Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнение кинетики действия и структуры цитозольной и митохондриальной пирофосфатазы печени крысы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнение кинетики действия и структуры цитозольной и митохондриальной пирофосфатазы печени крысы"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

УНГУРИТЕ Аушра Ляоновна

УДК 577.152.361

СРАВНЕНИЕ КИНЕТИКИ ДЕЙСТВИЯ И СТРУКТУРЫ цитозольной И МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ПИРОФОСФАТАЗЫ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ

03.00.04 — биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —1991

Работа выполнена в Межфакульгетской НИЛ молекулярной биологии и биоорганической химии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Йаучный руководитель доктор химических наук А.А. Байков

ОЗЕициалыше оппоненты: доктор биологических наук В.И. Муронец кандидат биологических наук О.Д. Лопина

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

Защита состоится

се.

1991 года в.

/Г

часов на заседании специализированного ученого совета Д 053.05.32 по биологическим наукам при биологическом факультете МГУ по адресу: 119999, . ГСП-3, Москва. Ленинские горы, МГУ, Оиологический факультет, кафедра биохимии.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан

;

,1991 года

Ученый секретарь совета кандидат биологических наук

Ю.Н. Ле^кин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Неорганический пирофосфат является общим метаболитом практически всех главных огненных путей в клетках живых организмов. Он образуется при синтезе белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов, аминокислот, активации жирных кислот, расщеплении АТР и в других процессах. Эти реакции обратимы, поэтому гидролиз рр( смещает положение их равновесия в направлении синтеза. Однако роль рр( в клетках, по-видимому, не исчерпывается этим. Пирофосфат является метаболически активным малым ионом, который, наряду с н\ nh*. со„ и р(, осуществляет контрольную функцию во многих важных обменных процессах, в регуляции к адьций-фосфатного обмена и кальцификации костных и других .тканей.

Судьба рр(, в основном, связана с его превращением под действием неорганической пирофосфатазы (КФ 3.6.I.Ii, которая, таким образом, выступает регулятором целого ряда важных биологических процессов. Пирофосфатазы делят на "растворимые" и мембранные. Под этим понимают, что первые функционируют в растворенном состоянии, например, в цитозоле, а последние - в виде комплексов с мембранами. Пирофосфатаза способна не только гидролизоватъ рр(, но и синтезировать его из фосфата. Синте-тазная функция свойственна, например, мембранному ферменту фютосинтезирущих бактерий Hhodospiriiium гиьгиа . Этот фермент способен синтезировать рр(, используя при этом энергию трансмембранного градиента электрохимического потенциала иона и'. Такой же способностью обладают мембранные ферменты вакуолей растений и, предположительно, митохондрий животных. Поэтому пирофосфатаза является удобным объектом для изучения химических основ сопряжения' транспорта н* через мембрану с гидролизом полифосфатов - основных переносчиков энергии в живых клетках.

Изучение мембранной пирофосфатазы находится на начальной стадии и имеющиеся данные не дают ответа на вопрос о том, какие особенности ее структуры связаны с транспортными функциями. В связи с этим представлялось целесообразным сравнить в функциональном и структурном аспектах мембранную и цитозольную пирофосфатазы, выделенные из одних и тех же клеток. Удобным источнк-

ком двух ферментов может быть печень крысы, где пирофосфатаза есть и в цитозоле, и в мембране митохондрий. Данный объект интересен еще и потому, что пирофосфатазы животных пока еще мало изучены, в отличие от бактериальных и растительных пирофосфатаз.

ЦЕЛЬЮ настоящей работы было сравнение кинетических и структурных свойств изоформ пирофосфатазы, выделенных из цитозоля и митохондрий печени крысы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Показано, что по первичной структуре две каталитичес" '.е субъединицы мито-хондриального фермента весьма сходны между собой и сильно отличаются от субьедакиц цитозольного фермента. Пирофосфатаза митохондрий печени крысы существенно гвдрофобнее пирофосфатаз цитозоля печени крысы и дрожжей. Установлена кинетическая схема гидролиза пирофосфата обеими пирофосфатазами в присутствии м<?2+, согласно которой существуют два пути реакции. Общее число ионов металла, участвующих в катализе, не менее четырех для цитозольного фермента и не менее двух для митохондриального. Присоединение последнего иона металла частично- ингибирует пирофосфатазу цитозоля, но активирует пирофосфатазу митохондрий. Показано, что константа ингибирования пирофосфатазы митохондрий ионами сл2* сравнима с 'концентрацией свободного са' в митохондриях. Этот результат подтверждает гипотезу о том, что действие гормонов на окислительные процессы в митохондриях опосредованы изменением в них активности пирофосфатазы и концентрации рр(. Пирофосфатаза митохондрий обладает значительно меньшим сродством к дифосфонат-ным аналогам пирофосфата по сравнению с пирофосфатазой цитозоля и, в отличие от последней, не инактивируется при инкубации с субстратом в отсутствие ионов металлов.

Полученные данные вносят вклад в изучение метаболизма пирофосфата и его регуляции в клетках млекопитающих. Результаты работы могут иметь практическую ценность при создании новых лекарств на основе дафосфонатов.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано Ь работ.

ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, посвещенного пирофосфатазам. животных и изоферментам с различной субклеточной локализацией, экспериментально- части, изложения результатов, выводов и списка цитиро-

А

ванной литературы < 216 названий». Объем работы страниц

машинописного текста, включая 24 рисунка и 10 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

А. Сравнение структурных особенностей пирофосфатаз цитозоля и митохондрий

При разделении митохондриальной пирофосфатазы в градиентном ПААГ была выявлена белковая полоса, соответствующая молекулярной массе ПО ± 10 кДа, которая совпадала с осноеной зоной при окраске по активности фермента. При разделении фермента в присутствии 0,1% ДСН, были получены три основные белковые полосы (молекулярные массы 30, 37, и 50 кДа), что, видимо, соответствует субъединицам фермента.

Для того, чтобы качественно сравнить первичную структуру цитозольной и митохондриальной пирофосфатазы, мы расщепляли бромцианом отдельные субъединицы двух ферментов и сравнивали полученные наборы пептидов после разделения в градиентном ПААГ. Наборы пептидов, соответствующие цитозольному ферменту, не совпадают с наборами пептидов, полученных из компонентов мембранного фермента (рис. I». Поскольку расщепление бромцианом происходит по остаткам метионина, основной вывод из данных результатов состоит в том, что цитозольная и митохондриальная пирофосфатазы имеют разные первичные структуры.

Б. Сравнение функциональных особенностей пирофосфатаз цитозоля и митохондрий

I. Кинетическая схема гидролиза рр1

Присутствие конов являлось обязательным условием гидролиза рр( как для цитозольной, так и для митохондриальной пирофосфатаз. Были измерены скорости реакции в широких диапазонах концентраций рр( и м?2' и полученные данные подвергнуты математическому анализу, результатом которого явилась схема взаимодействия фермента с субстратом и металлом-активатором.

Цитозольная пирофосфатаза. При постоянной концентрации м«г зависимость начальной скорости от концентрации м«рр1 подчинялась уравнению Михаэлиса-Мэнтен в широком диапазоне концентраций

24 18

14

■Л111!

т

т

рис. I Картина электрофоретичес-кого разделения пептидов, полученных действием в^ на субъединицы цитозольного и митохондри-ального ферментов. Гель окраиен на белок. Цифры внизу обозначают молекулярнуе массы субъединиц в кДа. Слева указаны подвижности маркерных белков и их молекулярные массы в кДа.

64 50 5СГ ЗТЗЗ

митохондриалъная пирофосфатаза

цитоэольная пирофосфатаза

рис.2 Зависимость Vм* от концентрации мдг* для цитозольной Шфофосфатазы. рн 7,2 (о), 8,5 (в), 9,3 <*).

80

1/%2* СшМ"1)

рис.3 Зависимость у""* от концентрации мд2* для

цитозольной пирофосфатазы. Обозначения как на рис. 2.

рис. 4 Зависимости i/ v*"* 1а) и к"? у""" (д) от

концентрации ыдг* при рн 8,5 для митохондриальной пирофосфатазы.

субстрата. Обработка этих зависимостей позволила определить значения к"* и уквж. Из рис, 2 и 3 видно, что зависимости и отношения к™ж^каж (наклон прямых на графике Лайнуивера-Берка) от обратной концентрации ионов м«г* представляют собой сложные функции. Эти результаты согласуются со следующей схемой катализа:

схема I

к.

е --

I

е(мрр)

ем

ем(мрр) т-

ь'

К

•121М 1 v

ем21мрр) «-

ЕИ.

к

ем3(мрр1 1 v

>

к

Она предпологает связывание трех ионов ив как со свободным ферментом, так и с фермент-субстратным комплексом, причем два из них активируют фермент и являются абсолютно необходимыми для катализа, а третий - частично ингибирует v). мрр обозначает комплекс мнрр,, к,- к5 - константы диссоциации для связывания металла, V и V' - максимальные скорос-ч для двух продуктивных комплексов.

Уравнение скорости для этой модели имеет вид:

v + v-

к См)

к' к.

к I м 3 1 +- +

к

К' к

в

[М] 1мГ

[мрр 1

• ^ ^ кг ^ к,*, к, + См1 + 1м1г

(I)

При фиксированной концентрации м8г' оно превращается в уравнение Михаэлиса-Ментен с параметрами, величины которых являются функциями концентрации металла.

Это уравнение было использовано для обработки зависимостей, представленных на рис. 2' и 3, методом нелинейной регрессии. Значения всех параметров, полученные этим путем при Рн 7,2, 8,5 и 9,3, представлены в табл. I. При Рн 8,5 и 9,3 значения параметров к и кп были слишком малы для их определения и поэтому были

Ташшца t

Кшытическне парагзэтра цятозальной и ынтохондривльноЗ пирофосфатез печени крысы

ис-точ колн- 40CÏ- диапазон концентраций

ник рН во измерен^ [MgPP.3 К «5 Ко К' D Y VV V

las2 * J " — — (мкМ) (мЫ) (МКЫ) (мкЫ)

ци- 7.2 132 0,3-100 0,01-50 .¿8110 ' 33111 9±5 150t 60 18±4 5,211,8 0,1210,03 1,Э4Ю,46 0,3410,16

8,0 21 100 0,015-60 42i5 1,1710,17 0,61i0,3

то- 8,5 ИЗ 0,3-100 0,01-50 22±3 20±4 7,612,6 2,710,4 0,1410,03 1,3510,13 0,2910,03

зол » 8.8 45. .100 0,01 Б-Б0 f 9,112,4 . - - . 4 - 0,9710,14 0,4910,2

9,3 87 0,2-100 0,015-50 36*5 4,0±1,8 20111 1,4i0,2 0,13Ю,05 0,Ç3i0,04 0,4110,03

ми-то- ZOH 7.2' '158 0,2-100 0,05-20 100±40 1915 1512 0,410,1 0,3210,02 2,1710,2

8,5 88 0,3-100 0,005-50 2,2710,27 52,8110,7 0,210,02 0,?"Ю,03 2,910,35

др-ии •

'данные В.Б. Дубновой Ев]

приравнены нулю, что согласуется с линейным характером зависимостей 1/уквж и К*в*/Ука* от 1/[Мцг*1 при низких концентрациях мвг* в этих условиях.

Несколько параметров были также определены при рн 8,0 и 8,8. Для этого была проана...широЕана зависимость скорости гидролиза при высокой концентрации мярр, (100 мкМ| от концентрации не2*. Скорость реакции при данной концентрацией мирр, отличались от максимальной не более, чем на 5%.

Митохондриальная гшрофосфатаза. Кинети"зский анализ реакции гидролиза, катализируемой этим ферментом, был проведен только при рн 8,5. Митохондриальный фермент отличался от цитозольного отсутствием ингибирования при высоких концентрациях не2* «рис. 4). Зависимость 1/\каж от 1/1 м«2* 1 была линейной в пределах ошибки измерения. Однако аналогичный анализ кинетики действия митохондриального фермента при ри 7,2 , проведенный недавно Е.Б. Дубновой , обнаружил, что величины \**ж при низких концентрациях иг2* замети® вше, чем следовало бы для линейной зависимости. Это означает, что и для этого фермента существуют два пути гидролиза, но VКроме того, зависимость к™*/у""* была нелинейной при рн 8,5 и ' соответствующая кривая обраш^на выпуклостью вверх. Модель с одним продуктивным комплексом не может объяснить такой характер этой зависимости. Значения всех параметров, определенные так же, как для цитозольного фермента, представлены в табл. I.

Следует отметить, что возможность присоединения двух ионов М8г,к митохондриальному ферменту в отсутствие субстрата не является доказанной .и рассматривается лишь по аналогии с цитоэодьнымл ферментами печени крысы и микроорганизмов. На основании имеющихся данных нельзя исключить, что для активации этой пирофосфатазы требуется лишь один ион мя2*. Как видно из табл. I, для обеих пкрофосфатаз максимальные скорости для двух продуктивных комплексов различаются в 2-3 раза, но для цитозольного фермента более активным является комплекс с меньшим количеством ионов металла, а для митохондриального фермента - с большим. В результате, повышение концентрации мкг* всегда активирует митохондриальный фермент. Для цитозольного фермента реальная скорость никогда не достигает v. В других аспектах модели для двух ферментов совпадают. Константы Михаэлиса <к и

к/) для митохондриального фермента больше, причем различие гораздо сильнее выражено для к .

2. Влияние рн на активность пирофосфатаз.

Для цитозольной пирофосфатазы параметры кг, к3, к,, кт и V являются рн-зависимыми (табл. I>. Рн-зависимость для цитозолъного фермента можно объяснить существованием по меньшей мере, трех ионогеншх групп, как показано на схеме 2:

схема 2

ен ч-

ЕНМ

' енм_

ен_

ен(нрр)

енм(мрр) у к ,

-у

ем2(мрр)

емэ(нрр)

енмг(мрр)

енмэ(мрр)

ен?(мрр)

енгм(мрр)

Значения Рка3 и рк>г оказались равными 9,2 ±0,15 и 8,80 ± 0,15 соответственно. Рк видимо, не меньше 7. В

а 1

свободном фзрменте от рн зависит присоединение' только первого иона нвг*. Это означает, что два других иона металла имеют своими лигандамк группы с рка ниже 7, скорее всего карбоксильные группы. Присоединение второго н«2* к фермент-субстратному комплексу контролируется группой с Ркг= 8,8 < рквг). Так как эта группа не проявляется в свободном ферменте |к2 не зависит от рн», можно предположить, что связывание субстрата индуцирует конформационные изменения в молекуле белка, вызывая некоторые изменения в координационной сфере иона металла и упрочнение комплекса. С этим согласуется меньшее значение к, по сравнению с кг при Рн э.з. Груша с рка= 9,2 принадлежит ферменту, и величина Рка должна быть существенно вше для ем2, как следует из схемы 2.

Для митохондриального фермента из имеющихся данных (табл. I) можно сделать вывод, что общие тенденции остаются такими же', при повышении рн от 7,2 до 8,5 облегчается связывание м«2> и уменьшается максимальная скорость. В то же время в количественном

отношении два фермента различаются судя по тому, что зависимость активности митохондриального фермента от рн в присутствии физиологических концентраций мв2* ю,4 мМ> и рр( u мкМ( сдвинута на 0,5 единиц Рн в щелочную область по сравнению с ферментом цитозоля.

3. Скорость взаимодействия пирофосфатаз с мзг*.

Все измерения, описанные в предыдущих разделах, были выполнены с ферментами, подвергнутыми достаточно длительной преинкубации с Mg2* для достижения полного равновесия в реакционной среде. Если цитозольный фермент, ,не содержащий м<?г\ добавляли в среду с рр( и и«2*, то скорость гидролиза возрастала во времени, указывая на активацию фермента во время измерения активности. В том случае, если данный фермент преинкубировали с . 0,2 мМ м«2', а затем прибавляли в реакционную среду, содержавшую меньше металла, то значение v*"* заметно возрастало <рис. 5>; при этом зависимость I/v"" от I/lMgz*l становилась линег&ой при низких концентрациях металла. Константа диссоциац>ш для присоединения мв2*, полученная экстраполяцией этой линейной зависимости на ось абсцисс, составила 190 ± 20 мкМ, т.е. совпала в пределах ошибки определения с к4 (табл. I). Эти данные указывают на то, что присоединение первого иона Mg2* к цитозольной пирофосфатазо представляет собой сравнительно медленный процесс по сравнению с временем измерения активности.

Для митохондриальной пирофосфатазы концентрация мцг* во время преинкубации на влияла на скорость гидролиза Следовательно, в этом случае связывание металла с ферментом происходит достаточно быстро.

4. Ингибирование ионами с»г>

Ионы с»г* ингибировали пирофосфатазу митохондрий при Рн 7,2 в меньшей степени, чем цитозольный фермент (рис. 6i. Кажущиеся константы ингибирования к, были расчитаны по уравнению:

V,» v/(l + Jjte^/K,), (21

в котором v и vt - активности в отсутствие и в присутствии с» , соответственно, и составили 5,9 ± 0,2 мкМ для пирофосфатазы

ZS

. 15-1 *

о 20 .60 , too '

' 1/[Mg*J(mM}

(рис. 5 Зависимость Укаж от концентрации при рН 7,2 для цитозольной пирофосфатазы, проинкубированной с Концентрация при преинкубации: (•») -0,2мМ, (о)-указана на оси абсцисс.

рис. б Ингибировакие пирофосфатаз цитоэолт (о) и митохондрий (*) ионами Са^в присутствии I мкМ РРА и 0,4 мМ MgCl2 при рН 7,2, 37°С. • '

цитоэоля и 15 ± 2 мкМ для пирофосфатазы митохондрий.

Ингибирование митохондриальной пирофосфатазы ионами са2* при рн- 8.5 было исследовано более подробно. Концентрации Mgpp, и свободного саг* были независимыми переменными в этих опытах, а концентрация свободного м«2* была постоянной - 0,4 NN. Характер кинетических зависимостей показывает, что при Рн 8,5 с«2* взаимодействует только с ферментом, содержащим рр(, и что связываются два иона саг*. Возможно, что один из них связывается

В ВИДе СаРР,.

5. Ингибирование дифосфонагами. ;

Качественную информацию о строении активного центра пирофос-фатаз дает изучение их взаимодействия с аналогами рр(, которые содержат в ностиковом положении атомы с или N. Наибольший интерес представляли с-замещенные дифосфонаты строения o3p-cir)ih*)-роэ. Ранее такой подход был успешно применен для сравнения цитозольных шрофосфатаз печени крысы, сердца быка, дрожжей и Еас. .т1сы&

coli .

В табл. 2 приведены константы ингибирования аналогами рр( митохондриального фермента, которые были получены тем же способом, что и в случае саг\ Как видно, все дифосфонаты связывались пирофосфатазой митохондрий слабее, чем пирофос-фатазой цитозоля, причем отношение величин к, для двух ферментов варьировало от 2,7 для метилендифосфоната до 115 для 1-оксизтилиден-1,I- дифосфоната. В то же время, имидодифосфат связывается пирофосфатазой митохондрий прочнее, чем пирофосфатазой цитоэоля. Это соединение оказалось самым сильным ингибитором пирофосфатазы митохондрий. Таким образом, активный центр пирофосфатазы иитохоадряа проявляет меньшую способность связывания аналогов субстрата и, следовательно, имеет другое строение.

6. Ингибирование ян-реагентами.

Цитозольная . пирофосфатаза печени крысы ингибируется зн-реагентама достаточно медленно, но глубоко фис. 7>, в отличие от митохондриальной пирофосфатазы, которая в присутствии этих реагентов полностью модифицируется в течение 2 мин, но ее остаточная активность оставляет от 7 до 93% , в зависимости от

U

Таблица 2

Кажущиеся константы ингибирования пирофосфатазы митохондрий дафосфонатами и имвдрдифосфетом в присутствии 1мкм РР1 и 1мЫ Hg2*

Ингибитор R R" к* . мкЫ

метилендифосфонат Н Н 190 ± 60 (70)

оксимвтилендифосфонат В ОН ■н Б (8)

амяпомвтилеядифосфонат Н MHg 160 ± 30 (11)

1-оксиэтилиден-1,1-дафосфояат 0Н3 он 870 ± 110 • (7)

дихлормвтилвн-дифосфонат О1 01 3000

дибромомвтилен-дифосфонат Вр Вр 1000 •* 200 (230)

имилодифосфат 0,8 ± 0,2 (2,2)

в скобках приведены данные H.H. Смирновой и др. для пирофосфатаэы цитозоля

рис. 7 Влияние I Ш Дитиобис 2-нитробензоата fo), 8 мМ (*f) и 16 Ш (t£ н-эталмаяеимида к 0,1 1ЙА ДЦШ (в) га активность пирофосфатаэы цитозоля.

природы эн-реагента (данные Е.Б. ДуОновой>. Также медленне происходит и реактивация дитиоэритритом цитозольной пирофосфатазы, обработанной ртутными соединениями, в то время как митохондриальный фермент восстанавливает активность почти мгновенно. Из этого можно сделать вывод, что митохондриальная и цитозольная пирофосфатазы имеют разное строение не только & области активного центра, но и за его пределами.

ВЫВОДЫ

1. Электрофоретический анализ продуктов расщепления мито-хондриальной и цитозольной пирофосфатаз печени крысы Сромцианом показал, что по первичной структуре две каталитические субъединицы митохондриального фермента весьма сходны между собой и сильно отличаются от субъединиц цитозольного фермента.

2. Судя по константам распределения в двухфазной водно-полимерной системе, пирофосфатаза митохондрий печени крысы существенно гидрофобнее пирофосфатаз цитозоля печени крысы и дробей.

3. Простейшая кинетическая схема гидролиза пирофосфата обеими пирофосфатазами в присутствии мз2< предполагает, что существуют два пути реакции, субстратом служит мярр,. а ион металла активирует фермент. Общее число ионов металла, участвующих в катализе, не менее четырех для цитозольного фермента и не менее двух для митохондриального. Присоединение последнего иона металла частично ингибирует- пирофосфатазу цитозоля, но активирует пирофосфатазу митохондрий. Активность первого ферменте зависит от состояния ионизации групп с рк<8,8 и 9,2.

4. Кони саг* ингибируют пирофосфатазу митохондрий 'по бесконкурентному механизму. Константа шгибирования сравнима с концентрацией свободного са2* в митохондриях. Это косвенно подтверждает гипотезу о том, что влияние саг'-мобилизирущих гормонов на энергетические процессы в митохондриях опосредуется изменением активности пирофосфатазы и, следовательно, содержания пирофосфата.

б. Пирофосфатаза митохондрий обладает значительно меньшим сродством к дафосфонатным аналогам пирофосфата по сравнению с пирофосфатазой цитозоля и, в отличие от последней, не ииактиви-руется при инкубации с субстратом в отсутствие ионов металлов.

6. Цитозольная пирофосфатаза инактивируется эн-реагентами значительно медленнее митохондриальной. Степени инактивации двух ферментов одними и теми же реагентами сильно различаются.

7. Полученные данные указывают на то, что пирофосфатазы цитозоля и митохондрий имеют отделенное родство и кодируются разными генами.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Унгурите А.Л., Смирнова И.Н., Кашо В.Н.,Байков А.А. Сравнение каталитических свойств неорганических пирофосфатаз митохондрий и цитозоля печени крысы // Биол. мембр. 1989. Т.6. Г' 4. С.356-361.

2. Унгурите А.Л., Кашо В.Н., Михеева Л.М.. Заславский Б.Ю. Изучение относительной гидрофобное™ неорганических пирофосфатаз, выделенных из различных источников // Биол. мембр. 1990. Т.7. № 6, С.580-585.

3. A. Unguryte, I.M. Smirnova, A.A. Baykov, Kinetic models for the action of cytoeolic and mitochondrial pyrophosphatases of rat liver // Arch, Biochem. Biophys. 1989. V.273. N.2. P. 292-300.

4. A.A. Baykov, S.E. Volk, A. Unguryte. Inhibition of inorganic pyrophosphatase of animal mitochondria by calcium // Arch, Biochera. Diophys. 1989. V.273. N.2. P.287-291.

5. A. A. Baykov, A. Unguryte, E.B. Dubnova, I.N. Smirnova, V.N. Kasho. Comparison of the structure and catalytic properties of the cytosolic and mitochondrial pyrophosphatases of mammalian cells // International symposium "Molecular organization of biological structures". Abstract book. 1989. Moscow, P.1-2,