Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез кофермента А в метаболической активности производных пантотеновой кислоты

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез кофермента А в метаболической активности производных пантотеновой кислоты"

- n

i u

, л V РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ имени А.Н. БАХА

На правах рукописи

УДК 577.151.33:577.164.14:612. 015.6

МОЙСЕЕНОК АНДРЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ

БИОСИНТЕЗ КОФЕРМЕНТА А В МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОИЗВОДНЫХ ПАНТОТЕНОВОЙ КИСЛОТЫ

03.00.04 "БИОХИМИЯ"

ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК В ФОРМЕ НАУЧНОГО ДОКЛАДА

МОСКВА, 1996

Работа выполнена в Институте биохимии АН Беларуси

Официальные оппоненты:

член-корреспондент АН Беларуси, профессор, доктор биологических: наук В.Н. Решетников

член-корреспондент АТН, профессор, доктор биологических наук В.Б. Спиричев

профессор, доктор биологических наук В. А. Пасешниченко

Ведущая организация:

Научно-производственное объединение "Витамины"

Защита состоится 1996 г. в 10 часов на засе-

дании специализированного совета Д 002.96.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (117071, Москва, Ленинский пр., 33, корп. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский пр., 33, корп.1)

Диссертация разослана " ¿0" С£1Ш7ЪЛ£>/иЯ-\996 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

Т.А. Валуева

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди проблем современной биохимии и витаминологии, относящихся к изучению механизмов поддержания метаболического гомеостаза, одно из важнейших мест принадлежит системе ко-фермента ацетилирования (СоА). Многочисленность и разнообразие СоА-зависимых ферментативных реакций открывает широкие перспективы для направленной (коферментной) регуляции метаболизма, однако реализация данного подхода ограничивается недостаточным уровнем знаний о биосинтезе СоА, механизмах стабилизации внутриклеточного фонда (фракций) кофермента,■ возможности использования предшественников его биосинтеза для регуляции уровня свободной формы СоА. Несмотря на методологические сложности, препятствующие детальному изучению предшественников и промежуточных продуктов биосинтеза СоА, достигнут определенный прогресс в изучении ферментов биосинтеза кофермента, ряда СоА-зависимых ферментов, чему способствовала разработка оригинальных методов получения фрагментов СоА (Skrede, 1973; Abiko, 1975; Robishaw, Neely, 1981; И.Б. Лихциер, В.Б. Спиричев. 1974; А.Я.Розанов, 1976; В.М.Копелевич, В.И.Гунар, 1988; Копелевич, 1991). В последние годы внимание специалистов сосредоточилось на внутриклеточных этапах формирования и стабилизации системы СоА, ее взаимодействия с относительно недавно открытым и пополняющимся классом пантотенатбелковых комплексов, прежде всего, относящихся к главному СоА-аккумулирущему компарт-менту клетки - митохондриям ( RoDisfcaw, Neely, 1985; Tahiliani, Beinlich, 1991; Huth et al.,1991; Schwerdt, Moller, Huth, 1991; Brass, 1994; А. Я. Розанов. 1976; А. Г. Мойпеенок, 1980; А. Г. Халму-радов, В. Н. Тоцкий, Р. В. Чаговец, 1982; Л.М. Карпов, 1994).

Формирование внутримитохондриального фонда СоА связывается с ключевой ролью ФПН. идентифицированного в значительных количествах в клеточном материале, субстрате для бифункционального

Список использованных сокращений: АПБ - ацилпереносящий белок, АФ - N-ацетилтрансфераза, ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная xdома-то графня, ГАМК - К-аминсмасляная кислота, ДТТ- дитиотройтол, ДЦА-СоА - длинноцепочечные ацил-СоА, KP(КНР)-СоА - 'кисло-то (не)растворимый СоА (фракция), КРА-СоА - кислоторастворимые ацил-СоА (короткоцегочечные ацил-СоА), КГД - 2-оксоглутаратдегид-рогеназа, ПАБК - пара-аминобензойная кислота, ПАК - пантотеновая кислота, ПБК - пантотенатбелковые комплексы, 1IJI - пантенол, ПТ(ПН) - пантетин (пантетеин), ФПН - 4-фосфопантетеин, ФПК -4'-фосфопантотеновая кислота, ФТА - фосфотрансацетилаза.

СоА-синтетазного комплекса митохондрий и являющемуся простетичес-кой группой фосфопантетинпротеидов (Larrabee et al..1965; Yol-pe, Vagelos, 1973; Ю.М.Торчинский, 1977). Важным элементом биосинтеза СоА из ФПН постулируется ферментативная система биосинтеза последнего путем прямого фосфорилирования ПТ (АТФ:пантете-ин-4'-фосфотрансферсза, КФ 2.7.1.34) (Movelli, 1953, 1954; Brown, 1960; Roblshaw, Neely, 1984, 1985). Изначально предполагаемая непроницаемость внутренней митохондриальной мембраны (Domschke, Liersch, Decker, 1971) в последние годы была опровергнута, что инициировало изучение механизма прямого транспорта СоА через ми-тохондриальные мембраны с участием специфической СоА-транспорти-рующей системы (Tahiliani, 1989, 1991; TaMllani, Keene, Kaplan, 1992), однако оставило открытым вопрос о соотношении специфического транспорта СоА с альтернативным транспортом ФПН или дефос-фо-СоА. Роль последнего в формировании внутримитохондриального фонда СоА представляется особенно убедительной, поскольку дефос-фо-СоА-киназа митохондрий локализована на наружной поверхности внутренней митохондриальной мембраны (Skrede, Halvorsen, 1979, 1983; Tahiliani, Neely, 1987).

Все чаще наблюдаемые в медицинской и ветеринарной практике болезни витаминной недостаточности, вызванные алиментарным дефицитом ПАК, либо нарушением метаболизма коферментной формы, неэффективность и трудоемкость существующих методов диагностики витаминного дефицита и механизмов его развития обусловливают необходимость поиска адекватных и эффективных подходов, диагностики, профилактики и лечения, прежде всего, на основе изучения функционирования системы кофермента А и ее взаимодействия с каскадом ферментов биосинтеза. В этом плане существуют особенно большие трудности, исходя из относительной ограниченности спектра выбора методов для анализа пантотената или ПАК-содержащих метаболитов в отличие от расширенных возможностей исследования самого СоА и ацил-СоА (Decker, 1959; Hotzel, 1980; Isler, Brubacher, 1982; Bieber, 1992; А.Г. Мойсеенок, 1979, 1984).

Широкий поиск лекарственных и витаминных средств в ряду производных ПАК, всестороннее использование фармакотерапевтических свойств производных витамина,таких как ПТ, ПЛ, ПАК-содержащих лекарственных форм (Szorady. 1967; Ю. В. Хмелевский, А.Я. Розанов, 1975; А. Г. Мойсеенок, В. М. Копелевнч. В. И. Шейбак, В. А. Гуринович, 1989) не могут быть полноценно реализованы в практике из-за отсутствия

четких представлений о механизмах их биотрансформации, возможности полноценной утилизации системой СоА и способности вызывать специфические эффекты на СоА-зависимые реакции, необходимые для достижения фармакотерапевтическихи профилактических целей. Цель и задачи исследования. Изучить роль системы биосинтеза ко-фермента А и пантотенатбелковых комплексов в формировании внутриклеточного фонда кофермента в печени при различных метаболических состояниях организма животных и молекулярные механизмы регуляции начальных реакций биосинтеза СоА.

Экспериментальные задачи диссертационной работы включали:

- исследование структуры фонда СоА, биотрансформации предшественников биосинтеза кофермента, активности ключевых ферментов системы СоА при развитии В3-витаминной недостаточности;

- разработку метода выделения и очистки пантотенаткииазы из печени крыс и изучение свойств и механизмов регуляции фермента;

- изучение роли начальных этапов биосинтеза СоА как потенциально регуляторных, а также транспортных (депонирующих) систем (ПБК) в функционировании всей системы биогранформации производных пантотеновой кислоты и их взаимоотношения с формированием внутриклеточного фонда СоА при различных метаболических состояниях;

- выяснение возможной роли метаболитов биосинтеза СоА - ФПН, дефосфо-СоА и СоАЗН в качестве внутриклеточных транспортных факторов системы СоА и возможности использования субстанции кофермента в качестве лекарственной формы;

- определение возможности использования препаратов пантотеновой кислоты в качестве эффективных витаминных и фармакотерапевти-ческих средств при развитии алиментарной В3-недостаточности организма, хронической алкогольной интоксикации, глубокой гипотермии и некоторых других патологических состояниях организма.

Научная новизна. Выдвинуто и экспериментально подтверждено положение о клеточной структуре фонда СоА - объекте метаболической регуляции, ведущем механизме реализации витаминной и фармакотера-певтической активности производных пантотеновой кислоты.

Выявлена широкая субстратная специфичность в отношении природных аналогов витамина ключевого фермента биосинтеза СоА - АТФ: Б-пантотенат-4-фосфотрансферазы, КФ 2.7.1.33 - пантотенаткииазы, что позволяет исключить существование фермента, осуществляющего прямое фосфорилирование пантетеина (пантетеинкиназа, КФ 2.7.1.34).

Установлен физиологический механизм регуляции активности пантотенаткиназы, заключающийся в деингибировании фермента (подверженного воздействию физиологического уровня свободного СоА) посредством образования симметричного дисульфида СоА и смешанных дисульфидов СоА с низкомолекулярными соединениями (цистин, панте-тин, окисленный глутатион).

В качестве компонентов внутриклеточного метаболизма и транспорта ПАК-содержащих соединений идентифицированы дефосфо-СоА и СоА-протеидизирующий белок цитозоля гепатоцитов с Н-ацетилтранс-феразной активностью (мол.масса 50-70 кД).

Установлено, что снижение уровня предшественников биосинтеза СоА, участвующих в реакции ацегилирования, является, наряду с активностью К-ацетилтрансферазы, наиболее ранним критерием развития в организме дефицита пантотеновой кислоты. Недостаточность витамина приводит к перестройке структуры фонда СоА и адаптивному увеличению активности пантотенаткиназы.

Научно-практическое значение. На основании результатов проведенной работы были расширены показания к клиническому применению отечественного препарата кальция пантотената, в частности, для лечения различных форм алкогольной болезни. Препарат пантегин (пантосин Дайичи) впервые применен для купирования алкогольных и сенильных психозов, а также для профилактики холодовой кардиопле-гии и постваготомического гастростаза.

В сотрудничестве с НПО "Витамины" разработан и внедрен в медицинскую практику препарат стабилизированного кальция пантотената (10% р-р, ампулы), одним из основных назначений которого явилось потенцирование дезинтоксикационной терапии алкоголизма.

Разработан и внедрен в клиническую практику ферментативный метод анализа в лейкоцитах уровня СоА и его предшественников, участвующих в реакции ацетилирования, для ранней диагностики недостаточности в организме коферментной формы пантотеновой кислоты и контроля биотрансформации ее препаратов в клинических условиях.

Адаптирован для клинико-биохимических исследований метод анализа ФТА-реагирующих эфиров СоА и активности М-ацетилтрансера-зы, апробированный для оценки тяжести интоксикационного синдрома у больных алкоголизмом и легочными формами туберкулеза, а также контроля эффективности терапии ПАК-содержащими препаратами.

Апробация работы и публикации, основные результаты работы докладывались на Всесоюзной конференции "Теоретические и практические аспекты изучения питания человека" (Москва, 1980). 6 объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР (Таллин, 1981), Всесоюзном научно-техническом совещании "Состояние и перспективы научных исследований и производства витаминов и их полупродуктов" (Белгород, 1983), симпозиуме "Биохимия, фармакология и медицинское применение производных витаминов и других предшественников коферментов" (Иркутск, 1983), 16-ой конференции ФЕБО (Москва, 1984), Пленуме проблемной комиссии АМН СССР "Проблемы витаминологии" (Самарканд. 1985), 17-ой конференции ФЕБО (Берлин, 1986),Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов (Алма-Ата, 1987),

23-ем съезде Польского биохимического общества (Белосток, 1987),

24-м съезде Польского биохимического общества (Познань, 1988), Всесоюзной конференции "Клиническая витаминология" (Москва, 1991), 2-ой Всесоюзной конференции "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний" (Гродно, 1991), 1-м Российском конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1992), Российском симпозиуме "Витамины и здоровье" (Москва, 1993), Международной конференции "Наука и медицина - Чернобылю" (Минск, 1993), 1-м Польском конгрессе по питанию (Варшава, 1994.), 2-й международной конференции "Анти-оксидантные витамины и бета-каротин в предупреждении заболеваний" (Берлин, 1994), международном симпозиуме "Витамины и здоровье" (Гродно, 1995), межлабораторном заседании сотрудников Института биохимии АН Беларуси (Гродно, 1995).

По материалам диссертации опубликовано 7 монографий и глав в методических руководствах, 89 научных работ, в т.ч. 2 обзора литературы, получено 8 авторских свидетельств на изобретения.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Методология изучения биотрансформации производных ПАК и характеристика системы СсА при недостаточности витамина у животных

Для изучения биотрансформации предшественников биосинтеза СоА наряду с традиционными микробиологическими и газохроматографичес-кими методами нами использован универсальный методологический подход на основе применения радионуклидных производных в сочетании с различными видами хроматографического разделения метаболитов [6.18,23]. Радиоактивность компонентов хроматографического

разделения измеряли жидкостной сцинтшшщионной спектрометрией, позволяющей достигать при максимальной удельной радиоактивности метаболитов чувствительности метода в диапазоне 10"11-10"12 М.

----3',5'-АДФ------->1'--------------------ФПН---------------->

---------ФПК----------------->|

------------------ т-----------_

------------плк-------------->1

паншоееая

— кислота----»1 6-станин --Ч

ОН СНдОН I ]

ч\ ,« 111 III I

чЧ N/ ЧГ СНг —0—Р—0—Р—0—СН2 —С—СН—C0NH—СН2 —СН2 —C0NH

Шг I

N ^ \ — N ОН

1/4

О О СН, СН,

у \ , *

ОН О—Р03Н2 HS—сн2

Рис. 1. Структурные компоненты СоА, исследуемые в качестве предшественников биосинтеза ксфермента: ПАК, ФПК, ФПН, дефосфо-СоА (* - отсутствующий фосфат в дефосфо-СоА); IUI - аналог ПАК, в котором ß-аланин замещен на 3-аминопропанол; ПТ - дисульфидная форма ПН.

В процессе выполнения исследовательских задач разработаны или модифицированы методы определения предшественников СоА, участвующих в реакции N-ацетилирования (дефосфо-СоА+ФПН) [А. с. СССР N1040412], количественного гидролиза ПАК-содержащих соединений до пантоевой кислоты и, далее, пантолактона [8,17] с последующим его газохроматографическим анализом [14,15], определение ФПК [26,40] и других компонентов биосинтеза СоА [4,30,39,42].

Использовали коммерческие меченые препараты пантотената натрия. СоА (производство NEM, Германия). Синтез пантолактона, ФПК, ФПН,ПТ вели из радиоактивных полупродуктов (пантолактон, бэ-та-аланин, пантетин) по оригинальным методикам [23,30]. 3Н-панте-тин получали методом термической активации трития (Бадун Г.А., Ре-зяпкин В.П., 1991). Препараты предшественников биосинтеза СоА получены и переданы для изучения В.М.Копелевичем из лаборатории гетероциклических соединений НПО "Витамины" (руководитель работ В.И.Гунар), а также частично нарабатывались в лаборатории кофер-ментов Института биохимии АН Беларуси A.B.Лысенковой и Т.В.Дедо-вич (рис.1). ПАК применяли в виде солей (ПАК-Са, Na), препараты ПТ и ПЛ получены в виде субстанций от фирм "Daiictii Seiyaku" (Япония) и "F. Hoffmann-La Roche" (Швейцария).

Разделение предшественников биосинтеза СоА осуществляли на ионообменнике Сервацел ДЭАЭ 23 SH в системе линейного градиента хлористого лития (0-0,075 М) в 0,003 н HCl [6,30]. Разделение

субстрата (ПАК) и продукта (ФПК) пантотенаткиназной реакции проводили на колонке с ДЭАЭ-сефадексом А-25 [16]. Для изучения природы ПАК-содержащего лиганда витамин-белкового комплекса из цито-золя печени использовали гель-фильтрацию на сефадексах Г-25, Г-200 и ТБК-геле Тойоперл Ш-60К [19,22]. Идентификацию метаболитов биотрансформации предшественников биосинтеза СоА проводили обращенно-фазной ВЭЖХ с использованием С!8-обращенной стационарной фазы в изократическом режиме, применяя в качестве подвижной фазы 20 мМ калий-фосфатный буфер/метанол (91,5:8,5) [39,42].

В расчетах эквивалентных доз пантотенату кальция, использующихся в профилактических и фармакотерапевтических целях [6,7], с учетом поверхности тела принимали величины 0,00130-0,00350 мг/см2 и 0,0140-0,0180 мг/см2. В экспериментах соответственно использовали. эквимолярные по ПАК разовые дозы препаратов: 3-4 мг/кг массы тела (профилактические эффекты), 20-30 мг/кг (минимальная), 100-200 мг/кг(максимальная терапевтическая доза). Последняя соответствует 1/10-1/20 величины ЛДйо, полученной в токсикологических экспериментах с парентеральным введением ПАК-Са [33].

Осуществленный нами на первом этапе работы скрининг производных ПАК по критерию их "утилизируемости"в организме животных на основании микробиоанализа экскретируемых с мочой свободной ПАК к ее метаболитов [1,6] выявил их значительные индивидуальные различия (рис.2). Полученные данные позволили разделить соединения на группы с относительно малой (ПАК-Са,ПН,ПЛ) и высокой (ФПК-Са, ФПН, ИТ) степенью усвоения. Эта закономерность подтверждена ре-

250

150

50

500

300

100

1 2 3 4 5 6 7

Рис.2. Экскреция свободной формы ПАК (1) и метаболитов витамина (2) с мочой половозрелых белых крыс через 6 (А) и 48(Б) ч после однократной инъекции производных ПАК в дозе, эквимолярной 3,3 мк/кг ПАК-Са. 1-контроль (без введения препаратов), 2-ПАК-Са, 3-ПЛ, 4-ФПК-Са. б-Э-бензоил-ПН, б-Б-бензоил ФПН, 7-ПТ.

зультатами экспериментов на животных с ПАК-недостаточностью, у которых исследовали экскрецию свободной формы витамина [5].

Важнейшим вопросом оценки биохимических последствий пищевой недостаточности ПАК является изменение уровня коферментной формы витамина в органах i' клеточных структурах. Различия в моделировании недостаточности витамина, применение разных методов определения СоА без учета их специфичности и использование некорректных экстракционных приемов приводят к трудносопоставимым результатам (Isler, Brubacher, 1982; Bieber, 1992). Эти факторы были учтены в нашей работе [21], методологической основой которой явилось сочетанное применение двух энзиматических методов на основе КГД-реакцйи (Tubbs, Garland, 1964).и АФ-реакции, с использованием разработанной нами [1] модификации учета количества ацетилирова-ния ПАБК в аналитической системе прямой реакцией с пара-диметила-минобензальдегидом.

Сопоставление данных, полученных двумя методами, показывает, что в процессе развития ПАК-недостаточности в печени животных наблюдается 'быстрое и, в последующем, прогрессивно нарастающее падение уровня ФПН и дефосфо-СоА (суммарный показатель), т.е. предшественников СоА, обладающих высокой активностью в АФ-реакции [1]. Это (рис.3) соответствует более ранним попыткам использования реакций ацетилирования в диагностике алиментарной недостаточности витамина В3 (Schulze zur Wiesch, 1974; Vas et al., 1990).

нмоль/г

800 т

600-

400-

200

О

ш

IV

Рис.3. Изменения в концентрации ПАК-содержащих соединений (общего СоА - светлая часть и дефосфо-СоА, ФПН - темная часть столбиков) в печени белых крыс-отъемышей, по лучащих сбалансированный синтетический рацион (1) или лишенный ПАК (2) через И (I), 22 (II), 33 (III), 44 (IV) суток эксперимента.

Изменения в структуре фонда СоА печени при развитии алиментарного дефицита пантотената приобретают устойчивый характер к истечению 6-ти недель эксперимента, когда задержка прироста массы достигает 30% от контроля и практически прекращается экскреция

ÂB JIJ В Г

Я И111 ь

1

1

свободного витамина почками. При значительном снижении общего СоА более чем в два раза уменьшается уровень СоАЗН, что отражается на соотношении СоАБН/общий СоА. Падение уровня КРЦА-СоА отмечается с ранних стадий развития недостаточности ПАК. тогда как фракция ДЦА-СоА оставалась более стабильной и ее удельный вес в структуре фонда СоА относительно увеличивался [21,24].

В последующем эксперименте проведено изучение структуры фонда СоА печени ПАК-дефицитных животных с помощью циклической ФТА-реакции. Изменения фракции ФТА-реагирующих компонентов фонда СоА подтвердили ранее выявленную закономерность. Как оказалось при ПАК недостаточности более чем в 2 раза падает уровень ключевого метаболита СоА-системы - ацетил-СоА при значительном снижении соотношения ацетил-СоА/СоАБН (табл.1). Полученные результаты объясняют развитие ряда патохимических нарушений при развитии ПАК-недостаточности [2,5].

Таблица 1

Основные показатели системы СоА печени белых крыс при пантотено-вой недостаточности

Показатель Метод Норма В3-дефицит % снижения

СоА. нмоль/г ФТА-реакшя 447+9 252+11** 44

Ацетил-СоА, ФТА-реакция 56±3 25±3** 55

нмоль/г +ИЕМ

Свободный СоА - " - 290±5 224+10* 23

нмоль/г

Соотношение

ацетил-СоА/

CoASH 0,19+0,01 0,11+0,009* 42

СоА и предшественники, нмоль/г АФ-реакция 614+25 470+22** 23 Синтетаза жирных кислот,

нмоль.мин'1 .мг"1 СФ-метрия 24+2 19+1* 21

ПАК-киназа

нмоль.мин"1 .мг-1 Радиометрия 0,050±0,028 0,113+0,009 -

Примечание: коэф.достоверности различий * Р<0,05; ** Р<0,001

При относительной стабильности системы гидролиза СоА в уело-

виях витаминного дефицита (изучались активность ферментов кислой и щелочной фосфатазы, 5'-нуклеотидазы, нуклеотидпирофосфатазы) [5,34], выявлена существенная активация ключевого фермента системы биосинтеза СоА - пантотенаткиназы (табл. 1). Различия активности фермента в диализуемых и недиализуемых экстрактах печени свидетельствовали о присутствии в обоих случаях низкомолекулярных ингибиторов ферментативной активности [6,13].

Таким образом, на первом этапе исследований удалось экспериментально доказать факт быстрого реагирования фракции предшественников биосинтеза СоА, участвующих в АФ-реакции (дефосфо-СоА и ФПН), на алиментарный недостаток витамина и специфичный характер адаптивных в условиях ПАК-недостаточности перестроек структуры фонда СоА в печени (двухкратное снижение ключевого метаболита -ацетил-СоА и сопутствующее падение соотношения ацетил-CoA/CoASH). Менее рельефными оказались изменения показателя общего СоА в ткани и, особенно. CoASH, что отразкает жизненно важную функции ко-фермента для метаболического гомеостаза (Abiko, 1972; Robis-haw.Ueely, 1985; Tahiliani, 1991; Brass, 1994; ) и, по всей вероятности, поддерживается адаптивной активацией биосинтеза СоА, в частности, заметным возрастанием активности ключевого фермента -пантотенаткиназы (см.табл.1). Специальные исследования изменения активности фермента печени при курсовом введении препаратов ПАК-Са и ПЛ В3-авитаминозным животным выявили существенное увеличение скорости ферментативной реакции, что подтверждает ранее высказанное предположение об индукции пантотенаткиназы ПАК-содер-жащими соединениями (А.Я. Розанов, 1977; Л.М. Карпов, 1994).

2. Исследование воздействия производных ПАК на структуру фонда СоА в печени и их биотрансформации системой биосинтеза коФермента

иолгттоиттр /-щгчп/ттчгт-ат rft/iuno РлЛ f nft MITJTJ Г*лЛ РпЛ СЩ TJV г»ппт>игипр —

ние) в печени животных, находящихся на сбалансированном рационе вивария и получавших однократно инъекцию ПАК-Са в дозе от 3 до 200 мг/кг массы тела, выявило увеличение общего СоА при использовании дозы витаминного предшественника 30 мг/кг и выше. С учетом концепции А.Я.Розансва об осцилляционных изменениях тканевого СоА после введения пантотенатов и их производных вследствие печеноч-но-кишечной рециркуляции (А.Я.Розанов, 1977; Л.Н.Степанова, 1983), исследования проведены в обширном диапазоне времени (1-24

ч) после инъекции ПАК. Максимальное увеличение общего СоА до 555+50 нмоль/г (КГД-метод) выявлено в печени животных через 3 ч после инъекции ПАК-Са в дозе 200 мг/кг, свободного СоА до 175±41 нмоль/г через 6 ч после введения дозы 30 мг/кг. В целом, подтвержден установленный А.Я.Розановым и сотрудниками пик увеличения СоА и метаболитов через 3-6 ч после инъецирования предшественников и показано, чтс дозозависимое реагирование общего СоА и структуры фонда кофермента на введение пантотената не наблюдается [6]. В этих экспериментах содержание CoASH изменялось, в основном, синхронно с количеством общего кофермента, что подтверждается стабильной величиной соотношения CoASH/ общий СоА.

10-дневное парентеральное введение минимальных терапевтических доз ПАК-Са. ПЛ, ФПК-Са или ПТ (эквимолярно) существенно и практически однозначно увеличило содержание общего СоА в печени, однако увеличение фракции CoASH найдено только в группе животных, которым вводили ПТ (табл.2). Последний показатель оказался даже сниженным у животных получавших ПЛ. Выявились также заметные различия в воздействии производных ПАК на фракции ДЦА-СоА, КРА-СоА и их соотношение в структуре тканевого фонда кофермента. Очевидно, что введение предшественников биосинтеза СоА приводит к весьма существенным изменениям структуры фонда кофермента, свидетельствующим о повышении метаболической загруженности пула СоА (увеличение ацил-СоА) и относительном уменьшении резервного фонда ключевого компонента - CoASH. Эти изменения для различных использованных препаратов ПАК характеризуются отчетливыми качественными и количественными различиями, что вероятно обусловлено не только их взаимодействием с системой биосинтеза СоА, но и системами их мембранного транспорта, индивидуальной биотрансформации, а также фармакокинетическими особенностями [6.23,37].

Действительно, как показывают результаты экспериментов [6,24], основанных на сочетанном применении двух различных по специфичности методов анализа СоА и позволяющих (по разнице) оценить содержание дефосфо-СоА и ФПН (см.рис.2), количество последних предшественников биосинтеза СоА в печени животных, получивших 10-кратные инъекции производных ПАК оказалось сниженным: при введении ПАК на 16%, ПЛ на 54%, ФПК на 43% и ПТ на 37% от контрольного уровня. Эти данные иллюстрируют механизм ретроингибирования начальных реакций биосинтеза СоА при курсовом введении ПАК-содер-жащих соединений, в частности, ПЛ (см.табл.2), который быстро

Таблица 2

Уровень СоА в печени белых крыс после подкожного введения производных ПАК в дозе, эквимолярной 30 мг/кг ПАК-Са, нмоль/г ткани

Показатель Контроль +ПАК-Са

+ПЛ +ФПК-Са

+ПТ

Общий СоА 344±20,6 Р1 Р2 РЗ Р4

CoASH 139+7,4 Р1 Р2 РЗ Р4

КРА-СОА 123+14, 1 Р1 Р2 РЗ Р4

ДЦА-СоА 86±4,7 Р1 Р2 РЗ •Р4

CoASH/ 0,4±0,03

Общий COA Р1

ДЦА-СоА/

Общий СоА 0,25+0,025

Р1

525±25,8 <0,001

154+6,1 >0, 1

265+14,9 <0,001

106+4,7 <0, 01

0,29+0,03 <0,05

510128,9 <0,001 >0,5

114+6,О <0, 05 <0, 001

303+22,О <0,0011 >0,1

e»±d. / >0,5 <0,01

О, 22+0, 03 <0. 05

508+25,6 <0,001 >0,5 >0.5

131+6,2 >0.5 <0.05 >0,05

281+23,9 <0,001 >0,5 >0,5

96+2, 9 >0,05 >0,05 >0. 05

О, 26±0, 03 <П. 05

461+17,5 <0,001 <0,05 >0,1 >0,2 172+6,4 <0,01 >0,05 <0.001 <0,001 169+22,2 >0,1 <0, 05 <0, 001 <0,01 123±3, 1 <0,001 <0,01 <0, 001 <0,001 О, 37±0, 02

0,20+0,031 0,17+0,033 0,19+0,03 0,27+0,02

Примечание: Р<0,05 относительно контроля (1), групп с назначением ПАК-Са (2), ПЛ (3), ФПК-Са (4).

окисляется в алкогольдегидрогеназной реакции [2] и эффективно переносится через плазматические мембраны, взаимодействуя с системой биосинтеза СоА. Указанное свойство ПЛ послужило основанием специального исследования его взаимодействия с алкогольдегидроге-

назой (КФ 1.1.99.8) и использования в качестве антидота при острой алкогольной интоксикации [47].

Из числа изученных соединений ПТ обладает выраженной гиполи-пидимической активностью, сравнимой с никотинатом, клофибратом и др.(H.H. Великий, 1982), причем наблюдаемое у соединения свойство стимулировать уровень ДЦА-СоА отражает не только мобилизацию жир-нокислотных остатков для окисления, но и выявленное нами активирующее действие на ацил-СоА-синтетазы [6]. ДЦА-СоА - сильные специфические ингибиторы синтеза жирных кислот в гепатоцитах с чрезвычайно низкими величинами Kt (Olbrich et al., 1981), а таете транспорта адениннуклеотидов на уровне митохондриального переносчика (A.B. Панов, 1984). Таким образом, опосредованный системой биосинтеза СоА путь к направленной регуляции уровня ДЦА-СоА имеет существенное воздействие на процессы синтеза и окисления жирных кислот в печени животных.

Нами выявлены значительные различия в накоплении и биотрансФормации меченого ПАК-На в печени нормальных и ПАК-дефнцитных животных в различные промежутки времени (10-60 мин) после однократной инъекции радионуклида. Общее накопление последнего, степень биотрансформации в ФПН и СоА оказались заметно большими у ПАК-дефицитных животных. Если в печени контрольных крыс количество радиоактивного ФПН прогрессивно возрастало, несколько опережая повышение уровня радионуклида во фракции СоА, то у ПАК-дефицитных животных отмечено равномерное увеличение радиоактивности фракций ФПН и СоА. Этот показатель для фракции ФПН у гиповитаминозных крыс на протяжении 20-60 мин опыта оставался практически постоянным [6,1.9], Эти данные отражают возросшую особность реакции фос-форилирсвания ПАК при недостаточности витамина [5,10].

Как же осуществляется процесс биотрансформации предшественников биосинтеза СоА в печени животных? Исследования на ПАК-дефицитных белых крысах-отъемышах, ткани которых отличаются высокой потенцией системы биосинтеза СоА, обнаружили существенные различия в накоплении и метаболизме инъецированных препаратов ПАК, ФПК, ПТ [23]. Наблюдения вели в диапазоне 10-360 мин после введения меченых препаратов с использованием хроматографической техники разделения на колонке с ДЭАЭ-целлшгазой. При элюции радиоактивных компонентов с колонки линейным градиентом хлористого лития детектировали 3 фракции радионуклидов в элюатах с концентрацией соли 0,004-0,014; 0,021- 0,035; 0,053-0,06 М. Первая фракция со-

держала свободную ПАК. ПТ или ПАК, образующуюся в результате гидролиза 14С-ПТ или 14 С-ФПК, вторая - фосфорилированные нуклеотид-ные предшественники биосинтеза СоА, третья - СоА.

Изученные препараты быстро поступают в клетки печени, причем суммарное содержание радиоактивности к 10 мин эксперимента при введении ПТ практически двукратно повышает накопление метаболитов ПАК и ФПК. В данный период только небольшая часть последней гид-ролизуется до свободного витамина. В период 60 мин распределение меченых метаболитов по фракциям составило для ПАК-Са - 65,22 и 13%, для ПТ - 90,10, 0 и ФПК-Са - 69,28 и 3% суммарной радиоактивности. Эти данные свидетельствуют об интенсивном дефосфорилирова-нии ФПК и предпочтительном внедрении инъецированного свободного витамина во фракцию фосфорилированных метаболитов ПАК и фракцию нуклеотидных производных. В частности,- к 360 мин эксперимента показатель внедрения радионуклида во фракцию СоА составлял для ПАК-Са 22+3, для ФПК-Са 8+2, для ПТ 3+0,1 нмоль/г ткани [23]. Полученные данные подтверждают ведущее значение начальной реакции биосинтеза СоА (ПАК-киназа) в биотрансформации производных ПАК.

В отличие от данных, свидетельствующих о высокой метаболической активности препарата ПТ (см.табл.2) в отношении фонда СоА в печени, сравнительное изучение биотрансформации соединения свидетельствует о его быстрой аккумуляции в органе, частичном фосфо-рилировании и чрезвычайно низком внедрении во фракцию СоА. В тоже время, высокая витаминная активность ПТ, обусловленная эффективным превращением его в коферментную Форму не вызывает сомнения и подтверждена различными исследователям! [45].Ответ на кажущиеся противоречия, но всей вероятности, следует искать в способности этого метаболита к тиол-дисульфидным превращениям и, в этой связи. образованию протеидизирующихся форм как своеобразных депонируемых (резервных) предшественников СоА (А.Я.Розанов, 1977). Проведенный нами расчет условной витаминудерживающей функции органов показал, что спустя 6 часов от однократного введения вышеупомянутых соединений ПАК основная часть радионуклида обнаруживалась в печени и почках и равнялась (суммарно) 6,5 - 10,9% введенной дозы ПАК-Са, 10,2-16,8% ПТ, 9,9-11,9% ФПК-Са. Способность ткани печени животных с недостаточностью ПАК удерживать метку характеризуется следующей закономерностью вводимых препаратов: ПТ> ПАК-Са> ФПК-Са [19,23].

В исследовании возможности накопления протеидизированных

форм метаболитов пантотенатов (не исключено СоА или его дисуль-фидной формы) было обращено внимание на цитозоль печени, как клеточный компартмент, аккумулирующий все ферменты, причастные к биосинтезу СоА. Важным обстоятельством являлось таюке локализация в цитозоле мультиферментного комплекса синтетазы жирных кислот с молекулярной массой 400- 550 кД, состоящей из 2 субъединиц и содержащей АПБ (фосфопантетеинпротеид) с молекулярной массой 7,5-13.6 кД (Larrabee et al., 1965; Yu Hon Lun, Burton, 1974; A-. Г.Мойсеенок, 1980). Использование техники гель-хроматографии на колонках, заполненных сефадексом Г-25, позволило изолировать из цитозоля печени крыс фракцию радионуклидных компонентов, находящихся в протеидизированной форме. Эта фракция условно определена, как фракция пантотенатбелковых комплексов (ПБК) цитозоля [22,25].

С целью выяснения роли ПБК в системе биотрансформации предшественников биосинтеза СоА и их взаимоотношения с метаболизмом фосфопантетеинпротеида синтетазы жирных кислот проведены исследования на модели адаптивного гиперлипогенеза. Этот подход традиционно используется для изучения синтетазы жирных кислот путем введения радионуклидного компонента в фосфопантетеиновый лиганд АПБ фермента (Yu Hon Lun, Burton, 1974). Особенностью эксперимента был постоянный период исследования метаболизма радионуклида ПАК (всегда 1 ч) в условиях различной продолжительности периода от начала кормления обогащенным сахарозой рационом - 3,6 и 24 ч после предшествующего 36-часового голодания. Выбранные сроки кормления характеризуются началом биосинтеза холофермента синтетазы жирных кислот (3 ч) и прогрессивным повышением его активности в цитозоле печени с соответствующим возрастанием уровня радиоактивности в зависимости от скорости обмениваемости лиганда со свободным СоА (Tweto et al., 1982) за счет ФПН-трансферазной реакции. Для определения влияния предшествующего витаминного статуса на степень биотрансформации и протеидизации метаболитов витаминного предшественника, исследования проведены на нормальных и ПАК-дефицитных крысах [22].

Исследование биотрансформации ПАК-Na в условиях адаптивного гиперлипогенеза выявило очевидное и прогрессирующее возрастание активности системы биосинтеза СоА, особенно выраженное у животных с ПАК-недостаточностью, что хорошо соответствовало периоду начала биосинтеза мультиферментного комплекса синтетазы жирных кислот. Однако параллельное исследование динамики радиоактивности ПБК ци-

тозоля подопытных животных выявило относительно умеренное реагирование этой фракции метаболитов витамина на процесс индуцированного липогенеза, несколько более выраженный у ПАК-дефицитных животных и, очевидно, не соответствующий динамике индуцирования синтетазы жирных кислот в цитозоле [2]. Вместе с тем, полученные данные подтверждают тесную взаимосвязь витаминдепонирующей (ПБК) системы и биотрансформации ПАК-производных, а также значительный удельный вес ПБК в распределении радионуклидов в цитозоле. В частности, последняя величина у животных с ПАК-недостаточностыо в состоянии адаптивного липогенеза достигала 0,002±0,0003 нмоль/мг белка, что составило 24+3% общей радиоактивности цитозоля [22].

Специальные исследования с длительным скармливанием белым крысам-отъемышам синтетической диеты, содержащей радиоактивный 14С-ПАК-Са в суточной дозе 1,3 мкКи, раскрыли динамику накопления ПБК в цитозоле печени [44]. Индикаторная доза радионуклида позволила оценить витаминдепонирунщую способность ПБК к 10-му дню витаминной недостаточности величиной 47-50% от общего уровня радиоактивного витамина цитозоля [5]. Молекулярная масса белка, связывающего радионуклид, определенная гельфильтрацией на сефадексе Г-200 с использованием белков-маркеров (рис.4), оказалась в диапазоне 50-70 кД [44]. Это обстоятельство, а также нековалентиый характер связывания метаболита ПАК (ФПН, дефосфо-СоА, СоА?) в составе ПБК позволяет их дифференцировать от ФПН-содержащей субъединицы (АПБ) в структуре холоферментного комплекса синтетазы гарных кислот цитозоля гепатоцитов.

Рис.4. Гель-фильтрация пантоте-нат-белковых комплексов печени крыс на колонке с сефадексом Г-200 (100x2 см), элюирование 0,05 М фосфатным буфером рН6, 8; обьем фракций 1,5 мл:

а—гтппгвт* тти а тлтттли <лоптуо {л—г\о г>ттг\опо па_

ние метки, имп/(минхмл), в-определе-ние молекулярной массы радиоактивных белковых фракций; 1-5 - белки-маркеры с Мг 25-237 КД.

Функциональная значимость ПБК цитозоля печени определяется не только депонированием витамин-содержащего метаболита в ком-партменте клетки, где осуществляется полная последовательность

реакций биосинтеза СоА и, следовательно, осуществляется "резервирование" полупродукта или готового кофермента для последующего использования. Столь же вероятно, что возникновение ПБК может иметь значение для последующего транспорта продуктов реакций, таких как ФПН, дефосфо-СоА, СоА в иные органеллы клетки, например, митохондрии. Последние, как известно, содержат только 2 фермента конечных стадий, тесно ассоциированных друг с другом в виде СоА-синтетазы (ТаЬШап!, Ве1пИсГ1, 1991). Вместе с тем, внутри-митохондриальный фонд СоА является превалирующим в гепатоцитах и, особенно, в миокардиоцитах [31] и, в этой связи, биосинтез или транспорт СоА в митохондриях нуждается в специальном исследовании. О взаимосвязи системы биотрансформации и протеидизации витаминного лиганда в цитозоле свидетельствует высокая степень корреляции между уровнем ПБК и степенью биотрансформации фракции фос-форилированных предшественников СоА и СоА в печени контрольных (г=0,997) и ПАК-дефицитных (г=0,957) животных [44].

3. Изучение АТФ: р-пантотенат~4'-фосфотрансферазы (пантотенатки-назы, КФ 2.7.1.33). Молекулярные механизмы регуляции и роль в биотрансформации производных пантотеновой кислоты

Концептуальное положение о ключевой роли пантотенаткиназы в системе биосинтеза СоА обосновано ранее (АМко, 1975; НоЫэЬа^», Йее1у, 1984), однако механизм регуляции активности фермента и взаимоотношение с альтернативной реакцией фосфорилирования ПН (АТФ: пантетеин-4'-фосфотрансфераза, КФ 2.7.1.34) остаются нейзу ченными. Совместно с Т. И.Хомич разработаны метод анализа активности фермента и схема его очистки из печени белых крыс, включающая 7 стадий: получение цитозоля печени, фракционирование прота-минсульфатом и сульфатом аммония, гель-фильтрацию на сефадексе Г-25, хроматографию на гидроксиапатите с последующим концентрированием и гель-фильтрацию на сефадексе Г-200, позволившие достигнуть 199-кратной степени очистки фермента и гомогенности при электрофорезе в полиакриламидном геле [16,43].

Методом гельфильтрации установлена молекулярная масса натив-ного белка равная 98 кД, включающая две равные по массе полипептидные цепи [43]. Как показали кинетические исследования, зависимость скорости реакции от концентрации ПАК при практическом насыщении другим субстратом (АТФ) имеет гиперболический характер. Км для пантотената, рассчитанная в координатах Лайнуивера-Берка рав-

на 1,2xlO~sM. Среди двухвалентных металлов, абсолютно необходимых в реакции, максимальный эффект проявил Mg2+. Истинным субстратом фермента ягляется комплекс М^ + -АТФ [43].

Наши эксперименты подтвердили, что пантотенаткиназа ингиби-руется по принципу отрицательной обратной связи CoASH, некоторыми предшественниками его биосинтеза, а также ацил-СоА. Торможение реакции добавленным CoASH, ФПН, дефосфо-СоА, ацетил-СоА, пальми-тоил-СоА осуществляется по бесконкурентному типу с Kt 0,45; 1,4; 6,4; 12,0; 5,6 мкМ соответственно. Можно полагать, что указанное ингибирование является проявлением регуляторных механизмов фермента, поскольку в физиологических условиях концентрация названных ингибиторов в клетке превышает значения Kt [2,6]. В этой связи нами высказано предположение о существовании своеобразного механизма деингибирования пантотенаткиназной реакции, позволяющего обеспечивать инициацию системы биосинтеза СоА и пополнение фонда кофермента [36].

Нами исследована роль тиол-дисульфидных превращений низкомолекулярных серусодержащих соединений в осуществлении процесса деингибирования пантотенаткиназы, находящейся под воздействием CoASH. Из числа изученных соединений цистин, окисленный глутатион предупреждали ингибирующий эффект кофермента на активность кина-зы, тогда как восстановление формы этих веществ подобным эффектом не обладали. В системе без CoASH цистин, окисленный глутатион и их восстановленные формы не являлись эффекторами фермента (табл. 3).

Изменение скорости пантотенакиназной реакции при внесении в инкубационную среду СоАБН или СоАБН в сочетании с дисульфидами

Таблица 3

CoASH, мкМ

Относительная активность, %

Без дисуль фидов

2

Глутатион, мМ 10

2

Цистин, имМ 10

О 100

1,5 51 3,0 .27

100 96 101

106 96

104 100 100 81

108 103 100

Для объяснения выявленного процесса деингибирования исследо-

вали симметричный дисульфид СоА, а также смешанные дисульфиды: СоА-Б-Б-глутатион и СоА-Б-Б-пантетеин. Внесение в реакционную среду этих дисульфидов (1,5-9,0 мМ) не приводило к ингибированию фермента, в то время как добавление ДТТ (20 мМ) в ферментативную среду значительно снижало активность пантотенаткиназы (рис.5). Действие ДТТ в данной ситуации связано с восстановлением дисульфидов до соответствующих тиольных форм, из которых отрицательным эффектором является только СоАБН (см.выше). Следовательно, предупреждение окисленным глутатионом и цистином ингибирущего действия СоАБН на реакцию фосфорилирования ПАК обусловлено образованием смешанных дисульфидов с СоА.

Результаты этих исследований позволяют объяснить высокую активность пантетина [6,45], а роль дисульфидных форм СоА в клетке можно рассматривать не только как резервную [2], но и регулятор-ную относительно начальной реакции биосинтеза кофермента.

В свете результатов этих исследований потребовалось выяснение возможности существования альтернативной системы биосинтеза СоА, ключевым этапом которой является функционирование специфического фермента фосфорилирования ПН- АТФ: пантетеин-4'-фосфот-рансферазы. Фермент описан и частично очищен в классической работе Новелли при изучении биосинтеза СоА (Novelli, 1953). Несмотря на известный факт фосфорилирования ПН пантотенаткиназой 1 (Brown, 1960), возможность существования отдельного фермента оставалась вероятной в свете гипотетических представлений о механизме транс-

порта ФПН в митохондрии (как известно последние синтезируют СоА только из ФПН) (Novelli, 1953; Robishaw, Neely, 1985).

Опыты, проведенные нами на высокоочищенном препарате панто-тенаткиназы показали, что без добавления восстановителей ПТ не тормозил скорость фосфорилирования ПАК. Выделенный фермент катализировал фосфорилирование пантетеина (только тиольную форму). Следовательно, пантетин может рассматриваться не как прямой субстрат соответствующей киназы, а, скорее как регуляторный (см. рис.5) или резервный фактор начальной реакции биосинтеза СоА [6].

Присутствие самостоятельно фермента фосфорилирования ПН кажется маловероятным, так как специфичность пантотенаткиназы достаточно высока к ПН (Кга 2.7x10"5 М), а разделение активностей по отношению к каждому из субстратов (ПН, ПАК) на протяжении всей процедуры очистки фермента из цитозоля клеток печени нами не выявлено. Предпринята также попытка выделить пантотенаткиназную активность, ассоциированную с митохондриальной фракцией клеток печени. В лизате митохондрий после предварительного диализа обнаружена следовая активность фермента, практически в равной степени фосфорилирующего ПАК и ПН ( но не ПТ), что может быть объяснено препаративной примесью цитозоля в анализируемом лизате. Следовательно, альтернативный путь биосинтеза СоА, опосредованный панте-теинкиназной реакцией (Brown, 1960) отсутствует в клетках печени белых крыс.

Специальное исследование возможности связывания 14С-ПТ митохондриальной фракцией, полученной из печени белых крыс дифференциальным центрифугированием при 8500g в течение 10 мин в 0,25 М сахарозе показало, что радиоактивный лиганд сорбируется органел-лами в количестве 0,7±0,05 мкг ПТ/мг белка. Добавление в среду АТФ, MgCI2, KCl не оказывало влияния на связывающую способность митохондрий. Добавление ДТТ в среду приводило к резкому снижению связывания (транспорта?) радиоактивного ПТ, что свидетельствовало о взаимодействии с мембраной митохондрий только дисульфидной формы ПН. Однако, метаболитами ПТ (по данным разделения экстрактов ВЭЖХ) оказались свободная ПАК (40%) и ПН (60%). ФПН и СоА в мито-хондриальных экстрактах не обнаружены. Следовательно в процессе связывания митохондриями (транспорта через внешнюю мембрану митохондрий?) происходит восстановление ПТ в ПН и частичный гидролиз последнего до ПАК (в пантетиназной реакции, КФ 3.5.1.4), тогда как процесс фосфорилирования ПН и его биотрансформация в кофер-

- 23 -

ментную форму не наблюдается [6].

Была предпринята также попытка сравнить эффективность взаимодействия ПАК и ПН с системой биосинтеза СоА в условиях В3-недостаточности организма, когда имеет место адаптивное увеличение активности ключевой реакции биосинтеза кофермента [5]. Несмотря на то, что общий уровень радиоактивности печени как у нормальных, так и у ПАК-дефицитных белых крыс был заметно выше при назначении ПГ, включение радионуклида (14С - пантоильный фрагмент) во фракцию СоА было практически в 2 раза большим в случае инъецирования ПАК-Са. Обращает на себя внимание преобладающее внедрение радионуклида ПТ во фракцию ФПН, что свидетельствует о его быстрой трансформации в ПН и соответствующее фосфорилированное производное (ФПН). Очевидно, накопление последнего является причиной ин-гибирования пантотенаткиназы (Ablko, 1975) и замедления скорости биотрансформации в целом.

Система биосинтеза СоА и возможности ее регуляции особенно детально изучались в миокарде (Нили, Робишо, Вейри. 1983) в связи с регуляцией процесса утилизации жирных кислот миокардиоцитами (Idell-Wanger et al., 1982; Robishaw, Neely, 1985). В развитии этих исследований удалось показать, что пантотенаткиназа миокарда по сравнению с ферментом из цитозоля гепатоцитов имеет более низкое сродство к ПАК, более высокую чувствительность к ингибирующе-му эффекту CoASH или ацетил-СоА, а также обладает способностью использовать АДФ вместо АТФ (в комплексе с Mg2*) в качестве истинного субстрата. Все это позволяет охарактеризовать указанные свойства пантотенаткиназы миокарда как органоспецифические и,несомненно, чрезвычайно подверженные регуляторному воздействию с точки зрения доступности предшественников биосинтеза СоА [48]. Как показали последующие эксперименты на животных, подвергнутых воздействию глубокой гипотермии, система СоА миокарда, как и биосинтез кофермента достаточно эффективно коррегируется или стабилизируется путем профилактического назначения одного из предшественников биосинтеза СоА [31,41,46].

4. Взаимоотношения внутриклеточных систем транспорта, депонирования и биотрансформации производных пантотеновой кислоты

Механизмы депонирования продуктов битрансформации ПАК, ПН или иных предшественников In situ, транспорт этих соединений или CoASH в клеточные органеллы является малоизученным звеном функци-

онирования внутриклеточной системы СоА. Внутриклеточное распределение кофермента зависит от функционального назначения ткани: в миокарде только 5% общего СоА (0.014 мМ) содержится в цитозоле и 95% (2, 26 мМ) в митохондриях; в печени до 26% локализовано в цитозоле (.0,06 мМ) и около 3/4 (2,55 мМ) в митохондриальном мат-риксе (ИеП-Мепсег, Ст^уоиат, Нее1у, 1978). Однако, если в цитозоле имеется полный набор ферментов биосинтетического пути, то в митохондриях обнаружены лишь два последних фермента - дефос-фо-СоА-пирофосфорилаза и дефосфо-СоА-киназа. Таким образом, мито-хондриальный синтез СоА должен определяться транспортом ФПН и (или) дефосфо-СоА из цитозоля. Относительно роли ФПН как предшественника СоА в митохондриальном биосинтезе получены экспериментальные обоснования (Бкгейе, На^огэеп, 1979).

Мобилизация системы биосинтеза СоА для наполнения внутрими-тохондриального фонда кофермента осуществлялась путем курсового введения клофибрата-(этал-2-(4-хлорофенокси) 2 метилпропионата), обладающего гиполишдемическими свойствами [12]. Как известно, это соединение является сильным стимулятором системы биосинтеза СоА (Бкгебе, На1уогзеп, 1979) и биогенеза митохондрий (Ирэку, Рейегзеп, 1982). С целью выяснения ресурса предшественников биосинтеза СоА для адекватного увеличения кофермента, эксперименты проведены на крысах-отъемышах, получавших синтетическую диету с 0,3% клофибрата, но с различным содержанием ПАК. Независимо от ПАК-обеспеченности организма наблюдался рост общего СоА в печени (у нормальных животных в 1,5 раза, у авитаминозных в 1,2 раза) и, аналогичным образом, фракции КР-СоА (т.е. СоАЗН, ацетил-СоА) [12]. По сравнению с животными, не получавшими клофибрата, активность пантотенаткиназы в цитозоле достоверно и существенно (на 30-36%) возрастала. Вместе с тем не выявлено параллельное накопление витаминных предшественников СоА, а также АФ-реагирующих метаболитов ПАК в печени, что было характерным только для ПАК-дефицитных животных.

Последующие эксперименты на половозрелых животных, которым в течение трех дней подкожно вводили клофибрат в дозе 600 мг/кг в виде 20% масляного раствора, выявили достоверное увеличение содержания общего СоА, свободного СоА и Ф'ГА-реагирующих эфиров кофермента как в митохондриях, так и цитозоле печени. При этом особенно реагировала фракция свободного СоА и ФТА-реагирующих эфиров в митохондриях, в то время как концентрация ДЦА-СоА в них остава-

лась без изменений (табл.4).

Таблица 4

Структура фонда СоА (нмоль/мг белка) в митохондриях и цитозоле печени крыс при введении клофибрата

Показатели Митохондрии Цитозоль

контроль опыт контроль опыт

Общий СоА 3,19+0, 26 4,76+0,32* 0,123+0,011 0,195+0,016*

СоАБН+

ФТА-СоА 1.8810,14 2,93+0,21** 0, 071+0,010 0,148+0, 019*

ДЦА-СоА 0, 64±0, 07 0, 73+0. 06 0, 043+0, 005 0, 046+0, 004

Примечание: коэф. достоверности различий (* <0,05, ** <0,001)

Исследование внутриклеточного депонирования (протеидизации) ПАК путем однократной нагрузки контрольных и опытных животных 14С-ПАК в дозе 42 мкмоль/кг (25 мкКи/кг) на период 40 и 360 мин показало, что степень радиоактивности ПБК цитозоля печени оказалась высокой и относительно постоянной у всех исследованных подопытных групп (37-45% от общей радиоактивности цитозоля). Одновременно выявлена значительная разница в накоплении радиоактивности в целой ткани (гомогенат) и цитозоле, что позволяет оценить вне-цитозольное накопление продуктов биотрансформации ПАК и констатировать его доминирующее увеличение при воздействии клофибратом. Это соответствует вышеприведенным результатам о преимущественном накоплении СоА в митохондриальной Фракции печени при курсовом введении клофибрата.

В вышерассмотренном эксперименте нами предпринято исследование активности в цитозоле АФ-ферменга, проявляющую исключительную зависимость от тканевого уровня СоА и используемого в качестве своеобразного критерия степени снижения уровня кофермента в развитии ПАК-витаминной недостаточности (Р1еЪгг1к, Но1ге1, 1980). Истинным субстратом фермента является ацетил-СоА, однако аце-тил-ФПН и ацетил-дефосфо-СоА также эффективно участвуют в М-аце-тилтрансферазной реакции, поскольку ацетил-СоА-синтетаза (КФ 6.2.1.1) обладает относительно низкой специфичностью (А.И.Бирюков и др., 1987). Молекулярная масса АФ и ПБК и их локализация в ци-тозольном компартменте весьма сходны. Исследования не выявили

коррелятивных взаимодействий между изменением активности АФ в ци-тозоле печени при введении животным клофибрата и накоплением радиоактивности в цитозоле или уровнем ее протеидизации в составе ПБК. Активность фермента, обработанного ДТТ, заметно снижалась во всех исследованных экспериментальных группах. Однако активность АФ с высокой степенью достоверности (г=0,906) коррелировала с показателем удельного веса ПБК в общей радиоактивности цитозоля после однократного введения 14C-nAK-Na.

В этой связи было проведено специальное исследование по идентификации ПБК цитозоля печени половозрелых белых крыс, которым внутрибрюшинно однократно вводили 14С-ПАК-Ма в дозе 1,23 мкМ (56,1 мкКи/мкмоль) на период 4 ч. Высокая удельная радиоактивность ПБК позволяла осуществить частичную очистку и идентификацию витамин-содержащего лиганда ПБК. В качестве последнего иденцифи-цирован CoASH, а белковым компонентом ПБК, по всей вероятности, является АФ цитозоля с молекулярной массой 50-70КД. Для окончательного доказательства идентичности ПБК и АФ необходим радиои-мунный анализ, подобно тому, как ацетил-СоА-ацетилтрансфераза (ацетоацетил-СоА-тиолаза, КФ 2.3.1.9) была идентифицирована как ПАК(СоА)-протеидизирующий белок в печени крыс (Hum et al.. 1991).

Среди экстремальных воздействий, приводящих к чрезвычайной мобилизации системы СоА в различных органах, росту его общего уровня и ацил-СоА, активизации СоА-зависисмых реакций липидного и энергетического метаболизма и, по всей вероятности, адаптивного возрастания биосинтеза кофермента, исключительное место принадлежит алиментарному голоданию подопытных животных (Reibel, Wyse, Berklch, 1981; Williamson, 1985). Наши эксперименты показали (табл.5), что данный методический подход приводит к достаточно быстрому и ощутимому росту уровня общего СоА в гепатоцитах, причем это увеличение падает как на КР-СоА, так и на фракцию КНР-СоА. Примечательно, что опережающее увеличение фракции свободного СоА и ФТА-реагирующих эфиров СоА наблюдается в "биосите-тическом" компартменте-цитозоле, тогда как ПАК-киназная активность не обнаружила заметного реагирования, несмотря на исследование образцов до и после (для удаления низкомолекулярных физиологических ингибиторов) диализа. В этой связи трудно принять точку зрения (Halvorsen, Skrede, 1982) о том. что ключевым механизмом возрастания фракции СоА в печени при голодании является уве-

Таблица 5

Изменения структуры фонда СоА (нмоль/мг белка) в субклеточных структурах печени и активность пантотенаткиназы (нмоль.ч"1.мг"1 белка) в динамике развития алиментарного голодания

Показатель, Время эксперимента

объект -

исследова- О 24 ч 48 ч 72 ч

ния

Митохондрии

Общий СоА 3,32+0,24 3, 72±0,31 4,15+0,20* 4,38±0,25*

Свободный СоА

+ФТА-эфиры

СоА 1,74+0,13 1,Э7±0,21 2,21+0,17* 2,46+0,18*

ДЦА-СоА 0,39+0,04 0,68+0,07* 0, 76±0, 06** 0, 79±0, 08** Цитозоль

Общий СоА 0,106±0,011 0,163+0,017* 0,192+0,019*0,174±0,015*

Свободный

СоА+ФТА-

Эфиры СоА 0.064+0,005 0,089+0,009* 0,101+0,012* 0,093+0,010* ДЦА-СоА 0,029+0,002 0,045+0,004* 0,052+0,005* 0,047±0,005* ПАК-киназа

(без диализа) 1,91±0,27 2,27+0.3 2,10+0,23 2,20+0,27 ПАК кинззо,

(после диализа) 6,79±0,59 6.29±0,86 6,11±0,64 6,08±0.63

Примечание: Р - коэффициент достоверности различий (* <0,05; ** <0,01) относительно 0. личение ПАК-киназы. Более того, возрастание в процессе голодания фракции свободного СоА и ФТА-реагирующих ацил-СоА (ацетил-СоА, ацетоацетил-СоА, пропионил-СоА и бутирил-СоА), а также ДЦА-СоА, являющихся аллостерическими ингибиторами ПАК-киназной реакции, не позволяет реально придать значение этому механизму в обеспечении накопления СоА в митохондриях печени. Не исключено, что в этих условиях может возрастать роль ФПН как предшественника митохонд-риального биосинтеза СоА (БкгесЗе, НаТуогэеп, 1979), тем более, что в условиях голодания тормозится альтернативный биосинтез фос-фопантетеинпротеидных компонентов синтетазы жирных кислот (01Ь-

rich, Dietl, Lynen, 1981).

С целью проверки высказанного предположения нами использован метод параллельного изучения накопления радионуклида в ткани, биотрансформации предшественников биосинтеза СоА, содержащих радионуклид, с одновременным контролем уровня меченого СоА во фракциях ПБК цитозоля в печени животных, голодавших в течение 72 ч. Препарат 14 С-ПАК вводился в индикаторной дозе однократно на период 30 мин и 4 ч (рис.6). У голодавших животных выявлено резкое увеличение внецитозольного распределения (аккумулирования) радионуклида, которое может характеризовать экспортные возможности системы биосинтеза СоА цитозоля в данных условиях. Последняя характеризовалась (по данным идентификации радиоактивных метаболитов после их разделения ВЭЖХ) увеличением скорости биотрансформации ПАК в СоА, пик которого через 4 ч после введения витаминного предшественника достигал 70% от суммарной радиоактивности цитозоля. Об этом свидетельствует и соотношение фракций радиоактивного СоА и ПАК, используемое для оценки скорости биотрансформации и равное 0,3 -1,1 и 2-2,6 у нормальных и голодавших животных в период 30 мин и 4 ч эксперимента, соответственно. С высокой скоростью биотрансформации ПАК в СоА у голодавших животных не коррелировали динами-

,20Г (имп/(мин - г) • Ю3 100

Рис.6. Внецитозольное накопление 14С-ПАК-содержащих метаболитов и их распределение по фракциям в печени половозрелых белых крыс, получавших полноценный рацион (1) или подвергнутых голоданию (2) через 0, 5 и 4 ч после однократного введения ПАК-Na в дозе 1,23 мкмоль / кг (56,1 мкКи/мкмоль). Полусферы отображают соотношение радиоактивных фракций экстрактов гомогената, полученных хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе (левая-соответствует эксперименту 0,5 ч, правая -4ч). Фракции: I - ПАК, II - ФПК.ФПН; III -СоА+дефосфо-СоА.

02277161

ка накопления промежуточного продукта биосинтеза - ФПН и удельная радиоактивность ПБК в цитозоле, хотя уровень последнего отражал суммарное накопление радионуклида в цитозольном компартменте [44].

Данные, представленные в таблице 5 и рис.6 позволяют сделать вывод о резкой интенсификации системы биосинтеза СоА при алиментарном голодании, происходящей в условиях "деингибирования" ПАК-киназы и приводящей к значительному росту биотрансформации 14С-ПАК в коферментную форму. При этом такие показатели в цито-зольной фракции как уровень ПБК и окисленного глутатиона не претерпевали существенных изменений. Примечательным является (рис.8) и относительно малое содержание фракции ФПН среди компонентов биотрансформации ПАК. что позволяет критически отнестись к роли этого компонента как ключевого метаболита системы СоА и главного предшественника митохондриального биосинтеза кофермента (Nakamu-га, 1969; Nakamura et al., 1967; Skrede, Halvorsen, 1979). Тем не менее значение ФПН как транспортной формы внутриклеточного метаболизма предшественников биосинтеза СоА может иметь место при введении препаратов ПТ(ПН) (см.выше), при утилизации простетичес-кой группы фосфопантетеинпротеидов (активированный липогенез), а также в процессе деградации СоА и дефосфо-СоА неспецифическими системами ферментативного гидролиза [34]. Последнее обстоятельство может быть отражено выявлением фракции ФПН в экстрактах гомо-генатов тканей (Nakamura, 1969) и подтверждено последующими исследованиями с применением солей тартрата для предупреждения неспецифического гидролиза нуклеотидных производных ПАК. Это особенно вероятно при исследовании образцов тканей голодавших животных, в органах которых происходит резкая активация микросомальных структур, характеризующихся высокой гидролитической активностью по отношению к нуклеотидным производным (Smith, 1978). Наши специальные исследования показали, что Фракция ФПН печеночных экстрактов в тзких условиях выявляется (метод ВЭЖХ) постоянно.

Табл.6 иллюстрирует результаты последующих экспериментов с целью изучения внутриклеточного метаболизма ,4С-ПАК в условиях интенсификации биосинтеза СоА. Очевидно, что митохондриальный транспорт продуктов биотрансформации ПАК в данных условиях является опережающим во времени и определяющим по массе аккумуляции ■ радиоактивных метаболитов витамина. Накопление радионуклида СоА в ПБК соответствует динамике радиоактивности цитозольной фракции, но не транспорту метаболитов в митохондрии. Хроматографическое

Таблица 6

Сравнительная характеристика распределения метки в тканях, субклеточных фракциях и ПБК печени нормальных (1) и пантотенатдефи-цитных (2) крыс через 30 мин и 4 ч после внутрибрюшинного введения им 14С-пантотената натрия в дозе 1,3 мкмоль/кг (57 мКи/ммоль)

Показатели Группы животных

1 2

30 мин 4 ч 30 мин 4 ч

Гомогенат печени

(имп/мин г) 10"6 0,46+0,06 0, 57±0,12 0, 61±0, 07 0,9210,09*

Цитозоль (имп/

мин мг"1 белка) 3800+600 4200+900 65001400 5500+500

Митохондрии, -"- 2100+250 5400±650* 4300+400 84001950*

ПАК-белковые

комплексы, -"- 700+100 1400±400 3200+350 2200+950

ПБК в % от общей

радиоактивности

цитозоля 18±3 29+1 50±2 44+4

Примечание: * - Р<0,05 относительно предшествующего срока

изучение (ВЭЖХ)радионуклидных компонентов митохондриальной и ци-тозольной Фракций обнаружило только 2 доминирующих компонента: СоА и дефосфо СоА. Фракция ФПН выявлена в небольшом количестве, детектировался также свободный пантотенат в цитозольном компарт-менте.

Введение эквимолярной ПАК-Ка дозе (по массе и удельной активности) препарата 3Н-ПТ не обнаружило столь заметной разницы у нормальных и голодавших животных в утилизации радионуклида как при введении 14С-ПАК. Через 30 мин после инъекции ПТ радиоактивность цитозоля возрастала в 1,5 раза, ПБК в 2 раза относительно контроля (5-10% от суммарной радиоактивности цитозоля). Эта величина к 4-часовому периоду наблюдений не превышала 20%. Исследование биотрансформации 14С-ПТ в цитозоле выявило пики ПАК, ФПН и СоА- Причем радиоактивность ФПН составляла чрезвычайно низкую ве-

личину. Относительное преобладание фракции ПАК в данном эксперименте может быть объяснено гидролизом ПТ до витамина пантетиназой (Бирге е! а1., 1973). В печени голодавших крыс биотрансформация ПАК в СоА происходила с большой скоростью, о чем свидетельствует коэффициент соотношения радиоактивности фракций СоА и ПАК (Экге-йе, 1973), равный у голодавших крыс 0,3 и 0,4, а в группе нормальных крыс только 0,1 и 0,2 через 30 мин и 4 ч после введения 3Н-ПТ.

Результаты этих исследований не позволяют сколько-нибудь значимо определить функциональную значимость ПБК, аккумулирующих значительную часть СоАБН в цитозоле (до 50% радионуклида) в условиях голодания, однако можно сделать важное заключение о том, что ФПН не играет существенной роли во внутриклеточной биотрансформации и транспорте ПАК-содержащих соединений . Судя по данным ВЭЖХ возможной формой транспорта предшественников СоА в митохондрии является дефосфо-СоА или одна из форм кофермента. Соотношение пиков радиоактивности этих двух компонентов показывает, что наиболее вероятной транспортной формой является дефосфо-СоА. 3

ешЛШК-Г) '10 120

А

Рис. 7. Динамика протеи-

дизации

1 4

С-пантотенатсо-

200

150

100

держащих метаболитов в составе ПБК (1), накопления их в цитозоле (2), гомогенате (3) и внецитозольное распределение радионуклидов (заштрихованное пространство) в печени крыс-отъемы-шей, получавших полноценный синтетический рацион (А) или лишенный витамина (Б) после однократной внутриб-рюшинной инъекции 14С-ПАК-Иа с удельной активностью 55,2 мкКи/ммоль в дозе 330 нмоль/кг.

Выполненные эксперименты на моделях индуцирования системы биосинтеза СоА клофибратом или голоданием все же не позволяют провести полную экспериментальную аналогию с моделью пищевой ПАК-недостаточности, послужившей базовой моделью для изучения биотрансформации ПАК и ПТ в клетках печени Шакатига еЬ а1., 1967). Сформулированная японскими исследователями концепция биотрансформации производных ПАК в печени животных опиралась на факт обнаружения значительных количеств предшественников биосинтеза СоА (ФПН + дефосфо-СоА) наряду с самим СоА в экстрактах ткани, подвергнутых хроматографическому или энзиматическому анализу (Иакашига, 1969; 1970). Аналогичный подход использован для исследования метаболитов ПАК в биологических жидкостях (Ыакашига, Ташига, 1974; 1981).

В наших экспериментах на животных с В3-недостаточностью (крысы-отъемыши) и животных, составляющих группу "параллельного кормления" использован радионуклид 14С-ПАК-На. В период от 10 до 60 мин эксперимента исследовали биотрансформацию ПАК, образование ПАК-белковых компонентов, накопление метаболитов в цитозоле и внецитозольном пространстве гепатоцитов (рис.7,8). Особенностью осуществления хроматографического разделения (классический вариант хроматографии на колонке с ДЭЛЭ-целлвлозой) была подготовка проб путем щелочной обработки, позволяющей избежать гидролиза СоА и дефосфо-СоА до ФПН (Яакагшга, 1969). Полученные результаты выявили насыщающийся характер распределения радионуклида в цитозоле

Рис. 8. Биотрансформация 14 С-ПАК-Ыа в печени нормальных (1) и ПАК-дефицитных (2) белых крьгс-отъемышей, получивших внутрибрюшинно витамин с удельной активностью 55,2 мкКи/ммоль в дозе 330 нмоль/кг. Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе экстрактов ткани, полученных щелочной обработкой . I -фракция свободной ПАК, II - фракция ФПН (ФПЮ.ГП- фракция СоА (де-фосфо-СоА).

ЕЫПЛШЕТ)'Ш1

и ПБК клеток печени нормальных и В3-дефицитных животных и прогрессирующее его накопление во внецитозольном пространстве клетки. Результаты изучения биотрансформации (рис.8) выявили резкий рост "экспорта" СоА и дефосфо-СоА во внецитозольное пространство на фоне последовательного снижения свободного витамина.

Рис.8,9 иллюстрируют незначительное присутствие фракции ФПН (исключая короткие сроки эксперимента) в вышерассмотренных условиях и,следовательно, результаты данного эксперимента позволяют исключить ключевую роль ФПН во внецитозольном транспорте предшественников биосинтеза СоА. Обеспечение основного клеточного фонда СоА в митохондриях осуществляется, по всей вероятности, за счет переноса из цитозоля дефосфо-СоА. К аналогичному заключению пришли в результате экспериментов на перфузируемом миокарде американские исследователи (ТаИШаШ, Ве1п11с11, 1992).

Рис. 9. Внутриклеточное

иш/Сыин-г) • Ю^ 1201

100

распределение 14С-ПАК-со-держащих метаболитов в печени крыс-отъемышей, получавших полноценный синтетический рацион (А) или лишенный пантотената (Б) через 10-60 мин после внугрибрюшинного введения 14С-ПАК-Ыа с удельной активностью 55,2. мкКи/ммоль в дозе 330 нмоль/кг. Изменение радиоактивности фракций полученных хроматографией на ДЭАЭ-целлю-лозп: 1 - ПАК вне цитозоля, 2 - ПАК в цитозоле, 3 - СоА, дефосфо-СоА, ФПН вне цитозоля, 4 - СоА, дефосфо- СоА, ФПН в цитозоле. Заштрихована зона внецитозольного накопле-шн ния ПАК-содержащих метаболитов .

Дополнительный эксперимент на животных с В3-недостаточностью

и группой "параллельного скармливания" синтетической диеты, которым в течение 10 суток инъецировали 14C-iIAK-Na в дозе 1,25 мг/кг (5 мкмолъ/кг, 6, 25 мкКи/кг массы, т.е. количество витамина не обеспечивало лечебно-профилактический эффект), выявил относительную стабильность структуры фонда СоА в митохондриальной фракции. Это выразилось в отсутствии изменений фракции общего СоА в митохондриях В3-авитаминозных животных и существенно меньшем снижении (на 21%) свободной формы кофермента (по сравнению с 30% в контроле). На рис.10 приведены результаты хроматографического разделения (ВЭЖХ) радионуклидсодержащих компонентов митохондриальной фракции печени (за 100% принята радиоактивность фракции свободного СоА). Доминирующими компонентами хроматографического разделения являются СоА и дефосфо-СоА. Последний метаболит выявляется в существенно меньшем количестве в митохондриях В3-авитаминозных животных, что может быть объяснено его быстрым превращением в СоА в условиях дефицита свободной формы СоА (см.выше). Только 10% (к уровню СоА) составляет фракция ФНН, являющегося продуктом обратимой реакции дефосфо-СоА-пирофосфорилазы митохондрий (Stewart et al., 1968).

Рис.10. Результаты хроматографического (ВЭЖХ) разделения пантотенатсодержащих метаболитов гомогената и митохондриальной фракции печени белых крыс-отъемышей, получавших с полноценным (А) или ПАК-дефицитным (Б) синтетическим рационом 14C-IIAK-Na в дозе 1,25 мг/кг (6,25мкКн/кг) в течение 5 или 10 суток. Метаболиты ПАК (радиоактивность фракции СоА принята за 100%): I- СоА, II -дефосфо-СоА+ПН, Ш-ФПН, IV-ПАК+ФПК.

Полученные нами экспериментальные доказательства существования значительных количеств дефосфо-СоА в митохондриальной фракции

печени животных, длительно получавших индикаторную дозу 14С-ПАК, а также присутствие этого компонента (наряду с СоА) в процессе экстрацитозольного переноса продуктов биотрансформации ПАК-содер-жащих предшественников СоА позволяет предположить, что основной транспортной формой предшественников биосинтеза СоА в митохондриях является дефосфо-СоА. В этой связи становятся понятными результаты тонкого изучения локализации ферментов биосинтеза СоА на внутренней митохондриальной мембране, которые показали более поверхностное расположение белка дефосфо-СоА-киназы относительно дефосфо-СоА-пирофосфорилазы (Зкгейе, На1уогзеп. 1983). Оба фермента структурно объединены в бифункциональном ферментном комплексе (т.н. "СоА-синтетаза митохондрий") и попытки их разделения были безуспешными (ЮоггаП, ТибЬв, 1983). Несмотря на то. что туннелирование дефосфо-СоА СоА-синтетазой не было выявлено в прямых исследованиях на гомогенном ферменте с использованием ФПН в качестве субстрата, исследователи обратили внимание на чрезвычайно низкий уровень Кл для дефосфо-СоА, равный 5 мкмоль/л (МоггаП, ТаЬЬэ, 1986). Этот факт объясняет трудную выявляемость дефос-фо-СоА как интермедиата в печени и, в особенности, в митохондриях, что может быть преодолено длительным введением ПАК-содержаще-го радионуклида с целью достижения адекватной для аналитического выявления удельной радиоактивности.

Концепция об изолированности митохондриального и цитозольно-го пула (фонда) СоА, основанная на непроницаемости внутренней митохондриальной мембраны для СоА (АЫко, 1975; Мее1у, 1984) также должна быть пересмотрена. Решающим аргументом, опровергающим традиционные представления, явилось открытие митохондриальной СоА-транспортирующей системы в миокардиоцитах (ТаШПап!, Нее1у, 1973). Показано, что митохондрии аккумулируют радиоактивный СоА, причем процесс имеет двухфазный характер. Первая фаза не зависит

ПФ Т*Г>ГРГ\ТТТ1Т,ГТ>,0 тг 'Т'Г^ГГТО^р Т»1 ГГ>Т Т Т X ГТТ. Г\ С^^СЙ Н8КС1СЬ"1Д^

ющийся процесс неспецифического связывания СоА на СоА-аде-нин-чувствительном месте митохондриальных мембран. Вторая фаза является энерго- и температуро-зависимой и характеризуется насыщающейся кривой специфического переноса СоА в митохондриальный матрикс (ТаП111ап1, 1989). Митохондриальный транспорт СоА в миокардиоцитах, как оказалось, моделируется рН матрикса и регулируется физиологическими концентрациями СоА. находящегося в цитозолс (величина Км транспорта- 17 мМ, близка к уровню СоАБН в цитозоле -

14 мМ) (ЫеП-ШепЕег еь а1.. 1978). Недавно сообщено об аналогичной митохондриальной СоА-транспортирующей системе в гепатоцитах (ТаМИап!, 1991). -

Мы наблюдали транспорт СоА в митохондрии, изолированные из печени крыс, (рис.11) в системе, содержащей ацил-донорный субстрат - пируват, путем одновременного контроля поглощения СоА ферментативным методом (ФГА-реагирующий СоА) и прямой радиометрией фракции кофермента, что дало возможность проследить во времени изменения удельной активности СоА. Содержание общего СоА в митохондриях зависело и от концентрации его в среде инкубации, пропорционально увеличиваясь от 25 до 100 мМ. Регистрируемый рост внутримитохондриального СоА происходит, вероятно, за счет накопления ацил-СоА, так как уровень фракции КР-СоА возрастал пропорционально времени инкубации, а среда содержала ацетильный донор-пируват. Подобные результаты получены при исследовании митохонд-риального транспорта СоА (ТаМПаШ, 1991).

иш/шн*нколь-1»мг-1 белка

1 .......... .........I I , I ■ I I I I ■

01 б 10 20 30

МИН

Рис.11. Накопление общего СоА (А) и изменение удельной радиоактивности кофермента (Б) в изолированных митохондриях печени крыс в зависимости от времени инкубации при рН 7,4 в среде (ТаМ-11ап1, 1991), содержащей радиоактивный препарат 3Н-СоА в количестве 3,6 нмоль (7мкКи/мкМ)/мл. В логарифмических значениях представлена зависимость накопления СоА в митохондриях (С1) от его концентрации (С2) во внешней среде.

Митохондрии печени, инкубируемые в течение 30 мин с радиоак-

тивным дисульфидом СоА в присутствии ДГТ были обработаны хлорной кислотой, нейтрализованы и после микрофильтрации подвергнуты ВЭЖХ-анализу. Выявлены 5 компонентов: СоА, дефосфо-СоА, ПАК. ФПН и ФПК, причем дефосфо-СоА и СоА в сумме составили 75% от всех выявленных радионуклидных компонентов. Эти исследования подтверждают существование механизма непосредственного транспорта СоА через мигохондриальные мембраны, однако, столь же вероятно, что транспортной формой параллельно является дефосфо-СоА, количество которого вполне сопоставимо с выявленным уровнем радиоактивной фракции кофермента к 30 мин инкубации. Кроме того, в условиях данного эксперимента, транспортирующийся в митохондрии свободный СоА, может быть субстратом "СоА-синтетазы" и, последовательно дефосфори-лируясь, трансформироваться в дефосфо-СоА и ФПН. Такого рода ферментативный механизм безусловно может быть важнейшим компонентом поддержания регуляторно необходимого соотношения свободного СоА и его ацилированных производных в митохондриальном матриксе (УЛШ-ашзоп, Согкеу, 1979).

Если в проблеме внутриклеточного транспорта предшественников биосинтеза СоА (гепатоциты, миокардиоциты) вопрос заключается в механизме переноса через митохондриальные мембраны дефосфо-СоА (или, что менее вероятно, ФПН), функционирующего наряду с альтернативной системой транспорта самого СоА ('ГайШаШ, 1991), то межорганный перенос ПАК-содержащих метаболитов, помимо названных компонентов, может включать такие компоненты как ФПК, ПТ(ПН) и, безусловно, свободную Форму витамина [11,35].

В опытах на изолированных гепатоцитах исследовали транспорт 14С-ЛАК-Ма по поглощению витамина из инкубационной среды. Процесс носил линейный характер в диапазоне концентраций ПАК до 1,5 мкМ

Рис.12. Изменение

12г

У,'103икп/глин

скорости

транспорта

14 С-ПАК-Яа изолированными гепатоцитамч в присутствии ДТТ и различных концентраций ПТ (1-без ПТ,2-изомолярных к ПАК, з- 5-кратных к ПАК,4-йзомолярных к ПАК без ДТТ) в среде

гжМ, ПАК БтиЩМИпсг (1985).

(концентрация витамина в крови человека 0,3-0,6 мкМ, в крови крыс - 1,0-1,4 мкМ), приобретая в последующем насыщающий характер.

В качестве продуктов метаболизма ПАК в изолированных гепато-цитах иденцифицированы (ВЭЖХ) ПАК,ФПК,ФПН и СоА, причем во все исследованные периоды инкубации (7-25 мин) максимальный процент (от поглощенного 14С-ПАК гепатоцитами) падал на нативную ПАК (78-90%). Уровень ФГ1К колебался в пределах 14-19%, снижаясь в последующие сроки, а фракция СоА выявлена только к 25 мин эксперимента. Судя по данным идентификации метаболитов, фосфорилирова-ние ПАК не является обязательным (доминирующим) фактором при транспорте витамина через плазматическую мембрану. Специальные исследования транспорта 14С-ПАК в присутствии окисленного и восстановленного глутатиона, гомо-ПАК, ФПН, СоА и ПТ (ПН) позволили установить, что только ПТ (ПН), являясь природным предшественником биосинтеза СоА. может поглощаться гепатоцитами и, следовательно, рассматриваться в качестве транспортной формы ПАК-содер-жащих метаболитов наряду со свободной формой витамина.

ПАК ПН

/////////

цитозоль

////////////

ПАК-киназа

//// ПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ МЕМБРАНА

фосфодиэстераза АПБ

СоА ПБК

4'-фосфо-пантетеин

-1

СоАББ-= СоА = ацил-СоА

АПБ

синтетаза АПБ

дефосфо-СоА-

МАТРИКС

транспорт //// ФПН ////////////

- и -

- СоА -~ Г -//// выброс

СоА 1

ацил-СоА

дефосфо-СоА-пирофосфорилаза

дефосфо-СоА-киназа

1и

дефосфо-СоА

СоА

СоА - синтетаза

СоА(ацил-СоА)~ трансферазы

ацил-СоА

Рис.13. Внутриклеточная система биосинтеза СоА в гепатоцитах.

Таким образом, проведенные исследования позволили представить общую схему соотношения процессов транспорта, биотрансформации предшественников биосинтеза СоА, их последовательности и взаимодействия с внутримитохондриальными процессами метаболизма ко-фермента. Как всякая схема, предложенная концепция внутриклеточной биотрансформации соединений нуждается в дополнительной экспериментальной проверке, однако объективно позволяет удовлетворительно объяснить имеющиеся в этой области экспериментальные факты (рис.13). Ключевыми элементами предлагаемой концепции являются впервые установленные нами факты: 1) выявление дефосфо-СоА как доминирующего предшественника системы биосинтеза СоА в митохондриях; 2) идентификация СоА-содержащих ПБК цитозоля; 3) доказательство транспорта ПН через плазматические мембраны, а также подтверждение транспорта нативного СоА через митохондриальнне мембраны гепатоцитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные при выполнении диссертационной работы результаты, анализ литературного материала и тенденции развития этой области коферментологии позволяют утверждать, что внутриклеточная структура фонда кофермента А (содержание и соотношение свободного СоА, фракций ацетил-СоА, короткоцепочечных и длинноцепочечных ацил-СоА, дисульфидных форм кофермента и СоА-белковых комплексов) является важнейшим фактором метаболической регуляции, изменение которого составляет ведущий механизм реализации витаминной и фар-макотерапевтической активности производных пантотеновой кислоты. Действие последних опосредуется системой биосинтеза СоА, в свою очередь являющей основной механизм поддержания внутриклеточного гомеостаза кофермента и осуществления цитозольно-митохондриально-го транспорта его предшественников. Препараты витамина, предшественники биосинтеза СоА (пантотенат, 4'-фосфо-пантотенат, панте-тин, пантенол, Б-сульфопантетеин, 4'-фосфо-пантетеин) проявляют существенные разлитая в процессе биотрансформации, транспорта, депонирования, взаимодействия с системой СоА, что обусловливает необходимость индивидуального исследования способов и показаний их фармакотерапевтического применения.

Развитие алиментарной недостаточности пантотеновой кислоты приводит к выраженным изменениям системы СоА в печени экспериментальных животных: более чем 2-х кратному падению уровня аце-тил-СоА, соотношения ацетил-СоА/свободный СоА, снижению уровня

свободного, кислоторастворимого и общего СоЛ, соотношения свободный СоА/общий СоА, адаптивному увеличению активности пантотенат-киназы и снижению активности синтетазы жирных кислот. Уровень предшественников биосинтеза СоА, являющихся АФ-реагирующими метаболитами (ФПН и дефосфо-СоА), подвергается наиболее быстрому уменьшению и в процессе развития ПАК-недостаточности достигает 50-60% от уровня, наблюдаемого у животных, получающих сбалансированный рацион.

АТФ: В-пантотенат-4-фосфотрансфераза (пантотенаткиназа, КФ 2.7.1.33), очищенная из цитозоля печени крыс до электрофоретичес-ки гомогенного состояния, обладает широкой субстратной специфичностью и с практически равной скоростью фосфорилирует пантотенат и пантетеин. АТФ является субстратом в комплексе с Мя2+. Активность фермента в митохондриальной фракции, а также альтернативный фермент - пантетеинкиназа (КФ 2.7.1.34) не выявлены. Установлен механизм регуляции активности фермента путем его деингибирования в системе, содержащей свободный СоА и обусловленный образованием смешанных дисульфидов кофермента с пантетеином, цистином или окисленным глутатионом. Как следует из материалов исследования, постоянным компонентом внутриклеточного метаболизма и депонирования пантотенатсодержащих соединений в цитозоле печени является ПаНТ0Т611аТбеЛК0БаК К0МПЛ6КС О МОЛВКуЛЯрНОИ МаССОЙ 50-70 Кд, ОиЛо.—

дающий N-ацетилтрансферазной активностью (КФ 2.3.1.5). В качестве витамин-белкового лиганда идентифицирована свободная форма СоА.

Доминирующим клеточным компартментом локализации фонда СоА клеток печени являются митохондрии, процессов биотрансформации пантотенат-содержаших соединений - цитозоль. В состоянии метаболического гомеостаза, развитии В3-витаминной недостаточности, активизации процессов липогенеза и липолиза (инсулиннезависимый диабет, голодание), интенсификации биогенеза митохондрий (введение клофибрата) процесс биотрансформации введенного радиоактивного витамина или его производных сопровождается быстрым и интенсивным экстрацитозольным транспортом метаболитов витамина, прежде всего, в митохондриальный компартмент клеток печени.

В опытах на изолированных гепатоцитах подтверждено ранее высказанное предположение о том, что основными формами межклеточного транспорта производных пантотеновой кислоты являются витамин и его природный серусодержащий аналог - пантетеин. В качестве превалирующего компонента внутриклеточного метаболизма и транс-

порта метаболитов пантотената наряду с CoASH идентифицирован де-фосфо-СоА. Обоснована концепция ключевой роли СоА-синтетазной реакции в поддержании гомеостаза внутримитохондриальной системы СоА. В процессе переноса 3Н-СоА через митохондриальные мембраны изолированных митохондрий происходит потеря 3-фосфатной группировки. Подтверждена возможность специфического транспорта СоА через митохондриальные мембраны в среде, содержащей ацил-донорный субстрат (пируват),

Выполнение настоящей работы, получение ряда приоритетных фактов и широкое внедрение результатов в народное хозяйство стало возможным благодаря сотрудничеству диссертанта и возглавляемого им научного коллектива с лабораторией гетероциклических соединений ВНИВИ, научными подразделениями Иркутского и Читинского мединститутов, Гродненского мединститута. Латвийской медакадемии и Киевского НИИ эндокринологии и обмена веществ. Наиболее важным итогом этих комплексных работ стало использование предшественников биосинтеза СоА в качестве эффективных патогенетических средств для стабилизации и коррекции метаболического гомеостаза и функционирования мембранных структур в условиях хронической алкогольной интоксикации [3,45,49]. глубокой гипотермии [32,46], постваготомического гастростаза [27], инсулнннезависимого диабета [28,29,38], алиментарной недостаточности пантотеновой кислоты [7,9] и некоторых других патологических состояниях [7,20,50] (A.c. СССР N902354, 971337, 1105172, 1425903).

Как показали совместные исследования с сотрудниками лаборатории биохимии клетки Института экспериментальной биологии им. Ненцкого ПАН, биосинтез СоА. является важнейшим биохимическим механизмом в предупреждении производными ПАК процесса поражения мембран асцитных клеток карциномы Эрлиха продуктами инициированного перекисного окисления [51,52]. В этой связи препараты ПАК успешно апробированы в качестве профилактических средств развития оксидативного стресса при операционной травме [А.с. СССР N 1666113].

- 42 -ВЫВОДЫ

1. Биосинтез СоА является ключевым механизмом поддержания гомеос-таза фонда кофермента в субклеточных компартментах клеток печени, сопряженным с внутриклеточными процессами транспорта и депонирования СоА и его предшественников (ФПН и дефосфо-СоА).

2. Установлено, что внутриклеточное соотношение фракций (фонда) СоА и, прежде всего, уровень СоА-БН, СоА-ББ, являются факторами регуляции начальной реакции биосинтеза СоА и важнейшим метаболическим эффектором в реализации витаминной и фармакотера-певтической активности производных пантотеновой кислоты.

3. Впервые выявлен молекулярный механизм регуляции активности пантотенаткиназы, заключающийся в деингибированш фермента (подверженного воздействию СоА-БН), посредством образования симметричного или смешанного дисульфида кофермента с низкомолекулярными соединениями (цистин, ПТ , окисленный глутатион).

4. Показано, что дефосфо-СоА является основным промежуточны?.! метаболитом внутриклеточной биотрансформации производных пантотеновой кислоты и цитозольно-митохондриального распределения конечных продуктов биосинтеза СоА.

5. Впервые идентифицирован связывающий СоА белок цитозоля гепато-цитов с молекулярной массой 50-70 кД, обладающий М-ацетилт-рансферазной активностью и свойством депонирования части цито-зольного фонда СоА в процессе его биосинтеза.

6. Постулируется лимитирующая роль начальных этапов биосинтеза СоА в реализации метаболических эффектов производных ПАК, отсутствие альтернативной (через пантетеинкиназу) системы биосинтеза СоА.

7. Выяснены особенности биотрансформации и активности производных ПАК - предшественников биосинтеза СоА в предупреждении и коррекции фонда СоА и СоА-метаболических процессов при В3-витаминной недостаточности, алкогольной интоксикации, глубокой гипотермии и других патологических состояниях.

Результаты диссертации изложены в следующих основных публикациях:

а) монографии и методические руководства -

1. Мойсеенок А.Г. Паптотеновая кислота// Экспериментальная витаминология. Под ред. Ю.М.Островского.- Минск: Наука и техника, 1979,- ГЛ.8,- С.267-320.

2. Мойсеенок А.Г. Пантотеновая кислота (биохимия и применение витамина).- Минск: Наука и техника, 1980,- 264 с.

3. Система ацетилирования у животных и человека при алкогольной интоксикации/ А.Г.Мойсеенок, П.С.Пронько, М.Л.Рыбалко, Е.А.Двербаум. Под ред. Ю. М.Островского// Этанол в обмене веществ,- Минск: Наука и техника, 1982,- Гл.7.- С.118-143.

4. Мойсеенок А. Г. Пантотеновая кислота// Методы оценки и контроля витаминной обеспеченности населения. Под ред. В. Б. Спири-чева.- М.:Наука, 1984.- С.111-120.

5. Метаболические эффекты недостаточности функционально связанных В-витаминов. Под ред. Ю.М.Островского/ А.Г.Мойсеенок, В. М. Шейбак, В. А. Гуринович, Т.И.Хомич, С. Н. Омельянчик. - Минск: Наука и техника, 1987,- Гл. 4,- С.163-225.

6. Производные пантотеновой кислоты: Разработка новых витаминных и фармакотерапевтических средств/А.Г.Мойсеенок,В.М.Копелевич, В.М.Шейбак,В.А.Гуринович.- Минск:Наука и техника,1989.-216 с.

7. Комар В.И., Васильев B.C., Мойсеенок А.Г. Водорастворимые витамины в инфекционной патологии. Под ред. Ю.М.Островского.-Минск: Наука и техника, 1991.- 208 с.

б) статьи -

8. Исследования в области переносчиков ацильных групп. 16. Гидролитическая устойчивость и ферментативное дефосформирование 4'-фосфо-0-пантотеновой кислоты/В.М.Копелевич, A.B.Лысенкова, В.В.Мищенко, А.Г.Мойсеенок// Химия природных соединений.-

1981,- N 4,- С.482-487.

9. Мойсеенок А.Г., Двербаум Е.А., Рыбалко М.А. Особенности биотрансформации препаратов пантотеновой кислоты у больных хроническим алкоголизмом// Хим.-фарм. журн.-1981.- N П. - С.24-28.

10. Мойсеенок А.Г., Двербаум Е.А., Рыбалко М.А. Биотрансформация пантотеновой кислоты в условиях витаминной недостаточности у человека//Вопр.мед. химии. - 1981,- N 6.- С.780- 784.

11. Мойсеенок А.Г. Пантотеновая кислота в питании человека и ее значение в стимуляции бифидофлоры кишечника// Вопр. питания.-

1982.- N 1. - С. 9-17.

12. Шейбак В.М., Мойсеенок А.Г.Характер изменений фонда кофермента А в связи с уровнем предшественников его биосинтеза при курсовом назначении клофибрата//Хим.-фарм. журн.-1983.-N7.-С.778.

13. Мойсеенок А.Г., Гуринович В.А., Овчинников В.А. Биосинтез кофермента ацетилирования в печени белых крыс в начальный период острой лучевой болезни// Радиобиология.- 1983.- Т. 23, К 5.- С.680-682.

14. Слышенков В.С., Мойсеенок А.Г. Газохроматографический метод определения пантоевой кислоты в витаминсодержащих препаратах// Хим.фарм.журн.- 1983.- Н 12.- С.1513-1516.

15. Количественное газохроматографическое определение пантолакто-на/ А.Г.Мойсеенок, В.С.Слышенков, Е. В.Сунозова, В. А. Гуринович// Вопр.мед.химии,- 1984.- Т.30, N 1.- С.126-128.

16. Радиометрический метод определения активности АТФ: D-пантоте-нат-4'-фосфотрансферазы/ Т.И.Хомич, А.И.Воскобоев, И.П.Черни-кевич, А. Г. Мойсеенок// Вопр.мед. химии. - 1984.- N1.-С.131-132.

17. Мойсеенок А.Г., Слышенков B.C., Лысенкова А.В. Кинетика образования пантолактона из пантотенатов и его количественное определение// Химия природн.соединений.- 1984.- N 1.- С.93-95.

18. Molseenok А.G., Gurinovlch V. А., KHomich T.I. Enzymatic transformation of biosynthetic precursors of coenzyme A// 111 International conference on cfiemistry and biotechnology of biologically active natural products: Sofia, 1985.- V. 5,-P. 249-254.

19. Гуринович В. A., Мойсеенок А. Г. Метаболизм пантотеновой кислоты и ее производных у животных с недостаточностью этого вита■ мина.// Укр. биохим. журн. - 1985,- 'Г. 59, N5.- С. 60-66.

20. СоA and CoA-dependent mitochondrial enzymes In galactosamine hepatitis/ A.Molseenok, V. Sheibak, B.Gorenstein, iu.Bandazi-evsky/У Hoppe-Seyler's. Z.Biol.Cnera.- 1986,- V.367.-P.221.

21. Ма1сяенак А.Г., Шайбак У.M. Суаднос1ны папярэдн1кау б1яс!нтэ-зу КаА, каферменту 1 яго ацьШраваных вытворных печан! у роз-ныя перыяды пантатэнавай недастатковасщ//Весц1 АН БССР. Сер.б1ял.навук.- 1986,- N 2,- С.74-77.

22. Гуринович В.А., Мойсеенок А.Г. Протеидизация и биотрансформация пантотеновой кислоты в печени при активации липогенеза// Вопр.питания.- 1986.- N 6.- С.50-54.

23. Биотрансформация пантотената, пантетина, фосфопантотената в печени крыс с недостаточностью пантотеновой кислоты/ А.Г.Мой-

сеенок, В. А. Гуринович, А.В.Лысенкова и др.// Хим.-фарм. журн. -

1986.- N 12,- С.1433-1437.

24. Moiseenok A.G.. SheibakV.M.. Gurlnovlch V.A. Hepatlc СоА, S-acyl-CoA, blosynthetlc precursors of the coenzyme and pan-tothenateproteln complexes ln dietary pantothenlc acid defl-clency// Int.J. Vit. Nutr.Res.- 1986,- V.57.- P.71-77.

25. Пратэ1дызацыя i б1ятрансфармацыя пантатэнату y цытазоле печа-Hl дыябетычных (db/db) мышэй/ A.Г.Майсяенак, В.А.Гурынов1ч, В.Б.Чыгер, I. Г.Абросава// Becui АН БССР. Сер.б1ял.навук. -

1987,- И 5.- С. 90-94.

26. Мойсеенок А.Г.,. Слышенков B.C., Дедович Т.В. Исследование устойчивости фосфоэфирной связи в 4'-фосфате D-пантотеновой кислоты// Химия природн.соед.- 1987,- M 2.- С.262-265.

27. Федченко С.И., Мойсеенок А.Г. Протективное действие пантетина на деинервированный желудок// Бюл.эксперим.биологии и медицины. - 1987,- Т.104, N 9.- С.359-362.

28. Биосинтез СоА и структура его фонда в печени мышей с диабетом (db/db) при введении производных пантотеновой кислоты/ А.Г.Мойсеенок, А.С.Ефимов, В.М.Шейбак и др.// Проблемы эндок-РИНОЛ.- 1987,- Т.33, N 6,- С.45-49.

29. Ингибирование пантетином литогенеза из пирувата в печени мышей db/db/ И.Г.Обросова, А.Г.Мойсеенок, А.С.Ефимов и др.// ДОКЛ. АН СССР,- 1987,- Т.297. N 1.- С.221-225.

30. Мойсеенок А.Г., Гуринович В.А., Лысенкова А.В. Разделение предшественников биосинтеза кофермента ацетилирования - производных пантотеновой кислоты хроматографией на ДЕАЕ-целлюло-зе// Химия природн.соедин.- 1987.- N 2.- С.258-262.

31. Б1яс1нтэз каферменту А у м1якардзе жывел1н, падвергнутых глы-бокай г1патэрм11/А. Г.Майсяенак,В. А. Гурынов1ч, С.М.Амельянчык i 1нш.//Весц1 АН БССР. Сер.б1ял.навук.- 1988.-М 1,- С.94-98.

32. Структура фонда кофермента А (КоА) и содержание ацетил-КоА в печени животных при глубокой гипотермии/А. Г.Мойсеенок, С. Н. Омельянчик, Л.Я.Утно и др.//Криобиология.-1988.-N 3.-С.36-39.

33. Мойсеенок А. Г., Дорофеев Б. Ф., Омельянчик С.Н. Защитный эффект производных пантотеновой кислоты и изменения системы метаболизма ацетил-КоА при острой интоксикации этанолом// Фар-макол.и токсикол.- 1988.- N 5.- С.82-86.

34. Резяпкин В. И., Мойсеенок А.Г. Фосфопротеинфосфатаза неспецифически гидролизует СоА//Укр.биохим.журн.-1988.-Т.60.- С.74-77.

35. Мойсеенок А.Г., Воробьев В.В., Хомич Т.И. Активный транспорт пантотеновой кислоты в тонком кишечнике крыс// Физиол.журн. СССР им.И.М.Сеченова.- 1988,- Т.74, N 1.- С.113-117.

36. Мойсеенок А.Г., Хомич Т.И., Резяпкин В.И. Восстановление активности пантотенаткиназы низкомолекулярными дисульфидами// ДОКЛ. АН СССР, - 1988,- Т.300, N2,- С.485-487.

37. Фармакокинетика 4'-фосфопантотената натрия/ А.Г. Мойсеенок. Б.Ф.Дорофеев. Л.Е.Холодов. Г.М.Яковлева// Хим.-фарм. журн.-

1988.- К 4.- С.401-406.

38. Действие фосфопантотената на биосинтез холестерина и его эфи-ров из различных предшественников в печени мышей db/db/ И.Г.Обросова, Ю.М. Островский, Л.М.Цырук, А.Г.Мойсеенок и др.// Биохимия,- 1988,- Т.53, N П.- С.1797-1802.

39. Разделение производных пантотеновой кислоты методом обращен-нофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии/ А. Г. Мойсеенок. В.И.Резяпкин, В. А. Гуринович, Т.В.Дедович//Химия природа, соединений. - 1938.- N8,- С.855-858.

40. Мойсеенок А.Г., Слышенков B.C.. Дедович Т.В. Кинетика гидролиза 4'-фосфата D-пантотеновой кислоты// Укр.хим. журн.-

1989.- Т.55, N 1,- С.79-82.

41. Содержание длинноцепочечных ацил-СоА митохондрий миокарда как энзимомодулирующий фактор в условиях глубокой гипотермии/ В.А.Корзан, Л.Я.Утно, А.Г.Мойсеенок и др.// Известия АН Латв.ССР. - 1989,- N 7.- С.87-89.

42. Резяпкин В.И., Гуринович В.А., Мойсеенок А.Г. Использование обраценнофазной высокоэффективной газожидкостной хроматографии для анализа производных пантотеновой кислоты.// Хим.-фарм.журн,- 1989,- М 3,- С.349-351.

43. Хомич Т.И., Мойсеенок А.Г., Воскобоев А.И. Очистка и некоторые свойства пантотенаткиназы из печени крыс// Биохимия. -

1990.- Т.55, вып. 8.- С.1468-1473.

44. Распределение и биотрансформация меченого пантотената в ци-топлазматической и митохондриальной фракции печени крыс с недостаточностью пантотеновой кислоты/В.И.Резяпкин, В. А. Гуринович, В.Б.Чйгер,А.Г.Мойсеенок//Вопр.питания.-1989.-N 5.-С.50-51.

45. Мойсеенок А.Г., Садовникова С.Ф. Пантетин: фармакологические свойства и клиническое применение// Пантетин: метаболизм, фармакология и регуляция обмена липидов: Сб. научн.статей.-Рига: Зинатне, 1991.- С.86-92.

46. Возможный механизм кардиопротекторной активности пантетина при глубокой гипотермии в связи с воздействием на метаболизм фосфатидилэтаноламина/М.И. Селевич, 3.Э.Липсберга, В.Г.Петушок, А. Г.Мойсеенок// Пантетин: метаболизм, фармакология и регуляция обмена липидов: Сб.научн.статей.- Рига: Зинатне,

1991.- С.104-107.

47. Дорофеев Б.Ф., Слышенков В.С., Мойсеенок А.Г. Ксенобиотичес-кий субстрат алкогольдегидрогеназной реакции в качестве антидота при острой алкогольной интоксикации// Хим.-фарм. журн.

1992,- Т. 5.- С. 24-26.

48. Хом1ч Т. I.,Шока А.Ч..Майсяенак А.Г. Асабл1васц1 рэгуляцьп ча-сткова ачышчанай АТФ:В-пантатэнат-4'-фосфатрансферазы з м!я-карда// ВесЩ АН Беларус!. Сер. б1ял.навук.-1993.- N2.-С.55-59.

49. Черникевич И.П., Дорофеев Б.Ф.. Мойсеенок А.Г. Возможные пути регуляции производными пантотеновой кислоты дезинтоксикацион-ных процессов в алкогольдегидрогеназной реакции// Еопр. мед.химии.- 1993,- N2,- С.38-40.

50. Moiseenok A.G., Khomlch Т.I.. Omelyanchik S.N., Gurinovlch V. А. СоА system and mechanism of body protection from complications of profound hypothermia//J.Hepatology.1995.-V.23.N1.P.219.

51. Slyshenkov V.S., Rakowska M., Moiseenok A.G., Woitczak L. Pantothenic acid and its derivatives protect Ehrlich ascites tumor cells against lipid peroxidation. // Free Radical Biology & Medicine. 1995,- V. 19, No. 6,- P. 767-772.

52. Slyshenkov V.S., Moiseenok A. G., Woitczak L. Noxious effects of oxygen reactive species on energy-coupling processes in Ehrlich ascites tumor mitochondria and the protection by pantothenic acid. // Free Radical Biology & Medicine. 1996,- V. 20, No. 6.- P. 793-800.

Утверждено к печати Институтом, биохимии им. А. И. Баха РАН

Подписало в почать 19 егктября 1336 г. 05ъея Z п.л.

Гирая 100 экз. Оригинал заказчика

Издано Институток бнохимии АН Беларуси 230017, Гродно, БЛК-50. РБ