с более высокой стехиометрией Используя метод ФЛС, было показано, что при взаимодействии МТазы T4Dam с кофактором SAM и ли-гандом SAH образуются комплексы со стехиометрией 1-1 и определены некоторые структурные характеристики этого фермента. В итоге по данным МУРР (табл. 4) и ФЛС взаимодействие МТаз T2Dam и T4Dam с олигонуклеотидами (ДНК) можно представить в виде структурной схемы, приведенной на рис. 3.

S

Рис. 3 Модель структурной схемы взаимодействия МТаз T2Dam и T4Dam (Е) с олигонуклеотидом (S), полученная по данным МУРР.

Совсем недавно авторы работы [Yang Z., Kossykh V.G., Hattman S. et al, 2003] методом PCA с разрешением 2,35 - 3,63 А получили пространственные структуры комплексов МТазы T4Dam с SAH и с 12-членным дуплексом ДНК, содержащим в центре цепи специфический сайт GATC. В связи с этим, имеется уникальная возможность сравнить полученные на 8-9 лег ранее методами МУРР и ФЛС структурные данные о МТазе T4Dam с прямыми кристаллографическими параметрами Несмотря на большую разницу в разрешениях, присущих методам РСА, МУРР и ФЛС, стехиометрия комплекса МТазы T4Dam с SAH (1:1), общая форма и размеры мономера ферменга оказались хорошо со-

ответствующими друг другу Действительно, точные значения параметров этой МТазы: 55 х 34 х 28 А, а полученные из данных МУРР (табл. 4): 61 х 35 х 28 Ä, что, с учетом гидратации молекулы фермента, очень близко к прямым данным РСА. Подтвердился также результат, полученный методом ФЛС о том, что только один из трех остатков триптофанов, имеющихся в МТазе T4Dam, близок к активному центру связывания этого фермента с SAH. В целом также подтвердился полученный нами из данных МУРР и ФС вывод о димеризации фермента T4Dam при взаимодействии со специфическими олиго-нуклеотидами. Правда, авторы [Yang Z , Kossykh V.G., Hatlman S. et al, 2003) использовали более короткий, чем у нас, специфический двухцепочечный олигонуклеотид из 12 пар оснований. Таким образом, результаты сравнения полученных на несколько ле-i ранее методами МУРР и ФС структурных данных о МТазе T4Dam с прямыми кристаллографическими данными можно считать вполне удовлетворительными, что показывает информативность этих биофизических методов и разработанных нами методик анализа биологических макромолекул и комплексов.

13. Равновесные взаимодействия аминоацил-тРГОС-синтетаз с тРНК. Другой не менее важный класс ферментов составляют аминоацил-тРНК-синтетазы, участвующие в биосинтезе белков: каждая клетка имеет не менее двадцати видов аминоацил-тРНК-синтетаз [Meinnel Т. et al. 1995]. Основная функциональная роль этих ферментов - акпи-вация аминокислог и перенос их на специфические тРНК, что происходит в результате взаимодействия молекул фермента с аминокислотой и тРНК [Уотсон Д. 1978; Meinnel Т. et al. 1995].

ФРС-тРНКр1>е. Для молекулярной системы ФРС-тРНКрЬе в литературе ранее были получены противоречивые результаты. Так, Холлер и соавт. [Holler Е. et al. 1981] на основании данных квазиупругого светорассеяния пришли к выводу о существенном изменении конформации фермента при взаимодействии с тРНКрЬе. В работе Дессена и соавт. [Dessen Р. et al. 1983] утверждается, исходя из данных МУНР, что при взаимодействии ФРС с tPHK1*' по двухстадийному механизму изменений в структуре фермента и субстрата не происходит. В общем же выводы о сохранении-несохранении конформаций тРНК и аминоацил-тРНК-синтетаз в процессе их взаимодействия сделаны самые разные

Таблица 5. Значения структурных параметров ФРС (Е), тРНКрЬ® (в) и их комплексов, вычисленные из рентгенограмм МУРР._

Параметр Макромолекулы и их комплексы

Е s es es2

R»,A 53,2 23,4 51,9 53,8

rc,A 28,6 11,8 33,8 34,6

2а, Ä 42,1 23,3 53,9 50.6

2b, А 80,0 41,0 124,0 128,8

2с, А 171,3 72,1 146,2 212,4

с: b : а 1 : 0,5 : 0,2 1 : 0,6 : 0,3 1 : 0,8 : 0,4 1 : 0,6 : 0,2

V 10"J,A3 545 40 650 700

Umax, А 170 70 145 210

М, кДа 310 28 320 345

Примечание-. Погрешность определения значений параметров 10 - 15 %.

и эта проблема широко обсуждается [Малыгин Э.Г., Киселев Л Л. 1984; Киселев Л. Л. и соавт. 1984; Мстпе1 Т., МеэЫат У., В1агк)ие1 Б. 1995].

По полученным нами данным МУРР, в форме макромолекулы ФРС, состоящей из субъединиц агрг, была выявлена неравноосность по всем трем осям эквивалентного эллипсоида, т.е. кроме некоторой "вытянутости" структура ФРС обладает еще "сшпосну-

18

тостью" (табл 5) В рамках одностадийной модели было показано, что m/n ~ 0,49. Это указывает на образование в смесях молекулярной системы «ФРС - тРНКрЬе» комплекса I1S2, как комплекса с максимальной стехиометрией Таким образом, можно представить взаимодействие ФРС (Е) из Е coh MRE-600 со специфической тРНК (S) в виде схемы (1.12) Для определения значений к, % (кь кг) использовали критерий оптимизации R3 (1.15). В результате были определены значения термодинамических параметров взаимодействия ФРС с тРНКрЬе, которые оказались, к = (0,8 ± 0,1) • Ю"6 М; х = 0,08 ± 0,02; (ki = 0,40 • 10"6 М; кг - 20 ■ 10 М). Это означает, что присоединение второй молекулы тРНКрЬе (S) к комплексу ES происходит с отрицательной кооперативностью (% ~ 0,1). Как и в случаях МТаз, были определены значения структурных параметров ФРС, тРНКрЬе и их комплексов (табл 5) Как видно из табл 5 и рис. 4, асимметрия фермента уменьшается при связывании с первой молекулой тРНК в комплексе ES, но при образовании комплекса ES2 происходит увеличение максимального размера в частице по сравнению с комплексом ES. Полученные результаты можно объяснить наличием конфор-мационпых изменений в ФРС при связывании с тРНК в комплексах, содержащих одну и две молекулы тРНКрЬе, что вполне согласуется с термодинамическими характеристиками этих комплексов и с полученными ранее биохимическими данными об этой молекулярной системе [Горшкова И И , Лаврик О.И 1982] Разная эффективность комплексообра-зования одной и двух молекул тРНКрЬе с ФРС связана, по-видимому, с регуляцией активности фермента в реакции аминоацилирования [Малыгин Э Г., Киселев Л.Л. 1984].

Рис. 4. Структурная схема взаимодействия ФРС (Е) с тРНКрЬе (в), полученная по данным МУРР.

Как и в случае с метилазой Т4Паш, спустя несколько лет после получения нами методом МУРР результатов по изучению взаимодействия ФРС со специфической тРНК, в 1995г авторам работа [Мояуак Ь е1 а1, 1995] удалось закристаллизовать и получить методом РСА с разрешением 2,9 А пространственную структуру свободной ФРС из ТЬ ТИегторЫЫ.ч, а в 1997г с разрешением 3,3 А и комплексов ФРС (из ТЬ ЛегторЫиэ) с

тРНКрЬе [ео]с)ёш. у

й а1, 1997] Известно, что молекулярные массы и структуры ФРС (012Р2) из 7Ъ /ЬегторЫш и из Е соН («2Р2) очень близки [Бобкова Е.В. и соавт. 1990; Метпе1 Т. й а1 1995] Поэтому мы снова можем сравнить полученные на несколько лет ранее методом МУРР структурные данные, на этот раз о молекулярной системе "ФРС-тРНКрЬе", с прямыми кристаллографическими параметрами Оказалось, что макромолекула ФРС из ТЬ. ЛегторИ11ш имеет длину около 170 А, а ширина и толщина молекулы в перпендикулярном направлении - приблизительно 65 и 45 А, соответственно [Мов1ак Ь. й а1., 1995; Со1ё§иг У., Моя1ак Ь., ЛпкПоуа V., Ьаупс О е1 а1., 1997] В эллипсоидальном приближении, с учетом сложной формы ФРС, значения параметров осей трехосного эллипсоида вполне соответствуют полученным нами методом МУРР параметрам эллипсоида: 42 х 80 х 171 А (табл 5). Также полностью подтвердилось, что именно две моле-

кулы

трНкрЬе

входят в каталитическим комплекс ФРС с тРНКрЬе и при этом каждая макромолекула тРНК связывается с ФРС в положениях, предсказанных из данных МУРР с точностью до ориентации наноструктуры из субъединиц (о^рг) фермента И, наконец, оказалось, что после формирования комплекса ФРС-тРНКрЬе структура фермента действительно подвергается наноструктурному конформационному изменению, которое, очевидно, обеспечивает лучшее взаимодействие поверхностей фермента и субстрата Причем эти изменения происходят только в районе связывания молекул тРНК

Таким образом, исходя из близости структур ФРС из Е coli и из Th thermophilus, как и в случае с МТазой T4Dam, результаты сравнения полученных методом МУРР на несколько лет ранее структурных данных о ФРС с прямыми кристаллографическими данными также можно считать вполне удовлетворительными Это еще раз доказывает информативность метода МУРР и разработанных нами методик анализа биологических наноструктур Но следует отметить, что этот метод позволяет гораздо более экспрессно, чем РСА, получать информацию не только о структуре, но и о стехиометрии всех образующихся комплексов, стадиях взаимодействия макромолекул и константах термодинамического равновесия стадий Кроме того, исследования макромолекул методом МУРР проводятся в нативных буферных условиях. А закристаллизовать в методе РСА удается, как известно, далеко не все структуры, которые представляют научный интерес.

ТРС. В случае эукариотической триптофанил-тРНК-синтетазы (ТРС) из поджелудочной железы быка также были неоднократные неудачные попытки закристаллизовать эту макромолекулу и ее комплексы со специфической тРНК [Sund F et al 1969] Ранее было установлено, что ТРС функционирует как димер ot2, состоящий из 2-х идентичных субъединип с молекулярной массой около 60 кДа [Kisselev L L et al 1979] В предварительных экспериментах с использованием МУРР мы обнаружили, что исходные препараты ТРС представляют собой полидисперсную олигомерную систему, зависящую от температуры и времени инкубации препарата Ранее в препаратах ТРС уже обнаруживали олигомеры со структурой аз и даже оц, наряду с основной формой а.2 [Kisselev L L. et al. 1979] Поэтому в данной работе мы ограничились предварительным этапом изучения физико-химических свойств этого фермента

Анализ полученных нами данных МУРР от препаратов ТРС показал, что зависящая от температуры олигомеризация макромолекул этого фермента происходит, по-видимому, последовательно через ряд стадий с объединением частиц во все большие комплексы Особенно интенсивно образование агрегатов идет при температурах 37 — 42°С. Кроме того, процесс олигомеризации ТРС прекращается при понижении температуры до 20°С и вновь продолжается при дальнейшем повышении нагрева препарата, т е идет по необратимому механизму Среднее число димерных молекул ТРС в олигомер-ных комплексах увеличивается от 2 для исходного состояния и до 56 после длительного прогрева в физиологическом диапазоне температур Среди наноструктур олигомерных комплексов имеются и существенно неравноосные (некомпактные).

Как показал анализ полученных в работе данных, олигомеризация ТРС, вероятнее всего, происходит за счет прямого образования химических связей между доменами с молекулярной массой 40 кДа Способность ТРС к олигомеризации, по-видимому, является частью молекулярного механизма компартментализации и отражает реализующиеся in vivo гомотропные белок-белковые взаимодействия [Наградова Н К 1990] Все это необходимо учитывать при дальнейшем изучении структуры ТРС и каталитических механизмов ее взаимодействия с тРНК.

1.4. Влияние комплексов anoAI с глюкокортикоизами на вторичную структуру ДНК и на биосинтез белка в гепатонитах. Ранее в работах [Панин Л Е и соавт 1983, 1987, 1990; Усынин ИФ и соавт 1995] был обнаружен эффект активации биосинтеза белка в гепатоцитах под влиянием кондиционной среды непаренхимных клеток печени,

инкубированных в присутствии ЛПВП, кортизола и ЛПС Было показано, что комплексы некоторых апоЛП с глюкокортикоидами (ТГК-апоА1) влияют на экспрессию генов и на биосинтез белка в гепатоцитах [Панин Л Е и соавт 1993, 1996;] Установлено, что повышение скорости биосинтеза белка связано с образованием комплекса ТГК-апоА1 в макрофагах, входящих в состав непаренхимных клеток печени Таким образом, было показано, что ЛПВП кроме своих основных функций, связанных с транспортом и метаболизмом липидов, участвуют также в регуляции экспрессии генов и биосинтеза белка в клетках Однако молекулярные механизмы взаимодействия комплексов апоА1 с глюкокортикоидами и с ДНК оставались в значительной степени не изучены

АпоА1-11 К-ДНК В рамках данной работы нами изучались некоторые аспекты молекулярного механизма взаимодействия апоА1 с глюкокортикоидами и с эукариотической ДНК Используя метод СР, было показано, что при взаимодействии апоА1 с тетрагидро-кортиэолом (ТПС), дигндроэпиандростеронсульфатом (ДГЭСС) и дигидроэпиандросте-роном (ДГЭС) образуются специфические комплексы со стехиометрией 1'1 и 12 (К^ = 0,2 - 0,7 мкМ), но при значительном превышении концентраций глюкокортикоидов над апоА1 происходит образование и неспецифичсских комплексов со стехиометрией до 15 (К,1 = 0,71 - 1,07 мкМ) Это не противоречит имеющимся в литературе представлениям о взаимодействии апоАТ со стероидными гормонами [Панин Л Е и соавт 1987, 1992]

Рис. 5 Рентгенограммы МУРР от исходного образца ДНК (0,84 мг/мл) и их смесей с апоА1 (0,4 мг/мл) и с комплексами апоА1-гормон (Г1, Г2) (0,3 мг/мл) и апоА1-ТГК (0,3 мг/мл) (а), а также кривые титрования ДНК комплексами апоА1-Г1, апоАТ-Г2, апоАГ-ТГК) методом СР (Д1(0)) (б) (здесь Г1 - ДГЭСС; Г2 - ДГЭС).

Используя оценки максимальной стехиометрии комплексов, из данных МУРР и СР (рис 56) было показано, что при взаимодействии ДНК с апоА1, апоА1-ТГК, апоА1-ДГЭСС и апоА1-ДГЭС образуются специфические комплексы со стехиометрией от 1 - 3 до 19 (Кд = 0,08 - 1,9 мкМ), а при значительных превышениях концентраций лиганд-комплекс над ДНК происходит образование и неспецифических комплексов со стехиометрией до 154 и выше По данным МУРР и СР взаимодействие комплексов апоА1-гормон (ТГК, ДГЭСС и ДГЭС) с эукариотической ДНК приводит к разрыву водородных связей между комплементарными парами азотистых оснований и образованию однони-тевых участков в структуре ДНК, способных к связыванию с ДНК-зависимой РНК-

полимеразой Известно, что о целостности вторичной сгруктуры ДНК можно судить по наличию на рентгенограмме МУРР дифракционного максимума в области у(лов Ь к 0,266 А"1 [Федоров Б А 1976], соответствующего диаметру двойной цепи ДНК (~ 24 А) Из рис 5а видно, что при Ь ® 0,27 А"' на рентгенограммах МУРР от препаратов натив-ной ДНК и от смесей ДНК с апоА1 без ТГК имеется дифракционный максимум, а от аналогичных смесей в присутствии гормонов ТГК, ДГЭСС (Г1) и ДГОС (Г2) величина пика достоверно снижается Взаимодействие высококооперативно и при этом связывается от 3 до 9 комплексов апоА1-гормон и до 6 молекул РНК-полимеразы на одну макромолекулу ДНК (М ~ 26000 кДа) Были определены структурные характеристики апоА1, нативной ДНК, РНК-полимеразы и их комплексов в присутствии ТГК. В этом молекулярном механизме апоАТ, по-видимому, выполняет роль целевого переносчика гормонов, а их восстановленные формы способствуют разрыву водородных связей между парами азотистых оснований ДНК, приводя к локальной ее денатурации и создавая предпосылки для взаимодействия РНК-полимеразы с однонитевыми участками ДНК

Такой механизм повышения экспрессии генов и может являться причиной активации биосинтеза белка в гепатоцитах под влиянием комплекса 11 К-апоА1. Но какова структура сайтов связывания комплексов ТГК-апоА1 с ДНК? Поиск предполагаемых последовательностей по существующим базам данных первичных структур ДНК, проведенный акад РАМН Паниным Л Е и к б н Лукашевым В А , показал присутствие цис-элемеша типа (ссс)„ в структуре гена апоА! человека. Аналогичная последовательность, но с большим числом повторов была выявлена в ре1уляторнт.гх областях многих генов млекопитающих и человека Эволюционно она является достаточно консервативной и, вероятно, играет важную роль в регуляции экспрессии этих генов

С целью определения сайтов связывания комплексов ТГК-апоА1 с ДНК нами было исследовано специфическое взаимодействие белка апоА1 с одноцепочечными и двухце-почечным олигонуклеотидами, содержащими последовательность СС(ОСС) ,, и определены структурные и равновесные характеристики их взаимодействия с апоА! в присутствии ТГК Связывание апоА1 с олигонуклеотидами, имеющими другие первичные структуры, почти не происходило. При замене ТГК на кортизол и при отсутствии ТГК взаимодействие принципиально меняется и идет в соответс I вии с другим механизмом

ТГК димер к, мономеры

Рис. 6 Структурная схема взаимодействия комплекса ТГК-апоА1 с олигонуклеотидным димером, содержащим последовательность СС((ЗСС)5, полученная по данным МУРР

Было показано, что в присутствии ТГК экспериментальные данные хорошо описываются двухстадийной моделью (1.12 - 1 15), где ^ = 9,92 мкМ, кг - 165,1 мкМ (к -19,84 мкМ, х ~ 0,24), а взаимодействие комплексов ТГК-апоА1 со специфическим ди-мерным олигонуклеотндом можно представить в виде структурной схемы, приведенной на рис. 6 Видно, что связывание одноцепочечных олигонуклеотидов с комплексом ТГК-апоА1 происходит с отрицательной коопсративностью (х < 1) В присутствии же корти зола и без ТГК днмерный олигонуклеотид после образования комплекса с апоА! не диссоциирует на одноцепочечные олигонуклеотиды, а остается целым

Таким образом, получены новые данные о молекулярном механизме активации биосинтеза белка в гепатоцитах Впервые показано, что взаимодействие комплекса ТГК-

anoAI с эукариотической ДНК приводит к разрыву водородных связей между комплементарными парами азотистых оснований и к обраюванию однонитевых участков в структуре ДНК Подтверждено предположение, что комплексы ТГК-anoAI (Р) могут вступать в равновесное взаимодействие с о л иго ну клеоти д н ы м и дуплексами, содержащими в своей структуре последовательности типа (GCC)n, в результате чего происходит частичный распад дуплексов на мономеры Этот молекулярный механизм, по-видимому, тесно сопряжен с синтезом аполипопротсинов

1.5. Изучение структурных, равновесных и биологических свойств синтетических фрагментов инсулина. Небольшой глобулярный белок инсулин с функциями гормона хорошо изучен, известны его первичная и пространственная структуры. Но механизм действия инсулина на молекулярном уровне изучен хуже, чем для других гормонов [Reavcn G.M 1988] Практическая медицина уже давно проявляет большой интерес к возможности использования вместо природного инсулина его синтетических фрагментов, адекватно связывающихся с рецепторами и обеспечивающих гормональный эффект [Bavenholm Р et al 1995] На основе теоретического анализа структурно-функциональной организации молекулы инсулина человека Паниным Л Е , Максютовым А 3 и Сабировым А Н в нашей совместной работе были выбраны, сконструированы и химически синтезированы три пептида- два мономерных пептида (нанодекапептид и тетрадекапептид) и димерный пептид, предположительно моделирующий рецепторпый домен инсулина С помощью метода МУРР нами были определены структурные и дисперсные характеристики синтезированных пептидов и коммерческого человеческого инсулина «Actrapid HM Penfill» в водных растворах. Было показано, что, в отличие от на-нодекапептида и димерного пептида, тетрадекапептид и инсулин имеют склонность к агрегации и образуют олигомеры, включающие в свой состав до шести молекул полипептидов каждый На основе анализа результатов можно сделать вывод, что для изучения функциональных свойств синтезированных пептидов перспективнее использовать димер и нанодекапептид

В совместной работе с Потеряевой О Н с использованием ИФА и специфических антител была подтверждена иммунохимическая идентичность модельного димерного пептида и соответствующего ему фрагмента молекулы инсулина Поэтому можно предположить, что в случае участия данного синтетического домена в рецепции он будет активным конкурентом нативного инсулина за связывание с рецептором Полученные результаты свидетельствуют о том, что в линейных пептидах могут легко происходить на-ноструктурные изменения, формирующие строго определенную конформацию, позволяющую пептиду взаимодействовать с антителом Выше уже отмечалось, что подобные наноструктурные изменения встречаются в механизмах практически всех макромолеку-лярных взаимодействий и происходят, например, при равновесных взаимодействиях ферментов с субстратами и лигандами Наноструктурные взаимодействия и переходы -это, по-видимому, основной механизм, взаимно адаптирующий молекулы и макромолекулы друг к другу при их функциональных контактах.

2. СТРОЕНИЕ, СУБФРАКЦИОННЫЙ И КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ СЫВОРОТОЧНЫХ ЛИПОПРОТЕИНОВ КРОВИ

Известно, что метаболические пути белков в организме тесно связаны с метаболизмом липидов и липопротеинов (ЛП) крови [Климов АН 1981; Assman G, Funke Н 1990] Поэтому изучение метаболизма липидов, как и белков, необходимо для понимания молекулярных механизмов функционирования биологических систем и причин появления заболеваний После белков и нуклеиновых кислот липиды являются третьим необходимым компонентом всех живых систем Достаючно назвать их роль в образова-

нии мембран, без которых не может образоваться и функционировать ни одна клетка и органелла живых организмов Но нерастворимые в водной среде жиры и лиггиды в организме, как известно, должны транспортироваться к тканям и органам, где они либо используются, либо запасаются Эту проблему в организмах эукариотов решает особый класс биологических наноструктур - липопротеиньт крови, образующиеся при их биосинтезе в результате взаимодействия неполярных липидов (ТГ и ЭХС) с амфипатиче-скими лилидами (ФЛ и НЭХС) и специфическими апо-белками

2.1. Новый подход к анализу сывороточных JIM крови дифракционными методами. Известно, что различные типы нарушений липидного обмена - дислипопротеине-мии СДЛП) сопровождаются нарушениями структур сывороточных ЛП крови и изменением их фракционного состава Причем в последнее время выявлено участие ЛП в механизмах нарушения липидного обмена, сопровождающих развитие, кроме атеросклероза, целого ряда других патологий типа диабета, гепатита, панкреатита, анемии и др [Липо-вецкий Б.М 2000; Карпов Р.С , Дудко В.А. 1999] Поэтому вполне очевидно, что для целей диагностики и профилактики заболеваний людей, а также для получения оценок эффектов лечений точное и экспрессное определение фракционного состава ЛП плазмы крови имеет первостепенное значение. Уже давно назрела необходимость определять полный и детальный ФС ЛП, причем непосредственно в цельной плазме или сыворотке крови и без длительного и трудоемкого отделения этих неустойчивых к физико-химическим воздействиям макромолекул от других сывороточных белков

Рис. 7. Экспериментальные зависимости (а) интенсивности МУРР (11(р)) (Ь = 0,01 А' ') от плотности буфера в растворе САЧ (7,8 мг/мл) и в сыворотке крови (а) и нормированные рентгенограммы МУРР от образца суммарных ЛП при двух плотностях буфера-1,0 г/см (А) и 1,27 г/см3 (о) (контрастеры - сахароза и №Ж}з) Штриховые линии в (а) соответствуют уровню рассеяния образцом сыворотки при плотности буфера 1,27 г/см3

В работе предложен новый эффективный подход к анализу ФС ЛП, основанный на использовании методов МУРР и контраста На рис 7а приведены интенсивности МУРР в первой точке рентгенограмм (11(р)) от плотности растворителя (буфера) препаратами сывороточного альбумина человека (САЧ) и цельной сыворотки крови Эти зависимости имеют вид парабол с точками минимумов вблизи р » 1,27 г/см3 (САЧ) и р ~ 1,21 г/см3 (сыворотка крови) Видно, что при р к 1,27 г/см3 дифракционное рассеяние от белковых молекул САЧ отсутствует Поскольку практически все простые белки в гидратирован-ном состоянии имеют плотность, соответствующую этой же величине (1,27 г/см3) [Шульц Г, Ширмер Р. 1982], то при р = 1,0 г/см3 липидные ядра ЛП в сыворотке крови

почти не лают вклада в рентгеновское рассеяние и последнее обусловлено в основном белками, а при р » 1,27 i/cm1, наоборот, не дают вклад в рассеяние белки и оболочки ЛП, и в этом случае ЛП «видны» методом МУРР как близкие к однородным сферические ли-пидные ядра соответствующих рашеров На рис 76 приведены 2 нормированные на первую точку рентгенограммы МУРР от препара i а суммарных ЛП, не содержащих других сывороточных белков, при двух значениях плотности буфера (1,0 г/см3 и 1,27 г/см ) Видно, что рентгенограммы МУРР существенно изменяются, а характер спада интен-сивностей дифракционного рассеяния вполне согласуется с известными данными о структуре ЛП [Laggner Р , Muller К W 1978]. Таким образом, используя методы МУРР и контраста, можно получать рентгенограммы рассеяния от липидных ядер ЛП непосредственно от цельной плазмы или сыворотки крови

В связи со сложным строением наночастиц ЛП разработка новой методики анализа сывороточных ЛП крови проходила в два этапа. На первом этапе, используя для сравнения традиционные методы анализа ЛП (ЭМ, УЦ и ЭФ), была показана эффективность применения метода МУРР для анализа ФС ЛП как в очищенных (от других сывороточных белков крови) препаратах ЛП, так и в цельных плазмах или сыворотках крови Для прямо! о сравнения и оценки возможностей определения ФС ЛП методом МУРР на реальных образцах ЛП из сыворотки крови методом УЦ были выделены 3 фракции ЛП (ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП) и также приготовлен суммарный препарат, содержащий все фракции ЛТТ (кроме ХМ) Были получены ЭМ микрофотографии от каждого из 4-х образцов и измерены рентгенограммы МУРР (рис. 8а-г) На рис 8д-з в виде сплошных линий графиков DV(R) приведены результаты определения ФС ЛП из экспериментальных данных МУРР (методом обратного Фурье-преобразования), а в виде гистограмм - результаты прямого подсчета частиц ЛП различных размеров на ЭМ фотографиях Гистограммы нанесены на графики функций DV(R) (рис 8д-з) с учетом масштабов увеличений на микрофотографиях Анализ полученных экспериментальных данных МУРР показывает хорошее соответствие структур липидных ядер ЛП моделям сплошных однородных сфер Действительно, т к 1(h) • h4 = const на концах всех рентгенограмм (рис 8а-г), то использование сферического форм-фактора при вычислении DV(R) вполне корректно [Свергун Д.И , Фейгин Л.А. 1986]. Из рис. 8д-з также видно, что рассчитанные из рентгенограмм МУРР функции DV(R) достаточно хорошо совпадают с гистограммами распределений, найденных непосредственно из ЭМ фотографий ЛП. Все распределения в каждом из образцов (рис. 8д-з) и размеры частиц ЛП во фракциях в целом хорошо согласуются с имеющимися представлениями о структуре ЛП [Otvos J D. et al 1996] Причем приведенные распределения ФС ЛП были получены от препаратов ЛП, очищенных or других белков плазмы крови (рис 8д-ж), и непосредственно от цельной сыворотки крови (рис 8з), из которой и были выделены фракции ЛП Видно, что полученные рентгенограммы (рис 8г) и распределения ФС ЛП (рис 8з) от цельной сыворотки крови и очищенного от сывороточных белков суммарного препарата ЛП очень близки. Имеющиеся небольшие отличия в распределениях можно объяснить неполнотой разделения фракций ЛП методом препаративного УЦ Сдвиг гистограмм на 20-30 А относительно графиков функций DV(R), полученных нами из данных МУРР, обусловлен толщиной белковых оболочек у частиц ЛП, которая в среднем близка к постоянной и составляет 22 А В целом же соответствие распределений ФС ЛН, полученных методами МУРР и ЭМ вполне хорошее, что подтверждает эффективность использования метода МУРР для определения ФС ЛП Было также получено хорошее соответствие и количественных результатов по новой методике с данными традиционных методов (УЦ и ЭФ).

Новый методический подход к анализу ФС ЛП в сыворотках крови отличается экс-прессностью анализа, простотой реализации, использованием всего одного реактива (контрастера) и разрешением вплоть до субфракций Но на первом этапе разработки

Рис. 8. Рентгенограммы МУРР, полученные от очищенных препаратов фракций ЛПВП (а); ЛПНП (б); ЛПОНП (в), суммарных ЛП (г) в координатах 1(Ь)-Ь4, Ь и функции Г\(Я), рассчитанные по этим экспериментальным данным (д - з). Значками (о) в (г) и (з) приведены данные от исходной цельной сыворотки крови. Плотность буфера в образцах 1,27 г/см3. Гистограммы ФКС ЛП в (д - з) получены по данным ЭМ.

методика позволяла определять концентрации не отдельных компоненюв ЛП (ТГ, ХС, ФЛ, БК), а суммарных липидов в ЛП подфракциях. Это затрудняло практическое использование результатов анализов в медицине, поэтому требовалось дальнейшее развитие предложенного методического подхода к анализу сывороточных ЛП крови для возможности определения не только их фракционного, но и компонентного состава

2.2. Модель, описывающая равновесный состав и общее строение сывороточных ЛП крови человека. С згой целью нами была разработана специальная математическая модель, описывающая строение наночастиц ЛП крови человека, хорошо соответствующая мировым литерагурным данным о компонентном составе ЛП всех классов и подклассов от ЛПВП до ХМ (использовалось более 70-ти источников), их молекулярным массам, структурам и размерам [Tardieu А et al. 1976; Luzzati V. et al 1979; Laggner P., Muller K.W. 1978; Morrisett J.D. et al. 1975; Mills GL. et al. 1984; Климов A.H , Ни-кульчева Н.Г. 1984; Gotto А М. et al. 1986; Bellamy M.F. et al. 1989; Thompson G R 1989; Baumstark M.W. et al 1990; Chana RS et al. 1990. и др.]. Модель, представляет собой систему из пяти основных экспоненциально-квадратных (2 2) и дополнительных балансных и нормировочных уравнений (2.3) и позволяет определять полный компонентный состав (ТГ, ЭХС, НЭХС, ФЛ и БК) любого класса ЛП и всех их промежуточных форм, используя только их размер (радиус г).

r = U(l (Щтт + D )хс.)/Ю0) ). (2.1)

Еьк(х) = ехр(9,453125 - 1,461 • х + 0,01299362 - х2); (2.2)

2н зхс(х) - ехр( 21,378 + 9,507 х - 0,9475275 ■ х2), при х < х№

12н5хс(х) = ехр(10,43031 2,3493 • х + 0,12707 • \2), при х > х„;

Djxc(x) ехр(-21,8124 + 10,222 • х - 1,016516 • х2), при х <х«;

D-mc(x) = ехр( 16,3372 - 3,63880 • х + 0,194364 • х2), при х > х„,

где х = In г, х„ 4,6039, tu = 21,5 А (средняя толщина оболочек ЛП), а численные значения объемных долей компонентов Du (х) и Е>фл (х) определяются из уравнений баланса: Dn(x) - 100 • (r-to)V -D3xc(x);

Ефл(х) ~ 100 - Dük(x) - Dinxc(x) - Doxc(x) - Dtt(x). (2.3)

Были учтены реальные плотности всех компонент ЛП и эффекты гидратации апо-белкового компонента БК. Модель (2.1) - (2.3) отражает наличие определенных закономерностей в строении сывороточных ЛП крови человека. Эти закономерности строения, выраженные в значениях параметров модели, проявляются в том, чю между ЛП сыворотки крови всех классов поддерживается динамическое равновесие, смещенное в сторону образования этих уникальных биологических наноструктурных комплексов, которое и стабилизирует их структуры. Поэтому разработанная нами модель строения ЛП, кроме методических целей, может быть полезной и при исследовании, например, слабо изученных молекулярных механизмов самосборки ЛП комплексов, происходящих в процессах их биосинтеза, а также при изучении процессов обмена липидными и апо-белковыми компонентами между ЛП и другими сывороточными белками крови.

2.3. Методики анализа субфракциониого и компонентного состава JITT в плазмах и сыворотках крови. Используя модель строения частиц всех субфракций сывороточных ЛП крови, методика определения ФС ЛП была развита до возможности определения фракционного и компонентного состава (ФКС) ЛП по данным метода МУРР. Было показано, что при определении размеров отдельных частиц ЛП в буфере с контрастером (р„ « 1 27 г/см3) радиус (R) однородного липидного ядра частиц ЛП и внешний радиус (г) ЛП связаны между собой выражением вида:

г = R (аЗЕк'(г)+Пфл(г)+П1Пхс(г)+1>1хг(г)+Оп'(г)) /(ОфЛ(г)+Онэхс(г)+ЕЬхг(г)+Отг(г)))2/3.

Интенсивность МУРР (1(h)) от сферической частицы с двумя уровнями плотности определяется известным выражением [Свергун Д.И., Фейгин Л.А. 1986]: I(h) = L(p-p„)-Vj(hR)]2,

где р0 = 1,27 г/см3 (плотность водного растворителя с контрастером); V, j(hR) - объем и амплитуды рентгеновского рассеяния от однородных сфер с радиусом R.

К сожалению, известному подходу к определению функции распределения ЛП частиц по размерам (Dv(R)) из данных МУРР на основе обратных Фурье-преобразований присущи многие трудности, в частности, связанные с «эффектом обрыва» дифракто-

грамм (рис 8) Поэтому вместо базового уравнения в интегральной форме для ренгено-грамм МУРР от полидисперсних систем наночастиц мы использовали его дискретной вариант в виде систем линейных уравнений [Свергун Д И , Фейгин Л А 1986], в результате чего функция DV(R) использовалась в «ступенчатом» или гистограммном виде Для определения параметров этой функции применяли процедуры численной оптимизации по методу Нелдера-Мида [Neider JA, Mead R 1965; Гилл Ф и соавт. 1985], была составлена и отлажена соответствующая вычислительная программа для ЭВМ При таком подходе становится возможным определение всего множества решений вблизи точки оптимума, что позволяет определять размеры доверительного интервала значений каждого параметра в явном виде На математических моделях было показано, что алгоритм обладает хорошей воспроизводимостью и устойчив к погрешностям исходных данных

Общие ЛП. В качестве примера на рис 9а приведена экспериментальная рентгенограмма МУРР от образца сыворотки крови человека, а на рис. 96 и в табл 6 - результаты определения концентраций всех компонент ЛП методом МУРР в графическом и табличном виде. Видно, что теоретическая рентгенограмма МУРР хорошо соответствуе-i экспериментальным данным (рис. 96).

Из рис 9 и табл 6 видно, что из анализа рентгенограмм МУРР от плазм и сывороток крови можно определять концентрации всех пяти компонент ЛП в 15 субфракциях, 6 подфракциях и 3 фракциях, т е всего более 150 значений параметров ФКС ЛП Границы интервалов по размерам наночастиц в субфракциях ЛП мы использовали, как в работах [Otvos J.D. et al. 1992, 1996]: ЛПВПзс (37 - 39 À); ЛПВПзь (39 - 41 А); ЛПВП3а (41 - 44 А), ЛПВП2а (44 - 50 А); ЛПВП2Ь (50 - 64 А); ЛПНП3 (91 - 98 А); ЛПНП2 (98 - 106 А); ЛПНП,(106 114 А); ЛППП (114 135 А); ЛПОНП5 (135 - 155 А); ЛПОНГЦ (155 - 175 А); ЛПОНПэ (175 - 205 А); ЛПОНП2 (205 - 300 А); ЛПОПП, (300 - 400 А)

h. А"

П - 1

___б_

1 i

\ 1 „

H u 1 Infi

Il_i: ЛГ n

lai iLi [illlHfïfililîi

H1 нг Ю Н4 H5 Lp(a) 11 L2 L3 IDL VI V2 V3 V4 V5

Рис. 9. Экспериментальная (—■—) и теоретическая (о) рентгенограммы МУРР от образца сыворотки крови в координатах 1(Ь) • Ь4, Ь (а), а также гистограмма (б) распределения суммарных липидов (ТГ+НЭХС» ЭХО ФЛ) в 15-ти субфракциях ЛП (Н1-Н5, Ьр(а), Ь1-ЬЗ, ГОЬ, VI-У5), полученная из экспериментальных данных МУРР. Измерения рентгенограммы проводили при температуре образца сыворотки крови 20°С

Однако сегодня такой расширенный анализ сывороточных ЛП с определением 150 параметров ФКС ЛП пока не востребован практической медициной и представляет интерес только для научных исследований. Кроме того, для получения значений такого количества параметров с необходимой точностью требуются повышенные затраты на измерения и обработку да1шых Поэтому далее в работе ФКС ЛП будут характеризоваться в виде 6 подфракций (ЛПВП3, ЛПВП2, ЛПНП,.3, ЛППП, ЛПОНП3.5, ЛПОНП|.2), 3 фрак-

28

ций (ЛПВП, ЛПНП, ЛПОПП) и общих липидов (ОХС, ОТГ) ЛП Были проведены сравнительные анализы параллельных определений концентраций ОХС, ХС-ЛПВП и ОТГ крови тремя методами (биохимическим методом, "сухой химии" и МУРР) у 134 пациентов Показано, чго эти значения, полученные мегодом МУРР, хорошо соответствуют значениям, полученным биохимическими методами для тех же образцов сывороток крови. Отклонение значений концентраций, измеренных тремя методами, составило 1 - 9 % и при этом выявлена сильная положительная корреляция (КК = 0,79 - 0,94) между данными параллельных определений концентраций параметров "триады" методом МУРР и биохимическими методами Все это является свидетельском хорошего соответствия разработанной модели строения ЛП реальным струи урам ЛП в образцах сывороток крови людей и эффективности используемого алгоритма анализа данных МУРР.

Таблица б. Значения концентраций компонентов в субфракциях, подфракциях и фракциях ЛГ1 в реальной сыворотке крови, определенные по данным метода МУРР (рис. 9).

№ п/п ЛП ТГ, мг/дл эхе, мг/дл нэхе, мг/дл (ХС), мг/дл ФЛ, мг/дл БК, мг/дл ЛП, мг/дл

Суб(] эракции ЛП

1 ЛПВПзс (Н1) 2,8 5,2 1,5 4,6 12,4 49,1 71,0

2 ЛПВПзъ (Н2) 1,0 2,3 0,6 2,0 5,3 15,1 24,4

3 ЛПВП3а (НЗ) 3,4 9,1 2,5 7,9 18,8 42,2 76,1

4 ЛПВП2а (Н4) 3,3 10,7 2,9 9,2 18,9 34,6 70,42

5 ЛПВП2Ь(Н5) 2,6 11,4 2,9 9,7 14,4 20,0 51,4

6 ЛП(а) (Ьр(а)) 0,2 1,0 0,3 0,9 0,8 0,8 3,2

7 ЛПНПз а.1) 17,6 75,8 19,1 64,3 43,3 39,7 195,6

8 ЛПНП2 (Ь2) 16,0 38,4 10,0 32,9 23,1 19,7 107,3

9 ЛПНП, (ЬЗ) 12,6 17,9 4,9 15,6 12,1 9,6 57,1

10 ЛППП (ГШ,) 22,7 17,6 5,2 15,7 14,3 10,1 70,0

11 ЛПОНП5(У1) 20,2 9,0 3,0 8,3 8,9 _, 5,6 46,7

12 ЛПОНП4 (У2) 6,7 2,1 0,7 2,0 2,4 1,3 13,3

13 ЛПОНПз (УЗ) 11,8 2,6 1,0 2,5 3,4 1,8 20,6

14 ЛПОНП2 (У4) 15,5 1,9 0,8 2,0 3,1 1,4 22,7

15 ЛПОНП1 (У5) 9,1 0,6 0,3 0,7 1,2 0,5 11,7

Г1од(| >ракции ЛП

1 ЛПВПз 7,2 16,6 4,6 14,5 36,5 106,4 171,5

2 ЛПВП2 5,9 22,1 5,8 19,0 33,4 54,5 121,8

3 ЛПНП1.3 46,5 133,1 34,4 113,6 79,4 69,9 363,3

4 ЛППП 22,7 17,6 5,2 15,7 14,3 10,1 70,1

5 ЛПОНПз-5 38,7 13,7 4,7 12,9 14,7 8,7 80,5

6 ЛПОНПиг 24,6 2,5 1,2 2,6 4,3 1,8 34,4

Фракции ЛП

1 ЛПВП 13,2 38,7 10,5 33.5 69,9 161,0 293,4

2 ЛПНП 69,1 150,8 39,6 129,4 93,6 80,0 433,3

3 ЛПОНП 63,3 16,2 5,9 15,5 19,0 10,5 115,0

Общие ЛП

1 | ЛП (все) 1 145.7 | 205,7 | 66,1 | 178.5 | 182,6 | 251,6 | 841,6

Примечание-. Средняя статистическая погрешность определения концешраций ЛП составляет: 20 - 30 % для субфракций, 10 - 20 % для подфракций и 5 - 10 % для фракций и общих (суммарных) компонентов ЛП.

Однако прикладные аспекты использования новой модели строения ЛП выходят за рамки возможностей только дифракционных методов анализа ЛП С появлением модели строения частиц ЛП стало возможным, например, корректное решение задач определения концентраций ЛП по данным химических, биохимических и других методов во фракциях, а после некоторого изменения схем измерений концентраций липидов в сыворотках крови, и даже в подфракнияч ЛП Первые результаты в этом направлении нами уже получены и работа продолжается.

Согласно литературным данным, наиболее близким (к МУРР) по информативности методом анализа ЛП крови следует отнести метод, предложенный исследователями из США [Otvos J. et al., 1992, 1996], на основе ЯМР - спектроскопии. Так сложилось, что начало работ и развитие наших методов совпали по времени и шли достаточно независимо, хотя конечные результаты возможности определения ФКС ЛП вплоть до субфракций -у обоих методов оказались близкими. Однако, на наш взгляд, метод на основе МУРР имеет ряд преимуществ перед ЯМР.

Модифицированные ЛП. В настоящее время в патогенезе атеросклероза и других заболеваний, прямо или косвенно связанных с нарушениями липидного обмена, важная роль отводится модифицированным ЛП. Было показано, что разрабоганная нами методика анализа общих ЛП по данным МУРР оказалась пригодна и для анализа модифицированных ЛП, поскольку их общая структура остается практически той же. Для препаративного выделения модифицированных ЛП из сывороток крови, как и авторы [Канская Н.В., Карпов Р.С. 1987, 1992] мы использовали полиэтиленгликоли (ПЭГ), в частности, ПЭГ-6000.

Термоустойчивость ЛПВП. Изучая физико-химические свойства сывороточных ЛП крови, нами была обнаружена высокая термоусюйчивость ЛПВП. Оказалось, что после кратковременного прогрева сывороток крови даже до 90 - 95°С частицы фракции ЛПВП не денатурируют. Термоустойчивость ЛП связана, по нашему мнению, с защитной ролью их липидных компонентов по отношению к апо-белкам ЛП - самому уязвимому к воздействию повышенной температуры компоненту ЛП. Это их свойство было нами использовано в эффективном способе препаративного выделения ЛПВП из плазм или сывороток крови. Сравнительные анализы ФКС ЛП показали, что субфракционный состав ЛПВП после термического воздействия остается почти без изменений в отличие от применения для выделения ЛПВП химическою осаждения смесью МпСЬ и гепарина

2.4. Фракционный и компонентный состав ЛП как набор маркеров для оценки состояния липидного обмена и ei о нарушений. Сывороточные ЛП, являясь ключевым звеном липидного обмена, специфически участвуют и проявляют себя при нарушении метаболизма липидов. Известно, что различия в вероятности развития атеросклероза и других заболеваний обусловлены |етерогенностью каждого из основных классов ЛП, состоящих из многих субфракций с различными биологическими функциями [Thompson G.R 1989; Климов А.Н. и соавт. 1980, 1981, 1984, 1995, 1999]. Поэтому детальная информация о ФКС сывороточных ЛП может стать полноценным набором маркеров для оценки состояний липидного обмена и типов его нарушений в организме.

Фенотипирование липопротсинемий В первую очередь нами были получены средние значения и диапазоны концентраций для подфракций общих и модифицированных ЛП фенотипа здоровых людей. В исследуемую группу входило 120 человек в возрасте от 25 до 60 лет. Критериями включения пациентов в группу нормолипопротеинемии было содержание ОХС менее 190 мг/дл, ХС-ЛППП менее 100 мг/дл и ОТГ менее 140 мг/дл. Полученные результаты хорошо согласуются с имеющимися в литературе данными о нормальных значениях концентраций основных фракций и подфракций ЛП [Холодова Ю.Д., Чаяло П.П. 1990].

Кроме нормолипопротеинемии, нами проведено предварительное фенотипирование таких заболеваний, как- коронарный атеросклероз (КА), рассеянный склеро 1 (РС), системная красная волчанка (СКВ), клещевой энцефалит (КЭ), инсулинозависимый диабет I типа (СД-1), инсулинонезависимый диабет II типа (СД-11), ревматоидный артрит (РА) и бронхиальная астма (БА) До настоящего времени детальные спектры ФКС ЛП крови при этих заболеваниях практически не были исследованы. Поэтому

| СЛ-1 1

г в 1 В В 1

1 ■ 1 -39.4

-55.6 _оо 5 ' -52,Й

I сд-п 4Я4

I- 40, т ■ ■

1______________I I 9Ь

8 В

-37,8 И -59 -Л)Ь

5

-т-1

СКВ ■ 1

В 54,7 |

_11--

-------И-Д-------1-

1 Н 1

1 11 -349 -пал

лпвп лпип лпонп лпвп лпнп лпонп

Рис. 10 Гистограммы отклонений от нормолипопротеинемии (в %) значений концентраций подфракций ЛП для фенотипов различных заболеваний (по ОЛИ) Штриховые линии соответствуют усредненным границам интервалов [± (9 - 16) %] достоверных отклонений от нулевой линии — нормолипопротеинемии

полученные нами предварительные результаты тестирования (фснотипирования) новым методом этих разных по механизмам ¡аболеватшй являются первыми, из которых 4 относятся к аутоиммунным (РА, СКВ, PC, БА)

На рис 10 приведены гистограммы отклонений от нормолипопротеинемии (в %) значений концентраций подфракций ЛП для фенотипов этих заболеваний (по ОЛП) Как и ожидалось, полученные результаты во всех случаях свидетельствуют о снижении содержания антиатерогенных ЛПВП Повышенные значения концентраций подфракций ЛПНП и ЛПОНП по сравнению с "нормой" получены у лиц с коронарным атеросклерозом (КА), которые хорошо соответствуют ожидаемым [Thompson G R. 1989] А вот для СД-1, КЭ и аутоиммунных заболеваний (PA, PC и БА) эти показатели оказались сниженными (отклонения от нормы - отрицательные). Близкими (по ФКС ЛП) к фенотипу КА оказались такие заболевания, как СД-Н и СКВ. Об этом же говорят результаты корреляционного анализа спектров ЛП (рис 10) Была выделена группа аутоиммунных заболеваний с КК = 0,84 - 0,96 К ним с КК = 0,85 - 0,93 формально оказался близок фенотип СД-1 Некоторая "близость" (по КК) обнаружена у таких заболеваний, как коронарный атеросклероз (КА) и СД II (КК = 0,9), клещевой энцефалит (КЭ) и СКВ (КК = 0,78), что не случайно. Об атеросклеротических поражениях коронарных артерий и других сосудов при заболеваниях СД-Н и СКВ говорится в работах [Соколов Е.И. 1996, Карпов Р С., Дудко В А. 1999; Змушко Е И и соавт 2001] С литературными данными также хорошо согласуются полученные нами низкие концентрации ЛПВП и повышенные - ОХС, ХС-ЛПНП и ОТГ при КА, СД-И и СКВ [Климов А Н и соавт 1987; Липовецкий Б А. 2000] И, как следствие "родства", фенотипы этих заболеваний имеют повышенные значения индекса атерогснности К., = 5,9 (КА); 4,1 (СД-Н); 4,2 (СКВ)

Важно отметить, что у пациентов с нормолипопротеинемией среднее содержание модифицированных ЛП составило 41,5 %. Как и ожидалось, наименее подвержена мо-. дификации оказалась подфракция ЛПВПз (22,9 %) а наиболее подверженная - подфрак-ция ЛППГ1 (62,2 %). Кроме нормолипопротеинемии, для фенотипов РА и БА нам также удалось получить усредненные статистические данные о концентрациях не только общих, но и модифицированных ЛП и степени их модификации Концентрации модифицированных ЛП и, соответственно, степени их модификации имеют достоверные отличия у мужчин, женщин и у возрастных групп больных РА У больных РА средний уровень модификации ЛП составил 58,9 %, причем наименее подвержена модификации оказалась подфракция ЛПВП2 (24,9 %) а наиболее - также подфракция ЛПТТП (82,4 %) Значительное повышение уровня модификации ЛП у больных РА происходит за счет фракций ЛПНП и ЛПОНП и имеется четкая тенденция к повышению этого уровня от молодых возрастных групп к более пожилым, достигая 90 и даже 100 % (ЛПТТП, ЛПОНПьг, ЛПОНПз-s).

Изменение ФКС ЛП у пациентов в процессе лечения Было показано, что новая методика анализа ЛП позволяет не только получать ценную диагностическую информацию, но может эффективно использоваться и для проведения клинических испытаний лекарственных препаратов и средств, предназначенных для профилактики и лечения нарушений липидного обмена, в первую очередь, атеросклероза и его осложнений Применяли такие лекарственные средства, как статины, фибраты, антигипертензивные средства и БАД. В исследования было включено 239 человек Из группы статинов использовали - ловастатин (ЛС) (30 пациентов с ИБС), церивастатин (ЦС) (30 пациентов с ИБС) и аторвастатин (АС) (17 пациентов с комбинированной ГХС) Из группы фибратов был выбран один из наименее изученных - ципрофибрат (ЦФ) (50 пациентов с ГХС), из препаратов растительного происхождения - хофитол (ХФ) (32 пациента с комбинированной ГХС), облепиховое масло (ОМ) (20 пациентов с комбинированной ГХС), пум-пан (ПМ) (40 пациентов с комбинированной ГХС) и пумпан + Бальзам Биттнера

(ПМ+ББ) (20 пациентов также с ГХС) Работа проводилась совместно с сотрудниками Института терапии СО РАМН (Новосибирск)

Таблица 7. Изменение концентраций сывороточных ЛП крови (в %) у групп пациентов до и после приема лечебных препаратов (ЦФ, АС, ЦС, ЛС) и БАД (ХФ, ПМ, ББ), определенные методом МУРР__

Фракции и П репараты

подфракции ЦФ АС ЦС ЛС ХФ ОМ ПМ ПМ+ББ

ЛП После приема препарата, недель

8 8 16 6 12 8 8 8 8

Холестерин (ХС)

ЛПВПз -20 (9 +0 84 -34 +15 -9 +182 + 28

ЛПВП2 +132 -37 -2 -3 + 54 -14 +0 +13 -12

ЛЛВП 44 -18 -1 27 + 23 -4 -4 +13 + 2

ЛПНПз +3 + 15 -33 -20 -54 +8 -27 -4 + 9

ЛПНП2 -21 -66 +7 11 4 7 -17 +82 +17 ^ 21

ЛПНП, -18 -40 (33 -44 -10 -4 101 +37 - 16

ЛТТПП -69 +16 -65 -И -33 -4 -8 -19 -25

ЛПНП -20 -7 -23 -16 -21 -1 +17 +3 -3

ЛПОНПз-5 -50 -20 -11 9 -25 +14 +30 -7 +32

ЛПОНП|.2 -43 -12 -47 9 -40 -20 -60 +24 +50

ЛПОНП -50 -22 -20 23 -26 +9 + 19 -3 +35

Ср. % откл. 59 36 33 32 43 16 53 50 31

Общие компоненты ЛП

ОХС -20 -12 -17 -4 - 15 +8 112 +5 + 2

ОТГ -41 -17 -29 +2 -21 -3 -35 +5 + 4

ОЛП -19 -14 -19 +5 -И +5 +3 +-13 + 3

Ка (по ХС) -53,8 +10 -19 -28 -38,5 +15 +21 -12 +0

Примечание• Жирным шрифтом выделены достоверные значения параметров.

Как видно из табл. 7, после приема практически всех используемых в работе лечебных препаратов (кроме ХФ) в спектрах ФКС ЛП произошли достоверные изменения (средние отклонения составили 31 — 59 %), причем в благоприятную сторону Полученные результаты свидетельствует об эффективности действия этих липидкорректирую-щих препаратов, но полученные результаты пока следует считать предварительными Наши исследования по анализу ЛП в сыворотках крови больных с различными нозоло-гиями показали, что при лечении самых различных заболеваний происходят положительные изменения в липидном обмене и, как следствие, - нормализуются спектры общих и модифицированных ЛП.

Таким образом, разработанная нами новая методика анализа ФКС сывороточных ЛП крови является прш одной для проведения клинических испытаний и исследований механизмов действия лекарственных препаратов и БАД.

Оценка состояния здоровья популяции жителей ЯНАО Известно, что проблемы выяснения степени опасности техногенного загрязнения окружающей среды для здоровья населения, как и методы оценки изменения здоровья людей под действием техногенных факторов, являются исключительно важными проблемами для экологической медицины Так, например, популяции тундровых ненцев и пришлого европеоидного населения ЯНАО после проведения в 1955-1962 гг ядерных испытаний на полигоне "Новая Земля" оказались под воздействием радионуклидов (в "тг'шг-ц тптппр" 137Гя и ^^ Эти дол-

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ | БИБЛИОТЕКА I СЛтНт I

О» ЯМ акт [ ■ 4« а л •

гоживущие изотопы были обнаружены в пробах различных тканей у коренных жителей ЯНАО [Osipova P.L. et al. 1999] В связи с этим, представлялось целесообразным получить оценку состояния здоровья в популяции как коренных жителей, так и пришлого населения (европеоидов), проживающего в ЯТГАО Анализ литературных данных показал, что при наличии множественных заболеваний у этих популяций почти всегда наблюдаются существенные изменения во фракционном составе ЛП крови [Холодова Ю Д., Чаяло ПП, 1990; Климов АН, Никульчева Н.Г 1995] Есть данные, указывающие на большую вероятность возникновения под действием ионизирующего излучения различного рода аутоиммунных заболеваний (АИЗ) Учитывая все это, мы исследовали состояние биологического здоровья жителей ЯНАО, используя новый метод анализа и данные о ФКС сывороточных ЛП крови Для этого мы использовали данные о ФКС ЛП крови жителей и полученные нами фенотипы ФКС ЛП для лиц в норме и страдающих КА, PC и СКВ Выше уже отмечалось, что по данным параметров фенотинирования у группы фенотипов АИЗ имеются сходные признаки (гиполипопротеинемии) Поэтому на основании анализа параметров ФКС ЛП достаточно легко отличить больных с нарушением липидного обмена типа КА с одной стороны, и АИЗ - с другой.

Были определены ФКС ЛП крови у случайной выборки населения из 374 человек, проживающих в 2-х территориальных районах ЯНАО Рассматривали две подгруппы: европеоиды, проживающие в ЯНАО не менее 10 лет (43 человека), и ненцы (331 человек). Статистический анализ полученных данных показал, что нормолипопротеинемии соответствуют плазмы и сыворотки крови только 5 - 15 % европеоидов и 8 - 10 % ненцев, а показатели остальных доноров попадают в группы с выраженными ДЛП [Chapman M.J 1994] При этом к больным типа КА относятся 33 % европеоидов и 22 % ненцев, а к больным типа СКВ и PC можно отнесги 54 % европеоидов и 48 % ненцев, т е примерно у 50 % жителей ЯНАО выявлены нарушения ЛП спектра по типу АИЗ Но 20 % европеоидов и 42 % ненцев по данным ФКС ЛП крови соответствуют, по-видимому, каким-то другим заболеваниям, для которых данных по фенотипированию ЛП спектров пока нет Нашими коллегами по данному разделу работы (Невинский Г А , Коровкина Е.С., Гармашова Н В ) было показано, что аутоиммунные реакции и изменения имеются у 41 % европеоидов и 56 % ненцев, что вполне согласуются с данными по ФКС ЛП

Влияние охлаждения организма на ФКС ЛП Проблема регуляции обмена липидов при температурных воздействиях на организм важна и с точки зрения выживания человека и животных в условиях холода. При этом симпатическая нервная система и ее медиатор норадреналин играют важную роль и в регуляции содержания сывороточных ЛП крови [Панин Л.Е., Филатова Т.Г. 1986].

Хотя ФС сывороточных ЛП крыс имеет специфические особенности, характерные для этих животных, но общее строение ЛП крыс и человека принципиально не отличаются [Холодова Ю.Д , Чаяло П П , 1990] Поэтому для определения ФКС сывороточных ЛП крови этих лабораторных животных использовали разработанный нами метод анализа ЛП Результаты определения ФКС ЛП методом МУРР показали, что гипертензивные крысы линии НИСАГ в исходных гермонейтральных условиях достоверно отличаются от Вистар только концентрацией подфракции ЛПВП2 (табл 8) В термонейтральных условиях значения индекса атерогенности (Ка) оказались повышены у гипертешивных крыс НИСАГ (1,1 ± 0,2), по сравнению с нормотензивными крысами Вистар (0,7 + 0,1) Таким образом, крысы линии НИСАГ с наследственной стрессиндуцированной гипер-тензией в исходном состоянии имеют пониженное содержание фракции ЛПВП в плазме крови и повышенный индекс атерогенности по сравнению с нормотензивными животными (табл. 8).

При медленном охлаждении животных произошли существенные изменения в под-фракционном составе всех фракций ЛП крови у гипертензивных крыс (табл. 8). Эти и s-

менения касались главным образом ЛПВП и ЛПОНП в обеих группах крыс, в ю время как содержание ЛПНП уменьшилось только у гипсртсн тиных крыс

Таблица 8. Концентрации подфракций ЛП у нормо1ензивных и гипертензивных крыс при различных темпера гурных воздействиях (Р < 0,05). __

Воздействие | ЛПВПз | ЛГ[ВП2 I ЛПНП,., | ЛППП | ЛПОНПз s | ЛПОНПы

Нормотензивные крысы линии Вистар, (п - 7)

Контроль 9,0 -L 3,6 37,2 ± 8,6 13,6 ±9,2 12,1 ± 1,8 6,2 ± 2,4 0,5 ±0,1

МО 5,1 ±2,9 56,2 ± 11 19,7 ±9,9 7,6 ± 4,7 12,2 ± 3,5 0,7 ± 0,3

БО 6,3 ± 1,1 29,7 ± 9,9 28,2 ± 5,0 3,6 ± 2,9 5,4 ±2,1 0,4 ± 0,2

Гипертанзивные крысы линии НИСАГ, (п - 7)

Контроль 4,9 а 2,9 22,9 ± 8,4 16,0 ±9,1 7,8 ± 5,0 5,8 ±2,1 0,5 ±0,1

МО 3,5 ± 3,4 45,4 ± 9,4 3,3 ± 3,2 6,8 ±4,1 17,5 ± 3,8 0,8 ± 0,3

БО 3,7 ± 2,4 22,0 ±5,7 12,5 ± 7,9 4,3 ±3,6 7,6 ± 3,5 0,5 ± 0,1

Примечания: МО - медленное охлаждение; БО - быстрое охлаждение Жирным шрифтом выделены достоверно отличающиеся от контролен значения концентраций ЛИ.

Значительное увеличение в содержания ЛПОНП у гипертензивных крыс в результате их медленного охлаждения связано, по-видимому, с повышенной потребностью в дополнительном энергетическом субстрате (табл. 8) Произошло значительное (в 2,5 раза) уменьшение после медленного охлаждения в крови у гипертензивных крыс содержания ЛПНП. Это положительное изменение, поскольку именно эти частицы, модифицируясь, участвуют в атеросклерозе стенок кровеносных сосудов [Карпов Р.С , Дудко В.А 1999]. Именно поэтому в клинике у пациентов с ИБС важнейшей задачей является снижение в первую очередь ХС-ЛПНП [Климов А.Н. и соавт. 1980, 1987, 1995, 1999] Из полученных экспериментальных данных также видно, что липидный обмен по-разному реагирует на охлаждение у нормотензивных и гипертензивных животных.

Таким образом, под влиянием холодового воздействия у гипертензивных животных происходят существенные изменения во фракционном составе ЛП крови, что указывает на принципиальную возможность коррекции нарушений ЛП спектра с помощью температурных воздействий у больных с артериальной гипертензией.

2.5. Наиоструктурные изменения в ЛПВП при хранении образцов плазм и сывороток крови. Выше уже упоминалось, что наиоструктурные комплексы ЛП играют важную роль не только в липидном, но и в белковом обмене. В частности, было показано, чю ЛПВП вместе с глюкокортикоидами принимают участие в регуляции экспрессии генов в клетках печени (раздел 1 4) Но при проведении исследований в условиях т vitro препаративно выделенные из сывороток крови фракции ЛПВП могут использоваться не сразу, а через нескольких суток Отсюда следует, что для корректного изучения механизмов биологического действия ЛПВП в различных экспериментальных моделях чрезвычайно важно знать - какие структурные изменения в них могут происходить в процессе хранения в условиях т vitro.

Характерный вид рентгенограмм МУРР, полученных от препарата ЛПВП, в трех состояниях- в исходном; через 4 суток и через 11 суток после хранения при 4°С показал, что при длительном хранении в образце ЛПВП происходят значительные структурно-дисперсные изменения В процессе хранения наблюдается перераспределение пиков в сторону больших размеров частиц. Обобщенный анализ результатов говорит о том, что при хранении ЛПВП в течение нескольких суток в них происходят структурные изменения, вероятно, по агрегационному механизму с нарушениями упорядоченности во внутренней структуре частиц ЛП. Об этом свидетельствует почти полное исчезновение дифракционного максимума (при h = 0,07 А"1) на рентгенограмме, полученной после хра-

нения препарата в течение 11 суток, а также уширение и смещение распределений P(Y), D„(R) в сторону больших размеров и расстояний

Таким образом, результаты оценки структурно-дисперсных изменений ЛПВП позволяют заключить, что при длительном хранении ЛП без специальных защитных добавок происходит деградация наночастиц ЛП с перераспределением субфракпионною состава и нарушением упорядоченности в их внутренней структуре, что необходагмо учитывать при определении структурных характеристик нативных ЛП в условиях т vitro

ВЫВОДЫ

1 Развиты теоретические и методические подходы, расширяющие возможности дифракционных методов при анализе биологических наноструктур в статическом состоянии и при равновесных многостадийных взаимодействиях макромолекул и комплексов в бинарных смесях.

2. Равновесное взаимодействие ДНК-метилтрансфераз (Ь) EcoDam (из Е coli), T2Dam и T4Dam (из Т-четных бактериофагов) со специфическими олш онуклеотидами (S) происходит в две основные функционально значимые стадии с образованием комплексов ES и E2S Присоединение вторых молекул фермента к комплексу ES у метилаз происходит с высокой положительной кооперативностью (х > 10), что и обеспечивает кооперативное взаимодействие субт.единиц фермента с ДНК в каталитическом акте метилирования остатков аденина.

3 Равновесное взаимодействие фенилаланил-ТРНК-синтетазы (Е) (из Е coli MRE-600) со специфической тР1 IKpbe (S) происходит в две стадии с образованием комплексов ES и HS2 В результате того, что при образовании комплекса ES изменяется конформа-ция фермента, присоединение второй молекулы TPHKphe к комплексу ES происходит ан-тикооперативно (х= 0,1).

4 Тршггофанил-тРНК-синтетаза (ТРС) (из поджелудочной железы быка) в условиях in vitro представляют собой пол и дисперсную олигомерную систему, зависящую от температуры и времени инкубации. Олш омеризация ТРС может быть частью молекулярного механизма формирования субклеточных секреторных гранул при регуляции биосинтеза белков в эукариотических клетках.

5. При равновесных взаимодействиях белка anoAI с глюкокортикоидами образуются специфические комплексы со стехиометрией 11, связывание которых с нативной эу-кариотической ДНК (М ~ 26 ООО кДа) приводит к образованию однонитевых участков в ее вторичной структуре Специфическое связывание комплексов anoAI-ТГК с короткими олигонуклеотидными димерами, имеющими структуру СС(ОСС)5, приводит к равновесному распаду дуплексов на мономеры и свидетельствует о соответствии или близости сайтов связывания комплексов в цельной ДНК структурам типа (GCC),,

6 Разработана формальная математическая модель, описывающая состав и строение сывороточных липопротеинов (ЛП) крови человека и позволяющая определять полный компонентный состав любой их субфракции На основе модели строения ЛП разработана эффективная методика определения фракционного и компонентного состава (ФКС) общих и модифицированных ЛП в плазме или сыворотке крови по данным метода МУРР.

7. Проведено фенотипирование липопротеинсмий в норме и при некоторых заболеваниях с использованием в качестве маркеров ФКС ЛП. Корреляционный анализ фенотипов (КА, PC, СКВ, КЭ, СД-1, СД-П, РА, БА, нормолипопрогеинемия) показал, что к группе АИЗ (PC, СКВ, РА, БА) формально блиюк СД-1 У пациентов с нормолипемией средний уровень модифицированных ЛП составил 41 %, у больных РА - 59 %, у больных БА - 56 % Наименее подвержена модификации подфракция ЛПВПз (22 — 36 %), а наиболее - подфракция ЛППП (62 - 82 %) в) После 6-18 недель приема липидкоррек-

тирующих препаратов у всех пациентов с ГХС отмечены изменения значений параметров ФКС ЛП в сторону нормализации.

8 Исследование состояния здоровья в популяции жителей peí иона ЯНАО, показало, что нормолипопро1еинемии соответствуют сыворотки крови только около 10 % жителей, а для 90 % выборки жителей ЯНАО характерен тот или иной тип ДЛГТ. При этом к больным тина КА относятся четверть жителей, к больным аутоиммунного типа - около 50 %, а у трети жителей по данным ФКС ЛП имеются другие типы заболеваний.

9. У крыс с наследственной стрессиндуцированной гипертензией при медленном охлаждении происходит повышение (в 2 раза) содержания подфракции ЛПВПг и снижение (в 2,5 раза) фракции ЛПНП, что нормализует ФКС ЛП, индекс атерогенности и указывает на принципиальную возможность коррекции нарушений ЛП спектра с использованием температурных воздействий. Наноструктуры ЛПВП обладают свойствами выдерживать без денатурации кратковременное повышение температуры до 95°С. Термоустойчивые свойства ЛП можно использовать для препаративного выделения фракции ЛПВП из плазм или сывороток крови Однако при длительном хранении препаратов ЛП без специальных защитных добавок в ЛПВП происходят изменения по агрегационному механизму с нарушениями упорядоченности во внутренней структуре.

10 Разработаны новые аппаратные методики измерений и эффективные конструкционные схемы блоков малоуглового рентгеновского дифрактометра и прибора в целом, что позволяет повысить аналитические возможности приборов этого класса и резко уменьшить их габариты, массу и стоимость. Конструкции основаны на использовании новых технических решений, материалов и технологий.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Тузиков Ф.В. Способ подготовки кюветы для рентгенографического исследования биологических объектов Патент РФ № 1052957. Бюлл. изобретений № 41 от 7 И 83i.

2. Тузиков Ф.В , Марьясов А Г, Гутина 3-Е. Определение физического титра макромолекул и вирусов в растворе методом малоугловою рентгеновского рассеяния. // Сборник трудов 7 научной конференции молодых ученых. ВНИИ Молекулярной биологии Новосибирск. 1984. С 131-142.

3 Тузиков Ф В. Об опыте эксплуатации координатных детекторов фирм "Siemens" (ФРГ), "Braun" (Англия) (тезисы доклада) // Материалы Всесоюзного рабочего совещания «Применение детекторов рентгеновского излучения в исследовании структуры биополимеров». 10-12 июня. 1985. Пущино. С.23.

4 Тузиков Ф.В , Онищенко В.М , Вавилин А.И. Малоугловой рентгеновский дифрак-тометр Патент РФ № 1562808 Бюлл изобретений № 17 от 07.05.90г.

5. Тузиков Ф.В , Миспорин Ю Н , Туликова Н.А, Богомолов Ю.Б. Устройство для управления пучками рентгеновского и i амма-излучений. Патент РФ Ks 2072575. Бюлл. изобретений № 3 от 27.01.97г.

6 Тузиков Ф В., Самотяжко В.Г., Тузикова H.A., Галимов Р.В. Новая конструкция малоуглового рентгеновско! о дифрактометра - новые возможности метода МУРР (тезисы доклада) // Материалы VI Конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока». 21-24 ноября 2000. Новосибирск. С 313-314.

7 Тузиков Ф В , Зиновьев В В., Вавилин В.И., Малыгин Э.Г., Баев А.А , Бурьянов Я И. Применение метода малоуг лового рассеяния для исследования фермент-субстратных взаимодействий в растворе (тезисы доклада) // Материалы Международного семинара «Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и нейтронов» 24-28 сентября. 1985. Пущино С 26.

8. Тузиков Ф.В , Зиновьев В.В., Яшина JIН, Вавилин В И , Малыгин Э Г , Садовский А.П Определение методом малоуглового рентгеновского рассеяния структурных и равновесных взаимодействии в растворе (тезисы доклада). // Материалы шестого симпозиума по конформационным изменениям биополимеров в растворах 20-22 ноября 1985. Тбилиси. С 47-48.

9. Зиновьев В В , Тузиков Ф.В , Малыгин Э.Г , Бурьянов Я И , Яшина Л Н , Речкунова Н И., Горбунов Ю А , Баев А А., Дегтярев С X., Вавилин В.И., Попов С Г Исследование стехиометрии комплексов при взаимодействии Ecodam метилазы с субстратом методом малоуглового рентгеновского рассеяния (тезисы доклада) // Материалы шестого симпозиума по конформационным изменениям биополимеров в растворах 20-22 ноября 1985 Тбилиси. С.56-57.

10. Тузиков ФВ., Зиновьев В.В., Яшина ЛН, Вавилин В И., Горбунов ЮА, Попов С.Г., Дегтярев С X., Малыгин Э Г., Садовский А П , Бурьянов Я И , Баев А А. Изучение индуцируемых субстратом изменений в состоянии метилазы Ecodam методом малоуглового рентгеновского рассеяния //Молекулярная биология. 1986 Т.20 Xü 4 С 1002-1007

11 Тузиков Ф.В., Зиновьев В.В., Вавилин В.И., Мапьи ин Э.Г. Исследование структуры макромолекулярных комплексов в растворе методом малоуг лового рентгеновского рассеяния (тезисы доклада) II Материалы V Всесоюзного симпозиума «Структура биологических макромолекул» 10-13 октября. 1987 Звенигород. С. 18

12. Тузиков Ф.В, Вавилин В.И., Малыгин ЭГ., Анкилова В.Н., Моор Н А , Лаврик О И. Исследование комплексообразования фенилаланил-тРНК-синтетазы из Ecoli с тРНК методом малоуглового рентгеновского рассеяния. // Молекулярная биология. 1988 Т.22. Xs 6. С. 1623-1631.

13. Tuzikov F.V., Zinoviev VV., Vavilin VI, Maligin E.G Small-angle X-ray scattering study of enzyme-substrate interaction in solution. // Studia Biophysica 1988 V.125 № 3 P.169-172.

14. Tuzikov F V., Zinoviev V.V., Vavilin V.I, Maligin E.G. Ankilova VN , Moor N.A , Lavrik О I Application of the small-angle x-ray scattering tcchinique for the study of equilibrium enzyme-substrate interactions of phenylalanyl-tRNA synthetase from E.coli witli tRNA // Febs Lett. 1988. V.1232. № 1. P.107-110.

15 Тузиков Ф.В , Зиновьев В В , Вавилин В И., Малыгин Э Г , Анкилова В Н , Моор Н А, Лаврик О.И Применение метода малоуглового рентгеновского рассеяния для исследования равновесных фермент-субстратных взаимодействий. // Сборник научных трудов «Химия физиологически активных веществ». Нальчик 1988. С 11-13

16 Тузиков ФВ., Речкунова НИ., Зиновьев ВВ, Вавилин В.И. Метилтрансфераза Ecodam из Ecoli: структурно-функциональные аспекты фермент-субстратного взаимодействия (тезисы доклада). // Материалы четвертой Всесоюзной конференции «Биосинтез ферментов микроорганизмами» 19-22 сентября 1988. Ташкент С 269-270

17 Buryanov Y.I, Zinoviev V.V , Gorbunov Yu A., Tuzikov F.V., Rechkunova N I, Maly-gin E.G., Baev A A Interaction of the Ecodam metytransferase with synthetic oligodeoxyri-bonucleotides. //Gene. 1988 V.74. P.67-69.

18 Тузиков Ф В , Зиновьев В В , Вавилин В И , Малыгин Э.Г., Бурьянов Я И , Баев А А Взаимодействие метилазы Ecodam с двухцепочечным дезоксирибоолигонуклеоти-дом. // Доклады АН СССР. 1989. Т 304 № 1 С 231-234.

19 Зиновьев В В., Речкунова Н И , В И , Горбунов Ю А , Тузиков Ф В , Вавилин В И , Малыгин Э.Г Изучение роли симметрии в специфическом узнавании природных и синтетических ДНК ферментами рестрикции-модификации типа 2 (тезисы доклада) // Материалы Всесоюзного симпозиума «Ферменты рестрикции-модификации ДНК- от генов до белков». Октябрь. 1989. Вильнюс. С 5

20 Zinoviev V.V., Rechkunova N.I, Gorbunov Yu A , Tuzikov F V , Vavilin V.I., Maligin E.G Studies on the rôle of symmetry in the specific recognition of DNA by type 2 restriction and modification enzymes. // International symposium «Molecular organization of biological structures». June 19-24 1989. Moskow. V 2. P.283

21. Тузиков Ф В , Тузикова H A , Вавилии В.И , Зиновьев В В , Малыгин Э Г., Фаворо-ва О.О , Заргарова Т А., Судомоина M А , Киселев Л Л. Зависящая от 1емпературы агрегация триптофанил-тРНК-синтетазы Исследование методом малоуглового рассеяния // Молекулярная биология 1991. Т 25. № 2. С 740-751.

22. Tuzikov F V., Zinoviev V.V ,Vavilin V.I, Maligin E.G. Studies of the role of simmetry in the specific recognition of natural and synthetic DNA by type П restrictions and modification enzymes // Abstracts of FASEB Summer Res 1 Conf. «Restriction Endonucleases and Modification». July 3-8 1993. Saxtions River. Vermont. USA P.139.

23. Тузиков Ф.В , Тузикова H A , Миспорин Ю.Н. Способ анализа липопротеидов в плазме крови методом МУРР. Патент РФ № 2099693. Бюлл. изобретений № 35 от 20.12.95г

24. Tuzikov F V, Zinoviev V V, Naumochkin A.N., Malygin E.G. Kinetic and equilibrium discription of the T4 Dam DNA Mcthyltransferase action Model examples. // French-Russian Symposium on Regulation of Gene Expression July 1-5. 1995. P.38. Novosibirsk. Russia.

25 Tuzikov F.V., Kossykh V G., Schlagman S.L., Zinoviev V.V, Malygin E.G., Hattman S. The study of equilibrium interactions of the phage T4 Dam DNA Methyltransferase with co-factor and substrates by fluorescence spectroscopy method's. // French-Russian Symposium on Regulation of Gene Expression. July 1-5. 1995 P.39. Novosibirsk. Russia.

26 Tuzikov F.V., Zinoviev V.V., Vavilin VI and Malygin F..G Application of the Small-Angle X-ray Scattering technique for the study of two-step equilibrium enzyme-substrate interactions. // Biopolymers. 1996. V.38. P.131-139.

27. Тузиков Ф В , Панин Л Е., Тузикова H А , Поляков Л.М. Применение метода малоуглового рентгеновского рассеяния для оценки структурных изменений в лилопротеинах высокой плотности. //Биологические мембраны 1996. Т.13 № 1. С.71-78.

28. Тузиков Ф В., Тузикова H А., Байбаков В.И. Влияние биопрепаратов на белковый и липидный состав крови (тезисы доклада) // Материалы конференции «Создание единой региональной системы мониторинга окружающей природной среды и здоровья населения Сибири». 17-19 сентября. 1996. Новосибирск С.75.

29 Тузиков Ф.В , Тузикова H А., Анисимова Т.И , Галимов Р В. Способ анализа липо-протеинов в плазме или сыворотке крови методом малоуглового рентгеновского рассеяния Патент РФ № 2115121 Бюлл. изобретений № 19 от 10.07.98i.

30. Vavilin V.I. and Tuzikov F.V. The determination of plasma lipoprotein profile by Small-Angle X-ray Scattering // Annual Meeting of the American Cristallographie Association. July 19-25. 1997. St. Louis. USA. P. 171.

31 Тузиков Ф В., Тузикова H A , Наумочкин A.H., Зиновьев В.В., Малыгин Э.Г. Изучение равновесного взаимодействия Dam ДНК-(^аденин)-мстилтрансферазы фага Т4 с субстратами и лигандами методом тушения флуоресценции. // Молекулярная биология 1997. Т 37. № 1. С.86-90.

32 Панин Л Е., Тузиков Ф В., Потеряева О Н., Максютов А.З., Тузикова Н.А., Сабиров А.Н . Синтез фрагментов инсулина и изучение их физико-химических и иммунологических свойств //Биоорганическая химия 1997. Т.23 № 12. С.953-960.

33 Тузиков Ф В , Тузикова H А., Панин Л Е., Никитин Ю.П., Крылова И.Н. Определение фракционного состава липопротеинов крови методом малоуглово! о рентгеновского рассеяния. // Биологические мембраны. 1998. Т.15. № 4. С.420-432.

34 Тузиков Ф В., Тузикова H А , Панин Л Е , Никитин Ю П Новый метод диагностики нарушений липидно!о обмена //Вестник РАМН. 1998. № 3. С.42-47.

35. Панин JIЕ , Тузиков Ф.В , Тузикова Н А., Харьковский А В., Усынин И Ф Влияние комплекса тетрагидрокортизол - аполипопротеин А-Т на биосинтез белка в гепатоци-тах и на вторичную структуру эукариотической ДНК // Молекулярная биология 1999 Т.ЗЗ №4 С.673-678.

36 Nikitin Yu Р , Tuzikov F V , Tuzikova N A , Ragino Yu I Application of the Small-angle X-ray scattering technique for animation structural change of lipoprotein fractions of blood // Abstracts of 71 European Atherosclerosis Society May 26-29 1999 Coustasy Greece P73.

37. Панин Л.Е., Тузиков Ф.В , Тузикова Н.А , Гимаутдинова О И., Поляков Л М. Взаимодействие эукариошческой ДНК с аполипопротеином A-I и его комплексами с глюко-кортикоидами. // Биофизика. 2000. Т.45. № 4. С 611-619.

38. Тузиков Ф В., Тузикова Н А , Галимов Р В , Рагино Ю.И , Антонова Е.В , Слеггчеи-ко Н В Применение метода МУРР для изучения влияния некоторых биологически активных добавок на липидный обмен в организме (тезисы доклада) // Материалы ГУ Международного симпозиума «Биологически активные добавки к пище: XXI век» 22-24 мая. 2000. Санкт-Петербург. С.43-44.

39. Тузиков Ф В , Тузикова Н А , Рагино Ю И Малоугловое рент геновское рассеяние -новый метод в клинической биохимии (тезисы доклада). // Материалы Международного Симпозиума «Пумпан - перспективы применения при атеросклерозе». 14-15 июня 2000 Новосибирск. С.36.

40. Панин Л Е., Тузиков Ф В , Тузикова Н А, Харьковский А В , Усынин И Ф , Гимаутдинова О И Влияние комплекса тетрагидрокортизол - аполипопротеин A-I на взаимодействие РНК-полимсразы с эукариотической ДНК и на скорость биосинтеза белка в ге-патоцитах.//Биоорганическая химия 2001 Т.27. №2 С.114-119.

41. Ragino Yu., Tuzikov F., Filatova N, Tuzikova N and Nikitin Yu. The effect of ciprofi-brate therapy on lipoprotein subspecies profile in patients with hypercholesterolemia // Abstract book of First International Symposium on PPARs: From Basic Science to Clinical Applications. April 4-7. 2001 Florence. Italy P.49.

42. Tuzikov F.V , Tuzikova N.A., Galimov R V , Ragino Yu 1, Nikitin Yu P , Panin L E New diagnostic method of determination of subfractional composition serumal lipoproteins of a human blood by SAXS method's. // Digest reports of the IV ISTC Scientific advisory committee seminar on "Basic Science in ISTC activities". April 23-27. 2001. Novosibirsk. Russia P.115.

43 Ragino Yu., Kashtanova E, Berezovskaja E., Tuzikov F , Tuzikova N , Vocvoda M Heterogeneous composition of lipoprotein subfractions and oxidative capacity of low density lipoproteins in coronary artery disease patients with hyperlipidaemia. II Posters of 72 European Atherosclerosis Society Congress. May 20-23 2001. Glasgow UK. Atherosclerosis Supplements. 2001. V.2/2. P. 120.

44 Тузиков Ф В , Тузикова Н.А, Галимов Р.В , Никитин Ю.П , Панин Л Е., Рагино Ю.И. Новый диагностический метод анализа субфракционного и компонентного состава сывороточных липопротеинов крови человека. // Сборник тезисов научно-практической конференции «Инновации в охране здоровья людей» в рамках региональной отраслевой выставки «ЗдравЭкспо - Сибирь 2001». 22-23 ноября 2001 Новосибирск С 200-201

45. Тузиков Ф.В., Рагино Ю.И., Тузикова НА , Иванова М.В., Галимов Р.В., Никитин Ю П Определение фракционного и субфракционного составов липопротеинов крови методом малоуглового рентгеновского рассеяния (сравнение с биохимическим методом). // Вопросы медицинской химии. 2002 Т 48 № 1. С 84-93

46 Панин Л Е., Тузиков Ф.В , Тузикова Н.А., Гимаутдинова О И , Поляков Л М. Взаимодействие комплекса тетрагидрокортизол-аполинопротеин A-I с эукариотической ДНК о одноцепочечньгми олигонуклеотидами // Молекулярная биология 2002 Т36 № 1 С.96-102.

47 Панин JIЕ , Гимаутдинова О И , Ку ¡ненов П Л , Акимжанова М В , Тузиков Ф В Влияние комплекса тетрагидрокортизол - аполипопротеин Л-I на вторичную структуру эукариотичсской ДНК и сс взаимодействие с РНК-полимеразой //Биохимия 2002 Т67 № 7. С.953-958

48 Tu/.ikov F V , Tuzikova N А , Galimov R.V., Panin L.E., Nevinsky G A. General model to describe the structure and dynamic balance between different human serum lipoproteins and its practical application // Med Sci Monit. 2002 V 8(6) № 6 P 79-88

49 Невинский Г A , Осипова Л П , Коровкина Е С , Тузиков Ф.В., Тузикова НА, Гар-машова Н В , Бунева В Н. Оценка состояния биологическою здоровья популяции тундровых ненцев ямало нененцкого автономного округа по данным анализа аутоантшел и липопро геидов крови доноров // Радиационная биология Радиоэколо! ия 2002 Т 42 № 6. С 726-732.

50 Nevivsky G А , Osipova L Р , Benzo Е Е , Tu/ikov F.V, Tu/ikova N А, Garmashova N D , Buncva V N. Evaluation of health status in the population of tundra nency from northwestern Siberia from data on autoantibodies and lipoproteins in blood serum. // International Conference of Emergency Radiation Situations Russia Moscow. June 10-13. 2002. M . Изд-bo Российского университета дружбы народов Р.210-213

51. Тузиков Ф В, Тузикова II А., Галимов Р.В., Панин Л.Е. Способ препаративною выделения фракции липопротеинов высокой плотности из плазмы или сыворотки крови // Патен i РФ № 2211040. Ьюлл изобретений № 24 от 27 08 2003i.

52. Невинский Г А , Коровкина Е С , Тузиков Ф В , Тузикова Н.А , Галимов Р В., Полосухина Д И , Каненкова Л П , Бунева В Н. Новый метод анализа сывороточных липо-протеидов крови человека - новые возможности в диагностике дислипопротеинемий. // Наука - производству. 2003 № 3 (59) С 20-25.

53. Panin L.E., Tuzikov F.V, Gimautdinova О I. Tetrahydrocortisol-apolipoprotein A-I complex specifically interacts with eukaryotic DNA and GCC elements of genes // J. Steroid Biochem & Mol Biol. 2003. V.87. P.309-318

54. Козырева T.B , Ломакина С.В , Тузиков Ф.В , Тузикова Н А. Коррегирующее влияние медленного охлаждения на состав липопро i еидов крови у крыс с артериальной ги-пер!ензией // Бюлл экспериментальной биологии и медицины 2003. № 10. С 379-381

55 Garmashova N., Buneva V., Nevinsky G., Tuzikova N , Tuzikov F Fractional content of lipoproteins in the blood plasma of patients with tick-borne encephalitis. // International Conference "Targeting RNA Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interfer ence" June 18-21 2003 Novosibirsk. Russia P 92

56. Korovkina E , Tuzikov F , Tuzikova N , Osipova L , Buncva V , Nevinsky G Evaluation of biological health in population of the Tundra Nenets (Noth-Western Siberia) from the data on autoantibodies and lipoproteins of donor sera // International Conference "Targeting RNA. Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interference" June 18-21. 2003 Novosibirsk Russia. P.97.

57 Тузиков Ф.В , Тузикова H А , Галимов Р.В., Невинский Г.А , Панин Л Е. Определение субфракционного и компонентного состава сывороючных липопротеинов крови по данным малоу1лового рентгеновского рассеяния // IV Национальная конференция по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования ма!ериалов (РСНЭ-2003) Москва 17-22 ноября. 2003 (Тезисы докладов). С 306.

58 Kozyreva Т V , Lomakina S V , Tu/ikov F V , Tu/ikova N A Plasma lipoproteins under the effect of cold exposure in normotensive and hypertensive rats. // J of Thermal Biology. 2004. V.29. P.67-72.

59. Tuzikov F V , Tuzikova N A , Galimov R.V , Nevinsky G A , Panin L E Determination of component and subfractional composition of human serum lipoproteins using the method of

small-angle X-ray scattering // Поверхность Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 2004 № 10. С.84-91.

60 Garmashova N V , Tuzikov F V., Tuzikova N A , Tyshkevich О В., Doronin В M , Bun-eva V N., and Nevinsky G.A Characteristics of lipids imbalance in patients with tick-borne encephalitis.//Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2004 V23 № 6-7 P. 1003-1007

61. Korovkina fc S , Tuzikov F V , Tuzikova N A , Osipova L.P , Buneva V.N , and Nevinsky G.A. Strong changes in lipoproteins and autoantibodies of blood serum of the Tundra Nency population as a result of environmental radiation on the territory they inhabit // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 2004. V.23. № 6-7 P.1003-1007.

62 Panin L E, Kunitsyn V G., Tuzikov F.V. Effect of glucocorticoids and their complexes with apolipoprotein A-I on the secondary structure of eukaryotic DNA // Int J of Quant Chcm. 2005. V.101. № 4. P 450-467.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ОБО:

АИЗ - аутоиммунные заболевания, Ano - аполипопротеин; ГТГ - гипертриглицеринемия, ГХС - гиперхолестеринемия; ДГЭС - де1 идроэпиандроиерон, ДГЭСС - дегидроэпиандростеронсуль-фат;

ДЛП - дислипопротеинемия,

ЛП - липопротеияы;

ЛПВП - ЛП высокой плотности;

ЛПЛ - липопротеинлипаза,

ЛПНП - ЛП низкой плотности,

ЛПОНП - ЛП очень низкои плотности,

ЛС - ловастатин;

КК - коэффициент корреляции;

МУРР - малоугловое рентгеновское

рассеяние;

МТаза - ДНК-метилтрансфераза;

НЭХС - неэтирифицированный

холестерин;

ОЛП-общие ЛП,

ОМ - облепиховое масло;

ОТГ - общие триглицериды,

ОХС - общий (суммарный) холестерин;

Соискатель

ЯИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

РС - рассеянный склероз,

РСА - рентгеноструктурный анализ;

СКВ - системная красная волчанка;

СР - светорассеяние;

ТГ - триглицериды;

ТГК - тетрагидрокортизол;

ТРС - триптофашш-тРНК-синтетаза;

УЦ - ультрацентрифугирование;

ФКС - фракционно-компонентный

состав;

ФЛ - фосфолипиды,

ФЛС - флуоресцентная спектроскопия;

ФРС - фенилаланил-1РНК-синтетаза;

ФС - фракционный состав;

ХМ - хиломикроны;

ХС - холестерин;

ЭХС - ^тарифицированный холестерин; ЯНАО - Ямало-Ненецкий автономный округ;

к<1 - равновесная константа диссоциации комплекса;

Я - обозначение критериев оптимизации; % - коэффициент кооперативное™

Ф В. Тузиков

Отпечатано в ЗАО РИЦ «Прайс-курьер», т. 307-202, тираж 100 экз, заказ № 336 от 16.05.2005

P1161 3

РНБ Русский фонд

2006-4 8315

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Тузиков, Федор Васильевич

стр.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ОБОЗНАЧЕНИИ И СОКРАЩЕНИИ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Молекулярные взаимодействия и функционирование биологических наноструктур.

1.2. Механизмы равновесных взаимодействий больших молекул: стадийность, структура комплексов и термодинамика.

1.3. Специфические макромолекулярные взаимодействия в некоторых системах метаболизма белков.

1.4. Наноструктуры сывороточных липопротеинов крови, их фракционно-компонентный состав и участие в липидном метаболизме.

1.5. Параметры маркеров для оценки состояний липопротеинового обмена и типов его нарушений.

1.6. Методы анализа для исследования строения, дисперсного состава и механизмов взаимодействий биологических наноструктур.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Получение и характеристика белков, ферментов, ДНК, тРНК, синтетических полипептидов и олигонуклеотидов.

2.2. Препараты плазм и сывороток крови.

2.3. Получение фракций сывороточных липопротеинов крови.

2.4. Буферные растворы. Плотность растворителей.

2.5. Научные приборы и оборудование.

2.6. Методики измерений и обработка экспериментальных данных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

3.1. Равновесные взаимодействия макромолекул и комплексов в системах модификации ДНК, биосинтеза белка и экспрессии генов

3.1.1. Анализ равновесных макромолекулярных взаимодействий биофизическими методами.

3.1.2. Равновесные взаимодействия ДНК-метилтрансфераз с олигонуклео-тидами и лигандами.

3.1.3. Равновесные взаимодействия аминоацил-тРИК-синтетаз с тРНК

3.1.4. Влияние комплексов anoAI с глюкокортикоидами на вторичную структуру ДНК и на биосинтез белка в гепатоцитах.

3.1.5. Изучение структурных, равновесных и биологических свойств синтетических фрагментов инсулина.

3.2. Строение, субфракционный и компонентный состав сывороточных липопротеинов крови.

3.2.1. Новый подход к анализу сывороточных липопротеинов крови дифракционными методами.

3.2.2. Модель, описывающая равновесный состав и общее строение сывороточных липопротеинов крови человека.

3.2.3. Методики анализа субфракционного и компонентного состава липопротеинов в плазмах и сыворотках крови.

3.2.4. Фракционный и компонентный состав сывороточных липопротеинов ф, крови как набор маркеров для оценки состояния липидного обмена и его нарушений.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Равновесные взаимодействия макромолекул и комплексов в некоторых биологических молекулярных системах.

4.2. Строение, дисперсный и компонентный состав сывороточных липопротеинов крови человека и животных.

4.3. Развитие методов анализа биологических наноструктур.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ биологических наноструктур в системах метаболизма белков и липидов"

Актуальность проблемы. В последние десятилетия значительно возрос интерес к изучению частиц нанометрового (1 нм = 10 А) диапазона размеров с молекулярными массами более 1000 Да, участвующих во многих химических, каталитических и биологических процессах в живой и неживой природе. Связано это, во-первых, с открытием во второй половине XX века большего числа природных явлений, в которых такие наноструктуры играют ведущие роли, а, во-вторых, с разработкой новых информативных физико-химических методов исследований и расширением возможностей детального анализа наночастиц. В частности, благодаря выходу на наност-руктурный уровень исследований появилась молекулярная биология, а в наши дни зарождается молекулярная медицина [Марри Р. и соавт. 1993].

К биологическим наноструктурам относятся все простые и сложные белки, нуклеиновые кислоты и их разнообразные комплексы вплоть до вирусов. С участием макромолекул и комплексов происходят все важнейшие биохимические и молекулярно-биологические процессы в живых организмах. Поэтому особенности поведения всех без исключения биологических макромолекулярных систем необходимо рассматривать на основе взаимодействия их наноструктурных элементов. Подобные подходы могут быть чрезвычайно плодотворными при исследовании молекулярных систем нуклеинового обмена, таких, как система рестрикции - модификации и система каталитического ацилирования тРНК, участвующих в процессах экспрессии генов, транскрипции, репликации, репарации ДНК, а также биосинтеза и катаболизма белков. В этих процессах, происходящих с помощью ферментов ДНК-метилтрансфераз, рестриктаз, аминоацил-тРНК-синтетаз, важнейшим является определение структуры и стехиометрии каталитически компетентных фермент-субстратных комплексов, стадийности, термодинамических характеристик и наноструктурных изменений при их образовании. Поэтому развитие аналитических методов и изучение механизмов ферментативного катализа метилирования ДНК и аминоацилирования тРНК остаются одними из приоритетных направлений в биохимии и биофизике.

В частности, ранее было показано, что каталитически активной формой большинства рестриктаз является димер, а в случае ДНК-метилтрансфераз известно лишь, что эти ферменты имеют мономерную субъединичную структуру в свободном состоянии. Наличие симметрии в обеих цепях участка узнавания ДНК этими ферментами, очевидно, должно отражаться и на структуре ферментов [Modrich Р. 1982; Malygin E.G., Zino-viev V.V. 1989]. Но в первичных структурах таких ферментов, как мстил-трансферазы EcoDam, T2Dam и T4Dam, не было обнаружено достаточно длинных повторов [Kossykh V.G. et al. 1995]. Это указывает на необходимость поиска симметрии в структурах более высокого порядка, например, в комплексах ферментов с ДНК, образующихся при их взаимодействии в акте биокатализа. Аминоацил-тРНК-синтетазы отвечают за катализ процесса аминоацилирования специфических молекул тРНК [Малыгин Э.Г., Киселев JI.JI. 1984; Киселев JI.JI. и соавт. 1984; Meinnel Т. et al. 1995]. Несмотря на наличие большого количества работ, связанных с изучением механизмов взаимодействия этих ферментов с субстратами, к началу проведения данной работы остро недоставало прямой информации о структуре и характере взаимодействий, например, ферментов с тРНК на каждой из стадий. Так, в частности, для фенилаланил-тРНК-синтетазы и тРНКрЬе имелись противоречивые данные о структуре фермент-субстратных комплексов и о наличии конформационных изменений в макромолекуле фермента при взаимодействии с тРНКрЬе [Pilz I. et al. 1979; Holler E. et al. 1981; Dessen P. et at. 1983].

Известно, что с белковым метаболизмом в организме тесно сопряжен липидный обмен [Марри Р. и соавт. 1993]. Основной транспортной формой нерастворимых в водной среде липидов являются липопротеины (ЛП) крови, которые представляют собой очень гетерогенный класс белково-липидных наноструктур размером от альбумина до средних вирусов [Климов A.H. и соавт. 1999]. ЛП делятся на четыре основных фракции, каждая из которых, в свою очередь, состоит из 4-5 субфракций со своими индивидуальными функциями. При различных патологических состояниях (атеросклерозе, диабете, гепатите и др.) отмечены изменения в содержании и химическом составе различных классов ЛП крови [Gotto A.M. et al. 1986; Ли-повецкий Б.М. 2000]. Проблемы профилактики и лечения болезней, связанных с нарушениями липидного обмена, в последние десятилетия стали важнейшими [Липовецкий Б.М. 2000]. Осложнения атеросклероза и связанных с ним заболеваний (ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, инсульт головного мозга, тромбозы) являются сегодня наиболее частой причиной инвалидности и высокой смертности людей в зрелом возрасте.

Сегодня известно, что сывороточные ЛП крови являются транспортной формой не только липидов, но и витаминов, гормонов, различных ксенобиотиков [Марри Р. и соавт. 1993]. Не менее важными являются регуля-торные свойства ЛП крови. Так, например, в работах [Панин Л.Е. и соавт. 1986, 1987, 1992] выявлено комплексное участие ЛПВП и глюкокортикои-дов в активации экспрессии генов в клетках гепатоцитов. Но детальные спектры дисперсного и компонентного состава сывороточных ЛП и характер их изменений остаются практически не исследованными как в норме, так и при дислипопротеинемиях (ДЛП) [Климов А.Н. и соавт. 1999]. Поэтому необходимо дальнейшее углубленное комплексное изучение состава, структуры и функций ЛП крови, а также их роли в развитии патологических состояний.

В настоящее время для анализа ЛП крови и диагностики нарушений липидного обмена применяют целый ряд аналитических методов, но стандартным клиническим набором анализов до сих пор остается определение общих (суммарных) ТГ, общего ХС и ХС-ЛПВП [Mills G.L. et al. 1984; Камышников B.C. 2003]. В большинстве случаев эти методы не дают прямой и детальной информации о фракционном составе ЛП крови и при этом или требуют большого количества крови для анализа, или очень трудоемки, или длительны. Поэтому очевидно, что для целей диагностики и профилактики заболеваний людей, а также для определения эффектов лечения имеется острая потребность в точных и экспрессных методах определения полного субфракционного и компонентного состава сывороточных ЛП крови - специфических маркеров состояния липидного обмена в организме. Их дефицит сильно затрудняет диагностику сердечно-сосудистых и многих других заболеваний, а также контроль за эффективностью коррегирующей терапии.

Одним из эффективных методов для получения прямой структурной и дисперсной информации о биологических наноструктурах является дифракционный метод - малоугловое рентгеновское рассеяние (МУРР), который уступает РСА в разрешении, но позволяет исследовать макромолекулы и комплексы непосредственно в растворе [Свергун Д.И., Фейгин JI.A. 1986]. Перспективным оказалось использование этого метода для изучения биологических макромолекул не только в монодисперсных состояниях, но и в условиях термодинамического равновесия с их комплексами. Однако до начала данной работы опыт применения метода МУРР для анализа полидисперсных и равновесных молекулярных систем ограничивался единичными случаями [Dessen P. et al. 1985, 1990; Baumstark M.W. 1990]. Отсутствие решений ряда теоретических и методических задач не позволяло использовать этот высокоинформативный метод для анализа механизмов многостадийных макромолекулярных взаимодействий и таких сложных, гетерогенных по составу и строению наноструктур, как сывороточные ЛП крови. Поэтому дальнейшее развитие методических подходов и методик анализа биологических наноструктур актуально не только для научных, но и практических целей, например, для клинической медицины и биотехнологии.

Цель работы - комплексный анализ строения, дисперсного состава и ** роли наноструктурных изменений в механизме равновесных взаимодействий биологических макромолекул некоторых систем модификации ДНК, активации экспрессии генов, метаболизма белков и липидов по данным дифракционных методов.

Задачи исследования:

1). Развить теоретические и методические подходы для структурно-^ дисперсного и равновесного анализа биологических макромолекул и их комплексов дифракционными методами.

2). Изучить молекулярные механизмы равновесных взаимодействий некоторых важнейших ферментов биосинтеза белка (ДНК-метилтрансфераз и аминоацил-тРНК-синтетаз) с синтетическими и природными субстратами.

3). Исследовать равновесные взаимодействия белка anoAI с глюко-^ кортикоидами и их комплексов, как ключевых элементов в молекулярном механизме активации экспрессии генов, с эукариотической ДНК, с олиго-нуклеотидами и ДНК-зависимой РНК-полимеразой.

4). Разработать формальную математическую модель, описывающую компонентный состав и строение сывороточных липопротеинов крови всех классов и их промежуточных форм.

5). Используя модель строения ЛП, разработать новую методику определения субфракционного и компонентного состава общих и модифици

4Ё; рованных липопротеинов в плазме или сыворотке крови по данным дифракционных методов и оценить ее эффективность в условиях клиники и эксперимента.

6). Развить аппаратные методики измерений дифрактограмм и усовершенствовать научную аппаратуру (новые конструкции блоков рентгеновских малоугловых дифрактометров).

Научная новизна работы. Разработан теоретический и методиче-♦ ский подход к исследованию равновесных взаимодействий макромолекул дифракционными методами, который впервые был применен для изучения механизмов комплексообразования макромолекул, происходящих в несколько равновесных стадий с образованием промежуточных комплексов.

Показано, что равновесное взаимодействие фермента (Е) ДНК-метилтрансферазы (МТазы) EcoDam (из E.coli) со специфическими олиго-нуютеотидами (S) происходит в две стадии с образованием комплексов ES и E2S, а ферментов МТаз T2Dam и T4Dam (из Т-четных бактериофагов) - в три стадии с образованием комплексов Е2, ES и E2S. При этом присоединение второй молекулы фермента к комплексу ES у МТаз происходит с высокой положительной кооперативностью (% > 10), что, по-видимому, и обеспечивает кооперативное взаимодействие субъединиц фермента с ДНК в каталитическом акте метилирования остатков аденина.

Установлено, что равновесное взаимодействие фенилаланил-ТРНК-синтетазы (Е) (из E.coli) со специфической тРНКрЬе (S) происходит в две стадии с образованием комплексов ES и ES2. Присоединение второй молекулы субстрата (S) к комплексу ES происходит антикооперативно, а в процессе комплексообразования ФРС с тРНКрЬе конформация фермента изменяется: уменьшается асимметрия в комплексе ES и восстанавливается в комплексе ES2. Установлено, что в условиях in vitro эукариотическая трип-тофанил-тРНК-синтетаза представляет собой полидисперсную олигомер-ную систему, состояние которой зависит от температуры и времени инкубации. Выдвинуто предположение, что олигомеризация ТРС может быть частью молекулярного механизма формирования субклеточных секреторных гранул при регуляции биосинтеза белков в эукариотических клетках.

Показано, что при равновесных взаимодействиях белка anoAI с глю-кокортикоидами (ТГК, ДГЭСС, ДГЭС) образуются специфические комплексы со стехиометрией 1:1 или 1:2, которые при взаимодействии с натив-ной эукариотической ДНК (М = 26 ООО кДа) связываются с ней (стехиометрия ~ 6:1) и образуют однонитевые участки. Специфическое связывание комплексов anoAI-ТГК с короткими димерными олигонуклеотидами (стехиометрия 1:1), имеющими структуру CC(GCC)s в одной цепи, приводит к равновесному распаду дуплексов на мономеры и свидетельствует о соответствии или близости сайтов связывания этих комплексов в цельной ДНК структурам типа (GCС)п.

Разработана единая математическая модель, описывающая состав, строение всех сывороточных ЛП крови человека и хорошо соответствующая литературным данным о ЛП. На основе модели строения ЛП разработана высокоинформативная методика определения фракционного и компонентного состава общих и модифицированных ЛП в плазме и сыворотке крови по данным МУРР. Впервые получены результаты детального фено-типирования липопротеинемий в норме и при некоторых заболеваниях. Средний уровень степени модификации ЛП у здоровых людей составил 41 %, у больных РА - 59 %, у больных БА - 56 %. Наименее подвержена модификации оказалась подфракция ЛПВПз (22 -г 36 %) а наиболее — под-фракция ЛППП (62 -f 82 %). Получены оценки эффектов лечений линид-корректирующими препаратами у пациентов с ГХС. Исследование состояния здоровья в популяции жителей одного из экологически неблагополучных регионов России (ЯНАО), показало, что нормолипопротеинемии соответствуют плазмы и сыворотки крови только 10 %, а у 90 % выборки жителей ЯНАО имеется тот или иной тип ДЛП.

Впервые показано, что наноструктуры ЛПВП обладают термоустойчивостью и способны выдерживать, не денатурируя, кратковременное (до 10 минут) повышение температуры до 95°С.

Разработаны новые конструкционные схемы блоков малоуглового рентгеновского дифрактометра и аппаратные методики введения концентрационных поправок в малоугловые дифрактограммы.

Теоретическая и практическая значимость работы. Комплексное определение параметров структуры, олигомерного состава, стадийности, стехиометрии образующихся комплексов и наноструктурных изменений при взаимодействий ДНК-метилтрансфераз (EcoDam, T2Dam, T4Dam) и аминоацил-тРНК-синтетаз (ФРС, ТРС) с их субстратами и лигандами расширяет имеющиеся представления о молекулярных механизмах модификации ДНК, биосинтеза белка и позволяет разрабатывать новые подходы к регуляции белкового метаболизма в целом.

Установление фактов, что взаимодействие комплексов anoAI-глюкокортикоид с нативной эукариотической ДНК приводит к разрыву водородных связей между комплементарными парами азотистых оснований и образованию однонитевых участков в структуре ДНК, а также, что связывание комплексов ТГК-anoAI происходит с участками цепи ДНК, имеющими структуру типа (GCC)n, существенно расширяет знание об открытом недавно молекулярном механизме активации экспрессии генов, ключевую роль в котором играет anoAI и его комплексы с восстановленными формами глюкокортикоидов.

Разработанная формальная математическая модель, описывающая состав, строение сывороточных ЛП крови человека представляет практическую и теоретическую значимость. Она является описанием того факта, что между компонентами сывороточных ЛП крови всех классов поддерживается устойчивое термодинамическое равновесное состояние, смещенное в сторону образования ЛП комплексов, которое и стабилизирует их структуры. Модель строения ЛП крови была практически использована при разработке высокоинформативной методики, позволяющей из данных МУРР определять полный фракционный и компонентный состав общих и модифицированных ЛП в плазме и сыворотке крови. Применение новой методики анализа ЛП в условиях клиники и эксперимента показало, что она может эффективно использоваться для проведения клинических испытаний лекарственных препаратов, а результаты детального фенотипирования ряда лииопротеинемий могут быть полезны в целях уточнения диагностики заболеваний и изучения их механизмов на молекулярном уровне.

В экспериментах на лабораторных животных показано, что факторы холодового воздействия могут найти применение в клинической медицине при разработке способов коррекции нарушений ЛП спектра в сторону нормализации у больных с артериальной гипертензией. Обнаруженные термоустойчивые свойства ЛПВП позволили предложить эффективный способ препаративного выделения этой фракции из плазм или сывороток крови [Патент РФ № 2211040. Бюлл. изобретений № 24 от 27.08.2003г].

Развитие теории и разработка новой аппаратной методики введения концентрационных поправок позволяет корректно устранять концентрационные искажения в малоугловых дифрактограммах при минимуме затрат на измерения. Показано, что высокоинформативный и многофункциональный аналитический метод МУРР может использоваться не только в научных, но и в технологических целях, например, в клинической медицине. Новые конструкции блоков малогабаритного дифрактометра и прибора в целом позволят повысить аналитические возможности приборов этого класса и уменьшить их габариты, массу и стоимость. В конструкции используются оригинальные технические решения и современные подходы к измерению и анализу экспериментальных данных на основе эффективного программного обеспечения и возможностей персональных ЭВМ.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Развитые методики анализа дифракционных данных позволяют эффективно исследовать строение, дисперсный состав и наноструктурные изменения в механизме равновесных многостадийных взаимодействий биологических макромолекул и комплексов.

2. Равновесное взаимодействие фермента (Е) ДНК-метилтрансферазы (МТазы) EcoDam (из Е. coli) с олигонуклеотидами (S) происходит в две стадии с образованием комплексов ES и E2S, МТаз T2Dam и T4Dam (из Тчетных бактериофагов) - в три стадии с образованием комплексов Е2, ES и E2S, а фенилаланил-тРНК-синтетазы (Е) (из Е. coli) со специфической тРНКрЬс (S) происходит в две стадии с образованием комплексов ES и ES2.

3. Взаимодействие комплексов апоА1-глюкокортикоид (ТГК и др.) с нативной эукариотической ДНК (М ~ 26 ООО кДа) приводит к разрыву водородных связей между комплементарными парами азотистых оснований и образованию однонитевых участков в структуре ДНК, способных к связыванию с ДНК-зависимой РНК-нолимеразой. Специфическое связывание комплексов anoAI-ТГК с короткими олигонуклеотидными димерами, имеющими структуру CC(GCC)s, приводит к равновесному распаду дуплексов на мономеры.

4. Разработанная формальная математическая модель, описывающая состав и строение сывороточных ЛП крови человека, хорошо соответствует литературным данным о структуре и компонентном составе ЛП и позволяет определять компонентный состав всех субфракций ЛП.

5. Разработанная на основе модели строения ЛП новая методика анализа ЛП по данным МУРР информативна и позволяет определять полный субфракционный и компонентный состав общих и модифицированных ЛП в плазме или сыворотке крови в условиях клиники и эксперимента.

Апробация результатов работы. Основные положения и материалы диссертации были представлены и доложены на следующих научных конференциях и симпозиумах: на Всесоюзном рабочем совещании «Применение детекторов рентгеновского излучения в исследовании структуры биополимеров» (Пущино, 1985); на Международном семинаре «Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и нейтронов» (Пущино, 1985); на VI Всесоюзном симпозиуме по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1985); на V Всесоюзном симпозиуме «Структура биологических макромолекул» (Звенигород, 1987); на IV Всесоюзной конференции «Биосинтез ферментов микроорганизмами» (Ташкент, 1988); на Всесоюзном симпозиуме «Ферменты рестрикции-модификации ДНК: от генов до белков» (Вильнюс, 1989); на Международном симпозиуме «Molecular organization of biological structures» (Москва, 1989); на Международной конференции «Restriction Endonucleases and Modification» (Vermont, USA, 1993); на Международном симпозиуме «French-Russian Symposium on Regulation of Gene Expression» (Новосибирск, 1995); на Международной конференции «Annual Meeting of the American Cristallographic Association» (St. Louis. USA, 1997); на Международной конференции «71 European Atherosclerosis Society» (Coustasy, Greece, 1999); на IV Международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище: XXI век» (Санкт-Петербург, 2000); на Международном Симпозиуме «Пумпан - перспективы применения при атеросклерозе» (Новосибирск, 2000); на VI Конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Новосибирск, 2000); на «First International Symposium on PPARs: From Basic Science to Clinical Applications» (Florence, Italy, 2001); на IV Международном семинаре фонда МНТЦ «Basic Science in ISTC activities» (Новосибирск, 2001); на «72 European Atherosclerosis Society Congress» (Glasgow, UK, 2001); на Научно-практической конференции «Инновации в охране здоровья людей» в рамках региональной отраслевой выставки «ЗдравЭкспо - Сибирь 2001» (Новосибирск, 2001); на «International Conference of Emergency Radiation Situations» (Москва, 2002); на Международной конференции «Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interference» (Новосибирск, 2003); на IV Национальной конференции «Применение рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (РСНЭ-2003)» (Москва, 2003); на Международной конференции «Chemical & Biological Problems of Proteomics (CBPP-2004)» (Новосибирск, 2004); на XV Международной конференции по использованию синхротронного излучения. (СИ-2004) (Новосибирск, 2004).

Кроме того, материалы работы в период с 1982 по 2005 г обсуждались ^ на отчетных сессиях и на межлабораторных семинарах: Института молекулярной биологии ГНЦ ВБ «Вектор» МЗ РФ (Кольцово, НСО); Института биохимии СО РАМН (Новосибирск); Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино); Института белка РАН (Пущино); Института кристаллографии РАН (Москва); Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино); Института биофизики СО РАН Ф (Красноярск); University of Rochester (Rochester, NY, USA); Института патологии кровообращения МЗ РФ (Новосибирск); Института терапии СО РАМН (Новосибирск); Института общей патологии и клинической медицины СО РАМН (Новосибирск); Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск); Института физиологии СО РАМН (Новосибирск); Института клинической иммунологии СО РАМН (Новосибирск) и др.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 62 научных работы, в том числе 32 статьи, 6 патентов РФ и 24 тезисов докладов на конференциях и симпозиумах.

Диссертация выполнена в соответствии с планами тем научно-исследовательских работ Института молекулярной биологии ГНЦ ВБ "Вектор" и Института биохимии СО РАМН, а также по проектам Международного научного фонда "International Human Frontier Science Program Organization" (HFSPO - 1994), Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ №95-04-12671-а; №00-04-49261; №01-04-49759; №01-0449761; №04-04-48926-а) и федеральной целевой научно-технической программы "Атеросклероз" (№ 01.97.000 5916). ы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Тузиков, Федор Васильевич

ВЫВОДЫ

1. Развиты теоретические и методические подходы, расширяющие возможности дифракционных методов при анализе биологических наноструктур в статическом состоянии и при равновесных многостадийных взаимодействиях макромолекул и комплексов в бинарных смесях.

2. Равновесное взаимодействие ДНК-метилтрансфераз (Е) EcoDam (из Е. coli), T2Dam и T4Dam (из Т-четных бактериофагов) со специфическими олигонуклеотидами (S) происходит в две основные функционально значимые стадии с образованием комплексов ES и E2S. Присоединение вторых молекул фермента к комплексу ES у метилаз происходит с высокой положительной кооперативностью (х > 10), что и обеспечивает кооперативное взаимодействие субъединиц фермента с ДНК в каталитическом акте метилирования остатков аденина.

3. Равновесное взаимодействие фенилаланил-ТРНК-синтетазы. (Е) (из Е. coli MRE-600) со специфической тРНКрЬе (S) происходит в две стадии с образованием комплексов ES и ES2. В результате того, что при образовании комплекса ES изменяется конформация фермента, присоединение второй молекулы тРНКрЬе к комплексу ES происходит антикооперативно (% = 0,1).

4. Триптофанил-тРНК-синтетаза (ТРС) (из поджелудочной железы быка) в условиях in vitro представляют собой полидисперсную олигомерную систему, зависящую от температуры и времени инкубации. Олигомеризация ТРС может быть частью молекулярного механизма формирования субклеточных секреторных гранул при регуляции биосинтеза белков в эукариоти-ческих клетках.

5. При равновесных взаимодействиях белка anoAI с глюкокортикои-дами образуются специфические комплексы со стехиометрией 1:1, связывание которых с нативной эукариотической ДНК (М ~ 26 ООО кДа) приводит к образованию однонитевых участков в ее вторичной структуре. Специфическос связывание комплексов anoAI-ТГК с короткими олигонуклсотидными димерами, имеющими структуру CC(GCC)5, приводит к равновесному распаду дуплексов на мономеры и свидетельствует о соответствии или близости сайтов связывания комплексов в цельной ДНК структурам типа (GCC)n.

6. Разработана формальная математическая модель, описывающая состав и строение сывороточных липопротеинов (ЛП) крови человека и позволяющая определять полный компонентный состав любой их субфракции. На основе модели строения ЛП разработана эффективная методика определения фракционного и компонентного состава (ФКС) общих и модифицированных ЛП в плазме или сыворотке крови по данным метода МУРР.

7. Проведено фенотипирование липопротеинемий в норме и при некоторых заболеваниях с использованием в качестве маркеров ФКС ЛП; Корреляционный анализ фенотипов (КА, РС, СКВ, КЭ, СД-1, СД-Н; РА, БА, нормолипопротеинемия) показал, что к группе АИЗ (РС, СКВ, РА, БА) формально близок СД-1. У пациентов с нормолипемией средний уровень модифицированных ЛП составил 41 %, у больных РА - 59 %, у больных БА - 56 %. Наименее подвержена модификации подфракция ЛПВП3 (22 -f 36 %), а наиболее - подфракция ЛППП (62 -г 82 %). в). После 6 -г 18 недель приема липидкорректирующих препаратов у всех пациентов с ГХС отмечены изменения значений параметров ФКС ЛП в сторону нормализации.

8. Исследование состояния здоровья в популяции жителей региона ЯНАО, показало, что нормолипопротеинемии соответствуют сыворотки крови только около 10 % жителей, а для 90 % выборки жителей ЯНАО характерен тот или иной тип ДЛП. При этом к больным типа КА относятся четверть жителей, к больным аутоиммунного типа - около 50 %, а у трети жителей по данным ФКС ЛП имеются другие типы заболеваний.

9. У крыс с наследственной стрессиндуцированной гипертензией при медленном охлаждении происходит повышение (в 2 раза) содержания под-фракции ЛПВП2 и снижение (в 2,5 раза) фракции ЛПНП, что нормализует

ФКС ЛП, индекс атерогенности и указывает на принципиальную возможность коррекции нарушений ЛП спектра с использованием температурных воздействий. Наноструктуры ЛПВП обладают свойствами выдерживать без денатурации кратковременное повышение температуры до 95°С. Термоустойчивые свойства ЛП можно использовать для препаративного выделения фракции ЛПВП из плазм или сывороток крови. Однако при длительном хранении препаратов ЛП без специальных защитных добавок в ЛПВП происходят изменения по агрегационному механизму с нарушениями упорядоченности во внутренней структуре.

10. Разработаны новые аппаратные методики измерений и эффективные конструкционные схемы блоков малоуглового рентгеновского дифракто-метра и прибора в целом, что позволяет повысить аналитические возможности приборов этого класса и резко уменьшить их габариты, массу ш стоимость. Конструкции основаны на использовании новых технических решений, материалов и технологий.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Тузиков, Федор Васильевич, Новосибирск

1. Анкилова В.Н., Лаврик О.И., Ходырева С.Н. Очистка и некоторые свойства фенилапанил-тРНК-синтетазы из E.coli MRE-600. // Прикладная биохимия и микробиология. 1984. - Т.ХХ. № 2. - С.208-216.

2. Аронов Д.М. Лечение и профилактика атеросклероза. // Москва: Триада -X.-2000.-413с.

3. Балаболкин М.И. Особенности лечения инсулиннезависимого сахарного диабета. // Терапевтический архив. 1996. № 10. - С.5-11.

4. Бекренев А.Н., Терминасов Ю.С. Рассеяние рентгеновских лучей под малыми углами. Основы теории и эксперимента. Куйбышев: КптИ. -1979. 246с.

5. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. М.: Высшая школа. 1977. - 280 с.

6. Благосклонная Я.В., Алмазов В.А., Красильникова Е.И. Общность патогенетических механизмов ишемической болезни сердца и инсулино-независимого сахарного диабета, профилактика, лечение. // Кардиология. 1996. № 5. - С.35-39.

7. Бобкова Е.В., Вольфсон А.Д., Анкилова В.Н., Лаврик О.И. Разделение и сравнительная характеристика субъединиц фенилаланил-тРНК-синте-таз из E.coli MRE-600 и Thermus thermophilus. И Биохимия. 1990. -Т.55. № 3. - С.525-533.

8. Богданов А.А., Леднева Р.К. Нуклеиново-белковое узнавание. М.: Изд-во ВИНИТИ АН СССР (Итоги науки и техники. Сер. мол. биология). -1975.-Т.5.- 153с.

9. Борисова О.Ф., Суровая А.Н. М.: Изд-во ВИНИТИ АН СССР (Итоги науки и техники. Сер. мол. биология). 1973. - Т.1. - С.141-196.

10. Бурьянов Я.И., Захарченко В.Н., Баев А.А. Выделение, очистка и некоторые свойства аденил-ДНК-метилазы Ecodam. // Докл. АН СССР. -1981. Т.259. - С.1492-1495.

11. Бурьянов Я.И., Кирьянов Г.И. Структурно-функциональные основы эн-зиматического метилирования ДНК. М.: Изд-во ВИНИТИ АН СССР (Итоги науки и техники. Сер. мол. биология). 1987. - Т.23. - 220с.

12. Гилл Ф., Мюррей У., Райт М. Практическая оптимизация. М.: Мир, 1985. 509 с.

13. Глушанок Ю.Б., Гущин В.А., Комяк Н.И., Лютцау В.Г., Ефанов В.П. Устройство для исследования объектов с помощью рентгеновского излучения. А.С. № 1278692. Бюлл. изобретений № 47 от 23.12.86г.

14. Горшкова И.И., Лаврик О.И. Взаимодействие тРНК-узнающих -участков в фенилаланил-тРНК-синтетазе из E.coli MRE-600 // Молек. биология. 1982. - Т. 16. - С.984-990.

15. Грацианский Н.А. Все больше данных указывает на то, что практически каждый больной коронарной болезнью сердца должен получать гинолшшдсмичсскос средство. // Клиническая фармакология и тсраиия. -1996. № 3. С.30-34.

16. Грацианский Н.Л. Гинолипидемические средства. // Кардиология. -1994. № 3. С.49-69.

17. Гришин В.К. Статистические методы анализа и планирования экспериментов. М.: Изд-во МГУ. 1975. - 128с.

18. Гусев Е.И., Бойко А.Н. Рассеянный склероз: от изучения иммунопато-генеза к новым методам лечения. 2001. М.: Губернская медицина. -128с.

19. Дембо А.Т. Рентгенографическое исследование строения некоторых бактериальных вирусов (Т2, ДД2, РВ2, ДД7): Дис. канд. биол. наук: 03.00.03. Защищена 22.03.77. Киев. 1976. - 137с.

20. Демченко А.П. Ультрафиолетовая спектроскопия и структура белков. -Киев: Наукова думка. 1981. - 208с.

21. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир. 1982. Т.1. - 389с.

22. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир. 1982. Т.2. - 816с.

23. Жулина Н.И., Оксютович В.М., Андриянова Е.В. Коррекция нарушений липидного обмена. 2004. Нижний Новгород: Изд. НГМА. - 28с.

24. Зайцев С.В., Курочкин И.Н., Варфоломеев С.,Д. Разностный метод анализа комплексообразования лигандов с центрами связывания. Выявление супервысокоаффинных центров связывания опиатных лигандов. // Докл. АН СССР. 1985. - Т.281. № 3. - С.727-731.

25. Зайцев С.В., Курочкин И.Н., Варфоломеев С.Д. Дискриминация моделей и оценка параметров лиганд-рецепторных взаимодействий. // Современные проблемы биокинетики. М.: Изд-во МГУ. 1987. - С. 198255.

26. Зенков Н.К., Меньшикова Е.Б., Шергин С.М. Окислительный стресс: диагностика, терапия, профилактика. // Новосибирск. 1993. - С. 181200.

27. Зиновьев В.В., Горбунов Ю.А., Попов С.Г., Малыгин Э.Г., Бурьянов Я. И., Нестеренко В. Ф. Взаимодействие метилазы Ecodam с отдельными сайтами последовательностей и синтетическими олигонуклеотидами // Молек. биология. 1985. - Т. 19. - С.847-854.

28. Зиновьев В.В., Овечкина Л.Г., Малыгин Э.Г. Стехиометрия связывания Оат-ДНК-Ы6-аденин.-метилтрансферазы фага Т4 с олигонуклеотид-ными субстратами // Молекул, биология. 1996. - Т.30. №. 5. - С.1203-1208.

29. Змушко Е.И., Белозеров Е.С., Митин Ю.А. Клиническая иммунология. 2001. СПб.: Питер. - 576с.

30. Иверонова В.И., Ревкевич Г.П. Теория рассеяния рентгеновских лучей. М.: Изд-во Моск. Ун-та. 1978. - 278с.

31. Иерусалимский А.П. Клещевой энцефалит. Руководство для врачей. -2001. Новосибирск: Наука. 359с.32.