Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кофермент Q: регуляция липидного обмена клеток животных в норме и в условиях ионизирующих воздействий

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кофермент Q: регуляция липидного обмена клеток животных в норме и в условиях ионизирующих воздействий"

г' од

ч ,. 'Г? / РОССИЙСКАЯ АКШШ НАУК

. J^

МипФТЯГГ\Г>Р Л 1ЖгЛъКОЛПГГХ 1Л ттотчгтг

На правах рукописи УЖ 577.125

Елена Григорьевна

Кофермент 0: регуляция лшшдного обмена

V ПОТ»ГМЛ »ТПЗЛФТЛТТ О гхгтмд ТГ О Тгп ТТЛ\ОТ*СГУ

ионизирувдих воздействий.

Биохимия 03.00.04

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

г.Пущино 1994

Работа выполнена в Институте биофизики клетки РАН

Оффициальнне оппоненты :

Доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН А.А.Яршшн Доктор физико-математических наук, профессор В.А.Печатников Доктор биологических наук Г.П.Гудимова

Ведущая организация - Институт экспериментальной и теоретической биофизики РАН.

Защита'состоится в час на заседании

Специализированного совета Д 200.23.01. по защите докторских диссертаций по специальности "биохимия" при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142292, г. Пункта, ИБК РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Н1ШИ РАН, Лущино ,

Автореферат разослан " " 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

АНЯ? 'СьЛЪНОСЯХЬ ТУ^ОС

Важным направлением в биохимии природных биологически 1КТИВ1ШХ соединений является исследование механизмов их егуляторнсго влияния нз метаболические процессы в живой клетке : поиск возможностей направленной регуляции метаболизма в словиях патологических состояний.

Функционирование животных клеток осуществляется таким бразом, что в течение всего периода существования отдельной летки происходит интенсивное обновление мембран, при этом ишдные компоненты мембран обменивается с гораздо большей коростью, чем белки. Физиологический смысл более интенсивного бмена липидной части биологических мембран состоит не только в беспечении их пластических свойств и образовании цятоскелетз. о и широко исследуемой в последние года функцш_ липидов в истеме вторичных мессенджеров при активации рецепторных груктур.

В клетках здорового животного поддерживается определенный ровень метаболизма лишдов. обеспечиващий для каждой мембраны мое молярное соотношение холестерина и фосфолипядов, которое ззволяет регулировать активность мембранно-связанных ферментов, энных каналов, насосов и рецепторов. При любых изменениях неточного гомеостзза - физиологических (рост, деление, зф$еренцировка). либо патологических - первичной реакцией яетки становятся сдвиги уровней метаболизма липидов и гораздо ззие - белков и нуклеиновых кислот. Более того, при воздействии мических агентов, многих физических факторов, внзыващих гзникновение патологических состояний в клетках эукариотов, в жбранах резко возрастает уровень активных форм кислорода, ¡зыващих активацию окислительных процессов, основными гбстратами которых служат молекулы липидов. Одним из факторов, ггализирущих возникновение свободнорадикальных лшидных )МПлексов, является ионизирующая радиация.

Эндогенная система защиты клетки от цитотоксических агентов, связанных с увеличением уровня окислительных процессов, включает презде всего природные антиоксиданты, к которым относятся и убихиноны. Хотя антиокислительная активность убихинонов меньше, чем других природных жирорастворимых антиоксидантов (токоферолов и каротиноидов), убихиноны являются единственными в этом ряду соединениями, которые способны синтезироваться в организме.

Регуляция продуцирования убихинонов в клетках животных осуществляется таким образом, что при дефиците других жирорастворимых антиоксидантов, например, а-токоферола, происходит компенсаторное увеличение образования и накопление убихинона в тканях. Таким образом, не являясь в строга определении витаминами, убихиноны, несомненно, обладает витаминной активностью.

Со времени открытия убихинонов в середине 50-х годо! большинство исследований было посвящено изучению коферментно! функции этих хинонов, их роли в транспорте электроне! митохондриальных мембран, идентификации убихинон-связывакщш белковых комплексов, способствувдих латеральной даНйгзю убихинонов в мембранах.

Исследование возможности нормализушего влияния убихинош в условиях пострадиационного энергетического дисбаланса, отягощенного значительными нарушениями пролиферативной, метаболической и функциональной активности клеток, представляет не только теоретический интерес. Настоящая работа предприняв для выявления регуляторной роли убихинонов в отношении липидног< обмена в клетках здорового организма, а также при ионизирувдш воздействиях (сублетальных и малых), вызывания нарушен® клеточного метаболизма в различной степени.

Цель и основные задачи исследования В настоящей работе проводилось систематическое изучен» влияния убихинона на липидный обмен клеток печени, слизисто!

ишечника. тимуса, селезенки и костного мозга здоровых крыс, а ara® ¡квотных, подвергнутых действии ионизирующего излучения в ироком диапазоне доз. При этом были решены следующие задачи:

1. Установлены оптимальные концентрации убишюнов для егудяции обмена липидов в клетках in vivo и In vitro, пределеш количественные характеристики накопления и выведения кзогенного убихинона в органах крыс при различных способах ведения.

2. Установлена закономерность, согласно которой, несмотря а некоторую органоспецифичность. влияние убихинона проявляется гнетением скоростей биосинтеза холестерина и фосфолипидов утем, независимым от синтеза РНК и ДНК в клетках животных.

3. Показано, что регуляторные функции экзогенного убихинона спеано осуществляются в условиях острых и хронических онизирувдих воздействий: показаны многочисленные признаки армализушего влияния кофермента Q на уровень биосинтеза ипидов и микровязкость клеточных мембран.

4. Установлена иммуномодулирувдая активность убихинона. эрмализация микровязкости плазматических мембран «мунокомпетентных клеток облученных еивотных вследствии згуляторного влияния убихинона способствует восстанавлению ровня пролиферации митоген-стимулированных клеток.

Научная ксвиз?а

При использовании различных способов образования в животных тетках избытка убихинона (диета с Q-9, подкожные иньекции зсляного рзствора и инкубация клеток с убихинонакз in vitro) хла установлена регуляторная роль убихинона в отношении обмена шидов внутриклеточных мембран и целых клеток.

Впервые показана регуляторная функция убихинсков в гношении фосфолипидного обмена: установлено, что в печени крыс ¡гуляция осуществляется путем подавления скорости биосинтеза ;рез реакции обмена оснований и угнетения скоростей распада сих молекул.

3

Доказана возможность полного или частичного устранения радиационных нарушений уровня обмена лшшдов и восстановления вязкостных свойств биологических мембран экзогенным убихиноном; восстановление фшко-химических параметров коррелировало с нормализацией функциональной активности клеток.

Научно-практическая ценность.

Результаты работы расширяют существующие представления о механизмах регуляторной функции убихинонов в отношении липидных компонент биологических мембран. Выяснение механизмов направленной регуляции метаболизма лшшдов клеток животных может быть использовано в прикладных исследованиях.

Во-первых, это касается радаозащитных свойств убихинонов, причем анализ экспериментальных данных позволяет сделать вывод о том, что наиболее эффективно применение убихинона в условиях хронического действия радиации, что свидетельствует о высокой надежности системы контролирования гомеосгаза убихиноном.

Во-вторых, можно рекомендовать исследование возможного использования убихинонов в качестве гшохолестершового агента при атеросклерозе.

В-третьих, обнаруженная иммуномодулирупцая способность убихинона делает перспективным его применение во многих случаях, связанных с ослаблением иммунной системы, например, при старении, при повышении риска злокачественных новообразований, вызванных техногенными загрязнениями окружающей среды.

Очевидно, необходимы дальнейшие исследования роли убихинонов в регуляции жизнедеятельности клетки, и расширение спектра применения этих биоантиоксидантов в клинике.

Апробация работ

Материалы диссертации опубликована в 31 статье. Основные результаты были доложены на I Всесоюзном радиобиологическое съезде.1Э8Э,Москва; на I Всесоюзном симпозиуме "Молекулярно-клеточные механизмы хронического действия ионизирущш излучений" ,1990 .Пущино; на 4 Всесоюзной конференции "Химия, фармакология и механизмы действия противоопухолевых средств",

1990, Москва; на 4 симпозиуме по биохимии липидов, 1994, Санкт-Петербург.

Структура и объел работ

Диссертация изложена на 221 стр., содержит 22 рисунка и 37 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, изложения собственных экспериментальных данных, обсуждения результатов, заключения и выводов, а также приложения, содержащего описание использовавшихся в работе методов и материалов. Список цитированной литературы содержит 467 ссылок.

Список сокращений

дг - диглицериды

кл - кардиолипин

Нон А - конканавалин А

иг - моноглицерида

3-ОМГ Кол - З-окси-З-метилглютарил Код

сжк - свободные жирные кислоты

см - сфянгомиедин

ФЯ - фОСфОЛ1ШВДЫ

Фй - фосфатидилинозитол

к - фосфатидилсерин

ФХ - фосфатидилхолин, лецитин

X - холестерин

эх - зфиры холестерина

ЬРЭ - липополисахаридо

о - убшашон

к

I. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ВЛИЯНИЕ УБИХИНОНА Q-9 НА ОБМЕН ЛШВДОВ in vivo В ОРГАНАХ НОРМАЛЬНЫХ И ОБЛУЧЕННЫХ КРИС

В настоящей главе описываются результаты исследований по влиянию экзогенного убихинона, вводимого в организм крысы путем подкожных инъекций, на скорости синтеза холестерина, убихинона, а также скорости обмена (синтеза и распада) основных фосфолипидов в органах здоровых и облученных животных.

Экзогенный убихинон Q-9 вводили подкожно в количестве 70 мг/кг в виде 5% раствора на растительном масле 3 раза с суточными перерывами, общая доза была ■ 200 мг/кг веса тела. Облученные крысы получали эти инъекции после облучения по той же схеме, мощность дозы была 4 Гр/мин. общая доза 7-облучения. полученная животными, составляла 8 Гр. После облучения контрольные и опытные животные получали только воду. За 3 часа до декапитации животные получали последнюю инъекцию убихинона. За I час до декапитации внутрибршинно вводили радиоактивные предшественники синтеза липидов: 2-14С ацетат натрия или 2-14С глицерин по 50 мкКи на крысу, или 3Н-Ь~серин но 30 мкКи на крысу. В экспериментах по изучению распада за 24 или 48 часов до декапитации животным вводили внутрибршинно по 50 мкКи 2-^С глицерина.

I.I. Облек убихинона в печени астральных и. облучехжх крыс, получающих убихинон.

В табл.1 приведены данные о концентрации убихинона в печени нормальных и облученных крыс через последовательные промежутки времени после третьей инъекции убихинона-9. Результаты показывают, что подкожно введенный препарат уже через два часа после введения накапливается в печени, и его концентрация превышает нормальный уровень в несколько раз. Через II часов

после введения количество убихинона в печени снижается до нормы. Не было найдено различий в скорости выведения экзогенного убихинона из печени интактных и облученных животных, период полувыведения избытка убихинона из печени составляет примерно 4 часа. Измеряя кинетику выведения меченого убихинона из печени крыс (рис.1), мы обнаружили, что время полужизни убихинона в печени интактных крыс составляет примерно 12 часов.

После облучения удельная радиоактивность убихинона увеличивается по сравнению с нормой, период полужизни убихинона уменьшается до 2 часов, что указывает на увеличение скорости' синтеза и распада убихинона печени. В отличие от других стрессовых

Таблица I

Накопление убихинона в печени контрольных и облученных крыс (мкг/г ткани) после подкожных инъекций в концентрации 200 мг/кг веса

Время после число контроль облучение

инъекций.час опытов

2.0 2 280+57 222±39

3.5 2 228±34 238±43

4.0 2 248±42 302±51

4.5 2 287±44 327+43

5.0 2 190±32 188±28

7.0 2 144±23 162±!9

11.0 2 54±12 44 ±6

без 0-9 10 47±4 52 ±3

1 ВРЕМЯ(ЧАС)"

Рис.1 Интенсивность синтеза убихинона в печени крыс 1п г1то. I-контроль, 2-облучение. По оси абсцисс - время после

введения 2-14с- ацетата натрия, по оси ординат -

удельная радиоактивность убихинона.

Каздое значение - среднее 4-х экспериментов.

воздействий, облучение не вызывает замедление скорости распада убихинона в печени, напротив, мы обнаружили пострадиационное усиление катаболизма убихинона. Интересно отметить, что нагрузка убихиноном не только не подавляет биосинтез убихинона в печени,-наоборот, имеет место существенное увеличение включения 2-14С-ацетата в убихинон печени крыс.

Как видно из сравнения кривых выведения меченого убихинона из печени (рис.1) и данных табл. I, избыток убихинона имеет гораздо меньший период далувыведения, чем вновь синтезируемый убихинон у интактных животных. Можно полагать, что нагрузка убихиноном активирует не только биосинтез, но и распад убихинона, поэтому выведение экзогенного убихинона ускорено.

8

.?,. Влияние убишют на облен холестерина и фосфолтибов в субклеточны.г фракциям печени крыс.

Концентрация мембранно-связанного холестерина в органеллах зчени при нагрузках убихиноном-9 уменьшается. Заметное уменьше-*е концентрации холестерина происходит в микросомах и в 35000 » g супернатантной фракции. Облучение приводит к значи-гльному уменьшению этерифицированного и увеличению свободного злестерина в микросомальных мембранах и, соответственно, к зеличению отношения свободный/этерфвдфованный холестерин. Это эрошо согласуется с общепринятой схемой регуляции активности ¡Г-КоА редуктззы по принципу "отрицательной" обратной связи.

Ионизирующее излучение, как известно, активирует синтез >лестерина в печени, что сопровождается уменьшением эфиров )лестерина в субклеточных органеллах. Нагрузка убихиноном ведет уменьшению концентрации эфиров холестерина в микросомах и ¡тохондриях печени нормальных крыс и снижает количество эфиров ¡лестерина в органеллах печени облученных крыс до следовых ¡ачений. Поскольку скорость синтеза холестерина в этих условиях давлена, то факт уменьшения эфиров холестерина в микросомах !чени позволяет утверждать, что холестерин и его эфиры не шлются эффекторами регуляции стериногенеза убихиноном.

Изменение концентрации свободного и этерифицированного «¡ветерана в субклеточных фракциях печени крыс, получавших 1грузку убихиноном и облученных в дозе 8 Гр, свидетельствует о >дификации структуры мембран при этих условиях. После нагрузки ¡кхинином происходят достоверное увеличение общих фосфолипидов микросомах (рис.2). В микросомах печени интактных крыс, «учивших убихинон. изменения количества холестерина и юфолипидов осуществляются однонаправленно, так, что почти не меняется отношение холестерин/фосфолипиды. Более того, ¡ачительное пострадиационное увеличение (на 40%) этого отношения в микросомах печени нормализуется под влиянием грузок убихиноном-9.

Ряс.2 Влияние экзогенного убихинона на фосфолишщшй состав мембран клеток печени. I- обгцие фосфолшиды, II- ФХ, III- ФЗА. А- митохондрии. Б- микросомы, В- 105 ООО х g супернатант. I-облучение, 2-нагрузка убихиноном, З-облучение+убихинон, пунктирные линии - контроль. Каждое значение - среднее 4-х экспериментов.

Количество ФХ и ФЗА увеличивается в митохондриях и уменьшается в микросомах печени крыс, получавших убихинон. Количество сфингрмиелина снижено в 105000 * g супернатантной фракции, а в микросомах- печени крыс, нагруженных убихиноном, концентрация сфингомиелина в 2'раза выше контрольных значений.

Таким образом, в мембранах печени облученных животных происходит увеличение количества холестерина и обеднение мембран фосфолипидами. ■ Нагрузка убихиноном нормализует лнпидные компоненты микросомальных мембран печет крыс, это относится к величине соотношения холестерина и фосфолипидов, а также количества сфингомиелина в микросомах печени облученных крыс.

ю

1.3.Регуляция уФтжтл облет фосфолтидоб б печени, селезенке и слизиаяай ютеикит

Введение убихинона-Э нормальным и облученным крысам вызывает изменение фосфолишдного состава в органах животного и интенсивности включения меченого предшественника в отдельные компоненты полярных липидов (табл.2). Избыток убихинона вызывает в печени возрастание содержания ФС и ФХ, причем для последнего

Таблица 2

Влияние экзогенного убихинона-Э на синтез фосфолшидов в органах крыс (включение 3Н-серина в имп/мин/мг ткани)

СМ ФЭА ФХ , ФС

Печень

контроль

облучение

убихинон

облучение + убихинон

Кишечник

контроль

облучение

убихинон

облучение + убихинон

Селезенка

контроль

облучение

убихинон

облучение + убихинон

2.00±0.03 2.00±0.09 1.57±0.20 1.39±0.12*

0.89±0.23 0.64*0.02 0.97±0.40 1.01 ±0.02

0.24±0.02 0.35±0.01 0.42±0.03 0.38±0.20

2.46*0.05 15.58+0.48

*

3.72±0.06 1.69±0.25* 3.281:0.02

2.25±0.50 2.73±0.12 1.52±0.24 1.41±0.27*

0.36±0.01 0.51±0.01 * 0.5б±0.02 0.87±0.01*

23.61±1.00 14.75±0.25 13.24t0.50

2.85±0.27 2.88±0.09 1.58±0.42* 1.64±0.13*

2.б5±0.11 2.01

1.4б±0.10 2.55±0.22 3.40±0.1б

0.84±0.06 1.32±0.01* 1.09±0.10 1.53±0.34*

11.89 О О

1.34±0.02 1.32±0.01 1.49±0.20 1.34±0.02

Каждое значение - среднее 4-х экспериментов.

* - отличие достоверно, р<0.05

эффект сохранялся и при облучении. Содержание ФЭА в печени, увеличенное в результате облучения животных, нормализуется прг введении убихинона. В кишечнике, напротив, под. влияние« убихинона происходит уменьшение содержания ФЭА и уменьшение уровня ФС до следовых количеств как у нормальных, так и у облученных животных. В селезенке облученных животных, а также крыс, получавших убихинон. наблюдается возрастание содержания СМ, причем при совместном действии двух факторов возрастание недостоверно.

Для анализа интенсивностей синтеза фосфолипидов в органа? крыс целесообразно рассмотреть отношение удельных радиоактивностей ФЭА/ФС, по которому можно примерно оценить скорость превращения ФЭА из ФС в результате декарбоксилирования. а также отношение ФХ/ФЭА, характеризующее интенсивность образования Ф1 из ФЭА путем метилирования. Результаты свидетельствуют о том, что нагрузка убихиноном значительно активирует декарбоксилирова-ние ФС и угнетает превращение ФЭА в ФХ в печени и селезенке крыс. При этом данный эффект сохраняется и в органах облученнш кивотных. В кишечнике крыс нагрузка убихиноном нормализуеч резкое угнетение в результате облучения превращения ФХ из ФЭА. Можно заключить, что применение убихинона изменяет эффем радиации на метаболизм фосфолипидов исследованных органов крыс, частично нормализуя уровень их обмена.

Для изучения интенсивности выведения меченых молекул фосфолипидов из органов крыс использовали 2-14С-глицерин, Которгй вводили крысам за 24 и 42 ч до измерений. В печени наблюдаете* отчетливое подавление выведения фосфолипидов как щи радиационном воздействии, так и после нагрузки убихиноном. I кишечнике крыс, напротив, все фосфолшшды активнее выводятся I результате облучения и нагрузки убихиноном. В селезенке наблюдается активация распада ФХ, выведение ФЭА изменяете? незначительно. Очевидно, в печени и радиочувствительных ткаюо наблюдаются противоположные изменения скорости вьведенш фосфолипидов под влиянием 7-облучения и нагрузки убихиноном.

Таким образом, введение убихинона-9 оказывает разнообразное органоспецифическое действие на обмен и содержание фосфолипидов в органах животных в норме и при 7-облучении, которое проявляется некоторой нормализацией интенсивности синтеза в органах облученных крыс и задержкой распада фосфолипидов в печени животных.

2. УЧАСТИЕ УБИХИНОНОВ В РЕГУЛЯЩИ ОБМЕНА ЖЩОВ В МЕТКАХ In vitro

2.1. Ситеэ холестерина в изолированных клешах печет, инку аиру елых в среде, содержащей убшхаюн.

При подкожных инъекциях убихинона было обнаружено накопление убихинона в печени животных, и можно было предположить, что

Рис.3 Влияние убихинона на скорость синтеза холестерина In vitro в гепатоцитах крыс. I-интактные клетки, 2- ICD мМ Q-9 в среде инкубации.

По оси абсцисс - время инкубации (час); по оси ординат -радиоактивность холестерина, (имп/мин /мг белка). Каждое значение - среднее 4-х экспериментов.

2

5 ЧАС

13

убихинон, непосредственно взаимодействуя с мембранами клеток печени, вызывает модификацию активности системы фермедтов. катализирующих обмен стеринов в печени. Но однозначно решить этот вопрос в опытах in vivo не представлялось возможным, поскольку введенный животным убихинон мог вызвать некоторые изменения, в том числе и гуморальные, опосредованно влияющие на липид-синтезируюпше ферменты.

Результаты, приведенные на Рис.3, свидетельствуют о том, что добавленный In vitro к гепатоцитам убихинон-9 подавляет обмен свободных стеринов в печени. При инкубации гепатоцитов с убихиноном в течение 2 и 3 ч степень подавления одинакова и почти не обнаруживается при 1-часовой экспозиции.

Рис.4 Включение б-^-уращш в РНК гепатоцитов (а) и тимоцитов (б) Ш yitro. о-контроль, в-IOO píí 0-9, В-100.ЦМ 0-1.По оси абсцисс- время инкубации (мин), по оси ординат-радиоактиЕНость РНК (имп/мин/мг белка). Каждое значение-среднее 4-х экспериментов.

Взаимодействуя с мембраной, убихинон-9 не уменьшает скорость проникновения меченого предшественника 2-14С-ацетата в

клетки печени. Добавленный в инкубационную среду 2-*4С-ацетат зыстро проникает в клетки и, по крайней мере, в течение 3 ч радиоактивность гепатоцитов в расчете на количество белка и ДНК клеток одинакова и составляет 140, 146, 153 имп/мин на Ю5 клеток в течение I. 2 и 3 ч в норме и 161, 157 и 175 имп/мин -rjQir влиянием "бяхинонз соответственно.

j, . и . ,

Известно, что 2- С-ацетат активно включается в жирные кислоты и служит предшественником ацильных групп фосфолипидов. Зключение меченого ацетата во фракцию фосфолипидов, очищенную от 1ейтральных липидов, не изменялось при инкубации гепатоцитов с /бихиноном-9. Это свидетельствует о том, что ингибируицее злияние убихинона на обмен свободных стеринов в гепатоцитах In ¡rltro является специфическим и не связано с обменом полярных йипвдов. Скорость синтеза РНК гепатоцитов также не изменялась три добавлении убихинона в среду инкубации (Рис.4).

Z.Z. Сишеэ липидов 6 изолированны.? клетках тихуса, инхубируелых с убихинокол.

Изучалось влияние ряда убихинонов (Q-I, 0-2. Q-8 и Q-9) на зинтез липидов в тимоцитах In vitro.

Было показано, что включение меченого урацила в РНК тимоци-гов In vitro как в контрольные тимоциты, так и в клетки, инкуби-зувдиеся в присутствии убихинонов стабильно в течение 2-х

isсовой экспозиции* • 30м8тных измбкбний синт633 суммзпк0& ркк в

пшоцитах в присутствии убихинонов по сравнению с контролем не збнарукено (Рис.4).

Интенсивность включения 2-^С-ацетата натрия в клетки, засчитанная в виде числа распадов в минуту на мг белка гимоцитов, при добавлении в среду всех исследуемых убихинонов в эазличных концентрациях (от I до 100 рМ) в течении 2-х часов шкубащш при 37°С не отличалась от контрольных значений. Это звидетельствует о том, что добавление убихинонов в среду шкубации не меняло проницаемости тимоцитов для меченого

предшественника и пул 2-14С- ацетата внутри клеток был одинаков при разных условиях инкубации - в присутствии, либо в отсутствие убихинонов.

Убихинон 0-9 является основным природным убихиконом в организме крысы, поэтому подробно исследовалось влияние экзогенного убихинона с девятью изопреновыми грушами в боковой цепи на синтез липидов в тимоцитах 1п уПго (Рис.5).

20 «О 60 во 100

Концентрация (2д в среде, цМ.

Рис.5 Включение 2- С-ацетата в холестерин (а) и общие липиды (б: тимоцитов,инкубируемых в среде с убихиноком 0-9. Заштрихованные полосы- доверительные интервалы контрольных

--------- значений (без убихинона в среде).

По оси абсцисс -"время ■инкубащш-(мгн)---------

По оси ординат - радиоактивность холестерина, (ими/мин/ мг белка).

Каждое значение - среднее 5-ти экспериментов.

16

Значительное угнетение синтеза холестерина в тимоцитах

показано в том случае, если концентрация экзогенного убихинона в

-Ч Т4

среде была не ниже 4'10 М. Включение 2- С-ацетата натрия во

фракцию общих липидов тимсцктсв после нагрузки среда убихиноном Q-9 при различных концентрациях достоверно не отличалось от контрольного уровня. Такой же эффект специфического угнетения холестериногенеза In yltro убихиноном Q-9 был обнаружен нами в гепатоцитах крыс. Это свидетельствует о ■ том, что ингибирующее влияние убихинона in yltro проявляется только в отношении С TS рСИДОВ И Нв С 5 Л 3 8Н0 с СбМ8 КОМ «ихрНЫХ кисло т«

Интересно было выяснить влияние убихинонов с короткой боковой цепью (Q-I и Q-2). а также убихинона Q-8. которые не присутствуют в организме крыс, на обмен холестерина в тимоцитах. Учитывая то обстоятельство, что при инкубации тимоцктов с убихиноном Q-9 эффект угнетения синтеза холестерина наблюдался в том случае, когда концентрация Q-9 в среде была не ниже 40 рМ, при инкубации клеток с убихинонами Q-I, 0-2 и Q-8 использовали концентрацию этих препаратов, равную 40 и 100 рМ. Инкубация тимо-цитов с убихинонами Q-I и Q-2 вызывала довольно значительное (примерно в 2.5 раза) угнетение синтеза холестерина в клетках. В этом отношении влияние убихинона Q-8 было не столь заметным, можно сделать вывод лишь о тенденции к подавлению холестериногенеза. Таким образом, обнаружены регуляторные связи между синтезом холестерина в тимоцитах крыс и концентрацией убихинонов во Енекней среде. Интересен тот факт, что убихиноны, не присутствующие в организме крыс даже в следовых концентрациях -Q-I и Q-2 - оказывают угнетающий эффект в отношении синтеза холестерина тимоцктов. Минимальная концентрация убихинона Q-э в инкубационной среде, которая снижает синтез холестерина в тимоцитах (4»10_5М), значительно ниже физиологической концентрации убихинона в сердце, почках и печет крыс, которая составляет в сердце 3*I0~4M [Beyer et al., 1962], в почках и печени 1.5*10 Tí [Beyer, 1962; Grane, 1965). В других тканях млекопитающих, где был обнаружен убихинон, - мышцы, селезенка, легкие, надпочечники, поджелудочная железа - концентрация

убихинона варьирует от 4*1СГ5 до 2*I0~4 М.

Результаты этих экспериментов дают возможность прояснить механизмы регуляции скорости регуляции биосинтеза холестерина убихиноном. Очевидно, что эта регуляция осуществляется путем, не зависимым от синтеза РНК, а также от длины боковой изопреноидной цепи убихинонов. Кроме того, показано, что избыток убихинона не изменяет скорость синтеза ДНК е клетках (ниже.раздел 4). Все это дает основание для вывода о том, что регуляция липидного обмена коферментом Q осуществляется на уровне изменения активности лимитирующего фермента - 3-ОМГ КоА редуктазы - без изменения его синтеза de novo.

3. ВЛИЯНИЕ УБИХИНОНА НА ЛЮЩНЫИ ОБМЕН В ГЕПАТОВДТАХ И

ЖЖВДНЫХ КЛЕТКАХ ЗДОРОВЫХ И ПОДВЕРГНУТЫХ ДЛИТЕЛЬНОМУ ХРОНИЧЕСКОМУ ОБЛУЧЕНИЮ КРЫС

Исследуя регуляторное влияние убихинона на лшзщшый обмен в органах животных, ш показали, что увеличением концентрации убихинона в тканях можно осуществить направленную регуляцию уровня литогенеза, и механизм такой регуляции не изменяет синтез нуклеиновых кислот и, по-видимому, белков в клетке.

Применяя одновременно нагрузки убихинона и ионизирующее воздействие в качестве катализатора возникновения активных форм кислорода в организме, удалось показать, что эта модель является удовлетворительной для исследования регуляторной функции убихинонов по трем основным факторам. Во-первых, ионизирушая радиация не препятствует накоплении экзогенного убихинона в организме; во-вторых, введение избытка убихинона не -угнетает собственный синтез убихинона в клетке и, в-третьих, при облучении не происходит накопление убихинона, как это наблюдается при многих других стрессовых влияниях. Таким образом, облученный организм не в состоянии обеспечить компенезторное увеличение концентрации биоантиоксиданта, столь необходимое в этих условиях.

Очевидно, что регуляторные свойства убихинона проявляются с образованием избытка убихинона в клетках In vivo и In vitro и устойчивое повышение концентрации убихинона в клетках необходимо для осуществления .этих функций. Поскольку инъекции коэнзима Q создают лишь временное увеличение концентрации убихинона в тканях, в дальнейшем применялась диета с 0-9 и хроническое облучение с низкими мощностями доз. так как при остром облучении любая диета неприемлема вследствии высокой радиочувствительности клеток слизистой кишечника.

Хроническое облучение проводили в большой камере размером 5 х 5 х 5 м, экранированной бетоном толщиной в I м и отделенной 10-ти метровым бетонированным лабиринтом. Источник 137Са был размещен у стены за свинцовым экраном и при необходимости убирался с помощью пульта управления, находящегося снаружи.

3.1. Влияние диет с убихинонол на облен мшиОов в изолированных клетках ns'iebu норжиъкых и облученных крыс (8 лг/кг веса Q-9 в сутки; латость дозы - 12.9 сГр/сут, овиря доза - 20 Гр)

После того, как животные получили сушарную дозу 20 Гр (155 суток непрерывного облучения), в гепатоцитах крыс измерялись интенсивности синтеза холестерина и фосфолипидов, а также концентрация фосфолипидов и нейтральных липидов.

Длительное хроническое облучение приводит к достоверному возрастанию холестерина и уменьшению свободных жирных кислот в гепатоцитах крыс. Пищевая нагрузка убихиноном Q-9 снижает повышенный уровень холестерина в печени крыс до уровня ниже контрольного. Концентрация убихинона в гепатоцитах крыс при кормлении Q-9 повышена более, чем в два раза. Возможно, что накопление убихинона в печени крыс при пищевой нагрузке Q-9 оказывается существенным фактором для нормализации уровня холестерина в гепатоцитах облученных крыс, учитывая регуляторную роль убихинона в отношении холестерикогенэза.

Наиболее эффективным сказывается влияние нагрузки убихино-

19

Концентрация фосфолипидов(а) и включение 2-14С-ацетата натрия в фосфолипиды(б) гепатоцитов крыс после хронического облучения и диеты с убихиноном Q-9.

СМ ФХ ФС ФИ КЛ Ф9А Общие

ФЛ

Контроль

а) 3±0.1

б) 28±11

20±0.7 19Т±15

4.7±0.2 18.5±б

Т.2±0.б 33±11

2.5±0.1 2б±8

10±0.4 44±12

77.5*4 863±65

Облучение а) 3.5±0.2

37í8 5.2±0.2

б) 35±9 287±59 33±12*

12.5±0.4* 11±0.3* 9.7±0.2 11б±7* 50±12 149±71* 51.7±21 984±102

Облучение +диета

а) 3.2±0.1 17*0.5

б) 32±)2 95±22*

3.7±0.1 19.4±4

б.2±0.3 48±7

7.5±0.2 26t5

6.7Ю.З 31 ±8*

89±б.9 712±73

Облучение - 12.9 сГр/сутки, общая доза - 20 Гр; диета - 8 мг/кг 0-9 в день, а - мкг/мг белка,б - имп/мин/мг белка.

* - отличие достоверно. р<0.05.

ном в отношении обмена фосфолипидов в гепзтоцитах крыс (табл.3). Заметное возрастание скорости включения меченого ацетата в ФХ. ФС и особенно КЛ гепатоцитов хронически облученных крыс совершена сажается кормлением из убкхкнонсм Q-9. Концентрация большинства исследованных фосфолипидов при нагрузке уашшокои;— снижается, это относится и к суммарной фосфолишшюй фракции.

Что же касается интенсивности включения Н-Ь-серина в фссфолшшды печени, то в опытах ln vivo было обнаружено, что введение убихинона вызывает угнетение синтеза всех исследованных

20

фосфолипидов. Сравнивая эффективность влияния убихинона на обмен фосфолипидов при трехкратном подкожном введении и длительном нероральном применении препарата 0-9 на обмен фосфолипидов, можно сделать вывод о более эффективном воздействии 0-9 при последнем способе применения. Следует отметить, что при длительном кормлении животных убихиноном 0-9 мы не обнаружили угнетение синтеза холестерина в печени, что было показано ранее при трехкрзтном подкожном введении 0-9 [Новоселова и др., 1979]. В данной работе обнаружено, что при длительной пищевой нагрузке убихинон, как и следовало ожидать, накапливается в печени крыс. Однако возрастание количества убихинона 0-9 в печени крыс было более существенным (хотя и непродолжительным), через 2-4 часа после последней инъекции - примерно в 4-5 раз. По-видимому, именно резкое возрастание концентрации убихинона в печени явилось регулирующим фактором, угнетающим холестериногенез.

3.2. Облей литЮов в изолированных клетках лилфоиджг органов (ясность дозы - 12.9 сГр/сут. Обирж доза - в Тр и 20 Гр)

3.2.1. Тилоцит

Тимус является важнейшим органом лимфатической системы животного организма, ответственным за общее состояние иммунитета. Измерение уровня липидного обмена и количественного состава липидов проводили через 2 месяца после содергания крыс в условиях хронического облучения, общая доза облучения достигала 8 Гр.

Измерение количества липидов и интенсивности включения меченого предшественника в холестерин, моноглицериды. диглицериды и свободные жирные кислоты клеток тимуса животных, получивших дозу облучения 8 Гр, не выявило достоверных изменений в обмене нейтральных липидов, тогда как при остром 7-облучении крыс в дозе 4 Гр наблюдаются значительная активация синтеза холестерина и увеличение его концентрации в тимоцитах .

21

Хроническое облучение в дозе 8 Гр приводит к увеличению количества ФХ, ФС, ФИ, КЛ и суммарных фосфолшшдов в тимоцитах крыс. Измерение интенсивности включения 2-14С-ацетата натрия в фосфолипиды показало активацию синтеза ФХ в тимоцитах хронически облученных крыс.

3.2.2. Спленоищы

Хроническое облучение крыс до общей поглощенной дозы 8 Гр приводило к повышению количества моно- и диглицеридов и к активации синтеза диглицеридов и свободных жирных кислот в

Таблица 4

Концентрация нейтральных лшшдов (а) и включение 2-14С-" ацетата натрия (б) в нейтральные липиды клеток селезенки крыс после хронического облучения и нагрузки убихиноном.

ДГ СЖК ЭХ Q-9

X

Канщюлъ а 12.5±0.б б 604±95 Облучение

15.2±0.Т* 989*87*

а б

8.7±0.2 659±88

68.4*0.12 1739±150

65.2±9 1124±105* 2326±128*

б.7±0.2

с*

Облучение' * Q-9 a 14.U0.4 б--540±101_

б.3±0.3 _119±21*

74.5±9 2052*140

9.2±0.4 331±38

6.3 t0.4* 418±45*

8.110.5 265±51*

0.14*0.02

0.1Т±0.01

0.47±0.03

а - мкг/мг белка; б - имп/мин/мг белка. Облучение - 12.9 сГр/сутки, общая доза - 20 Гр; диета - 8 мг/кг 0-9 в день.

* - отличие достоверно, р<0.05

22

клетках селезенки. Показатели обмена холестерина в эти сроки не отличались от контрольных уровней также, как и втикоцитах.

Измерение концентрации и радиоактивности отдельных фосфолипидов в клетках селезенки показало увеличение концентрации ФС и КЛ и активацию скорости синтеза ФС, ФИ и суммарной фракции фосфолипидов. Концентрация и скорость синтеза основных фосфолипидов - ФХ и ФЭА, а также СМ не изменялись в клетках селезенки под действием 7-сблучекия в дозе 8 Гр.

При увеличении срока экспозиции животных в условиях хронического облучения до суммарной дозы 20 Гр изменения концентрации и скорости синтеза липидов были более значительными, чем при меньшей дозе. Показаны активация скорости синтеза холестерина, диглицеридов, свободных жирных кислот и общей фракции липидов, а также возрастание количества общего холестерина и снижение количества этерифщированного холестерина и диглицеридов в спленоцитах облученных животных (табл.4). Применение убихинонз-9 в условиях хронического облучения приводило к снижению радиационной активации синтеза холестерина (общего и этерифишрованного), суммарной липидной фракции и диглицеридов до контрольного уровня и ниже. При этой дозе хронического облучения (20 Гр) наблюдали существенную активацию синтеза СМ, ФХ и общей фракции фосфолипидов и тенденцию к активации синтеза ФС (тзбл.5).

Воздействие убихинона выражалось в нормализации радиационной активации синтеза фосфолипидов и снижении количества общих фосфолипидов в клетках селезенки облученных крас. Как видно из таблицы 4, кормление хронически облученных крыс убихиноном-9 приводит к 3-х кратному увеличению концентрации убихинона в селезенке животных. По-видимому, этим и объясняется регулирующее влияние убихинона-9, выраженное в подавлении скорости синтеза холестерина и фосфолипидов в клетках селезенки облученных крыс.

Включение 2-14с-ацетата натрия в фосфолипиды селезенки крыс после хронического облучения и диеты с убихиноном 0-9.

СМ ФХ ФС Ш КЛ ФЭА Общие

Ф,Т

Конт- 157±21 981±121 183±28 93*11 б9±15 21Т±54 2950±140 роль

Облу- 245±32* 2130±156* 274±34 125±34 71±19 203±61 3682±156 чение

Облу- 154±29 907±87 149±20 99±17 73±14 234±42 2859±138

чекие + 0-9

Облучение - 12.9 сГр/сутки, общая доза - 20 Гр; диета 8 мг/кг 0-9 в день. * - отличие достоверно. р<0.05;

3.2.3. Клетки костного лозга.

В костном мозге крыс, подвергнутых хроническому облучению до суммарной дозы 20 Гр, показаны увеличение интенсивности включения меченого предшественника в холестерин и свободные жирные кислоты, а также рост концентрации холестерина, диглице-ридов и свободных жирных кислот (табл.6). Нагрузка убихиноном облученных крыс снимает радиационную активацию синтеза холестерина и нормализует его количество в клетках костного мозга крыс. Влияние убихинона на обмен фосфолипидов в костном мозге облученных крыс выражалось в снижении радаоактизностей молекул ФХ и ФЭА~д6~уровией~ее2с--контрольного и_ угнетении включения меченого предшественника в ФИ и суммарную фракцию^фосфолипидов —

*фаЛ Т1 7 \ Фокт-гм лЛраог\м и о хгтто'тч^сут упп'Гиг^-пг, илчп« ипДптооф^а

пострадиационное возрастание включения меченого предшественника в ряд нейтральных тшдов и основные фосфолипиды. Применение убихинона вызывает процессы угнетения интенсивности включения метки в липиды клеток костного мозга облученных крыс.

Концентрация нейтральных лшшдов (а) и включение 2-14С-ацегата натрия (б) в нейтральные лкпвды клеток костного мозга после хронического облучения и нагрузки убихиноном.

холестерин

диглицериды свободные обпще липиды жирные к-ты

Ю.6±0.71 1510±1£4

Облучение а 12.3±0.32*

б 2025*132*

Облучение + диета а 9.3±0.5

О 1147±98

6.7 ±0.2 82.4 ±18

10.8 ±0.2* 82.8 ±21

11.3 ±0.21 71.3 ±17

48.8 ±10 2169 ±205

102 ±14* 3553 ±198

117 ±15*

3234 ±245* 31706 ±1058;

*

44587 ±2110

46090 ±1185

*

а - мкг/мг белка; б - имп/мин/мг белка. Облучение - 12.9 сГр/сутки, общая доза - 20 Гр; диета - 8 мг/кг 0-9 в день.

* - отличие достоверно, р<0.05

Очевидно, что 7-облучение животных с низкой шцносты) дозы обладает гораздо меньшей эффективностью в сравнении с острым облучением животных при равной суммарной дозе облучения. Ранее мы покззали, что при остром облучении животных в дозе 4 Гр обнаруживается заметная активация холестериногенеза в лимфоцитах периферической крови и тимуса и накопление холестерина в этих клетках (Новоселова и др., 1985; Новоселова и др.,1986). Хроническое облучение животных до суммарной дозы 8 Гр не вызывает изменений уровня синтеза холестерина в лимфоцитах тимуса и селезенки. При этой же дозе облучения животных обмен фэсфолипидов в лим^оидных клетках оказывается более радиочувствительным, наблюдается активация синтеза ряда фосфолипидов и тенденция к возрастанию концентрации

Концентрация фосфолипидов(а) и включение 2-14С-ацетвта натрия е фосфолипиды(б) клеток костного мозга крыс после хронического облучения и диеты с убихиноном 0-9.

СМ ФХ ФС ФИ КЛ ФЭА Общие

ФЛ

Контроль

а) 3.1±0.6 14±0.7 11±0.7 12*0.4 6±0.2 10.5*0.8 66.5*7

0) 212±5< 1874*149 294±62 297*51 267±58 300±45 31759±140 Облучение

а) 2.8*0.8 15±0.6 11.3*0.5 11.7*0 6.4*0.4 10*0.8 60.9*9

б) 258*67 2924*118* 357*81 304*71 301±73 784*110* 33490*1340

Облучение +диета

а) 3*0.5 10±0.2 10.8*0.8 5.2*0.3 7.1*0.5 5.6*0.3 52.5*5

*

б) 237*58 1512*143 234*48 269*28 246*98 405±98 2276*659

Облучение - 12.9 сГр/сутки, общая доза - 20 Гр:

диета 8 мг/кг 0-9 в день, а - мкг/мг белка,б - имп/мин/мг белка.

* - отличие достоверно, р<0.05.

фосфолипидов в клетках облученного организма. Существенным является и то обстоятельство, что в клетках облученных животных значительно возрастает концентрация ФС, который, как известно, является самым эффективным среди фосфолипидов - стимуляторов протеинкиназы С; в клетках селезенки и костного мозга показано 1гвеличение"количестБз-ДГ, присутствие—которого_необходаю для функционирования фосфатидилинозитольного цикла.

Таким образом, показано, что регуляторное влияние убихинона в отношении биогенеза мембран затрагивает различные клеточные системы; это дает основание предполагать надежность регуляции убихиноном клеточного гомеостаза. Одним из проявлений такой

26

регуляции на уровне целого организма является радиозащитный эффект убихинона в условиях острых ионизирующих воздействий и улучшение физиологического состояния животных при хронической экспозиции- Последнее проявлялось в том, что отставание в весе у хронически облученных крыс, получавших убкхикон с пищей, било достоверно ниже, чем у животных, имевших обычный рацион.

Известно, что 7-облучение животных, в том числе и хроническое, является сильным иммунодепрессивным фактором и ведет к резкому повышению частоты образования злокачественных образований у животных. № полагали, что наряду с регуляторным и нормализующим действием убихинона 0-9 в отношении липидного обмена животных в условиях постоянного облучения не исключена возможность активации иммунной системы крыс, получающих убихинон.

4. ВЛИЯНИЕ УБИХИНОНА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ Т- И В-ЛИМЮШТОВ СЕЛЕЗЕНКИ КРЫС в кои®; И ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ОБЛУЧЕНИИ

Роль липидов в генерации иммунного ответа клеток очевидна, по крайней мере, по двум причинам. Во-первых, нормальная функциональная активность иммунокомпетентных клеток в большой степени зависит от лкпидкого состава мембран, который определяет необходимые параметры "текучести" или микровязкости этих мембран, как условие норальной реакции клетки на действие митогенов. Имеются многочисленные доказательства того, что липидное окружение оказывает непосредственное влияние на мембранные белки, более того, существует концепция "оптимальной текучести" мембранных липидов для осуществления физиологических функций клеток [Traill, Wick, 1984]. Во-вторых, клетки, вовлеченные в генерацию специфического иммунного ответа, также могут быть подвержены неблагоприятному воздействию свободных радикалов, липидных перекисей и других продуктов, образованных в

процессе окислительных реакций. Безусловно, активные формы кислорода возникают и в здоровом организме, однако в нормальных условиях они перехватываются антиоксидантами, присутствующими в клетке в достаточных количествах. Стрессовые воздействия, которые приводят к усилению образован!« свободных радикалов и липидных перекисей и/или к дефициту антиокислителей в тканях, резко подавляют одну из основных функций иммунной системы, направленной на предотвращение канцерогенеза. Известно, что ионизирующее излучение в малых дозах увеличивает вероятность появления патологических состояний организма, связанных с поражением иммунной системы, особенно это касается повышения частоты образования злокачественных опухолей. К настоящему времени имеется большое число работ, в которых изучалось влияние однократных ионизирующих воздействий на лимфоциты животных, как на наиболее радиочувствительные к ионизирующей радиации клетки. Такие воздействия, как правило, вызывают поражение радиочувствительных клеток, что хорошо проявляется изменением основных функциональных показателей их жизнедеятельности СЯрилин и др., 1990, 1994; Pechatnikov et al, 19861.

Известны многочисленные эпидемиологические исследования по мониторингу участников радиационных аварий [Awa, 1975; Bloom et al.. 1983; Langolls et al., 1987; Bloom et al., 19881, которые, несомненно, имеют основной недостаток, связанный с трудностями по точному определению мощности дозы и времени воздействия радиации для различных групп населения. Более успешными представляются исследования, выполненные на животных и культурах клеток, когда есть возможность дозиметрировать интенсивность воздействия.

В данной "главе будут списаны результаты исследования влияния диеты с убихиноном на функциональное состояние Т- и Ь-лим^оцитов селезенки крыс, находящихся в условиях постоянного 7-облучения с низкими мощностями доз.

4.1. Хроническое облучение (лащпоаяь дозы 12.Э сТр/сут) 4.1.1. т-лиифаиут

Измеряли дозовую зависимость скорости пролиферации нести-мулированных Т-лимфоцитов селезенки крыс в условиях воздействия постоянного внешнего 7-облучения с мощностью 13.9 сГр/сут в течение 77 дней до получения животными общей дозы ионизирующего излучения 10 Гр. № подтвердили стимулирующий эффект ионизирую-, щего излучения в отношении скорости пролиферации Т-лимфоцитов. По мере увеличения времени экспозиции животного в радиационном поле более 23 дней стимулирущий эффект уменьшался и при общей дозе 10 Гр наблюдали угнетение включения меченого тимидика в нестимулированные клетки.

В этом же интервале доз определяли способность Т-клеток облученных крыс активироваться при добавлении в среду культивирования митогена Кон А. На рис.6 показана динамика изменения митоген-стимулированной пролиферативной активности Т-лимфоцитов селезенки облученных крыс по отношению к контрольным. При всех дозах (за исключением доз I и 3 Гр) наблюдается уменьшение реакции бласттрансформации под влиянием Кон А в культуре Т-лимфоцитов облученных животных. Такая бимодальная закономерность изменения уровня функциональной активности клеток при действии малых доз ионизирующей радиации наблюдалась и для многих других объектов.

Таким образом, измерение уровня клеточного иммунитета In vitro показало, что у облученных крыс происходит уменьшение иммунного ответа в культуре Т-лимфоцитов селезенки при всех дозах облучения, кроме доз I и 3 Гр. При сравнении изменений клеточности (количества всех лимфоцитов) селезенки со способностью клеток активироваться под влиянием митогенов обнаружено, что подъем числа лимфоцитов через 23 дня (доза 3 Гр) полностью совпал со временем пика уровня клеточного иммунитета,

Рис.6 Влияние хронического облучения (12.9 сГр/сутки) на пролиферативный индекс Т-лимфоцитов селезенки крыс. Пролиферативный индекс определяли по отношению включения ^-тимидина в стимулированные Кон А клетки к включению%-тимидина в нестимулированные лимфоциты. По оси абсцисс- доза облучения, Гр.

который был угнетен в течение всего диапазона доз ионизирующего воздействия, когда наблюдалась значительная лим$опения селезенки.

4.1.2. в-лшфмщн

Уровень пролиферации В-клеток облученных крыс не отличался-существенно от контрольных значений и лишь при дозе 3 Гр показано достоверное незначительное увеличение уровня включения ®Н-тимидина в культуре В-клеток селезенки облученных крыс.

Более важным нам казалось выяснение вопроса о соотношении радиочувствительности Т- и В-лтфоцитов в условиях хронического облучения. Отношение количества Т-клеток к В-клеткам было выше

контроля при облучении дозой I Гр, а при облучении дозами 2, 3 и 6 Гр оно было ниже контрольных значений. Это показывает, что относительная уязвимость В-лимфоцитов к хроническому воздействию радиации выше при облучении до дозы I Гр. а при дальнейшем облучении более уязвимыми становятся Т-лимфоциты. По-видимому, в данном случае важен фактор времени, а не дозы, поэтому большая поражаемость В-лимфоцитов по сравнению с т-лимфоцитами наблюдается раньше.

4.2. Хроническое облучение (лютость дозы 3.0 сГр/суши) и диет с убихтопол Э.

Хроническое облучение с мощностью дозы 3 сГр/сут вызывало уже на 19-й день (общая доза 57 сГр) угнетение пролиферативной активности Т-лимфэцитов селезенки, которое оставалось зачетным через 47 дней после пребывания животных в радиационной камере и которое нормализовалось через 68 дней облучения, когда суммарная дозэ % полученная %5воткыми, достигзлз 204 сРп« Если сп8вккть с дина?шкой изменения включения "^Н-тимидина в Т-лим$оциты после облучения с более высокой мощностью дозы, то, очевидно, что, несмотря на противоположный эффект облучения (наблюдается активация пролиферативной активности), нормализация скорости

Р'ог'Ттлпг ггтггучой'лтлй тгплтттггТюпотттг Т—V по фпхг ттгулпгп^^^т'т» ттптгмотгт-) в

одни и те же сроки (63-й и 68-й день).

При суммарных дозах облучения 57 и 204 сГр (19 и 68 суток) иммунологический статус Т-лимфоцятов облученных крыс не отличаете, от контроля, тогда как экспозиция животных в течение 47 суток вызывало полную утрату способности Т-клеток селезенки активироваться митогеном. Применение диеты с убихиноном в этих условиях сохраняло величину иммунного ответа лимфоцитов облученных крыс почти на уровне контроля (Рис.7).

31

контроль Г контроль+Кон А

облучение ^

ъ

ослучеиие+Кон А оопучение+й

облучение+йд+Кон А

-тишдина (имп/мин я

10 20 30 40

включение 3Н-т

103)

Рис.7 Нормализация иммунного ответа Т-лимфоцитов облученных крыс диетой с убихиноном 0-9. а-контроль,в-облучение, с-облучевие+диета. Мощность дозы 3.0 сГр/сутки.общая доза 141 сГр. я

По оси ординат - включение 3Н-тимидина,имп/мин/0.5»10 клеток.

_____ J^_здopoвыx крыс диета с убихкноном-э не вызывала изменения

включения меченого "тимидкна- в -Т- — и В-лиьфоциты,_однако

митоген-стимулированная пролиферация была значительно усилена, что свидетельствует об иммуномодулирувдей способности кофермента-0.

32

4.2.2. В-лилфоцит,

•5

Измеряли интенсивность включения Н-тимидина в В-лимфоциты селезенки крыс через 68 суток после хронического облучения и диеты с убихиноном (Табл.8). Показано, что скорость пролиферации В-клеток облученных крыс возрастает более чем в 4 раза, а диета с убихиноном восстанавливает уровень включения меченого тнмкдина в В-клетки облученных животных. Пострадиационное уменьшение отношения Т/В частично восстанавливается после нагрузки убихиноном (Табл.8).

Таблица 8

Влияние хронического облучения с мощностью дозы 3.0 сГр/сутки, общая доза 204 сГр и диеты с 0-9 на включение 3Н-тюявдша в В-лимфоциты и отношение Т/В.

Контроль Облучение Облучение + диета с 0-9

®®/0.5хЮ6 клеток 958±?2 Т/В 6.21 ±0.43 4139±425* 2.58±0.19* 1155 ±176 3.86 ±0.28*

Крысы получали 8 мг 0-9 на кг веса в день.

о с

Включение Н-тимидина выражено как имп/мин/0.5»10 клеток. Каждое значение - среднее из 3-9 измерений. * - отличие достоверно, р<0.05

Таким образом, уменьшение мощности дозы хронического воздействия от 12.9 до 3 сГр/сут не изменяет реакцию В-клеток на облучение, как это показано выше для Т-лимЕоцитов в отношении изменения скорости нестимулированной пролиферации. Интенсивность зролиферации В-клеток увеличивается при воздействии радиации с мощностями доз 12.9 и 3 сГр/сут .

4.2.3. ЛигшОтй состав Т-лшфлтов селезенки крыс (Оигяа с уоихшюнол, общзя воза облучения 141 сТр).

В целых лимфоцитах соотношение разных классов лишдов (за исключением СЯК) соответствует соотношению этих молекул в плазматических мембранах. Мы определили липидный состав Т-клеток селезенки крыс через 47 дней экспозиции в радиационном поле и диеты, обогащенной убихиноном. Обнаружено двукратное возрастание количества холестерина и свободных жирных кислот, а также некоторое накопление фосфолипидов, за исключением ФС (Табл.9).

Следует заметить, что обычно возрастание концентрации холестерина в свободных жирных кислот в клетках наблюдали также при остром однократном облучении животных (Новоселова, 1979).

Таблица 9

Влияние диеты с убихиноном 0-9 и хронического облучения на липшшый состав Т-лимфоцитов селезенки крыс (мкг/мг белка)

ХОЛ МГ СЖК Общие ФХ ФС ФИ ФЭА

Ш

Катроль

11*0.1 6.4*0.8 30.3*2.2 64*7 13*1.3 6.0*0.4 5.6*0.4 8.4*0.7

Облучение

22*0.2* 8.1*0.5 75.8*6.3* 70*5 18*1,5 3.8*0.3* 5.8*0.5 10.3*0.5

Облучение + 0-9

---16*0.2 9.2+1.0 29.1*3.4 70*8 18*1.3 5.3*0.4 4.9*0.4 10.5*0.?

Облучение - 3.0 сГр/сутки, общая доза - 141сГр; диета - 8 мг/кг 0-9 в день. Каждое значение - среднее 3-х экспериментов.

* - отличие достоверно, р<0.05

34

Таким образом.была обнаружена одинаковая направленность действия радиации с высокой и низкой мощностями доз. Очевидно, [то диета с убихиноном снимает пострадиационное накопление щрных кислот и холестерина в Т-лимфоцитах селезенки.

Известно, что молярные соотношения липидов в плазматических юмбранах точно соответствует микровязкости этих мембран, шределяемой поляризационным методом [Ruber et al.. 1991].

Молярные соотношения липидов, которые положительно :оррелируют с микровязкостью мембран, представлены в таблице 10. (чевидно, что при хроническом ионизирующем облучении возрастает ксткость плазматических мембран Т—лиг-л^оцятов, а применение ■бихинона оказывает нормализующее воздействие. ' Заметное вменение физико-химических параметров мембран (возрастание Екровязкости) коррелирует с угнетением функциональной ктивности лимфоцитов, и в этом случае диета с убихиноном «останавливает величину иммунного ответа Т-лимфоцитов (Рис.7).

Таблица 10

Молярные отношения липидов Т-лимфоцитов селезенки крыс после хронического облучения (3.0 сГр/сутки, общая доза - 141 сГр) и диеты с Q-9.

оздействие 1/ФЛ Х/ФХ Х/ФЭА ФЭА/ФС

онтроль 0.329 ±0.3 0.78 ±0.05 2.10 ±0.15 0.90 ±0.07

блучение 0.601 ±0.6* 1.09 ±0.09* 2.60 ±0.18 2.23 ±0.08*

блучение 0.43 ±0.4 0.76 ±0.06 1.49 ±0.09* 1.80 ±0.02*

0-9

Средние значения из трех экспериментов, * - различие достоверно, р<0.05

>

Очевидно, восстановление избытком экзогенного кофермента О ^иммунного статуса Т-клеток селезенки облученных крыс позволяет заключить, что регуляторы липидного обмена, способные нормализовать липидный состав мембран, оказывают непосредственное влияние на функциональную активность клеток.

вывода

1. Доказано, что регуляция коферменгом 0 обмена холестерина в клетках осуществляется на уровне лимитирующего фермента 3-оксиметилглютарил КоА редуктазы и не зависит от скорости синтеза РНК и ДНК в клетке и от длины боковой цепи молекулы убихинона.

2. Установлена внутриклеточная локализация регуляторного влияния убихинона на обмен лищдов в клетках печени. Механизм контролирования убихиноном биосинтеза холестерина не зависит от степени этерификации холестерина,что является определяющим при известной регуляции холестериногенеза по типу "отрицательной обратной связи".

3. Регуляция биосинтеза фосфолипидов печени убихиноном осуществляется путем подавления скоростей реакций обмена оснований и угнетения скоростей распада этих молекул.

4.-Обнаружена_закономерность влияния острого однократного ионизирующего воздействия в широком диапазоне доз на синтез липидов 1п Yit.ro в изолированных клетках радиочувствительных тканей. Летальные и сублеталыше дозы облучения, вызывающие массовую гибель радиочувствительных клеток (лимфоидных и эпителиальных) вызывают угнетение синтеза холестерина и фосфолипидов и уменьшение холестерина в мембранах. Дозы

36

облучения порядка 4 Гр и менее, после которых возможно восстановление популяции, вызывавт пострадиационную активацию биосинтеза липидов.

5. Установлено, что длительная (в течение 5 месяцев) диета, обогащенная убихиноном 0-9, способствует полном!' снятию радиационной активации синтеза фосфолипидов и нормализации уровня холестерина печени крыс, находящихся под непрерывным воздействием радиационного поля. Применение убихинона в условиях хронического облучения ведет к угнетению скоростей синтеза холестерина и фосфолипидов в клетках лимфощшх органов (тимус, селезенка, костный мозг) и способствует нормализации соотношений разных классов липидов в мембранах этих клеток.

6. Показано усиление реакции бласттрансформации Т-лимфоцитов селезенки крыс, получающих экзогенный убихинон. ИМмуномоду-лирувдая способность убихинона проявлялась в нормализации иммунного ответа Т- и В-лимфоцитов крыс, подвергнутых длительному хроническому ионизирующему воздействию, а также в частичном восстановлении клеточности этого органа, опустошенного после экспозиции в радиационном поле.

7. Доказано,что регуляция экзогенным убихиноном активности липид-синтезирущих ферментов многих клеточных систем в условиях лучевой патологии направлена на востановление уровня обмена липидов в мембранах. Нормализация убихиноном микровязкости плазматических мембран коррелировала с восстановлением функциональной активности клеток. •

37

Сшсок публикаций

1. Новоселова Е.Г., Коломийцева И.К., 1976. Ранние радиационные нарушения метаболизма холестерина, сквалена и убихинона в печени крыс. Радиобиология, 16. стр.606-609.

2. Kolomlytseva I.K., Kovosslova E.G.. Kuzln A.M. 1975. Participation or Isoprenolds In primary radiation reaction of an organism. Studla Blophyslca, 53. 141-142.

3. Новоселова Е.Г. 1979. Активация биосинтеза убихинона в печени крыс при 7-облучении и нагрузках убихиноном-9. Радиобиология, 27, стр.411-413.

4. Новоселова Е.Г., Перепелкина Н.И., Коломийцева И.К., Самохвалов Г.И., Обольникова Е.А. 1979. Нормализация убихино-ном-9 липидного состава микросом печени облученных крыс. Радиобиология, 19, стр.572-576.

5. Коломийцева И.К.,Новоселова Е.Г.,Нуруллаева Г.Э. и др. 1973. Регуляция убихиноном обмена холестерина в норме и при лучевом поражении. Радиобиология, 19, стр.8-13.

6. Коломийцева И.К., Новоселова Е.Г., Казначеев и др. 1979. Биосинтез и межмембранный перенос липидов, как факторы постлучевого восстановления мембран. Инфорл.бюлл. "Радиобиология", 22, 30-32.

7. Маркевич Л.Н., Новоселова Е.Г.. Перепелкина Н.И..Коломийцева И.К. 1979. Влияние убихинона-9 на количество холестерина в органах 7-облученных крыс. Радиобиология. 19, стр.614-618.

8. Коломийцева U.K., Новоселова Е.Г., Обольникова Е.А. и др. 1980. Угнетение биосинтеза сфжнгокиелина в печени крыс при 7-облучении и нагрузках убихиноном 0-9. Докл. АН СССР, 251,

_____стр.240-242.

9. Коло!^цёва~И.КГ,^Казначсгв-1).С..-__Ковоселова Е.Г. 1980. Угнетение метаболизма эфиров холестерина в органеллах~ печени-7-облученных крыс. Радиобиология, 20, 519-523.

ТО W^rrwtrncxaTjQ "Р Ч Xtrs М W \Jr\x>c\c(b пгшо 7? Р Wт/отжи А М

i. Ja ILj ¿> J X > V • g !_>!_» f liWUWWb'Wl^lJU Л-1 a A a fivjwlUl A • >U a

1983. Биосинтез холестерина в тканях облученных крыс. Докл.АН СССР. 270. Стр.741-742.

11. Новоселова Е.Г. 1984. Угнетение включения 2-14С-ацетата ео фракцию свободных стеринов гепатоцитов под влиянием убихинона-9. укр.биохим.курн., 56. стр.199-202.

12. Новоселова Е.Г., Коломийцева й.К. 1985. Обмен фосфолипидов в органах 7-облученных крыс. Радиобиология, 25, 328-332.

13. Новоселова Е.Г., Коломийцева И.К.. Обольникова Е.А., и др.,

1985. Влияние убихинона на общий обмен фосфолипидов при лучевом повреждении. Бюлл.эксп.биол. мед.,49, 440-442.

14. Новоселова Е.Г., Кулагина Т.П.. Потехина Н.И., и др.,1985. Обмен холестерина в клетках крови облученных крыс. Докл.ДШ АН СССР, 284 , 510-512.

15. Коломийцева И.К., Новоселова Е.Г., Потехина и др. 1985. Терапевтическое действие растительных масел и убихинона-9 при лучевом поражении. Радиобиология, 25, стр.53-58,

16. Коломийцева .И.К.,Новоселова Е.Г.. Потехина Н. И. я др., 1984. Убяхинон-9. Влияние на липидннй обмен и радиационную гибель Препринт, Пувшно.сс.29

17. Новоселова Е.Г.. Кулагина Т.П.. Коломийцева И.К. Кузин A.M.

1986. Синтез липвдов в тидацитах облученных крыс. Радиобиология. 26. I7I-I74.

18. Kolomiytseva I.X., Novoselova E.G., Kulaglna Т.P.. Kuzln A.M. 1987. The elfect oi Ionizing radiation on lipid metabolism to lymphoid cells. Int. J. Radlat. Biol. 51, 53-58.

19. Коломийцева И.К., Новоселова Е.Г.. Кулагин а Т.П.и др.,1986. Липидный обмен в тканях крыс при дозах облучения, вызываниях интерфазную гибель клеток. Радиобиология, 26, стр.313-317.

20. Новоселова Е.Г., Колокийцева И.К., Самохвалов Г.И., и др.

1987. Роль убихинона в регуляции лкпидного обмена в клетках крыс. Информ.бдял. по проблемам радиобиологии, 3, стр.35-36.

21. Петруняка В.В.. Новоселова Е.Г., Мусиенко B.C. 1987. Участие кальция в регуляции метзболизма липидов в облученных тимоцитах. Информ.бюлл.по пробл.радаобиологии, 34, 51-52.

22. Новоселова Е.Г. 1987. Влияние убихинонов на обмен липидов в тимоцитах крыс. Деп.ВИНЙТИ, Н8863-В87.

39

23. Novoselova E.G. 1989. The role or ubiquinone In the regulation or lipid metabollsa In rat thymocytes. FEBS Lett., 249, 371-374.

24. Новоселова Е.Г. 1989. Роль убихинонов в регуляции липидного обмена в тимоцитах крыс. Биохимия, 54, стр.27-32.

25. Новоселова Е.Г., Корсунский О.Ф., Коломийцева И.К. и др. 1990. Радиопротекторные свойства убихинонов при остром и хроническом облучении крыс. Радиобиология, 30, стр.774-777.

26. Новоселова Е.Г. 1991. Обмен фосфолипидов в лимВоидных клетках в отдаленные сроки после сублетального т-облучения крыс. Радиобиология, 31, стр.352-356.

27. Новоселова Е.Г. 1992. Липидный обмен в клетках слизистой кишечника в ранние и отдаленные сроки после т-облучения крыс. Радиобиология, 32, стр.134-142.

28. Новоселова Е.Г. 1992. Липидный обмен в тканях крыс при хроническом действии т-облучения и убихинона-9. Биохимия, 57, стр.531-538.

29. Novoselova E.G., Gordon R.Ya., Safonova M.V. 1993. The prollleratlve response of T- and B-cells alter prolonged low-dose Irradiation. In: 25th Ann.Meet.Eur.Soc.Rad.Biol., Stocholm, P0823.

30. Новоселова Е.Г..Сафонова H.B. 1994. Функциональная активность Т- и В-лим$оцитов селезенки крас в условиях постояного воздействия т-радиации с низкой мощностью доз. Радиац.биол. Радиоэкол., 34, стр. 407-413.

31. Novoselova E.G., Safonova M.Y., Gordon R.Ya., Semlletova N.V. 1994. The tame function of spleen lymphocytes of rats subjected to chronic Irradiation and ubiquinone 0-9 diet. Int.-J.-Rodlat.-Blol._(In press). _

40

12.10.94 г. Зак.6286Р. Тир.100 экз. Уч.-изд.л. 2.0 Отпечатано на ротаринте в ОНИ ПНЦ РАН