Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства опиатсвязывающих белков, изолированных из синаптических мембран мозга крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свойства опиатсвязывающих белков, изолированных из синаптических мембран мозга крыс"

ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ им. ПАТРИСА ЛУМУМБЫ

На правах рукописи

УДК 612.822.1-И>12.815.1+616.8

ИЗЫКЕНОВА

Галина Александровна

СВОЙСТВА ОПИАТСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ, ИЗОЛИРОВАННЫХ ИЗ СИНАПТИЧЕСКИХ МЕМБРАН МОЗГА КРЫС

03.00.04 — БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА,СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

МОСКВА 19 9 2

Работа выполнена в Институте физиологии им. И. П. Павлова АН ССС1 Санкт-Петербург.

Научный руководитель — доктор биологических наук Н. II. Тарапова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук К. Н. Ярыгш доктор медицинских наук, профессор А. П. Хохлов.

Ведущая организация — Московский государственный университе им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « Дч » 1992 1

в № часов на заседании специализированного совета Д 053.22.02 пр Университете дружбы народов им. Патриса Лумумбы по адресу: 11719! Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Университет дружбы народов им. Патриса Лумумбы ^117198, Москва, ул. Миклухо-Ма» лая; д. 6).

Автореферат разослан < Я

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук, профессор М!., 1 В. Э. Торбе

(иг ]

и

Изд. № 215 Подписано к печати 09.01.92 Бесплатно Зак. 574 Типография РНИИ «Электроистандарт», 1992

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы,В настоящее время одной их важных проблем нейробиологин является выяснение механизмов дейстшя экзогенных и эндогенных лигавдов на нсйрорецептора. в ряду многообразных и широкораспроетраненннх кейрорацепторов для различных медиаторов а гормонов особое место занимает ошатные рецепторы, через которые реализуются эффекты опиоидных пептидов и производных морфина (опиаты) (Belluzt et al., 1976; Wei et al., 1977j Fuilraoto, Holmee, 1990).

Опиаты известны человечеству не одно тысячелетие, тогда как ошаоидные пептиды была открыты в 1973 году. Интенсивное исследование свойств последних позволило получить важные сведения о строении, распределении, основных закономерностях взаимодействия опиоидов с ошагныш рецепторами мозга (Hughes, 1ЭТ8} Snyder et al., 1979 Siron, Hiller,1989). Вместе с тем, в настоящее время появились сведения и об опиатных рецепторах: их гетерогенности, распределении в нервной системе млекопитапцих, гликопротеидной природе и взаимодействии этих рецепторов с радиолигандами (Zukin, Zukin, 1981; Майский и др., 1982; Варфоломеев и др., 1985). Показано такие, что эти рецепторы сопряжены с аденилатциклазой через G-белки и вносят вклад в работу К4- и Са2+-каиалов (ffong et al., 1989; Polaatron. et al., 1990; McFadzean, 1988).

Однако, до сих пор не выяснены вопросы о молекулярных основах гетерогенности опиатных рецепторов (Demoliou-Hason, Barnard, 1990). Представляет интерес и вопрос о субтипах опиатных рецепторов, их составе и механизмах функционирования. Несомненно, что эта информация будет полезна для поиска и зоздания новых лекарственных препаратов, воздействующих на центральную нервную систему через ошатные рецепторы.

Известно, что длительное применение опиатов в качестве иекарственных веществ с аналгетическаад свойствами сопряжено с зозникковением зависимости. Для поиска новых аналитических препаратов, не имеющих этого вредного побочного эффекта, {еобходашс изучение механизмов ох действия на организм и, в частности, на мозг. Наиболее перспективным путем создания ювых лекарственных соединений является синтез веще ста. родственных природным физиологически активным соединениям, а имей-то, пептидам (Тагов, 1982; Pujlmoto, Holaes, 1990). Ваестэ о

- а -

тем, изучение функция синтетических опиоидов в ЦНС, например, даларгина (Тир-Д-Ала-Гли-Фен-Лей-Арг), только начинается (Сма-гин и др., 1983; Варфоломеев и др., 1985; Ярыгин, 1990). До сих пор не известны возможные мишени действия этих синтетических опиоидов в нервной системе.

В связи с вышесказанным целесообразно провести сравнительное исследование свойств тех компонентов синаптических мембран, с которыми взаимодействуют эндогенный (р-эндорфин) и синтетический (даларгин) опиоиды. Исследование действия нового опяоидного пептида на мозг млекопитающих мокет оказаться полезным для выяснения механизмов лекарственной зависимости, создания принципиально новых препаратов и позволит получить новые сведения о строении и функции опиатных рецепторов.

Работа выполнена в рамках программы Президиума Академии наук СССР "Сигнал" и рамках плановой теш лаборатории функциональной нейрохиши "Нейрохимические характеристики состояния головного ыозга при нарушениях его функций в условиях экстремальных воздействий" Номер гос.регистрации 01.86.0109063.

Целью работы является исследование свойств опватсвязывао-щйх белков, изолированных из синаптических мембран мозга крас с помощью специфических сорбентов, содержащих экзогенный и эндогенный опиоидные пептиды.

1. Разработать способ выделения опиатсвязываюцих белков иг синаптических мембран мозга крыс с помощь» новых аффинных сорбентов, содержащих ковалентно иммобилизованные опиоидные пептида: р-зндорфин и даларгин.

2. Провести сравнительное исследование кинетических параметров связывания опиатсвязыввющих белков, очищенных с помощью э-эндорфин- а даларгин-ш-аминогексилсефарозы 4В, с 3Н-налоксонои и 3К-ДАДЛЕ, и некоторых физико-химических свойств этих белков.

3. Исследовать дефосфорилируюцую активность опиатсвязы-вакцих белков, изолированных из синаптических мембран мозга крыс с применением разных сорбентов.

4. Исследовать изолированные опиатсвязываицие белки с помощью поликлональных антител к ним.

Основные положения, выносимые не защиту

Т". Белки, изолированные иэ синаптических мембран мозга

крыс с помощь*) специально синтезированного аффинного сорбента, содержащего иммобилизованный эндогенный пептид - р-эндорфнн (0СБ1 и 0СБ2) и белки, изолированные с применением синтетического опиоидного пептида - даларгина (ДСБМаС1), специфически связывают лиганды опиатных рецепторов (3Н-налоксон и ЭН-ДАДЛЕ).

2. Кинетические параметры специфического связывания белков 0СБ1, 0СБ2 и ДСВ^аС1 как с 3Н-налоксоном, так и 3Й-ДАДЛЕ имеют близкие значения. Величины констант свидетельствуют о то«, что эти белки имеют более высокое сродство к ДАДЛЕ, чем к налоксону. Исследование молекулярных масс, субь-единичного состава (29, 45, 66 кД) и изоэлектрических свойств (рХ 5,3-5,4) сравниваемых белков свидетельствует о том, что эти белки имеют сходные физико-химические характеристики и являются компонентами опиатных рецепторов.

3. Элшрованные раствором Д&ГО или налоксона ДСБ специфически связывают эН-налоксон и 3Н-ДДДШ!. Белки, элюированные ДАГО, имеют более высокое число мест связывания и более высокую аффинность к Н-налоксону, чей белки, элшрованные налок-соном. Эти белки являются гликопротеидами с молекулярной массой субьединицы 42 кД и изоэлектрической точкой 5,4, соответствуют компонентам мкн и дельта-рецепторов.

4. Поликяоналыше антитела, полученные к ДС%ас1; ингиби-руют связывание этих белков с 3Н-налоксонои. Иммуноблотинг подтвердил наличие в синаптических мембранах белков с молекулярной массой 45 и 66 кД, характерной для опиатсвязывающих белков. Иммуноморфологическое исследование срезов мозга крыс с помощью этих антител позволило выявить опиатсвязыващие белки в различных структурах мозга.

Научная новизна и теоретическое значение работы. Впервые из синаптических мембран мозга крыс были изолированы белковые компоненты - мишени действия нового лекарственного препарата - гексапептида даларгина, производного лей-энкефалина.

Проведено сравнительное исследование физико-химических свойств опиатсвязываодшс белков, выделенных с помощью эндогенного (р-эндорфина) и синтетического (даларгина) опиоидных пептидов, которое показало сходство этих белков и позволило отнести их к компонентам опиатных рецепторов ию- и дельта-типа.

Выделены новые ранее не охарактеризованные опиатсвязываю-

щие белки с молекулярной кассой 42 кД и показано, 'что они являются гликопротеидами. Полученные результаты позволяют дополнить факты, касаициесз одного вз наиболее значимых классов модуляторных нейрорецепторов.

Било показано, что выделенные наш опнатсвязываодие белка обладают дефосфорилирувцей активностью, которая мохвт играть важную роль в механизмах трансдукции сигнала агонистов в антагонистов опиатных рецепторов.

С помощью политональных антител к ДС%ас1, изолироваюшы из синаптическах мембран мозга крыс, впервые определена локализация in situ (на срезах ыозга) ыембранных компонентов -шшеша действия даларгша.

Научно-практическое значение полученных результатов.

Впервые показано, что даларгин, - язво- и ранозагивляющий препарат, способен эффективно воздействовать на ЦНС и имеет молекулярные мишени в ткани головного мозга.

Полученные сведения о способности даларгшш непосредственно взаимодействовать с опиатными рецепторами ЦНС могут оказаться полезными как для создания принципиально новых лекарственных препаратов пептидной природы, так и для выяснения механизмов лекарственной зависимости. .

Полшяональные антитела в выделенным нет опиатсвязыввю-цаы белкаи могут быть рекомендована для использования в качестве маркеров при исследовании процессов формирования и деградации опиатных рецепторов в ЦНС в норме и при патологии.

Апробация, работы. Материалы диссертации были представлены на X Всесоюзной конференции по биохимии нервной системы "Фундаментальные достижения нейрохишв - медицине" (Горький,1987)/ на Всесоюзной конференции "Механизмы действия гормонов и медиаторов на вффекторные клетки" (Суздаль, 1989), на 12 -Мевду-народной конференции международного нейрохимического общества (Португалия, 1989), на 5 1»'евдунар©даом симпозиуме-школе иолодах ученых "Организация и адаптация функций мозга" (Болгария, 1989). По материалам работы опубликовано 3 научных статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа содержит ИЗ страниц машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (глава 1>, материалов и методов исследования (глава 2), результатов собственных исследований (глава 3), обсувдеиия результатов (глава 4), выводов и указателя

литературы. Работа содержат 24 рисунка, 8 таблиц. В списке литературы приведены работы 25 отечественных и 133 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ * Материалы в методы исследования. В опытах использовали крыс-самцов линии Вистар массой 150-200 г,. (по 16 крыс- в опыте). Крыс декаштировали, брали мозг без мозжечка. Выделение синаптических мембран из головного мозга крыс проводили методом дифференциального центрифугирования с некоторыми модификациями (Pert et al., 1974). Синаптические мембраны солзобялизи-ровали 0,5 % раствором дагвтонина и очшцали на сефадексе G-IQ0 (fine, "Pharmacia", Швеция). ,

Дальнейшую очистку опиатсвязьгаающих белков. (ОСБ) проводили с помощью аффинной хроматографии на специально приготовленных сорбентах - р-зндорфин- шш,даларгин-<в-аминогексилсефарозе 4В. Специфически связавшиеся о р-эндорфином или даларгикои белки элшровали в линейном градиенте 0-1,0 M N'a CI в рабочей буфере (100 ил). В отдельное серии опытов ошатсвязкващие белки элюнровали с даларгш-®-аманогвксилсефарозы 45 раствором специфического, лиганда. Содержание белка в, пробах определили по методу Lowry (1951).

Связывание белков на разных ступенях очистки с 3Н-налок-соном (50 Кю/ммоль, Araereàan, Англия) или 3Н-Д&ДЛЕ (45 Кю/ " миоль, "Amereham", Англия) проводили с помощью радиолигандкого анализа (BidlacK et al.,1982), концентрация радиолигандов варьировала от I до 12 нМ.

Контроль гомогенности в чистоты опиатсвязывающих белков проводили с помощь» ВЭЖХ на хроматографе "Gilson" (Франция) и колонке Zorbax GF-250 ("Dupont", Франция) с детекцией белков ' при длине волны 210 ни. Субьедшшчный состав опиатсвязываодих белков определяли о помощью электрофореза по Laemrall (1970).

йзоэлектрические точки ошатсвязыващих белков определяли с использованием коммерческого набора Servalyte-Precotee, рН 3-Ю ("Serra", ФРГ) или хроматофокусированием на ионнообиенни-ке РВЕ™ 94 коммерческого набора ( "Pharmacia", Швеция ).

Углеводные компоненты s препарате ОСБ 'Определяли по методу (Woodward, Zwaal, 1972) ила с поыЬщьо аффинной хроматографии ошатсвязыващих белков на кошшшвалин-А-сефарозе 43 (Allan et al., 1972).

Дефосфорилирувдую активность ОСБ определяли по-методу Ноу и соавт.(1986) с регистрацией реакции на спектрофотометре Unlcam SP1700/1800("Pye Unlearn", Англия) при 420 нм.

Поликлональше антитела получали при внутрикожной иммунизации кроликов ДСБЫаС1 в полном адьнванте Фрейнда. Иммуноглобулины С выделяли из сыворотки иммунизированных животных аффинной хроматографией на протеин-А-сефарозе 4В (Туркова, 1982). Титр антител во фракции IgG определяли с помощью иыыу-ноферментного анализа (Ngo, Lenhoil, 1980). йымуноблотикг белков синаптических мембран проводили по методу (Бейлез в др., 1990).

Исследование срезов мозга с помощью антител к опиатсвязы-вакцим белкам проводили пшунофлуоресцантным методом (Полак Дж., Ван Норден С., IS87).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Разработка метода очистки опиатсвязывающих белков мозга с использованием аффинных сорбентов, содёркаЩх опиоидные пептиды.

Синаптические мембраны выделяли из мозга 16 крыс с помощь» метода дифференциального центрифугирования в ступенчатом градиенте плотности сахарозы. Солюбилизированные 0,5 % раствором дигитошна синаптические мембраны предварительно очищали от избытка детергента и белков, не обладающих опиатсвязывающей активностью с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-I00.

Для дальнейшей очистки опиатсвязывающих белков наш были приготовлены новые специфические сорбенты, содержащие кова-лентно связанные опиоидные пептида - р-эндорфин или даларгин.

С помощью аффинной хроматографии опиатсвязывающих белков на р-эндорфин-й)-аминогексилсефарозе 4В и неспецифической элвдии раствором NeCI (0,5 М) были выделены белки фракций 90-115 (0СБ1), составляющие не более 5 % от нанесенных на сорбент ( 2 иг) и проявившие высокую активность связывания налоксона (рис.IA). Наиболее прочно связанные с сорбентом белки (ССБ2) элшровались I М раствором NaCI.

С помощью аффинной хроматографии солюбилизированных белков на даларгин-и-аминогексилсефарозе 4В и элюции 0,5 Ы раствором NeCI были выделены фракции белков 110-130 (ДСБМаС1),

S1 t>

* lis дат

й й o w hd Ь ырэ о ооН

ill^ife« S КО N _

'© о S ЮЫО.Ш Ej

вяттлал» ялгокг^мкд)

ит1иш Mtmt ц}

■esse

; о i s wä

IS wi

SOC

м

SSgë S

о •_о

И О Ott

¡3 ы к»

• дш« ыяк

Ii?" $

] M

' L

которые связывали меченный налоксон (рис.1Б). На долю этих фракций приходится 3-4 % белков, нанесенных на аффинный сорбент.

• В результате аффинной хроматографии опиатсвязыввщие белки, изолированные из синаптических мембран мозга крыс, были очищены в 400-500 раз по сравнению с содержанием белка во Фракции синаптических мембран ( 40 иг). Выход 0СБ1, 0СБ2, ДСБйаСГ - 80-100 мкг для каждого белка.

Для повышения степени очистки ошатсвязывающих белков была предпринята попытка элюции их с даларгин-ш-аминогексилсе-фарозы раствором ДАГО, - специфического агониста или налоксо-на,- антагониста ошатних рецепторов. Эти фракции белков были обозначены ДСБд^ и ДСБнал> и такке связывали 3Н-налоксон. Количество белка в этих фракциях составляло не более 0,5 Я (10 ыкг) от белков, нанесенных на аффинный сорбент. Эти белки были очищены в 4000 раз по сравнению с содержанием белков во фракции синаптических мембран.

2. Сравнительная характеристика ошатсвязывающих белков, выделенных из синаптических мембран с помощью р-эвдор-фин- и даларгин-ш-амикогексилсефарозы 4В : "

2.1. кинетические параметры связывания изолированных опиагсвязываюпра белков с 3Н-налоксоном и 3Н-ДДДЛЕ

В настоящее время основным критерием, согласно которому выделенные нз синаптических мембран белки можно идентифицировать как опиатные рецепторы, является их способность связывать опиатные радиолигзнда с высокой степенью сродства.

•* Исследование связывания 0СБ1 и 0СБ2 с ^-налоксоном показало, что связывание достигает максимума через 20-25 мин инкубации, является обратимым, специфическим и насыщаемым. Определение кинетических параметров специфического связывания ОСИ и 0СБ2 с 3Н-налоксона с использованием метода Скэтчарда позволило установить, что указанные белки имеют по одному типу центров связывания для этого лиганда (рис.2). Константы диссоциации и'количество активных центров связывания 0СБ1 и 0СБ2 о %-налоксонои сравнимы по значениям (табл.I).

Связывание 0СБ1 и 0СБ2 с ^-ДАДЯЕ было такке специфическим и насыщаемым. Кинетические, параметры связывания этих белков с 3Н-ОДДЛЕ указывают на высокое сродство как 0СБ1, так

Таблица 1 -

Физико-химические свойства опиатсввзывающих белков, изолированны* из синаптическизе мембран мозга крыс

Препарат Аффинный Специфическое связывание лигандами с радио— Молеку- Молеку- Суёг-еди- Изоэлвкт-

сорйент "Н-налоксон »н-дадле лярная масса" л иркые раэнвры 1-илчны-Д состав рические точки

нМ Вмаио. пМ/нг нМ _ пМ/мГ М-.кД Я», А кД рХ

0СБ1 ?-зндор—_ «бмн— ¿3 — 19,5+2,5 2,7+0,3 2,7+0,3 6,0+0,5 45 ¿6 2В 35 ЗО, 42, 45 4,4 5,1 5,3

0СБ2 агилно- гексил- се«ароза 12,2+1,7 1,4+0,2 4,7+0,2 0,55+0,02 45 67 2В 37 28, 45 ¿6 5,3

дзлар— Г1ЛН~а> _ 21,2+5,1 1,2+0,1 5,0+1,1 0,5В+0,Г2 45 2Э 35 29. 45 66 5,4

ДСБдяс-с амино-гексил- СОФаРОэа 6,6+0,9 690+40 5,З+О,9 610+18 43 2В 42 " 5,4"

ДСБ^шп. г------------ - // - 31,0+4,3 293+14 4,9+0,3 594+11 45 23 42 3,4

" Определена с понашью ВЭТХ; ** Определена с помочь»« хРомато^юкусирозания

и 0СБ2 к атому рэдиолигавду и в токе время показывают, 45 0СБ2 имеют несколько более высокое сродство к 3Н-ДАДЛЕ (табл, I). Указанные белки проявили в 3 раза более высокое сродство лиганду дельта-рецепторов - ДАДЛЕ, чем к лиганду ию-рецептор< - налоксону (табл.1).

Связывание ДСБ^аС1 с 3Н-налоксоном (рис.2) также бЫJ обратимым, насыщаемым, специфическим. Анализ данных специф! ческого связывания в координатах Скэтчарда позволил получи-прямолинейные графики для связывания ДСБ^р ДСБддро • Д^на с антагонистом. Это свидетельствует о том, что указанные бел] имеют также как ОСБ1 и ОСБ2 только один тип центров связывай для 3Н~налоксона. Кроме того, ДС%аС1 ииели сродство 3Н-налоксону, сходное со сродством 0СБ1 к этому антагонист; Плотность активных центров связывания ДСВ^зСТ 0 налоксон сравнима с количеством активных центров связывания для 0СБ2 этим радиолигандом (табл.1).

Высокоочтценные белки ДСБнад>имели более низкое сродств к налоксону, чем ДСБНаС1, 0СБ1 и 0СБ2, однако плотность акти них центров связывания была на два порядка выше (табл.1 Сродство и количество активных центров связывания у ДС элшрованшх ДАГО, с 3Н-налоксоном были самыми высокими (табл.1). Бее эти факты свидетельствуют о высокой степе очистки опиатсвязывающих белков, элюированных ДАГО, а не МаС и сохранении их активности. При этом высокоочщенные бел ДСБддрф более активно связывали антагонист, чем ДСБ, злюар ванные налоксоном (табл.1). Следовательно, при использован одного и того же аффинного сорбента и разных элюентов (агони та и антагониста опиатных рецепторов) можно выделить белк отличающиеся по способности связывать один и тот же лиганд.

Опиатсвязываюцие белки, изолированные из синаптичесн мембран с помощью даларгина и элюированные как НаС1, так специфическими элюентаии, с высокой аффинностью и насыщение специфически связывали лиганд дельта-рецепторов Н-ДАДЛЕ. Бе ки ДС%агт» ДСЕддро и ДСБНал. имели одан тип центров связые ния для 3Н-ДАДЯЕ. Значения констант связывания для этих бел» свидетельствуют о высокой аффинности ДСБКаС1 (ДСБддр0) ^-ДАДДЕ, которая была выше, чем сродство указанных белков налоксону. Кроме того, величины Кд для ДС%аС1 и ДСЕддГ0 1 связывании с 3К-ДАДЯЕ оказались сравнимыми со значениями ко*

гант диссоциации, полученными при связывзшт этого лиганда а белков, изолированных с помощью р-эндорфина - 0СБ1 и 0СВ2 (табл.1).

2.2. Некоторые физико-химические характеристики очищенных опиатсвязывающих белков

Определение молекулярных масс 0СБ1, 0СБ2 и ДСБ^ас1 с помощью ВЭЖХ показало, что они имеют 45 и 66 кД и радиусы Стокса 28 и 35 2 (табл.1). Для высокоочнщекных опиатсвязывап-вях белков, зяшровакных ДМ*0 или налоксоном, бил получен белковый пик с молекулярной массой 45 кД и радиусом Стокса 28

Для белков 0СБ1 при электрофокусированш были выявлены три белковые полосы с р1 4,4, 5,1 я 5,3 (табл.1), однако связывали 3Н-налоксон только белки с рГ 5,1 и 5,3. Для белков 0СБ2, ДСБ^аС1 и ^^нал было ^"зрУ36110 по одной белковой полосе с р1 5,3, что свидетельствует об их гомогенности (табл.1). Белок ДСБщ-,,-, шел р! 5,4. Полученные результаты показали, что опнатсвязывавщие белга имеют одинаковые изозлек-трические свойства и являются кислши белками.

Электрофорез белков в денатурирующих условиях показал, что субьединичный состав ОСИ представлен белковыми полосами с молекулярными массами 30, 42, 45 кД. Белки 0СБ2 содержали белковые полосы с ^ 28, 45, 56 кД. Белки имели сос-

тав, похожий на 0СБ2. Для высокоочнщекшх белков ДСБддрр и ДСБнал обнарукено лишь по одной белковой полосе с Мр 42 кД (табл.1). Для выделенных наш белков были определены радиусы Стокса, значения которых были сходны для белков, изолированных с помощью р-эндорфина и даларгина (табл.1).

Окрашивание ДСБ^^ после электрофореза реактивом (Щ4>а показало, что опиатсвязыващие белки являются гликопротевдаш: с реактивом Шиффа взаимодействовали белковые полосы ДСБКаСЗ- с Мр в области 29, 45 и 66-70 кД. Это свидетельствует о наличии в них углеводных компонентов. Результаты аффинной хроыатогра-фии ДСБддр0 на Кон-А-сефарозе 4В подтвердили, что ДСБдАГ0 таете является гликопротеидом.

2.3. Др^пфорилирустая активность изолированных опиатсвязываюадах белков

Важную роль в трансдукции сигнала мембранными рецептораыи играют процессы мембранного и внутриклеточного фосфорилирова-ния и дефосфорилировашя (Нагайа е! а1., 1989; Мо§апза1ви е! а].,

-14 -

Таблица 2

Дефосфорилирущая активность опиатсвязыващих белков*

Препарат Аффинный сорбент Скорость дефосфо-рилирова-ния Время достижения максимума реакции Латентный период реакции

■ л' - - ПМ/ИР белка/мин мин мин

ОСГ.1 ((—зндор— фИН-м- 2,30 100 30

ОПБ2 аминогек-силсефа-роза 4В 0,75 80 30

дс%аС1 даларгин- Щ-81ИНО- 0,90 70 30

дсбдаго гексил- 32 6 0

сзфароза

Л^нал, 4В 390. 6 о

* Субстрат реакции г п-нитрофенилфосфат

UC .

о" so íoo

Коищитрвцня JjjG . wr/кл

Рис.3. Влияние поликлоналышх антител на связывание ошвтсвязыващих белков ДСБМпГ,т с ^-налоксоном

1989). Однако роль этих процессов в трансдукцяи сигнала оплатили рецепторами пока не ясна.

Инкубация опиатсвязывающих белков 0СБ1, 0СБ2, ДС%аС1 с п-нитрофенилфосфатои показала, что они обладают дефосфорили-рующей активностью (табл.2). Наибольшую скорость дефосфорили-рования проявили высокоочгаценные белки ДСВдДГ0 и ДСБнал-• Белки ДСБнад< в 10 раз активнее дефосфорилировали субстрат (п-нитрофеншфосфат), чем ДСБ, элшровашше ДАГО (табл.2). Такое различие функциональных свойств компонентов опиатных рецепторов, изолированных наш ез синаптических набран мозга с- помощью антагониста (налоксон) пли агониста (ДАГО) этих рецепторов, может быть одной аз причин различного механизма действия вгонистов и антагонистов на нейрорецепторы опиатов.

3. Исследование опиатсзязываккрх белков ишунокншческиыа методами

Для исследования изолированных опиатсвязывающих белков с помощью иммунохимических катодов былв получена подихлонэльная антисывороткз кроликов к с татрой 1:14000. С помощью

аффинной хроматографии полученной сыворотка ка протепн-А-сефарозе была выделена пкиуиогяобулзаа С, которые сохраняли способность взаимодействовать с антагэноа пра кокцез1трации 1^0 0,1 нкг/ил. Эти шмуноглобуляны выявляли а синаптических мембранах белковые полосы с Мр 45 и 66 кД, характерные для оппатсвязыввкцих белков. Очищенные кэш етшуноглобулины С пнгибпровали связывание ДС%8с1 с 3К-налоксокои (максимум вигибнрования 50 % при нонцзхггрзцзи 50 кс/мл (рпс.Э).

Политональные антитела а спаатсвязывавщим белкам (ДСБМа^и), изолированным из еннзптачаекдя иеибран мозга, былг^аспользозаиы в иммуноморфологаческах экспериментах и выявляла опиатсвязывакЕцае белкз - компоненты опиатанх рзцепто-ров в гипоталамуса и типпокамаз мозга.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для решения вопроса, способен ли даларгин, - новый опиоид-ный пептид, взаимодействовать с синаптическиш мембранами в ЦНС, необходимо выделить мембранные компоненты I ответственные за это взаимодействие и сравнить свойства их и опиатсвязывающих белков, взаимодействующих с эндогенными опиоидными пепти-

дами, например, с р-эндорфином. Кроме того, было целесообно изолировать опиатсвязывающие белки не из тотальной мембранной фракции мозга, а из фракции синаптических мембран, практически не содержащей примеси глиальных клеток, которые могут присутствовать опиатные рецепторы с другими свойствами (Дбутидзе и др., 1987).

С помощью новых специально синтезированных аффинных сорбентов, ковалентно связаных с эндогенным опиоидным пептидом, -р-эндорфином, либо синтетическим производным лей-энкефалина, -даларгином, из фракции синаптических мембран мозга крыс выделены опиатсвязывающие белки, злшрованные раствором NaCI. При исследовании физико-химических свойств этих белков нами было

показано их сходство по способности специфически связывать

■1 h

лиганды опиатных рецепторов ( Н-налоксон и °Н-ДАДЛЕ), по величинам молекулярных масс и радиусов Стокса и было установлено, что опиатсвязывающие белки, изолированные из синаптических мембран с помощью двух сорбентов, содержащих разные пептиды, являются кислыми гликопротеидами, как и опиатные рецепторы (Ueda et al., 1988). Полученные результаты позволили заключить, что нами с помощью даларгина были выделены опиатсвязывающие белки, которые являются компонентами опиатных рецепторов синаптических мембран. При использовании специфических элзоентов (ДАГО или налоксона) с даларгин-ш-аминогексилсефарозы 4В были выделены новые, ранее не описанные высокоочшценные опиатсвязывающие белки, которые имели молекулярную массу субъединицы в области Мр 42 кД. Эти белки проявили более высокую активность к лиганду дельта-рецепторов - 3Н-ДАДЛЕ, чем к 3Н-налоксону и высокую дефосфорилирующую активность In vitro. Косвенные указания на присутствие белков с близкими значениями молекулярной массы в составе опиатных рецепторов были приведены в работах (Bidlack et al., 1981j Simon J, 1987), однако они не были выделены и охарактеризованы, не известна роль этих белков в структуре и функции опиатных рецепторов (Derooliou-Mason, Barnard, 1989).

Обнаружение того факта, что изолированные нами опиатсвязывающие белки проявляют дефосфорилирующую активность, как и опиатные рецепторы, выделенные из тотальных мембран мозга с использованием морфина (Ноу et al., 1986), указывает на присутствие в изолированных наии белках не только узнающих и свя-

зываюпдах опиоидц участков, но и зффекторных участков рецептор-ного комплекса, которые могут быть связаны с механизмами трансдукции сигнала внутрь клетки, в частности с процессами фосфорилирования-дефосфорилирования.

Использование поликлсшальных антител позволило впервые продемонстрировать присутствие даларгин-связывающих белков непосредственно в синаптических мембранах, а также на срезах некоторых отделов мозга.

Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что даларгин способен непосредственно взаимодействовать с опиатны-ш рецепторами, локализованными на синаптических мембранах мозга. Вместе с тем, они подтверждают существование гетерогенности рецепторов, которая может быть обусловлена не только их способностью связывать лих^анды разных типов, но и их локализацией в различных клеточных структурах нервной ткани, например, в нейрональиых или глиальных мембранах.

выводи

1. Из синаптических мембран мозга крыс с помощью специально синтезированных аффшшых сорбентов, которые содержат иммобилизованные эндогенный (р-эндорфин) и синтетический (даларгин) опиоидные пептиды, изолированы белки, которые специфически связывают лиганды опиатных рецепторов.

2. Исследование кинетических характеристик очищенных опи-атсвязывающих белков показало, что белки, очищенные с помощью Э-эндорфана (0СБ2), имеют один тип центров связывания 3Н-налоксона с Кд = I2,2tl,7 нМ, Выакс_= I,4tO,2 пмоль/мг белка. Белки, выделенные с помощью даларгина (ДС%аС1^ также ше" ют один тип центров связывания этого литанда с Кд=21,2±5,1 кМ, Вцакс<= I,2*0,1 пмоль/ мг белка.

3. Показано, что 0СБ2 способны специфически взаимодействовать с 3Н-ДАДЛЕ, имеют один тип центров связывания для этого радиолиганда с Кд = 4,7*0,3 нМ, В^акс>= 0,55±0,02 пмоль/мг белка. Белки ДС1%аС1 также имеют один тип центров связывания 3Н-ДАДЛЕ сК, = 5,0*1,1 нМ, R„w„ = 0,58i0,I2 пмоль/мг. Ука-

; занные белки характеризуются более высоким сродством к лиганду дельта-рецепторов - ДАДЛЕ, чем к лигзкду шьрецепторов - на-локсону.

4. Белки, выделенные из синаптических мембран с помощью

р-эндорфина и даларгдаа, сходны по своих фязико-хишчесгаш свойствам: молекулярной массе, изоэлектрическим свойствам и кинетическим параметрам связывания и могут быть отнесены к компонентам опиатных рецепторов. Сходство физико-химических свойств этих белков указывает на то, что даларгин взаимодействует с ошатными рецепторами синаптических мембран.

5. С помощью аффинной хроматографии на даларгин-ш-амино-гексилсефарозе 4В и специфической злюции раствором ДАГО (ДСБддр0) и налоксонои (ДСБ^^) выделены новые, ранее не охарактеризованные опиатсвязывающие белки с молекулярной массой 42 кД, р1 5,4, которые являются гликопротеидами. Эти белки специфически связывают лиганды опиатных рецепторов ию- а дельта-типа.

6. Выявлена дефосфорилируицая активность опиатсвязывапвдх белков, изолированных из синаптических мембран с помощью р-эндорфана в даларгина. Показано, что с наибольшей скоростью дефосфоршшруют п-штрофенилфосфат высокоочшценные белки

И%ГО и ДСБнал.'

7. Получены поликлоналыша антитела (1£С) к ДСБНаС1, которые взаимодействуют с белками синаптических мембран с Мр 45 в 66 кД, характерной дня опиатсвязывавдих белков и ингибируюг связывание очищенных белков с %-налоксоном.

8. Иммуиоморфологическое исследование срезов коры, гиппо-кампа в гипоталамуса мозга крыс с помощью поликлональных антител к ДСБуасх позволяет выявить локализацию ошатсвязываадах белков в различных структурах мозга.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Изыкенова Г.Д. Выделение и очистка белков синаптических мембран головного мозга крыс, специфически связывапцих р-эвдорфин//Тез. Всес.конф. по биохимии нервной системы. Горький . -I 987 . -С .76-77

2. Изшшнова Г.4., Баранова Н.П. выделение опиатсвяаываю-Бих мембранных белков с помощью р-эадорфин-ы-аминогексилсефа-розы 4В//Нейрохшшя.-1989.-Т.8, Й2.-С.282-292

3. Тарашва Н.П«, Изыкенова Г.Д. Исследование ошатсвязы-вапцих белков, выделенных из синаптических иемйран с помощью природного в синтетического пептидов//Тез.Всес.конф. "Механизмы действия гормонов и медиаторов на зффекториые клетки". Суз-

даль. — 1989. — С. 187

4. Taranova N. P., Izykenova G. A. Isolation and characterization of synaptic opiate—binding proleins// J. Neurochem.—1989.—V. 52, Suppl.l.—P. S112

5. Izykenova G. A. Opiate receptor of the synaptic membranes: isolation and properties//' Abstr. V Inter. Symp. — School «Organization and adaptation of brain functions». Bulgaria. Varna. — 1989. — P. 135

6. Изыкенова Г. А., Таранова H. П. Опиатсвязывающие белки синаити-ческих мембран головного мозга крыс// Нервная система. Проблемы нейро-химии. Л.: изд. ЛГУ. — 1991, Вып. 30. — С. 43—49

7. Таранова Н. П., Изыкенова Г. А. Сравнительный анализ белков, изолированных из синаптических мембран мозга крыс с немощью р-эндор-£ина и даларгина// Внутриклеточная сигнализация.—1991,—тТ. 1.—С. 84—87