Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболизм липидов ядер и хроматиеа клеток печени и тимуса крыс в норме и при гамма-облучении

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Метаболизм липидов ядер и хроматиеа клеток печени и тимуса крыс в норме и при гамма-облучении"

од

Л ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 576.312.31.:577.391.

КУЛАГИНА ТАТЬЯНА ПЕТРОВНА

МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ ЯДЕР И ХРОМАТИНА КЛЕТОК ПЕЧЕНИ И ТИМУСА КРЫС В НОРМЕ И ПРИ т-ОБЛУЧЕНИИ

03.00.01. - радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук И.К. Коломийцева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор A.B. Алесенко

доктор биологических наук, профессор E.H. Гончаренко

Ведущая организация:

Институт теоретической и эксперинентальной биофизики РАН

Защита состоится "

1995 г. в часов на

заседании диссертационного совета Л.053.05.74. при Московской государственной университете ин. М.В. Ломоносова (г. Москва, 119899, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет)

Автореферат разослан 995 г .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

О.Р. КОЛЬС

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

X.АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Липиды являются нормальными минорными компонентами немембранных ядерных структур - хроматина и ядерного матрикса. Показано влияние липидов на стабильность двойной спирали ДНК (Manzoli et al. 1974, Шенгелия и др. 1984), участие липидов в контроле активности РНК- и ДНК-полимераз (Алесенко и др. 1983, 1993), изменение липидов ядра и хроматина в клеточном цикле (Алесенко, Бурлакова 1976, Алесенко, Пантаз 1983), при опухолевой трансформации (Manzoli et al. 1977) и опухолевом росте (Пальмина, Мальцева 1982), клеточном росте и дифференцировке (Manzoli et al. 1989), при старении организма (Бабенко 1989.).

Ионизирующая радиация вызывает глубокие нарушения клеточного метаболизма (Кузин A.M. 1986, Гончаренко, Кудряшов 1980). Показаны изменения липидов ядер и ядерных мембран при действии ионизирующей радиации (Мальцева и др. 1984, Моисеева и др.1984). Изучены радиационные изменения липидов надмолекулярных комплексов ДНК (Стручков, Стражевская 1993). Однако, к моменту начала наших исследований в литературе отсутствовали сведения о влиянии ионизирующей радиации на липиды хроматина клеток млекопитающих.

Изучение влияния ионизирующей радиации на липиды ядер и хроматина представляет интерес не только в связи с их ролью в лучевом поражении, но и для понимания роли липидов в функционировании генетического аппарата клетки в норме.

П.ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы является изучение пострадиационных изменений метаболизма липидов ядер и хроматина различных по радиочувствительности органов - печени и тимуса крыс. По нашему мнению, одним из наиболее информативных подходов для изучения влияния радиации на липиды ядер и хроматина является использование радиоактивных предшественников синтеза липидов и исследование распределения меченых липидов в ядре в ответ на лучевое воздействие. Однако, внутриядерное распределение липидов, меченых по 2-14с-ацетату в норме, мало изучено. В связи с вышеизложенным в работе были поставлены следующие задачи:

1.Исследование включения меченого 2-14С-ацетата в липиды микросом, ядер и хроматина печени, а также в липиды ядер и хроматина тимуса крыс.

2.Сравнение включения 2-14с-ацетата в липиды ядер, хроматина

и ядерной мембраны тимоцитов при инкубации клеток in vitro.

3.Изучение влияния острого э—облучения крыс в дозе 10 Гр на

14

количество липидов и включение 2- С-ацетата в липиды хроматина печени и тимуса крыс в условиях in vivo.

4.Изучение влияния острого э—облучения крыс на количество

14

липидов и включение 2- С-ацетата в липиды клеток, ядер и хроматина при инкубации тимоцитов in vitro.

5.Исследование влияния фракционированного у-облучения крыс в дозе 6 Гр (2 Гр х 3 с недельным интервалом) на количество липидов в гомогенате и ядрах тимуса в ранние и отдаленные сроки после облучения.

III.НАУЧНАЯ НОВИЗНА" РАБОТЫ. Впервые показана высокая метаболическая активность липидов хроматина печени и тимуса крыс, поскольку липиды хроматина имеют более высокую удельную радиоактивность по сравнению с липидами ядер.

14

Исследование распределения меченых по 2- С-ацетату липидов между хроматином и ядерной мембраной показало, что удельная радиоактивность липидов хроматина значительно выше удельной радиоактивности липидов ядерной мембраны. Это свидетельствует о различии пулов липидов хроматина и ядерной мембраны.

Впервые показано участие липидов хроматина радиорезистентной печени и радиочувствительного тимуса в ответных реакциях животного организма на острое летальное облучение. Облучение животных в дозе 10 Гр вызывает перераспределение меченых липидов в ядре. Это выражается в изменении соотношения удельных радиоактивностей липидов хроматина и целых ядер.

Обнаружены изменения количества кардиолипина хроматина печени и тимуса через 10 минут после облучения животных в дозе 10 Гр, коррелирующие с возрастанием функциональной активности ядер. Выявлено разнонаправленное изменение количества фосфатидилхолина в хроматине радиорезистентной печени и радиочувствительного тимуса через 40 минут после облучения крыс.

Сокращения: ФЛ - фосфолипиды, 0ФЛ - общая фракция липидов, ОФФЛ -общая фракция фосфолипидов, СФМ - сфингомиелин, ФХ фосфатидилхолин, ФЭА - фосфатидилэтаноламин, фС фосфатидилсерин, 1СЛ - кардиолипин, СЖК - свободные жирные кислоты.

Показано изменение количества липидов в ядрах тииуса при облучении животных в сублетальных дозах. При фракционированном облучении крыс в дозе 6 Гр (2 Гр х 3 с недельным интервалом) через 1 час после последнего облучения происходит резкое возрастание количества свободных жирных кислот и уменьшение количества фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина в ядрах тикуса при отсутствии достоверных изменений этих липидов на уровне гомогената. В отдаленные сроки после облучения показано увеличение концентрации свободных жирных кислот в гомогенате тимуса при отсутствии изменений их концентрации в ядрах.

IV.ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Результаты исследования имеют важное теоретическое и практическое значение для понимания роли липидов в функционировании генетического аппарата клетки в норме и при облучении животного организма, а также для направленного поиска радиопротекторов.

V. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были доложены, на симпозиумах "Структура и функции клеточного ядра" (Черноголовка 1987, Гродно 1990, Санкт-Петербург 1993), на I Радиобиологическом съезде (Москва 1989), на конференциях и семинарах ИБК РАН.

VI.ПУБЛИКАЦИИ.По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

VII. СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 'fÄj страницах, содержит 7 рисунков и 25 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы крысы-самцы линии Вистар массой

150-180 г. Для исследования отдаленных эффектов

фракционированного облучения использованы крысы-самцы с исходной

массой 70-80 г. Животных облучали на установке ГУПОС у-лучами 137

Cs в дозе 10 Гр и 6 Гр фракционированно (2 Гр х 3 с недельным

интервалом) при мощности дозы 2,52 Гр/мин. Тимоциты в g

концентрации 10 кл/мл инкубировали в фосфатном буфере Кребса -

Рингера, 20mM HEPES, pH 7,4. Радиоактивный предшественник синтеза 14

липидов 2- c-ацегат вводили животным внугрибрюшинно сразу после облучения в дозе 4 МБк на 200 г массы тела или 0,44 МБк на 1 мл

3

суспензии тимоцитов. 6- Н-урацил добавляли в концентрации 0,6 МБк

на 1 мл суспензии. Ядра из ткани печени получали по методу Шово (Chauveau et al. 1957), из ткани и клеток тимуса по методу Олфри (Alfrey et al. 1957). Хроматин из очищенных ядер получали по методу Уманского (Umatisky et al. 1975) . Кккросоны из печени выделяли по методу Покровского, Арчакова (1968). Препараты ядерных мембран тикоцнтов получал* в процессе выделения хроматина из ядер. Начиная с процедуры лизирования ядер в растворе 0,075М NaCl, 0,024М ЭДТА, 0,01М трис-HCl, pH 7,5 и до получения препаратов "чистого" хроматина собирали супернатанты, содержащие фрагменты ядерных мембран. Объединенный супернатант центрифугировали при 12500хд 20 мин для осаждения фрагментов хроматина, затек вновь центрифугировали при 85000хд 45 мин. В осадке получали неочищенную фракцию ядерных мембран. Контроль чистоты хроматина и наличие ядерных мембран в выделенных нами препаратах осуществляли методом электронной микроскопии. Липиды экстрагировали по методу Фолча (Folch et al. 1957). Разделение липидов проводили методом тонкослойной хроматографии на силикаге-ле в смеси растворителей: хлороформ-метанол-вода (65:25:4, v/v/v) для фосфолипидов (Wagner et al. 1961); нейтральные липиды разделяли в системе: гексан - дкэтнловый эфир - ледяная уксусная кислота (73:25:2, v/v/v) (Прохорова, Туликова 1965). Количество СЖК определяли по методу Марша (Marsh, Weinstein 1966), холестерина - по методу Марша и Златкиса (Виркемп, Броукхьюз 1979). Липидный фосфор определяли по кетоду Герлаха - Дойтике (Gerlach, Deutike 1963). Количество ДНК определяли по нетоду Лише (Сквирская, Чепи-нога 1961), количество белка - по Лоури (Lowry et al. 1954).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МЕТАБОЛИЗМА ЛИПИДОВ ХРОМАТИНА И КЛЕТОЧНЫХ ОРГАНЕЛЛ ПЕЧЕНИ И ТИМУСА КРЫС С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ 2-14С-АЦЕТАТА В УСЛОВИЯХ IN VIVO.

Изучение соотношения удельных радиоактивностей липидов хроматина и ядер, а также липидов «хроматина и микросомальной фракции позволяет установить степень взаимосвязи липидов хроматина и ядерной мембраны. Представляло интерес,исследование интенсивности метаболизма липидов хроматина из тканей, различающихся по

степени пролиферации и липиднону обнену - печени и тимуса.

Определение количества липидов в хроматине клеток печени и тимуса, выделенном из ядер без использования тритона Х-100 для удаления ядерной мембраны, показало, что в хроматине печени содержится в 2 раза больше фосфолипидов и в 3 раза больше холестерина, чем в хроматине тимуса ( табл.1, табл.2). Низкий темп деления и более высокий уровень дифференцировки клеток

Таблица 1. Количество связанных с хроматином фосфолипидов и холестерина в печени и тимусе крыс (мкг липида на 1 мг ДНК).

исследуемый число фосфолипиды холестерин

орган опытов

печень 8 105 + 11 16,6 Т 1,4

тимус 7 50 + 4,8 5, 9 + 0,6

печени по сравнению с клетками тимуса совпадает с повышенным содержанием липидов в хроматине печени.

Сравнение удельной радиоактивности липидов микросом, ядер и

хроматина клеток печени, а также ядер и хроматина клеток тимуса 14

при введении 2- С-ацетата показало, что удельная радиоактивность

Таблица 2. Количество ФЛ в хроматине печени и тимуса крыс в норме и после облучения в дозе 10 Гр (мкг ФЛ на 1 мг ДНК)

печень

ФХ ФЭА КЛ СФМ остальные ФЛ

норма 54,? 28, 6 7,1 10, 0 5,0

10 мин после

облучения со 1Л ч1 17,1 1, 6* 7,0 3,6

40 мин после

облучения 74, 0* 30,1 4,5* 12, 0 3,7

тимус

И, ФЭА КЛ СФМ остальные ФЛ

норма 30, 7 11,4 2,0 3,0 2,9

10 мин после

облучения 28, 7 12,4 1,6* 3,0 2,3

40 мин после

облучения 27, . 2* 17, 3* 1,6* 3,2 2,3

п=5

* разница между контролем и облучением достоверна (р<0,05)

липидов хроматина печени выше удельной радиоактивности липидов ядер и соизмерима с удельной радиоактивностью липидов микросом (табл.3).

Таблица 3. Включение 2-14С-ацетата в липиды микросои, ядер и хроматина печени крыс в норке и через 40 мин после облучения в дозе 10 Гр (имп/мин на 1 мкг липядного фосфора или на 1 мкг холестерина)*.

микросомы ядра хроматин

липиды

норма обл. норма обл. норма обл

ФХ 1250 1600 860 1480 1200 1060

ФЭА 1080 1360 840 1080 1040 1080

СФМ 240 280 210 240 430 470

КЛ - - 1300 2250 1600 3400

ХОЛЕСТЕРИН 42000 48000 23500 41500 42000 86000

* представлены данные одного из 4х типичных опытов

Удельная радиоактивность липидов хроматина тимуса также превышает удельную радиоактивность липидов ядер (табл.4).

Более высокая удельная радиоактивность липидов хроматина по сравнению с липидами целых ядер может быть объяснена наличием в ядре собственных ферментных систем для синтеза липидов, либо, что более вероятно, существованием особых "каналов" транспорта вновь синтезированных липидов в хроматин из иеста их синтеза

Таблица 4. включение 2- С-ацетата в липиды ядер и хроматина тимуса крыс в норме и через 40 мин после облучения в дозе 10 Гр (хмп/кин на 1 мкг липидного фосфора)*

исследуемая ядра хроматин

фракция норма облучение норма облучение

ФХ 58 40 275 250

ФЭА 49 32 230 110

СФМ 21 13 45 36

КЛ 75 18 340 380

* представлены данные одного из 4х типичных опытов

эндоплазматичесного ретикулума - без усреднения метки с липидами ядерной мембраны. Поэтому было проведено сравнительное исследование удельной радиоактивности липидов ядер, хроматина и ядерной мембраны тимоцитов крыс.

II. СРАВНЕНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ВНОВЬ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ЛИПИДОВ В ЯДЕРНЫХ СТРУКТУРАХ ТИМОЦИТОВ КРЫС ПРИ ИНКУБАЦИИ КЛЕТОК IN VITRO.

Для сравнения включения метки в липиды целых клеток, ядер, хроматина и ядерной мембраны были выбраны 2 срока инкубации тимоцитов: 7 мин - начальный период включения метки в липиды и 45 мин - период после наступления изотопного равновесия. Электронно-микроскопический анализ не выявил загрязнения образцов хроматина пкпидами ядерных мембран. Препараты неочищенной фракции ядерных мембран загрязнены фрагментами хроматина. Однако, в хроматине содержится значительно меньшее количество липидов, и они не могут существенно влиять на количество липидов в препаратах ядерных мембран.

Нами показано, что удельная радиоактивность холестерина ядерной мембраны через 45 мин инкубации клеток значительно ниже, чем в хроматине (табл.5).

Удельная радиоактивность СЖК ядерной мембраны также ниже, чем удельная радиоактивность СЖК хроматина (табл.6).

Полученные результаты свидетельствуют, что хроматин имеет свой собственный пул липидов, обладающих более высокой метаболической активностью по сравнению с липкдани ядерной мембраны.

Таблица 5. Включение 2- С-ацетата в холестерин клеток, ядер, хроматина и ядерной мембраны тимуса (кмп/мин на 1 мкг холестерина).

время инкубации, мин

7

45

фракция

удельная радиоактивность

% от включения метки в хроматин при попарном сравнении

удельная радиоактивность

% от включения метки в хроматин при попарном сравнении

клетки 5, 2 + 3,3 196 + 68,0 16 + 3 101 ¥ 11, 5

ядра 2, 9 + 0,8 111 + 2,9 11 + 2 64*Т 1, 4

хроматин 2, 6 + 0, 6 100 17 + 2 100

ядерная

мембрана 2, 2 + 0,7 70 + 15,7 10 + 2 56,7*Т 7, 6

п=3

*р < 0,05

14

Таблица 6. Включение 2- С-ацетата в СЖК клеток, ядер, хроматина и ядерной мембраны тимуса (имп/мин на 1 мкг СЖК).

фракция

время инкубации, мин

45

удельная % от включения удельная радиоак- метки в хрома- радиоактивность тин при попар- тивность нок сравнении

% от включения метки в хроматин при попарном сравнении

клетки 1, 9 0, 6 96 + 37 19 + 11 59, 9*+ 6,9

ядра 1, 9 + 0,9 107 + 19,3 21 + 8 57,6*+ 9,0

хроматин 2, 0 + 1,3 100 31 + 17 100

ядерная

мембрана 0, 6 + 0,4 29,5*+ 8,9 24 15 52,7 Т 15,5

п=3

*р < 0,05

III. ВЛИЯНИЕ ОСТРОГО j-ОБЛУЧЕНИЯ КРЫС В ДОЗЕ 10 Гр НА МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ В ЯДРАХ И ХРОМАТИНЕ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ И ТИМУСА.

Радиационные изменения метаболизма липидов в хроматине радиочувствительного тимуса определяли через 10 мин после облучения животных и перед началом видимой гибели клеток тимуса (через 40 мин) в сравнении с изменениями липидов хроматина клеток радиорезистентной слабопролиферирующей печени.

ИЗМЕНЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ЛИПИДОВ

Через 10 мии после облучения крыс в хроматине печени

увеличивается относительное содержание ФХ. В этот же срок в

хроматине обоих органов снижается количество КЛ (табл.2).

Снижение количества КЛ коррелирует с увеличением функциональной

активности ядер печени и тимуса при облучении крыс в этой же

дозе. Наблюдается активация фосфорилированкя ядерных белков

(Зотова 1978), активация транскрипции (Токарская и др. 1976,

Скотникова и др. 1977), активация синтеза белков в ядрах

(Блохина, Коржова 1976). Через 40 мин после облучения количество

КЛ в хроматине печени имеет тенденцию к увеличению до

контрольного уровня, тогда как в хроматине тимуса количество КЛ

остается сниженным. В этот же срок в хроматине радиорезистентной

печени, для клеток которой не описан феномен радиационной

межнуклеосомной деградации хроматина, увеличено количество ФХ,

повышающего степень конденсированности хроматина, что делает его

менее доступным для деградации эндонуклеазами (Coceo et al. 1984,

Будкер и др. 1986). В хроматине тимуса количество ФХ снижено, что

по-видимому, связано со структурными перестройками хроматина,

2+

которые обеспечивают большую доступность хроматина для Ca 2+

Mg - зависимой экдонуклеазы, ответственной за его межнуклеосомную деградацию (Nikonova et al. 1980) в результате включения программы клеточной гибели (Уманский 1982, Stewart 1994) .

ИССЛЕДОВАНИЕ ВКЛЮЧЕНИЯ 2-14С~АЦЕТАТА В ЛИПИДЫ МИКРОСОМ, ЯДЕР И ХРОМАТИНА ПЕЧЕНИ И ТИМУСА j-ОБЛУЧЕННЫХ КРЫС

Наряду с изменением количества липидов в хроматине облучение вызывает некоторую стимуляцию включения меченого ацетата в ФЛ

ядерной и микросомальной фракции клеток печени. Удельная радиоактивность ФЛ хроматина также увеличивается за исключением ФХ (табл.3). Накопление ФХ в хроматине совпадает со снижением его удельной радиоактивности, что, по-видимому, связано со снижением скорости его распада или выведения. Повышенная удельная радиоактивность ФЛ хроматина печени облученных крыс свидетельствует о радиационной активации биосинтеза липидов в эндоплазматическом ретикулуме и активации мембранных ацилтрансфераз (Казначеев 1974, Коломийцева, Казначеев 1979). Удельная радиоактивность ФЛ хроматина и ядер тимуса после облучения снижена за исключением КЛ хроматина, удельная радиоактивность которого возрастает (табл.4). Пострадиационное изменение отношения величин удельной радиоактивности липидов хроматина к величинам удельной радиоактивности соответствующих липидов целых ядер, особенно резко выраженное для КЛ в тимусе, свидетельствует об изменении степени компартментализации липидов хроматина после облучения (табл.7).

Таблица 7. Пострадиационные изменения отношения величин удельной радиоактивности липидов хроматина из печени и тимуса крыс к величинам удельной радиоактивности соответствующих липидов ядер.

печень тимус

исследуемая

фракция контроль облучение контроль облучение

ФХ 1,39 0, .12 4,7 6,3

ФЭА 1,23 1, 00 4,7 3,4

СФМ 2,03 1, 95 2,1 2,8

КЛ 1,23 1, ,50 4,5 21,0

ХОЛЕСТЕРИН 1,80 2, , 07 -

п=4

Таким образом, изменения метаболизма липидов хроматина связаны со структурными и функциональными перестройками хроматина, имеющими различный характер в радиорезистентной печени и радиочувствительном тимусе.

IV. ВЛИЯНИЕ ОСТРОГО J-ОБЛУЧЕНИЯ КРЫС В ДОЗЕ 10 Гр НА МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ ЯДЕР И ХРОМАТИНА ТИМОЦИТОВ ПРИ ИНКУБАЦИИ КЛЕТОК IN VITRO.

Радиационные изменения липидов ядер и хроматина печени и тимуса in vivo обусловлены помимо прямого действия радиации влиянием всей совокупности нейрогуморальных факторов облученного целостного организма. Исследование липидного метаболизма в хроматине тимуса при инкубации клеток, полученных из ткани тимуса, удаленного из организма крыс сразу после облучения животных {"-30 сек), позволяет исключить влияние этих факторов на метаболизм липидов хроматина и возможность маскировки метаболизма липидов тимуса липидами печеночного происхождения, переносимыми липопротеидами крови во все другие органы.

В тимоцитах r-облученных крыс не обнаружено угнетения

3

включения 6- Н-урацила в кислотонерастворимую фракцию суммарной 14

РНК. Включение 2- С-ацетата в суммарную фракцию белков и липидов в норме и при облучении достоверно не отличалось на протяжении 120 мин инкубации клеток, хотя синтез РНК и белка в клетках тимуса радиочувствительны в условиях in vivo (Токарская и др. 1976, Скотникова и др. 1977, Блохина, Коржова 1976)

Радиоактивность ОФЛ клеток, ядер и хроматина снижены по

сравнению с контролем (табл.8). Отсутствие подавления включения

метки в суммарную фракцию РНК и суммарную фракцию белков и

14

липидов при угнетении включения 2- С-ацетата в ОФП свидетельствует о специфичности и более ранних сроках угнетения синтеза липидов в тимусе.

При инкубации тимоцитов r-облученных крыс in vitro обнаружено увеличение количества ФЭА в хроматине при отсутствии изменений количества фосфолипидов в ядрах и клетках.

Показано достоверное угнетение включения 2-14с-ацетата в СФМ и ФХ хроматина тимоцитов облученных крыс (табл.9).

Незначительное, но достоверное возрастание количества СЖК в ядрах тимоцитов облученных крыс (табл.10) при отсутствии уменьшения количества индивидуальных ФЛ, по-видимому, связано с угнетающим действием облучения на окислительное фосфорилирование ядер. Известно, что характерной особенностью лимфоидных клеток является их способность к аэробному синтезу АТФ за счет

Таблица 8. Радиоактивность общей фракции липидов клеток, ядер и хроматина тимуса контрольных и г-облученных крыс.

исследуемая фракция

радиоактивность, имп/мин на 1 мг белка

контроль

облучение*

клетки ядра

хроматин

8030 + 3050 3660 + 230 4320 + 450

83**+ 2 78+6 87+8

п=3

* проценты от контроля при попарном сравнении ** р<0,05

14

Таблица 9. Включение 2- с-ацетата в фосфолипиды клеток, ядер и хроматина тимуса контрольных и г-облученных крыс (имп/мин на 1 мкг фосфолипида).

ОФФЛ СФМ ФХ+ФС

исследуемая _

фракция контр, обл*. контр. обл*. контр, обл*.

клетки 41+ 8 82, 9+ 7,2 40+34 66,7 +10, 0 23+ 5 88, 9 +10,8 ядра 42+13 80,6+ 8,3 8+ 3 64,8 +21,1 30+ 5 76,2 +10,1 хроматин 86+23 90,5+28,1 34+10 31,3**+15,7 58+17 82,2**; 5,4

ФЭА

исследуемая _

фракция контр. обл*.

клетки 25+3

ядра 26+8

хроматин 59+4

КЛ

контр, обл*.

19+11 145,2+39,5 10+ 3 64,8+21,0 88+81 123,0+52,6

86,7+18,О 83,5+20, О 74,7+21,8

п=4-5

* проценты от контроля при попарном сравнении

** р<0,05

эндогенных субстратов, которыми могут выступать липиды. Облучение крыс в дозе 10 Гр вызывает угнетение аэробного синтеза АТФ (Кузин 1973), по-видимому, обусловливающее накопление СЖК в ядрах.

Таблица 10. Количество и удельная радиоактивность свободных жирных кислот клеток, ядер и хроматина тимуса контрольных и у-облученных крыс.

количество,

миг на 1 мг белка

исследуемая -

фракция контроль облучение*

радиоактивность, имп/мин на 1 ккг СЖК

контроль облучение*

клетки ядра

хроматин

26, 0+10,4 14,ЗТ 3,6 11,41 3,0

90,5 + 15,3 119,7**+ 0,4 102,3 т 11,0

6+2 6+1 9+2

75+13 71+21 88+ 8

п=3

* проценты от контроля при попарном сравнении

** р<0,05

Менее выраженные изменения липидного метаболизма при инкубации тимоцитов облученных крыс in vitro в отличие от условий in vivo свидетельствуют о том, что радиационные изменения липидов хроматина в определенной степени обусловлены влиянием нейрогуморальных факторов облученного целостного организма.

V.ВЛИЯНИЕ ФРАКЦИОНИРОВАННОГО у-ОБЛУЧЕНИЯ КРЫС В ДОЗЕ 6 Гр НА ЛИПИДЫ ЯДЕР ТИМУСА Б РАННИЕ И ОТДАЛЕННЫЕ СРОКИ ПОСЛЕ ОБЛУЧЕНИЯ.

При облучении животных сублетальнымк дозами изменение метаболизма липидов в ранние и отдаленные сроки после облучения интересно в плане понимания механизмов возникновения различных патологий, в частности старения и радиационного канцерогенеза. Токазано, что фракционированное облучение в дозе 6 Гр (2 Гр х 3 с недельным интервалом) индуцирует более раннее возникновение тнмфоидной лейкемии у линии мышей, предрасположенной к этому эаболеванию (Kaliss et al. 1974). в связи с проблемой роли

метаболических нарушений в проявлении возможных радиационны* патологий исследовали липидный состав гомогената и ядер тимусе через 1 час, 1, 2 и 3 месяца после последнего облучения крыс.

Через 1 час после последнего облучения наблюдается резкое возрастание количества СЖК в ядрах тимуса при отсутствш достоверных изменений их количества в гомогенате (табл.11). Чере: 1, 2 и 3 нес после облучения в ядрах отсутствуют достоверны! изменения количества СЖК. В гомогенате тимуса облученных крыс количество СЖК повышено по сравнению с норкой. С увеличение) времени, прошедшего с момента облучения, разница в количестве СЖ1 между контролем и облучением нарастает. Увеличение количества СЖ1 в гокогенате тимуса облученных крыс, возможно, связано с нарушением процессов их утилизации, поскольку отдаленны! последствия облучения в выживших клетках могут ограничиватьс! преимущественно цитоплазматическими проявлениями в виде нарушени! метаболизма и энергетики (Ярилин 1988) .

Таблица 11. Количество свободных жирных кислот в гомогенате и ядрах тимуса контрольных (мкг/мг белка) и облученных (в % от контроля при попарном сравнении) крыс*.

время после облучения вариант 1 цас 1 иес 2 мес 3 иес

гомогенат

контроль 62,9Т 1,9 95,9 114,3

облучение 118,6+14,9 120,3**+ 1,9 ядра

контроль 21,3 +1,8 24,4* 3,9

облучение 238,3**+24,1 76,8+ 4,7

_

* калибровочная кривая по арахидоновой кислоте

** р<0,05

77,1 + 6,5 111,5+13,7

138,0**+ 2,9 175,3**113,3

16,2+ 5,9 19,1+ 3,9

106,2+32,4 90,9+ 5,7

Нами обнаружено достоверное снижение массы тимусов облученны крыс через 1 час после последнего облучения с последующи восстановлением ее до контрольного уровня через 1 мес поел облучения. При этом количество белка на 1 г ткани тимуса н

изменялось после облучения. Поэтому снижение массы тимусов облученных крыс отражает снижение клеточности тимусов и ее восстановление через 1 мес после облучения.

Количество ФХ+ФС и ФЭА в ядрах тимуса через 1 час после облучения снижено, при том, что количество этих липидов на уровне гомогената достоверно не изменяется (табл.12, табл.13). Через 1, 2 и 3 мес количество ФХ+ФС и ФЭА в норке и при облучении достоверно не отличается ни в ядрах, ни в гомогенате. Снижение количества ФХ+ФС и ФЭА в ядрах тимуса через 1 час после облучения при резком возрастании количества СЖК, по-видимому, отражает процессы, ведущие как к интерфазной гибели части клеток, так и к активации процессов дифференцировки и пролиферации выжившей части клеток, о чем свидетельствует восстановление массы тимусов крыс до контрольного уровня через 1 мес после облучения.

Таблица 12. Количество ФХ+ФС в гомогенате и ядрах тимуса контрольных (мкг на 1 мг белка) и облученных (в % к контролю при попарном сравнении) в дозе 6 Гр крыс.

время после облучения

вариант

1 час 1 мес 2 мес. 3 мес.

гомогенат

контроль 20,20+ 1, 65 21, 57 + 1, 99 24,98+ 1, ,31 24, ,77? 0, 72

облучение 89,14+11, .55 100, 50 + б, 01 108,54т 7, . 68 101, ,8бТ 3, .79

ядра

контроль 16,23 +1, 53 17, 12 + 3, .36 14,33т ,77 20, ,93Т 1, ■ 97

облучение 62,42*+2, ,90 113, 52Т11, ,12 118,40+ 7, ,36 104 ,78*10, .50

п=3

* р<0,05

Таким образом, на основании литературных и наших данных следует, что липиды ядер и хроматина принимают активное участие в функционировании генетического аппарата клетки. Липиды хроматина клеток печени к тимуса имеют более высокую

Таблица 13.Количество ФЭА в гоногенате и ядрах тимуса контрольных (мкг на 1 мг белка) и облученных (в % к контролю при попарном сравнении) в дозе 6 Гр крыс.

время после облучения

вариант

1 час 1 мес. 2 мес. 3 мес

гомогенат

контроль 5, 87+ 0,54 11/ 23+ 1, 34 7, 64+ 1, .45 11,95+ 0, 70

облучение 78, 06+8,10 97, 63+15, 66 99, 55+23, .49 78,89+14, 07

ядра

контроль 3, 73 ТО,48 5, 17+ 0, 55 5, 75+ 0, ,93 9,40+0, 68

облучение 68, 41*}5,05 121, 78Т19, 26 74, 78+11, ,01 69,69+9, 14

п=3

* р<0,05

метаболическую активность по сравнению с липидаки ядер, поскольку удельная радиоактивность липидов хроматина превышает удельную радиоактивность соответствующих липидов ядер. Облучение крыс вызывает специфические изменения метаболизма липидов хроматина в радиорезистентной печени и радиочувствительном тимусе. Влияние нейрогуморальных факторов облученного организма на изменение метаболизма липидов хроматина тимоцитов свидетельствует о тон, что эти изменения представляют собой не только результат прямого действия радиации, а являются отражением активной реакции клеток на облучение.

ВЫВОДЫ

14

1. С использованием 2- С-ацетата в качестве предшественника синтеза липидов показано, что удельная радиоактивность липидов хроматина клеток печени и тимуса крыс в 2-5 раз превышает удельную радиоактивность соответствующих липидов целых ядер. Это свидетельствует о более высокой метаболической активности липидов хроматина.

2. Показана раздельность метаболических пулов холестерина и

свободных жирных кислот ядерной мембраны и хроматина тимоцитов крыс: удельная радиоактивность холестерина и свободных жирных кислот хроматина превышает удельную радиоактивность этих липидов в ядерной мембране.

3. Липиды хроматина клеток печени и тимуса участвуют в ответных реакциях на облучение крыс в летальной дозе (10 Гр) . Показано: а/ снижение количества кардиолипина в хроматине печени и тимуса через 10 минут после облучения, коррелирующее с увеличением функциональной активности ядер-, б/ увеличение количества фосфатидилхолина в хроматине печени и снижение его количества в хроматине тимуса через 40 минут после облучения, коррелирующее с различной радиочувствительностью этих органов.

4. Облучение крыс в дозе 10 Гр вызывает изменение отношения величин удельной радиоактивности липидов хроматина к величинам удельной радиоактивности соответствующих липидов целых ядер. Показано резкое возрастание (в 5 раз) этого отношения для кардиолипина клеток тимуса, что свидетельствует об увеличении степени разъединенности пулов кардиолипина хроматина и ядерной мембраны при облучений. Радиационные изменения соотношения величин удельной радиоактивности липидов хроматина и ядер для других фосфолипидов и холестерина клеток печени и тимуса выражены менее значительно.

5. При инкубации в течение 45 минут тимоцитов, извлеченных из организма крыс сразу после облучения животных (~30 сек), не обнаружено снижения количества кардиолипина и фосфатидилхолина в хроматине, показанного в условиях in vivo в тот же срок. Это свидетельствует о влиянии нейрогуморальных факторов облученного целостного организма на метаболизм липидов хроматина.

6. Фракционированное облучение крыс в сублетальной дозе 6 Гр (2 Гр х 3 с недельным интервалом) вызывает глубокие изменения липидов ядер клеток тимуса в ранние сроки после облучения: резкое возрастание количества свободных жирных ■кислот и снижение количества фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина при отсутствии этих изменений в готеогенате через 1 час после последнего облучения. Отсутствие изменений количества липидов ядер в отдаленные сроки после облучения (1, 2 и 3 месяца) сопровождается нарастающим увеличением количества свободных жирных кислот в гомогенате тимуса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Казначеев Ю.С., Кулагина Т.П., Иаркевич Л.Н., Коломийцева И.К., Кузин A.M. О метаболизме липидов хроматина печени и тимуса крыс. Молекулярная биология, 1984,18, 3, 607-612.

2. Казначеев Ю.С., Коломийцева И.К., Кулагина Т.П., Маркевич Л.Н. обновление хроматинсвязанных и мембранных липидов печени и тимуса r-облученных крыс. Биохимия, 1984, 49, 12, 2008-2011.

3. Казначеев Ю.С., Кулагина Т.П., Маркевич Л.Н., Колонийцева И.К. Радиационные изменения количества липидов хроматина печени и тимуса r-облученных крыс. Радиобиология, 1985, 25, 2, 174-178.

4. Кулагина Т.П., Коломийцева И. К. Липиды хроматина тимуса стареющих крыс. В сб.: Тезисы докладов IX Всесоюзного симпозиума "Структура и функции клеточного ядра". Черноголовка, 1987, с. 68.

5. Кулагина Т.П., Коломийцева И. К. Липиды ядер и хроматина тимуса крыс при лучевом поражении. В сб. :Тезисы докладов на I Всесоюзном радиобиологическом съезде. Москва, 1989, т. 1, с. 67.

6. Кулагина Т.П. Холестерин и жирные кислоты ядер и хроматина тимуса крыс в отдаленные сроки после у-облучения. Радиобиология, 1990, 30, 3, 317-320.

7. Кулагина Т.п. Фосфолипиды ядер и хроматина тимуса крыс в отдаленные сроки после r-облучения. Радиобиология. 1990, 30, 6, 745-748.

8. Кулагина Т.П., Коломийцева И.К., Казначеев Ю.С. Участие липидов хроматина тимоцитов крыс в ответных реакциях на повреждающее воздействие jr-радиации. Биохимия, 1990, 55, 11, 1962-1968.

9. Коломийцева И. К.. , Кулагина Т.П. Метаболизм фосфолипидов в хроматине тимоцитов крыс при повреждающих воздействиях. В сб. : Тезисы докладов X Всесоюзного симпозиума "Структура и функции клеточного ядра". Гродно. 1990. С. 139.

10. Кулагина Т.П., Шурута С.А., Коломийцева И.К. Метаболизм нейтральных липидов ядер и хроматина тимоцитов крыс в норме и после у-облучения. Биохимия, 1993, 58, 2, 295-300.

11. Шурута С. А. , Кулагина Т.П., Коломийцева И.К. Сравнительное исследование метаболизма нейтральных липидов хроматина и ядерной мембраны тимоцитов крыс. Тезисы докладов XI симпозиума "Структура и функции клеточного ядра".

Санкт-Петербург. Цитология. 1933, т. 35, вып. 10. С. 103.

12. Кулагина Т.П., Шурута С.А., Коломийцева И.К., Попов В.И. Различие метаболических пулов холестерина и свободных жирных кислот хроматина и ядерной мембраны тимоцитов крыс. Молекулярная биология/ 1994, 28, 3, 714-719.