Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Множественные формы тиаминтрифосфатазы в почках быка

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Множественные формы тиаминтрифосфатазы в почках быка"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ИНСТИТУТ БИОХИМИИ»

I

I УДК 577.152.3

Руснна Ирина Михайловна

МНОЖЕСТВЕННЫЕ ФОРМЫ ТИАМИНТРИФОСФАТАЗЫ В ПОЧКАХ

БЫКА

03.00.04 -Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Гродно 2004

Работа выполнена в лаборатории энзимологии ГНУ «Институт биохимии HAH Беларуси»

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Макарчиков А.Ф.

ГНУ «Институт биохимии HAH Беларуси», лаборатория энзимологии

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Горбач З.В. ГВУУ «Гродненский государственный аграрный университет», кафедра общей химии

кандидат биологических наук,

доцент Киселевский Ю.В.

ГВУУ «Гродненский государственный

медицинский университет»,

кафедра реаниматологии и анестезиологии

с курсом клинической биохимии

Оппонирующая организация: ГВВУ «Белорусский государственный

медицинский университет», кафедра биохимии

Защита состоится « » июня 2004 года, в /Г** часов, на заседании совета по защите диссертаций (Д 01.30.01) при Институте Биохимии HAH Беларуси по адресу: 230017 г. Гродно, бульвар Ленинского комсомола, 50, тел. 33-32-11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Институт биохимии HAH Беларуси».

Автореферат разослан « /4 .» tU&Zi% 2004г.

Ученый секретарь

Совета по защите диссертаций, Ли

кандидат биологических наук П.С. Пронысо

2004-4 11294

i 6ШЬЬ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертапии. Функциональные нарушения тиамин-зависимых процессов в организме человека в наиболее яркой форме проявляются в виде расстройств нервной и кардиоваскулярной систем, приводят к развитию синдрома Вернике-Корсакова и, вероятно, служат одним из патогенетических факторов болезней Альзгеймера и Паркинсона (Gibson е.а., 2002). В связи с этим выяснение всех аспектов, касающихся биологической активности тиамина, имеет высокую социальную значимость и представляет собой актуальную проблему современной медико-биологической науки.

Наряду с ТДФ - кофактором мультиферментных комплексов окислительного декарбокс илирования а-кетокислот и транскетолазы - в тканях человека и животных присутствует ТТФ, функция которого в жизнедеятельности клетки неизвестна. Еще 5 лет назад возможная биологическая роль ТТФ рассматривалась исключительно исходя из представлений о специфической неко-ферментной функции тиамина в возбудимых тканях (Bettendorff, Wins, 1999). Однако в последнее время появляются все новые экспериментальные данные, которые не могут найти адекватной интерпретации в рамках этой гипотезы. Теперь уже не вызывает сомнений факт повсеместного распространения ТТФ в биологических объектах вне зависимости от их принадлежности к тем или иным таксономическим группам или индивидуальных особенностей организма (Makarchikov е.а., 2003). И это обстоятельство, предполагающее фундаментальную роль ТТФ в биологии клетки, диктует необходимость разработки новой концептуальной основы, которая могла бы послужить прочным фундаментом для дальнейших исследований. В экспериментах на бактериях и растениях установлено, что внутриклеточная концентрация ТТФ регулируется в ответ на внешние воздействия, такие как гипоксия или смена источника углерода, и это может указывать на существование функциональной связи ТТФ с адаптацией клетки к изменяющимся физиологическим условиям (Makarchikov е.а., 2003). В качестве первого шага к выяснению возможной роли ТТФ в молекулярных адаптационных механизмах представляется плодотворной гипотеза о его участии в регуляции и координации реакций энергетического обмена, протекающих в цитозоле и митохондриях клетки. В тканях млекопитающих концентра-

Припятые обозначения и сокращения: ТТФ - тиаминтрифосфат, ТДФ - тиамивдифос-фат, ТТФаза - тиаминтрифосфатаза, СДГ - сукпинатдегидрогеназа, ПДК - пирувагдекарбок-силаза, ЛДГ - лаггатдегвдрогеяаза, Г-6-Фаза - глюкозо-б-фосфахаза, ГДГ - глутаматдегид-рогеваза, СО - сульфитоксидаза, "ГХУ - трихлоруксусяая кислота, ПААГ - псшиакриламид-ный гель, - неорганический фосфат, ИЭФ - изоэлектрическое фокусирование, ЭР - эндо-плазматнческий репосулум, Кн - константа Михаэяиса, Кик - максимальная скорость реакции, *ог - каталитическая конспшта, у0 - начальная скорость реакции, [7] - концентрация ингибитора, р1 - нзоэлектрическая точка, Е, - энергия активации, т - молекулярная масса

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА СЛНтербург

ция ТТФ контролируется специфичной растворимой ТТФазой (КФ 3.6.1.28) (Makarchikov, Chernikevich, 1992; Lakaye е.а., 2002; Makarchikov е.а., 2002), активность которой максимальна при рН 8,9. Механизмы регуляции этого фермента неизвестны, однако анализ аминокислотной последовательности и опыты in vitro свидетельствуют о возможности его фосфорилирования (Lakaye et al., 2004). Исходя из сказанного, можно предположить, что в тканях млекопитающих присутствует множественные формы растворимой ТТФазы, наличие которых является отражением двух различных аспектов рассматриваемой проблемы - компартментализации метаболизма ТТФ и регуляции активности фермента фосфорилированием. В связи с этим пель настоящей работы заключалась в обнаружении, идентификации и характеристике физико-химических и кинетических свойств множественных форм растворимой ТТФазы в тканях млекопитающих.

В задачи исследования входило:

- модифицировать метод определения активности ТТФазы с целью его упрощения и повышения точности;

- выяснить распределение и локализацию ТТФазной активности в субклеточных фракциях из почек быка;

- идентифицировать фермент с ТТФазной активностью в митохондриях из тканей крысы и быка;

- выделить, очистить и охарактеризовать митохондриальную форму ТТФазы из почек быка, исследовать возможность транспорта фермента в митохондрии;

- выделить, очистить и охарактеризовать минорную форму растворимой ТТФазы из почек быка.

Объект н предмет исследования. Объектами исследования являлись почки и головной мозг быка (Bos taunts), почки, печень и головной мозг белых крыс (Rattus norvegicus). Предмет исследования - идентификация, физико-химические и кинетические свойства множественных форм специфичной растворимой ТТФазы.

Гипотез«. В тканях млекопитающих присутствуют множественные формы специфичной растворимой ТТФазы, что является отражением компар-тментализации метаболизма ТТФ в цитозояе и митохондриях и регуляции активности фермента фосфорилированием.

Методология и методы проведения исследований. Методологический подход заключался в выделении, фракционировании, очистке и исследовании изолированных субклеточных компонентов и макромолекул. В работе использовались методы стационарной ферментативной кинетики, дифференциальное центрифугирование, гель-фильтрация, ионообменная, гидрофобная и псевдоаффинная хроматография, ИЭФ, электрофорез в ПААГ, денситометрия, спек-трофотометрия, колориметрия.

Научная новизна и значимость. Впервые получены данные о субклеточном распределении ТТФазы в почках быка. Установлено сходство в рас-

пределении активности фермента в почках н головном мозге, предполагающее общность путей метаболизма и функций ТТФ в клепках и тканях различной специализации.

Впервые показано, что в митохондриях млекопитающих локализован фермент с ТТФазной активностью. Фермент частично очищен из почек быка и идентифицирован как митохондриальная форма ТТФазы.

В почках быка впервые обнаружена минорная форма растворимой ТТФазы. Исследования физико-химических и кинетических свойств частично очищенного фермента позволяют предполагать, что данная форма фермента является фосфорилированной цитозолыюй ТТФазой.

Полученные результаты, свидетельствующие о множественной компар-тментализации ТТФазы в клетке и возможности ее регуляции фосфорилирова-нием, имеют важное теоретическое значение для разработки новой концептуальной основы дальнейших исследований одного из фундаментальных аспектов витаминологии - некоферментной функции тиамина.

Практическая значимость. Усовершенствован метод определения активности ТТФазы по концентрации ТДФ, основанный на биоспецифическом связывании ТДФ как кофермента с апоПДК. Благодаря изменению способа остановки реакции снижена трудоемкость и повышена безопасность работы, увеличена точность и скорость проведения анализа. Предлагаемый метод может использоваться в клинических лабораториях с целью диагностики нарушений обмена физиологически активных форм тиамина, а также в учебных лабораторных практикумах студентов биологических, сельскохозяйственных и медицинских специальностей. По результатам работы получена приоритетная справка № а20010777 гос. патента РБ от 19.09.2001.

Оптимизировано выделение субклеточных фракций из почек быка методом дифференциального центрифугирования. Тщательный подбор режимов центробежного ускорения и времени центрифугирования позволил значительно снизить перекрестное загрязнение получаемых фракций. Данный метод может быть использован в учебных и исследовательских целях. Основные положения, выносимые на защиту:

1. При рН 8,9 ТТФазная активность регистрируется во всех субклеточных фракциях, выделенных та почек быка методом дифференциального центрифугирования. Активность ядерной, митохондриальной и микросо-мальной фракций обусловлена действием растворимого фермента.

2. В матриксе митохондрий клеток млекопитающих локализована специфичная ТТФаза, отличающаяся от цитозольного фермента физико-химическими и квиетическими свойствами.

3. Почки быка содержат минорную форму цитозольной ТТФазы, которая, вероятно, представляет собой фосфорилированяый фермент.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные исследования, статистическая обработка данных и аналитический обзор литературы осуществлены лично соискателем. Планирование исследований, обобщение и анализ получен-

ных результатов проведено с участием научного руководителя. В работе над усовершенствованием метода определения активности ТТФазы принимала участие н.с. лаборатории энзимологии ИБХ НАНБ Лучко Т.А.

Аиробадия результатов диссертации. Основные результаты исследований представлены на XXXVI, XXXVII, XXXVIII и XXXIX съездах Польского биохимического общества (Познань, 2000; Торум, 2001; Вроцлав, 2002; Гданьск, 2003); 4-ой международной научно-практической конференции «Наука-производству» (Гродно, 2001); 5-ой международной научно-практической конференции «Наука-производству» (Гродно, 2002); международной конференции «Биохимические аспекты жизнедеятельности биологических систем» (Гродно 2000), Республиканской научно-практической конференции «Хроматографические методы в химии, экологии и медицине» (Гродно, 2002); международной научно-практической конференции «Сельское хозяйство - проблемы и перспективы» (Гродно, 2003); Республиканской конференции молодых ученых «Молодежь в науке» (Минск, 2003); общеинститутских научных семинарах ИБХ НАНБ (2001,2003).

Связь Работы с крупными научными программами, темами. Работа выполнялась в рамках государственных программ фундаментальных исследований "Метаболизм" и "Регуляция и патогенез" по заданиям НИР "Молекулярные механизмы реализации биологических функций витаминов Bt и В2" (1998-2001гг.), гос. per. № 19982495 и "Структурно-функциональные исследования тиаминтрифосфатазы, нуклеозидтрифосфатазы и транскетолазы в тканях животных в норме и при нарушениях углеводного обмена" (2002-2005 it.), roc. per. № 20021190.

Опубликованность результатов. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из которых 9 рецензируемых статей (4 в журналах, 1 в сборнике и 4 в материалах конференций) и 5 тезисов докладов. Общее количество печатных страниц - 40, лично автору принадлежит 27,8 (69,5 %).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из оглавления, перечня сокращений и условных обозначений, общей характеристики работы, обзора литературы, главы материалы и методы, 5 глав собственных исследований, заключения и библиографического указателя, включающего 253 наименований. Работа изложена на 117 страницах компьютерного текста и иллюстрирована 5 таблицами и 35 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе использованы носители для хроматографии: сефакрил S-200, сефадексы G-10, G-75, G-200, ДЭАЭ А-25, ДЭАЭ А-50, сефароза CL-4B "Pharmacia", тойоперл HW-60, ДЭАЭ-тойоперл 650М "Toyo Soda Со"; химические реагенты фирм "Sigma", "Reanal", "Flub", "Serva", "Chemapol", "Loba", "PhannaciaBiotech", "Ferak", "Amersham" и "Реахим".

Субклеточные фракции выделяли методом дифференциального центри-

фугирования, контролируя степень перекрестного загрязнения по активностям маркерных ферментов - СДГ (КФ 1.3.99.1), ЛДГ (КФ 1.1.1.27), Г-6-Фазы (КФ 3.1.3.9), ГДГ (КФ 1.4.1.3), СО (КФ 1.8.3.1) (Орехович, 1977; Северин, Соловьева, 1989; Lionard е.а.,1965, MacLeod е.а., 1961) - и содержанию ДНК (До-сон с соавт., 1991). Очистку митохондрий из мозга проводили в ступенчатом градиенте плотности фиколл-маннитол (Clark, Nicklas, 1970).

Активность кислой фосфатазы измеряли по скорости гидролиза л-нит-рофенилфосфата, рассчитывая концентрацию я-нитрофенола по поглощению при 405 нм (Холод, Ермолаев, 1988).

Стандартная реакционная смесь для определения ТТФазной активности содержала 50 мМ трнс-HCl буфер, рН 8,9, 5 мМ MgCl2, 50 мкг БСА, 0,05 мМ ТТФ и образец белка в общем объеме 0,5 мл. Реакцию проводили при 37°С в течение 30 мин и останавливали, добавляя 2 мл 0,5 M Na-фосфатаного буфера, рН 6,8. Количество образующегося ТДФ регистрировали ферментативным методом. С этой целью отбирали аликвоту объемом 0,1 мл и добавляли к смеси, состоящей из 0,5 мл Н20, 0,1 мл 50 мМ MgCl2 и 0,1 мл апоПДК (0,5 - 1 ед). Рекомбинацию проводили 30 мин при 25°С и останавливали, внося 2 мл 0,15 M натрий-цитратного буфера, рН 5,9. Активность холоПДК измеряли в сопряженной с АДГ реакции по убыли поглощения NADH при 340 нм. За единицу активности (Ед) ТТФазы принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкмоль ТДФ за 1 мин в стандартных условиях испытания. Удельную активность выражали в Ед на 1 мг белка. Калибровочный график строили с известными количествами ТДФ-стандарта.

При исследовании субстратной специфичности ТТФазы использовались 1 мМ фосфатсодержащие соединения. Количество Р„ высвобождающегося за 60 мин инкубации при 37 "С, определяли по методу Sapru е.а., 1987.

ИЭФ осуществляли в трубках 5% ПААГ в градиенте рН 3-10. Для выявления локализации ТТФазы гели разрезали на сегменты по 1 мм, элюировали белок в течение 20 часов при 4°С, помещая каждый сегмент в 0,2 мл 20 мМ трис-HCÎ, рН 7,5 и измеряли ферментативную активность. Изоэлектрические точки рассчитывали по калибровочному графику.

Молекулярную массу определяли методами электрофореза в пластинках 10% ПААГ в присутствии ДСН в фосфатной буферной системе (Weber.Osbom, 1969) и гель-фильтрации на колонке с сефакрилом S-200 (0 2,2 х 46 см), сефа-дексом G-75 (0 2,5 х 36 см) и G-100 (0 1,5 х 37,5 см). Значения m и радиуса Стокса ТТФазы рассчитывали по калибровочным графикам.

Концентрацию белка определяли по связыванию с красителем кумасси бриллиантовым голубым G-250 (Bradford, 1976), по поглощению при 280 нм или 215 и 225 нм (Waddell, 1956)

Для статистической обработки данных использовался пакет статистического анализа и стандартной статистики S-Plus 2000 Рго. При графическом анализе, требующем построения прямых, рассчитывались уравнения линейной регрессии по методу наименьших квадратов с использованием программы Microsoft Excel 97. Анализ аминокислотной после-

довательности ТТФазы быка осуществлялся программами сервера ЕхРАБу (http:Wwww.expasy.ch).

Основные результаты н нх обсуждение Модификация метода определения активности ТТФазы.

Предложенный ранее метод определения активности ТТФазы, в основе которого лежит биоспецифическое связывание продукта реакции - ТДФ - с апо-формой пируватдекарбоксилазы, характеризуется высокой чувствительностью, точностью и воспроизводимостью (Чарткев1ч з саа^Тт., 1990). Однако его недостатками являются многостадийность и использование токсичных веществ (ТХУ, диэтиловый эфир) для остановки реакции и последующей обработки реакционной смеси. Мы нашли возможность значительно упростить данный метод благодаря изменению способа остановки реакции.

Активность ТТФазы ингибируется по смешанному типу вторым продуктом реакции - Р! (Рис. 1), при этом значения кинетических параметров составляют: = 46,4 мкМ и У°иакс = 2,0 мкмоль • л"1 • мин"1 (для исходной реакции), ЯГМ'= 48,6 мкМ; 61,3 мкМ и = 1,68 мкмоль • л"1 • мин'1; 0,56 мкмоль ■ л"1 ■ мин"1 (для [7] = 1 мМ и [7] = 10 мМ, соответственно). К,, рассчитанная по этим данным графическим методом в координатах А'„И'мак(/ЙГм<Умаю - [/] (Крупянко, 1990), равна 2,7 мМ.

Рис. 1. Зависимость начальной скорости реакции, катализируемой ТТФязой

из почек быка от концентрации субстрата в координатах Хейнса. 1 - в отсутствие ингибитора; 2 и 3 - в присутствии 1 мМ и 10 мМ Р|, соответственно

[ПФ], мЛ1

Исследование концентрационной зависимости показывает, что уже при [7] = 50 мМ скорость гидролиза ТТФ снижена на 75%, а при [7] = 500 мМ у0 = 0 (Рис.2). Представление экспериментальных данных в виде графика Диксона дает прямую линию (не показано), что характерно для полностью смешанного типа ингибирования. Используя известные соотношения (Келети, 1990) можно рассчитать, что для концентрации ТТФ 5 = К°и (50 мкМ) величина 7зо равна 3,2 мМ, а для насыщающей концентрации субстрата 5 = 107£°„ (500 мкМ) - 3,7 мМ, т. е. уже в присутствии столь низких концентраций ингибитора скорость реакции снижается наполовину. Следовательно, Рь концентрация которого находится в пределах 100 мМ или выше, может быть использован для остановки ТТФазной реакции.

Оптимальным является добавление к реакционной смеси 4-х

кратного объема 0,5 М Ка-фосфатного буфера, рН 6,8, так как при этом, достигается необходимое разведение образца, создается требуемая концентрация фосфата и рН в смеси для рекомбинации с апоПДК. Ход дальнейшего анализа описан в разд. "Материалы и методы исследования".

-г 3

2

5 0

Рис. 2. Влияние возрастающих концентраций Р; на начальную скорость реакции, катализируемой ТТФазой из почек быка (и = 3)

Без 0,05 0,5 5 50 [Фосфат], мМ

500

Остановка реакции фосфатным буфером позволяет избежать использования ТХУ и диэтилового эфира, сократить число манипуляций с 8 до 5 (проведение реакции — остановка реакции — рекомбинация - остановка рекомбинации - измерение активности ПДК) и повысить точность анализа до 2,1% (4 параллельных измерения) по сравнению с оригинальным методом.

Исследование распределения и природы ТТФазной активности в субклеточных фракциях из иочек быка. Использование стандартных схем дифференциального центрифугирования, разработанных для печени, скелетной мышцы, сердца и мозга (Северин, Соловьева, 1989), приводит к высокой степени взаимного загрязнения субклеточных фракций из почек быка. В связи с этим нами исследовано влияние величин центробежного ускорения (&) и продолжительности центрифугирования на седиментацию компонентов гомогената почек быка.

Образцы почек измельчали, пропускали через пресс с диаметром пор 1 мм и гомогенизировали в 4-х объемах охлажденной до 4° 0,25 М сахарозы на 10 мМ трис-НС1 буфере, рН 7,4, содержащем 0,5 мМ К+ЭДТА, в гомогенизаторе с тефлоновым пестиком десятью циклами при 600 об - мин"1. Гомогенат фильтровали через 4 слоя влажной марли и доводили до исходного объема перед центрифугированием. Оптимальный режим центрифугирования для получения субклеточных фракций, обогащенных ядрами, митохондриями и микросомами, представлен в таблице 1.

Таблица 1

Фракции веред ' Время, мин % ■ мин

Ядра 270 6 1620

Митохондрии 3000 20 60000

Микросомы 105000 60 6300000

Как показано на рис. 3, основное количество маркеров, за исключением Г-6-Фазы, обнаруживается в соответствующих компартментах: 77,7 % ДНК - в ядрах, 72,2% СДГ - в митохондриях и 93,3% ЛДГ - в цитозоле. Активность Г-6-Фазы - фермента ЭР клеток, осуществляющих глюкоеногенез (печень, почки, кишечник) распределена достаточно равномерно во фракциях субклеточных органелл.

120

100

1 80

§

1 60

40

20

0

А-1ДНК Б" ИСДГ

В-СЗЛДГ г- ШГ-6-Фаза А" ■ ТТФиза А

Рис. 3. Распределение ДНК, активностей маркерных ферментов и ТТФазы в субклеточных фракциях из почек быка: 1 - ядра, 2 митохондрии, 3 - микросомы, 4 - щггозоль (и = 3)

12 3 4

Субклеточные фикции

Высокая активность Г-6-Фазы в ядерной и митохондриальной фракциях, вероятно, обусловлена двумя причинами. Известно, что ядерная оболочка образует единую с ЭР сеть (НорЫп, 1978); кроме того, препараты ядер, выделяемые дифференциальным центрифугированием, всегда содержат клеточные обломки и крупные фрагменты мембран, образующиеся в результате разрушения клетки. Вторая причина состоит в загрязнении лизосомами, которые имеют сходную с митохондриями плотность в растворе сахарозы (Финдлей, Эванз, 1990). В связи с этим необходимо отметить, что по сравнению с другими тканями почки характеризуются гораздо более высокой активностью лизосомаль-ной кислой фосфатазы, субстратом которой является и Г-6-Ф (Диксон, Уэбб, 1982). Очевидно, что заметные количества ДНК (11,1%) и СДГ (6,4%) в цито-зольной фракции являются следствием частичного разрушения ядер и митохондрий при гомогенизации ткани.

Исследование локализации ТТФазы показало, что при рН 8,9 84,9% активности сосредоточено в цитозоле, 8,9% - в митохондриях, 4,7% - в ядрах и 1,4% - в микросомах (рис. 3). Таким образом, субклеточное распределение ТТФазной активности в почках быка практически идентично ее распределению в головном мозге (Макарчыкау з саауг., 1993). Полученные экспериментальные данные хорошо согласуются с прогнозом, основанным на анализе аминокислотной последовательности ТТФазы быка программой "Та^еф 1.0", в соответствии с которым возможность локализации фермента в цитозоле составляет 87,8, митохондриях - 10,3, других органеллах - 0,65.

Для выяснения вопроса о том, определяется ли ТТФазная активность субклеточных частиц мембранно-связанным или растворимым ферментом, осадки суспендировали в 20 мМ трис-НС1 буфере, рН 7,5, содержащем ОД мМ ЭДТА, разрушали замораживанием-оттаиванием и разделяли на мембранную и растворимую фракции, центрифугируя в течение 60 мин при 105000g. Как следует из данных, представленных на рис. 4, в супернатантах количество ТТФазной активности в 2,5 - 9,5 раз выше по сравнению с мембранами.

1ЛЛ □мембраны

Рис. 4. Распределение ТТФазной активности между мембранами и растворимым содержимым

субклеточных частиц: 1 - ядра, 2 -митохондрии, 3 - микросомы (я =3)

Можно полагать, что растворимая активность микросомальной и ядерной фракций является результатом присутствующих в них цитозольных загрязнений, поскольку для обеих фракций характерно практически одинаковое процентное содержание растворимой ТТФазы и ЛДГ. Однако в митохондриальной фракции процентное содержание растворимой ТТФазной активности более чем в два раза превышает содержание ЛДГ, что указывает на присутствие в этих ор-ганеллах конститутивной ТТФазы.

Выявленные закономерности внутриклеточного распределения ТТФазной активности в почках быка предполагают фундаментальное сходство процессов обмена ТТФ в возбудимых и невозбудимых тканях. С другой стороны, наличие в митохондриях растворимого фермента с ТТФазной активностью может свидетельствовать о существовании в клетке пространственно обособленных функционально активных пулов ТТФ - митохондриального и цитозольного.

Идентификация белка с ТТФазной активностью в митохондриях млекопитающих. Для выяснения локализации растворимого белка, катализирующего гидролиз ТТФ, митохондрии из мозга крысы, почек и мозга быка, суспендированные в изотонической среде, инкубировали 60 мин при 4°С в присутствии различных концентраций тритона Х-100 (Lai, Cooper, 1986) с последующим определением активности в стандартной реакционной смеси, содержащей 0,25М сахарозу. Как показано на рис.5, во всех трех случаях наблюдался резкий всплеск ТТФазной активности при концентрации детергента 0,030,05%, что соответствует разрыву субстратного барьера, воздвигаемого внутренней митохондриальной мембраной. При этом активность латентной лизосо-

мальной кислой фосфатазы возрастала до максимального значения уже при концентрации тритона Х-100 0,001%, тогда как для ГДГ и ТТФазы формы кривых полностью совпадали (рис. 5А). Полученнные результаты позволяют говорить о локализации растворимого фермента с ТТФазной активностью в матрик-се митохондрий. Дополнительный всплеск активности, наблюдаемый в препарате из почек быка (рис. 5Б) в области очень низких концентраций детергента, вероятно, связан со степенью чистоты препарата, поскольку для исследования использовалась грубая фракция, в то время как митохондрии из мозга подвергались дополнительной очистке.

-4 -3 -2 -1 0 [Тритон Х-100]

-4 -3 -2 -1 0 Ье [тритон Х-100]

-4 -3 -2 -1 0 [тритон Х-100]

Рис. 5. Зависимость ТТФазной активности в суспензиях митохондрий из мозга крысы (А), почек быка (Б) и мозга быка (В) от концентрации тритона Х-100Д - ГДГ, о ТТФаза, ■ - кислая фосфатаза, ▲ - интактные митохондрии; п- 2

Так как наружная мембрана легко проницаема для молекул с т < 10 кДа (Альберте с соавт., 1994) высокий базовый фон ТТФазной активности может объясняться действием мембранно-связанных фосфатаз, активные центры которых локализованы на наружной поверхности митохондрий либо экспонированы в межмембранное пространство. Кроме того, возможно, что ТТФаза присутствует в обоих митохондриальных компартментах, о чем свидетельствуют эксперименты с митохондриями из печени крысы (рис. 6).

Рис. 6. Активность ферментов-маркеров и ТТФазы в межмембранном пространстве (1) и матриксе (2) митохондфий печени крысы (и = 3). Для получения субфракций митохондрий субфракции использован метод гипоосмотиче-ского шока (Северин, Соловьева, 1989)

100 [ Б-всо ^ 80 1 Ь-ШТМ*»

1

2

Кинетические исследования покачали, что ферменты из митохондриаль-ной и цитозольной фракций почек быка достоверно различаются (р < 0,05) по кажущемуся сродству к субстрату, при этом значения рассчитанные для графиков в координатах Хейнса, равны соответственно 33,8 ± 3,1 мкМ и 45,1 ± 1,6 мкМ (и = 3). Однако по данным гель-фильтрации т митоховдриального белка составляет 27,7 кДа, что соответствует т цитозольной ТТФазы (Makarchikov, 2001). Следовательно, белок с ТТФазной активностью, локализованный в митохондриях почек быка, представляет собой митохондриальную -форму ТТФазы. К аналогичному выводу приводят результаты, полученные при изучении свойств ТТФаз митохондриальной и цитозольной фракций печени крысы (не представлены).

Выделение, очистка н свойства ТТФазы из митохондрий дочек быка. Поскольку фракции субклеточных частиц, выделяемые дифференциальным центрифугированием, всегда содержат цитозодьные примеси, для изучения свойств митохондриальной ТТФазы нами разработан метод очистки фермента.

Все операции по очистке ТТФазы проводились при 4°С в 20 мМ трис-НС1 буфере, рН 7,5, содержащем 0,2 мМ ЭДТА и 50 мМ NaCl. Митохондрии, выделенные из 400 г почек, разрушали замораживанием-оттаиванием и удаляли мембраны центрифугированием (105000g, 60 мин). Белки экстракта осаждали сульфатом аммония (27-50% S), хроматографировали на колонке с сефадексом G-200 (0 2,8 х 66,5 см) и наносили на колонку с ДЭАЭ сефадексом А-50 (0 2,8 х 15 см). Элюцию белка осуществляли линейным повышающимся градиентом NaCl от 50 мМ до 450 мМ (по 200 мл в каждой камере). На данном этапе ТТФазная активность разделялась на два практически эквивалентных пика (рис. 7). На рис. 8 представлены результаты экспериментов по определению Км и pl, позволившие идентифицировать фермент второго пика как цитозольную ТТФазу (К* = 46,6 мкМ, pl = 5,16 ± 0,01 (я=2)). Значения ДГМ и pl ТТФазы первого пика составляли соответственно 25,5 мкМ и 5,26 ± 0,01 (и=2).

'S

X

■а

Рис. 7. Хроматография ТТФазы из митохондрий почек быка на колонке с сефадексом ДЭАЭ А-50; • концентрация белка, о - ферментативная активность

Фракции

300 [ А 1 8 7

1 200 4 2 *& 6

100 5 4

*—/1 1 1 3

-60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 [ТГФ], мхМ

0 2 4 6 8 Расстояние от анода, см

Рис. 8. А. Определение Кш ТТФаз первого (7) и второго (2) пиков, полученных при хроматографии на колонке с сефадексом ДЭАЭ А-50. Б. Определение pl: 1 -метиловый красный, 2 - ферритин, 3 - второй пик после сефадекса ДЭАЭ А-50, 4 -первый пик после сефадекса ДЭАЭ А-50,5 — гемоглобин, б - миоглобин

Для дальнейшей очистки фракции первого пика объединяли, добавляли (NH^SOí до 27%S и пропускали через колонку с фенилсефарозой (0 1 х 4,5 см), уравновешенной буферным раствором, содержащим 27%S (NH^SO^ Затем колонку последовательно промывали 20 объемами буфера без (ЬЩ^БОд и линейным градиентом глицерина от 0 до 40% (по 50 мл в каждой камере). ТТФазу элюировали 15 мл буфера с 40% глицерином. Удельная активность очищенного фермента составила 3,93 Ед ' мг"1, что в 2532 раза выше по сравнению с экстрактом из митохондрий (табл. 2).

Таблица 2

Очистка ТТФазы из митохондриальной фракции почек быка

Фракция Объем, Общий Общая Удельная Степень

мл белок, активность, активность, очистки,

мг мЕд мЕд • мг1 раз

Экстракт 173,0 2456,6 3814,7 1,55 -

Высаливание 27-50%S 16,0 510,7 2288,0 4,5 2,9

Сефадекс G-200 107,0 214,0 2198,9 10,3 6,6

Сефадекс ДЭАЭ А-50 26,5 8,48 368,4 43,4 28,0

Фенилсефароза 6,0 0,012 47,1 3925,0 2532,3

По данным гель-фильтрации значения т и радиуса Стокса фермента равны соответственно 27,9 кДа и 2,42 нм. Митохондриальная ТТФаза проявляет максимальную активность при рН 8,9 и абсолютную зависимость от ионов при этом форма зависимости начальной скорости реакции от общей концентрации ионов металла описывается сигмоидной кривой со значением 5Ь.5=

2,6 мМ. К„ очищенного фермента митохондрий, рассчитанная по уравнениям линейной регрессии для прямых в координатах Хейнса, составляет 21,2 ± 2,9 мкМ (л=3), что в 2 раза ниже по сравнению с Ки ТТФазы цитозоля. Митохондриальный фермент не обладал активностью по отношению к АТФ, п-нитрофенилфосфату, ТМФ и ТДФ, что свидетельствует о его строгой субстратной специфичности. Очевидно, что более высокое значение Кы ТТФазы (33,8 ± 3,1 мкМ), полученное для экстракта митохондрий, обусловлено присутствием в нем двух ферментов, действующих на один и тот же субстрат (Диксон, Уэбб, 1982).

Исследование транспорта ТТФазы в митохондрии. Эксперименты по обработке цитозольной ТТФазы из почек быка 8 М мочевиной показали, что удаление или снижение концентрации денатурирующего агента приводит к быстрому спонтанному рефолдингу активного белка. Это дает возможность судить об импорте ТТФазы по изменениям ферментативной активности в митохондриях до и после инкубации с денатурированным цитотольным ферментом.

Транспортная смесь (ЬЫЬага, МШага, 1998) объемом 1 мл включала 0,25 М сахарозу, 1 мМ АТФ, 20 мМ сукцинат, 5 мМ МАБН, 1 мг БСА, 0,05 мл ми-тохондриальной суспензии (0,7 мг белка) и образец ТТФазы (10 мкг фермента, очищен в 3507 раз) По завершении инкубации (25°С, 30 мин) смесь быстро охлаждали, помещая пробирки в измельченный лед, митохондрии отделяли центрифугированием (10000g, 15 мин, 4°С) и дважды промывали охлажденным до 4°С 0,25 М раствором сахарозы на 10 мМ трис-НС1 буфере, рН 7,5. Контрольные пробы не содержали препарата ТТФазы. Промытые осадки суспендировали в 0,05 мл сахарозного буфера и по 3 контрольных и опытных пробы замораживали-оттаивали для разрушения митохондрий. Осадки отделяли центрифугированием, ТТФазную активность в супернатантах определяли в стандартных условиях.

Как следует из данных, представленных на рис. 9, разность активности в надосадочной жидкости опытных разрушенных и неразрушенных митохондрий на 22,3% выше по сравнению с разностью, наблюдаемой для контрольных препаратов, что свидетельствует о возрастании количества фермента внутри митохондрий при их инкубации с денатурированной ТГФазой. Таким образом, фермент может транспортироваться из цитозоля в митохондрии.

3 V

2 1,5 1

0,5 0

Рис. 9. Прирост ТТФазной активности в супернатанте разрушенных контрольных (транспорта» смесь без ТТФазы) и опытных (транспортная смесь с ТТФазоВ) митохондрий из почек быка

Контроль Опыт

Выделение, очистка и идентификация минорной Формы цитозольной ТТФазы из почек быка. Анализ аминокислотной последовательности ТТФазы с использованием программы PROSITE свидетельствует о присутствии в структуре белка потенциальных сайтов для фосфорилирования протеин киназой С и казеинкиназой 2. Недавно было продемонстрировано, что казеинкиназа 2 (но не протеинкиназа С) способна фосфорилировать рекомбинантную ТТФазу человека in vitro (T.akaye е.а., 2004). Предполагая, что регуляция фосфорилированием действительно имеет место в организме, можно ожидать, что в экстрактах тканей существует несколько форм фермента, различающихся по кинетическим и физико-химическим свойствам. В связи с этим нами исследовалось наличие модифицированных форм ТТФазы в почках быка.

Очистку ТТФазы осуществляли по описанному ранее методу (Makarchikov, 2001), уделяя особое внимание анализу фракций, элюируемых за основным пиком активности в процессе ионообменной хроматографии. Как показано на рис. 10, при хроматографии на ДЭАЭ-тойоперле 650М действительно обнаруживается небольшой пик ТТФазной активности, который следует за основным пиком, содержащим цитозольную ТТФазу, и вымывается из колонки при концентрации NaCl 101-115 мМ.

Рис. 10. Хроматография ТТФазы на колонке с ДЭАЭ-тойоперлом 650М.: • -концентрация белка, о - ТТФазная активность

0

60

20 40 Фракции

Заключительный этап очистки ферментов минорного и основного пиков осуществляли методом псевдоаффинной хроматографии на колонке (0 0,8 х 7 см) с голубой сефарозой (МакагсЫкоу, 2001). Полученные препараты имели удельную активность 6,3 мхмоль • мин*1 • мг"1 и 164,6 мкмоль • мин"1 • мг'1, соответственно. Результаты очистки суммированы в таблице 3.

При электрофорезе цитозольной ТТФазы выявлена одна белковая полоса, соответствующая т 26 кДа; препарат фермента минорного пика содержал 4 полосы (т = 20,1; 26,0 (площадь пика 21%); 62,0; 73,3 кДа) (Рис. 11).

В таблице 3 представлены результаты сравнительного исследования физико-химических и кинетических свойств очищенных препаратов, позволившие идентифицировать минорный фермент как модифицированную форму ий-

тозолыгой ТТФазы, поскольку оба белка неотличимы по от и рН-оптимуму, однако, характеризуются различными значениями Км р1, и Ел.

Таблица 3

Очистка основной и минорной форм тиаминтрифосфатазы из почек быка

Фракция

Объем, мл

Общий белок, мг

Общая активность, Ед

Удельная активность, Ед • мг'1

Очистка, раз

Экстракт Тойоперл HW-60 Сефадекс G-75 ДЭАЭ-тойоперл 650М пик 1 пик 2

Голубая сефароза пик 1 пик 2

2985 39849

76 65

22,2 14,6

ИЗО 81,1

1,95 2,50

7,0 0,063 3 0,0054

170,55 72,66 62,45

29,26 0,95

1037 0,034

4,28 х 1<Г 6,43 х 10'2 0,77

15,01 0,38

164,6 6,3

15,0 179,9

3507 88,8

38457,9 1472,0

1 2 3

Рис. 11. Электрофорез в 10% ПААГ препаратов ТТФазы из почек быка после очистки на колонке с голубой сефарозой: 1 - стандарты, 2 - белок основного пика, 3 - белок минорного пика

Таблица 4

Физико-химические и кинетические свойства очищенных препаратов цито-

Фермент т, кДа1' pH- PI Ки, мкМ А*м, с кДж-

оптимум моль"1

Пик 1 29 8,9 5,16±0,01 46,1+03 135Д±5,1 78,1±3,8

Пик 2 29 8,9 4,96±0,01 64,9±1,5 28,7±3,9 90,7±3,2

1)

определена методом гель-фильтрации

Из анализа аминокислотной последовательности ТТФазы следует, что акцепторами фосфата в реакции фосформирования казеинкиназой 2 могут выступать остатки Ser и Ihr в позициях 33, 37 и 59 полипептидной цепи, т. е. весьма вероятно, что молекула фермента содержит от одного до трех фосфо-ршшруемых сайтов. Исходя из этого, можно рассчитать теоретические pl не-модифицированной и фосфорилированных форм фермента и сравнить их с экс-

периментальными значениями. Использование программы

PRIMARY SRTUCTURE ANALYSIS показало, что теоретическая pi ТТФазы равна 5,15, тогда как нейтрализация двух положительных зарядов на молекуле белка в результате ф ос формирования одного сайта должна приводить к снижению pi до 4,95. Эти величины хорошо согласуются с полученными нами экспериментальными данными и позволяют сделать заключение о том, что ТТФаза минорного пика представляет собой фосфорилированную по одному аминокислотному остатку форму фермента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспериментальные данные, представленные в настоящей диссертации, свидетельствуют о присутствии в тканях млекопитающих множественных форм специфичной растворимой ТТФазы. Это явление, вероятно, обусловлено двумя причинами: компаргментализацией метаболизма ТТФ в митохондриях и цитозоле и существованием механизма регуляции активности фермента фосфо-рилированием. Основные результаты работы можно сформулировать в виде следующих выводов:

1. Эффект ингибирования ТТФазы продуктом реакции - Pi - использован для усовершенствования метода определения активности фермента, что позволяет значительно упростить процедуру, повысить точность и скорость проведения анализа [1,2,3,4].

2. При рН 8,9 активность ТТФазы выявляется во всех субклеточных фракциях, выделенных из почек быка методом дифференциального центрифугирования, при этом 84,9% активности локализовано в цитозоле, 4,7% - в ядрах, 8,9% - в митохондриях и 1,4% - в микросомах. Наблюдаемая картина соответствует распределению активности фермента в головном мозге, что предполагает общность путей метаболизма и функций ТТФ в возбудимых и невозбудимых тканях [1].

3. В митохондриях млекопитающих локализован конститутивный растворимый фермент с ТТФазной активностью, который идентифицирован как одна из множественных форм ТТФазы. Это указывает на существование в клетке двух пространственно обособленных функционально активных пулов ТТФ -митохондриального и цитозольного [2,7,11].

4. Митохондриальная ТТФаза, впервые очищенная из почек быка в 2532 раза, имеет т 27,9 кДа, радиус Стокса 2,42 нм, pi 5,26 ± 0,01, проявляет максимальную активность при рН 8,5-8,9 и абсолютно зависима от ионов Mg2+. Фермент характеризуется строгой субстратной специфичностью; для ТТФ составляет 21,2 ± 2,9 мкМ [4,6, 8,12,14].

5. В почках быка обнаружена и очищена в 1472 раза минорная форма цито-зольной ТТФазы, отличающаяся изоэлектрической точкой, каталитическими и термодинамическими свойствами. Существование этой формы может являться результатом регуляторной ковалентной модификации фермента фос-форилированием [3, 5,9,10,13].

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в отечественных и зарубежных журналах, рецензируемых сборниках научных работ

1. Русина И.М., Макарчиков А.Ф. Активность тиаминтрифосфатазы в субклеточных фракциях почек быка // Весщ HAH Беларусь Сер. б1ял. навук. - 2002. -№ 1.-С. 115-117.

2. Русина И.М., Макарчиков А.Ф. Тиаминтрифосфатазная активность в митохондриях млекопитающих // Укр. биохим. журнал. - 2003. - Т. 75, № 5. - С. 63-«8.

3. Макарчиков А.Ф., Русина И.М. Выделение, очистка, физико-химические и кинетические свойства модифицированной формы тиаминтрифосфатазы из почек быка // Весщ HAH Беларусь Сер. мед.-б1ял. навук. - 2003. - № 4 . - С. 7679.

4. Русина И.М., Макарчиков А.Ф. Физико-химические и кинетические свойства митохондриальной тиаминтрифосфатазы из почек быка // Новости медико-биологических наук. - 2004. - № 1. - С. 104-108.

5. Макарчиков А.Ф., Русина И.М. Идентификация изофермента тиаминтрифосфатазы в почках быка. // Биохимические аспекты жизнедеятельности биологических систем: Сб. науч. тр./ Под. ред. Л.И. Нефедова. - Гродно: ГрГУ, 2000. -С. 191-195.

Статьи, опубликованные в рецензируемых материалах республиканских н международных конференций

6. Русина И.М. Выделение, очистка и свойства тиаминтрифосфатазы из митохондрий почек быка // Материалы 4-ой международной научно-практической конференции «Наука-производству» / Сб. ст. науч.-прак. конф. - Гродно, 2001. -С. 368-371.

7. Русина ИМ. Исследование локализации и свойств фермента с ТТФазной активностью в митохондриях печени крыс // Материалы 5-ой международной научно-практической конференции «Наука-производству» / Сб. ст. науч.-прак. конф. - Гродно, 2002. - С. 268-269.

8. Русина И.М., Макарчиков А.Ф. Совокупность хроматографических методов при очистке белка с тиаминтрифосфатазной активностью из митохондрий почек быка // Применение хроматографических методов в химии, экологии и медицине: Материалы Республиканской науч.-практ. конф., посвященной 50-летию использования газо-жидкостной хроматографии, Гродно, 2002 / Под ред. А.Л. Перцовского и др. - Минск: Издательский центр БГУ, 2002. - С. 130-133.

9. Русина И.М., Макарчиков А.Ф. Регуляция активности тиаминтрифосфатазы из почек быка фосфорилированием // Материалы международной научно-практической конференции «Сельское хозяйство - проблемы и перспективы» / Сб. науч. трудов- Гродно, 2003. - Т. 1 - ч.2. - С. 286-288.

Тезисы докладов в материалах международных н республиканских конференций

10. Makarchikov A., Rusina I. The existence of thiamine triphosphatase isoenzymes in bovine kidney // XXXVI Zjazd Polskiego Towarzystwa Biochemicz. - Poznan, 2000.-P. 96

11. Rusina I., Makarchikov A. Properties of tiamine triphospatase from bovine brain and kidney mitochondrial // XXXYII Zjazd Polskiego Towarzystwa Biochemicznego. - Torum, 2001. - P. 307.

12. Rusina I., Makarchikov A.. Purification of thiamine triphosphatase isoenzyme from bovine kidney mitochondria // XXXVIII Zjazd Polskiego Towarzystwa Biochemicz. - Wroclaw, 2002. - P. 306-307.

13. Rusina I., Makarchikov A. The properties of modified from of cytosolic thiamine triphosphatese from bovine kidney // XXIX Zjazd Polskiego Towarzystwa Biochemicz. - Gdansk, 2003. - P. 325-326.

14. Русина И.М. Исследование транспорта тиаминтрифосфатазы в митохондрии почек быка // Молодежь в науке: Сб. трудов молодых ученых НАН Беларуси. -Минск: Право и экономика, 2003. - Т.2 - С. 131.

РЭЗЮМЭ Русша 1рына МЬсайлауна

Множныя формы тыямш трыфасфатазы у нырках быка

Ключавыя словы: тыям1нтрыфасфатаза (ТТФаза), субклетачная лака-Л1зацыя, М1тахондры1, фасфарышраванне, множныя формы.

Аб'екты даследванняу: нырю \ галауны мозг быка, печань 1 галаУны мозг белых пацукоу.

Прадмет даследвання: лакал!зацыя, ф1зпса-х1м!чныя 1 кшетычныя свойства множных форм спецыф1чнай растварымай ТТФазы.

Метады даследвання: цэнтрыфуправанне (дыферэнцыяльнае I У прыступ-кавым градыенце шчыльнасщ), гель-фшьтрацыя, ¡енаабменная, пдрафобная, псеудаафинная храматаграф^я, ¡заэлектрафакуйраванне, элеюрафарэз у по-Л1акрьшам1дным геле, дэнсггаметрыя, метады стацыянарнай юнэтыи, спектра-фотаметрыя, каларыметрыя.

Мэта даследвання: выяуленне, ¡дэнтыфжацыя 1 характарыстыка множных форм растварымай ТТФазы у тканях млекакармячых.

Атрыманыя выниа 1 ¡х навЬна: мадыф^цыраван метад вызначэння ак-тыунасщ ТТФазы, што дазваляе пазбегнуць ужывання такичных рэагентау, па-выЫць экспрэснасць 1 дакладнасць аяал1за. Распрацавана схема ды-ференцыяльнага цэнтрыфуправання для атрымання субклетачных фракций з нырак быка; упершаню наказана, што размеркаванне спецыф1чнай ТТФазы у субклетачных фракциях з нырак аналапчна размеркаванню фермента У галау-ным мазгу, гэта дапускае агульнасць шляхоу метабашзма 1 футсцьй ТТФ ва уз-будл1вых 1 неузбудлхвых тканях. Устаноулены факт прысутнасщ у мггахоядры-ях млекакармячых формы растварымай ТТФазы, што указвае на ¡снаванне у клетках дзвюх прасторава адасобленных, функцыянальна актыуных пулау ТТФ - М1тахандрыяльнага 1 цытазольнага; метахандрыяльная ТТФаза ачышчана у 2532 раза з нырак быка, ахарактарызаваны яе ф1зша-х1м1чныя 1 юнетычныя асабл!васщ.. У нырках быка выявлена 1 ачышчана у 1472 разы мшорная форма ТТФазы, якая адрозшваецца ад цытазольнага фермента ¡заэлеетрычнай крон-кай, кшетычньпш 1 тэрмадынам^чным! асабл!васцям1, минорны фермент щэнцыфщыраваны як фасфарьшраванная форма ТТФазы, ¿снаванне якой, маг-чыма, з'яуляецца сведчаннем рэгулягорнай, кавалентнай мадыфпсацыяй бялка.

Рэкамендадьи па выкарыстанню: удасканалены метад вызначэння ТТФазнай актыунасщ 1 схема вылучэння субклетачных фракцый з нырак быка дыферанцыялькым цэнтрыфуправаннем могуць быць скарыстаны у даследчых 1 навучальных мэтах - навукова-даследчых 1 лабараторных практикумах для студэнтаУ б1ялапчных, медыцынсюх 1 сельскагаспадарчых спецыяльнасцяу.

Галша выкарыстання: б1ялопя, медыцына.

РЕЗЮМЕ Русина Ирина Михайловна Множественные формы тиаминтрифосфатазы в почках быка

Ключевые слова: тиаминтрифосфатаза (ТТФаза), субклеточная локализация, митохондрии, фосфорилирование, множественные формы.

Объект исследования: почки и головной мозг быка (Bos taurus), печень и головной мозга белых крыс (Rattus norvegicus).

Предмет исследования: локализация, физико-химические и кинетические свойства множественных форм специфичной растворимой ТТФазы.

Цель работы: обнаружение, идентифицикация и характеристика множественных форм растворимой ТТФазы в тканях млекопитающих.

Методы исследования: центрифугирование (дифференциальное и в ступенчатом градиенте плотности), гель-фильтрация, ионообменная, гидрофобная и псевдоаффинная хроматография, изоэлектрофокусирование, электрофорез в полиакриламидном геле, денситометрия, методы стационарной ферментативной кинетики, спектрофотометрия, колориметрия.

Полученные результаты и их новизна: модифицирован метод определения активности ТТФазы, что позволяет избежать применения токсичных реагентов, повысить экспрессность и точность анализа. Разработана схема дифференциального центрифугирования для получения субклеточных фракций из почек быка; впервые показано, что распределение специфичной ТТФазы в субклеточных фракциях из почек аналогично распределению фермента в головном мозге; это предполагает общность путей метаболизма и функций ТТФ в возбудимых и невозбудимых тканях. Установлен факт присутствия в митохондриях млекопитающих формы растворимой ТТФазы, что указывает на существование в клетке двух пространственно обособленных функционально активных пулов ТТФ - митохоядриального и цигозольного; митохондриальная ТТФаза очищена в 2S32 раза из почек быка, охарактеризованы ее физико-химические и кинетические свойства. В почках быка обнаружена и очищена в 1472 раза минорная форма ТТФазы, которая отличается от цигозольного фермента изоэлектриче-ской точкой, кинетическими и термодинамическими свойствами; минорный фермент идентифицирован как фосфорилированная форма ТТФазы, существование которой, вероятно, является следствием регуляторной ковалентной модификации белка.

Рекомендации к применению: усовершенствованный метод определения ТТФазной активности и схема выделения субклеточных фракций из почек быка дифференциальным центрифугированием могут быть использованы в исследовательских и учебных целях - научно-исследовательских лабораториях и практикумах для студентов биологических, медицинских и сельскохозяйственных специальностей.

Область применения: биология, медицина.

SUMMARY

Rusina Irina Mikhaylovna

Multiple forms of thiamine triphosphatase in bovine kidney

Key words: thiamine triphosphatase (ThTPase), subcellular localization, mitochondria, phosphorylation, multiple forms.

The object of research: kidney and brain of the bull (Bos taurus), liver and brain of the rat (.Rattus norvegicus).

The subject of research: localization, physico-chemical and kinetic properties of multiple forms of specific soluble ThTPase.

The purpose of the work: to reveal, identify and characterize multiple forms of ThTPase in mammalian tissues

The methods of investigation: centrifugation (differential and in stepped density gradient), gel filtration, ion-exchanged chromatography, hydrophobic chromatography, pseudoaffinity chromatography, isoelectrofocusing, polyacrylamide gel electrophoresis, densitometry, methods of steady state kinetics, spectrophotometry, col-orimetry.

Results and their novelty: the method of ThTPase determination has been modified to escape the using of toxic reagents, to raise quickness and accuracy of analysis. The scheme for isolation of subcellular fractions from bovine kidney by differential centrifugation has been developed and subcellular distribution of specific ThTPase in bovine kidney has been shown for the first time to be identical with the brain. This may imply common metabolic pathways and functions of ThTP in excitable and non-excitable tissues. It has been shown that mitochondrial form of ThTPase is present in mammalian tissues implying the existence of two spatially separated functional pools of ThTP - mitochondrial and cytosolic. Mitochondrial ThTPase has been purified 2532-fold from bovine kidney, and physico-chemical as well as kinetic properties of the enzyme have been characterized. A minor form of specific ThTPase has been revealed and purified 1472-fold from bovine kidney; this form differs from cytosolic enzyme in isoelectric point, kinetic and thermodynamic properties. The minor enzyme has been identified as ThTPase phosphorylated form, which seems to be a result of its regulatory covalent modification.

The degree of use: both the improved method of ThTPase determination and the scheme of subcellular fraction isolation from bovine kidney can be used in scientific laboratories and practical training for students of biological, medical and agricultural specialities.

Fields of use: biology, medicine.

Подписано в печать 10.05.2004. Формат 60x84/16. Бумага Офсетная №1. Печать Офсетная. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,10. Тираж 100 экз. Заказ 84.

Отпечатано на технике издательского отдела Учреждения образования «Гродненский государственный университет имени Янки Куп алы». ЛП № 111 от 29.12.2002. Ул. Пушкина, 39.230012, Гродно

i.

b

РНБ Русский фонд

2004-4 11294