Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы регуляции и кинетические свойства пантотенаткиназы печени крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы регуляции и кинетические свойства пантотенаткиназы печени крыс"

Pro 0.1

" /-.«-¡i АКАДЕМИЯ НШ БЕЛАРУСИ

/ ШСТШЭТ РАДИОБИОЛОГИИ

[1/10/

На правах рута плел

хомнч тймра штш

шштшш механизм рвгаяции и кинетические свойства одлнвдаганш ДЗЧШ

03.00.0S " ùxxsxsm

Автореферат

диссзртссзя па coîicjîekïîs ytjsïjoiî суоми':

Клггк - ХГ/З

Работа выполнена в лаборатории ко ферментов

Института бдаташш АН Беларуси *

Научные руководители: кандидат ыедицинских наук, старший научный сотрудник

А.Г.ЖШСЕШЖ

доктор биологических наун, профессор А.И.ЮСКС)ЕОЕВ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Т.С.ШРОЗКЙНА доктор медицинских наук, .профессор А.А.ЧИИШН

Ведущая организация - Институт биоорганической химии А£ Беларуси

Защита состоится "/ Т" декабря 1993 г. в часов на заседания ссециализировакшго совета Д 006.30.01 по защите дис-сертггрй на соискание ученой степени доктора биологических наук в Институте радиобиологии АН Беларуси по адресу: 220600, г.Минск, ул. Жэдииская, 2.

С диссертацией юш ознакомиться в библиотеке Института радиобиологии АН Беларуси.

Автореферат разослан шлбрл 1923 г.

Ученый секретарь специализированнаго совета кандидат биологических кауг ' А.М.ХС)Д)00ВСКАН

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Биологическое действие пантотеновой кислоты (ПАК, витамин В3) опосредовано образование« в организме человека и животных ряда метаболически активных производных ви-. тамина, среди которых центральное место занимает кофермент аце-тилирования (КоА). Ферментативный путь превращения пантотената в КоА начинается с его фосфэрилирования, катализируемого ATi: D-пантотенат-4 -фосфотрансферазой (пантотенаткиназой, КФ 2.7. 1.33) (Abilco, 1975 ). К настоящему времени ПАК-киназй была частично очищена из печени (AMko ot al., 1972 ), почек (Ка-raaawa ot al., 1972 ), сердца крысы (Fichor ot al., 1S85 ) и некоторых микроорганизмов (Shinlau et al., 1Э72; Jooto^aü, 1973 ). Гомогенный препарат фэраента подучен из Rravibactoriun eraioniagsnsa.

Интерес к детальному изучения пантотен&иышаэы определяется тем, что имеются доказательства клачзвоа рола ккчазы э б:-:о-трансфзрмацни витамина до кофэрионтнкх ^эгм f.AMfco, 1975; ЯоЫ-зЬая, lisely, 1984 ). Вместе с тем, фэрдент 'чело изучен. Отсутствуют биохимические данные, характеризуйте особ-эинос::) регуляции его активности, а такяе ззажоотнойениэ с альтернативно?, реакцией фосфэрнлцроьшшл пашатина (ИТ) (ЛТ5: глнто'.'зик—i -600-■>траисфзраза, КЗ 2.7Л.34) (3oveUl, 1S54 ). Наследования s этой области п?::обретса? особую аэтуалы:зсть, госта л ъ:г»' флкация пантотаиняиказц шгла €и быть оснсгэЯ для .;;сгг;;озлетая изхэнизиоэ транспорта прэдзэстзоннихов КоА э штохон.чрзя, содержащие ферионты биосинтеза soójpjsirra пз -1 -фэсфэпиг?32-;:и;:а. Репзниэ этого вопроса у?::от сг.:оэ ¡¡эглертдетегшюэ огизг.эгаэ г. врднзйгэй прэблсыэ биохимии кофэршкта А - фор-трэзак?,» пнутрл-i/итохондриельного фэнда КоА, состазл;зпэго os::os¡¡y3 састь .метаболически актишгаго КоА в клатяэ.

D последнее прэмя как з г-лшмгэ, ток я а лабораторных ис-слодопаииях наряду с вгктотеватом использугтся аналоги витамина как фяр^аетлогисесгае ц «этнзятаикшс.'в факторы. В этой связи исследования бяогогнтасгай аатаагастя вткк совдятакхй, обусловленной действием на ожташметь пзлтотвнаткякази, представляется весьма судастваюся. В разной ста гага ото относится я татаму Спофаятору как карняткн, соггрглз.чтто квгаболиз«^ которого с бйосинтазсм КоА прямее»» ивегшезэ пгслздорзталэЯ.

Основная цель и задачи работы. Целью настоящего исследования явилось изучение основных кинетических свойств и механизмов регуляции пантотенаткиназы, выделенной кз печени крыс. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

- разработать доступный, высокочувствительный ыетод определения активности ПАК-киназы в биологическом материале;

- выделить и очистить фермент из печени крыс до состояния гомогенности;

- изучить кинетические и структурные параметры пантотенаткиназы;

- провести сравнительный анализ пантетеин- пантотенатки-назной активности в цитоооле и митоховдриях;

- выявить возмоаше пути регуляции активности ПАК-киназы;

- исследОЕать субстратную специфичность фермента и фэр-ыальный механизм реакции.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенных исследований впервые был выделен электрофэре-тически гомогенный препарат пантотенаткиназы из печени крыс и определены его кинетические параметры, механизм реакции; установлено, что белок обладает четвертичной структурой и имеет ши рокуз субстратную специфичность в отношении донора фосфатной группы, а также акцепторов (аналоги ПАК); показано, что ПАК-ю наза фосфорклкрует пантетин только в тиольной форме, приведет доказательства отсутствия отдельного фермента (пантетеинкина-зы), катализкрувщего фосфорилирование пантетеина (ПН); изучен; регуляторныз свойства ПАК-киназы как ключевого фермента биосш теза КоА, определены константы мотивирования киназы предшественниками биосинтеза КоА, Кс'АЗН, ацил-КоА, что позволило суди' о значимости этого торможения скорости реакции в клетке; впер виз выявлено деингк&'розанне фермента (гюдверканного воздейст в;ш КЬАЗН) посредством образования симметричного дисульфида К к смешанных дисульфидов КоА с низкомокекулярнши соединениями (цнсткн, пантетин, окисленный глутатион), самостоятельно не я дящ 12.КСЯ оф&кторол! кииазы; гокезако, что Х-карнитин эацкг е? ПАК-кчяазу от юеткбирущего действия КоАЗН.

Врэдстакгекньв в работо данныа расашряэт к углубяшге сус стсущее о к.-глсс" глк-я представление о бкосинтесе КоА - с

ного из важнейших факторов, необходимых для нормального функционирования организма.

Практическое значение результатов заключается в том, что обнаруженная регуляция активности ПАК-киназы, контролирующей биосинтез КоА, за счет тиол-дисуль$идных взаимодействий эффекторов может стать основой для разработки наиболее оптимальных методов коррекции нарушений скорости биосинтеза кофэрмента при некоторых экспериментальных или патологических состояниях. Полученные сведения о роли аналогов пантотената в фуякционнрова-нии ПАК-киназы позволят более целенаправленно использовать их для медико-биологических целей.

Разработанный метод определения активности фермента дает возможность контролировать интенсивность биосинтеза КоА тканями животных на уровне ключевой реакции, а предложенный метод очистки ПАК-киказы может быть использован для препаративной наработки фермента и последующего использования в биотехнологии получения меченых предшественников биосинтеза КоА £4*— фосфо-ПАК, 4' -фосфэ-ПН). - ' .

На защиту выносятся следующие положею«:

1. Разработанный метод выделения гомогенного препарата пантотенаткиназы из печени крыс и определения ее активности с использованием радионуклидов.

2. ПАК-киназа аз печени крыс ингибируотся по принципу отрицательной обратной связи конечным продуктом (КоАЗН), его предшественниками биосинтеза м ацил-КоА. Регуляция активности фермента может осуществляться посредством "изолирования" КоАэн в ряде дисулы^идов (тер лтднсульфидщ.й метину). Свободней карнитин монет участвовать в регуляции фарманта.

3. Аналоги витамина с р^э^н^нда иоди^яациян^ в структуре £ нианиноэого фрагмента ¡^олакуяы ннгибируют ЦАКтЕинаэу.

В стабилизации крифордацин ЦАК и ее биологической алсгпртстп существенно присутстгиэ ^З-аланинорого ^загаент».

4. § рто£0»до«ях гепатоцитов отсутствует пактетеяккина-за. фосфоридировадае паятетина в гаояьцой ф>р$«в катализируется в цигоголе пантотенаткмназой.

5. Для фермента характерна четвертичная структур», формальный кинетический кехагазм ПАК-гиназной рва^в соответствует {«одели ?шнг-гоигя с у^рядочеин^ ррс^едакэтз&ч су бет-

ратов.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на:

- УИ Гродненском симпозиуме "Антивитамины в регуляции обмена веществ (эксперимент, клиника)" (Гродно, 1983);

- Всесоюзном симпозиуме " Биохимия, фармакология и медицинское применение производных витаминов и других предшественников коферментов" (Иркутск, 1983);

- ХУ1 конференции SEED (Москва, 1984);

- УН Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР, ГДР "Проблемы современной биохимии и биотехнологии" (Рига, 1985) ;

- У Всесоюзной научной конференции "Проблемы и перспективы ферментативного катализа* (Москва, 1987);

- совместном заседании лабораторий Института биохимии АН Беларуси и кафедры биохимии Гродненского мединститута МЗ Беларуси (1988, 1990, 1992).

Публикации. Результаты исследований изложены в 19 публикациях отечественной и зарубежной печати.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (191 источник).

' ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ. ИССЩОВАШЯ

В экспериментах использованы беспородные белые крысы массой 250-300 г, содержащиеся на сбалансированном рационе вивария. За 24 ч до забоя тавотных лишали корма,,сохраняя свободным доступ к воде. ■

Измерение ферментативной активности ПАК-киназы проводили разработанным нами радиоизотопным методом. Реакционная среда содержала: трис-ыалэатнкй буфер (рН 6,5) - 5.10~2Ы, АТ<5 - 5« 10"%, ЦзС12 - 5-Ю~3Ы, 14С-пантотенат натрия - 2,5-10"% (3,6 ыкКи/мкЫ), тнтотенат натрия - ô'IOtJ и 40-400 мкг ферментного препарата (в зависимости от степени очистки) в общем объеме I ш. Реакцию останавливали кипячением I мин, продукт ферментативной реакции и исходный субстрат разделяли хроматографией на колонке с ДЭАЭ-сефадексон А-25. Величину радиоактивности измеряли на жидкостном сцинтиляяционном счетчике

"Марк IIй (США). Концзнтрацию 4'-фос&пантотоната рассчитывали исходя из удельной радиоактивности *4С-ПАК (субстрат). Удельную активность фермента выражали в нмоль 4 -фэсфо-ПАК, образующейся за I мин на I мг белка.

Степень чистоты полученных препаратов ПАК-киназы оценивали методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле ( Davia, 1964 ). Количество субъединиц в белке и их молекулярную массу определяли после обработки образцов 1% додецилсульфатом натрия и 1% меркаптоэтанолом диск-электрофорезом в 10% полиакриламидном геле в присутствии додецклсульфата натрия (Weber, ОаЪот, 1969 ). Молекулярную массу нативного фермента находили гель-(З^льтрацией на колонке с сефадексоы Г-200 (Andrews, 1965).

Изучение кинетических характеристик ПАК-киназы проводили с использованием приемов стационарной кинетики и методов графического анализа (Корниш-Боуден, 1979; Уэбб, 1966).

Механизм реакции исследовали измеряя начальную скорость при поочередном варьировании концентрации обоих субстратов (Ке-savan at al., 1984; Florini, Vestling, 1957 ). Порядок присоединения субстратов к активному центру фермента изучали методом равновесного диализа (Муег, 1962).

Для выделения митохондрий использовали дифференциальное центрифугирование в растворе сахарозы (Мосолова И.М. и др., 1971), разрушение митохондрий проеодали 2-х-кратным замораживанием в жидком азоте и оттаиванием водной суспензии, а такяе обработкой детергентами - тритон Х-100 и солянокислым бензилами-ном (Орехович В.Н., 1977).

Содержанке белка в пробах определяли го методу Лоури (ьсга-ry et el., 1951 ), а также спэкторофотометрически при 280 ни ( Warburg, Eri3tisn, 1941).

Смешанные дисульфиды получали в реакции неферментативного тиол-дисульфидного обмена КоАзН с окисленным глутатионом, цис-тином или пантетином при 25°С (pH 10,5) в атмосфере азота. Избито к непрореагировавшего пантетина удаляли хроматографией на колонке с сервацелом ДЭАЭ-23 s Н. Дисульфид КоА был получен путем окисления кислородом КоАзН в растворе при pH 10,5. Частоту полученных дисульфидов контролировали методом ВЭлХ.

При изучении субстратной специфичности все- нуклеозидтри-фосфаты перед использованием очицали хроматографией на ДЕАЕ-

ТоуорвахХ 650 1!, элэдруя линейккм градиентом 0-0,4 М НаСх и концентрировали на этом же иокообменнике.

Концентрирование препаратов ПАК-киназы осуществляли с поморье мембранных фильтров СХ-30 фирмы "Ш-Шроге " (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ •

I. Очистка и некоторые свойства пантотенаткиназы из печени кшсы. Установление лимитирунцей роли пантотенаткиназы в биосинтезе КоА и исследования в области биотехнологнческого получения препарата ко фермента определили необходимость получения вы-сокоочищенного фермента для изучения его каталитических, регу-ляторкьж и структурных особенностей.

В разработанной нами схеме очистки использованы некоторые подходы, основанные на свойствах ПАК-киназы, ранее обнаруженных исследователями (лыко ег а1., 1972 ). Процедур*1 выделения имела ряд методических сложностей: фермент неконтролируемо инакти-вировался, в большинстве первоначально проведенных экспериментов наблюдался низкий процент выхода. В связи с этим, на всех стадиях очистки в качестве стабилизатора бьш использован глицерин в концентрации 10-20$, эффективность которого была более высокой в сравнении с другими стабилизаторами. На отдельных стадиях предотвращали инактивацию фермента добавлением 10"^ -- 10"^ Ы АТФ. Выделение ПАК-киназы включало 7 стадий: получение цитозодя печени, фракционирование протаыинсудьфатом, фракционирование сульфатом аммония, гель-фильтрацию на сефедексе Г-25, хроматографа) на гидроксиапатите с последующим концентрированием и гель-фильтрацию на.сефадексв Г-200. На завершаю-цем этапе очистки выход фермента составил 9,355, степень 9чистки - 199 раз. В таблице I приведены результаты всех стадий очистки пантотенаткиназы.

Полученный препарат фэраента гомогенный при электрофорезе в шлиакришидноы геле. В растворе 1055 глицерина и 5* 10""% АТ5 (рН 6,5) активность ПАК-киназы стабильна в течение 10 суток при 4°С.

Молекулярная масса нативного белка, определенная гель-^яяьтрацией на сефадексе Г-200, равна 98 ООО. ЬЬлекула белка состоит из двух полипептидных цэпеЯ с молекулярной массой 49 ООО. ■

Исследования форельного кинетического механизма ПАК-ки-

"назной реакции показали, что графики, о тратящие зависимость начальной скорости реакции от концентрации одного из субстратов при (фиксированных концентрациях другого, представляат собой серии параллельных прямых. Определение ыеханизиа по методу Корниш-Бэудена в графическом изображении выражается прямыми линия»!, пересекающимися в одной точке, лежащей на оси ординат. В совокупности с акалкео« результатов равновесного диализа, постулирован механизм реакции типа "пинг-понг" с упорядоченным присоединением субстратоз.

Таблица I.

Выделение и очистка пактотенаткиназа кз пэчекя прусы

Этапы очистки

: . Общая :Удельная Объем,:активность,:активность, мл :нмоль/иин :ныоль/мин : :на I иг

: :белка

:Бэсод :Сте-:пень :кента, :очяс-; % :ткл

130 103 0,043 . 100 I

50 92 0,18 89,3 4

8 76 0,45 73,7 II

21 74 0,73 71,8 17

SO 45 2,18 43,7 51

28 29 4,37 28,2 102

5,6 9,6 8,55 9,3 199

Экстракт

Фракциониро ванио протаыинсульфатом

Фракционирование сульфатом м.з'оняя (0,4^0,55 насщо-ния)

Гель-йиль

на се&адо

А-50

Хроматография на гидроксиапататэ

Гель-фильтрация ira сефадексо Г-200

2. Кинэтичзсгпе характеристики гантотанчтстназн. Исследование скорости реакции ПАК-гаш&зы э зазксидастн от рН свидетельствует, что максимальное значение алтяеяостз >гагодится а пределах 6,2-6,8 в различиях буфор:шх системах. —-ее?

колоколообразнуп форау. Прэдорлогэот, что,как я для мюпя ги-наз, осуществляющих пзрзнос групп с атф.?а второй суВстрат, происходит активация нкядазола гаетадата, .játj ¡¡второго 6,6-7,0.

Бкрсянтеа 4'-^o^jHWíaf^issía ,|!po®jsa* jqntaftío a revean

4-х часов при 37°С и содержании белка не более 2 мг.

Зависимость скорости реакции от концентрации ПАК при практическом насыщении другим субстратом имеет гиперболический характер. Ку для панто^ената, рассчитанная в координатах Лайнуи-вера-Берка равна 1,2'ЮМ.

Катионы двухвалентных металлов абсолютно необходимы в реакции. Максимальный эффект проявлял М^4". Кривая зависимости удельной активности фермента от концентрации ионов магния при постоянных значениях ПАК и АТФ (рис. I) характеризуется резким подъемом в ответ на увеличение концентрации магния, достигая максимума при соотношении Мд2+/АТ£ равным I. В условиях эксперимента (рН 6,5) около 8С$ АН находится в комплексе с который и является истинным субстратом фермента. К^ для комплекса, рассчитанная из двойных обратных'координат'равна 1,4*10Гт1.

Рис.1. Влияние на активность ПАК-ки-назы при постоянных значениях АТФ, равных 5* 10"% (а); зависимость скорости реакции от концентрации комплекса J%AT& 16).

Показано, что в ПАК-киназной реакции могут быть использованы также Ыг?+, в изомолярных концентрациях с ATS&.

3. Субстратная специфичность пантотенаткиназыт ПАК-киназа в отношении нуклеотидов обладает широкой групповой специфичностью при соотношении m/vhtp равный i. Наиболее аффективным донором фосфатной группы был АТ2, в присутствии ИТ®, ЦШ, УТФ, ГТФ максимальный синтез 4/-фосфо-ПАК достигал 65, 40, 31, 21% соответственно, если активность АТФ принять за 1008». АД® и &Ш не ингибировали фермент в концентрациях изоколярных AT®.

Г 9

5

s

1 3 zs

f¿ а

га 3>

\

И5

аз ¡í

-0,2 02 0,6 </S

1.0

24 40

MgCL2, мМ

fc i m. I

Результаты исследования влияния аналогов ПАК с модифицированным >3 -аланиновым участкси молекулы га скорость фэсфоря-лирования 14С - пантотената пригеденн в таблице 2.

Таблица 2.

Иктябирование пэдтотзЕаткнказн прокззоднкмя ШК

: % ингиб! [ропанкя пра соот-

Группа ; Производное : катанки су есграт:ингибитор

: 1:1 : 1:10 : 1:20

I а Пантоат натрия 2,8 0 0

б Пантоат кобальта 0 0 0

в Пантоат шипа 0 0 . П,5

г Пантоат меди 11,0 81,2 93,8

На Гоиопаитотзиопгя кислота 44,6 83.4 91,5

б Пантоилемяковзязршгясвая 43,1 37,2 94,3

кислота .

в Пзлтоклг^пйкапрсдаваа 20,4 73,3 77,3

кислота

г Пактояламгаоэнаятозая ! 64,0 95,5

кислота 75,4

д Пангойлглицян 9,3 16,4 S9,2

0 Пактонлпрояин 7.2 8,1 11,9

Ша в,Ь-к-бензилпантокястид 55,0 64,5 91,1

б D-H -бензидгаип'Ойламнд 65,1 91,0 93,5

в L-H - бензилплнгояля'кид 22,4 42,1 59,S

Ш Пантоилтаурнн 32,9 79,2 81,1

б Пантенол 30,6 73,S ?S,6

а Паитоилгомотауркн 43,1 62,2 72,î

У а Пантотян ¿9,8 92,0 93,4

б ГоЕОпантэтея SB, 6 75,1 73,Э

Примечание. Активность ПАК-гшяазы бгэ добаздапя вкгзбгтзра принята sa I00&.

v

Пэлученныэ д&инкэ поз ¡голата сделать прэдго^ожегсев о су^у-ственнэй {»ля J} -манянового фрапиэита шлекули субстрата в ферментативной прзврзденки, кзтализируеади гглготс'птгякзлзя. Об этом свидетельствует отсутстиэ фосфзрнлировагеш паитоевой кислоты, а таяке низкая еф^эктиЕКзеть соедошзкггй с уетроташэЯ углеводородной цзпьэ jô -алаиикового угаеэта (гяищт.Ерзлаи).

Среда исследуемых соединений гошпантотеновая кислота, гоыопантегин, пантоиламинокапроновая кислота ингибируют фермент по конкурентному типу к пантотенату с константой ингиби-рования 2,5'Ю~5, 6,8'10 и 4,0*10"% соответственно. Представления о фэсфорилировании пактетина, несмотря на высокую витщошнуа эффективность, в доступной литературе противоречивы: сообщения о фосфорилировании ПАК-киназой тиола или дисульфида пантетина и наличии специфического фермента - АТ5: панте-теин-4'-фосфотрансферазы (К® 2.7.1.34). Опыты, проведенные на высоЕООЧищенном препарате ПАК-киназы, показали, что без добавления восстановителей, ПТ на тормозил скорость ферментативной реакции. Выделенный белок катализировал фосфэрилирование пантетина, ко только в форыз тиола (пантетеин). Присутствие самостоятельного фермента кажется маловероятным, так как специфичность ПАК-киназы достаточно высока к пантетеину (К^ 2,7' •10""%), а разделения активностей го отношении к какдоыу из субстратов (шнгетенн, ПАК) на протяжении всей процедуры очистки фермента наш: не выявлено.

Ыитохондриальная фракция гепатоцитов исследовалась такие на наличие пантетеинккназы. Зто обусловлено тем, что транспортной формой витамина в митохондрии, предполосительно, является 4'-фосфопантетеин (Бкгейе, ЕаЗлгогввп, 1983 ), а исследования активности фермента в предыдущих работах осуществлялись без учета возможности присутствия его основных ингибиторов (КоАбЕ и ацил-КоА). В лизаге штоховдрий после предварительного диализа нами .обнаружена следовая активность фермента, в равной степени фосфорилирукцего ПАК и пантетеин (но не пантетин). Исследования позволяет подтвердить предполосениз об отсутствии первых ферментов биосинтетического цути КоА в митохондриях, механизм транспорта цитозольного 4 -фосфопанта-тенна через митохондриальные мембраны остается неясным.

4. Регуляция активности ПАК-киназы. Общее количество КоЛ в печени, содержание его в клеточных структурах значительно варьирует при различных физиологических и патологически состояниях (Моисеенок А.Г., 1980). На основании ряда исследований показано, что уровень КоА преимущественно регулируется зи счет изменения скорости реакций биосинтеза, среди которых основной СЕорость-лимитирущей является пантотенаткиназная реакция

(НоМзЬа*, Кае1у, 1935).

Наши эксперименты подтвердили, что ПАК-киказа ингибирует-ся по принципу отрицательной обратной связи КоАзН, предшественниками его биосинтеза, а также ацил-КоА. Тор/.ог.ение реакции КоЛБН, 4'-фосфопантетеином, дефосфо-КоА, ацетил-КоА, пальмито-ил-КоА осуществляется по бесконкурентному типу с К1 0,45; 1,4; 6,4; 12,0; 5,6 мкМ соответственно. Это ингибирование, вероятно, имеет существенное значение в физиологических условиях, так как концентрации ингибиторов в клетке превышают значения К.^ в 10 и более раз. В этой связи возникло предположение о существовании других механизмов в регуляции активности пантотенаткина-зы, позволяющих поддерживать стабильный внутриклеточный уровень КоА или обеспечивать дополнительным фондом кофермента в экстремальных условиях.

Среди большого числа исследуемых соединений цистин,■окисленный глутатион (2, 10 мМ), вносимые в инкубационную среду одновременно с КоАБН (1,5 или 3,0 мкУ), предупреждали ингибирую-щее действие кофермента на активность киназы (табл. 3), тогда как восстановленные формы этих препаратов подобным эффектом не обладали. В чистых системах (без КоАэШ цистин, окисленный глутатион и их тиолы не являлись эффекторами фермента.

Таблица 3.

Изменение скорости ферментативной реакции, катализируемй пантотенаткиназой, при внесении в инкубационную среду КоАзН или КоАзН в сочетании с дисульфидами

Относительная активность, %

мкМ' : Без-:дисульфидов : Глутатион, ыМ : Щетин, ыЦ

: 2 : 10 : 2 : 10

0 100 100 106 96 108

1,5 51 . 96 104 100 103

3,0 27 • 101 100 81 100

Для объяснения выявленного процесса деипгибирования, исследовали симметричный дисульфид КоА, а такае смешанные дисульфиды: КоА-З-э-глутаткон и КаА-З-а-пантетеин, синтезированные нами. Внесение в реакционную среду этих дисульфидов (1,5-9,0

{.Ц) нз приводило к ингибирования фгр.:ента, в то время как до- , бавлэние дитиотрейтола (20 мЫ) в аналогичную ферментативную среду значительно сникало активность ПАК-киназн (рис.2). Действие дитиотрейтола в датой ситуации связано с восстановлением дисульфидов до соответствующих тиольных форм, из которых отрицательно! зфйектороы является только КоАЗН.

Следовательно,.предупреждение окисленным глутатионом и ци-стииом ингибирущего действия КоАЭН на реакцию фосфорилирова-ния ПАК обусловлено образованием смешанных дисульфидов с КоА. Становится понятной высокая биологическая активность пантети-на, а роль дисульфидов КоА в клетке мояно рассматривать не только как резервную, но и регудяторнув.

• 13

"д ■■ щт

С, мхМ

Рис.2. Влияние различ-• ных концентраций сим- ■ метричного и смеианных дисульфидов КоА на скорость ЙАК-киназной реакции е срсде, содорпа-щей (а) и не содержащей (б) дитиотрейгол; в присутствии KoA-3-S -КоА (I), KoA-S-S-глу-татпона (2), KoA-S-S-пантетика (3).

В присутствии карниткна обнаружен такке эффект снижения ингибирущаго действия КоАЗД на активность пантотекаткинасы (табл.4). Биологическую активность проявляя только Ь -карни-ч'лн, D-форма была неактивна такне как к ацеяил-нарнитин.

Ингибированке ПАК-кинази еция-КЬА, по всей вероятности, имеет второстепенное значение. Эти соединения б плетке, боль-сеП частью, находятся б связанном с белком состоянии (КагаЪ, 196S; Brecher, 1963).

Исследование-циклические куклеотвдов (аденозкн-2 -З'-, гсенозин-З -5'-, гуанозин-2 -3 -циклофосфат) в концентрации I'IO-^ и 2,5" 10~% в ПАК-ккназной реакции не обнарусило измз-

Таблица 4.

Изменение скорости фосфорилирования пантотената в присутствии ацетил-каркитина и карнитина на фона ингибитора (KoASH)

КоАгН, Относительная активность, %

MKtá '. Контроль :D-карнитин,:L : 5 ыМ : -карнитин,: Ацетил-L -кар-5 мМ :нитин, 5 мЫ

0 1.5 3,0 100 54 23 102 57 22 98 101 89 54 78 26

нения ее скорости. Можно предположить, что при нарушении гормонального статуса (аллоксановый диабет, голодание), когда уровень общего КоА высокий, изменение соотношения тиол/днсу-льс]мд может служить важнейшим фактором изменения скорости синтеза НоА на уровне пантотенатшшазы.

ВЫВОДЫ

1. Разработан радиометрический метод определения активности АТ$: D-пантотенат-4 -фосфотрансфэразы (пантотенатнина-зы), основанный на количественном хроиатографическоа выделении продукта реакции, позволяющий контролировать активность фермента на всех этапах его изучения.

2. Впервые из печени крысы выделен электрофорэтическн гомогенный препарат пантотенатхин&зы со степенью очистки 199 раз и удельной активностью 6,55 кмоль за I шя на I мг белка. Выход - 9,355. Фермент обладает четвертичной структурой и состоит из двух идентичных субьединиц с молекулярной массой

49 ООО Да. Стабилизаторами белка являются глицерин и АТ5.

3. Зависимость начальной скорости реакции фосфорилирования витамина от концентрации АТФ и пантотената подчиняется кинетике Шхаэлиса-Ментен. АТЗ является субстратом в комплексе с Ку =1,4*10 И, Ку для пантотената - 1,2* Реакция протекает ш механизму "пинг-понг" с упорядоченным присоединением субстратов.

4. Пантотенатяиназа кз печени крысы имеет широкуэ спе-

'циничность б отношении субстратов. Донорами фосфатной группы могут быть Ига, ЦТФ, УТФ, ГЦ в комплексе с Mg2+ и эффективностью 65, 40, 31, 21% в сравнении с MgATaS2". $осфорилирование пантетина осуществляется только в тиольной форме (пантетеин), 1^=2,7.10-%.

5. Аналоги пантотената с замещениям в jS-аланиновой части молекулы инлибируют падтотенаткиназу по конкурентному типу. Отсутствие j3 ^аланина в структуре молекулы (соли пангоевой кислоты) , задена его пролином или глицином приводит к потере ингибитор»« свойств соединений.

6. 4'>-фосфопантетеин, дефосфэ-КоА, KoAsH и ацил-КоА инги-бируют фермент по бесконкурентному типу, что предполагает наличие регуляторного центра в молекуле пантотенаткиназы. Блокирование скорости реакции физиологическими концентрациями этих метаболитов, в особенности KoAsH, свидетельствует, что активность киназы la vivo постоянно подвержена -воздействию отрицательных эффекторов.

7. Обнаружен механизм регуляции активности фермента цу~ тем его деингибировдния в системе, содержащей KoAsH, который обусловлен образованием смешанных дисульфидов при взаимодействии пантетина, цистина или окисленного глутатиона скофермен-том. Эффектом деингибирования пантотенаткиназы обладает также L -карнитин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБШЮВАНВД ДО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хомич Т.И., Шейбак Б.Ы., Гуринович В.А. Динамика изменений фосфорилирования пантотената и структура фонда КоА печени белых крыс, получавших гомопантотенат и находившихся на диете с различным содержанием витамина// Антивитамины в регуляции обмена веществ (эксперимент, клиника): Тез, докл.- Гродно, 1983.-С.87-83.

2. Хомич Т.И. Способ определения субстратной специфичное^ ти пантотенаткиназы с 33Р-АТ£// Биохимия, фармакология и медицинское применение производных витаминов и других предвественг-ников ко ферментов: Тез. докл.- Иркутск, J993,=C.I42.

3. Хомич Т.И. Дантотенаткиназа из печени крыс: вцкелрдар, очистка , свойства// Биохимия, фармакология и медицинское прг мэнедае производных витаминов н других предшественников ко|£Рг ментов: Тез. докл.- Иркутск, 1983.-С.142-143.

4. Гуринович В.А., Хомич Т.И., Лысенкова A.B. Шидкостно-адсорбционная хроматография 4' -фосфопантотеновой кислоты//

I Всесоюзная конференция по хроматографии в биологии и медицине: Тез. докл.- Москва, 1983.-С.224.

5. Предшественники биосинтеза КоА каи регуляторы неогене-за кофермента и его S -ацил-производных/ Моисеенок А.Г., Шей-бак В.М., Гуринович В.А., Хомич Т.И. и др.// ХУ1 конференция ФЕЮ: Тез. докл.- ЬЬсква, IS84.-C.I62.

6. Хомич Т.И., Воскобоев А.И., Черникевнч И.П., ¿Зоисеенок А.Г. Радиометрический метод определения активности АТФ: Л-пан-тотенат-4'-фосфотрансферазы// Вопр. мед. химии.- 1984.-Т.30, »I.-C.I3I-I32.

7. Предшественники 4' -фосфопантетеина и регуляция биосинтеза КоА в цитозоле печени крыс/ Моисеенок А.Г., Гуринович В.А., Хомич Т.И. и др.// УШ Объединенный симпозиум биохимических обществ СССР-ГДР по проблемам современной биохимии и биотехнологии: Тез. докл.- Рига, I985.-C.II5-II6.

8. Moiseenok A.G., Gurinovich V.A., Khomioh T.I. Enzymatic transformation of biosynthetic precursors of ccenzyae A// XXI International conference on chemistry and biotechnology of biologically active natural products* Abstracto.- Sofia, 1985.-

P.249-254.

9. Структура фонда КоА печени животных в условиях торможения и интенсификации биосинтеза кофермента/ Моисеенок А.Г., Шейбак В.М., Хомич Т.И. и др.// У Всесоюзный биохимический съезд: Тез. докл.- Москва, I986.-T.2.-C.I08.

10. Моисеенок А.Г., Шейбак В.М., Омельянчик С.Н., Хомич Т. И. Структура фонда КоА митохондрий печени белых крыс при изменении субстратной обеспеченности начальных реакций биосинтеза кофермента// Всесоюзный симпозиум по молекулярным механизмам регуляции энергетического обмена: Тез. докл.- Пущино, I986.-C.I6.

11. Koiseenok A.G., Khoaich T.I. Properties and activity regulation of rat liver pantothenate kinase// 18-th FEЗЬ

feeting: Abstracts.- Xyublyana, 1987.-P.115.

■ 12. Synthesis, conformational analysis and biologicalstu-ay of pantothenic acid derivativen 'aith nodiiied ß -alanine fraonent/ Hoisecnok A.G., Golsbovich V.?., Khcrnich T.I. et al.// IУ International confercnce on cheniatry and biotcchno-

lcgy of biologicalli active natural products: Abstracts.-Budapest, 1987.-P.53.

13. ¿¡оисеенок А.Г., Хомлч Т.К., Резяпкин В.И. Тиол-дису-льфидные взаимодействия' КоА в регуляции активности пантотенат киназк// Химия физиологически активных веществ: Сборник научных трудов.- Нальчик, 1988.-С.62-63.

14. Моисеенок А.Г., Хомич Т.И., Резяпкин В.И. Восстановление активности пантотенаткиназы низкомолекулярными дисульфи доми// Доел. АН СССР.- I938.-T.300, .'Й.-С.485-487.

15. Khomich T.I., Uoiaeenok A.G., Rezyapkin V.I. Physiological regulators of pantothenate kinase froa rat liver// 14-th International congrcss of biochesiatry: Abstracts.- Pra, gue, 1988.-P.128.

15. Хоашч Т.К., ЬЬисеекок А.Г., Воскобоев А.И. Очистка и некоторые свойства пантотекаткинази из пзчена-крыс// Еиохииия - 190.-Т.55, JT3.-С. 1458-1473.

17. Or^anospecifity and control of CoA of biosyntheui3/ Uoiacor.ok A.G., IChOiich T.I., Gurinovich V.A. st al.// 15-th International congi-acc of bioc.hcrr.ictry: Abstracts.- Jerusalem 1S91.-P.1C0.

18. Jiierarchy of trrussport and regulatory nachaniu::3 ir. pantothenic acid biotransformation/ ¡¿oiacenok A.G., Khc:nich T I., Gurinovich V.A. ot al.// ХУ International congress cn vi-tiuuins and biofsctors in life science: AbstractsKobe, 1991.-2P-S2.-P.1CO.

19. Хошч Т.И. Лантетин и регуляция биосинтеза кофзрыенг; ацетилированля// Пантетин: ыотаболизи, фармакология н регуляция обмена лцпидов: Сборник ьаучшгх трудов.- Рига, 1991,-

С.112-118.

Подписано к печати I6.II.I993 г. Зак.ЯЗ Тир. 100 экз. Отпечатано нп ротапринте Гродненского государственного университета им. Я.Купалы.