Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Некоторые физико-химические и кинетические свойства сорбитдегидрогеназы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Некоторые физико-химические и кинетические свойства сорбитдегидрогеназы"

Р Г б Ой 2 2 МАЙ 1335

На правах рукописи УДК 577.152.141

ЖАРМУХАМЕДОВА ТАТЬЯНА ЮРЬЕВНА

НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА С0РБИТДЕГИДР0ГЕНАЗЫ

03.00.04. - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1ШЦИН0, 1995 г.

Работа выполнена на кафедре физико-химической биологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: кандидат медицинских наук, доцент В.Е. Судовцов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор М.Н. Кондрашова, кандидат биологических наук, ст.н.с. Т.В. Кулаковская

Ведущая организация: Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Защита состоится _1995 г. в__часов на заседании

Специализированного совета по биохимии Д.200.29.01 при Институте почвоведения и фотосинтеза Российской Академии Наук по адресу: 142292, г. Пущино, Московской обл., Институт почвоведения и фотосинтеза РАН, БОН, большой конференцзал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института почвоведения и фотосинтеза РАН.

Автореферат разослан "_"_1995 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

Б.Н. Иванов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Сорбитдегидрогеназа (СДГ) - фермент, широко распостраненный в клетках прокариотов (Horwitz et al.t 1964) и эукариотов (Lenning, 1984). СДГ осуществляет обратимое, NAD'''-зависимое дегидрирование сорбита до фруктозы. Функционирование полиоль-ного пути метаболизма глюкозы, ключевым ферментом которого служит СДГ, имеет важное физиологическое значение: 1) как аварийный путь снижения алиментарной гипергликемии 2) как система, обеспечивающая трансгидрогеназную реакцию (передача восстановительных эквивалентов в системе nad/nadph з) как источник глицерина в обмене липидов.

Первая публикация о выделении и частичной очистке СДГ появилась еще в 1962 году (Smith, 1962), но только в 80-ых годах возник значительный научный интерес к исследованию функционирования поли-ольного пути и СДГ. Он бил ишщшгосван принятием предположения об обусловленности возникновения диабетических патологий осмотическим дисбалансом клетки, который, в свою очередь, напрямую зависит от активности СДГ (Kinoshita et al., 1981). В условиях диабетической гипергликемии количество метаболизирусмой через этот путь глюкозы возрастает. Это приводит к накоплению сорбита в клетках, который не способен проникать через клеточные мембраны, и осмотическому дисбалансу, инициируя, таким образом, развитие диабетических осложнений (катаракта, отек мозга, ретинопатия, нейропатия). Несмотря на активное изучение этого вопроса сведений в литературе об условиях функционирования и свойствах СДГ мало.

В связи с этим, исследование функционирования СДГ в норме и патологии, возможностей и принципов регуляции ее активности является актуальным и имеет важное научное значение.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление функционирования полиольного пути метаболизма глюкозы в печени и изучение некоторых физико-химических и кинетических свойств СДГ. При этом решались следующие задачи: 1) подбор условий выделения, очистки и хранения СДГ из цитоплазмы клеток печени быка; 2) определение оптимума рН, молекулярной массы, зависимости от температуры и ионной силы, выявление множественных молекулярных форм фермента; 3) исследование кинетических характеристик СДГ из печени быка при различных значениях рН; 4) влияние Сахаров и фосфосахаров, некоторых ингибиторов; 5) изучение стереоспецифичности; 6) проведение сравнительного анализа активностей СДГ с ферментами маркерами -алкогольдегидрогеназой (АДГ) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой (Г6ФДГ).

Научная новизна работы. Нами установлено, что в печени быка.

крысы, суслика и собаки активно функционирует полиольный путь метаболизма глюкозы. Выявлено ингибирующее действие ряда углеводов и продуктов их метаболизма на активность СДГ. Полученные результаты могут свидетельствовать в пользу регуляторного влияния фосфосахаров на функционирование полиольного пути в печени. Изучение стереоспе-цифичности СДГ показало, что на ферментативную активность влияет не только цис-2,4 дигидроксиконфигуращя, но и длина углеродной цепи полиола. Данные кинетических исследований СДГ выявили, что в щелочных условиях (рН 9,0 и 10,0) и концентрации субстрата (3,0-4,0 мМ) фермент начинает проявлять кооперативные свойства, о чем свидетельствует увеличение коэффициента Хилла. Подробно изучено влияние ионной силы, температуры и рН на активность СДГ.

Практическая значимость работы. Представленные в диссертации результаты расширяют и углубляют сведения о полиольном пути метаболизма глюкозы. Выявление активного функционирования этого пути и условий его регуляции в норме и патологии, а также изучение физико-химических и кинетических характеристик СДГ, может способствовать разработке лекарственных препаратов при лечении диабета и диабетических осложнений. Полученные данные могут также найти применение в медико-биологической практике, в биотехнологии.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции молодых ученых (Пущино, 1988), Всесоюзной конференции по гибернации (Пущино, 1990), заседании кафедры физико-химической биологии МГУ (1992) и расширенном семинаре кафедры физико-химической биологии МГУ (1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (методы и объект исследования), пяти глав, представляющих основные результаты работы и их обсуждение, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на стр машинописного текста, содержит 27 рисунков и 7 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературных данных составляет первую часть диссертации. В нем изложены современные представления о полиольном пути метаболизма глюкозы. Сделан обзор данных по методам выделения СДГ, физико-химическим и кинетическим свойствам.

Объект и методы исследования. В работе использовали СДГ из цитоплазмы клеток печени. За основу выделения и очистки выбрали методику описанную (Smith, 1961). Белок определяли по Лоури (Lowry et

ai., 1951). Определение чистоты ферментного препарата проводили диск-электрофорезом по общепринятой методике (Маурер, 1971). Выявление множественности молекулярных форм проводили гистохимическим методом (Shenker et al., 1971). Реактивы для гель-электрофореза были дважды перекристаллизованы. Молекулярную массу СДГ определяли методом гель-хроматографии на сефадексе G-150 (Доис, 1983). О ферментативной активности судили по начальной скорости реакции (vQ). Активность СДГ определяли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре по изменению оптической плотности при 340 нм и выражали в мМ NADH в минуту на мг белка (Доис, 1983). Константу Михаэлиса (Кт) и максимальную скорость (У) определяли из графиков (Диксон и Уэбб, 1982). Состав инкубационной среда: 2 мл трис-HCL буфера (50 мМ, рН 8,0), содержащего NaCL (100 мМ), NAD+ (1 мМ) и 40 мкл (1,2-2,0 мг бежа) ферментного препарата. Реакцию начинали добавлением в опытную кювету раствора сорбита (20 мМ). 1 условная единица на графике соответствует 1 мМ nadh в минуту на мг белка.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА С0РБИТДЕГЭДР0ГЕНАЗЫ Влияние рН. Кривая зависимости активности СДГ от рН среды имеет острый пик при рН 9,о. Наблюдается резкий подаем ферментативной активности от рН 7,0 до рН 9,0 и затем относительно медленный ее

. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕНИЕ

18

------

12

6

О

б

8

10

12

рН среды

Рис. 1. Зависимость активности сорбитдегидрогеназы из печени _быка от рн среды._

спад до рН 12,0. Так при закислении среды инкубации до рН 7,0 активность фермента падает на 55%, а при защелачивании до рН 12,0 -только на 20% (рис. 1). Подобный профиль получен нами для СДГ из печени теленка. Влияние рН также изучено для СДГ из печени собаки, суслика, курицы, домашней утки, фазана обыкновенного и кряквы.

Влияние температуры на стабильность СДГ из печени быка изучали • в диапазоне температур 5-60°С. Наблюдали подъем ферментативной активности от 1 ,о до 1э мМ ыащ на мг белка в минуту в интервале температур от 5°С до 40°С. При 42°С начиналось резкое падение активности, а при 5Э°0 наступала полная инактивация СДГ.

Изучено изменение активности СДГ во времени при 35° и 45°. Установлено, что при Э5°С фермент практически не менял свою активность в течении эо минут. При 45 СДГ инактивировалась на 50% в течении 15 минут и на 70% в течении эо минут. Таким образом, оптимальной температурой при работе с СДГ является температура 30-35°, при которой активность фермента оставалась достаточно высокой и не изменялась в течении 30 минут.

Влияние ионной силы. Увеличение ионной силы буфера приводило к увеличению активности СДГ (с 55%) (в отсутствие в буфере ИаСЬ) до 96% (при ионной силе 0,75). При дальнейшем увеличении ионной силы наблюдали медленное снижение (до 87%) активности фермента цри ионной силе 1,5. Возможно, ионная сила стабилизирует фермент, снижая процесс агрегации белка, поддерживая структуру фермента в активной конформации.

Субстратная специфичность.. Для оценки субстратной специфичности изучали влияние сорбита, ксилита, рибита, маннита, дульцита, эритрита, глицерина и глюкозы на активность СДГ из печени быка и суслика, в диапазоне концентраций (5-1оо мМ).

Высокая активность СДГ из печени быка наблюдалась при использовании в качестве субстрата сорбита (юо%) и ксилита (91%). Скорость дегидрирования рибита составила 25%. Полное отсутствие активности СДГ имело место при использовании в качестве субстрата маннита, дульцита, эритрита, глицерина и глюкозы, как при различных величинах рН, так и в широком диапазоне концентраций. Для СДГ из печени суслика активность фермента с сорбитом в качестве субстрата составила юо%, ксилитом - 50%, рибитом - 13% и маннитом 2%. Полученные результаты в основном согласуются с данными литературы для СДГ из печени крысы ЫеИет^у & <1огг№а11., 1983), овцы (С1етег^ е1; а1., 1968) и лошади (ВаШеу еЬ а1., 1981).

Стереослецифичность. Высокая активность СДГ по отношению к сорбиту, ксилиту и рибиту подтверждает мнение Эдсона об определен-

ной стереоспецифичности фермента: дегидрируемый полиол должен обладать цис-2,4-дигидроксиконфигурацией и трансориентированным гидро-ксилом у 3-го углеродного атома (Edson, 1954, Hollmann, 1959). Анализ активности СДГ из разных источников (печень быка и суслика) в присуствии разных полиолов и Сахаров подтвердил это мнение. Кроме этого, нами установлено, что длина углеродной цепи (сорбит - сб, ксилит - С5; рибит - С5, эритрит - Сд) также влияет на скорость дегидрирования полиола. Наблюдали снижение активности СДГ при использовании их в качестве субстратов по мере уменьшения длины углеродной цепи. Выявленная нами закономерность прослеживалась у СДГ из печени быка и суслика (наши данные), лошади (Bailley et al., 1981), овцы (Clement et al., 1968), крысы (Jeffery & Jomvall.. 1983). Следовательно, для каталитической активности СДГ помимо структурного требования Эдсона определенное значение имеет и длина улеродной цепи полиола.

Множественные молекулярные формы СДГ из печени быка. Литературные данные о молекулярной гетерогенности СДГ противоречивы. В цитоплазме клеток печени суслика методом нативного диск-электрофореза с последующим гистохимическим анализом активности СДГ выявлена одна форма фермента (Судовцов и Гречкина, 1985). В цитоплазме клеток мозга млекопитающих (бык, морская свинка, хомяк, крыса, мышь) зарегистрировано от 5 до 7 молекулярных форм СДГ (Судовцов и Асла-ниди, 1990). Нами этим же методом обнаружено 6 зон ферментативной активности с величинами относительной электрофоретической подвижности (ОЭП) равными 0.387, О.338, 0.226, 0.193, 0.129 и 0.074. Зоны отличались интенсивностью окраски и шириной.

Определение молекулярной массы. Молекулярную массу СДГ из печени быка определяли методом гель-хроматографии на сефадексе G-150. В качестве маркеров использовали пероксидазу (М.м. - 40.000), гек-сокиназу (М.м. - ЮО.ООО), АДГ из дрожжей (М.м. - 148.000) и ката-лазу (М.м. - 280.000). Строили график зависимости логарифма М.м. маркера от объема элюции. М.м. СДГ из печени быка определяли по графику путем интерполирования. Наш фермент выходил в том же объеме, что и АДГ из дрожжей, т.е. М.м. СДГ из печени быка составляет 145.000 - 150.000.

Зависимость vp от концентрации субстрата при различных значениях pH. Одним из существенных факторов регуляции ферментативной активности является pH. В связи с этим исследовали зависимость активности СДГ из печени быка от концентрации сорбита при значениях pH (7,0, 7,5, 8,0, 9,0 и 10,0) (рис. 2). Показано, что зависимость

20

10

о1- ч

0 2 4 6 8 10 [сорбит], мМ

-1

0.3 усл.ед. / •

0.2

0.1 1 1 ......1...... 1

-0.6 -0.2 0.2 О.в 1.0

[сорбит], мМ

Рис.2 . Зависимость активности сорбитдегидрогеназы из печени быка от концентрации сорбита при значениях рН среды равных: 7,0 (1), 7,5 (2), 8,0 (3), 9,0 (4) и 10,0 (5). А - прямые, Б - двойные обратные координаты.

аачальной скорости реакции (у0) от концентрации сорбита [30] при рН 7,0, 7,5 и 8,0 имеет гиперболическую форму с величинами равными, соответственно, Э,3*10~3, 2,Э*10~3, и 2,08~3 М. При рН 9,0 и 10,0 наблюдается сложная кривая зависимости от [зоЬ При низких концентрациях (0,25 - 3,0 мМ) сорбита активность СДГ резко возрастает, затем в диапазоне концентраций (3,25 - 4,0 мМ) она замедляется, образуя так называемое "промежуточное плато". Дальнейшее повышение концентрации сорбита до 10 мМ приводит к монотонному повышению активности фермента (рис. 2).

Наличие промежуточного плато в кинетике ферментативных реакций свидетельствует о проявлении кооперативных свойств фермента (Курганов с соавт., 1975). Рассматривая такие данные в координатах Хилла, можно более полно охарактеризовать кооперативные свойства фермента. Коэффициет Хилла (г^) указывает на число центров связывания фермента с субстратом (Диксон и Уэбб, 1982). Этот коэффициент, в изучаемой наш реакции, зависит от концентрации субстрата. При низких концентрациях сорбита (до з мМ) Пд равен 1,0 и 1,16, соответственно, при рН 9,0 и 10,0. При более высоких концентрациях сорбита (от э до ю мМ) - 2,4 при рН 9,0 и 2,18 при рН 10,0. Возможно, в щелочной области рН при варьировании концентраций субстрата наблюдается медленный переход от мономерной формы фермента к олигомер-ной, что имеет важное физиологическое значение.

Показателем сродства фермента к субстрату для гиперболических кривых зависимости у0 от [Б0] служит величина К,п. При увеличении рН от 7,0 до 8,0 наблюдается снижение величины с одновременным возрастанием максимальной скорости реакции (V) (рис. 2). Это указывает на увеличение сродства СДГ к субстрату. При дальнейшем защелачива-нии (рН 9,0 и 10,0) фермент переходит в новое конформационное состояние, при котором он проявляет положительную кооперативность (коэффициент Хилла равен примерно 2).

Концентрация фермента также может влиять на переход мономерной формы фермента к олигомерной (Каган, 1975). С этой целью исследовали зависимость у0 от [бо] при разных концентрациях СДГ в условиях фиксированной величины рН. Показано, что при повышении концентрации СДГ в инкубационной смеси происходит увеличение скорости ферментативной реакции (при 0,325 мг белка - 2,5; 0,455 мг белка - 4,0 и 0,655 мг белка - 5,7 мМ мш в минуту на мг бежа). Кт остается неизменной. Кривые зависимости имеют гиперболическую форму и подчиняются классической кинетике Михаэлиса-Ментена т.е. увеличение концентрации фермента не приводит к переходу мономерной формы фермента в олигомерную.

20

10

i?o, усл.ед.

а= =й=

о— —е— —о

Л-Л-А

I-1_1

6 10 15 20

[NAD+], М*10"5

0.3 усл.ед. 1

0.2 тг

3

t

-0.6

-0.3 0.0

0.3

0.6

[NAD ]

,+ 1 -1

Рис.3. Зависимость активности сорбитдегидрогеназы из печени быка от концентрации NAD+ при значениях рН среды равных: 7,0 (1), 7,5 (2), 8,0 (3), 9,0 (4) и 10,0 (5). А - прямые, Б - двойные обратные координаты.

Зависимость vp от концентрации NAB* при различных значениях рН Активность СДГ из цитоплазмы клеток печени быка, суслика, собаки, дикой и домашней утки, курицы и фазана обыкновенного проявлялась только в присутствии nad+. В присутствии nadp+ фермент не проявлял никакой активности. Т.е. СДГ обладает строгой коферментной специфичностью. Это согласуется с данными полученными для СДГ другими авторами, (Smith, 1962; Van Heiningen, 1962; Winegrad et al., 1972; Jedziniak and Yates, 1973; Regh. and Toraok, 1977; Bailey et al., 1981; Jeffery and Jornvall, 1983; O'Brien et al., 1983; Судовцов И Гречкина, 1986).

При изучении зависимости vQ от концентрации nad+ при различных величинах рН (7,0; 7,5; 8,0; 9,0; 10,0) и фиксированной концентрации сорбита (20 мМ) показано, что кривые зависимости имеют гиперболическую форму (рис. 3). По мере роста рН происходит постепенное увеличение скорости реакции до ее максимального значения: рН 7,0 - 1,75; рН 7,5 - 2,5; рН 8,0 - 3,5; рН 9,0 - 4,2; рН 10,0 -4,25 мМ nadh на 1 мг белка за 1 минуту. Наблюдается постепенное затруднение связывания фермента с nad+, о чем свидетельствует увеличение величины Кщ: 2.94*10_5М (рН 7,0), 3,64*Ю~5 М (рН 7,5), 4,1*10-5 М (рН 8,0), 4,76*10-5 М (рН 9,0 и 10,0). Это, по-видимому, связано с изменением ионизации (депротонированием) аминокислотных групп фермента, участвующих в связывании фермента с nad+. Идентифицировать эти группы трудно и требуются специальные исследования.

ВЛИЯНИЕ САХАРОВ И ИХ Ф0СФ0ПР0ИЗВ0ДНЫХ НА АКТИВНОСТЬ СОРБИТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Для выяснения условий функционирования СДГ, как ключевого фермента полиольного пути метаболизма глюкозы, исследовали активность СДГ в соокислительных условиях. Для этого в среду инкубации добавляли в субстратных концентрациях (10-40 мМ): L-арабинозу, L- и D-маннозу, ь-сорбозу, L-рамнозу, L-рибозу, ь-галактозу, ь-ксилозу, глюкозу, фруктозу и их фосфорные производные: глюкозо-1-фосфат, глкжозо-6-фосфат, фруктозо-6-фосфат и фруктозо- 1,6-дифосфат.

Было выявлено, что добавление глюкозы, маинозы и L-арабинозы приводит к минимальному (не более 10%) торможению активности СДГ. Слабый эффект (торможение активности на 12% и 13%) наблюдался при добавлении рибозы и галактозы. Максимальный эффект торможения отмечался для фруктозы (24%), сорбозы (20%) и ксилозы (18%).

Относительно высокий процент торможения активности СДГ в при-суствии фруктозы можно объяснить с позиции ингибирования конечным продуктом реакции, так как фруктоза образуется при окислении сорбита в присуствии nad+. Аналогично объясняется торможение в присутс-

твии сорбозы, имеющей стерическое сходство с фруктозой. Торможение активности СДГ в присутствии ксилозы можно объяснить исходя из структурного сходства его с ксилитом, который дегидрируется практически с такой же скоростью, что и сорбит.

Учитывая, что используемые нами концентрации Сахаров в физиологических уловиях не имеют места, можно сделать вывод, что их влияние на функционирование полиольного пути метаболизма глюкозы незначительно .

Поскольку из всех исследованных нами Сахаров максимальный ин-гибиругаций эффект был получен для сорбозы, ксилозы и фруктозы, эти соединения были взяты для выяснения типа ингибирования. Установлено, что кривые зависимости активности фермента от концентрации субстрата в присутствии Сахаров (20 мМ и 40 мМ) и фиксированном значении рН имеют гиперболическую форму и подчиняются классическим законам Михаэлиса-Ментена. В двойных обратных координатах величины Кт для фруктозы (контроль, 20 мМ и 40 мМ) составляют, соответственно, 2,94 мМ, 11,76 мМ, 33,33 мМ; ксилозы 2,857 мМ, 11,0 мМ, 50,0 мМ и сорбозы 2,77 мМ, 5,0 мМ, 9,09 мМ, т.е. с увеличением концентрации сахара отмечается увеличение значения Кю и снижение сродства фермента к субстрату.

Максимальная скорость реакции, определяемая в присутствии данных Сахаров также возрастает: для сорбозы, соответственно (контроль, 20 мМ и 40 мМ), 181,8, 238,1 и 294,1 мМ мабн в минуту на мг бежа; ксилозы: 181,2, 312,2 и 666,6 мМ N1011 в минуту на мг белка и фруктозы: 181,8, 285,7 и 500,0 мМ иа1)н в минуту на мг белка. в двойных обратных координатах пересечение прямых наблюдается в правом квадранте , т.е. это типичный пример псевдоингибирования фермента (Крупянко, 1990). Следовательно, влияние данных Сахаров на активность СДГ несущественно.

Особый интерес представляет изучение влияния на активность СДГ фосфосахаров, поскольку они являются важными интермедиатами глико-литического и пентозофосфатного путей метаболизма глюкозы. Добавление в субстратных концентрациях глюкозо-1-фосфата и глюкозо-6-фос-фата приводило к торможению активности СДГ из печени быка, соответственно, на 21,5% и 24,0%, а фруктозо-6-фосфата и фруктозо-1,6-ди-фосфата, соответственно, на 42,3% и на 100%. Анализируя этот факт, можно предположить, что фруктозофосфаты могут принимать участие в регуляции полиольного пути метаболизма глюкозы.

При выяснении типа ингибирования активности СДГ фосфосахарами (20 мМ и 40 мМ) установили, что для глюкозо-6-фосфата эта зависимость в прямых координатах имеет гиперболическую форму. Отсутствует

Б

-0.6 -0.2 0.2 0.6 1.0

[сорбит], мМ

Рис. 4. зависимость активности сорбитдегидрогеназы из печени быка от концентрации сорбита в отсутствие других добавок

(1) и в присутствии глюкозо-б-фосфата в концентрации 20 мМ

(2) и 40 мМ (3). А - прямые, Б - двойные обратные координаты

[сорбит], мМ

Рис. 5. зависимость активности сорбитдегидрогеназы из печени быка от концентрации сорбита в отсутствие других добавок

(1) и в присутствии фруктозо-6-фосфата в концентрации 20 мМ

(2) и 40 мМ (3). А - прямые, Б - двойные обратные координаты

влияние данного фосфосахара на связывание фермента с субстратом (одинаковые величины К - 2,56 мМ) (рис. 4). При увеличении концентрации глюкозо-6-фосфата наблюдается снижение максимальной скорости реакции (контроль, 20 мМ и 40 мМ), соответственно, 161,54, 142,8 и 127,54 мМ NADH в минуту на мг белка. В двойных обратных координатах прямые пересекаются на оси абсцисс в точке (~1/Кт;0). Это случай неконкурентного ингибирования, т.к. неконкурентные ингибиторы не влияют на связывание субстрата с ферментом, а изменяют только скорость ферментативной реакции.'

Фруктозо-6-фосфат ингибирует активность СДГ по конкурентному типу, т.е. субстрат и фосфосахар конкурируют за место связывания с ферментом. В двойных обратных координатах прямые пересекаются на оси ординат в точке (О; 1 /vQ ). При конкурентном ингибировании снижается сродство фермента к субстрату, максимальная скорость не меняется. Для фруктозо-6-фосфата получены следующие значения Кт, соответственно, (контроль, 20 мМ и 40 мМ) 2,8, 5,0 и 5.6 мМ, и максимальной скорости: 166,2 мМ NADH в минуту на мг белка (рис. 5).

Фруктозо-1,6-дифосфат ингибирует активность СДГ из печени быка по смешанному типу, который характеризуется затруднением связывания фермента с субстратом (увеличение Кт) и снижением максимальной ско-

Б

[сорбит], мМ

рис. 6. зависимость активности сорбитдегидрогеназы из печени быка от концентрации сорбита в отсутствие других добавок (1) и в присутствии фюуктозо-1,6-дифосфата в концентрации 2,5 мМ (2), 5,0 мМ (3) и 20 мм (40). А - прямые, Б - двойные обратные координаты

рости реакции (т.е. ухудшается ассоциативная и каталитическая функция фермента) (Крупянко, 1990). Для фруктозо-1,6-дифосфата (рис. 6) получены следующие значения Кт , соответственно, (контроль, 2,5 мМ, 5,0 мМ, 20 мМ) 2,77 мМ, 6,25 мМ, 6,25 мМ, 4,25 мМ и максимальной скорости: 167,8, 130,0, 111,6 и 52,3 мМ восстановленного NAD+ в минуту на мг белка.

Анализируя полученные результаты можно заключить, что фрукто-зофосфаты, конкурируя за активный центр фермента, влияют на активность СДГ.

ВЛИЯНИЕ ИНГИБИТОРОВ

Анализ ингибирования ферментов служит одним из подходов при изучении механизмов действия ферментов. Данных о влиянии ингибиторов на активность СДГ незначительно. Так, известно, что в щелочных условиях борная кислота подавляет активность СДГ fBlakley, 1951). Считается, что действие борной кислоты может быть обусловлено или образованием слабодиссоциируемого комплекса между молекулой полиола и борной кислотой (Smith, 1962; Шварц, 1968), или непосредственным действием борат-иона на молекулу фермента (Murray et al., 1969).

Для решения этого спорного вопроса нами изучено влияние борной кислоты (0-50 мМ) на активность СДГ из печени быка. Показано, что при повышении концентрации бората активность фермента монотонно снижается. 50% снижение активности СДГ отмечено в присуствии 14 мМ бората, 85% - при 40 мМ.

В опыте по восстановлению активности СДГ к ферментному препарату добавляли 40 мМ борную кислоту и наблюдали снижение активности СДГ на 85%. При добавлении в опытную кювету раствора сорбита (20 мМ) происходило восстановление ферментативной активности на 75%.

При изучении влияния различных концентраций борной кислоты на активность СДГ и в опыте по восстановлению активности фермента, СДГ инкубировали с борной кислотой в течении 1 минуты (в первом опыте) и 5 минут (во втором), после чего добавляли субстрат. В обоих случаях при наличии 40 мМ борной кислоты в среде инкубации отмечалось 85% ингибирование СДГ, т.е. ингибирование борной кислотой не развивалось во времени, а происходило мгновенно.

Для выяснения типа ингибирования активности СДГ изучали влияние борной кислоты (15 мМ и 40 мМ) на активность СДГ при различных концентрациях сорбита. График зависимости в прямых координатах имеет гиперболическую форму, т.е. подчиняется классической кинетике Михаэлиса - Ментена. В двойных обратных координатах прямые пересекаются во втором квадранте, что соответствует смешанному типу ингибирования. Наблюдается увеличение значений Кт (контроль - 2,5 мМ,

15 мМ борат - 3,3 мМ и 40 mV. борат - 3,846 мМ) и снижение• максимальной скорости ферментативной реакции, соответственно (153,8, 74.15, 37.06 мМ nadk в минуту на мг. белка). Полученные данные свидетельствуют о затруднении связывания фермента с субстратом и ухудшении ассоциативной и каталитической функций фермента. Таким образом, действие борной кислоты обусловлено непосредственным действием борат-иона на молекулу фермента.

ФУЖТШОНА.ЯЬНЛЯ СВЯЗЬ ПЦГ О ДРУГИМИ ФЕРМИЩЩ УГЛЕВОДНОГО МЕТАБОЛИЗМА; АДГ И Г6ФДГ Полиольный путь метаболизма глюкозы осуществляется в обход гликолиза и пентозофосфатного пути (схема 1). Для выяснения взаимосвязи СДГ с Г6ФДГ, ключевым ферментом пентозофосфатного пути, и АДГ, маркерным ферментом, который присутсвует в печени в значительных количествах, а также для выяснения степени функционирования по-лиольного пути в печени сравнивали активности СДГ, АДГ и Г6ФДГ из печени быка, теленка, крысы, собаки и суслика. Показано, что активность СДГ из печени исследуемых животных не только не ниже активности ферментов, избранных нами в качестве маркеров (АДГ и Г6ФДГ), но и в несколько раз превышает их (табл. 1). Так, отношение АДГ/СДГ и Г6ФДГ/СДГ в печени быка составляло, соответственно, 1.0/4.5 и 1.0/2.2, теленка - 1.0/5.0 и 1.0/2.2, крысы - 1.0/7.8 и 1.0/3.8, суслика - 1.0/20.6 и 1.0/5.6 и собаки - 1.0/ю.б и 1,0/3.3. Обнаружение высокой активности СДГ в цитоплазме клеток печени исследуемых животных свидетельствует об активном функционировании полиольного пути метаболизма глюкозы в данном органе.

таблица 1.

Сравнительная активность алкогольдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и сорбитдегидрогеназы в _цитоплазме клеток печени разных животных_

Цитоплазма клеток печени 1'люкозо-б-фосфат дегидрогеназа алкоголь дегидрогеназа сорбит дегидрогеназа

п ммоль nadph+ п ммоль nadht п ммоль nabht._

мг белка мин мг белка ш мг бежа

Быка 8 9,8б±1,21 8 4,82-0.05 9 21,78*1,55

Теленка 16 8,41-1 .01 16 з.69*0,18 16 18.44-1.79

Крысы 15 13.09^1.73 15 6,32±0.67 15 49.57-3.93

суслика 4 13,19*0.70 4 3.60-0.30 4 74.30-4.01

собаки 4 10,09*0,80 4 3.19*0,25 4 33.70*2.30

Взаимосвязь между исследуемыми ферментами может осуществляться следующим образом. Альдозоредуктаза (первый фермент полиольного пути) функционирует в присутствии КАЛРН, источником которого служит

Схема I. Взаимосвязь полиольного пути метаболизма глюкозы с гликолизом и пентозофосфатным путем.

глюкозо-6-фосфатдегидрогеназная реакция. Конечный продукт этой реакции - оорОит, затем окисляется в присутствии nad+ до фруктозы (King and Mann, 1959; Van Heiningen, 1962; Morrison et al., 1970). Если фруктоза фосфорилируется по 1 положению то источником окисленной формы nad+ может быть алкогольдегидрогеназная реакция и образующийся NAD"" может использоваться СДГ. Следовательно, на уровне окисленно - восстановленных форм nad+ может существовать связь между АДГ и СДГ, а на уровне nadph - между Г6ФДГ и альдозоредуктазой.

СДГ появляется уже на ранних этапах развития организма и ее активность в онтогенезе продолжает увеличиваться (РаЪго et al., 1975). При сравнении удельной активности СДГ из печени теленка (18,44 мМ NADH на мг белка в мин) и печени быка (21,78 мМ NADH на мг белка в глин) наблюдается некоторое увеличение активности фермента, что согласуется с литературными данными (Fabro et al., 1975). Изменение ферментативной активности связывают с множествеными молекулярными формами фермента (Судовцов, 1985). С этой целью анализировалась СДГ из печени теленка и быка методом энзим-электрофореза. Полученные данные (6 зон активности на каждой зимограмме с одинаковыми величинами ОЭП) свидетельствуют об отсутствии этих различий в онтогенезе для данного фермента.

ВЫВОДЫ

1. Подобраны условия выделения, очистки и хранения СДГ из цитоплазмы клеток печени быка. Ферментный препарат был очищен в 496 раз. Молекулярная масса, определенная методом гель-хроматографии, соответствует 145-150 кДа. Фермент имеет 6 множественных молекулярных форм с величинами ОЭП равными: 0,387, 0,338, 0,226, 0,193, 0,129, 0,064.

2. Оптимум рН в прямой реакции для СДГ из печени быка, теленка, собаки, суслика, фазана обыкновенного, кряквы, домашней утки и курицы находится в интервале рН 9,0 - 10,5.

3. Исследованы кинетические характеристики СДГ из печени быка. Показано, что форма кривых накопления NADH зависит от рН среды и концентрации субстрата. При рН - 7,0; 7,5 и 8,0 кривая накопления NADH подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментена. При рН 9,0 и 10,0 появляется промежуточное плато. Зависимость приобретает сложный s-образный характер.

4. СДГ из печени быка, теленка, собаки, суслика, фазана обыкновенного, кряквы, домашней утки и курицы обладает строгой кофер-ментной специфичностью. Активность регистрируется только в присутствии nad+. Графики зависимости начальной скорости фермента от концентрации nad+ имеют гиперболическую форму при всех исследованных

значениях рН.

5. СДГ из печени быка и суслика проявляет строгую субстратную специфичность. Установлено, что для проявления максимальной активности важна не только цис-2,4-дигидроксиконфигурация субстрата, но и длина углеродной цепи.

6. Исследовано ингибирующее действие фосфофахаров на активность СДГ из печени быка. Показано, что фруктозо-1,6-дафосфат, фруктозо-6-фосфат, глюкозо-1-фосфат и глюкозо-6-фосфат в концентрации 40 мМ подавляют ферментативную активность, соответственно, на 100%, 42,3%, 21,5% и 24%.

7. Выявлено активное функционирование полиольного пути метаболизма глюкозы в печени быка, крысы, собаки-и суслика. Показано, что активность СДГ из печени исследованых животных в несколько раз превосходит активность фериментов, выбранных нами в качестве маркеров (АДГ и Г6ФДГ).

8. Полученные данные кинетических исследований, субстратной специфичности и ингибирования фосфосахарами активности СДГ позволяют предположить, что СДГ является регуляторным ферментом, модуляторами регуляции которого могут служить продукты гликолиза.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы: и Судовцов В.Е. и Жармухамедова Т.Ю. Физико-химические характеристики СДГ из цитоплазмы клеток печени быка. Вопросы мед. химии, 1987, Т. 33. N. 3. С. 81-84.

Судовцов В.Е. и Жармухамедова Т.Ю. Стереоспецифичность СДГ из цитоплазмы клеток печени. Известия Академии Наук СССР, серия биологическая, 1989, Т. N. 4, С. 534-539.

2Л Судовцов В.Е., Жармухамедова Т.Ю. и Гарифуллина Г.Ф. Уровень сорбитдегидрогеназной активности в цитоплазме клеток печени млекопитающих. Известия Академии Наук СССР, серия биологическая, 1989, Т. N. 5, С. 769-772.

4^ Судовцов В.Е. и Жармухамедова Т.Ю. Кинетические свойства СДГ из цитоплазмы клеток печени теленка. Биохимия, 1990, Т. 55. N.4. с. 680-686.

Судовцов В.Е. и Жармухамедова Т.Ю. Влияние Сахаров на активность СДГ из цитоплазмы клеток печени быка Известия Академии Наук СССР, серия биологическая, 1990, Т. N. 4, С. 611-615.

27.04.95 г. Зак.6Б70Р. Тир.100 экз. Уел.печ.л. 1.0 Отпечатано на ротапринте в ОНИ! ПЩ РАН