Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Развитие клеточных механизмов действия АДГ в постнатальном онтогенезе почки млекопитающих

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Развитие клеточных механизмов действия АДГ в постнатальном онтогенезе почки млекопитающих"

рг6 од

о м.\й ДО

"российская академия медицинских наук

сибирское отделение институт физиологии

на правах рукописи удк 612.433:612.017:615.5-002.5

с о л е н о в евгений иванович

развитие клеточных механизмов действия адг в остнатальном онтогенезе почки млекопитающих

03.00.13 - физиология человека и животных

Диссертация в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Новосибирск - 1994

Работа выполнена в Институте цитологии п генетики СО РАН Новосибирск

Научный консультант: д.м.н., ч л. корр. РАН, профессор Иванова Л.Н.

Официальные оппоненты: д.б.н., в.н.с. Дыгало H.H. д.м.н., профессор Велпканова JI.K. д.х.н., чл.корр. АТН РФ Загребельный С.Н.

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. U.M. Сечено РАН

Защита состоится на заседании специал

зированного совета Д 001.14.01 в Институте физиологии СО РАМ 630117, Новосибпрск-117, ул. академика Тимакова, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ф зиологип СО РАМН

Диссертация в форме научного доклада разосла! _ 1994 года

Ученый секретарь специализированного совета к. б-п. Елисеева А.]

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

В структуре физиологических механизмов, осуществляющих гормональную регуляцию, можно выделить несколько уровней организации: молекулярный, клеточный, органный, организменный, в некоторых случаях можно говорить о популяционном уровне, когда имеют место взаимодействия между особями опосредованные гормонами. Не затрагивая проблемы исследования высших форм организации гормональных систем, надо отметить, что в основе любого эндокринного механизма лежит способность ткани-мишени специфически воспринимать гормональный сигнал и отвечать на него специфической реакцией, г е понятие гормональной компетентности. Проблема изучения механизмов, обусловливающих гормональную компетентность, в настоящее время переживает период интенсивного развития. Значительный прогресс достигнут в изучении механизмов гормональной регуляции всех основных жизненных функций млекопитающих и человека, особенно если речь идет о сформировавшемся - дефинитивном организме. Специального внимания заслуживают исследования развития механизмов гормональной компетентности в онтогенезе. Формирующаяся ткань-мишень не инертна по отношению к гормональным сигналам. Известно, что для развития гормональной компетентности многих тканей необходимо присутствие гормонов, регулирующих функцию этих тканей в дефинитивном состоянии (Valente et.al. 1983, Saez et.al. 1984, Parker 1991, Celsi et.al. 1993). Механизмы взаимодействия развивающейся ткани-мишени с гормоном, который вначале может выступать в качестве фактора управляющего процессами морфогенеза, а в дальнейшем как регулятор функции дифференцированной ткани, в настоящее время значительно менее исследованы по сравнению с механизмами гормональной регуляции дифференцированных тканей взрослого организма. Естественно, что многообразие путей развития механизмов транедукции гормонального сигнала в различных тканях и недостаток современных знаний о процессах дифференцировки тканей-мишеней не позволяют составить общее представление о взаимодействии гормона с тканью-мишенью на протяжении онтогенеза, особенно в период диффереггщровки. В этой связи представляется перспективным исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе созревания физиологической реакции клеток ткани-мишени на гормон.

Наиболее адекватным объектом для развития исследований подобного направления является почка млекопитающих, морфологическое п функциональное становление которой завершается после рождения к моменту перехода от материнского вскармливания на самостоятельное питание в так называемый период вининга. Низкая концентрирующая способность почек новорожденных обусловлена незрелостью структур концентрирующего механизма, низким концентрационным градиентом натрия и мочевины в мозговой зоне почки и ареактивно-стью клеток эпителия дистального сегмента нефрона и собирательных трубок по отношению к гормону непрогипофиоа вазопресспну (антпдиуретпческому гормону, АДГ), оснвному регулятору транспорта воды в почке (Гннешшский 1963, Фпнкинштейн и др. 1965, Stanier 1972, Длоуга н др. 1981, Horster к. Zink 1982, Наточин и др. 1983, Bastin et.al. 1990).

Известно, что физиологический ответ на АДГ у млекопитающих может быть зарегистрирован только по завершении перода вининга (Aperia к Hcrin 1975, Speller к Moffat 1974, Длоуга п др. 1981). Именно в этом возрасте в изолированных сегментах собирательных трубок обнаруживается резкое увеличение осмотической проницаемости под влиянием вазопрессина (Horster 1985, Siga fc Horster 1991). Очевидно, что в основе появления функционального ответа на АДГ на уровне целого органа и канальцевого эпителия лежит формирование внутриклеточных механизмов, обуславливающих транедукцню гор',¿опального сигнала от рецептора на базолатеральной мембране до структур апикальной мембраны, изменение состояния которых и обуславливает увеличение проницаемости для потока воды. Однако, если у взрослых животных клеточные механизмы регуляции АДГ достаточно хорошо изучены (Scorecki et.al. 1992), то данные о формировании гормональной компетентности почки в онтогенезе крайне немногочислен!»! и нередко противоречивы.

В этой связи целью настоящего исследования явилось изучение онтогенетических изменений в клеточных механизмах, обуславливающих реакцию почки на АДГ(вазопрессин).

Задачи исследования

1. Исследовать возрастные изменения специфического связывания вазопрессина мембранными рецепторами во внутренней зоне мозгового вещества почки лабораторных крыс и мышей, выявить изменения в моле,\\ .тарной структуре рецептора вазопрессина.

2. Изучать возрастные изменения системы функционального сопряжения специфических рецепторов ваоопрессина с АДГ-зависимой аденилатцпклаоой, представленой мембранными С-белками, поскольку незрелость механизмов сопряжения может быть причиной отсутствия реакции на гормон.

3. Исследовать возрастные изменения функциональной активности и изозимного состава цитозольных сАМР-зависимых протеин-кинаа (сАК), которые являются основными внутриклеточными рецепторами сАМР и обеспечивают внутриклеточную трансдук-цию сигнала ваоопрессина.

4. Для оценки роли глюкокортпкоидов в регуляции развития концентрирующей функции почек, исследовать влияние ранних воздействий физиологических концентраций глюхокортпкоидов на развитие функции осмотического концентрирования почки и некоторые звенья внутриклеточного механизма, реализующего эффект вазопресспна.

Научная новизна и практическая ценность работы

Новыми результатами проведенного исследования являются данные об изменениях ключевых звеньев клеточного механизма транс-дукции сигнала вазопресспна в почке, осуществляемого через рецепторы У2 в период становления гормональной компетентности почечного эпителия у лабораторных животных (крыс и мышей). Этот механизм составляет молекулярно-клеточную основу гормональной компетентности почки в целом, и его развитие в онтогенезе завершает функциональное созревание почки. Впервые показано полп-субьединпчное строение специфического рецептора вазопресспна в зрелой почке и установлено, что в период становления гормональной компетентности почечного эпителия по отношению к вазопрес-спну происходит формирование его полисубьедпничной структуры из мономеров рецептора, присутствующих в плазматической мембране незрелого эпителия. Показано, что с возрастом существенно возрастает способность вазопресспна повышать СТРаоную активность стимулирущих гуанпдин-связывающих белков (С8-белков) мембран почечного эпителия, что дает основание говорить о появлении функционального сопряжения мембранного рецептора с последующими звеньями механизма транедукцип сигнала. Впервые установлено, что цитозольные рецепторы сАМР, являющиеся регуляторнымп субьецинпцами сАМР-завпсимых протепнкиназ, могут присутство-

вать в виде димеров и при этом сАМР-зависимые протеинкиназы 2-го типа, более характерные для почки взрослых животных, способны в большей степени диссоциировать в присутствии сАМР по сравнению с ферментом 1-го типа, представлевым главным образом в незрелой почке. Установлено, что в условиях длительной стимуляции концентрирующей функции почки, возникающей в результате водной депривацни, происходит дополнительная индукция сАМР-зависимых протеинкиназ преимущественно 1-го типа, что в определенной мере, может обусловить снижение чувствительности к гормону. Обнаружено, что в раннем постнатальном периоде в надпочечниках крыс до 20% глюкокортшсоидов представлены гидрокортизоном. Результаты исследования влияния гидрокортизона как наиболее эффективного глюкокортикоидного гормона способного модифицировать формирование многих функций, показали, что однократное повышение содержания гидрокортизона в плазме крови, не превышающего уровень характерный для стресса, приводит к стойким последствиям, выражающимся в снижении темпов развития концен-трпрующей функции почки и ее реакции на вазопрессин, при этом гидрокортизон существенно поменяет возрастную динамику активности сАМР-зависимых протеинкиназ в медуллярной части почки.

Т.о. наше исследование показало, что в период созревания концентрирующей функции почки, в клетке-мишени происходит ряд существенных изменений в ключевых звеньях молекулярного механизма трансдукции сигнала АДГ, которые, в значительной мере определяют становление гормональной компетентности почки. Этот результат следует учитывать при гормональной терапии.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на 8-м Совещании по эволюционной физиологии, (Ленинград, 1982), 14-м Съезде физиологов СССР, (Баку 1983), 16-й конференции ФЕБО. (Москва 1984), симпозиуме СССР-ГДР, Проблемы современной биохимии и биотехнологии., (Рига 1985), 7-й Всесоюзной конференции по физиологии почек (Чернигов 1985), 15-м Съезде Всесоюзного физиологического общества им.Павлова (Кишинев 1987), 8-й Всесоюзной конференции по физиологии почек (Харьков 1989), на 7-м Симпозиуме по фармакологии развития (ГДР 1989), на европейских коллоквиумах по почечной физиологии - 4-м (Прага 1982), 5-м (Франкфурт на Манне 1985), С-м

(Варна 1988), 7-м (Неаполь 1992).

Обьем и структура работы

Диссертация изложена в форме научного доклада. Материалы диссертации получены самостоятельно и в совместной работе с М.Н.Зелениной (глава 3 "Развитие внутриклеточных механизмов рецепции сАМР") и И.И.Хегаем (глава 4 "Ггсюкокортикоиды как факторы модификации онтогенеза почки"), которым автор выражает глубокую благодарность. Особую признательность автор выражает чл.-корр. РАН, профессору Л.Н.Ивановой за постоянное внимание, консультации и критику.

Результаты и обсуждение

1) Исследование структурно-функциональных характеристик рецептора ваоопресслва в развивающейся почке.

В настоящее время специфические рецепторы (в дальнейшем просто рецепторы) вазопресспна (VP) описаны в таких органах и тканях, как печень (Georgoussi et.al. 1991), почка (Dublineau et.al. 1989,1990), клетки макрофагального происхождения, тромбоциты и гладкомышечные клетки сосудистой стенки (Lutz et.al. 1987, Ammar et.al. 1992). Есть указания на присутствие этих рецепторов в тимусе, семенниках (Lee et.al 1976, Chase and Рауле 1983). Естественно, можно ожидать, что распространенность рецепторов VP в организме значительно шире приведенного списка,при этом набор функций, регулируемых VP через своп рецелториый механизм, по-видимому, также весьма широк. Принято разделять рецепторы VP на два принципиально различных типа ~ V] и V2. Это разделение производится на основании регулируемой функции и особенностей молекулярно-клеточного механизма трансдукции сигнала гормона.

Рецепторы Vi (в дальнейшем просто Vi) распространены в организме весьма широко, их обнаруживают практически во всех тканях: в гладких мышцах сосудистой стенки (Lutz et.al. 1987), тромбоцитах (Doyle, Ruegg 1985), клетках Лепдига, сперматидах и гепатоцитах (Georgoussi et.al 1990), кроме того существуют непрямые указания на существование этих рецепторов в клетках эпителия собирательных трубок почки (Friedlander, Amiel 1987, Gaisser et.al 1989), в последнее время их удалось выявить непосредственно с помощью специфических синтетических агонистов (Ammar et.al. 1992) Рецепторы типа V2 (в дальнейшем просто V2) опосредуют антидиуретический эффект и обнаружены исключительно в почке (Morel, Doucet 1986). Ген ре-

цептора Уг в настоящее время картирован в X хромосоме человека и частично клонирован (НгаШш е^а1. 1993). С точки зрения функциональной ролл рецепторов, существенное значение имеют внутриклеточные механизмы трансдукции сигнала вазопрессина. Рецепторы вазопрессина обоих типов являются мембранными образованиями и сопряжены, согласно современным представлениям с двумя различными системами внутриклеточных вторичных посредников: V] с системой Са+2 и (1,4,5)инооитолтрнфосфата; Уг с системой циклической АМР. Это, по-видимому, относится и к эпителию нефрона, т.к. в нем показано наличие обоих типов рецепторов, однако, концентрация рецепторов 1-го типа мала по сравнению с рецепторами Уг (Са^ог ес.а!. 1989, Аштаг е1;.а1. 1992). Т.о. величины специфического связывания, полученные в препаратах мембран сосочка н внутренней медуллярной части почки определяются рецепторами типа Уз- В наших экспериментах по исследованию функциональных характеристик рецепторов УР мы использовали самцов крыс Вистар в возрасте 14 - 15 дней, когда отсутствует реакция на вазопрессин п 60-дневных взрослых животных. Часть экспериментов выполнена на мышах линии СБА в возрасте 10-11 дней и 60 дней, п мышах с наследственным нефрогенным диабетом (N01) в возрасте 1 год с умеренным проявлением мутации.Результаты исследования специфического связывания методом конкурентного вытеснения показали возрастание концентрации специфических рецептороп п некоторую тенденцию к возрастанию аффинности, т.е. константы сродства, рецепторов УР в почке в период становления фукциональноп компетентности этого органа (Табл. 1).

Таблица 1. Возрастные изменения характеристик рецепторов АУР в почке крыс

Возраст 14 дней СО дней уровень

доверительности

Концентрация

специфических 1.12 ±0.28

рецепторов (б)

АУР (ГшЫ/шв)

2.81 ± 0.53

(6)

р< 0.05

Константа

аффинности (8.48 ± 2.2) - 10" (1.04 ± 0.26) • 10: рецепторов (6) (3)

АУР (Л/-')_

(3)

|10

н.д.

В скобках укапано количество определений.

c.p.m

a -'-b

Рисунок 1. Хроматография рецепторов вазоцрессина и комплексов вазопрессик-рецептор, солюбилпзпрованных из препаратов мембран сосочка п внутренней медуллярной части почки крыс Wistar в возрасте 14 дней. Типичные профили пз 5 экспериментов. Специфическое связывание 3H-AVP. Условия хроматографии. Колонка: К16/40, Scphacryl S-300. Буфер: ТЕ, 2 тМ /3-меркаптоэтанол, 0.1 mM PMSF Скорость: 6 мл/час, обьем фракции 1.0 мл Образец: 2 мг белка в 200 мкл

а) - рецептор, не связанный с вазопрессином; Ь) - комплекс вазопрессин-рецептор. Оси: абсцисс - N фракции; ординат - радиоактивность фракции (c.p.m.). Маркеры MW: DB - голубой декстран (2,000 kDa), Ov.alb. - яичный альбумин (45 kDa).

Эти результаты согласуются с известными данными о возрастании активности VP-зависимой адевияатциклазы в период вининга (Imbert-Teboul efc.al. 1984).

Для оценки размера рецепторов в состоянии наиболее адекватном нативному, производили гель-хроматографию рецепторов, со-любилизированных из мембран сосочка и внутренней медуллы почек крыс, и комплексов рецепторов с вазопрессином, полученных инкубацией в присутствии меченого тритием вазопрессина (рис. 1,2). В таких условиях был получен молекулярный размер комплекса около 500 kDa, что указывает на полисубьединичное строение рецепторов V2. Это предположение подтверждается также хроматографией со-любилпзированного рецептора в отсутствие вазопрессина. В этом случае положение пика рецептора на хроматографическом профиле определяли по величине специфического связывания во фракциях. Результаты хроматографии указывают на молекулярный размер связывающей молекулы около 45 kDa, что, по-видимому, представляет собой субьединицу рецептора.

Размеры комплексов рецепторов с вазопрессином оказались одинаковы в препаратах зрелой и незрелой почки. Однако, хроматогра-фпческие профили рецепторов несвязанных с гормоном отличаются: в препаратах незрелой почкп рецептор представлен главным образом отдельными субьединицами с размером ок. 45 kDa, т.е. можно думать, что в незрелой почке рецептор еще не существует в виде полисубьедпничного комплекса, а процесс полимеризации рецептора связан с созреванием механизма чувствительностп почки к вазо-прессину. Полученные в наших экспериментах данные о размерах зрелого рецептора и его субьедпниц позволяют предположить, что зрелый рецептор должен состоять в среднем из 10 субьедпниц. Наше заключение о субьедпнпчном строении рецепторов V2 подтверждаются данными Fahrenholz с соавторами (1985), которые, используя фотоаффинную методику и диссоциирующий PAAGE, определили молекулярный вес субьедпнпцы в 30 kDa. Сделанный в последнее время рсстрпкционный анализ амплпфицированного гена рецептора \Г2 крысы и человека дает расчетную величину рецептора хорошо совпадающую как с биохимическими данными полученными в нашей группе, так и с приводимыми в литературе (Birnbaunior et.al. 1992, Lobait et.al. 1992). Другим результатом наших исследовании комплексов рецептор-вазопрессин было то, что мы показали способность вазопрессина вызывать образование агрегатов рецепторных субьедпниц, что, на наш взгляд, можно рассматривать как начальную стадию формирования зрелого полимерного рецептора.

c.p.m.

Рисунок 2. Хроматография рецепторов вазопрессина и комплексов вазопрессин-реиептор, солюбипиоированных из препаратов мембран сосочка и внутренней медуллярной части почки крыс Wistar в возрасте 60 дней. Условия хроматографии и обозначения те же, что и на рисунке 1.

Иная картина была обнаружена при сопоставлении хроматогра-фических характеристик рецепторов V2 из почек мышей с наследственным несахарным диабетом (NDI). Причиной полиурии у этих мышей является нечувствительность почки к вазопрессину. Природа этой резистентности в настоящее время до конца не ясна, однако, авторы этого стока мышей, обнаружившие мутацию NDI, показали, что мутация существенно не затрагивает такие ферменты, участвующие в транедукции сигнала вазопрессина в почке, как аденилатцл-клаза и фосфодиэстераза (Jackson et.al 1974). В более поздней работе эти авторы показали, что мутация NDI снижает чувствительность АДГ-оависимой аденилатциклазы и повышает активность фосфоди-эстеразы (Jackson et.al. 1980). В наших экспериментах мы

3000 2600 2000 1600 1000 600 0

с.р.т.

л

*

I \

I \

I

I

I

V

-ь

1

\ I

4 7 10 13| 16 19 22 26 28 31 34

0В

#

Ov.aU>. -Ь

Рисунок 3. Хроматография комплексов вазопрессин-рсцоптор, <о-любилизированных из препаратов мембран сосочка и внутренней медуллярной части почки мышей СБА в возрасте 10 дней. Специфическое связывание 3Н-АУР. Условия хроматографии п обозначения те же, что и на рисунке 1. Типичный профиль из С экспериментов. а) - профиль специфического связывания. Ъ) - область кооперативного связывания. Оси: абсцисс - N фракции; ординат радиоактивность фракции (с.рлп.)

определяли величину специфического связывания и молекулярный размер солюбилнзпрованных рецепторов УР из почек мышей N01 п СВА. В этом исследовании было показано, что рецепторы мышей N01 существенно отличаются от рецепторов нормальных животных как по уровню специфического связывания так, по-видимому, и по споен молекулярной организации. В отлично от рецепторов нормального животного (Рис. 4). образующих острый пик на профиле хроматографии. рецепторы мышеи XI)I ныходилц широким

с.р.т. хЮОО

Рисунок 4. Хроматография комплексов ваоопрессин-рецептор, со-любилизированных из препаратов мембран сосочка и внутренней медуллярной части почки мышей СВА в возрасте 60 дней. Условия хроматографии и обозначения те же, что и на рисунке 1. Типичный профиль из 5 экспериментов.

плосковерншнным пиком (Рис. 5), что указывает на присутствие множества неоднородных по размеру связывающих молекул. Кроме того в этих же препаратах наблюдали сильное положительное кооперативное связывание вазопрессина, проявляющееся в том, что "холодный", т.е. нерадиоактивный гормон вызывал повышение связывания меченого. Это отразилось на хроматографических профилях специфического связывания, где область кооперативного связывания представлена выделенным пиком.

В этой области связывание меченого вазопрессина существенно увеличивалось в присутствии "холодного" гормона. Средняя величина таких комплексов, природа которых остается неясной, по нашим

с.р.ш. Х1000

а

Рисунок 5. Хроматография комплексов ваоопресспн-рецептор, солю-билпопрованных па препаратов мембран сосочка п внутренней медуллярной части почки мышей N01 в возрасте 1 год. Условия хроматографии и обозначения те же, что п на рисунке 1. Типичный профиль из 5 экспериментов.

опенкам составляет около 50 кБа. У нормальных животных дпшга СВА кооператпвность связывания выражена только в препаратах рецепторов пз незрелой почкп молодых мышеи этой линии и очень слабо у зрелых особей, когда в большинстве экспериментов этот эффект не проявляется совсем. Природа этого эффекта у мышей N01 неясна и с определенной осторожностью можно предположить, что в данном случае сказывается мутационное изменение гена рецептора, являющееся по мнению авторов причиной нефрогенного диабета (Каина с1.а1. 1993). Возможно также, что какие-то компоненты мембраны, тесно связанные с рецептором, изменяют его функционирование. Известно, что рецепторы У2 находятся в тесной связи с плазматиче-

скоп мембраной и существует взаимозависимость функционального состояния рецептора и жидкокристаллической структуры плазматической мембраны (Giocondi et.al. 1990).

Функционирование рецептора вазопрессииа в почке мышей NDI может быть нарушено в результате действия нескольких факторов, прежде всего это мутационное нарушение первичной структуры п при этом, возможно нарушение его взаимодействия с непосредственным окружением в мембране, что в свою очередь может отразиться на функциональном цикле рецептора в клетке и таким образом вызвать снижение чувствительности почки к вазопрессину.

Одним из ярких признаков развития гормональной компетентности ткани-мишенп являются характерные изменения клеточных гормональных рецепторов. Это хорошо видно из данных по возрастной динамике специфического связывания агонистов /3-адренорецепторов (Перцева 1982). При этом обращает па себя внимание то, что изменения рецепторов могут быть как количественные, так могут сопровождаться и структурно - функциональными изменениями . В тех случаях когда происходит увеличение количества рецепторов, обусловленное увеличением клеточной массы и соответственно поверхностью плазматической мембраны, можно думать, что в этом случае нет интенсивного процесса дифференцировки и соответственно возможность гормонального влияния не ход развития минимальна. В данном случае если у ткани нет выраженной гормон- зависимой функции, можно говорить о восприимчивости к фоновым гормональным воздействиям, которые необходимы для нормальной жизнедеятельности клеток. В этом случае гормон не выступает в роли регулятора специфической функции, и говорить о гормональной компетентности такой ткани, по-видимому, не следует. Что касается термина гормональная компетентность, то вероятно его следует применять в отношении гормональной регуляции функции специализированной ткани. Исследование таких тканей, приуроченное к периодам, когда процессы дифференцировки наиболее интенсивны, может способствовать пониманию путей развития механизмов гормональной регуляции. Ориентируясь на характер возрастной динамики концентрации гормона и параметров его репторов, можно с определенной вероятностью выявить моменты особого взаимодействия гормона с тканью-мишенью. При этом в тех случаях когда это исследовалось, авторы обнаруживали особую эффективность гормональных воздействий на процесс дифференцировки ткани (Denenberg 19G4, Науменко

,и др. 1979). Можно думать, что значительные изменения параметров рецепции связаны с критическими периодами развития ткани-мишени и, возможного участием гормона в регуляции формообразовательных процессов. Существующие данные о влиянии гормональных воздействий на развитие функциональных систем указывают на повышенную чувствительность процессов развития к гормональным воздействиям в критические периоды. Например, в развивающейся печени отмечается монотонный рост специфического связывания таких гормонов как гормон роста, пролактин, инсулин (Wittmaack et.al. 1983) Можно думать, что роль этих гормонов заключается в стимуляции наращивания массы печени и ее ферментных систем. Подобное поведение рецепторов инсулина отмечено и при компенсаторной гипертрофии почек (Polichronacos et.al. 1985). Монотонный характер изменения рецепторных параметров характерен для инсулина и гормона роста во многих растущих тканях и это отражает их хорошо известную функцию стимуляции роста тканей в организме (Wanireddy 1984). В эти процессы вовлечены н белки связывающие металлы, в частности цинк и медь, часто выступающие как кофакторы ферментов и рецепторов (Brady 1981). Наиболее характерно монотонное возрастание активности в онтогенезе для такого фермента как аденплатциклаза, который является наиболее универсальным звеном в механизме транедукцип вазопрессина в ночке и многих гормонов, имеющих рецепторы организованные по типу р-адренорецептора (Moliinder 1979). Если попытаться охарактеризовать общую направленость процессов, происходящих при созревании рецепторов AVP в почке, то можно сказать, что самым заметным событием, происходящим в период становления функциональной компетентности, является возникновение надмолекулярной структуры рецептора, что выражается в образовании полпеубьедпничного комплекса, включающего порядка 10 рецепторных субьединиц. Следует также отметить возможное участие вазопрессина в процессе образования такого комплекса, поскольку в условиях in vitro присутствие вазпресснна вызывало агрегацию рецептора.

2) ГУанндин-связывающне белки мембран почки сопряженные с рецепторами V2.

Столь же существенным для возникновения rojmoHa.ibHou компетентности клеток-мишеней эпителия почечных канальцев, как и развитие собственно специфических рецепторов гормона, является фор-

мпрование системы сопряжения мембранного рецептора и гормон-зависимой аденлатциклазы. Согласно современным представлениям, эта система представлена семейством т.н. больших гуанидин- связывающих белков (G-белков) (Levitzki 1988). Эти белки представляют собой гетеротримерные голоферменты состоящие из трех субьеди-ниц обозначаемых a,ß и 7. Все виды ферментной активности G-белка определяются иооформой а-субьединицы, в то время как ß и 7 значительно более консервативны и всегда в физиологических условиях присутствуют в виде димера /З7 в комплексе пли отдельно от соответствующей а-субьедпнпцы. В зависимости от эффекта воздействия на аденилатцшслазу а-субьединицы разделяют на стимулирующие (а,) или ингибирующпе (а,). Представление о функциональном цикле и некоторых свойствах наиболее изученных больших G-белков, можно получить из схемы приводимой в обзоре Gilman (1990). Не вдаваясь в детали функционирования этих белков, которые изложены во многих работах (Doyle, Ruegg 1985; Kinter efc.al. 1988, Matsuoka et.al. 1993), следует отметить, что в процессе онтогненеза эта система, по-видимому, существенно изменяется. О характере изменений G-системы можно судить по результатам исследований на культурах клеток кардиомиоцигов, где по мере роста возрастает количество G,~ белков, судя по ADP- рибозилироваяию коклюшным токсином (Allen et.al. 1988).

Схема функционального цикла большого G-белка (Gilman 1990).

GQ-GD E —»GGDP —♦ HR• G • GDP Pi IT HR

У 1 E ßy r

H20 i \ H+R

Ga • GTP • E* <— G„ ■ GTP — HR • G • GTP

H - гормон; R - рецептор; G - G-белок; E - эффектор.

/ \

GTP

GDP

Таблица 2. Полиморфизм в семействе больших С-белков, некоторые свойства их субъединиц, (по вНтаи 1990).

субъединица мояехугаркыи раомер фунщяя

G.„(X4) MW 44.5 -н 46 kDa ахтнвацш адевипатцихлаоы,

Ca+2 каналов, субстраты Cholera toxin

G,o(x3) MW 44.7 слабое ннгибирование аденилатцихлазы

jS(x4) MW 37.4 ßf взаимодействие а-субъединицы с

рецептором

7(хЗ?) MW 8 10 инахтиваци« Ga

Goa MW 39.9

субстраты Pertussis toxin

MW 40.9

В схобгах угадано количество изомеров.

в, - стимулирующие адениЛатцихлаэу в-белш; С.-икгибирующие

Та же тенденция была обнаружена в культуре клеток надпочечников где с 4-го по 7-й день роста происходило 40-кратнос возрастание относительного содержания С,-белков по отношению к в.,-белкам (Ве5еоЬ е1.а1. 1988). Однако в процессе развития могут, по-видимому, происходить изменения и собственно а-субъедпниц С-белков. У эмбрионов мышей была обнаружена форма а^-субъединнцы большего молекулярного размера по сравнению с таким белком взрослого организма, но она обладала меньшой способностью активировать аде-нилатцпклаоу (Шив е1.а1. 1991).

В ходе своего функционального цикла С-белкп, участвующие в реакциях сопряжения, проявляют такие виды функциональной активности как специфическое связывание СТР и его гидролиз. Поскольку функционирование системы С-белков необходимо для транедукшш гормонального сигнала, в настоящей работе мы исследовали эти свойства экспериментально, в тех же возрастных группах, что и рецепторы. Это позволило составить представление о том как изменяется в процессе функционального становления сопрягающей системы С-белков, ее основная функциональная характеристика способность повышать СТР-апную активность в препарате мембран сосочка почки, содержащем специфические рецепторы.вазопрессина. в присутствии эТого гормона. Результаты определения СТР гидролизной активности препаратов мембран выявили ее .высокий назальный уровень е высокой специфичностью по .отношению к СТР (К,„ 1 .'.'¿О.З-НГ'1 М

ié

То, что ваоопресслн вызывает в препаратах мембран медуллярной части почки взрослых животных достоверное повышение СТРаоной активности в пределах 28 -г 50% (Табл. 3) указывает на наличие функциональной связи между в-белками и рецептором вазопрессп-на. В таблице приведены результаты различных экспериментов по определению реактивности препаратов мембран медуллярной части почки взрослых мышей СБА и N01 по отношению к вазопрессину, видно, что положительный прирост активности имеет место только у взрослых мышей СВА. В препаратах незрелой почки эффекта ва-зопрессина не наблюдали (данные не приводятся). Предварительное воздействие на мышей холерным токсином привело к значительному снижению базальной вТР гидролазнон активности С-белков и потере реакции на вазопресспн. Такое глубокое подавление гидролазной активности, по-видимому, связано с тем, что в основной массе С-белки представлены С,-формой, т.к. они являются субстратом холерного токсина.

Таблица 3. ГТФ-азная активность препаратов мембран медуллярной части почки мышей СВА (60 дней) и N01 (1 год) (ршо1 Р,/тт//^) (М ± т).

ыышя эгсле- активность прирост юнстанта

римент в отсутствие активности Р Михаэляса -

АДГ в присутствие Ментен

2 мхмоль АДГ (М)

СВА 1 9.3±0.8 2.4±0.7 (6) 0.05 (1.2±0.3)'10~ь(4)

2 4.3±1.3 1.2±0.4 (6) 0.05

3 2.2±0.5 1.2±0.4 (б) 0.05

4* 0.15±0.05 0.1±0.04 (12) -

NDI 1 8.6±0.8 0.9±0.9 (6) - 0.73±0.2-10~ь(4)

2 9.1±2.0 -1.0±1.5 (6) -

3 4.3±1.2 -1.7±1.9 (б) -

4* 0.11±0.05 0.29±0.06 (12) 0.05

( ) в еюблах ужаоано холичество определений

*) воздействие хоперпым тогсином

Другой показатель активности G-белков - специфическое связывание GTP - по сути, находится в реципрокных отношениях с ферментной активностью, что видно и из результатов наших экспериментов (Рис. 6). На рисунке представлен радиоавтограф нативно-го PAAG электрофореза комплексов 32Р — -y-GTP с G-белками, со-любилизированных из мембран сосочка и внутренней медуллы почки. Хорошо видно, что в препаратах незрелой почки и обработан-

1Э

ных холерным токсином, концентрация комплексов значительно выше чем в препаратах нормальной зрелой почки. Столь высокое специфическое связывание GTP, по-видимому, осуществляется особыми ювенильными формами G-белков у которых отсутствует пли очень низкая GTP гидролазная активность. Можно думать, что недостаток гидролазной активности и обуславливает функциональную некомпетентность G-белков в незрелой и обработанной холерным токсином почке, поскольку становится невозможным нормальный функциональный цикл G-белка , В то же время, причины низкой ферментной активности G-белков в незрелой почке, по-видимому, иные, чем ADP-рибооилирование в результате обработки холерным токсином. Наиболее вероятной причиной изменения свойств системы G-белков мембран в онтогенезе представляется смена состава пзоформ этих белков. Действительно, в литературе описано существование в эмбриональных тканях пзоформы а-субъедпницы Gs-белка, которая отсутствует в тканях взрослого организма (Begin-Heic 1990, Ruis et.al. 1991).

123456789 10

Рисунок 6. PAAG электрофорез комплексов Л1Р — 7—GTP и гуанидин-связывающих белков, солюбилизированных из препаратов мембран сосочка и внутренней медуллярной части почки мышей. На дорожках 1,3,5,7,9 комплексы образовывались в присутствии 10 пМ Z2P - 7-GTP ; на дорожках 2,4,6,8,10 добавляли 10 цМ "холодного" GTP. Содержание белка в пробе на дорожках: 1,2) 40 /ig белка. СВА 60 дней; 3,4) 4.0 fig белка. СВА 10 дней; 5,6) 4.0 ßg белка. NDI 1 год; 7,8) 4.0 ¡ig белка. СВА 60 дней + Cholera toxin; 9,10) 4.0 ßg белка. NDI 1 год -f Cholera toxin.

»

-*- Огай. ИаС1

Рисунок 7. Хроматография комплексов 3Н-СТР и гуанидпн-связывающпх белков, солюбилизированных из препаратов мембран сосочка и внутренней медуллярной части почки мышей СВА в возрасте 10 дней.

Типичный профиль специфического связывания из 4 экспериментов.

Условия хроматографии.

Колонка: 2/60-Милихром, Мопо-(3

Буфер: ТЕ, 2 шМ /3-меркаптоэтанол, 0.1 тМ РМБР

Скорость: 100 мкл/мин, обьем фракции 50 мкл

Образец: 0.5-^1.0 мг белка в 2000 мкл

Градиент: 0.0 0.3 М ИаС1

Оси: абсцисс - N фракции; ординат - радиоактивность фракции (с.р.т.)

В нашем исследовании определенным подтверждением предположения о смене изоформ С-бслков, могут служить результаты НРЬС солюбилпзированных в-белков из препаратов мембран медуллярной части почки и сосочка (Рис. 7,8). Из представленных типичных про-

филей видно, что картина мажорных пиков значительно изменяется в период созревания почки: на профиле препарата незрелой почки присутствует единственный мажорный пик, в зрелом органе этот пик менее выражен, но становится мажорным пик в области элюцпи буфером с меньшей концентрацией хлорида натрия. Отсутствие в зрелой почке G-белха с хроматографическими свойствами, соответствующими наиболее массовому G-белку развивающейся почки, на наш взгляд, может служить свидетельством в пользу предположения об исчезновении изоформы этого белка, характерной для почки в период развития.

Резюмируя эту часть исследований, можно заключить, что функциональное созревание системы G-белков мембран, как звена сопряжения рецепторов вааопрессина с аденилатциклазой, происходит в период становления физиологической реакции на вазопрессин. По-видимому, этот процесс связан с частичной заменой фетальных пзо-форм G-белков на изоформы характерные для зрелой почки.

Мутация NDI существенно снижает чувствительность эпителия нефрона к вазопрессину, при атом, с точки зрения авторов этого стока мышей, такое снижение чувствительности нельзя объяснить нарушениями в звеньях внутриклеточного молекулярного механизма трансдукции сигнала вазопрессина дистальнее аденилатцпклаоы (Jackson et.al. 1974, 1980). В нашем исследовании были обнаружены особенности надмолекулярной организации рецептора вазопресспна. Мутация не вызвала снижения специфического связывания гормона, наоборот, как отмечено выше, у NDI специфическое связывание в мембранах почки оказалось несколько выше по сравнению с нормальными животными. В тоже время, изучение характеристик мембранных G-белков этих мышей, выявило их особенности по сравнению нормальными животными линии СВА. В наших экспериментах исследование ГТФазной активности препаратов мембран сосочка и внутренней медуллярной части почки позволило установить тенденцию к повышенному уровню базальной активности по сравнению с нормой (табл. 3). Присутствие вааопрессина не влияло на ферментную активность этих препаратов. Предварительная обработка му-тантных мышей холерным токсином снизила базальную ГТФазную активность до величин, которые наблюдались у животных группы сравнение.

-*- (Згас1. N801

Рисунок 8. Хроматография комплексов 3Н-СТР и гуанпдин-связывающих белков солюбплизированных из препаратов мембран сосочка и внутренней медуллярной части почки мышей СВА в возрасте 60 дней.

Условия хроматографии и обозначения те же, что и на рисунке 7. Ткиичный профиль специфического связывания из 4 экспериментов.

Однако, в отличие от препаратов мембран нормальных животных, в препаратах мышей N01 вазопрессия вызывал небольшое, но статистически достоверное повышение ГТФазной активности. Этот факт указывает, с нашей точки зрения, на присутствие небольших количеств О-белков, не являющихся субстратами холерного токсина и находящихся в функциональном сопряжении с рецептором вазопрес-сина. В частности это могут быть пнгибирующие формы С-белков ГТФ-азная активность которых в норме маскируется значительно

-*- Qrad. NaCI

Рисунок 9. Хроматография комплексов 3H-GTP и гуанндпн-связывающпх белков солюбилизированных по препаратов мембран сосочка и внутренней медуллярной части почки мышей NDI в возрасте 1 год.

Условия хроматографии и обозначения те же, что и на рисунке 7. Типичный нрофпль специфического связывания из 4 экспериментов.

более высокой активностью стимулирующих G-белков основных субстратов холерного токсина. Специфическое связывание ГТФ G-белжамп мутантных животных более чем на порядок выше по сравнению с уровнем нормальных животных. После обработки холерным токсином в обоих группах животных специфическое связывание возрастает до величин одного порядка. Анализ состава G-белков методом FPLC на колонке moiio-Q показал, что хроматографичеекпе свойства '"мутантных белков" значительно отличаются и от нормы и от белков незрелой почки (Рас 9). Эти результаты дают нам основания полагать, что повреждающий эффект мутации NDI не только

нарушает первичную структуру субъединицы рецептора, о чем упоминалось ранее, но, судя по всему, затрагивает и систему сопрягающих G-белков. Результатом такого эффекта ,по-видимому, является нарушение сопряжения рецептора и механизмов внутриклеточных посредников, что также вносит свой вклад в проявление физиологического эффекта мутации NDI.

Резюмируя эту часть исследований, можно заключить, что функциональное созревание системы G-белков мембран, как звена сопряжения рецепторов вазопрессина с аденилатциклазой, происходит в период становления физиологической реакции на вазопрессин и, по-видимому, этот процесс связан с частичной заменой изоформ G-белков, функционирующих в фетальном органе, на изоформы характерные для зрелой почки.

3) Развитие внутриклеточных механизмов рецепции сАМР.

Основным путем внутриклеточной трансдукции сигнала вазопрессина в чувствительных клетках эпителия нефрона и собирательных трубок являются процессы, регулируемые сАМР. Развитие молекулярного механизма действия этого посредника в клетке также значимо для формирования пути трансдукции гормонального сигнала, как и наличие специфических рецепторов гормона. В основе эффектов сАМР в клетке лежит специфическая рецепция этого ну-клеотида, которая в эукариотических клетках, в основном, осуществляется небольшой группой белков, т.н. сАМР-завпсимыми про-теинкиназами. Самую значительную роль в механизме регуляции сАМР-зависимых протеинкиназ играют их регуляторные субъединицы, которые в клетках высших животных являются основными специфическими рецепторами сАМР (Armstrong, Kaiser 1978). Не останавливаясь подробно на строении этих ферментов, т.к. в настоящее время они изучены достаточно глубоко (Jabnsen et.al. 1985, Ringheim et.al. 1988, Saraswat et.al. 1988), сАМР-зависимые протепн-киназы представляют собой гетеротетрамеры состоящие из двух ре-гуляторных и двух каталитических субъедшшц. Последние способны диссоциировать из комплекса, если регуляторные субъединицы связываются с молекулами сАМР (Kuo , Greengard 1970). У организмов, принадлежащих к низшим таксонам, обнаруживают и другие сАМР-связывающие белки, которые по-видимому, также участвуют в ре-гуляторных процессах, связанных с развитием организма (Schaller et.al. 1984, Tsang & Tasaka 1986). В тканях высших животных пзме-

нения активности сАМР-зависимых протеинкиназ в онтогенезе часто коррелирует с критическими периодами. В семенниках крысы в раннем постнатальном периоде активность сАМР-зависимых протеинкиназ представлена ферментом 1-го типа, к началу пубертации в клетках присутствуют и 1-я, и Н-я иэоформы (Ьее е1;.а1. 1976). В развивающейся матке крысы пик активности сАМР-зависимых протеинкиназ выявляется на 3-5 день (ЕррепЬе^ег е^а1. 1979). В хроматине простаты максимум активности отмечается на 48 день, что по-видимому также связано с процессом пубертации (МогуНсЬ с!;.а1. 1982). Отмечается, что во взрослом организме первая изоформа сАК более чувствительна к Са-зависимым протеазам (Веег 1984), что возможно способствует известному преобладанию второй формы в большинстве тканей взрослых организмов. В печени молодых животных отмечали постоянный рост активности этих ферментов с возрастом, однако, это вероятно более связано с ростом интенсивности метаболических процессов, чем с процессами дифференцировкп (\Vittmaack е^а!. 1983).

Наши исследования общей концентрации специфическихцитозоль-ных рецепторов в период становления компетентности почки по отношению к вазопресспну не выявили какой либо коррелятивной зависимости между чувствительностью почки к вазопресспну и концентрацией цптозольных рецепторов сАМР. При этом, исследование ферментной активности и специфического связывания сАМР на протяжении периода становления гормональной компетентности почки выявило период, на протяжении которого паттерн специфического связывания сАМР в цптозольной фракции сосочка почки крыс характеризуется двумя пиками в период новорожденности и в конце впнпнга, т.е. в периоды критические для развития почек (Рис. 10). В ранний постнатальный период почки нечувствительны к вазопресспну, п высокий уровень рецепции сАМР в этом возрасте, вероятно, отражает функцию рецепторных субъедпниц, связанную с их влиянием на активность генома, стимуляцию клеточного деления и дпф-ференцнровку (Бе СготЬп^е с1.а1. 1984), т.е. на процессы, которые происходят в клетках нефрона в неонатальный период. Мы склонны трактовать это явление как указание на существование самостоятельной роли регуляторных субъедпниц в период активных диффе-ренцировочных процессов. В пользу такого предположения говорит как существование генов, регулируемых сАМР, так и сходство

Рисунок 10. Возрастные изменения концентрации специфических рецепторов сАМР (а) и активности сАМР-зависимых протеинкиназ (Ь) в цитозоле сосочка и внутренней медуллярной части почки ин-тактных крыс Wistar.

Осп: абсцисс - возраст (дни); 1 - ординат - концентрация специфических рецепторов сАМР (fmol/mg)(M ± т); 2 - ординат - сАМР-зависимая протеинкиназная aKTiiBH0CTb(Pi/mg 5 min)(M ± m). На рисунках 10, 16, 18, 19, 20 каждая точка результат 6-7-16 определений.

биохимических характеристик белка связывающегося с респонсивны-ми элементами этих генов с регуляторными субъединицами сАМР-завпсимых протеинкиназ (Cole et.al. 1992).

Из результатов анализа сродства (Рис. И) и хроматографиче-ских характеристик (Рис. 12) можно заключить, что и в незрелой почке, и в почке взрослых животных рецепция сАМР осуще-

ствляется в каждом исследованном возрастном периоде рецепторами в основном одного типа, характерного для данного возраста. Создается впечатление, что у взрослых животных рецепторы сАМР более эффективны как регуляторы сАМР-зависимых протеинкиназ. Действительно, экспериментальное исследование комплексов сАМР-оависимых протеинкиназ выявило существенную разницу в способности к диссоциации фермента незрелой и зрелой почки (Рис. 13,14). Из полученных данных видно, что при концентрации сАМР порядка константы диссоциации сАМР-зависимые протеинкиназы второго типа, характерные для зрелой почки, диссоциируют более полно по сравнению с изоформой первого типа. При этом был показан такой ранее не описанный в литературе факт как существование дн-меров регуляторных субъединиц, что следует из результатов гель-фильтрации цитоаолышх рецепторов сАМР, где присутствуют пики рецепторов сАМР молекулярного размера соответствующего диме-рам регуляторных субъединиц. Несомненно, что различия физиологической значимости сАМР-зависимых протеинкиназ 1-го и 2-го типов существуют, но их еще предстоит изучить. Так при активации концентрирующей функции почки в результате дегидратации организма происходит значительное возрастание активности сАМР-зависимых протеинкиназ, но за счет появления отсутствующей в норме 1-й иаоформы (Рис. 15). В настоящее время не ясно в чем заключаются различия функций двух типов сАМР-зависимых протеинкиназ с точки зрения их участия в физиологических процессах клетки, однако, из ряда источников можно видеть, что часто в онтогенезе на разных стадиях наблюдается преобладание одной из изо-форм фермента (Lee et.al. 1976, Beer 1984). Согласно результатам нашего исследования, в превининговом периоде в медуллярном веществе почки преобладает 1-й тип сАМР-зависимой протеинкиназы, а в зрелой почке фермент 11-го типа.

По характеру взаимодействия регуляторных субъединиц с сАМР и между собой мы обнаружили значительные различия, касающиеся как аффинности регуляторных субъединиц по отношению к с AMP, так и способности к ассоциации - диссоциации субъединиц голоэн-зима в зависимости от присутствия сАМР в среде (Рис. 13, 14). Анализ комплексов сАМР-рецептор с помощью гель- фильтрации показал, что в качестве цитозольного рецептора могут

Рисунок 11. График Скетчарда для цитозольных рецепторов сАМР из сосочка и внутренней медуллярной части почки крыс '\Vistar в возрасте 14 и 00 дней, а) - 14 дней; Ъ) - 60 дней

—— а —Ь 0г«1. ИаС!

Рисунок 12. Хроматография цитозольных сАМР-зависимых про-теинкииаз из сосочка и внутренней медуллярной части почки крыс \Vistar в возрасте 14 и 60 дней. Типичный профиль ферментной активности из 3 хроматографии. Условия хроматографии. Колонка: БЕ-52, К9/10.

Буфер: ТЕ, 2 тМ /3-мерхадтоэтанол, 0.1 тМ РМБР Скорость: 10.0 мл/час, объем фракции 500 мкл Образец: 1.0 мг белка Градиент: 0.0 - 0.3 М №С1

Хроматография производилась на смоле БЕ-52. Колонка К9/10. а) - 14 дней; Ь) - 60 дней

Оси: абсцисс - N фракции; ордпнат - сАМР-зависимая протеинкп-назная активность (Р( тшгГ'тд-1) (103с.р.т.).

10.0 пМ сАМР -+- 1.0 пМ сАМР

Рисунок 13. Гель-фильтрация цнтозольных рецепторов сАМР пз сосочка и внутренней медуллярной части почки крыс '\Vistar в возрасте 14 дней в присутствии сАМР в различных концентрациях. Типичный профиль специфического связывания из 7 экспериментов. Условия хроматографии. Колонка: К16/40, ЭсрЬаскх в-ЮО. Буфер: ТЕ, 2 тМ /3-меркаптоэтанол, 0.1 тМ РМБГ Скорость: 6 мл/час, обьем фракции 1.0 мл Образец: 2 мг белка в 200 мкл а) - 1.0 пМ; Ь) - 10.0 пМ

Оси: абсцисс - N фракции; ординат - радиоактивность фракции (с.р.ш.)

— 10.0 пМ сАМР 1.0 пМ сАМР

Рисунок 14. Гель-фильтрация цитооольных рецепторов сАМР из сосочка и внутренней медуллярной части почки крыс \Vistar в возрасте 60 дней в присутствии сАМР в различных концентрациях. Условия хроматографии и обозначения те же, что и на рисунке 13. Типичный профиль специфического связывания из 5 экспериментов.

выступать не только индивидуальные регуляторные субъедивицы, но и их димеры, а также, судя по молекулярным размерам, возможно существование некоторого количества комплексов с неднссошшрован-ным голоэнзимом. Естественно допустить, что когда наблюдаются подобные комплексы, имеет место неполное насыщение четырех связывающих центров фермента сАМР, что и позволяет ему существовать в виде голоэнзима. Теоретически нельзя исключить и возможность ингибирования диссоциации фермента какими-то неизвестными факторами цитозоля.

#

— а —Ь -*- Огас1. Ыаа

Рисунок 15. Хроматография цитозольных рецепторов сАМР из сосочка и внутренней медуллярной части почки крыс \Vistar в возрасте СО дней после водной деприващга в течении 24 часов. Условия хроматографии и обозначения те же, что и на рисунке 12. Типичный профиль специфического связывания из 3 экспериментов, а) - контроль; Ь) - 24 часа водной депривацпп

Т.о. можно отметить тот факт, что в незрелой почке, где преобладает 1-й тип сАМР-завпсимой протеинкпназы, фермент более склонен к диссоциации на олпгомсры из субъедпниц, а сАМР-завпспмая протеинкиназа П-го типа, характерная для зрелой почки, в большей мере диссоциирует на индивидуальные субьедшшцы. Известно, что диссоциация фермента необходима для актнл.щии его каталитических субьединиц и в этом смысле 2-й тип представляет собой более чувствительную форму, что, по-впдпмому, существенно для реализации его физиологической роли как звена транедукции сигнала ва-эопресспна.

U/P 08Г71

10-12 14-18 18-20 30

Ша ШЬ

Рисунок 16. Возрастные изменения показателей осмотического концентрирования почки иптактных крыс Wistar (U/Posm), (М ± m). а) - контроть; Ь) - 24 часа водной депривации Оси: абсцисс - возраст дни; ординат - U/P05m

Однако, как показали наши эксперименты с дегидратацией животных начиная с 18-20 дневного возраста, в условиях высокого напряжения функции осмотического концентрирования, когда показатель и/р <мт возрастает до значений 5.0 - 7.0 (Рис.16), повышение сАМР-зависимой протеинкинаяной активности в медуллярной части почки осуществляется главным образом за счет индукции фермента 1-го типа. Т.е., по-видимому, существует селективность в индукции 2-х типов сАМР-зависимой протеинкиназы: в условиях дифференциров-ки и экстремального напряжения функции преобладает 1-й тип, а в дефинитивной почке в нормальных физиологических условиях 2-й тип фермента.

Резюмируя этот раздел исследований, можно сделать заключение, что в период становления физиологической реакции на вазопрессин происходит существенное изменение наиболее значимого внутриклеточного звена трансдукции сигнала гормона, которое выражается как в смене нзоформы сАМР-зависимой протеинкиназы, так и в установлении менее высокого, по сравнению с пиковыми значениями периода вининга, уровнем ферментной активности.

4) Пдакокортпкопды как факторы модификации онтогенеза почки

В настоящее время существующие данные не позволяют составить сколько нпбудь полное представление об участии гормонов в регуляции процессов, связанных с появлением гормональной компетентности, Поскольку развитие в онтогенезе имеет стадийный характер, то можно ожидать, что наиболее эффективное воздействие на ход развития в онтогенезе гормоны должны оказывать в так называемые критические периоды. С другой стороны, в возрастной динамике концентрации пли секреции гормонов в эти периоды отмечаются пли существенное повышение, пли существенное понижение, что, вероятно также связано с особой ролью гормонов в критические периоды. (Hess 1962, Scott 1962, Krecek et.al. 1971, 1980).

Наиболее ранние работы по исследованию роли стероидных, гормонов в регуляции онтогенеза касались исследования влияния ранних воздействий экзогенных глюкокортпкоидов п стресса на развитие организма (De Fries 1964, Denenberg 1964) или на определенные функциональные системы, такие как гппофпоарно- надпочечниковая (Нау-менко и др. 1979), или механизмы осмотического концентрирования в почке (Ivanova ct.al. .1987).

Самый общий вывод который можно сделать по анализа данных о влиянии стероидных гормонов на развитие физиологических систем организма -это выраженная корреляция эффектов гормонов и перестроек в тканях мишенях в те пли иные критические периоды онтогенеза, в том смысле, в котором их определял Шмальгаузен. Неравномерность развития прослеживается для большинства эндокринных механизмов. Часто это проявляется в виде скачков значений параметров эндокринной системы. Так описан пик рецепторов глюкокортпкоидов в передней доле гипофиза в раннем постнатальном периоде у крысы (Sakley 19S1), у'овцы аналогичное событие происходит в эмбриональном периоде (Rose 19S5). Пик андроген -связывающего

белка в цитозоле семенников крысы непосредственно предшествует периоду пубертации (Danzo 1985). В надпочечниках отмечен рост рецепторов андрогенов и эстрадиола с 15-го по 90-й день жизни, возможно, однако, что пик концетрации

рецепторов был в более ранние сроки (Luthy 1984). Подобная неравномерность прослеживается ц в развитии механизмов других гормонов. У эмбрионов крыс специфическая рецепция гормона роста возникает на 21-й день эмбрионального развития (Wanireddy 1984), в то же время уровень гормона роста в плазме сразу после рождения снижается на порядок (Boer 1983). В печени концентрация рецепторов гормона роста и пролактина монотонно повышалась от рождения до пубертации (Maes 1983), однако, в надпочечниках на 30 - 40 день жизни происходит значительный подьем с последующим

снижением концентрации рецепторов пролактина (Luthy 1984). У крыс пик рецепции фактора роста нервов (NGF) в п. sciatic обнаружен на 20-й день эбрионального развития (Yan 1987). Подобную картину можно наблюдать и для таких гормонов, существенно влияющих на процессы роста в организме, как инсулин и инсулинпо-добные факторы роста. У куриных эмбрионов рецепторы инсулина обнаруживают на 3-4-й день с пиком на 6-й день, в процессе развития имаго насекомых также имеет место пик рецепторов инсулина (Garofalo 1985). В индукции компенсаторной гипертрофии почки высших животных, судя по возрастающей активности рецепторов, принимает участие пнеулин-подобный фактор роста (IGF II) (Polychionacos 1985). Рецепторы тпреоидных гормонов у человека обнаруживаются у 10- недельного эмбриона, на 16-й неделе происходит значительное увеличения их количества (Bernai, Perkonen 1984). У крысы подобная возрастная динамика имеет место на 13-й день эмбрионального развития (Perez 1985). При этом есть указания на то, что в эмбриональном периоде эти рецепторы более полно заняты гормоном по сравнению с рецепторами взрослого организма (Haidar 1984).

Наиболее сложная возрастная динамика отмечена для глюкокор-тикоидов. При этом разные авторы обнаруживают пики связывания и уровня концентрации глкжокоргикоидов в различные возрастные периоды как в пренатальном (Rose 1985),так и в постнатальном возрасте (Sakly, Koch 1981). Известно, что эти гормоны могут активно влиять на ход онтогенетических процессов при формировании как собственно эндокринных органов (Mann et.al. 1984), так и дру-

гих функциональных систем (БепепЬе^ 1964). Как это показано в наших исследованиях, в раннем постнатальном периоде глюкокорти-коиды способны эффективно влиять на развитие концентрирующей функции почки. В экспериментах на крысах \Vistar мы исследовали влияние воздействия в раннем онтогенезе (4-5 дни жизни) однократного повышения концентрации кортизола в плаоме крови на возрастную динамику чувствительности почки по отношению к вазпресспну. В специальном исследовании нами методами тонкослойной хроматографии, хроматографии высокого разрешения и радиоиммунного анализа, было установлено, что в возрасте 14-15 дней в надпочечниках крысят до 20% общего содержания глкшжортикопдов составляет кортпзол, гормон, которых! в надпочечниках взрослых крыс не обнаруживается (Рис. 17). В настоящее время нельзя сказать, каково значение появления этого стероида в онтогенезе, хотя, не вызывает сомнения, что он принимает участие в регуляции развития организма.

Для выявления возможного влияния кортизола на развитие чувствительности почки к ваоопрессину мы исследовали последствия однократного внутрибрюшпнного введения кортизола. Инъекцию делали на 5-й день жизни. Как показали исследования И.И. Хегая, (1983) это момент наивысшей восприимчивости в раннем постнатальном критическом периоде. Гормон вводили в количестве 1.0 /¿ё/ё веса тела. При таком введении происходит относительно кратковременное повышение содержания кортизола в плазме крови (Хегай п др. 1983). Оказалось, что в дальнейшем у таких животных наблюдаются характерные отклонения развития почки от возрастной динамики характерной для контрольных животных, подвергавшихся ложному воздействию раствора изотонического хлорида натрия. Это относится к возрастной динамике показателей осмотического концентрирования, которая существенно различалась на протяжении периода исследования после 20-го дня и в возрасте 60 дней. Наблюдали отставание у экспериментальных животных в темпе увеличения индекса осмотического концентрирования II в величине ответа почки на ва-зопрессин (Рис. 18).

Резюмируя эту часть исследований, можно сказать, что пх результаты в значительной мерс подтверждают теоретическое предположение об особой чувствительности морфогенетпческнх процессов

о

0.4

и

930 сек.

■ ' ■ 900 еек.

Рисунок 17. Фаоообращенная хроматография экстракта надпочечников крыс ^^ах в возрасте 14 дней.

А - экстракт надпочечников. Синтетические стероиды (Ленинград (С.-Петербург)): Б - гидрокортизон; В - кортикостерон. Условия хроматографии.

Колонка: 2/60-Милпхром, //-Ьап(1ораск С-18 (5 /лт) Подвижная фаза: метанол/вода (55:45) Скорость: 100мкл/мин Образец: 20 мкл

Типичный профиль специфического связывания из 4 экспериментов. Оси: абсцпсс - время удержания (сек.); ординат - оптическая плотность (А-до) Пики: 1 - гидрокортизон; 2 - кортикостерон

0.4

за

в критические периоды к изменению фона гормональных воздействий, когда даже относительно небольшое возмущение в системе глюкокортпкопдов в раннем постнатальном периоде приводит к множественным изменениям в развивающейся физиологической системе. Возможно, в оспове изменений реакции на вазопресспн у взрослых животных, подвергавшихся воздействию гидрокортизона в раннем постнатальном периоде, лежит изменение молекулярных механизмов реализующих трансдукцию гормонального сигнала. Как было показано в совместных исследованиях с М.Н. Зелениной, значительные изменения затрагивают внутриклеточный механизм сАМР, вторичного посредника, реализующего антпдпуретпческпй эффект вазо-прессина. Исследование возрастной дпнамикп концентрации регуля-горных субьедпнпц сАМР-зависимых протеинкпназ, которую определяли как специфическое связывание сАМР в условиях насыщения, а также сАМР-завпспмоп протсинкпназной активности, позволило выявить существенные изменения этих показателей у опытных животных (Рис.19, 20). Наиболее ярко выраженными оказались изменения концентрации регуляторных субьеднниц сАМР-зависимых протеинкпназ в конце периода впнинга, когда у опытных животных не происходит столь значительного возрастания этого показателя по сравнению с контрольными животными. Возрастная динамика сАМР-оавнспмой протеинкиназной активности по форме повторяет динамику специфического связывания, однако с меньшей амплитудой. В то же время ясно, что в целом эффект глюкокортпкоидного воздействия. по-впдимому, обусловлен суммой многообразных эффектов этих гормонов в организме, поскольку рецепторами глюкокортпкопдов, а следовательно и восприимчивостью к ним, обладают в разной степени все ткани организма. Что касается почки, то пониженная антиднуретпческая реактивность у крыс, пндуцпрованных в раннем онтогенезе гидрокортизоном, по-видпмому, является следствием модификации молекулярных механизмов, обеспечивающих чувствительность почечного эпителия к вааопрессцну..

Реализация генетической программы развития организма в онтогенезе происходит благодаря сочетанному функционированию всего множества генов. Изучение развития систем рецепции и транедук-цшг гормонального сигнала один пз путей к пониманию принципов п механизмов, управляющих активностью генома в онтогенезе. В результате исследования молекулярных систем клетки-мишени

Рисунок 18. Возрастные изменения показателей осмотического концентрирования почки крыс Wistar, подвергавшихся воздействию гидрокортизоном в раннем постпатальном критическом периоде (U/P«„m).

a) контрольные животные, получавшие инъекцию физраствора;

b) опытные животные, получавшие инъекцию гидрокортизона 1 /ig/g веса тела на 4-й день жизни;

aF) реакция почки контрольных животных на АДГ (0.5 mU/100g); bF) реакция почки опытных животных на АДГ (0.5 mU/100g). Оси: абсцисс - возраст дни; ординат - U/Pojm _Р<0.05; -.-= Р<0.01

-—- а -■»- Ь

Рисунок 19. Возрастные изменения концентрации специфических рецепторов сАМР в цитополе сосочка н внутренней медуллярной части почки крыс \Vistar, подвергавшихся воздействию кортпзола в ]>ашгем постнатальном периоде.

а) контроль, Ь) крыс ы подвергавшиеся воздействию кортпзола Оси: абсцисс - возраст (дни); ординат - концентрация специфических рецепторов сАМР. Обозначения как на рнсунке 10 .

вазопресснна в развивающейся почке получена феноменологическая картина этих процессов в период впнпнга. Созданная модель влияния экзогенного кортпзола на развитие почечной функции позволяет расширить представление об особой восприимчивости организма к воздействию глюкокортпкопдов в постнатальном периоде онтогенеза, т.к. показана эффективность концентраций гормона, не

-®-е -ь-Ь

Рисунок 20. Возрастные изменения активности сАМР-зависимых протеишсиназ в цнтозоле сосочка и внутренней медуллярной части почки крыс Wistar, подвергавшихся воздействию кортизола в раннем постнатальном периоде.

а) контроль, Ь) крысы подвергавшиеся воздействию кортизола Оси: абсцисс - возраст (дни); ординат - сАМР-зависимая протеин-киназная активность. Обозначения как на рисунке 10 ,

превышающих его уровень в крови, наблюдаемый при стрессе. Таким образом, однократное кратковременное нарушение гормонального баланса организма в первые дни жизни может значительно изменить развитие антидиуретического ответа, поскольку воздействие гидрокортизоном в критический период структурно -функционального развития почки, по-видимому, затрагивает множество различных звеньев реализации гормонального сигнала. В целом совокупность

экспериментальных данных указывает на некоторую синхронность в развитии молекулярных механизмов действия вазопрессина, хотя характер конкретных изменений индивидуален.

Т.о. проведенное исследование позволяет расширить представление о таком принципиальном понятии биологии развития как критический период.

Выводы

1. Функциональное созревание молекулярных структур рецептора и механизма трансдукцпи сигнала вазопрессина в почке происходит в раннем постнатальном онтогенезе. Об этом свидетельствуют обнаруженные нами изменения функциональных характеристик ключевых звеньев механизма реализации сигнала вазопрессина в почке, таких как мембранный рецептор, в-белки мембран, цнтоплазматпчсскпе сАМР-завпсимые протепнкиназы. При этом функциональное созревание этих структур связано с перестройкой молекулярной организации этих звеньев.

2. Показано, что специфический рецептор вазопрессина в зрелой почке имеет полисубьедпнпчное строение. Формирование поли-субьсдннпчной структуры специфического рецептора вазопрессина происходит в период формирования гормональной компетентности почечного эпителия по отношению к вазопрессину.

3. Установлено, что в период формирования гормональной компетентности почечного эпителия, появляется способность С-белков, находящихся в мембранах клеток медуллярной части почки, повышать ГТФ-азную активность в присутствии вазопрессина. Это указывает на появление функционального сопряжения специфического рецептора вазопрессина п стпмулпрущпх гуанпдпн- связывающих белков (в^белков) мембран почечного эпителия. В этот же перпод происходит изменение функциональных п хроматографпчеекпх характеристик мембранных С5-белков сопряженных с рецептором вазопрессина. что позволяет высказать предположение о смене пзоформ этих белков в перпод созревания почечной функцпн.

4. Показано, что в период формирования гормональной компетентности почечного эпителия по отношению к вазопрессину проис-

ходит замещение преобладающего в раннем постнатальном онтогенезе 1-го типа сАМР-зависимых протеинкиназ на 2-й тип фермента. На это указывают изменяющиеся показатели аффинности к сАМР и хроматографические характеристики сАМР-завпсимых протеинкиназ в цитозоле внутренней медуллы и сосочка. Рецепторы сАМР в цитозоле могут присутствовать в виде димеров, при этом диссоциация сАМР-зависимых протеинкиназ 2-го типа происходит при меньших концентрациях сАМР по сравнению с изоферментом 1-го типа.

5. При длительной стимуляции концентрирующей функции почки в результате водной депривации происходит увеличение концентрации сАМР-зависимых протеинкиназ преимущественно 1-го типа, что указывает на индукцию генов соответствующих субье-диниц.

6. Процессы формирования дефинитивного механизма трансдукцпп сигнала вазопресспна в период впнинга протекают на фоне глю-кокортикоидного статуса организма существенно отличного от гормонального статуса взрослого организма. Показано, что в раннем постнатальном периоде в надпочечниках крыс до 20% глюкокортикоидов представлены гидрокортизоном.

7. Однократное, кратковременное нарушение глюкокортпкоидного статуса организма, вызванное иньекциеи экзогенного гидрокортизона в ранний постнаталышй период, приводит к отдаленным последствиям, выражающимся в задержке созревания механизма трансдукции сигнала вазопресспна и снижении темпов развития концентрирующей функции и реакции осмотического концентрирования почки на антпдиуретический гормон.

Список публикаций по теме работы:

1. Соленов Е.И., Иванова Л.Н. Изучение цптоплазматическпх рецепторов цАМФ в почках крыс различного возраста с помощью гель-фильтрации // Бюлл.Эксп.Биол.и Мед.,1985, т.ХС1Х, N6 с.683- 685

2. Соленов Е.И., Зеленина М.Н., Иванова Л.Н., Рецепция АДГ и цАМФ в медуллярной части почки мышей нечувствительных к АДГ. // Физиологический журнал СССР им. Сеченова т.77, N 5, с. 85-91, 1991

3. Козлов В.М., Соленов Е.И., Иванова Л.Н., Изменение содержания

глюкокортикопдов в плазме крови и ткапях крыс в постнатальном онтогенезе // Проблемы эндокринологии т.36, N 2, с. 66-69, 1990

4. Иванова Л.Н., Соленов Е.И., Хегай И.И. Влияние гидрокортизона на формпрование функции осмотического концентрирования у крыс // Бюллетень эксперимен-тальной биологии и медицины, 1982, т.ХСИ 1, N6, с.16-18

5. Логвиненко Н.С., Соленов Е.И., Свиташева Н.Г., Иванова JI.H. Рецепция альдостерона фракцией мембран и цптозолем почек крыс в посткатальном онтогенезе // Физиологический журнал СССР шм.Сеченова 1989 т.75, N2, с.251-256

С. Свиташева Н.Г., Логвиненко Н.С., Соленов Е.И., Иванова Л.Н. Влияние альдостерона на системы вторичных посредников в почках крыс // Физиологический журн. СССР им.Сеченова 1991 т.77, N10, с.114-119

7. Соленов Е.И. Изменение цАМФ зависимой протеинкиназы почки крысы в онтогенезе //8 Совещание по эволюционной физиологии, Ленинград, 1982

8. Соленоп Е.И. .Изменение цитозольных рецепторов цАМФ почки крысы в онтогенезе //14 С'езд физиологов СССР, Баку, 1983, с. 310

9. Соленов Е.И., Логвиненко Н.С., Свиташева Н.Г., Иванова Л.Н., Влияние альдостерона и вазопрессина на концентрацию внутриклеточного Са+2 в кортикальных отделах собирательных трубок почек крыс И Биологические Мембраны - 1991, т.8, N8, с.882 - 8842.

10. Зеленина М.Н., Соленов Е.И., Иванова Л.Н. 12.Активяость сАМР- зависимых протепнкпнао и сАМР- связывающие белки ци-тозоля почки крысы при дегидратации // Биохимия, 1985, т.50, N3, с.439- 442

11. Селягпцкая В.Г., Соленов Е.И., Шорин Ю.П., Иванова Л.Н. Показатели гормональной регуляции водно-солевого обмена и рецепции цАМФ в сосочках почки крыс при адаптации к холоду // Бюл.т.Эксп.Биол.п Мед., 1985, т.С, N10, с.393-394

12. Соленов Е.И. Рецепция цАМФ и цАМФ -зависимая протеин-киназная активность в почке крыс с нарушенным онтогенезом концентрирующей функции //7 Всесоюзная конференция по физиологии почек,Чернигов 1985, с. 211

13. Зеленина М.Н., Соленов Е.И., Иванова Л.Н. Возрастные изменения сАМР-зависимой протепнкинаоной активности в почке крысы // Пробл.Совр.Биох. Бпотехнол., симпозиум СССР-ГДР,Рига 1985 е.135

14. Зеленина М.Н., Соленов Е.И., Иванова JI.H. Изменение рецепции сАМР в цитозоле развивающейся почки крыс // Биохимия 1986, т.51, N1, с.77-79

15. Зеленина М.Н., Соленов Е.И., Иванова JI.H. Онтогенез рецепторов сАМР и активности сАМР-зависимых протепнкинаа в почке крыс // Изв.СОАН СССР, 1985 N1, с.135-138

16. Соленов Е.И., Логвиненко Н.С., Зеленина М.Н., Дзгоев С.Г., Иванова JI.H. Изменение рецепторного звена в процессе развития чувствительности почки к альдостерону и антидиуретическому гормону // Физиологический журнал СССР им.Сеченова 1986, т.72, N12, с.1673-1679

17. Соленов Е.И., Иванова JI.H. К вопросу о молекулярной структуре рецептора АДГ в онтогенезе почки //8 Всесоюзная конференция по физиологии почек. Харьков 1989, с. 179

18. Соленов Е.И., Логвиненко Н.С., Зеленина М.Н., Дзгоев С.Г., Изменения молекулярных механизмов гормональной компетентности в развивающейся почке крыс //15 С'езд Всесоюзного физиологического общества им.Павлова Кишинев 1987, с.500

19. Соленов Е.И., Зеленина М.Н., Иванова Л.Н. Модификация развития молекулярного механизма периферического действия вазопрес-сина // Онтогенетические и генетпко-эволюционные аспекты нейро-эндокршшоп регуляции стресса. Международное совещание. Новосибирск 1988, с.61-62

20. Соленов Е.И., Логвиненко Н.С., Свпташева Н.Г., Иванова Л.Н., Возрастные изменения рецепторов АДГ и альдостерона в почке крыс и мышей // препринт ИЦиГ СОАН СССР. Новосибирск 1988

21. Козлов В.М., Соленов Е.И., Иванова Л.Н. Изменение содержания глюкокортикоидов в плазме и тканях крыс в постнатальном онтогенезе // Проблемы Эндокрпнол. 1990, т.36, N2, с.66-69

22. Соленов Е.И., Иванова Л.Н. Влияние сАМФ на степень агрегации регуляторных субьедпниц цитоплазматических сАМР- зависимых протеинкиназ почки молодых и взрослых крыс // 16 конференция ФЕБО. Москва 1984. с.167

23. Иванова Л.Н., Зеленина М.Н., Мелиди H.H., Соленов Е.И., Хегай И.И. Ваоопрессин: онтогенез антпдпуретического действия на клеточном уровне // Физиологический журн. СССР им.Сеченова1989 T.75,N7,c.970-979

24. Соленов Е.И., Зеленина М.Н. Иванова Л.Н. Рецепция АДГ и цАМФ в медуллярной части почки мышей нечувствительных к АДГ

// Физиологический журн. СССР им.Сеченова 1991 t.77,N5,c.85-91

25. Иванова JI.H., Зеленина М.Н., Логвиненко Н.С., Соленов Е.И., Свиташева Н.Г. Возрастные изменения молекулярных механизмов гормональной регуляции функции почек // Журнал эволюционной биохимии и физиологии 1990, т.26, N4, с.482-489

26. Логвиненко Н.С., Соленов Е.И., Зеленина М.Н. Становление молекулярных механизмов гормональной чувствительности в развивающейся почке крыс // 1-й сьезд физиологов Сибири и Дальнего Востока. Новосибирск 1986, с.179-180

27. Соленов Е.И., Зеленина М.Н. Иванова Л.Н. Изменения рецептора вазопресспна и системы его вторичного посредника в онтогенезе почки // Всесоюзный симпозиум Биохимия рецепторных систем. Таллин 1990 с. 37-38

28. Ivanova L.N., Solenov E.I., Zelenina M.N., Khegay I.I. Decrease in the response to ADH of the rat kidney as a result of early treatment with Cortisol // Pflugers Arch. - 1987. - V.408. - P.328-332.

29. Solyenov E.I., Zelenina M.N., Ivanova L.N. Development of vasopressin receptors in kidneys of rats and mice // Acta physiol. Pharmacol, bulg. - 1988. - У.14. - Suppl.l. - P.82.

30. Ivanova L.N., Grigoriev A.I., Melidy N.N., Solenov E.I., Changes in kidney response to ADH under hypogravity: rat models and possible mechanisms // The Physiologist 1989, v.32, sl6 - sl8

31. Ivanova L.N., Solenov E.I., Zelenina M.N., Khegay I.I. Reduction in the response to ADH of the rat kidney as a result of early postnatal Cortisol treatment // 5Eur. Colloqium on Renal Physiology Frankfurt am Main 1985, p.227

32. Ivanova L.N., Logvinenko N.S., Solenov E.I., Svitasheva N.G. Age related changes in the molecular events provoked by vasopressin and aldosterone in the developing kidney // 7 Symposiumon Developmental Pharmacology. GDR 1989, p.23-25

33. Ivanova L.N. Solenov E.I., Zelenina M.N. Khegay I.I., Reduction in the response to antidiuretic hormone of the rat kidney as result of early postnatal Cortisol treatment // Renal Physiology 1986 v.9, N1-2, p.118-119

34. Solenov E.I., Ivanova L.N. Ontogenic changes of the cAMP cytoplasmic receptors in the rat kidney //4 European Colloqium on renal physiology Praga 1982,p.ll5

35. Solenov E.I. Age related changes in G- proteins of kidney medullary membranes in CBA and nephrogenic diabetes insipidus (NDI) mice //

Renal Physiology and Biochemistry,1992, v,15,N3- 4,p.l88

36. Ivanova L.N., Khlebodarova T.M., Logvinenko N.S., Solenov E.I., Svitasheva N.G. Molecular aspects of the aldosterone effect on the developing rat kidney // Renal Physiology and Biochemistry,1992, v.l5,N3-4,p.l88

37. Logvinenko N.S., Solenov E.I., Svitasheva N.G., Ivanova L.N. Does aldosterone effect on systems of secondary messengers in the rat kidney? // Renal Physiology and Biochemistry 1992 v.15, N3-4, p.208