Исследование кинетических параметров надмолекулярного кластера алкоголь- и лактатдегидрогеназы в печени крыс

Уланова, Александра Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование кинетических параметров надмолекулярного кластера алкоголь- и лактатдегидрогеназы в печени крыс
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование кинетических параметров надмолекулярного кластера алкоголь- и лактатдегидрогеназы в печени крыс"

На правах рукописи

УЛАНОВА АЛЕКСАНДРА АЛЕКСАНДРОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ НАДМОЛЕКУЛЯРНОГО КЛАСТЕРА АЛКОГОЛЬ - И ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В ПЕЧЕНИ КРЫС

03.01.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 8 НОЯ 2013 005539839

Воронеж 2013

005539839

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» (ФГБОУ ВПО «ННГУ им. Н. И. Лобачевского»).

Научные руководители: доктор медицинских наук

Зимин Юрий Викторович кандидат биологических наук Соловьева Анна Геннадьевна

Епринцев Александр Трофимович

доктор биологических наук, профессор, Воронежский государственный университет, заведующий кафедрой биохимии и физиологии клетки

Копытова Татьяна Викторовна

доктор биологических наук, Нижегородский филиал ФГБУ ГНЦДК Министерства здравоохранения Российской Федерации заведующая биохимической лабораторией

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Нижегородская

государственная медицинская академия Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Официальные оппоненты:

Защита диссертации состоится: «13» декабря 2013г. в /С.^О часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская площадь, д. 1, корп. 1, биолого-почвенный факультет

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного университета www.vsu.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан « ^ » 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Известно, что основу всех метаболических процессов составляют ферменты, изучению молекулярных механизмов действия очищенных препаратов которых уделяется огромное внимание. Однако такой классический подход мало что даёт для оценки каталитических свойств ферментов клетки, находящихся в динамическом взаимодействии друг с другом и обуславливающих ее функционирование и поведение (Зимин, 2001).

По современным представлениям "растворимые" ферменты могут обратимо взаимодействовать с субклеточными структурами. Контролируемая метаболитами обратимая адсорбция энзимов на мембранах органелл расширяет регуляторные возможности клетки (Mitchison, 1992; Parkhouse et al., 1992; Shmelev et al., 1997; Lushchak, 1998).

Способность образовывать комплексы характерна и для ключевого фермента биотрансформации печени алкогольдегидрогеназы (АДГ). Проводились эксперименты по включению АДГ в искусственные мембраны. Показано, что увеличение количества алкогольдегидрогеназы, связанной на единицу массы носителя, сопровождается снижением её активности, причиной которого являются возникающие диффузионные затруднения, препятствующие доступу субстратов к активным центрам фермента (Riveros - Rosas, 1997).

При физиологическом состоянии организма в реакции, катализируемой АДГ, происходит реокисление НАДН и увеличение НАД. Таким образом, АДГ участвует в регуляции отношения НАДН/НАД в клетке, конкурируя с другими НАД-оксидоредуктазами за кофермент. Имеются доказательства тесной метаболической связи между обменами субстратов и продуктов алкогольдегидрогеназной и лактатдегидрогеназной реакций: этанол-ацетальдегид и лактат-пируват (Сатанов-ская и др., 2002). Лактатдегидрогеназа (ЛДГ), как фермент гликолиза, играет важную роль в регуляции энергетического обмена клетки. Согласно литературным данным, ЛДГ способна взаимодействовать с мембранами субклеточных органелл, изменяя при этом свою активность (Hashimoto et al., 2008; De Bari et al., 2010). Ha основании различия кинетических характеристик для мембранной и «свободной» форм ЛДГ предполагается, что связывание фермента с митохондриями играет важную регуляторную роль в клетке. Динамическое равновесие между мембрано-связанной и «свободной» формами фермента в клетке регулируется субстратами и НАД/НАДН.

Существуют сведения о взаимодействии данных ферментов в условиях in vitro (Chaubey et al., 2001; Trivedi et al., 2005; Tsai et al., 2007; Nicolau et al., 2012). Ранее уже высказывалась гипотеза о связи образованного комплекса ЛДГ - АДГ со структурными компонентами клетки, в частности, с митохондриями (Зимин и др., 2001; 2009; 2012). На примере алкогольдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, можно рассмотреть возможности формирования различных вариантов надмолекулярных ансамблей, включающих различные конформационные состояния ферментов, существование фермент - ферментных комплексов, а также взаимодействие ферментов с мембранными структурами.

Следует отметить, что современное развитие медицинской энзимологии практически невозможно без изучения каталитических свойств мультиэнзимных комплексов клетки. Подобные исследования, в частности, раскрывают молекулярную сущность функции печени и составляют рациональную основу для разработки новых подходов к профилактике, ранней диагностике и возможности эффективного лечения различных патологических альтераций данного органа (Зимин и др., 2009).

Поражения печени наблюдаются уже в первые часы после воздействия различных ксенобиотиков (Зимин и др., 2001; Михайлова и др., 2009; Попова и др. 2009; СНсЫа е1 а1., 2011). К ксенобиотикам с высокой степенью избирательной гепатотоксичности относят хлорированные углеводороды, типичным представителем которых является тетрахлорметан (СС14). Отравление экспериментальных животных этим токсином по морфологической характеристике и биохимическим изменениям близко к острым поражениям печени у человека. Имеются данные, что в результате введения четыреххлористого углерода происходит усиление сво-боднорадикальных процессов и как следствие изменение метаболизма печени, сопровождающееся нарушением активности ферментативных систем (Тутельян и др., 2009).

В настоящее время отсутствуют какие-либо представления о роли функционального взаимодействия ЛДГ-АДГ в составе надмолекулярного кластера в молекулярных механизмах поражения печени на модели острого токсического гепатита при однократном действии ксенобиотика.

Цель исследования

Целью данной работы явилось исследование кинетических параметров надмолекулярного кластера ЛДГ-АДГ в норме и при токсическом действии гепатотроп-ного ксенобиотика СС14.

Задачи исследования:

1) Изучить особенности каталитической активности и кинетических свойств препаратов очищенных ферментов ЛДГ, АДГ в процессе формирования кластера ЛДГ-АДГ.

2) Сравнить изменения регуляторных свойств НАД-оксидоредуктаз в субклеточных фракциях печени крыс в составе кластера ЛДГ-АДГ в норме и при гепа-топатии.

3) Исследовать кинетические параметры ЛДГ и АДГ печени интактных животных и крыс, подвергшихся воздействию СС14.

4) Определить степень взаимодействия ферментативного комплекса ЛДГ-АДГ с мембраной митохондрий в норме и при токсическом гепатите.

Научная новизна работы

Впервые обосновано положение о взаимодействии ЛДГ и АДГ в составе надмолекулярного функционального кластера, связанного с мембранами субклеточных органелл клеток печени и предложена новая гипотеза ферментативного катализа в гетерогенной надмолекулярной системе на основе кластеро-кинетической модели.

Выявлено, что АДГ и ЛДГ прочно связаны с мембранами митохондрий и устойчивы к солюбилизирующему действию 0,15 М №С1.

Установлено, что характер взаимодействия ЛДГ, АДГ с мембранами субклеточных органелл печени, а также их каталитические свойства, зависят от физиологического состояния организма и изменяются при действии токсического ксенобиотика (тетрахлорметана).

Впервые выявлены особенности регуляции оксидоредуктаз печени при экспериментальном токсическом гепатите, выражающиеся в падении активности и нарушении процесса взаимодействия ферментов с мембраной митохондрий.

Научно-практическое значение работы

Получены данные изменения каталитических свойств ЛДГ, АДГ, которые расширяют современные представления о механизмах регуляции метаболической адаптации нормальной и патологически измененной печени, способствуя пониманию молекулярных механизмов резистентности данного органа к воздействию токсичных ксенобиотиков.

Основные научные положения, выносимые на защиту

1. Показана возможность образования надмолекулярного функционального кластера, ЛДГ-АДГ, для препаратов очищенных ферментов и различных ком-партментов клетки.

2. Установлено образование различных надмолекулярных кластеров ЛДГобр-АДГобр и АДГпр-ЛДГпр в субклеточных органеллах и участие их в молекулярных механизмах реализации метаболического эффекта гепатотоксичного ксенобиотика.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены и опубликованы на Ш-ей международной конференции всероссийского конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010 г.); на IV-ой международной конференции всероссийского конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж, 2011 г.); на 11-ой международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии» (Донецк, 2011 г.); в международной конференции «Актуальные проблемы науки и образования» (Куба, 2011 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК, и 7 тезисов докладов региональных, всероссийских и международных научных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа в объеме Afivl страниц содержит главы: обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Диссертация иллюстрирована 3JI таблицами, рисунками. Библиографические указания включают ¿^С литературных источника (отечественных■{$!> ; иностранных /).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В первой части работы в опытах in vitro изучали активность и кинетические характеристики очищенных препаратов алкогольдегидрогеназы (Fluka, из печени лошади), лактатдегидрогеназы (Reanal, из мышц свиньи) и их комплексов.

Во второй части работы проведены эксперименты на 105 крысах-самцах линии Wistar массой 180-200 г, содержащихся на стандартном рационе вивария при

свободном доступе к пище и воде, а также естественном чередовании суточной освещенности.

Все экспериментальные животные были разделены на следующие группы:

1 группа - интактные животные;

2, 3, 4 группа - контрольные животные после однократного введения физиологического раствора внутрибрюшинно (в/бр) и забитые на 1, 7 и 14 сутки соответственно;

5, 6, 7 группа - опытные животные после однократного введения в/бр тетрах-лорметана и забитые на 1, 7 и 14 сутки соответственно (табл. 1).

Таблица 1

Количество животных, использованных в эксперименте_

Условия эксперимента Количество животных

Интактные животные 15

Контроль: 1 сутки 15

7 сутки 15

14 сутки 15

Опыт: 1 сутки 15

7 сутки 15

14 сутки 15

Итого 105

Модель экспериментального токсического гепатита создавали внутрибрю-шинным введением 40% четыреххлористого углерода (ССЦ) в растительном масле в дозе 1,0 мл на 100 г веса однократно. Предварительно наркотизированные животные забивались декапитацией на 1, 7, 14 сутки от начала эксперимента.

Для диагностики печеночной недостаточности после воздействия ССЦ в плазме крови контрольных и опытных животных определяли уровень общего билирубина, активность аланинаминотрансферазы (AJIT), аспартатаминотрансферазы (ACT). Для оценки активности цитолитической реакции рассчитывали коэффициент де Ритиса, отражающий соотношение между активностью аминотрансфераз. Исследования осуществляли с помощью высокопроизводительного полуавтоматического биохимического анализатора CLIMA MC-15 (Испания). Для проведения анализа были использованы фирменные наборы реагентов (DiaSys).

Для оценки активности антиоксидантной системы и процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) использовали 10%-ные гомогенаты ткани, приготовленные на основе среды, содержащей 0,25 М раствор сахарозы, 0,01 М трис-НС1-буфер (рН=7,5) (1000 g, 10 мин, t—0 + 2°С). Активность каталазы определяли по скорости разложения перекиси водорода спектрофотометрическим методом Aeby (Сибгатуллина и др., 2011), концентрацию продукта ПОЛ, малонового диальдеги-да (МДА), - по методу М. Uchiyama и М. Mihara (1980).

Морфологические исследования выполнены с использованием морфометриче-ского комплекса LEICA DM 1000.Кусочки печени крыс для гистологического исследования фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине и заливали в парафин, из которого приготавливали срезы толщиной около 6-8 мкм. Срезы ткани окрашивали гематоксилином-эозином по Романовскому (Пирс, 1962). При увеличении 10x1,25x40, количество и объемную плотность жировых включений определяли на препаратах, окрашенных Суданом III после криостатной резки; при окраске препаратов по Фельгену на иммерсионном увеличении подсчитывали ко-

личество митозов гепатоцитов (Алов и др., 1972). Относительный объем соединительной ткани и паренхимы печени крыс на срезах определяли по методу Вайбеля (Weibel, 1979).

Исследование активности и кинетических свойств ЛДГ и АДГ проводили в гомогенате, цитоплазматической и митохондриальной фракциях на спектрофотометре Power Wave XS. Митохондриальную и цитоплазматическую фракции клеток печени экспериментальных животных получали методом дифференциального центрифугирования на центрифуге Multifuge 1 S-R (Ещенко, 1982; Финдлей, Эванз, 1990). Для оценки взаимодействия ферментов с мембраной митохондрий проводилась солюбилизация мембраносвязанных форм ЛДГ, АДГ путем суспен-дирования митохондрий в 0,15 М NaCl, pH 6,0 (Carmen, 1984; Sagrista et al., 1987).

Активность лактатдегидрогеназы определяли с использованием в качестве субстрата молочной кислоты (прямая реакция, ЛДГпр) и пировиноградной кислоты (обратная реакция, ЛДГобр) (Кочетов, 1980). Определение активности алко-гольдегидрогеназы проводили с использованием в качестве субстрата этилового спирта (прямая реакция, АДГпр) по методу W. М. Keung et al. (1989), с использованием в качестве субстрата ацетальдегида (обратная реакция, АДГобр) по методу М. Koivusalo et al. (1989).

Определение активности и кинетических свойств ферментов в надмолекулярной системе (АДГобр-ЛДГобр и ЛДГпр-АДГпр) проводили путем одновременного внесения в пробу субстратов для лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогена-зы.

Из первичных экспериментальных данных полной кинетической кривой накопления продуктов реакции АДГ и ЛДГ (зависимость скорости накопления продуктов (V) от времени (t) с начала реакции до полного расходования субстрата) в гетерогенной системе, используя математический метод, рассчитывали кинетические параметры: Kt, Vmax, Kn, Ка, Kd, Н, где Kt - интегративный показатель, характеризующий сродство фермента к субстрату (время полупревращения субстрата ферментативной реакции) (усл.ед.); Vmax - максимальная скорость реакции фермента (максимально возможное накопление продукта реакции при полном расходовании субстрата) (усл.ед.); Ка - коэффициент каталитической эффективности ферментативной реакции (усл.ед.); Кп - коэффициент кооперативности ферментативной реакции (усл.ед.); Kd - коэффициент структурных изменений фермента (усл.ед.); Н - коэффициент направленности метаболических изменений (усл.ед.) (Kostir, 1985; Зимин, 2001; Зимин и др., 2013).

Характер ингибирования и активации ферментов определяли по В.И. Крупян-ко (1990). Концентрацию белка в субклеточных фракциях оценивали по методу Лоури в модификации (Coakley et al., 1978; Dawson et al., 1984).

Результаты исследований обрабатывали с использованием t-критерия Стью-дента. Обработку данных осуществляли на персональном компьютере с помощью программы STATISTICA 6.0, BIOSTAT. При расчете t-критерия Стьюдента применяли поправку Бонферрони, позволяющую устранить ошибку первого рода, возникающую при сравнении более чем двух выборок данным методом (Гланц, 1998).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Активность и кинетические характеристики очищенных препаратов ферментов АДГ и ЛДГ (0,1 mg/ml) и их кластеров (0,1 mg/ml)

Полученные результаты показали, что каталитическая активность ЛДГпр в составе кластера АДГпр-ЛДГпр статистически значимо уменьшилась на 59%, тогда как удельная активность энзима АДГпр, наоборот, увеличилась на 56% по сравнению с активностью ферментов в односубстратных реакциях. Данная тенденция наблюдается и в обратной реакции: снижение каталитической активности ЛДГобр и повышение АДГобр в составе кластера (рис. 1).

Рис. 1. Активность препаратов очищенных ферментов ЛДГ, АДГ и кластеров АДГпр-ЛДГпр, ЛДГобр-АДГобр

Примечания: * - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе ЛДГпр и ЛДГобр; # - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе АДГпр и АДГобр

Можно предположить, что в растворе ЛДГ образует олигомерный гомокла-стер, где активные центры фермента экранируются, что и проявляется в снижении каталитической активности (Leyva F., 1998, Lee Y.G. et al., 2000). В отличие от ЛДГ, АДГ образует олигомерный гетерокластер, каждая субъединица которого выполняет определённую функцию. Одна субъединица образует хелатный комплекс и формирует третичную структуру энзима, вторая субъединица участвует в каталитическом акте (Гладышев и др., 2010). В процессе самосборки, индуцированной субстратами, образуются кластеры АДГпр-ЛДГпр и ЛДГобр-АДГобр, отличающиеся по своим характеристикам от препаратов очищенных ферментов (Fahien et ai., 1993).

Полученные результаты показали, что каталитические свойства очищенных препаратов исследуемых оксидоредуктаз как в исходном виде, так и в составе кластера, сопровождались изменением их кинетических характеристик (табл. 2).

Из данных, представленных в таблице 2, видно, что сродство лактатдегидро-геназы к субстрату в прямой реакции, а также каталитическая эффективность ЛДГпр в составе кластера АДГпр-ЛДГпр статистически значимо уменьшились соответственно на 83% и 77%, что способствовало падению удельной активности ЛДГпр комплекса (рис. 1). Кластеро-кинетический механизм снижения ферментативной реакции заключается в псевдоингибировании (Крупянко, 1990). Возможно, что в процессе ингибирования участвуют различные конформеры ЛДГ, обладающие разным сродством к субстрату - ингибитору (Сабурова и др., 2005).

Таблица 2

Кинетические свойства очищенных препаратов ферментов ЛДГ, АДГ и __кластеров АДГпр-ЛДГпр, ЛДГобр-АДГобр_

Показатели, усл.ед. ЛДГпр АДГпр АДГпр-ЛДГпр ЛДГобр АДГобр ЛДГобр-АДГобр

К! 1,62±0,09 5,33±0,28 9,67±0,51 *# 2,23±0,12 13,51±0,71 1,28±0,07 *#

Vmax 10,33±0,54 3,64±0,19 18,83±0,99 *# 22,41±1,18 18,81 ±0,99 9,35±0,49 *#

Ка 6,35±0,33 0,68±0,04 1,95±0,10 *# 10,06±0,53 1,Э9±0,07 7,33±0,39 *#

Кп 0,81 ±0,04 1,12±0,06 0,95±0,05 0,85±0,04 1,04±0,05 0,78±0,04 #

Kd 1,62±0,09 2,23±0,12 1,91±0,10 1,69±0,09 2,08±0,11 1,56±0,08 #

Установлено, что сродство к субстрату для АДГпр в составе кластера АДГпр-ЛДГпр уменьшилось на 45%. Выявлено статистически значимое повышение коэффициента кооперативности (согласованные конформационные изменения) комплекса АДГпр-ЛДГпр по сравнению с Кп ЛДГпр на 17%, но снижение Кп кластера по сравнению с Кп АДГпр - на 16%, что привело к аналогичным существенным структурным изменениям исследуемых ферментов в составе кластера АДГпр-ЛДГпр: Kd комплекса достоверно выше коэффициента структурных изменений ЛДГпр на 18%, но статистически значимо ниже на 15% по сравнению с Kd для АДГпр. Тем самым изменение кооперативности определяет возможность структурных переходов в энзиме (Permyakov et al., 2006).

Выявлено, что повышение активности АДГпр в составе кластера АДГпр-ЛДГпр происходит по типу двупараметрической рассогласованной активации. Полученные кинетические характеристики показали, что уменьшение активности ЛДГобр в составе кластера осуществляется по типу двупараметрически рассогласованного ингибирования, тогда как увеличение активности АДГобр в составе кластера - по типу псевдоактивации (Крупянко, 1990).

Возможно, что даже очищенные ферменты в растворе могут образовывать кластеры АДГпр-ЛДГпр и ЛДГобр-АДГобр (Терентьев и др., 2009). Последний тип «гипотетического» кластера (ЛДГобр-АДГобр) численно преобладает, имея высокую каталитическую эффективность (Ка =7,33), как и сродство к субстратам реакции (Kt=l,28) (табл. 2), но в нём меньше доля выраженных структурных изменений энзимов.

Для очищенных препаратов ферментов каталитическая эффективность ЛДГ и АДГ в обратной реакции превышает каталитическую эффективность в прямой реакции. В процессе формирования кластера Ка ЛДГ как в прямой, так и в обратной реакциях уменьшается, тогда как Ка для АДГобр, АДГпр увеличивается (Ка ЛДГобр-АДГобр > Ка АДГпр-ЛДГпр).

Таким образом, нами предлагается кинетический подход к кластерной организации ферментативного катализа, в процессе которого изменяется кластеро-кинетическая организация фермента в среде.

С нашей точки зрения, кинетический энзимокластер (англ. cluster - скопление) - это динамическое объединение нескольких гомо- (гетеро-) конформеров фер-

мента в процессе катализа, которое может рассматриваться как самостоятельная единица, обладающая определёнными свойствами.

Предполагается, что для любых ферментов существуют как минимум два основных ферментативных конформера: каталитический и агрегационный. Каталитический конформер характеризуется тем, что при объединении субъединиц в единое целое, все активные центры фермента остаются активными. В противоположность ему, агрегационный конформер характеризуется такой пространственной организацией, при которой часть активных центров фермента экранируются (Зимин и др., 2012).

В целом, каждый энзимокластер представлен взаимодействием различного отношения каталитических и агрегационных конформеров между собой. В результате получаются три кинетических варианта энзимокластера:

1. При равном количестве каталитических и агрегационных конформеров у фермента практически не проявляются кооперативные свойства его субъединиц (Кп= 1).

2. При условии, когда каталитических конформеров больше, чем агрегационных, у фермента имеет место положительная кооперативность взаимодействия субъединиц (Кп > 1).

3. Если больше агрегационных конформеров, чем каталитических, то фермент обладает отрицательной кооперативностью (Кп < 1).

На основе кластеро-кинетической концепции и анализе кинетических параметров можно охарактеризовать изменения ферментативных процессов в составе кластеров. У ЛДГпр с отрицательной кооперативностью, энзим образован, преимущественно, агрегационными конформерами, тогда как АДГпр обладает положительной кооперативностью и состоит большей частью из каталитических конформеров. Кластер АДГпр-ЛДГпр практически не проявляет кооперативности, что вероятно обусловлено взаимоисключающими кинетическими свойствами очищенных ферментов, входящих в состав комплекса.

Рассматривая ферментативные механизмы, характерные для препаратов очищенных ферментов, для прямой и обратной реакций АДГ, ЛДГ и их комплексов АДГ-ЛДГ было показано, что действие двупараметрической рассогласованной активации или другими словами аллостерического ингибирования связано с отдельными участками фермента АДГпр вне активного центра. Такое связывание влечет за собой конформационные изменения в молекуле фермента, которые приводят к уменьшению его активности. В молекуле АДГ существуют области, способные связываться с ингибиторами. Таких участков насчитывается около четырёх. Например, свободная область стерически доступная для лигандов, близких по размеру к этанолу, участок, находящийся между атомом цинка, никотиновым кольцом кофактора и остатком ТЬг 48 (Куценко и др., 2000). Механизм ферментативной реакции для ЛДГпр в составе кластера АДГпр-ЛДГпр заключается в псев-доингибировании. Данный тип реакции выполняется при условии: К1 АДГпр < Ю: АДГпр-ЛДГпр и Ушах АДГпр > Ушах АДГпр-ЛДГпр.

Снижение активности ЛДГобр по типу двупараметрического рассогласованного ингибирования (бесконкурентного) в составе кластера ЛДГобр-АДГобр имеет место быть, если К1 ЛДГобр-АДГобр < КЛ ЛДГобр, Ушах ЛДГобр > Ушах

ЛДГобр-АДГобр. Механизм псевдоактивации, характерный для АДГобр, наблюдается при Kt ЛДГобр-АДГобр < Kt ЛДГобр, a Vmax' ЛДГобр > Vmax ЛДГобр-АДГобр (Крупянко, 1990).

Согласно литературным данным, комплексообразование АДГ с ЛДГ позволяет проводить целенаправленную модификацию свойств молекул препаратов очищенных ферментов (Martin et al., 2003).

Способность очищенных препаратов ферментов образовывать кластеры побудило продолжить исследование по выявлению роли функционального взаимодействия ЛДГ-АДГ в составе надмолекулярного кластера в норме и при токсическом поражении печени.

Активность и кинетические параметры АДГ, ЛДГ и их кластеров в субклеточных фракциях печени крыс в норме и при токсическом гепатите

Полученные результаты показали, что каталитическая активность ЛДГпр в цитоплазматической фракции печени у интактных и контрольных животных в составе кластера АДГпр-ЛДГпр уменьшилась, а АДГпр, наоборот, увеличилась (рис. 2). Анализ кинетических параметров ферментативных реакций свидетельствует, что снижение активности ЛДГпр происходит по типу бесконкурентного ингибирования. Активность АДГпр повышается за счёт двупараметрически рассогласованной активации (Крупянко, 1990). _________________________________

■ Инт ИК И1 сутки ■ 7 сутки ■ 1Д сутки

Рис. 2. Активность ЛДГ, АДГ и кластеров АДГ-ЛДГ в прямой и обратной реакциях в цитоплазматической фракции печени у интактных животных и при токсическом гепатите

Примечания-. & - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе ЛДГпр, ЛДГобр; л - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе АДГпр, АДГобр; * - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе «интактные»; # - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе «контроль»

Уменьшение активности лактатдегидрогеназы в прямой реакции цитоплазматической фракции печени на 1, 7 и 14 сутки после поражения способствует накоплению лактата. При этом активизируется протеолиз, усиливается внутриклеточный ацидоз, что, в свою очередь, вызывает повреждение цитомембран. Увеличение количества лактата сопровождается инициацией перекисного окисле-

ния липидов и накоплением в жидких средах его продуктов: малонового диальде-гида, диеновых и триеновых конъюгатов, гидроперекисей липидов, диенкетонов (Поздняков, 2009). Результатом этого является деструкция клеточных мембран и разрушение клеток (Яи^е, 1991).

Результаты, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о том, что воздействие четыреххлористым углеродом сопровождается статистически значимым увеличением уровня малонового диальдегида (на 1-е сутки - на 49%, на 7-е сутки - на 71%) по сравнению с контролем. Активность каталазы снизилась на 1, 7 и 14 сутки на 19%, 25% и 15% соответственно.

Таблица 3

Активность каталазы и уровень малонового диальдегида в печени крыс

контрольной и опытных групп

Показатели Контроль Опыт (1-е сутки) Опыт (7-е сутки) Опыт (14 - е сутки)

МДА, нмоль/мл 8,29±0,48 12,33±0,38* 14,21±0,56* 9,04±0,49

Каталаза, мкмольН202/минхмг белка 0,251 ±0,007 0,204±0,009* 0,187±0,012* 0,214±0,006*

Примечания: * - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к контрольной группе

Из данных, представленных в таблице 4, которые характеризуют печеночную недостаточность и отражают «синдром цитолиза», следует, что активность АлАТ и АсАТ статистически значимо увеличились на 1-е сутки после поражения тет-рахлорметаном в 2,4 и 1,8 раза, на 7-е сутки - в 2,8 и 1,6 раза, на 14-е сутки - в 1,9 и 1,4 раза соответственно. При этом принимали во внимание, что АлАТ - ци-топлазматический фермент, и его уровень повышается при легких формах повреждения гепатоцитов. В то же время АсАТ - митохондриальный фермент, и его активность отражает более тяжелую степень поражения печеночных клеток. Отмечено снижение коэффициента де Ритиса на 1, 7 и 14 сутки после воздействия тет-рахлорметаном на 26%, 44% и 24% соответственно по сравнению с контролем.

Таблица 4

Активность аминотрансфераз и уровня билирубина в плазме крови крыс по-

сле воздействия тетрахлорметана

Показатели Контроль Опыт (1-е сутки) Опыт (7-е сутки) Опыт (14 - е сутки)

АсАТ, мкмоль/мин*л 279,2±56,6 494,18±26,18* 442,23±42,6* 398,04±37,08*

АлАТ, мкмоль/мин*л 150,0±47,1 354,20±21,72* 421,3±75,7* 278,7±9,1 *

Коэф. де Ритиса 1,86 1,39 1,04 1,42

Общий билирубин, мкмоль/л 1,08±0,03 5,15±0,09* 3,31 ±0,05* 2,07±0,07*

Примечания: * - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к контрольной группе

Полученные результаты свидетельствуют о том, что токсический гепатит сопровождается повышением уровня общего билирубина в плазме крови крыс через

24 ч после введения СС14 в 4,8 раза по сравнению с контролем, на 7-е сутки после воздействия - в 3 раза, на 14-е сутки - в 2 раза (табл. 4).

Повышение активности АДГпр в составе кластера на 7 и 14 сутки после поражения способствует накоплению высокотоксичного ацетальдегида, который в повышенных концентрациях нарушает структуру и функции плазматических мембран (Ашмарин, 2003). Полученные результаты показали, что каталитическая активность ЛДГобр в цитоплазматической фракции печени у интактных и контрольных животных в составе кластера ЛДГобр-АДГобр уменьшилась на 35% по типу псевдоингибирования, а АДГобр, наоборот, увеличилась на 74% в результате двупараметрически рассогласованной активации (Крупянко, 1990) (рис.2).

Установлено, что на 1, 7 и 14 сутки токсического гепатита происходит снижение активности лактатдегидрогеназы в обратной реакции. Увеличение АДГобр в цитоплазматической фракции печени на 1, 7 и 14 сутки после поражения способствует накоплению этанола и снижению высокотоксичного ацетальдегида.

Изменения активности ЛДГ, АДГ, их комплексов в норме и при токсическом гепатите опосредованы, в частности, изменением кинетических свойств, наиболее выраженным на 14 сутки после воздействия ССЦ (табл. 5).

Таблица 5

Кинетические свойства ЛДГ, АДГ и кластера АДГ-ЛДГ в цитоплазматической фракции печени при токсическом гепатите

Показатели (усл.ед.) Серии экспериментов

Интактные животные Токсический гепатит (14 сутки)

ЛДГ ЛДГ АДГ-ЛДГ ЛДГ АДГ АД1 -ЛДГ

прямая реакция обратная реакция прямая реакция обратная реакция прямая реакция обратная реакция прямая реакция обратная реакция прямая реакция обратная реакция прямая реакция обратная реакция

Vmax 29,6« ±1,56 14,37 ±0,76 1,96 ±0,10 2,46 ±0,13 8,19 ±0,46 &л 54,69 ±2,9&" 5,74 ±0,32 46,02 ±2,54* 6,37 ±0,35* 4,03 ±0,22* 14,85 ±0,81* 16,18 ±0,88*&

Ка 4,49 ±0,24 5,63 ±0,29 2,07 ±0,10 2,29 ±0,12 2,54 ±0,15 &я 4,97 ±0,26&А 1,72 ±0,10 16,04 ±0,89* 1,06 ±0,06* 1,51 ±0,08* 1,48 ±0,08* 13,09 ±0,72*&

Кп 1,10 ±0,06 1J2 ±0,07 0,96 ±0,05 0,76 ±0,04 0,88 ±0,05 & 1,05 ±0,06&л 1,21 ±0,07 0,87 ±0,05* 1,1 ±0,1* 0,86 ±0,05* 1,06 ±0,06* & 0,77 ±0,04*&

Kd 2,18 ±0,11 2,64 ±0,14 1,49 ±0,08 1,52 ±0,08 1,76 ±0,09 2,10 ±0,11&я 2,43 ±0,26 1,74 ±0,09* 2,2 ±0,1* 1,73 ±0,10* 2,11 ±0,12* 135 ±0,08*&

Kt 6,60 ±0,35 2,55 ±0,13 0,95 ±0,05 1,08 ±0,05 3,22 ±0,17 10,99 ±0,58 &я 3,33 ±0,18 2,87 ±0,16* 5,99 ±0,33* 2,67 ±0,15* 9,99 ±0,55* 1,24 ±0,06*&

Примечания: & - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе ЛДГпр, ЛДГобр; л -статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе АДГпр, АДГобр; * - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе «интактные»

Показано, что на 14 сутки после поражения тетрахлорметаном статистически значимо уменьшилось сродство АДГпр к субстрату по сравнению с интактными животными в цитоплазматической фракции печени.

Кооперативность ЛДГпр цитозоля в составе кластера АДГпр-ЛДГпр снизилась, для АДГпр - увеличилась, что отразилось на структурных перестройках ферментов в комплексе. Отмечено разнонаправленное изменение каталитической эффективности ЛДГпр и АДГпр в кластере АДГпр-ЛДГпр.

На 14 сутки после действия тетрахлорметана сродство кластера ЛДГобр-АДГобр в цитоплазматической фракции увеличилось по сравнению с интакными животными, способствуя повышению каталитической эффективности.

В митохондриальной фракции в составе кластеров АДГпр-ЛДГпр и АДГобр-ЛДГобр удельная активность ЛДГпр и ЛДГобр печени интактных и контрольных животных уменьшилась на 59% и на 22% соответственно, каталитическая активность АДГпр увеличилась на 84%, АДГобр - повысилась на 53% (рис. 3). Из анализа кинетических параметров ферментативных реакций следует, что механизм понижения активности ЛДГпр и ЛДГобр в составе кластера - псевдоингибирова-ние. Увеличение активности АДГпр происходит по типу двупараметрически рассогласованной активации (Крупянко, 1990).

■ И нт ■ К ■ 1 сутки ■ 7 сутки ■ 14 сутки

Рис. 3. Активность ЛДГ, АДГ, кластеров АДГ-ЛДГ в прямой и обратной реакциях в митохондриальной фракции печени в норме и при токсическом гепатите

Примечания. & - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе ЛДГпр, ЛДГобр; л - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе АДГпр, АДГобр; * - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе «интактные»; # - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе «контроль»

Дисфункция митохондрий - это начальный этап проявлений гепатотоксично-сти, а сами митохондрии служат первичной мишенью для токсинов (Martin et al., 2003).

Уменьшение удельной активности лактатдегидрогеназы в прямой реакции в митохондриальной фракции печени на 1 сутки после поражения и повышение удельной активности ЛДГобр на все сутки после введения крысам тетрахлроме-тана способствует накоплению лактата и развитию тканевой гипоксии. Увеличение активности АДГпр и снижение АДГобр в митохондриальной фракции печени крыс на 1,7, 14 сутки после воздействия СС14 вызывает возрастание уровня высокотоксичного ацетальдегида, который ингибирует активность многих ферментов

мембран и сыворотки крови (Кленова, 2006). Повышенное содержание ацетальде-гида и лактата, которые могут стимулировать синтез коллагена фибробластами, приводит к накоплению соединительной ткани в печени и развитию цирроза, а на его основе опухолевого роста и возникновение гепатом (Березов и др., 1997; Ма-янский и др., 1998).

Таким образом, в митохондриальной фракции печени на 1,7, 14 сутки после однократного введения токсического ксенобиотика, тетрахлорметана, возникают изменения активности ЛДГ и АДГ, что указывает на существенные нарушения в метаболических реакциях в данном компартменте клетки: доля ацетальдегида, лактата возрастает, а доля эндогенного этанола и пирувата падает. Данная биохимическая картина характеризуется выраженным аэробным гликолизом (Ткачук, 2004).

На 14 сутки токсического гепатита отмечено статистически значимое снижение времени полупревращения субстрата для АДГпр, сопровождающиеся увеличением каталитической эффективности ферментов в митохондриальной фракции печени (табл. 6).

Таблица 6

Кинетические свойства ЛДГ, АДГ и кластера АДГ-ЛДГ в митохондри-

альной фракции печени в норме и при токсическом гепатите

Показатели (усл.ед.) Серии экспериментов

Интактные животные Токсический гепатит (]4 с утки)

ЛДГ АДГ АДГ-ЛДГ ЛДГ АДГ АДГ -ЛДГ

пряма» реакция обрат- пая реакция прямая реакция обрат- пая реакция прямая реакция обратная реакция прямая реакция обратная реакция прямая реакция обратная реакция прямая реакция обрат-пая реакция

Утах 10,41 ±0,55 5,76 ±0,30 2,80 ±0,15 34,44 ±1,82 46,19 ±2,48 &л 9,91 ±0,53&л 36,24 ±2,04* 11,62 ±0,65* 3,90 ±0,22* 2,02 ±0,12* 5,79 ±0,34* &л 11,83 ±0,70*л

Ка 5,46 ±0,29 15,43 ±0,81 0,27 ±0,01 1,91 ±0,10 1.59 ±0,08 &л 6,14 ±0,33&л 7,89 ±0,44* 49,38 ±2,77* 4,75 ±0,27» 0,76 ±0,04* 5,44 ±0,32* 15,38 ±0,90*&

Кп 0,83 ±0,04 0,64 ±0,03 0,96 ±0,05 1,03 ±0,05 1,02 ±0,05 & 0,81 ±0,05&л 0,91 ±0,05 0,59 ±0,04 0,73 ±0,04* 0,86 ±0,05* 0,76 ±0,05* & 0,72 ±0,05&л

М 1,66 ±0,09 1,27 ±0,07 1,91 ±0,10 2,06 ±0,11 2,04 ±0,11 & 1,62 ±0,08&л 1,82 ±0.10 1,19 ±0,07 1,45 ±0,08* 1,73 ±0,10* 1,52 ±0,09* & 1,43 ±0,08*&

К! 1,91 ±0,10 0,37 ±0,02 10,25 ±0,54 17.99 ±0,95 28,99 ±1,53& 1,61 ±0,09 4,59 ±0,25» 0,24 ±0,02* 0,82 ±0,05* 2.67 ±0,15* 1,06 ±0,06* &л 0,77 ±0,05*&

Примечания-. & - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе ЛДГпр, ЛДГ обр; л - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе АДГпр, АДГобр; * - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе «интактные»

При токсическом гепатите на 7 и 14 сутки в митохондриальной фракции печени коэффициент структурных изменений и кооперативность ЛДГпр в кластере АДГпр-ЛДГпр уменьшились, для АДГпр комплекса АДГпр-ЛДГпр - увеличились.

На 7 и 14 сутки гепатита в митохондриальной фракции печени крыс выявлено увеличение сродства АДГобр к субстрату в составе кластера и по сравнению с ин-

тактными животными. На 7 и 14 сутки после действия тетрохлорметана сродство кластера ЛДГобр-АДГобр возросло по сравнению с интактными животными, что отразилось на повышении каталитической эффективности комплекса ферментов (табл. 6).

Активность и кинетические параметры АДГ, ЛДГ и их кластеров в митохондриальной фракции печени крыс до и после солюбилизации в норме и при токсическом гепатите

В условиях внутриклеточного окружения ЛДГ и АДГ могут образовывать кластерный надмолекулярный комплекс, связанный с мембранами субклеточных ор-ганелл, в частности митохондрий. С целью изменения сил электростатического взаимодействия ферментативного комплекса с мембраной митохондрий нами был использован 0,15 М ЫаС1 при рН 6,0 (Гринштейн, Кост, 2001).

В проведенных опытах было показано, что 65% суммарной активности ЛДГпр интактных животных приходится на лабильно связанную (солюбилизат) с мембраной форму фермента, тогда как 35% суммарной активности ЛДГпр прочно связаны с мембранами митохондрий (после солюбилизации фермента). Аналогичное распределение активности выявлено для АДГпр и комплекса ЛДГпр-АДГпр у интактных животных: преобладающее количество общей активности АДГпр (53%), кластера ЛДГпр-АДГпр (63%) отмечено в солюбилизате, 47% АДГпр и 37% комлекса - связаны с мембранами (рис. 4).

АДГпр интактные

АДГпр-ЛДГпр интактные

■ После

■ Солюб.

АДГпр Т. Г. 14

ЛДГпр Т.Г. 14

АДГпр-ЛДГпр Т. Г. 14

■ Со/иоб.

■ После

■ Со/иоб

Рис. 4. Распределение общей активности (нмоль НАДН/мин) ЛДГпр, АДГпр и их комплексов до и после солюбилизации

Примечание: Т.Г. - токсический гепатит

Установлено, что под воздействием тетрахлорметана происходит перераспределение общей активности оксидоредуктаз в прямой реакции и их комплекса. Наибольшее количество суммарной активности ЛДГпр, АДГпр, ЛДГпр-АДГпр приходится на прочно связанную форму фермента. Таким образом, в условиях токсического гепатита ферменты способны переходить из лабильных форм в мембраносвязанные. Согласно литературным данным, изменение способности белков к связыванию с мембраной может сопровождаться существенными преобразованиями в строении и в функционировании энзимов (Гринштейн, 2001).

Выявлено, что у интактных животных в обратной реакции преобладает растворимая форма лактатдегидрогеназы (рис. 5). Под влиянием тетрахлорметана (14 сутки после поражения) количество мембраносвязанной формы ЛДГобр возрастает и составляет 51%. Иная картина характерна для АДГобр интактных животных, при которой подавляющее количество фермента находится в связанном с мембранами состоянии (78%). В условиях токсического гепатита (14 сутки после травмы) соотношение связанных и «свободных» форм АДГобр достигает равновесного состояния. Для комплекса ЛДГобр-АДГобр интактных животных выявлено преобладание прочно связанных (57%) форм энзима над лабильными (43%). У крыс с токсическим гепатитом (на 14 сутки после внутрибрюшинной инъекции тетрахлорметана) отмечена тенденция к снижению количества комплексов ЛДГобр-АДГобр, связанных с мембранной (рис. 5). Перераспределение ферментов между «свободными» и связанными с мембранами формами при токсическом гепатите, вероятно, связано с активацией свободно-радикальных процессов под влиянием тетрохлорметана, приводящей к модификации структуры мембран и связанных с ней энзимов. __

ЛДГобр интактные

■ После

■ Солюб.

АДГобр интактные -п

78% ^ ш С

ЛДГобр-АДГобр интактные

Ъ1%

■ После

■ Солюб.

ЛДГобр Т.Г. 14

АДГобр Т.Г.14

ЛДГобр-АДГобр Т.Г.14

\ ■ После к"I Г 5°% ■ После

.....

■ Посл<.чолю6илп;

■ Солобилим!

Рис. 5. Распределение общей активности (нмоль НАДН/мин) ЛДГобр, АДГобр и их комплексов до и после солюбилизации

Примечание: Т.Г. - токсический гепатит

Каталитическая активность ЛДГпр в митохондриальной фракции печени до солюбилизации у интактных и контрольных животных в составе кластера АДГпр-ЛДГпр уменьшилась на 62%, удельная активность АДГпр, наоборот, увеличилась на 82%. Механизм, посредством которого происходит понижение активности ЛДГпр - смешанное ингибирование (Крупянко, 1990) (рис. 6).

Понижение активности ЛДГпр в составе кластера АДГпр-ЛДГпр на 1, 7 и 14 сутки токсического гепатита по сравнению с интактными животными обусловлено неконкурентным ингибированием. Уменьшение лактатдегидрогеназы в прямой реакции способствует накоплению лактата. Повышение активности АДГпр кластера в митохондриальной фракции печени до солюбилизации на 7 и 14 сутки после поражения проходило по механизму ассоциативной активации. Данное увели-

чение активности алкогольдегидрогеназы в прямой реакции вызывает накопление высокотоксичного ацетальдегида.

■ Инт ■ К и 1 сутки ■ 7 сутки ■ 14 сутки

Рис. 6. Активность ЛДГ, АДГ и кластеров АДГ-ЛДГ в прямой и обратной реакциях в митохондриальной фракции печени до солюбилизации в норме и при токсическом гепатите

Примечания: & - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе ЛДГпр, ЛДГобр; л - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе АДГпр, АДГобр; * - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе «интактные»; # - статистически значимые различия при р < 0,05 по отношению к группе «контроль»

Каталитическая активность ЛДГобр в митохондриальной фракции печени до солюбилизации у интактных и контрольных животных в составе кластера ЛДГобр-АДГобр уменьшилась на 7%, для АДГобр, наоборот, - увеличилась на 59%. Понижение активности ЛДГобр в составе кластера происходит по типу псевдоингибирования, повышение активности АДГобр обусловлено двупарамет-рически рассогласованной активацией (рис. 6).

Показано, что на 1, 7 и 14 сутки токсического гепатита активность ЛДГобр в составе кластера снижается по сравнению с удельной активностью лактатдегид-рогеназы в обратной реакции вне комплекса АДГобр-ЛДГобр. Увеличение алкогольдегидрогеназы кластера в обратной реакции в митохондриальной фракции печени до солюбилизации на 1, 7 и 14 сутки после поражения способствует накоплению этанола и снижению высокотоксичного ацетальдегида. Этанол является хорошим энергетическим субстратом, обладает малой клеточной токсичностью (существенно меньшей, чем, молочная кислота), оказывает защитный эффект, предохраняя клеточные структуры от неизбирательного перекисного окисления, так как является ловушкой супероксидрадикалов (Сторожок, 1983).

Полученные результаты свидетельствуют, что каталитическая активность ЛДГпр в митохондриальной фракции печени после солюбилизации у интактных животных в составе кластера АДГпр-ЛДГпр уменьшилась на 58%, удельная активность АДГпр, наоборот, увеличилась на 78% (рис. 7). У контрольных животных прослеживается аналогичная тенденция: снижение активности ЛДГпр в составе кластера АДГпр-ЛДГпр и повышение АДГпр типу двупараметрически рас-

согласованной активации. Механизм, по которому происходит ингибирование ак тивности ЛДГпр в составе кластера АДГпр-ЛДГпр - псевдоингибирование.

I 1 сутки

I 7 сутки ■ 14 сутки

Рис. 7. Активность ЛДГ, АДГ и кластеров АДГ-ЛДГ в прямой и обратной реакциях в митохондриальной фракции печени после солюбилизации у ин-тактных животных и при токсическом гепатите

Каталитическая активность ЛДГобр и АДГобр в митохондриальной фракции печени после солюбилизации у интактных и контрольных животных в составе кластера ЛДГобр-АДГобр увеличилась соответственно на 27% и 39%. Повышение активности ЛДГобр и АДГобр в составе кластера обусловлено - двупараметриче-ски рассогласованной активацией (рис. 7). Увеличение удельной активности алко-гольдегидрогеназы в прямой реакции и снижение АДГобр в митохондриальной фракции печени после солюбилизации печени на 1, 7 и 14 сутки токсического гепатита по сравнению с интактными и контрольными животными способствует накоплению высокотоксичного ацетальдегида.

Изменение активности АДГ и ЛДГ при воздействии на митохондрии 0,15 М ЫаС1 указывает на сохранение функциональной связи между ферментами. Однако в количественном отношении ферментов недостаточно, что отражается в снижении уровня метаболической адаптации.

Полученные результаты показали, что при токсическом гепатите происходит статистически значимое нарастающее к 14 суткам повышение активности ЛДГобр и понижение активности АДГобр по сравнению с интактными и контрольными животными.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований установлено, что энзиматические механизмы взаимодействия лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы в норме и при токсическом гепатите состоят в следующем: у контрольных животных реакция лактатдегидрогеназы сдвинута в сторону обратной реакции и характеризуется накоплением лактата и кофермента НАД; в норме количество пирувата в тканях на 2 - 3 порядка ниже, чем лактата, а сам пируват, подобно ацетальдегиду, очень легко вступает в химические реакции; аналогичные реакции отмечаются при токсическом гепатите (преобладание активности ЛДГобр по сравнению с ЛДГпр).

В то же время наблюдается иная картина в отношении алкогольдегидрогеназы. В норме реакция алкогольдегидрогеназы сдвинута в сторону обратной реакции и характеризуется преобладанием этанола и кофермента НАД. При токсическом гепатите равновесие сдвигается в сторону АДГпр, что сопровождается увеличением количества ацетальдегида и восстановленного НАД. На данные ферментативные преобразования указывает коэффициент направленности метаболических изменений. Использованный нами методический подход кинетического анализа ферментов, входящих в состав сложной гетерогенной системы (мультиэн-зимный комплекс), позволил оценить направленность метаболических изменений в субклеточных фракциях печени, связанных с каталитическими свойствами ЛДГ, АДГ, при метаболической адаптации данного органа к факторам среды (Зимин, 1993). Установлено, что у интактных животных энзиматические механизмы взаимодействия обмена лактат-пируват и этанол-ацетальдегид направлены в сторону увеличения содержания эндогенного пирувата и этанола в клетке. Это создаёт условия эффективного использования пирувата митохондриями в условиях аэробного синтеза АТФ (Островский и др., 1988; 1995). В то же время поддержание оптимальной концентрации ацетальдегида играет важную роль в регуляции работы дыхательной цепи митохондрий (Корнеев и др., 1994).

Таким образом, на примере очищенных препаратов ферментов выявлена и подтверждена для энзимов в гетерогенной системе (интактные крысы; контрольная группа) общая закономерность изменения каталитической активности исследуемых оксидоредуктаз при образовании комплекса. Так, в процессе формирования кластера происходит снижение активности лактатдегидрогеназы как в прямой, так и в обратной реакциях, для АДГ как в прямой так и в обратной реакциях показано увеличение каталитических свойств фермента, в результате активность образовавшегося комплекса ЛДГобр-АДГобр больше активности АДГпр-ЛДГпр.

Подводя итог, можно предположить следующую гипотетическую схему механизма действия гепатотоксичного ксенобиотика СС14 на каталитические свойства ЛДГ, АДГ печени (рис. 8).

Гепатотоксический ксенобиотик, тетрахлорметан, вызывает структурно-функциональные изменения метаболических компартментов клеток печени, способствует развитию жировой дегенерации, фиброза, апоптоза, канцерогенеза. Установлено, что токсическое действие СС14 связано в первую очередь с проок-сидантным действием образующихся в процессе его метаболизма свободных радикалов - трихлорметильного и высокореактивного трихлорметилпероксильного.

Данное воздействие четыреххлор истого углерода вызывает кластеро-кинетическое изменение надмолекулярных комплексов ферментов субклеточных органелл.

В результате конформационно-структурных перестроек образуются кластеры ЛДГпр-АДГпр и ЛДГобр-АДГобр, от соотношения которых будет зависеть соотношение (количество) окисленных и восстановленных форм кофермента в клетке.

Рис.8. Гипотетическая схема механизма действия гепатотоксичного ксенобиотика ССЦна каталитические свойства ЛДГ, АДГ печени

Кластер ЛДГпр-АДГпр ответственен за образование в печени таких метаболитов как этанол и лактат, от функционирования кластера ЛДГобр-АДГобр зависит содержание в печени ацетальдегида и пирувата. Преобладание того или иного субстрата играет определяющую роль в усилении или ослаблении токсического действия ксенобиотика.

ВЫВОДЫ

1. В растворе очищенных препаратов ферментов выявлена общая закономерность изменения их активности при образовании комплекса: в процессе формиро-

вания кластера, отмечено снижение лактатдегидрогеназы как в прямой, так и в обратной реакциях, увеличение активности АДГпр и АДГобр, в результате активность кластера ЛДГобр-АДГобр больше активности кластера АДГпр-ЛДГпр. Для препаратов очищенных ферментов показано, что каталитическая эффективность кластера ЛДГобр-АДГобр выше Ка кластера АДГпр-ЛДГпр.

2. В гомогенате, цитоплазматической и митохондриальной фракциях печени при токсическом гепатите на 1, 7 и 14 сутки после поражения удельная активность лактатдегидрогеназы как в прямой, так и в обратной реакциях в составе кластера снижается.

3. В гомогенате, цитоплазматической и митохондриальной фракциях печени при токсическом гепатите на 1, 7 и 14 сутки после поражения удельная активность алкогольдегидрогеназы как в прямой, так и в обратной реакциях в составе кластера увеличивается, за исключением 1 суток в митохондриях и цитозоле, 14 суток в гомогенате, где активность АДГпр снижается.

4. Введение крысам тетрахлорметана вызывает изменение кинетических свойств АДГ печени, способствуя снижению удельной активности АДГобр и повышению каталитической активность АДГпр на 1, 7 и 14 сутки после воздействия СС14 в цитоплазматической и митохондриальной фракциях печени крыс. При токсическом гепатите отмечено уменьшение каталитических свойств ЛДГпр в цитозоле и повышениие удельной активности ЛДГобр в митохондриях.

5. В митохондриальной фракции печени при токсическом гепатите на 1, 7 и 14 сутки после поражения удельная активность прочно - (после солюбилизации фермента), лабильно- (солюбилизат) связанной с мембраной лактатдегидрогеназы как в прямой, так и в обратной реакциях в составе кластера снижается.

6. Для очищенных препаратов ферментов и энзимов гетерогенной системы (гомогенат, цитоплазматическая и митохондриальная фракции в норме и при токсическом гепатите) выявлено, что в составе кластеров ЛДГпр-АДГпр, ЛДГобр-АДГобр изменяются кинетические характеристики лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы (сродство ферментов к субстратам реакции, каталитическая эффективность, конформационные изменения, кооперативность и структурные изменения), приводя к смещению направленности метаболических изменений.

7. Сформулирована кластерная гипотеза, отражающая особенности функционирования ЛДГ и АДГ и заключающаяся в том, что в процессе ферментативного катализа изменяется кластеро-кинетическая организация оксидоредуктаз в среде, которая зависит от соотношения каталитических и агрегационных конформеров ферментов в энзимокластере.

8. На основе кластеро-кинетической концепции и анализа кинетических параметров показано, что в составе кластера ЛДГпр с отрицательной кооперативно-стью образована преимущественно агрегационными конформерами, тогда как АДГпр, обладая положительной кооперативностью, состоит большей частью из каталитических конформеров. Кластер АДГпр-ЛДГпр практически не проявляет кооперативности, что, вероятно, обусловлено взаимоисключающими кинетическими свойствами очищенных ферментов, входящих в состав комплекса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК:

1. Уланова, A.A. Кинетические свойства митохондриальной алкогольдегидро-геназы клеток печени при токсическом гепатите / A.A. Уланова, В.Н. Крылов, Ю.В. Зимин // Вестник Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского. - 2011. - № 2 (часть 2). - С. 222-224.

2. Зимин, Ю.В. Алкогольдегидрогеназа. Молекулярная и надмолекулярная регуляция / Ю.В. Зимин, A.A. Уланова, А.Г. Соловьева // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 3 (часть 3). - С. 527-530.

3. Зимин, Ю.В. Кластеро - кинетическая гипотеза ферментативного катализа / Ю.В. Зимин, A.A. Уланова, А.Г. Соловьева // Фундаментальные исследования. -

2012. - № 9 (часть 3). - С. 559-562.

4. Зимин, Ю.В. Оценка кинетических параметров ферментов в гетерогенной надмолекулярной системе / Ю.В. Зимин, А.Г. Соловьева, A.A. Уланова // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 2. - С. 68-71.

5. Соловьева, А.Г. Оценка взаимодействия надмолекулярного кластера «алкогольдегидрогеназа - лактатдегидрогеназа» с мембраной митохондрий печени крыс / А.Г. Соловьева, A.A. Уланова, Ю.В. Зимин // Фундаментальные исследования. -

2013. - № 8 (часть 6). - С. 1400-1405.

II. Статьи, тезисы докладов региональных, всероссийских и международных конференций:

1. Зимин, Ю.В. Ксенобиохимия печени (гепатотоксичность лекарственных препаратов) / Ю.В. Зимин, А.Г. Соловьева, Ю.А. Уланова, A.A. Уланова, Н.В. Норенкова // Нижегородские ведомости медицины. - Нижний Новгород, 2009 г. -№ 11.-С. 8-11.

2. Уланова, A.A. Изменение активности алкогольдегидрогеназы печени крыс при действии цефазолина в условиях in vitro / A.A. Уланова // Материалы III - его всероссийского международного конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010», - Нижний Новгород, 2010 г. - С. 154.

3. Зимин, Ю.В. Кинетические свойства алкогольдегидрогеназы в субклеточных фракциях печени крыс при токсическом гепатите / Ю.В. Зимин, A.A. Уланова, А.Г. Соловьева // Международный журнал экспериментального образования. -2011.-№4.-С. 43.

4. Зимин, Ю.В. Аномальные белки, ферменты - результат белковой инженерии / Ю.В. Зимин, А.Г. Соловьева, A.A. Уланова // Международный журнал экспериментального образования. - 2011. - № 4. - С. 44.

5. Уланова, A.A., Изменение активности алкогольдегидрогеназы при экспериментальном поражении печени / A.A. Уланова, Ю.В. Зимин, А.Г. Соловьева // Международный журнал экспериментального образования. - 2011. - № 4. - С. 48.

6. Уланова, A.A. Пространственная архитектоника алкогольдегидрогеназы / A.A. Уланова // Материалы IV - го всероссийского международного конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2011», - Воронеж, 2011 г. Т. 1. -С. 51-52.

7. Уланова, A.A. Функционирование гепатоцитов и их способность к регуляции механизмов биотрансформации ксенобиотиков / A.A. Уланова // Материалы II - ой международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии», - Донецк, 2011 г.-С. 120-121.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДГ - алкогольдегидрогеназа

АТФ - аденозинтрифосфат

AJIT — аланинаминотрансфераза

ACT - аспартатаминотрансфераза

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

НАДН - никотинамидадениндинуклеотид, восстановленная форма

ТХМ - тетрахлорметан

ПОЛ - перекисное окисление липидов

МДА — малоновый диальдегид

Подписано в печать 31.10.2013 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1. Заказ № 899. Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ННГУ им. Н.И. Лобачевского. 603000, г. Нижний Новгород, ул. Б. Покровская, 37

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Уланова, Александра Александровна, Нижний Новгород

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. Н.И. ЛОБАЧЕВСКОГО

УЛАНОВА АЛЕКСАНДРА АЛЕКСАНДРОВНА

03.01.04 - биохимия

04201451179

На правах рукописи

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор медицинских наук,

ГЗимин Ю7В1; кандидат биологических наук, Соловьева А.Г.

Нижний Новгород 2013

Оглавление

Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1.1. Метаболические нарушения при токсическом гепатите 9

1.1.1. Общая характеристика токсических повреждений печени 9

1.1.2. Токсический гепатит 14

1.1.3. Токсические эффекты тетрахлорметана 15

1.2. Алкогольдегидрогеназа: характеристика, свойства,

роль в защитных механизмах организма 21

1.3. Лактатдегидрогеназа: характеристика, свойства,

роль в защитных механизмах организма 29

1.4. Надмолекулярные комплексы ферментов 34 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 49

2.1. Постановка эксперимента 49

2.2. Выделение митохондриальной и цитоплазматической фракций

печени 51

2.3. Влияние 0,15 М NaCl на активность лактатдегидрогеназы

и алкогольдегидрогеназы в митохондриях печени 51

2.4. Определение активности лактатдегидрогеназы 52

2.5. Определение активности алкогольдегидрогеназы 53

2.6. Определение кинетических характеристик ферментов 54

2.7. Определение активности каталазы 56

2.8. Определение МДА 57

2.9. Морфологическое исследование печени 58 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 60

3.1. Активность и кинетические характеристики очищенных

препаратов АДГ и ЛДГ (0,1 mg/ml) и их кластеров (0,1 mg/ml) 60

3.2. Активность и кинетические параметры АДГ, ЛДГ и их кластеров в гомогенате печени крыс в норме и при токсическом гепатите 66

3.2.1. Биохимические и морфометрические показатели крови и печени крыс при токсическом гепатите 66

3.2.2. Активность и кинетические показатели АДГ, ЛДГ в прямой реакции и кластера АДГпр-ЛДГпр 72

3.2.3. Активность и кинетические показатели АДГобр, ЛДГобр

и кластера ЛДГобр-АДГобр 82

3.3. Активность и кинетические параметры АДГ, ЛДГ

и их кластеров в цитоплазматической фракции печени крыс в норме и при токсическом гепатите

3.3.1. Активность и кинетические показатели АДГ, ЛДГ в прямой реакции и кластера АДГпр-ЛДГпр

3.3.2. Активность и кинетические показатели АДГ, ЛДГ в обратной реакции и кластера ЛДГобр-АДГобр

3.4. Активность и кинетические параметры АДГ, ЛДГ и их кластеров в митохондриальной фракции печени крыс в норме и при токсическом гепатите 106

3.4.1. Активность и кинетические показатели АДГ, ЛДГ в прямой реакции и кластера АДГпр-ЛДГпр 106

3.4.2. Активность и кинетические показатели АДГ, ЛДГ в обратной реакции и кластера ЛДГобр-АДГобр 114

3.5. Влияние 0,15М №С1 на активность и кинетические параметры АДГ, ЛДГ и их кластеров в митохондриях печени 121

3.5.1. Активность и кинетические показатели АДГ, ЛДГ в прямой реакции и кластера АДГпр-ЛДГпр до солюбилизации 121

3.5.2. Активность и кинетические показатели АДГ, ЛДГ в обратной реакции и кластера ЛДГобр-АДГобр до солюбилизации 129

3.5.3. Активность и кинетические показатели АДГ, ЛДГ в прямой реакции и кластера АДГпр-ЛДГпр в солюбилизате митохондрий печени крыс 137

3.5.4. Активность и кинетические показатели АДГ, ЛДГ в обратной реакции и кластера ЛДГобр-АДГобр в солюбилизате митохондрий печени крыс 144

3.5.5. Активность и кинетические показатели АДГ, ЛДГ в прямой реакции и кластера АДГпр-ЛДГпр после солюбилизации 152

3.5.6. Активность и кинетические показатели АДГ, ЛДГ в обратной реакции и кластера ЛДГобр-АДГобр после солюбилизации 159

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

167 174 176

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АДГ - алкогольдегидрогеназа

AJ1T - аланинаминотрансфераза

АОТ - аэрозоль диизооктилсульфосукцинат натрия

ACT - аспартатаминотрансфераза

АТФ - аденозинтрифосфат

АФК - активные формы кислорода

ГАФД - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

НАДН - никотинамидадениндинуклеотид, восстановленная форма

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат

ПАВ - поверхностно - активные вещества

ПОЛ - перекисное оксление липидов

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РБФК/О - рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза

РФИ - рибозофосфатизомераза

СЖК - свободные жирные кислоты

ТХМ - тетрахлорметан

ФДГ - формиатдегидрогеназа

ФРК - фосфорибулокиназа

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

МДА - малоновый диальдегид

ВВЕДЕНИЕ

По современным представлениям "растворимые" ферменты могут обратимо взаимодействовать с субклеточными структурами. Контролируемая метаболитами обратимая адсорбция энзимов на мембранах органелл расширяет регуляторные возможности клетки (Курганов и др., 1991; Курганов, 1992; 1994; 1996; Поглазов, 1996; Mitchison, 1992; Parkhouse, 1992; Kellershohn et al., 1994; Lyubarev, 1997; Shmelev et al., 1997; Lushchak, 1998).

При физиологическом состоянии организма в реакции, катализируемой АДГ, происходит реокисление НАДН и увеличение НАД (Островский и др., 1988). Таким образом, АДГ участвует в регуляции отношения НАДН/НАД в клетке, конкурируя с другими НАД-оксидоредуктазами за кофермент (Hurley, Bosron, 1992). Имеются доказательства тесной метаболической связи между обменами субстратов и продуктов алкогольдегидрогеназной и лактатдегидрогеназной реакций: этанол-ацетальдегид и лактат-пируват (Островский и др., 1989; Хворостинка и др., 1993; Дудченко, 1994;

Сатановская и др., 2002). Лактатдегидрогеназа (ЛДГ), как фермент гликолиза, играет важную роль в регуляции энергетического обмена клетки. Согласно литературным данным, ЛДГ способна взаимодействовать с мембранами субклеточных органелл, изменяя при этом свою активность (Lushchak, 1992; Hashimoto et al., 2008; De Вагу et al., 2010). На основании различия кинетических характеристик для мембранной и «свободной» форм ЛДГ предполагается, что связывание фермента с митохондриями играет важную регуляторную роль в клетке. Динамическое равновесие между мембраносвязанной и «свободной» формами фермента в клетке регулируется субстратами и НАД/НАДН (Есакова и др., 1994; Ермаков, 1995).

Существуют сведения о взаимодействии данных ферментов в условиях in vitro (Фридрих,1986; Наградова и др.,1991; Ермаков,1993; Ашмарина и др.,1994; Курганов, 1994; Srivastava et al.,1987; Batke et al.,1992; Chaubey et al., 2001; Trivedi et al., 2005; Tsai et al., 2007; Nicolau et al., 2012). Ранее уже высказывалась гипотеза о связи образованного комплекса ЛДГ-АДГ со структурными компонентами клетки, в частности, с митохондриями (Зимин и др., 2001; 2009; 2012). На примере алкогольдегидрогеназы и лактатдегидрогеиазы, можно рассмотреть возможности формирования различных вариантов надмолекулярных ансамблей, включающих различные конформационпые состояния ферментов, существование фермент ферментных комплексов, а также взаимодействие ферментов с мембранными структурами.

Каримов и др., 1993; Скобелева, 1994; Погромов, Лашкевич, 1996; Зимин и др., 2009).

Поражения печени наблюдаются уже в первые часы после воздействия различных ксенобиотиков (Зимин и др., 2001; Михайлова и др., 2009; Попова и др., 2009; СПсЫш е1 а1., 2011). К ксенобиотикам с высокой степенью избирательной гепатотоксичности относят хлорированные углеводороды, типичным представителем которых является тетрахлорметан (СС14). Отравление экспериментальных животных этим токсином по морфологической характеристике и биохимическим изменениям близко к острым поражениям печени у человека. Имеются данные, что в результате введения четыреххлористого углерода происходит усиление свободнорадикальных процессов и как следствие изменение метаболизма печени, сопровождающееся нарушением активности ферментативных систем (Тутельян и др., 2009).

Цель и задачи исследования

Целью данной работы явилось исследование кинетических параметров надмолекулярного кластера ЛДГ-АДГ в норме и при токсическом действии гепатотропного ксенобиотика СС14.

С этой целью в работе были поставлены следующие задачи:

2) Сравнить изменения регуляторных свойств НАД-оксидоредуктаз в субклеточных фракциях печени крыс в составе кластера ЛДГ-АДГ в норме и при гепатопатии.

3) Исследовать кинетические параметры ЛДГ и АДГ печени иптактных животных и крыс, подвергшихся воздействию СС14.

Научная новизна

Установлено, что АДГ и ЛДГ прочно связаны с мембранами митохондрий и устойчивы к солюбилизирущему действию 0,15М №С1.

Впервые выявлено, что характер взаимодействия ЛДГ, АДГ с мембранами субклеточных органелл печени, а также их каталитические свойства, зависят от изменения физиологического состояния организма и изменяются при действии токсического ксенобиотика (тетрахлорметана).

Выявлены существенные нарушения регуляции оксидоредуктаз печени при экспериментальном токсическом гепатите, выражающиеся в падении активности и нарушении процесса взаимодействия ферментов с мембраной митохондрий.

Научно-практическое значение работы

Библ. 246 названий

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Метаболические нарушения при токсическом гепатите

Проблема предупреждения возникновения и эффективного лечения общей и молекулярной патологии человека, связанная с особенностями регуляции метаболической адаптации печени актуальна для многих разделов клинической и экспериментальной медицины. Особое значение она приобретает в современных условиях состояния биоэкологии среды, когда увеличивается риск возникновения патологических изменений печени (Березов, 1993; Каримов и др., 1993; Скобелева, 1994; Погромов и др., 1996). К числу последних относятся токсические поражения печени (Иваников и др., 2002).

Заболевания печени представляют собой актуальную проблему современного здравоохранения в России и в мире в целом (Буеверов, 2001).

1.1.1. Общая характеристика токсических повреждений печени

Печень является главным органом метаболизма ксенобиотиков и подвержена их токсическому влиянию (Иваников и др., 2002).

Процессы первой фазы метаболизма ксенобиотиков преимущественно катализируются микросомальной монооксигеназной системой, основным компонентом которой является цитохром Р-450, именно он определяет функционирование всей системы метаболизма ксенобиотиков (Lee et al., 1991). Многие ксенобиотики, первично нетоксичные для печени, способны превращаться в токсические метаболиты (Fahien et al., 1993; Chen et al., 1998; Omiecinski et al., 1999). Благодаря реакциям второй фазы происходит конъюгация образованных метаболитов с глюкуроиовой, серной, уксусной кислотой и глутатионом, что приводит к повышению их водорастворимости и облегчает выведения почками. Конъюгирование метаболитов предотвращает дальнейшее повреждение печени, так как большинство конъюгатов являются биологически инертными веществами (Hinson; Forkert, 1995; Lee et al., 1998).

Существует два основных типа повреждения печени ксенобиотиками (Lee et al., 1991; Sturgill, Lambert, 1997; Tanaka, 1998). Так называемая, предсказуемая гепатотоксичность характеризуется дозозависимым образованием токсических метаболитов и зависимым от дозы масштабом повреждения гепатоцитов. Токсическое действие таких веществ возникает вследствие их приема в дозе, превышающей емкость систем биотрансформации (дефицит субстратов конъюгации, коферментов и ферментов, необходимых для детоксикации) или влияния индукторов и ингибиторов метаболизирующих ферментов. Дозозависимое поражение печени способны вызывать тетрахлорметан, парацетамол, аспирин, тетрациклины, гризеофульвин, никотиновая кислота и ее производные, амиодарон, эстрогены, анаболические гормоны, меркаптопурин, метотрексат, полусинтетические пенициллины, цитостатические антибиотики и ряд других веществ.

Другие препараты, такие как эритромицин, изониазид, галотан, хлорпромазин, дают токсический эффект лишь у некоторых чувствительных лиц и независимо от дозы. Такую гепатотоксическую реакцию относят к проявлениям идиосинкразии (Арзамасцев, Любимов, 1995; Larrey, Pageaux, 1997). Причинами идиосинкразии на лекарство могут быть генетические различия в активности метаболизирующих ферментов, наличие генетических дефектов в защитных механизмах, что увеличивает экспозицию к токсическим метаболитам, продуктам конъюгации метаболитов с белками и другими макромолекулами (Wolf et al., 2000; Lazarou et al., 1998; Wormhoudt et al., 1999).

В свою очередь повреждения печени ксенобиотиками весьма многообразны и могут быть острыми и хроническими. Острое повреждение печени классифицируют как цитотоксическое, холестатическое и смешанное. Хроническое поражение печени проявляется хроническим активным гепатитом, стеатозом, фосфолипидозом, веноокклюзивной болезнью,

циррозом печени, пелиозным гепатитом и другими состояниями (Zimmerman, 1993; Lammert, Matern, 1997).

Гистологическая классификация токсических повреждений печени ксенобиотиками приведена в таблице 1.

Таблица 1

Гистологическая характеристика некоторых типов токсического

повреждения печени ксенобиотиками (Sturgill, Lambert, 1997)

Характеристика повреждения Возможный механизм повреждения Представители ксенобиотиков

Зональный некроз Образование клеточных аддуктов, свободных радикалов, неоантигенов Ацетаминофен, галотан

Токсический гепатит Образование гаптенов Изониазид,фенитоин, сульфаниламиды

Микровезикулярный стеатоз Дефицит В-окисления жирных кислот Тетрациклин,вальпроевая кислота, тамоксифен

Макровезикулярный стеатоз Повышение синтеза триглицеридов и снижение их выхода из клетки Хроническое употребление этанола

Фосфолипидоз Образование лизосомальных включений Амиодарон

Гепатоканаликулярный холестаз Воспаление, повреждение билиарных канальцев Хлорпромазип

Капаликулярный холестаз Уменьшение текучести мембран, активности №+/К+-АТФазы Стероидные гормоны

Вено-окклюзивные заболевания Тромбозы терминальных печеночных венул Радиация, азатиоприн, 6-тиогуанин

Пелиозный гепатит Повреждение синусоидальных мембран Стероидные гормоны, тамоксифен

Опухоль печени Неизвестен Стероидные гормоны

Существует два механизма гибели гепатоцитов - некроз и апоптоз (Фильченков, Стойка, 1999; Jones, Gores, 1997; Kaplowitz, 2000). Непосредственной причиной некроза является окислительный стресс и пероксидация липидов, связывание токсических метаболитов ксенобиотиков с биологически важными макромолекулами; повреждение митохондрий и

нарушение продукции энергии; разрушение цитоскелета, масс�

Информация о работе

Уланова, Александра Александровна
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2013
ВАК 03.01.04

Диссертация

Исследование кинетических параметров надмолекулярного кластера алкоголь- и лактатдегидрогеназы в печени крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы