Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование некоторых аспектов тканеспецифической регуляции митохондриальных процессов в печени крысы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование некоторых аспектов тканеспецифической регуляции митохондриальных процессов в печени крысы"

Форма 3.3 '

ЕРЕВАНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЧЕЛВДЗЕ Медгар Арсенович

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ АСПЕКТОВ ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ МИГОХОНДРИАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В ПЕЧЕНИ КРЬЮЫ

(03.00.02 - Биофизика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН- 1990

Работа выполнена в лаборатории биофизических испытаний Научно-исследовательского института технологии и безопасности лекарственных средств.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

ЭЛБАКИДЗЕ Г.М.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

ТРЧУНЯН A.A.

кандидат физ.-мат. наук ГШЫАНДАШН A.B.

Ведущая организация: Институт Биофизики АН СССР

Защита диссертации состоится " 90 г.

1 0 ^ в W u час, на заседании специализированного Совета К 055.01.08.

по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при Ереванской Ордена Трудового Красного Знамени Государственном Университете /375049, Ереван, ул.Мравяна, I, Ереванский Университет, биологический факультет,кафедра биофизики/.

С диссертацией ыокно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан

"¿L1990 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

Jk<

ko-J—■ Л.Г.АНАНЯН

- ? -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время интенсивно исследуются механизмы, обеспечивающие внутритканевую интеграцию клеток. Интерес к этой проблеме обусловлен не только её относительно малой изученностью, но л возможностью использования эш-Фскторов внутритканевых межклеточных взаимодействий для избирательного воздействия на функции отдельных тканей организма. Такая возможность открывается благодаря общему свойству упомянутых ректоров - кейлонов, контактннов и кимутонов - тканевой специфичности их действия в отношении регулируемых ими процессов (;-и11оипп , 1965; (Лалеяков, йоцянова, Ямскова, 1977, 1978; Элбакидзе, Ливанова, 1977). Била показана способность кейлонов и коптактипон пнгпбировать митотичеокую активность клеток из гомологично« ткани ( ^иНоиуЬ , Не'.чс« , 1_оигепсе, 1204; ГЛален-ков, Модянова, лмскова, 1978). Внсказквалооь предположение, что комутопн также могут вносить вклад в контроль роста вырабатывающей их ткани (Элбакидзе, 1978). Молекулярике механизмы действия этих регуляторов оставались малоисследованными. Было уста-новдено, что кейлоны ингибиругот синтез ЛИХ в ядрах клеток, кон-тактины повышают адгезивность плазматических мембран и силу сцепления клеток, а комутоны стимулируют дыхание митохондрий в среде с субстратом в присутствии олигомицина и разобщают окислительное фосторилпрованне митохондрии (Элбакидзе, Духин, 1984). Тлеются данные, свидетельствующие об универсальном характере комутогшого контроля дыхания и окислительного фоссТгари-ляровапкя митохондрий в тканях позвоночных животных. Так, существование полутонов ¿нло показано в печени, почке, сердце, легком и тимусе крнси (Элбакидзе, Г.пронова, Ковдраюова, 1974; Элбакпдзе, Г„70), а также в печени птицы, лягушки и рыбы (Ливанова, Элбакидзо, 1980). Было показано также отсутствие видовой епсц!:о\ггчнооти в действии копутона на тикая до и окислительное У'Опг:,орилпрование (Ливанова, Элбакидзе, 1981). Экспериментальная проверка предположения об участии когутона в регулировании роста тканей и других процессов, протекающих в печени, изучение ■"¡зпко-хн.'ических свойств этого оотулятора и механизма его действия на митохондриальные лрочессп способствовали бы пониманию гелонг'х принципов организации вчутоитк:-,нового контроля энерге-

тических процессов в клетках позвоночных животных.

Цель исследования. Изучение комутонной регуляции митохон-дриальных процессов.

Задачи исследования. I) Исследование динамики активности комутона в печени крысы при различных функциональных состояниях этого органа. 2) Исследование физико-химических свойств комутона из печени крысы. 3) Изучение комутонной регуляции дыхания, окислительного фосформирования и транспорта ионов Са^+ в митохондриях.

Научная новизна. В работе впервые исследована динамика активности комутона в регенерирующей печени крысы, изучены цир-кадный и аннуальный ритмы этой активности в нормальной печени, изменения её веддзины после введения животному гормонов, а такие после эмоционально-болевого воздействия. Выделен высокоочи-щенный препарат комутона из печени крысы. Показано, что он производит следующие тканеспецифические эффекты в отношении митохондрий из печени: стимулирует их дыхание в среде с различными субстратами, стимулирует АТФ-азную активность митохондрий, уменьшает продолжительность удержания ими ионов Са^+ и понижает Са^+-емкость этих' органам, а также усиливает выход ионов Са^+ из матрикса митохондрий и стимулирует их высокоамдлитудное набухание, индуцированное ионами Са .

Практическая ценность. Практическая ценность работы связана с принципиальной возможностью примененияисследу^юго комутона из печени в качестве фармакологического средства. Полу' ченные результаты могут быть использованы в лабораториях, изучающих проблемы внутритканевых регуляций и молекулярной патологии.

Апробация работы и публикации. Материалы работы докладывались на Международном симпозиуме по биологической регуляции клеточной пролиферация (9-ая кейлонная конференция), Милан, 1986, и на I Школе-семинаре "Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий", Кобулети, 1987.

По теме диссертации опубликовано 10 работ. ^

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и списка литературы, включающего 175 наименований: Текст изложен на 156 стр. и иллюстрирован 51 рисунком.

Принятые сокращения: ЕСА - бычий сывороточный.альбумин, БЦФ - безмитохондриальная цитоплазматическая фракция, ВАН -высокоамллитудное набухание, ВОФК - высокоочищенная фракция комутона, ДК - дыхательный контроль, MX - митохондрии, ОП - оптическая плотность, 0$ - окислительное фосфорилирование, РК -рутений красный, РФК - растворимая фаза клетки, ЧГЭ - частичная гепатэктомия.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы посвящен современным представлениям о механизмах и регуляции 0$ MX и транспорта ионов Са^+ в этих ор-'ганеллах. В нем также содержатся сведения о проблеме внутритканевых межклеточных взаимодействий.

Объекты и методы исследования изложены во П главе диссертации.

'Объектт-т иррледогдпдл. Сксперименты проводились на белых ■ беспородных крысах массой 200-250 г. При изучении циркадного ритма животных адаптировали к условиям' содержания в закрытом помещении с естественным освещением и свободным доступом к воде и пище, которые давались в избытке. Глюкозу с помощью зонда вводили сытым животным интрагастрально из расчета 2 г глюкозы в 5 мл воды на крысу массой 250-г. Продигиозан вводили крысам, которых за I сутки до этого лишали корма при сохранении' свободного доступа к воде. Препарат вводили путем внутрибрюшинной инъекции из расчета 500 мкг/кг массы. Введение СС1Д осущест-апяли интрагастрально зондом из расчета 2 мл 40$ раствора на подсолнечном масле на I кг массы животного. Влияние сс1д изучалось на животных, содержащихся на полноценном рационе питания. Частичную гепатэктомию проводили по методу Хиггинса и Андерсона. Кормление крыс прекращали за I сутки до операции и опыты проводили на голодающих крысах., имеющих свободный доступ к воде. Контролем служили крысы, подвергнутые ложной операции -лапаратомии. Забой крыс осуществляли в 14 ч. Трийодтиронин (500 мкг/кг массы) и питуитрин (4 ед.акт./кг массы) вводили внутрибрюшинио крысам, лишенным за 24 ч. до начала опыта доступа к пище. Адреналин (I мг/кг массы) и гидрокортизон (6 мг/кг массы) вводили внутрибрюиинно сытым животным. Эмоционально болевое воздействие на крыс производили по методу ( Deslderato t

1974) с небольшими модификациями. Во всех описанных опытах для получения МХ печени и почки были использован!' крысы, тех же срокоЕ после воздействия, что и животные, из печени которых выделяли комутонсодержащие фракции.

Препаративные методы. МХ из различных тканей крысы выделяли методом Шнейдера с модификациями (Мосолова с соавт.,1974). Среда выделения МХ печени состояла из 280 мМ сахарозы и 10 мМ трис-буфера рН 7,5. Выделение МХ почки, мозга и сердца проводили на среде, содержащей 280 мМ сахарозы, 1% высокоочищенного бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 5 мМ ЗДТА, рН 7,5. Среда выделения МХ скелетных мышц состояла из 100 мМ ксл , 50 мМ трис-буфера, I мМ ngci2 и 1% БСА рН 7,5. МХ ресуспензировали в среде выделения МХ печени крысы.

Комутонсодержащую безмитохондрналъную цитоллазматическую фракцию (БЦФ) получали в виде супернатанта после центрифугирования гомогената печени при 10000* а в течение 20 минут. Среда выделения содержала 280 мМ сахарозы и 20 мМ трис-буфера рН 9,0. Растворимую фазу клеток (РФК) из печени получали уль-трацентрифугированяем БЦФ при 105000х 9 в течение часа. Гель-фильтрацию РФК проводили на колонке с сефадексом с -15 размером 80 см х 3,0 см. сИпсцию проводили раствором 2 мМ ацетата аммония (рН 7,0). Оптическую плотность элюата измеряли при длине волны 280 нм. Комутонсодержащие пробы объединяли, лиофили-зироваля и использовали на слецудадх: этапах фракционирования. Гель-хроматографию этой фракции проводили с сефадексом о-Ю размером 1,5 см х 25 см. Комутонсодержащий материал после гель-фильтрации на сефадексе G-I5 фракционировали с применением методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (BSX) на хроматографе фирмы ^üson .. Гель-хроматографию проводили ка колонке Tsl< G -3000 sv.' ( ) 7,5 мм х 300 мм. Для ионообменной хроматографии использовали анионообменнуга колонку Partiüi] Ю ылх 4,6 мм х 250 мм ( .;hatman ). Обратнофазовую хроматографию проводили на колонке так - i-Msnyl - 5 r, 7,5x75 мм и Lychrosorb i;p-I8 4 мм х 250 мм ( w.a). В режиме ионпарной хроматографии (колонка Lychrosorb ;<;> -18) в качестве контриона использовали тетраэтиламмоник (40 мм, рН 4,5).

Аналитические методы. Активность комутона из печени е составе различных фракций оценивали по тканеспецифической стику-ляции crcpocTí: 2ыж:"ля I.1X из гомологичной ткани в среде с cytí-

стратом ( \/4. ) и тканеспецифическому увеличению потребления,- ' МХ кислорода в активном метаболическом состоянии ( &Оакт ) в присутствия этих фракций. С целью выявления тканеспецифических эффектов исследуемых фракций сравнивали их действие на скорость дыхания я параметры ОФ МХ из печени и почки. В хроматографичес-ких экспериментах для оценки степени очистки комутонсодержащих фракций мы использовали условно введенные нами понятия единицы активности комутона и удельной активности комутонсодержащих фракций. За условную единицу активности комутона (Е) принимали тканеспецяфяческое действие комутонсодержащих фракций на изолированные Ж, заключающиеся в стимуляции v4, гомологичных МХ до 200% от величины этого параметра у интактных Ж в стандартных условиях эксперимента. Удельную активность рассчитывали по отношению к сухому весу (М), либо к ОН и объему растворенного комутонсоцержащего материала ( V ) и обозначали соответственно как Ец , Еоп и Е„ ( Е^Е/М , а Еоп=Е/СП, ЕУ=ЕА ). Влияние фракций на дыхание я 05 МХ изучали методом полярографической регистрации потребления МХ кислцрода в различных метаболических состояниях. Измерения проводили в закрытой термоста-тируемой при 28°С ячейке объемом I мл, открытым вращающимся платиновым электродом и каломельным электродом сравнения. Показания измерительного электрода непрерывно регистрировали на ■ самописце КСП-4. Среда инкубации'МХ, с учетом инградиентов добавляемых комутонсодержащих фракций состояла из 280 мМ"сахарозы, 10 мМ трис-буфера, рН 6,8, ЗМ1 ЭДТА, 3 мМ КН^О^ 5 мМ сукцината. МХ (2 мг/мл) вводили в ячейку после добавления в нее комутонсодержащей фракции и начинали измерение поглощения ими кислорода. Через 1-1,5 мин в среду добавляли 100-150 мкМ АДФ и продолжали регистрацию содержания кислорода в ячейке, вплоть до его полного исчерпания.

Влияние.комутона на АТФ-азнуга активность оценивали путем сравнения его действия на скорость АТФ-азной реакции МХ печени и почки. Эту активность регистрировали по изменению рН инкубационной среды в открытой термостатируемой при 28°С ячейке объемом 3 мл. Среда инкубации содержала 150 мМ сахарозы, 50 мМ

кс1 , 2 мМ трис-буфера, рН 8,0. В ячейку вводили 2 мг/мл белка МХ и через 30-40 сек после этого в среду добавляли I мМ АТФ. Комутонсодержащие фракции вводили в среду- инкубации до МХ.

Процесс транспорта ионов Са^+ в митохондриях изучали по-

тенциометрическим методом с использованием Са^+-селективного электрода (производство "Грузаналитприбор"). В некоторых экспериментах для этого применяли рН-электрод. Измерения проводили в термостатируемой при 28°С ячейке объемом 3 мл. МХ (2 мг/ш) вводили в среду перед добавлением комутонсодержащей фракции. Среда инкубации состояла из 280 мМ сахарозы, I мМ МдС12 , 0,8 мМ КН^РО^, 5 ¡¿Л сукцината, 50 мкМ АДФ, 0,66 мкг рогенона/мг белка МХ и такое не количество олигомицина, 5 мМ трлс-буфера, рН ,7,5.

Действие комутонсодержащей фракции на транспорт ионов Са2+ в МХ оценивали по тканеспецифическим изменения:«! параметров этого процесса. Етияние комутока из печени на ЕАН МХ изучали, регистрируя тканеспецифичное изменение светорассеяния суспензии гомологичных МХ. С этой целью сравнивали изменения ОП^дщ, суспензий МХ печени и почки после добавления комутона из печени. Измерения проводили при 25°С на спектрофотометре СФ-26 в кювете с длиной оптического пути, равной 0,5 см. Среда инкубации МХ содержала 150 мМ сахарозы, 50 мМ < ксх , Ю мМ трис-буфера, рН 7,0. МХ (0,35 мг белка/мл) добавляли в среду после введения комутонсодеркащей фракции. ВАН индуцировали добавлением СаС12 .

Количество белка в суспензии МХ определяли по методу Лоу-

ри.

Приведенные данные являются средним по 3-7 экспериментам. Дня статистической обработки полученных результатов применялся метод вычисления значения генерального среднего и квадратичного отклонения.

Результаты экспериментов изложены в 3-5 главах диссертации. Основным .объектом исследования комутонной регуляции являлась ин-тактная печень взрослой крысы (Элбакидзе, Ливанова, 1977; Ливанова, Элбакидзе, 1980; Элбакидзе. Духин, 1984). Было обнаружено, что величина активности комутона может изменяться в этом органе в широких пределах и полностью отсутствовать у голодающего животного (Ливанова, Элбакидзе, 1980; Элбакидзе, Духин, 1984)4 Между тем, динамика комутонной активности при различных функциональных состояниях печени оставалась неизученной. В связи с тем, что функциональное состояние этого органа закономерно изменяется в течение суток, нами был изучен циркадный ритм комутонной активности. Исследовали также влияние введения крысам глюкозы, продигиозана, четыреххлористого углерода, некоторых

гормонов, частичной гепатэктокии и эмоционально-болевого воз-г действия на величину активности комутона в печени.

Как видно из данных рис Л, активность комутойа в печени значительно изменяется по величине в течение суток. Тканеспеци-фическое увеличение А0а у МХ печени в присутствии гомологичной ЕЦФ и тканеспецифическая стимуляция уд> наблюдаются в период с 3 до 9 ч. и отсутствуют в остальные сроки измерений. Тканеспецифическое изменение г ф повторяло динамику А0акт Влияние кокутонсодеряащей ЕЦФ на скорость дыхания МХ в состояли] "3" отсутствовало.

24 з S э 12 <5 (3 г7

Интрагастральная инфузия глюкозы вызывает тканеспецифичес-кую стимуляцию скоростей дыхания МХ печени в среде с субстратом в присутствии гомологичной БЦФ, с максимумами этого эффекта на I и 4 ч. после инфузии глюкозы. На 2 ч. стимуляция дыхания дополняется незначительным по величине тканеспецифическим разобщающим эффектом комутона.

Добавление в среду ротенона не влияло ка величину ткане-специфичесних эффектов комутона.

Нами были проведены эксперименты по изучению активности комутона в печени животного после введения ему продигиозана. Оказалось,' что уже через I ч. после инъекция препарата в печени появляется тканеспецифическая стимуляция v4,, которая сохраняется на том же уровне по величине до 15 ч., после чего заметно увеличивается к 24 ч. Изменения сопряжения ОФ МХ отсутствовали.

Была изучена динамика активности комутона в печени крысы после однократного введения cci4 . Тканеспецифическая стимуляция v4. и v у МХ печени в присутствии гомологичной ЕЦФ

Рис Л

Суточная динамика изменений v . и Л0акт у МХ из пече-

л

наблюдалась в этих экспериментах с 8 ч. по 2 сутки после введения СС14 , а также с 5-х по 7-ые сутки после этого воздействия. На 3 и 4-ые сутки этот эффект незначителен по величине и сопровождается нетканеспецифической стимуляцией дыхания. Тка-неспецифическое понижение сопряжения ОФ МХ печени в присутствии ЩФ происходило на 2-е и 3-й сутки. При этом тканеспецифически увеличивались М)акт и гф , а оставалось без изменения. Интрагастральная инфузия глюкозы за I ч. до забоя животным, получившим ' СС14 не влияла на характер и величину регистрируемых эффектов комутона.

С целью выявления возможного вклада комутонного контроля, дыхания и ОФ МХ в регуляцию митотической активности печени были проведены эксперименты по изучению динамики активности комутона в регенерирующей~"печени крысы. Полученные результаты представлены на рис.2. Как видно из данных этого рисунка, тканеспецифи-ческий разобщающий эффект комутона по А0о„„ наблюдается на

4 и 16 час после частичной гепатэктомии, а также с 24 по^ЭО и с 42 по 48 ч. Тканеспецифические<изменения 1ф повторяли эту динамику Д0акт и не отражены на рис.2. Тканеспецифическая стимуляция дыхания МХ под действием ЩФ в среде с субстратом оказалась более выраженной по скорости у4.. Она имела место в

. период с 6 по 16 ч., с 20 по 28 ч., с 34 по 36 и с 48 по 52 ч. после операции. Изменений скорости ^ в описываемых экспериментах отмечено не было.

Как известно, трийодтиронин и питуитрин-являются*эффективными модуляторами функционального состояния гепатоцитов. Нами было исследовано влияние этих гормональных препаратов на акти- • вацшо комутонной регуляции в печени крысы. Проведенные эксперименты по измерению активности комутона в печени у животных, которым предварительно вводили питуитрин, показали, что через

5 мин. после воздействия исследуемая активность в этом органе отсутствовала. Однако через I ч. тканеспецифическая стимуляция дыхания МХ печени комутоном достигала значительной величины. Далее было показано, что при совместном воздействии питуитрином и глюкозой, а также питуитрином и продигиозаном можно наблюдать более высокую активность комутона в печени, чем при воздействии каждым из этих веществ в отдельности..Эффектов комутона в отношении ОФ МХ в описанных экспериментах замечено не было.

■ Исследование влияния трийодтиронина на комутонную регуля-

цию в печени крысы показало, что тканеспецяфическая стимуляция

проявляется в этом органе уже через I ч. после введения гормона. Здесь также отсутствовал тканеспецифическйй разобщающий эффект комутона.

Рис.2. Динамика тканеспецифических изменений Д°акт и у МХ из регенерирующей печени крысы под действием ЕЦФ из этого органа. Абсцисса - время после операции (часы). Ордината - что и на рис.1. 1,3 - А0дкт , 2,4 - . 1,2 - крысы после ЧГЭ. 3,4 - ложнооперированные животные.

Обобщение трехгодичных данных по измерению активности комутона в печени крысы позволило выявить закономерность в сезонном изменении этой активности. Было обнаружено, что у ин-тактннх животных активность комутона отсутствует в феврале и марте. В этот период оказывается невозможным активизировать комутонную регуляцию посредством однократной интрагастральной инфузии глюкозы.

Нами показано, что нанесение крысам эмоционально-болевого воздействия в утреннее время, т.е. в период активного Функционирования комутонной регуляции в печени, приводит к инактивации этой регуляции. Бтою установлено также, что инъекция адреналина через 30 и 60 мин после интрагастральной инфузии глюкозы полностью ингибирует активацию комутонной регуляции в этом органе. Ме'хпу тем, гидрокортизон в интервале времени от 2 до 24 ч. после его введения не влиял' на активацию комутонной регуляции в

- 12 - • печени под действием глюкозы.

Было приведено фракционирование комутонсодержащей РФК из печени крысы, которой за 24 ч. до забоя вводили продигиозан. Данные экспериментов по гель-фильтрации РФК на колонке с сефадексом g -15 отражены на рис.3. Активность комутона выходила во внутреннем объеме колонки в составе 2-го пика. При рехромато-графии этой фракции на колонке с сефадексом g-IO .активность комутона также выходила во внутреннем объеме упомянутой колонки. Материал, полученный после гель-фильтрации РФК на колонке с сефадексом G-I5, фракционировали методом ШХ. Гель-хроматография на колонке tsk g -3000 sw при элюировании 0,5 М ацетатом аммония позволила отделить 25% примесей, по поглощению на 226 нм. Более эффективная очистка комутона была достигнута с применением метода обратнофазовой хроматографии на колонке tsk Phenyl - 5 pw со слабогидрофобной матрицей, а также метода ионларной хроматографии на колонке Lychrosorb RP-I8 С тетраэтиламмонием в качестве контриона. Наилучше результаты были получены в ходе фракционирования комутонсодеряащего материала на анионообменной колонке Partisil 10 sax и на колонке Lichrosorb RP-I8 с высокогидрофобной матрицей (рис.4). Каждая из этих процедур позволила отдалить примеси, составляющие 45-50% судя по 0I^2g или 80% при оценке удельной активности комутона по сухому весу.

Гомогенность фракции комутона, полученной в результате обратнофазовой хроматографии на колонке Lichrosorb rp-18, была подтверждена в процессе её рехроматографии на анионообменной колонке Partisil IOsax . Гомогенный в упомянутых процедурах препарат комутона из печени крысы в дальнейшем был обозначен нами как "высокоочищенная фракция комутона" (ВОФК). Было показано, что ВОФК из печени на 200-300% повышает скорость дыхания МХ печени в состоянии 4' и не влияет на скорость дыхания МХ почки, сердца, мозга и скелетных мышц. Этот эффект комутона не снимается добавлением в среду инкубации (элигомицина. Тканеспецифическая стимуляция дыхания МХ печени в присутствии ВОФК наблюдается при окислении ими сукцината, изоцитрата, глу-тамата. и пирувата с малатом. Зависимость величины эффекта стимуляции дыхания МХ от концентрации ВОФК в интервале от 40 до 240.мкг/мл близка к линейной. Даже при очень высоких концентрациях ВОФК не наблюдается полного разобщения ОФ. Однако в присут-

ствии неразобщающих концентраций 2,4-ДНФ или низких концентраций малоната добавление ВОФК может привести к тканеспецифичес-кому разобщению ОФ.

Рис.3

Гель-Фильтрация комутон-содержащей РФК на колонке с сефацексом в -15. Абсцисса-№ проб. Левая ордината - 0П280* Правая ордината - удельная активность комутона (Е/мл). Сплошная линия - ОЙ,

Ю <5 20 25 50 35 40 40 50 Г5

■ООП*

Пунктир - величина удельной активности комутона.

03,0.20Л-

комугон

А

£

Рис.4. Фракционирование частично очищенного комутона из печени методом обратнофазовой ЖХ на колонке 1ЛсЬгозогЬ -18. ' прерывистая линия - градиент ацетонитрила от 0 до 80%. Абсцисса - объем элюции, мл. Ордината - ОП

Было изучено влияние ВОФК на АТФ-азную активность МХ (рис.. 5). Как видно из данных этого рисунка, добавление ВОФК вызывало усиливающуюся во времени стимуляцию АТФ-азной реакции у гомологичных МХ и не влияло, на ход этой реакции' у МХ почки.

Рис.5. Влияние 2,4-ДНФ и ВОФК на АТФ-азную активность МХ из печени и почки. А - МХ печени; В - МХ почки; I - 100 мкМ ДНФ; 2 - ВОФК (31 мкг/мг белка МХ), 3 - контроль. Стрелки - введение олигомицина.

Исследование воздействия ВОФК на ВАН,, индуцированное у МХ ионами Са^+, показало, что исследуемая фракция заметно усиливает этот процесс у МХ печени и не влияет на таковой у МХ почки (рис.6). Добавление ВОФК к МХ из печени и почки не влияет на скорость транспорта Са^+ - из -наружного пространства в мат-рикс этих МХ, но существенно внижает Са2+-емкость МХ печени (рис.7).

Было обнаружено также, что добавления ВОФК к гомологичным МХ уменьшает время удержания ионов Са2+ с 20 до 1,4 минут и не влияет на этот параметр, у .МХ почки (рис. 8}.

Процесс выхода ионов Са2+ из матрикса МХ в присутствии рутения красного, ингибирующего поглощение этих ионов МХ из внешней среды,-был исследован в двух вариантах опыта. В первом случае МХ нагружали таким количеством ионов Са2+, что добавление рутения красного в среду инкубации сразу по завершении транспорта этих ионов в матрикс МХ приводило к выбросу Са2+ в наружное пространство. В этих условиях ВОФК в 3-4 раза усиливала скорость индуцированного РК выхода Са^+ из МХ печени. На параметры транспорта ионов Са^+ у МХ почки ВОФК влияния не оказывала.

Рис.6. Влияние ВОФК на высокоамплитудное набухание МХ печени и почки крысы, индуцированное ионами Са2+. Ордината -ОП520 нм. Сплошная линия - набухание МХ в присутствии ВОФК (40 мкг), прерывистая линия - контроль. Стрелки указывают введение сас12 . I - МХ печени, Са^+ -600 нмоль: 2 - МХ печени, Са2+ -'300 нмоль; 3 - МХ почки, Са - 600 нмоль.

Рис.7. Влияние ВОФК из печени на Са2+-емкость МХ печени и

почки. А - МХ печени, В - МХ почки; I - интактные МХ, 2 - МХ в присутствии ВОФК (75 мкг). Стрелками указано введение СаС12

-Рис.8. Влияние ВОФК из печени на время удержания Са~+ МХ печени и почки. Стрелки показывают введение caci2 . А - МХ печени; В - МХ почки. I - интактные МХ, 2 - МХ в присутствии ВОФК (75 мкг).

В другом опыте к суспензии МХ добавляли меньшее количество ионов Са^+, после чего МХ были способны длительно удерживать связанный Са^+ в присутствии FK. В таких условиях добавление ВОФК в среду инкубации через I минуту после введения в нее РК индуцировало медленный выход ионов Са^+ из МХ печени. При этом ВОФК печени не оказывала влияния на МХ почки (рис.9).

Обсуждение полученных результатов приведено в 6 главе. Исследование циркацного ритма активности комутона в печени крысы показало, что комутонная регуляция реализуется в печени в период бодрствования крысы. Для этого периода характерно высокое содержание в гепатоцитах гликогена, усиление гликолиза и повышение активности ферментов, участвующих в липогенезе (Peret et al, 1976). Активность гликоген-синтетазы к моменту активации комутонной регуляции находится в акрофазе (sable , Agid 1969). Таким образом активация комутонной регуляции в печени происходит в условиях повышенной функциональной активности этого органа.

В связи с тем, что активация комутонной регуляции дыхания

и ОФ в печени приходится на период усиленного синтеза гликогена, мы предположили, что между этими процессами имеется причинная связь. Экспериментальная проверка показала, что интрагастраль-ная инфузия глюкозы действительно приводит к активации комутон-ной регуляции в печени крысы.

ЯХ Ca PK В0*К

U L_L

Л

1 Г 1пин.

1-1 А ' *

ИХ Со* PK

IM

i.2

Рис.9. Влияние ВОФК из печени на медленный выход ионов Са из МХ печени. А - МХ печени, В - МХ почки. I - контроль; 2 - МХ в присутствии ВОФК (75 мкг).

2+

Введение животному эндотоксинов сопровождается значительными изменениями в функциональном состоянии гепатоцитов. Известно, что купферовские клетки печени, активированные эндотоксином, выбрасывают в межклеточное пространство ряд веществ (супероксид-анион, лизосомальные ферменты и др.), которые оказывают на гепатоциты повреждающее воздействие ( Maier , ulevitch , 1981; Маянский, 1981). В наших экспериментах было установлено, что введение крысам продигиозана, представляющего собой эндотоксин, выделенный ИЗ Serratia marcescens , приводит к активации комутонной регуляции в печени. Исследование влияния повреждения гепатоцитов на активность комутона в печени было продолжено в экспериментах с введения крысам ccl4 . Как известно, в первые сутки под влиянием примененной дозы этого гепатотоксина в клетках печени происходят глубокие нарушения разнообразных метаболических процессов, а также имеет место гибель значительной части гепатоцитов ( Reynolds ,1963). На 2-е сутки в печени акти-

визируются репаративные и регенераторные процессы, и к 7-м суткам после воздействия происходит восстановление этого органа (Фрундер, 1968). Было установлено, что комутонная регуляция активирована в этом opräHe в течение всего времени наблюдения с 8 ч до 6-х суток после введения uui4 включительно. Ткане-специфическое'понижение сопряжения ОФ МХ совпадает с началом активации регенераторных процессов, а в остальпне сроки имеет место тканеслецифическая стимуляция дихания МХ в среде с субстратом.

Сопоставление эффектов комутона в отношении дыхания и ОФ МХ в регенерирующей печени с динамикой клеточных популяций в этом объекте позволило установить корреляцию между характером проявления комутоняой регуляции и прохождением клетками печени отдельных фаз митотического цикла. Было обнаружено, что ткане-специфическое увеличение Д0акт и МХ печени в присутствии гомологичной комутонсодержащей фракции совпадало по времени с моментами входа клеток в митотический цикл,, а также с их выходом из этого цикла. Тканеспецифическая стимуляция дыхания МХ в печени в среде с субстратом сопровождала прохождение клетками g1 -фазы митотического цикла.

Эксперименты по изучению влияния трийодтиронина и питуитрина на динамику активности комутона в печени крысы показали, что' эти гормональные препараты являются эффективными активаторами исследуемой регуляции. Известно, что введение животным тиреоицных гормонов приводит к увеличению потребления кислорода тканями организма и к усилению окисления субстратов ( Hoch , 1962). В состав питуитрина входят вазопрессин и окситоцин. Показано, что вазопрессин стимулирует дыхание клеток печени, а также усиливает поступление Са^+ в гепатоциты из межклеточного пространства и мобилизует ионы Са^+ из клеточных депо ( Brand , Murphy , 1987; charest et al,i983). Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что гормональные воздействия на энергообеспечивающие механизмы гепатоцитов приводят к активации е них комутонной регуляции МХ процессов. •

При изучении аннуального ритма активности комутона было сделано заключение о том, что комутонная регуляция в печени крысы инактивируется в ходе весеннего стресса животного. Эмо-■ ционально-болевое воздействие также приводило к подавлению исследуемой регуляции. Эксперименты с введением животному адрена-

лша показали-, что этот гормон, участвующий,в перестройке метаболизма при развитии общего адаптационного синдрома,инакти-вирует комутонную регуляцию в печени крысы. Таким образом, отсутствие этой рефляции в печени крысы в условиях сезонного стресса, а также её инактивация в результате эмоционально-болевого воздействия на животное получило свое объяснение.

В ходе Изучения физико-химических свойств комутона печени активированного введением животному продигиозана, было установлено, что он является термостабильным и устойчивым к аэрированию веществом (Злбакидзе, Челидзе, Элбакидзе, Гачечиладзе, 1989). В результате экспериментальной работы по фракционированию комутона было подобрано оптимальное сочетание препаративных процедур, позволяющее получить высокоочищенный препарат этого регулятора. Был разработан метод очистки .комутона, включающий гель-фильтрацию РЖ из печени на колонке с сефадексом 6-15, и обратно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке ИсНговогЬ яр -18. Полученный препарат комутона был гомогенным при вариациях процедур различных видов высокоэффективной жидкостной хроматографии, что указывало на высокую • степень его очистки.

Результаты экспериментов по фракционированию комутона позволяют заключить, что он является низкомолекулярным соединением с молекулярной массой менее 700, заряженным отрицательно при нейтральных и щелочных значениях рН,и проявляющим слабые гидрофобные свойства при рН 2,3.

Таким образом комутон, активируемый в печени крысы проди-гиозаном, сильно отличается от обнаруженного ранее в рнтактной печени термостабильного комутона, являющегося пептидоМ с молекулярной массой менее 5000, и функционально-активными сульф-гидрильными группами (Элбакидзе, Ливанова, 1980; Элбакидзе, Устинов, 1984).

Ввиду того, что добавление ВОФК к гомологичным митохондриям, окисляющим'сукцинат, вызывает у них стимуляцию скоростей дыхания в состояниях "4' " и "4", а у МХ из почки, сердца, скелетных мышц а мозга крысы в аналогичных экспериментах параметры дыхания и ОФ не изменялись, было сделано заключение о тканевой специфичности действия ВОФК из печени в отношении дыхания гомологичных МХ. То обстоятельство, что стимуляция дыхания МХ печени в присутствии ВОФК не снималась после добавления в среду олиго-

мицина, свидетельствовало о разобщающем действии комутона в составе этой фракции на МХ. С этим заключением согласуются и данные опытов по сравнению влияния ВОФК на дыхание МХ печени и почки при окислении ими сукцяяата, изоцитрата, глутамата и диру-вата с малатом, где способность этой фракции тканеспецифически стимулировать дыхание МХ не зависела от вида субстрата. Сравнение влияния различных концентраций ВОФК и 2,4-ДНФ на дыхание и ОФ МХ печени показало, что ВОФК вызывает более медленное нарастание скорости дыхания МХ в среде с субстратом при увеличении концентрации этой фракции в сравнении с эффектами синтетического разобщителя.

Ранее было показано, что тканеспецифическая стимуляция дыхания интактннх МХ под действием гомологичного комутона дополняется тканеспецифическим разобщением ОФ после преинкубации МХ .с ионами Са2+ или Ре^" (Элбакидзе, Федоров, Злбакидзе, 1986; Элбакидзе, Элбакидзе, Гачечиладзе, Рогова, 1985). Было установлено, что этот эффект реализуется благодаря индукции калиевой проницаемости у МХ-мембраны вследствие активации митохондриаль-ной фосфолипазы А или перекисного окисления лилидов упомянутыми ионами. Роль увеличения калиевой проницаемости этой мембраны в реализации разобщающего эффекта комутона оставалась не изученной. Ввиду того,.что в наших экспериментах тканеспецифический разобщающий эффект комутона развивался при добавлении в среду инкубации низких концентраций 2,4-ДНФ или малоната, было сделано заключение о том, что упомянутый эффект реализуется на фоне дополнительного деэнергизующего воздействия на МХ. Таким образом, участие ионов К+ в активации тканеспецифяческого контроля ОФ МХ печени гомологичным комутоном носит неспецифический характер.

Обнаруженная в наших экспериментах способность ВОФК из печени тканеспецифически стимулировать'АТФ-азнута активность гомологичных МХ согласуется с представлением о его разобщающем действии на ОФ МХ.

Как известно, повышение нагрузки на специальные функции ткани, а также повреждение клеток сопровождается набуханием митохондрий. Ввиду того, что ВОФК тканеспецифически усиливал ВАН у МХ печени, а комутонная регуляция активизируется в печени при тех же функциональных состояниях, при которых наблюдается набухание МХ, можно полагать, что эта регуляция вносит вклад

в рассматриваемые структурные изменения МХ.

Исследование действия ВОФК из печени на время удержания ионов Са2+ в матриксе МХ из печени и почки, а также на кальциевую емкость этих органелл, показало, что комутоя из печени вызывает тканеспецифическоо перераспределение этих ионов между матриксом МХ и наружным пространством, понижая способность этих органелл связывать кальций. Как известно, в процессе удержания кальция в матриксе МХ может иметь место рециклинг этого иона на внутренней мембране упомянутых органелл.

Добавление РК подавляет вход Са2+ в матрикс и позволяет наблюдать за'движением этого нона в противоположном направлении. Эксперименты по изучению влияния В05К на процесс выхода ионов Са"+ из матрикса митохондрий, проведенные с добавлением к МХ РК показали, что комутон активирует этот процесс. Таким образом, результаты экспериментов по изучению влияния ВС'Ж на ВАН гомологичных МХ и различные параметры кальциевого обмена в МХ получили объяснение.

Проведенные нами исследования позволили выявить важную роль ионов Са^+ в функционировании комутонного контроля МХ-про-цессов. Следует отметить, что свойство контактияа восстанавливать механическую прочность ткани также реализуется лишь в присутствии этих ионов (Маленков, 1983). Было высказано предположение, что рост-тормозящее действие кейлонов осуществляется посредством торможения им проницаемости наружной плазматической мембраны, для Са2+ (ноиск зг а1д973). Таким образом, изменение компартментов ионов Са^+ в клетке может являться общим свойством всех эффекторов внутритканевых межклеточных взаимодействий. I

ВЫВОДЫ

1. Изучение циркадного ритма активности коыутона в печени интактной крысы показало, что вызываемые этим регулятором ткане-специфические эффекты - стимуляция дыхания МХ в среде с субстратом и разобщение ОФ - наблюдаются с до 9 , с акрофа-зами на 6 .

2. Активация энергетического метаболизма в печени крысы после введения животному трийодтиронина, питуитрина и проди-гиозана, а также в ходе регенерации печени после её повреждения

гепатотропным адом СС1Д или частичной гепатэктомйи сопровождается значительным повышением активности комутона в этом органе.

3. В регенерирующей после ЧГЭ печени крысы наблюдаются закономерные колебания активности комутона. Тканеспецифическая стимуляция дыхания МХ в среде с субстратом в присутствии кому. тонсоцержащей фракции из этого органа наблюдается в интервалах

с 6 до 16 ч., с 32 до 36 ч., и с 46 до 62 ч. после гепатэктомии. . Тканеспецифическое разобщение ОФ в этих условиях происходит у МХ печени с 2 до 6 ч.е 24 до 30 ч. и с 42 до 48 ч. после операции.

4. Комутонная рефляция в печени крысы инактивируется в условиях стресса. Введение крысам адреналина предотвращает активацию в печени комутонной регуляции под действием глюкозной нагрузки. Гидрокортизон не влияет на этот процесс.

5. Разработан метод получения высокоочищенной фракции термостабильного комутона из печени крысы. Сохранение свойства

' тканевой специфичности действия упомянутой фракции комутона в отношении дыхания МХ из гомологичного органа подтверждена в экспериментах с МХ из печени, почки, сердца, мозга и скелетных мышц крысы.

6. Влияние, оказываемое высокоочищенной фракцией термостабильного комутона из печени на дыхание и ОФ гомологичных Ж, можно квалифицировать как мягкое разобщение ОФ, эквивалентное действию низких концентраций синтетических разобщителей (10-20 мкМ 2,4-ДНФ). У интактных МХ печени в присутствии упомянутой фракции комутона не происходит полного разобщения ОФ, а наблюдается лишь не снимаемая олигомицином стимуляция дыхания при окислении сукцината, изоцитрата, глутамата или пирувата с мала-том, а также стимуляция АТФ-азной активности МХ. Тканеспецифическое разобщение ОФ под действием комутонной фракции имеет место лишь при дополнительной деэнергизации Ж введением в среду инкубации низких концентраций 2,4-ДНФ или малоната.

7. Высокоочищенный термостабильный комутон тканеспецифи-чески активирует антипортер Са2+ во внутренней мембране Ж печени и усиливает выход этого иона из матрикса МХ.

8. Высокоочищенный термостабильный комутон тканеспецифи-чески сенсибилизирует МХ печени по отношению к Са2+, активируя спонтанный выброс этих ионов из матрикса Ж в условиях массив-

ного накопления кальция в митохондриях. Указанный эффект комутона проявляется в виде снижения Са^+-емкости MX печени в присутствии комутона, снижении времени удержания MX накопленного Са~+ и усилении высокоамплитудного набухания MX, индуцированного ионами Са^+.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Элбакидзе Г.М., Лухин А.И., Челидзе М.А. Внутритканевой контроль энергетического метаболизма печени крысы в условиях голодания в ранние сроки после "частичной гепатэктомии.// Изв. АН СССР. Сер.биол. -1984 .-JM .-С .529-534.

2. Eloakidze G.il., ülbakidze I.II., Chclidze H.A. Some basic principles of the intratissue Control of energetic metabolism in rc.t liver. Comuton concept .//International syrap. of diol. Regulation of Cell Proliferation.9-th' Chalone Conference.-

3. Элбакидзе Г.М., Челидзе М.А., Элбакидзе И.M. Нарушение внутритканевого контроля энергетического метаболизма печени как возможная причина диабета. - В кн.: Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий. - Тбилиси, ГОНТ ГССР, 1987 -С.. 178-185.

4. Элбакидзе Г.М., Челидзе М.А., Элбакидзе И.М., Рогова Н.С., Ливанова Л.М. Изучение циркадного ритма активности комутона в печени крысы.// Изв. АН СССР, сер.биол. .-I988.-Ji2.-C .267275.

5. Элбакидзе Г.М., Челидзе М.А., Элбакидзе И.М., Рогова Н.С. Сезонные колебания активности комутона в печени крысы. -

В кн.: Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий. - Тбилиси, ГКНТ ГССР, 1989,-С .73-75.

6. Элбакидзе Г.М., Элбакидзе И.М., Челидзе М.А. Комутонная регуляция дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий печени при окислении различных субстратов. - В кн.: Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика

и терапия Хронических патологий. - Тбилиси, ГКНТ ГССР, 1989.-С. 75-77.

7. Элбакидзе Г.М., Челидзе М.А., Элбакидзе И.М., Гачечиладзе А.Г. Физико-химические свойства комутона, активируемого в

печени продигиозаном. - В кн.: Регуляция тканевого гомео-стаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий. Тбилиси, ГКНТ'ГССР. 1989.-С.77-78.

.8. Злбакидзе Г.М., Челидзе U.A., Злбакидзе И.М. Влияние однократного введения фенобарбитала и четыреххлористого углерода на активность комутона в печени крысы.// Изв. АН СССР, сер.биол..-1989,-№5.-С.666-673.

9. Челидзе М.А.,. Злбакидзе Г.М. Индукция " р> " состояния кому-тонной регуляции окислительного фосфорилирования митохондрий 2,4-ДНФ и малонатом.// Изв. АН СССР, сер.биол..-1989,-№ 6.-С.926-930.

10. Злбакидзе Г.М., Челидзе U.A., Злбакидзе И.М. Тканеспецифи-ческая регуляция транспорта ионов кальция термостабильным комутоном из печени крысы // ДАН СССР. - 1990. - Т. 313, JS5.