Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выделение, очистка, физико-химические и кинетические свойства тиаминтрифосфатазы мозга быка
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Выделение, очистка, физико-химические и кинетические свойства тиаминтрифосфатазы мозга быка"
смэленекий гтгсударггвшмй модшюе&ш институт
Но
МАКАРЧНКОВ Александр Федорович
ВЫДЕЛЕНИЕ. ОЧИСТКА, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ТИАМИНТРИФОСФАТАЗЫ МОЗГА БЫКА
03. СО. 04— гкьома
АВТОРЕФЕРАТ диссертации «а СОйСКАЯЕ!- ученой степени
кандидата втттящмх наух
Работа выполнена в лаборатории прикладной энзимодогии и биотехнологии Института биохимии АН Беларуси.
- * . ■ ■ ■ ■ . Наутаый руководитель - кандидат биологических наук, старей* научный сотрудник И. П. Черникёвич.
Официальные оппоненты: . доктор биологических наук, профессор 3. В. Горбач; доктор химических наук, профессор Д. И. Метелица.
' Ведущая организация - Институт питания АМН РФ
Залита состоится Чг^ссс^Л- 1993 г. в 7 У .час
на заседании специализированного совета К 084.34.01 Смоленско государственного медицинского института (214019, г; Смоленск, ул. Крупской, 23).,
С диссертацией, можно ознакомиться в библиотеке Смоленске государственного медицинского института.
Автореферат разослан■*.<№'* 1993 г.,
Ученый секретарь специализированного совета» профессор
Н. Ф. ¿арах
ОБЩ XÄPiHTEFKCTIäKÄ РАВШ
Актуальность проблемы. В клетках кивотша болеэ ЯЗЦ витамина Bj представлено фэсфорилированшии производим»! - тиа^нмоно-, да- и трифосфатом, и именно фосфорные з$иры определяй? биологическую активность тиамина (Leder, 1975; Haas, 1988). Зункцик ТДФ в реакциях клеточного метаболизма как кофактора транскетола-зы и ферментных систем окислительного й квакястатеяьного декар-боксилирования <£-кетокислот достаточно хорояо кзучека (Островский, 1974; Кочетов, 1978). Точная бйопаягёэсхая роль TTS а вас-тощее время остается неизвестной. Шеаа^еся № сегодая акевэра-яенгалькве. данные позволяет говорить а возйоавом зшстиз Жэ энергетической обеспечении нервного пмг^льса, посЕогьяу бита показано, что процессы нервной активности сопровэгдздтсл дефасфэ-рилированием данного производного ютакива (itebraa, Coeper, 197Ö, 1972). Предполагается» что метаболические прэгр&щенял ТГФ вносят вклад в: контроль'за ^децкокалиагл состоянием натриевого канале, однако механизм этого процесса неизвестен (Schoifenieie, gargjoesini, 1985).
3 литературе пражтичзскаотсукгтвуют «вадяниа о сшця^ич-!{цх фзразнтксгадраяизаТТй в ив рамой ?гаяз« зсетя memo окз гут быть исходны» пунктом в иссяадокцая ¡ахъгущтэго вахагш-уа нвЯротропной функций таашда. Э свет о «та тел» Hacggggsfl работы заключалась в «вдвлвшвг и очнстга до гояогэнкэго состояния тиаииктряфэсфьтазу ¡гозга бкхз, пссгэдов£Ккя вЗггаяахул.'фш-кинетмческях свойств я возмотдсс кехйяхзвэа ротэнэдаг.
В заката исследования входило:
- разработать ¡ахроветод определения TS®, ssarcsrsia гэдкязкзэ и стабилизацию комплекс» атЦДК а Щ'.шэ савгга дразкаЗ, say^s-даа огггпиальккг усдргрЗ сгяэдазлвя мзгрозеетгастз Ейфзрагзэта о ' 5побэл»оя, cpbrmjro модаяыю а система оярэдэлвпая ЗД5;
- разработать кэтод пзкгрсягя мстивкэста ТТФ-ааа гр юяяадс??? образутаогоск э реакция прэдугта - ЭДО;
- псс^доБать ахтаэтеоть IT^-sssf о рзэгячад орр&явх я тш\кх. -ifcza, субллетоод® легалззазпз з юэзго; .•'
■ ■JI _... I I II. Ii HUI I. • . , у . IJ 1 V J J • 1' II-----L —---*--' " * I " " ' ' "* ' ■1 ■ 1 1
Врикптпз сокрздзкая: АДГ - йзетгодъдзгздрэгэгаса; ЩД-- ss-оувагдепарбоаспдава*, - «аююДО*» 273 - ®аив2Я5а$«-
0!Ш - югапямадмОДз*;: - BÄä^S^s.
~ получить гомогенный про парат ИФ-азы из головного мозга быка; - изучить-субстратную специфичность, ыоленудярно-кинетические -параметры, возможные цути регуляция фермента, природу взаимодействия белка с молекулой ТТФ и формальный механизм реакции.
Научная новизна. Впервые описана методика получения элект-рофоретически гомогенного препарата ТТФ-азы. Показано» что фермент аз шзга быка состоит из одной полипептидной цепи и обладает абсотатной .специфичность?) к ТТФ. Изучены его кинетические свойства, механизм действия, возможные пути регуляции в клетке, взаимодействие с субстратом.
Сформулировано представление о цатозольной ТГФ-азе как периферическом измбранноы белке и универсальной роли ТТФ в транспорте ионов.
Доказано существование двух взакго превращающихся фора ТТФ-азы, характеризующихся различными активностями, сродством к субстрату и энергиями активации. Предложена схема формального механизма реакции. Установлено, что связывание с ферментом осуществляется за счет фосфатных остатков ТТ<В, а взаимодействие тиаыино-вой части ыолекули с каталитическим участком активного центра приводят к правильной ориентации и гидролизу субстрата. Еааная роль в процессе катализа принадлежит аминогруппе гаридадинового кольца,, гидрофобнш силам и четвертичному азоту тказола.
Обнаружена возможность регуляции активности ТТФ-азы в условиях клетки аданозинтрифосфатом и свободными ионами ¡&в2*.
Полученные данные имеат вааноз теоретическое значение для понимания одного из фундаментальных аспектов витаминологии -нехофераентной .фунадай тиамина.
Практическая ценность работы. Предложен ыэтод определения ггакрокояичзств "ВДэ, пригодный для вирокого использования в клинической и лабораторной практике при биохимической диагностике Вр-недсстаточностн ноцеже танинового статуса населения.
Нетод измерения активности ТГФ-азы по продукту реакции -ТДФ может применяться при изучении поведения фермента в условиях различных патологий у ладей и моделирования заболеваний у зксгйргазнтальных кивотних.
Приоритетный способ выделзния и очистки ТГФ-азы из мозга быка, ко.-лет быть использован в оригинальном виде или после адаптации к соответствующему объекту при проведении научно-исследс-зательсжих работ. Идентификация реаздяошосшообных участков ь ТТ; дает еозмояность осуществлять синтез нознх анадо-
гов ТГФ с заранее предполагаемыми свойствами.
Основше положения» выносниаэ на заздту:
1. ТТФ-аза локализована в цитозольной.фракции клеток головного козга быка;
2. цитоэольная lTS-аза мозга быка - специфичный фзркзнт гидролиза TTS; _ .
. 3. TTS-asa существует в вида дзух кинетически различимых форм с разной активность®, сродство» к субстрату н энергиями активации;
4. механизмы регуляции ТГФ-ази вкязчгэт кнгибировашга аде-иоэиитрифосфатоы» контроль аа состксЕвякем иэофОрч фзргкжта под влиянием концентрации ГШ и аативаща .свободными г:сяагш кггакя.
: Апробация работы. Осноенкз результаты исследований дарованы и обеуадеиы на:
- i-oii Международном конгресса "Витамины и баофаиторы в shshh науки", Кобз, Япония, 1991;
-7 Гродненской областной кон^ранций иолодшс учшадс и специалистов, Гродно, 1991;
— заседаниях Института бкохдаин М Бэларусн.
Публикации. По темэ диссертации опубликовано 6 рабо*.
Структура и объем работа. Диссзртгдяя coctosst га введения, обзора литературы (2 глоен), 6 гяаз оебетвеикйг ессгздозгшй, звкявчакия, вводов и бк&лмогрс^ячвского угезатока, nsssrasr^ro 270 наименований, кз них 225 ка miocrpcxmac sskkes. Рабгга гзго-гзна на 151 страпгцэ кгэжовяского текста н плдяйгрдрове-ш 14 .. таблкцакк к SO рисунке¡¿я.
■ &вшш и гзнур газвдозша
Объекта кссладойУчаА. ß вйаветвэ ееякгвго tratepsesa з работе исавяьвоввкн: I. Окаю» драгга взвсйадазпувез•еи»1вЬ»гря»я1я 7-9 явонкзабкках раге«$рацжЯ. 2. Балке кзлэгзОггэ apiSH обгзго пола uaccoft 200-2^0 г. з 25-ssirteasj. 3. СгззкЗ гг?гл-
' srrfl -КС8Г аак кскшйй фчрйага.
• Onmsosoms. жяпюю* Шоа.. Вмэдктэ ваавса чумгса-голмгосгм |ф9Дйсжнскк5 рякев еятею&а
кей"?& во иворммкгвсявау -фосйоггу (г&гйй.'^жа^-тэтег.Увзй«^» • в», 153t •) «зЕопрвреЕзя.двя! нвк^^яш» кяаташ-еяормета jpss-^
'■■пни я»з «KSK« г-епщгйгрййкзк.су0с?1>85й,--Икгя..р&зрЕЙвге5_ißi.' Г • ••
ниже) и.прякэияяся метод, основанный на количественном определении другого продукта реакции -
Концентрация .общего тиамина и ТТФ в органах и тканях быка определяет фяуорииетрически (levelile, 1972) на флуориметре ЭФ-З-iîA. ТТ§ предварительно отделяли or другие. тиаминфосфатов хро-ьзтографиай на катконкге КРС-12П.40Г в 10 ыМ натрий-ацетатное буфере, pH 4,05. ' : ' •
Количество белка в пробах находили по Ерэдфорду (Eradfcrâ* IS75) и сдактрофотоиотрическа (bayno, 1957) на сгактрофотомет~ pax "Spekol-211"(iSP) к "Perkin-Elmer 402"
Субклеточное фракционирование мозга быка осуществляли методой дифференциального цэнтрифугирования (iwata et al., 1974).
Химический синтез ТТФ проводили по ранее описанной иетоди~ ко (Черникзвич с соавт., 1990).
Голубуп сефарозу синтезировали согласно методу Дина и У<га~ сона (Deen, Eatson, 1979).
1ТО~аэа кэ мозга быка была очищена с применением методов гидрофобной и ионообменной хрокатографш на тойогарлах ня-бО и CEA2-650SÎ, гель-фильтрации на сефадексе G-75 и хроматографии ка голубой сефарозе. Балок хранили в замороженном состоянии при -20°С. .
• Молекулярную массу нативной ГГФ-азы определяли -гель-фильтрацией ш колонке с сефадексом G-100 (Andrews, 1965)..
Количество поли пептидных цепей и их молекулярную массу определяли. методом диск-электрофореза денатурированного белка в ПААГ в присутствии додецидсульфата натрия (Weber, Osborn, 196S) Гомогенность препарата TTâ-ады оценивали электрофорезом в ICSS ПДАГ Tipa pH 8,9 (Daviar 1964). .
: • Определение бо&Ьатазкэд: активностей и субстратной специфичности ТГ6-азы. Для изучения субстратной специфичности использовали инкубационную среду сладуззцзго состава: 50 Ш трис-КС1 буфер» pH 6,7, 5 иМ щзо4, 13 нг очищенного фзрмг®?& и фосф&т-содераациа соединения в концентрациях 0,15 мМ и 3 ыЫ. Количесл> во Pi, высвобоздаачзгоея за 60 шш инкубации при 37°С определяли по иетоду.Сащцу с соавт. (Звргу et al., 1SS7 ),- Наличие прн-iiecKüx кесжциф1че<жас фзсфагазнж активностей в препаратах Tîî-asa выявляли cteiorir-acat образок sa исклгчзжсч тога5 что всаакшиж ррзводалм при pH 7,5 в 9,0, а нукдеоакд- к таашнфэс-' фая* исшльзовааивь s повциттрщои 5 Ш. Конечный обьеа nmydv
ционной смеси составляя 0,5 мл. Реакцию останавливали реактивом для определения
Кинетические исследования ИФ-аэы проводили на спектрофотометре РегкШ-ЕХшаг 402 (США). Для расчета скорости ферментативной реакции использовали стационарные участки кинетических кривых.
Математические методы. При графическом анализе данных, требующем построения прямых линий, рассчитывались уравнения линейной регрессии о использованием метода наиыеньа&с квадратов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И Ж ОБСЩЕНИЕ
Получение йешентного препарата для количественного определения ХДФ. .
Существенным недостатком ферментативного метода определения ЗДФ, основанного на рекомбинации его как кофактора с япо-ПДК и последующем проведении реакции с избытком гшрувата в присутствии АДГ {Ullrich, 1970), является необходимость предвари- . тельной независимой, очистки двух ферментов - ЦДК и АДГ при низкой устойчивости холо- и особенно апоОДК, В радо случаев - при анализе содержания в крови, иоче и некоторых тканях «ли определении малых количеств ТД0, образующегося в ходе фераджтата-еного гидролиза ТТЙ в условиях ого нхззэа концентраций - оказывается недостаточной и чувствительность метода» В евши о эгаа одним из этапов нашей работы'было дадучениэ очищенного котдах-са АДГ и апоВДК из пивных дрожяей,' его стабилизация я разработка способа определения Ийярэк0й5чэств'1ДЭ.
Очистку ферментного комплекса проводили следувдаз образса. 400 г сухих дроетей сыешвата с 1750 ил водного раствора, содэ- ■ ржяцего 67 кл глицерина, 0,67 г ЗДТА, 23,2 г Уа^гто^ я 2,8 ? (KiJgSO^. Скось интенсивно перемешивали 10 шш» охлаждали дэ 0-2°с1 обрабатывай» ультразвуком при 20 кГц в течение 20 дан а центрифугировали SO кш при 4000-g,. а затем I ч. прз I05000.g. • Экстракт фракционировала ацзтоноа кюзду 35-4Й насйцэкия.^Оса-до,-С отделяли цэятри&'гирогсипеч, раегворвяи в 400 мл 20 «П. трис-HCI бу^ра, pH 7,3 с 2и&-%йТА п 5 йУ игетекн-гадрехло^'-доу и фракциоиipoвали сульфатом акмэнкя при .наездэнпн 45-55Я. Зая-/ -■жчнтельнуэ очистку осуарйтзллгл методов адсорбционной гзайш на" гидтяксиапатито. з 0,12 П бу&ерз, zH ,
6,8, содержащем 20 ыМ На2+, I нМ-ЗДТА, 0,5 мМ ЗДФ и 5 мИ цясте-ин-гидрохлорид.-.В результате очистки удельная активность ПДК возрастала в 36, а АДГ в 17,5 раз; соотношение активностей в ферментном комплексе составляло 1:0,15, что исключало возможность лимитирования сопряженной реакции АДГ.
Для получения агоформы ПДК (удаления ЗДФ) высоленный после фракционирования на гидроксиапатите комплекс растворяли в 10 мМ трис-НС1 буфере, рН 9,0, с I м!1 ЭДТА и 5 ыМ цистеином и хромато-грфировали на колонхе с ыолселектом Г-25.
Стабилизацию комплекса апоПДК и АДГ осуществляли глицерином или (Ь*Н4)2304 в присутствии ионов Из2+. В первом случае рН гаяо-ируемого с колонки раствора апофермента снижали 50 мМ Иа-фосфат-нын буфером до 6,8, а затем вносили глицерин и 0,5 М ¡^го^ до конечной концентрации компонентов 30% и 20 мМ, соответственно. Во втором - к белковому элюату приливали равный объем 5,4 Ы (йн4)2зо4 в ОД М На-фосфатном буфере, рН 6,8, с 0,04 М Ыеэо^ после чего белок лиофилизировали при температуре -35°С и давлении 0,05 Па. В 30$ глицерине в присутствии реактивация аго-ЦЦК с низкими концентрациями ВДФ оставалась высокой 1,0-1,5 нед. Лиофилизированный комплекс был стабилен в течение- года.
Очищенный из дрожжей и стабилизированный комплекс апоПДК и ¿ДГ использовался наш для разработки методов определения микроколичеств ЗДФ и активности "ПФ-азы.
' Ферментативный миктеметод количественного определения ИДФ
В результате исследования оптимальных условий рекомбинации микроколичеств ЗДФ с апоПДК. н211:1 установлено, что максимальное связывание осуществляется в реакционной смеси следующего состава: 20 мМ Па-фосфатный буфер, рН 6,8, 2-5 ыМ и 70-150 мкг белка комплекса. Рекомбинацию необходимо вести.2 ч при температуре 18-25°С. Отмеченные закономерности были положены в основу разработки модельной системы количественной детекции в биолога ческих жидкостях.
Для определения микроколичеств ВДФ 0,1-0,2 мл алихвоты прокипяченных'экстрактов тканей или крови рексмбжшруат в течение 2 ч с 0,1 мл растг-ора очищенного ферментного комплекса, разбавленного до необходимой концентрации 20 ыИ На-фосфатнкм буфером, рл о,о, 1'. 0,1 мл 50 мМ Из50л; обаиё объем смеси доводится до О,о мл тем -,е буфером.* По истечении срока рекомбинации в хсалсдую
пробу вносят по 2 мл 0,15 i! Ha-цитратного буфера, рН 5,9, и 0,1 мл 0,2 Ы гирувята на. Реакцию зацускают добавлением 0,1 мл 0,5 ыМ ШДН и измеряют изменение оптической плотности раствора первые 5-10 мин при 340 ны. По величине изменения оптической плотности находят соответствуащуо ей точку на калибровочной кривой, построенной с использованием известных: концентраций препарата ■ВДФ. В исследуемом интервале концентраций г.офзрмента линейность сопряженного процесса сохраняется в пределах 1-200 пмоль ДО. Точность измерения составляет в среднем 2,10«; чувствительность метода ка порядок превышает чувствительность метода-прототипа (Ш-lrlch, 1970). . '
Метод измерения активности TTS-азы по наработке Щй
Прикешшаыйся ранее метод определения октипности ТТФ-шш по ?, (Hashltani, Cooper, 1972} ieattinen, 19S1) характеризуется низкой чуЕСтвительностьа, что ке позволяет использовать его в измерении начальных скоростей реакции при низких концентрациях TTS, и спе19»фичностьв, поскольку при изучении активности TTS-азы в экстрактах тканей количество образующегося помдаю расщепления ТГФ во многом звеисят от скорсста гидролиза ТД5, ТМФ, нунлеозидфосфатов, яругах фос^ЕрйГиросглтс китсраедкатон клетка. Наш предложен цетод опредегеккз активности ^йраекта та другому продукту реакции - ЗДЙ.
Инкубационная агесь объемом ! гаг вклптгага 0,05*1 иН ПФ, 10 мМ b&so4, 20 иМ тр.'!с-НС1 буфзр, рН 8,7, и 0,1 шг экстракта исследуемой ткани. PeEio?so велн 10-30 кан пра 37°С а оетакавга-вали 0,2 хл 20% Ш, яоторуп затем удалая акстракцаэП ёосьыьп объемами водокасщешого э£г?рп. Посла зкстрагоря ТХУ скесь разбавляли 3 из 50 кМ Иа-фосфатного буфера, рН 6,8, цектрк$уп?рэ-вяли 10 ¡ли и отсвда отбирала га 0,1 шi для рзксмбикации (20 кин) образованного за время нккубецяи ТДЭ с апоПДК дретка. Начальную скорость сопрягзккоЯ ЦЦК-ДДГ реакции фиксировала еаз описано &г&з. ^
Предссяёнкнй изтод пошнго ЕЕсокой пувегвятольковга (20 пиоль? по ?i - 50 нзюль (resttiaen, tSSi}) ^ гпрзэтврегуэтея п более 'высокой врасй^ивкйсгьэ, что. находят отрасеиив; в етожязв-sprsa реап^и: 'ъ-сф&в экстрактов-*пФаа,1кд?ош> 1юа ТХ$. прим?»», к обрадован:» йогь щ т£ь ?±'.
гкг*юрвя!«ееягкач.т казга а««' -..у
I тн а 2 а 25 ыМ трнс-HCI буфера, рН.7,5, с 0,2 ыЫ ЗДТА и 0,15 Ш KCI. Гокогенат центрифугировали при 5000-g I ч. К экстракту добавляла до 30^-го насыщения, осадок отделяли центри-
фугированием, а белки супернаганта адсорбировали на колонке (3,5 х 60 су) с тойоперлом Ни-60 , уравновешенной (Ije^)2S0. в 25 цН трнс-HSI буфере, pLi 7,2, с 0,2 мМ EftTA и 50 мИцаС1. Белок элэирозгли линайнш градаентоа (ЕН4) 2S04 от 30 до 0% в теп se буфере. Акткзныз фракции высаливали, растворяли в 25 ыМ трис-HCI буфере, рН 7,4, с 0,2 iM ЭДТА, 50 мМ НаС1 и хроматографиро-вали на колонке (2,2 х НО см) с сефадексом G-T5. Фракции с вы- ■ сокой TTi-аэной активностью объединяли, добавляли глицерин до конечной концентрации 20% и-наносили на колонку (1,3 х 8 сы) с ДЭАЭ-тойо перлом 550М, уразноаааеннув 25 ыМ трис-HCI буфером, рН 7,4, с 0,2 мМ дЦТк, 50 mü SaCl и 20$ глицерином. Элгоцкю проводили линейным градиентом H&CI от 50 до 400 мМ. Активные фракции объединяли,-диализогали против 1,5 л 10 мЫ трис-малеатного буфера, рй 6,5, с 0,2 мМ 8ДТА и 50 mü KaCl к наносили на колонку (0,5 х 3 см) с голубой сефарозой, уравновешенную тем ке буфером. Десорбцию белка осуществляли линейнш градиентом рН и глицерина (исходный буфер, рН 6,5 - 25 мМ трис-HCI буфер, рН 8,1, содержащий 0,25 мМ ЭДТА, 50 мМ НаС1 и 40)£ глицерин).
Результаты очистки ТТз-азы суммированы в таблице I.
Таблица.I
Очистка гиаминтрифосфатазы из мозга быка
Стадия очистки
Белок,: Общая : Удельная '.Очистка, мг ;активность,;активностьраз
• ' с-1 • -I -I' : с : с *мг х:
Выход,
Экстракт 18868 , 3,01
Гидрофобная хро-
ыатография на 141,4 1,03
то йо перле НЗ-60
Сефадекс 0-75 10,9 .0,71
ДЭАЗ-тойоперд 0,24 0,27 óóCM
Голубая сефароэа 0,015 0,17
1,6-Ю~4
7,3-Ю-3
6,5-Ю'2 1,12
10,8
46
405 7000
100
34
23 8,9
68000 5,5
Прегярат ТЕФ-азы был гомогенен при электрофорезе в ПААГ к m содержал пргасескыс фогфат&зкьж акглвкзегей. Ощщвншй фзр~
мент проявлял абсолатнуп специфичность 8 ГГФ.
Определенная методом гель-фильтргщии молекулярная масса нативной ТТФ-азы оценивается в 33500 Да, что хорошо согласуется с литературными данными для аналогичных белков из мозга и печени крысы (Ыг 30000 Да (Penttinen, Uotila, t98l}). В присутствии ДСН денатурированный фермент мигрировал в веде одной белковой полосы с электрофоретической подвижностью, соответствующей молекулярной массе 33900 Да. Полученные данкуе, таш образом, свидетельствуют об отсутствии у ГГФ-азы козга быка четвертичной • структуры. ' _ . j ■
Распоедзлензв ТТФ-азноЯ активности в организме. Субклеточная локализация (бзриента в мозге. •
Гидроляз ÏT& с различной скоростьп протекает во всех исследованных нами тканях быка. Гидролитическая активность спинного козга составляла 15,06 ниоль• , головного -12,83, по-
чек - 10,39, сердца - 6,46, мышц - 5,71, легки - 3,5, селезенки - 2,46 и печени - 1,82 нмоль'кшг^'мг""*. Как следует из приведенных данных наиболее высокая активность ÎTS-ssh характерна для возбудимых тканей и почек - систем организма с высокой кн-тенсивностьп трансиеибранных потоков коков Sa+ . Basa угтаналооь о гипотезе, связываний метаболические превращения (гадродкз) ТГФ с циклом регулирования Bsf-канала в нервной тквка (ScircîTe-aiels, Karglneeaa, is85). Присутствие TTS и высокая активность ТТ®-азы в различных органах н тканях деа? осковакае предполагать универсальную роль, данного соеддаз!тя в гхеткэх разка: та поп (не только а керзноЯ сксгеыз), cssssis^a с йсетрояем врокщае-кости мембран для «оков Па"*".
Исследование р!1-га£лскмзсгл • гадрохнза TTiï гскгогзгжша взз-га показало, 'сто какскь'аяъкгщ гетявкостъ паблздается срз рЯ 0»?- } 8,8. Анализ субклеточного распрэдглсгая ^арггита пра дыши! 03- ; пягальноц зкачеша водородного показателя ссхдетольстсуо?, :
основная часть ТГЗ~азноЯ зктнкгасгз кажется сяедсгЕйва деЕстпал < цитозольксго фзругнта, поскольку в растмргкоЯ фраяцкв sz&na } локагшзозако около 85$ асСопз'вгавляя çyseeïsoseane tps- < тозолькоа вбсоязгяо- стср&чной к суSsrpssy 3T§-ssa с «сибдоггэа 1 • еокалозетей (Seteu«e, Coepoe, 10i)' n -tsSMfij»KiafiSi '.. }
7№, tmjwi» предстаг-«», «я»-*»»®» фр«»» вмются-^ rapstùipKicvxsi къябрщяга «sssfîi. Згяя«5гя«»*ж$а &tejqrî3ïy? ' J. сгж>т- cdfeEsjjBSKSW ftstst 'вер-.. ; ,
ТТ4> мП
Рис. I. Зависимость начальной скорости ТГ5-езной реакции от концентрации ТТ§ (А). Б - то же в обратных координатах
мента (высаливание, сорбция на носителях при низкой концентрации (]П;4)2зо4 ) и результаты гистохигагееских исследований, согласно которым .при рЯ 9,2 Т1Ф-расцепляющая активность мозга крысы локализована в области плазматической мембраны и синапсов (Ода-да et а!., 1975).
■ Кинетические исследования ТТФ-азы Как показано на рис. ЗА, зависимость начальной скорости реакции от концентрации ГЕй описывается двухфазной кривой спро-у.ехуточным плато. Трансформация в двойных обратных координатах приводит к линеаризации обеих ез ветвей, на графше при заом на-Сладчется выраженный паролем (ркс. 1Б). Такой характер кривой насыщения, на кап взгляд, г.:з:кко объяснить исходя из предс-тазле-н.;.-; о двух кинетически различимых изомерных формах Пй-азы, равновесие кехду которыми определяется концентрацией субстрата: при ысльгс кою;ейтрацйях ТТ£ преобладает юэрид, с_богюаэй аффинностью * субстрату (К^. 43 гжй; 7,,акс 2,9 шаюль-с"-^?"1 (рис. 1Е)>» повькагею коццзнгршрл Тй индуцирует обраткшй пгреход белка б Солей аггпзнуз <Ьр:лу с яасггч сродством к су£сграту (К., 203
Рис. 2. Температурная зависимость начальной скорости ТТФ-азной реакции (А). В - то.зз в координатах т,$ у от ч/т
тггшяс 19,3 мкмоль-с~1?мх'"1).
Обоснованность выдвинутого нами предположения подтверждается характером влияния температуры на активность фермента (рис.2). Температурная зависимость начальной скорости реакция исследовалась при концентрации ТТШ 160 мкМ, что соответствует 4 К^ для формы ТТФ-азы с высоким сродством к субстрату и позволяет говорить о насыщении белка, т. е. исследовании действия температуры на 7макс' и справеДдавостн использования уравнения Аррениуса (Келети, IS90). Построенный в координатах Аррзнауса график имеет достаточно отчетливый перелом (рис. 2Б). Наблюдаемое изменение наклона прямой, очевидно, является результатом протекания в системе двух параллельных реакций гидролиза вследствие присутствия при данной концентрации ТТЙ двух форм <$еркента, обладающих различной активностью. и характеризуются раэнгаог энергия»® мгаивя-ции. Температура оказывает влияние на положение равновесия, сдвигая его в сторону изомера с больной идталитичсско4? активностью и более низкой энергией активации. Численные значения с-н«т>-гий активации, рассчитанные из рис. 2Б, для двух изомерных форм TTí-азы составляют 65,278 гда/г-оль и 47,173 кДа/шль.
Очищенный фермент проявляет абсолютную зависимость от ионов двухвалектнах металлов, среда которых наиболее высокой актишту-способностью выделяется катионы Так хан ТТ-3 обдчдзз?
зпео:сой хэяатирузкдай способность» к ясна! копия (Barsbi, Vial-г*> полагать, что ITS комплекс ¡алеется истин-
:~:л -VócrpaTo-j Х-ГЗ-ази. »Ьрвздекзнч ks^i асыакзазэкия показет-гот, иг-:.!!»«.?--? в ржцз: из ?одь:со гоппонон -
1/|/0 Б
0.1
05 ИЗ .15
1/5, ИМ4
ее, иМ
Рис. 3. Зависимость начальной скорости ТШ-азной реакции от свободных ионов Ме2+ при различных концентрациях ТТ©: о—® ~ 0,05 иМ, о—о - 0,5 м1! (А). Б -'определение Кц для Не2+сЬоб
ТТФ комплекса. Свободные ионы магния выступают в качестве необходимого активатора фермента: гидролиз ТТФ.не осуществляется при рассчитанной концентрации Кв2своб нижа 0,1 мК. Активация свободными ионами металла носит сложный характер и является функцией концентрации ГЮ (рис. ЗА), что может быть отражением имеющего ыесго перехода белка из одной формы в другу» при увеличении концентрации субстрата. Кажущаяся \ для ^своб Равна
Регуляция активности ТШ-азы
Проведенные нами эксперименты показали, что различные нук-леозидфосфатн ингибируют фермент по частично смешанному типу, причем эффективность ингибитора (величина Кр главнш образом определяется количеством фосфатных остатков .2 его шлекуле (К| НТ$из чего следует, что фосфатсодерка^ий фрагмент вносит основной Е1слад в сгязшаниа л определяет прочность комплекса ингибитор-ТШ-аза. Чтобы установить какие компонента молекулы ингибитора препятствуют связывании субстрата, а какие его превращении, изучалось влияние на активность фермента адекозииа и . Как оказалось еденозон Ы таатн) .кнгибирует реакции по неконкурентно,^, и гг^ - по конкурентному типу. Полученные результаты свидетельствует, что фэсфаткыз группы ингибитора и субстрата взишодейстеувт с 'субсг^йтоаязкващки участком активного денгра Ив-аэы, -загдакак прав:аькая ориентация теекиновой «асам квейходйма-дам его ююааивтекого расцепления. К| 'да АТС (1,6 «Ш дат в. обсас5и'-фв8вологй«!ской квкц*н*рац88 данного соединении и.'шэго, чк> дозваяя«?- юаорииго -еозкдааздй рггу-
ную скорость реакции (В)
ляции им активности ITS-аз и в клетке.
Еще один механизм -регуляции ферыента, вероятно, связан с ал-лостзрическим дойсгзием ТТФ, шздуцирущего переход ТГФ-аэы из одной активной конформации в другую. Несмотря на то, что общая концентрация ТТО э мозге по данным ВЭЖ (Ishii et al-, 1979; Hetten-dorff at al., 1985) составляет 0,04-0,07 мхМ, учитывая его локализацию в области плазматической мембраны (Kataudar Cooper, 1981) исходя из простых арифметических вычислений объемов сфер и цилиндров, соответствующих диаметрам тел и аксонов нервных клеток, реально олсидать существования локальной концентрации ТТФ на три порядка выше, т. е. в пределах 50-100 мкМ, что соответствует диапазону концентраций, в котором осуществляется переход между изофэргшми фермента.
Третий путь регуляции ТШ-азы in viro , по-Еидшому, связан с активацией свободными ионами концентрация которых в клет-
ке составляет менее 0,4 мМ (Purlch, Уготи, 1972). Рассчитанная нами Ку для Ks2qqo<j равна 1,3 мй. Данное обстоятельство может существенным образец определять скорость ТГФ-азной реакции, поскольку при такой соотношении величин (^своб^^ реакция приближается к первому порядку, и лабыэ незначительные изменения концентрации ионов металла будут вести к сравнительно большим изменениям скорости реакции.
Взаимодействие ТТй-азы с субстратом
рК аминокислотного остатка в связывающем участке активной центра ТТФ-азы, установленное из рН-зависимости Км для ТТ£, ум. ет значение 9,2 (рис. 4А), что может соответствовать константе ионизации £-аминогруппы лизина (Диксон, Узбй, 1982). Находясь преимущественно в протокированкой форме при рН<9,2, данная гру па способна легко взаимодействовать с отрицательным фосфатным радикалом ГТФ посредством электростатического притязания, что, вероятно, является первой стадией образования фэрмзнт-субстрат ного комплекса. Сравнение для нуклеозадфосфатов, содеркадмх различное количество фосфатных остатков, говорит о присутствии не менее двух остатков лизина в активном центре ТТФ-азы..-
Применение аналогов-тиамина и ТГФ с замещениями пиримидин вого и тиазодового циклов дало возможность установить, какие группы субстрата участвуют во взаимодействии с каталитическим участком активного центра фермента, приводящем к правильной ор ентации ТТ£ и разложению образующегося функционально активного фермент-субстратного комплекса на свободный фермент и продукть Согласно полученным нами результатам, вашая роль в связыванш с каталитическим участком принадлежит аминогруппе пиршидиновс го кольца молекулы П2> и гидрофобным силам, .тогда как взаимод* ствие четвертичного азота тиазола с соответствув^ей группой ш тивного центра фермента приводит к непосредственно!.*-/ гидролиз терминального фосфата субстрата.
рК аминокислотных остатков активного центра, определенно! состояние ионизации которых необходимо для гидролиза ТШ, рав; 7,8 и 9,8 (рис. 4Б) и могут соответствовать «¿-аминогруппе и г; роксилу тирозина. Падение активности ТТй-азы, набявд£Ш?ззся п; сдвиге рН от оптимума (рис 43) в кислуа сторону, в таком случ объясняется протонированиеы вшшназванной аминогруппы, так чг приобретенный еа положительный заряд в значительной мере прегг ствует образования водородной связи меззду одной из близлогзл;;: карбонильных групп пецтидаой связи и -Кн2 группой ниршкдкиа лакулы ТТ£, а также ослабляет гидрофобяыз взашодзйствш;, еле .стонем чего является нарутвппе правильной флвеецш субсгрс-ти. йоляо полагать, -чю падение активности в.енлшо палочной обла «и - следствие" козизе^в -Ш группы тирозина. Нвходясь при рй ••ниев. 9,8 ареицуезственно в -ш фс-р,»,- шззукйзекн&к группа к . сет частичка« хюаовмтейшый а&рвд ва ето^о водорода. Сита отталкивания •иекцу е?ка' еерядои и -.иойоекз-ально
азотом тимола, вероятно, и приводят к окончательной деформации субсттата и разрыву связи между?" и *-атомами ¿осйора. Действительно, восстановление четвертичного азота ТК (потеря положительного заряда, тиохром- и тетрагидротиаминтрифосфат) делает невозможным осуществление катализа. К этому приводит и диссоциация протона гидроксила тирозина в активном центре (появление отрицательного заряда).'
На рисунке 5А представлена кривая насыщения lia-азы uiw,
отражающая переход белка из- одной изофорш в другую. При низких концентрациях OTT® или Ш фермент практически полностью представлен формой с высоким сродством к "Ш 43,3 мкМ) и абсолютно к нему специфичной. По мере повышения концентрации OTTS (или ТТФ) начинает взаимодействовать помимо активного с другим (алло-стерическим) центром, индуцируя изменение конформации белковой молекулы и переход ее в более активную форму, что сопровождается снижением специфичности фермента (приобретает способность расщеплять 0ТЩ. При концентрации OTTS или ТТФ порядка 0,2 мЫ Шг-аза представлена практически полностью второй формой ( 30.5 для OTTS 0,3-0,4 мМ (рис. 5Б), что совпадает со значением \ для
TIS - 0,298 мМ (рис. 1Б)).
Вызе мы рассматривали взаимодействие ТТФ-азы с формой фермента с большим сродством к ТТФ, так как влияние pH на активность исследовалось при низких концентрациях субстрата, й этих условиях ОТТФ не гидролизуется (рис. 5Ä) возможно потому, что гядроксильная группа ОТ находится преимущественно з оксоформе ic=o л не способна к образования водородной связи с карбониль-
cysctpatj ?lS1
F;ic. 5. Зависимость начальной сгошета ГГ'З^азной реакции от
концзнтрацли субстрата. А - в прлза
f- G'I
го
-ьзрка
ной группой пептидной связи. Яри переходе фермента под действием ОТТФ в другую изомерную форму конформация белка, по-видимому, изменяется так, что столь жесткая ориентация субстрата в активном центре не является обязательным условием осуществления катализа.
Формальный механизм ТТФ-азной реакции
Поскольку для ферментативного гидролиза ТТФ абсолютно необходимо присутствие свободных ионов последний может рассматриваться как субстрат, не подвергающийся превращению (Диксон, Уэбб, 1982), а реакция анализироваться при помощи уравнений для двухсубстратаных систем. Зависимость начальной скорости ТТФ-азной реакции от концентрации ТГФ при различных фиксированных концентрациях в двойных обратных координатах представляет со-.бой серив прямых, пересекающихся на оси абсцисс. Аналогичная картина наблюдается и для зависимости скорости гидролиза от Ц£2н в условиях фиксированных концентраций ТТ$. Пересечение прямых в обоих случаях на оси абсцисс предполагает неупорядоченный механизм с образованием тройного комплекса и полностью независимым присоединением субстратов.
ВЫВОДЫ
1. Из мозга быка впервые получен электрофоретически гомогенный препарат • тиаминтрифосфатазы со степзньтз очистки 63000 раз и выходом 5,5%, Установлено, что фермент состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой 33900 Да, является ме-талл-зависикыи и обладает абсолютной специфичностью к субстрата
2. Из пивных дрогшей выделен и стабилизирован ферментный комплекс АДГ и ЦЦК для количественного определения ГДО. Продло-кен оптимизированный метод ферментативного определения микроко-лвчеств ТД5 (1-40 пмоль).
• 3. Разработан метод измерения активности 'ХТй-азы по количеству образующегося в реакции 2Д», обледеащий высокой чувства тельносхь» и специфичностью.
4. Показана-взаикссек&ъ иеаду акгивкостьо ТТФ-аан и гая-он сивиостьв/традсшекбрыввзк лотокев иоиоа Ев1' в различных тканях -<5кка. Продемонстрирована щмговоаьная локализация фзраокта а кя ткйх иовга, .■
'-'175. Изучение стационарной 'кннепгаи указывав? на существование двух изомерных кинетически различимых форм ТГФ-азн, равновесие между которыми определяется концентрацией ИЗ.
6. Ванная роль з образовании активного комплекса с ферментом принадлежит гидрофобный сияаы, аминогруппе пиримидииового кольца, четвертичному азогу тказола и фсфоркохясяому радикалу молекулы 113.
7. Вероятные механизм регуляции- Т1Ф-азы включаит ингибиро-вание-ATS, конто роль за соотношением йзоформ фермента под влиянием концентрации ТТФ и активацте свободными' конами магния.
3. Реакция, катализируемая ГГФ-азой, протачает с образованием тройного формант-субстратного комплекса с неупорядоченным присоединением субстратов.
ОскоЕНое содержание диссертации отражают следувдио работы:
1. Чарк1кев1ч X.11., Манарчшсау к Л., Лучко Т.А. Вызначэнне тыягЛнтрыфасфзтазнай актьунасц! па каицзнтрацы1 тыям1ндыфасфату Ц Весц1 АН БССР» сер. б!ял. - 1990. - & 4. - С. 65-68.
2. -Черникевич Й.И., Гриценко Э.А.» Макарчиков А.Ф. Способ получения ферментного препарата для количественного определения ткаюшдифас'фата в биологических объектах: Авторское свидетельство СССР № 1620483. - Бол. № 2, 1991.
3. Черникевич И.П., Гриценно Э.А., Макарчиков А.Ф., Воскобоев А.И. Ферментативный микрометод количественного определения тияминдифэсфата в биологических жидкостях // Прикл. биохим. и микробиол..- 1991. - Т.27. - Бып.5. - С. 762-771.
4. Ыакарчиков А А. Изучение тиадантрифосфатаэн (тиаюштри-фэсфат-фосфогидролаза (К§ 3.6.1.28)) мозга быка // Тез. 7 Гродненской конференции молодых учгшк. - Гродно, 1991. - С. 36.
5. Hakarchllcov A.?., Ciieraifcsvioh, I.P. Studies on ThiaHine ffriphocpiiataae (2S 3.6.1.29) froa Sovias Brain: Purification and Properties // 1-st International Congress on "Vitamins and Bio-factora in btfe Science". - КоЬз, tSSI.-^dvaneo Program, p. 23.
6. MakarehikoY A.F., Cherniknvich I.P. Purifioaticn and Characterisation of Shicsair,® Sriphospiintase fronr Bovine Brain // Biocbls. at Slophys. £ot*. - 1992. - Vol. 1117tHo. 3. P. 326
зза. . "
Подгпсаго s аочгтл I5.II.IS93 p. Ззк. 100 экз.
*'РЭДКзясяого государста^яюго •
- Макарчиков, Александр Федорович
- кандидата биологических наук
- Смоленск, 1993
- ВАК 03.00.04
- Множественные формы тиаминтрифосфатазы в почках быка
- Некоторые физико-химические и кинетические свойства сорбитдегидрогеназы
- Очистка и исследование аденозиндезаминазы из пяти отделов мозга крупного рогатого скота
- Кислые медьсодержащие белки гловного мозга млекопитающих. Их очистные свойства
- Свойства опиатсвязывающих белков, изолированных из синаптических мембран мозга крыс