Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование белок-липидных взаимодействий в биологических мембранах методами протеолиза и флуоресцентных зондов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование белок-липидных взаимодействий в биологических мембранах методами протеолиза и флуоресцентных зондов"

РГ6 од РГ6 0Й

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ ФОТОБИОЛОГИИ

УДК 577.336

САМОИЛЕНКО Светлана Геннадьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ БЕЛОК-ЛИПИДНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАНАХ МЕТОДАМИ ПРОТЕОЛИЗА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1997

Работа выполнена в Институте фотобиологии IIAH Беларуси.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, академик HAH Беларуси, Конев C.B.

доктор биологических наук, профессор Аксенцев С. Я.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Киселев П.А. кандидат биологических наук Козлова Н.М.

Оппонирующая организация - Белорусский государственный университет

Защита состоится » ЦвМц&^Я 1997 года в часов на заседании совета по защите диссертаций (Д 01.37.01) в Институте фотобиологии HAH Беларуси по адресу: 220072 Минск, ул. Ф. Скорины, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фотобиологии HAH Беларуси

Автореферат разослан irttt-CЪ 1997 года

7f

Ученый секретарь

совета по защите диссертаций,

кандидат биологических наук

Л.Ф. Кабашникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации. Нековалентные белок-липидные взаимодействия составляют фундаментальную основу структурной и функциональной организации биологических мембран. К настоящему времени всесторонне исследовано влияние липидов на динамику и функции мембранных белков. Существует обширная информация о модификации лшшдного бислоя мембранными белками в искусственных протеолипидных системах [Marsh, 1996; Davis, 1986; McEhlaney, 1986; Wolf, 1994]. Значительно меньше сведений о белок-липидных взаимодействиях в природных мембранах. Основная информация о влиянии белков на липидную компоненту получена при сравнении состояния лшшдной фазы до и после частичного или полного удаления белков [Jost, Griffith, 1980; Davis, 1986; Ikegami, Kinosita. 1986]. С помощью такого подхода в эритроцитарных мембранах выявлено влияние периферических белков на микровязкость, степень упорядоченности и микродоменную организацию липидов [Haest, 1982], тогда как эффекты интегральных белков либо слабы, либо не регистрируются [Van Blitterswijk et al, 1981; Collins, Grogan, 1991; Fiorini et al, 1987]. Другой, более адекватный подход, не связанный с обработкой мембран растворителями или хаотропными агентами, и основанный на избирательной структурной модификации белков, в частности, с помощью протеолиза, использовался на интакгных клетках и касался структурной реорганизации мембран [Mazhul et al, 1982], адгезивных свойств клеток [Konev et al, 1982] и текучести липидов [Devaux, Seigneuret, 1985, Burleson et al, 1978]. Приведенные результаты не позволяют оценить характер белок-липидных взаимодействий в мембранах, а регистрируемые изменения микровязкости мембран - однозначно интерпретировать как реакцию липидов только на расщепление белков, поскольку протеолитическая обработка клеток может запускать сложную цепь биохимических реакций, включая активацию фосфолипаз, различные виды внутриклеточной сигнализации и др. Задача осложняется тем обстоятельством, что для природных мембран до сих пор не разработаны четкие критерии, позволяющие надежно интерпретировать данные зондовой флуориметрии как изменения микровязкости липидов, отличая их от артефактов, обусловленных тушением флуоресценции, агрегацией или перераспределением зонда в липидшш бислое.

Таким образом, изучение влияния белков на физическое состояние липидной фазы в природных мембранах является актуальной и недостаточно исследованной проблемой клеточной биофизики, решение которой позволит понять природу белок-липидных взаимодействий и механизм их участия в осуществлении разнообразных мембранных функций.

Связь работы с крупными научными программами, темами. Диссертационная работа выполнена в рамках плановой темы Института фотобиологии HAH Беларуси по Республиканской комплексной программе фундаментальных исследо-

вашш (Рефляция 0.3) "Метастабильные напряженные состояния биологических мембран как фактор регуляции функциональной активности клеток".

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования было с помощью флуоресцентного зондирования выявить и установить характер влияния ферментативного расщепления белков на физическое состояние липидной фазы в изолированных природных мембранах.

Поставленная цель включала решение следующих задач:

- разработать экспериментальный подход для корректной оценки микровязкости и полярности мембранных липидов и измерения тушения флуоресценции пире-на в мембранах не зависящего от микровязкости;

- определить концентрационные и температурные фаницы применения пирена для оценки микровязкости бислойных и прибелковых липидов, исходя из учета характера его распределения в липидной фазе мембран;

- охарактеризовать влияние протеолитической обработки проназой синаптиче-ских и эршроцитарных мембран на микровязкость и полярность липидной фазы;

- сопоставить эффекты протсолиза белков в прибелковом и общем лштадных пулах.

Научная новизна полученных результатов. Впервые обосновывается и используется регистрация интенсивности флуоресценции в изобестической точке спектра испускания пирена для оценки параметров тушения флуоресценции зонда и определения диапазона концентраций пирена в биологических мембранах, в котором эксимеризация контролируется диффузией и зависит от микровязкости липид-ного окружения. .

Выявлена температурно-индуцированная гетерогенность распределения пирена в липидном бислое мембран.

Показано, что протеолитическое расщепление белков синаптических мембран активирует перекисное окисление липидов (ПОЛ), тогда как при том же воздействии в эршроцитарных мембранах продукты ПОЛ не обнаруживаются.

Продемонстрировано, что протеолиз приводит к снижению микровязкости липидной фазы изолированных синаптических мембран, тогда как в эршроцитарных мембранах этот эффект менее выражен и не затрагивает полярную зону лшшдного бислоя в области глицериновых остатков фосфолипидов.

Установлено, что прибелковый и суммарный липидные пулы синаптических мембран различаются по полярности, температурно-зависимому перераспределению пирена и ответу на протеолиз.

Практическая значимость полученных результатов. Данные по влиянию ферментативного расщепления белков на состояние липидной фазы мембран расширяют и углубляют понимание природы белок-липидных взаимодействий и демонстрируют возможность применения протеолиза как эффективного подхода для изучения структурной организации биологических мембран. Разработанные экспериментальные подходы, позволяющие определять концентрационные и темпера-

турш.те границы применения эксимеризации пирена для корректной оценки микровязкости липидов, а также способ оценки динамического тушения флуоресценции зопда, могут быть использованы в медико-биологических работах патогенетического и диагностического направления.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Интенсивность флуоресценции пирена в изобестической точке спектра испускания характеризует общий стационарный уровень возбужденных молекул зонда и может использоваться для оценки степени тушения флуоресценции и определения диапазона концентраций пирена в мембранах, в котором эксимеризация контролируется диффузией, а отношение флуоресценции эксимеров и мономеров является мерой микровязхости липидов.

2. При температурах выше 30 °С для эритроцитарных и 35 °С для синаптиче-ских мембран изменение коэффициента эксимеризации пирена обусловлено увеличением гетерогенности его распределения как в липидном бислое, так и в црибелко-вой зоне, и не может применяться для определения микровязкости.

3. Протеолитяческое расщепление белков наружной поверхности эритроцитарных мембран вызывает снижение микровязкости в центральной зоне липидного бислоя и существенно не затрагивает область полярных головок липидов. Эффекты протеолиза в липидной фазе выявляются только на мембранах, содержащих большую часть периферических белков, способствующих сохранению интактных белок-липидных взаимодействий.

4. Протеолго белков синаптических мембран инициирует окислительный процесс в липидах. При ингибировании ПОЛ в липидной фазе мембран регистрируется снижение упорядоченности и микровязкости липидов как в полярных, так и в гидрофобных зонах липидного бислоя.

Личный вклад соискателя. Экспериментальный материал получен при решающем участии автора. Выбор условий эксперимента и анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно.

Апробация результатов диссертации. Результаты диссертационной работы были представлены на 1-ом и 11-ом Съездах Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 22-23 ноября 1994 г.; Минск, 25-27 тоня 1996 г.).

Опублнкованность результатов. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 2 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, 4-х глав, включающих: обзор литературы; материалы, объекты и методы исследования; результаты исследования и их обсуждение; выводы. Список цитируемой литературы включает 220 литературных источников. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 28 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Эритроцитарные мембраны выделяли по методам Доджа [Dodge et al., 1963] и Фэйрбэшсса [Fairbanks et al., 1971]. Розовые тени, проницаемые для проназы, готовили гипотоническим лизисом эритроцитов в 10 мМ натрий-фосфатном буфере с последующими отмывками и переводом мембран в 30 мМ трис-HCl буфер с рН 7,4. Препарат теней содержал 0,4 - 0,5 мг гемоглобина (НЬ) на 1 мг мембранного белка или 5-7 % от его содержания в эритроцитах. Непроницаемые для проназы (запечатанные) тени получали [Nash, Meiselman, 1985] двумя дополнительными отмывками изотонической средой, содержащей 30 мМ трис-HCl и 140 мМ NaC] (рН 7,4). Белые тени выделялись в 5 мМ натрий-фосфатном буфере с рН 8,0, переводились в 30 мМ трис-HCl буфер с рН 7,4 и содержали около 30 мкг НЬ на 1 mi мембранного белка или менее 1% его количества в эритроцитах. Синоптические мембраны изолировали из полушарий мозга белых крыс стадного разведения седиментацией в градиенте сахарозы [Jones, Matus, 1974]. Митохондрии получали из сердца быка [Конев, Руденок, 1986]. Концентрацию мембранного белка определяли методом Лоури. Липиды оритроцитарных мембран экстрагировали из эритроцит«! смесью хлороформ:изопронанол в объемном отношении 7:11 [Rose, Oklander, 1965] Липосомы из фосфатидилхолина или липидных экстрактов мембран получали ин-жекционным методом [Batan, Korri, 1973] путем впрыскивания раствора липида je хлороформе через тонкую иглу в 30 мМ трис-HCl буфер (рН 7,5) при интенсивном перемешивании до полного испарения хлороформа.

Мембраны или липосомы в 30 мМ трис-HCl буфере с рН 7,4-7,5 загружали« флуоресцентными зондами пиреном [Dembo, 1979] или дифенилгексатриенол (DPH) [Plazek, 1988]. Рабочие концентрации составляли: мембран и проназы - по 0,1 мг/мл белка; липосом - 0,1 мг/мл липида; пирена - 6 мкМ; DPH - 1 мкМ. Лротеоли-тическую обработку мембран проназой Е проводили в течение 60-90 минут npi 37 °С. Флуоресцентные измерения проводили на спектрофлуориметре JY-3CS ("Jobin Ivon", Франция) при 23-25 °С.

Флуоресценция DPH определялась при вертикально поляризованном возбуждающем свете с лвозб = 365 им и Хфл = 430 нм. Интенсивность (Idph) и стационарная анизотропия (rs) флуоресценции зонда расчитывались как 1ВРН = 1ц + 2G*Ii rs = (I[| - G*Ij)/Jdph [Litmam, Barenholz, 1982], где 1ц и Ij. - соответственно интенсивности флуоресценции при параллельной и перпендикулярной ориентации анализатора относительно вектора возбуждающего света; G = 1,02 - приборный фактор • был измерен для раствора DPH в октане.

Спектры флуоресценции пирена регистрировали в диапазоне 360-490 нм npi Хвозб = 337 нм (прямое возбуждение) или в диапазоне 310-490 нм при Хвозб = 28( нм (возбуждение через перенос энергии с белков). В последнем случае снектрь корректировались с учетом вкладов белковой флуоресценции и флуоресценции пи

рена, возбуждаемого непосредственно светом с /.вози = 280 нм [Литвинов, Образцов, 1982]. Перенос энергии определялся по степени тушения белковой флуоресценции пиреном (1Я0) как Qtrp = 1 - I/I0, где I и 10 - интенсивности собственной флуоресценции мембран (Хвозб = 280 нм, Хфл = 330 нм) в присутствии и в отсутствии зонда.

Содержание продуктов ПОЛ в мембранах оценивали по поглощению комплекса малонового диальдегида с тиобарбитуровой кислотой (МДА-ТБК) при 532 нм [Koster, Slee, 1980]; по флуоресценции этого комплекса, экстрагируемого в n-бутонол при Х.возб = 515 нм и Яфл = 550 нм [Logani, Daviec, 1980]; по флуоресценции липофусцин-подобных продуктов при А.возб = 370 нм и Яфл = 455 нм [Kikugawa, Beppu, 1987].

Результаты представлены в виде изменений параметров, регистрируемых у обработанных проназой препаратов мембран относительно необработанных контрольных образцов (Проназа/Контроль).

Статистическую обработку данных проводили методами вариационной статистики [Рокицкий, 1973].

Основные результаты н их обсуждение

Оценка общего стационарного уровня возбужденных форм пирена и его использование при определении микровязкости и динамического тушения флуоресценции зонда в биологических мембранах.

Для оценки микровязкости липидов используется диффузиошю-контроли-руемый процесс образования эксимеров пирена, количественно выражаемый отношением стационарной флуоресценции эксимеров (Хфл = 475 нм) и мономеров (Хфл = 397 нм) или 1еЛга [Galla, Sackmann, 1974]. Однако кроме микровязкости на отношение 1еЛт существенное влияние оказывают избирательное тушение флуоресценции эксимеров [Веюшш, 1987] и эффекты, связанные с агрегацией зонда при высоких локальных концентрациях, в частности появление димеров, способных возбуждаться из основного состояния и флуоресцировать, как и эксимеры [Kaneda et al., 1985; Кашулин, 1991]. С другой стороны, изменение микровязкости искажает оценку тушения флуоресценции пирена по тушению мономерной или эксимерной флуоресценции [Vekshin, 1985]. Эти обстоятельства привели к необходимости проведения исследования с целью получения критерия диффузионного характера экси-меризации пирена и определения степени тушения флуоресценции зонда, не зависящего от микровязкости.

В основе предлагаемого подхода лежит измерение интенсивности флуоресценции пирена в изобестической точке спектра испускания'. Значение этой интенсивности характеризует общий стационарный уровень возбужденного пирена в мембранах (мономеры + эксимеры) и не меняется при изменении микровязкости среды. Данное положение обосновывается при помощи анализа спектров флуорес-

пенции пирена в синаптических, эритрощпарных и митохондриальных мембранах, а также в липосомах из яичного фосфатидилхолина, при различных соотношениях зонд/мембраны.

На рис. 1а приведено семейство спектров флуоресценции пирсна в эритроци-тарных мембранах (ОД мг/мл белка), нормированных по концентрации зонда в пробах в диапазоне 1-5 мкМ (1/[руг]). Видно, что нормированные спектры имеют изо-бсстическую точку при Ял = 442 нм, т.е. измеряемая (ненормированная) интенсивность флуоресценции при этой длине волны (К) пропорциональна концентрации зонда и не зависит от отношения 1еДт. Аналогичные семейства с положением 1л при 440-445 нм были получены для других исследованных мембран.

Рис. 1. (а) Спектры флуоресценции пирена в мембранах эритроцитов, нормированные на концентрацию зонда. Концентрации: мембраны - ОД мг/мл белка, пирена ([руг]) - 1-5 мкМ (приведены около спектров). (б) Зависимость между нормированными интенсивностями мономерной (1т/[руг]) и эксимерной (1е/[руг]) флуоресценции пирена.

Для семейства спектров зависимость 1е/[руг] от 1т/[руг] носит линейный характер (рис. 16) и может быть представлена формулой 1е + к*1т = где коэффициент к (тангенс угла наклона) зависит от типа мембраны и температуры. Наличие изобестической точки в спектре флуоресценции пирена свидетельствует о том, что эксимеры и мономеры находятся в динамическом равновесии друг с другом, а общая концентрация двух возбужденных форм зонда в мембранах остается неизменной при варьировании отношения 1е/1т (не зависит от микровязкости среды) и может быть количественно охарактеризована параметром Н или величиной Ь.

При увеличении концентрации пирена в мембранах величина 1э/[руг] начинает снижаться, а линейность зависимости между 1е/[руг] и 1т/[руг] нарушаться после 8 мкМ для синаптических, 6 мкМ для эршрогдатарных и 3 мкМ для митохондриальных мембран (рис. 2). Причем в мембранах с меньшим содержанием липидов (митохондрии < эритроцита < синаптосомы) эти эффекты проявляются при более низких концентрациях зонда. При содержании пирена в мембранах выше критического прямая корреляция между концентрацией зонда, с одной стороны, и отноше-

"[руг] 1</[руг]

350 - 400 450 500

X, нм

нием 1еЛт и Ь, с другой, нарушается. Снижение 1ч и, соответственно, Ц указывает на снижение суммарного уровня возбужденного пирена, т.е. на концентрационное тушение флуоресценции, связанное, по-видимому, с агрегацией зонда и появлением димеров пирена в результате создания высоких локальных его концентраций в отдельных липидных доменах. Это подтверждается в экспериментах на липосомах из фосфатидилхолина при высоких соотношениях зонд/липид. Так, при изучении влияния дезагрегации пирена на параметры его спектров возбуждения и испускания оказалось, что уменьшение молярной концентрации зонда в липосомах с 10 до 1 мол. % сопровождается снижением количества димеров (/.г.озб = 360 гол и л.фл = 480 нм) и параллельным возрастанием значений 11 и Ь.

Рис. 2. (а) Зависимости нормированных на концентрацию пирена значений эксимерной (1е/[руг]) от м01ю-мерной (1т/[руг]) флуоресценции зонда в синаптиче-ских (1), эритроци-тарных (2), и мито-хондриальных (3) мембранах при концентрации мембранного белка 0,1 мг/мл и концентрациях пирена в диапазоне 1-10 мкМ. (б) Соответствующие зависимости нормированных на концентрацию зонда значений Ь = 1е к*1гп, где коэффициенты к рассчитывались, исходя из значений тангенсов углов наклона линейных участков.

В диапазоне концентраций пирена, в котором сохраняется линейность зависимостей 1е/[руг] от 1т/[руг] а также П или Гэ от [руг], мономеры и эксимеры находятся в динамическом равновесии друг с другом и процесс эксимеризации носит преимущественно диффузионно-контролируемый характер. В этих условиях значения И и Ь характеризуют общую концентрацию пирена в мембранах и могут использоваться для определения степени тушения зонда. Отклонение от линейности указанных зависимостей - критерий появления либо агрегированных форм зонда и прямого фотовозбуждения димеров, либо тушителей флуоресценции. При наличии тушенш и/или агрегации пирена отношение Те/Ьп не может служить мерой микровязкостл липидов.

УГруО

У Груз

0,03

0,02

0,0

0,1 0,2 1т/[РУ]

0,08

0,06

0,05

2 4 6 8 10 [руг], мкМ

Температурно-зависимая гетерогенность распределения пирена в мембранах На рис. 3 представлены температурные зависимости степени эксимеризацш пирена в синантических и эритроцитарных мембранах а также в липосомах из суммарных липидов эритроцитарных мембран в диапазоне 15-55 °С. Для сииаптических мембран приведены данные для общего и прибелкового липидных пулов. Видно, что при температурах выше 30-40 °С выход эксимеров пирена (1еЯт) в мембранах снижается, что не согласуется с представлениями об увеличении текучести липидов с ростом температуры. Эти зависимости воспроизводились после удаления кислорода из суспензии мембран и при охлаждении нагретых мембран в том же температурном диапазоне. Регистрируемые эффекты свидетельствуют об обратимом изменении состояния лидидного окружения пирена в области 30-40 °С, которое, однако, не связано со структурной перестройкой мембраны, поскольку анизотропия флуоресценции DPH изменялась линейно во всем температурном диапазоне.

Рис. 3. Влияние температуры на степень эксимеризации пирена (Ie/Im) в эритроцитариых мембранах (1), в липосомах из суммарного шпидного экстракта эритро-цитарных мембран (2), в бислойном (3) и прибелковом (4) липидных пулах сииаптических мембран. Использовались концентрации: мембран - ОД мг /мл белка; липосом - 0,1 мг /мл липида; пирена -■ бмкМ.

Аналогичные эффекты обнаружены в модельных экспериментах на липосомах из соевого фосфатидилхолина. Анализ параметров флуоресценции пирена в липосомах при относительных концентрациях зонда 0,25 и 1,5 мол. % в интервале 20-60 иС выявил монотонное снижение интенсивности флуоресценции пирена в изобестической точке QA = 440 нм) при нагревании, тогда как степень эксимеризации пирена и отношение виброшгых пиков изменялись немонотонно с экстремумами при 40-45 °С. Рост полярности микроокружения пирена выше 40 °С, коррелирующий со снижением выхода эксимеров, позволил предположить, что регистрируемые эффекты связаны с перераспределением молекул зонда в полярные области липосомальной мембраны. Анализ дозовых зависимостей тушения флуоресценции пирена водорастворимым иодидом калия [Barenholz, Cohen, 1991] показывает (рис. 4а), что при 25 °С зависимость И от концентрации иодида в координатах Штерна-Фольмера близка к линейной и, следовательно, все молекулы зонда доступны для тушителя [Лакович, 1986]. При более высоких температурах (45, 55 °С) нелинейный ход кривых титрования указывает на появление недоступной для иода-

да компоненты зонда. На основании этих данных сделан вывод о том, что распределение пирена относительно поверхности липосом при 25 °С близко к гомогегаюму, а при температурах выше 40 °С становится гетерогенным и появляется дополнительный пул молекул зонда, отсутствующий при 25 С.

Рис. 4. Тушение флуоресценции пирена иодидом калия в изобестической точке: (а) - в липосомах из фосфатидилхолина (Ал=440 нм) при температурах 25 - (1), 45 -(2), 55 - (3) °С; в бис-лойном (б) и ануляр-ном (в) лшшдах си-наптических мембран (?л=445 нм) при 10 -(1), 20 - (2), 35 - (3) и 50 - (4) °С.

0,85

Рис. 5. Зависимости отношения вибронных пиков флуоресценции пирена в синаптиче-ских мембранах от температуры при возбуждении светом с Хвозб = 337 - (1) и Авозб = 280 нм - (2). Концентрация белка в мембранах составляла 0,1 мг/мл, концентрация пирена - б мкМ.

10 20 30 40 50 t,°C

Для синантических мембран данные по тушению иодидом флуоресценции пирена в изобестической точке (/Л = 445 нм) приводятся для бислойного (рис. 46) и прибелкового (рис. 4в) липидных пулов при температурах 10, 20, 35 и 50 °С. В случае бислойного липида зависимости Штерна-Фольмера при 10 и 20 °С линейны (однородное распределение пирена) и недоступный для тушителя пул пирена (гетерогенность распределения зонда) появляется при 35 °С. В прибелковом липиде нелинейность штерн-фольмеровских зависимостей становится выраженной после

35 °С. Судя до изменению угла наклона зависимостей, эффективность тушения пи-реновой флуоресценции низкими концентрациями иодида в суммарном липиде непрерывно растет, тогда как вблизи белков от 10 до 35 °С падает, а при дальнейшем нагревании до 50 °С нарастает. Данные по тушению коррелируют с изменением полярности микроокружения зонда в двух лидидных пулах синаптических мембран (рис. 5). Приведенные зависимости демонстрируют выраженное влияние белок-липидных взаимодействий на характер температурпо-индуцируемых изменений полярности в окулярных липидах.

Совокупность данных свидетельствует, что в синаптичсских и эритроцитарных мембранах при температурах выше 30-35 °С пирен неравномерно распределен в ли-пидном бислое и изменение отношения 1с/1т не отражает изменение микровязкости.

Исследование влияния иротсолиза белков проиазой Е на лииидную фазу эритроцитарных мембран.

Из рис. 6 видно, что протеолитическая обработка розовых незапечатанных теней эритроцитов приводит к уменьшению подвижности зондов (снижение 1е/1т, рост г5) и значительному тушению флуоресценции (10РШ Ь). Поглощение пирсна при этой длине волны падало.

Рис. 6. Влияние обработки проиазой незапечатанных теней эритроцитов с остаточным содержащем гемоглобина 57% в 30 мМ трис-НС1 буфере на параметры флуоресценции пирена и БРН без и в присутствии антиоксидантов: ионола (10 мкМ) и ЭДТА (1 мМ). к, 1е/1т, 1'/13 - соответственно, интенсивность флуоресценции, степень эксимеризации и отношение вибронных пиков пирена; 1Прн, г5 - интенсивность флуоресценции и анизотропия флуоресценции ВРН.

п р о наза/ко нтрол ь

без антиоксидантов 10 мкМ ионола 1 мМ ЭДТА

1,0

0,8

0,6

1е/!т IV!3 !0РН Г8

Тушение зондовой флуоресценции искажает оценку микровязкости липидов не только по отношению 1е/[т пирена (как показано вьппе), но и по анизотропии флуоресценции БРН, т.к. в условиях неравномерного распределения зонда анизотропия может отражать локальную мшсровязкость вблизи фракции БРН с непотушенной флуоресценцией. В связи с этими затруднениями возник вопрос о природе тушителей флуоресценции зондов в мембранах при протеолизе. Поскольку после инкубации с проназой тушение флуоресценции и снижение оптической плотности пирен;:

при 337 пм полностью устранялись солюбилизацией мембран детергентом (0,5% SDS), был сделан вывод о непосредственном взаимодействии тушителей с зондами в липидпой фазе без образования устойчивых комплексов и без их химической модификации. Такими тушителями могут быть: (а) сама проназа или продукты ее ав-толитического расщеиления; (б) продукты ПОЛ; (в) продукты раехцепления гемоглобина (НЬ) проназой.

Эксперименты на лггаосомах позволили исключить непосредственное влияние проназы или продуктов ее автолиза на флуоресценцию зондов. К тушению не имело отношение и ПОЛ, поскольку введение в среду инкубации мембран с проназой ан-тиоксидантов ионола (10 мкМ) или ЭДТА (1 мМ) не устраняло эффекты протеолиза (см. рис. 6). Попытки обнаружить накопление продуктов ПОЛ в ходе протеолиза (по поглощению комплекса МДА-ТБК; по флуоресценции этого комплекса, экстрагируемого в n-бутанол; по флуоресценции липофусцин-подобных продуктов) также не увенчались успехом. В модельных экспериментах на липосомах из суммарных ли-пидов эритроцитарнътх мембран было обнаружено, что их инкубация с НЪ при концентрациях последнего выше 1 мкг/мл вызывает тушение флуоресценции, более выраженное для пирена, чем для DPH. Эти различия, по-видггмому, связаны с разной преимущественной локализацией зондов в липосомальной мембране и свидетельствуют о слабом проникновении молекул НЪ в лшшдный бислой. В том случае, когда в среде инкубации присутствовала проназа, интенсивность флуоресценции пирена и DPH с ростом концентрации НЬ снижалась значительно резче и в равной степени для обоих зондов. Эти данные указывают на проникновение продуктов расщепления НЬ проназой в липидную фазу и взаимодействие их с зондами.

По-видимому, и другие флуоресцентные эффекты (снижен!« Ie/Im, рост rs) протеолиза на незапечатанных розовых тенях при доступности белков цитоплазма-ттеской поверхности мембран для проназы, также связаны с расщеплением гемоглобина. В опытах на тенях эритроцитов с низким содержанием lib (белые тени) протеолитическая обработка не сопровождалась тушением флуоресценции, но при этом не менялись и другие флуоресцентные характеристики, чувствительные к состоянию липидного матрикса. Отсутствие влияния протеолиза белков на липидную компоненту белых теней может быть связано с уменьшением количества периферических белков, контактирующих с лшшдами и участвующих в протеолизе, относительно их содержания в розовых тенях (примерно на 30-35% [Fairbanks et al., 1971]), а также со значительными отклонениями структурной организации белых теней от интактных мембран на уровне белок-липидных взаимодействий. Прояснить вопрос мог бы эксперимент на эритроцитарных мембранах с иптактными белок-лшвдшшми взаимодействиями, но без помех со стороны гемоглобина. Этому условию соответствует протеолиз белков наружной поверхности запечатанных розовых теней.

Влияние протсолитической обработки наружной поверхности эритроцитарных мембран в изотонических условиях на спектральные характеристики зондов иллюстрируется рис. 7, из которого видно, что протеолиз не сопровождается выражен-

ным тушением флуоресценции зондов, не влияет на степень эксимергоации и отношение вибронных пиков пирена, но вызывает достоверное (р < 0,001) снижение анизотропии флуоресценции БРИ в присутствии 1 мМ ЭДТА. Снижение г5 не выявляется без ЭДТА, что, по-видимому, связано с действием ЭДТА как хелатора двухвалентных катионов, формирующих внутри- и межмолекулярные солевые мостики [Оешш, 1989], разрыв которых способствует разрыхлению мембраны и увеличению доступности белков для проназы. Таким образом, наружный протеолиз теней не оказывает заметного влияния на состояние лшшдного микроокружения пирена, в то время как усредненная микровязкость липидов в области локализации РРН снижается. Учитывая преимущественную локализацию зондов, можно заключить, что расщепление белков наружной поверхности мембран эритроцитов вызывает снижение микровязкости в центральной зоне липидного бислоя и существенно не затрагивает зону полярных головок в области глицериновых остатков фосфолшшдов.

проназа/ контроль

-! без ЭДТА

Рис. 7. Влияние протеолиза белков наружной поверхности эритроци-тарных мембран (розовые запечатанные теш) в изотоническом буфере (30 мМ трис-НС1, 140 мМ №С1) без и в присутствии 1 мМ ЭДТА при 37 °С на параметры флуоресценции пирена 1еЯт, 1'Я3) и ПРИ (10рн, гб). Обозначения параметров те же, что на рис. 6.

Разными методами [Gordon, Mobley, 1984; Galla, Luisetty, 1980; Venna, Wallach, 1976; Bieri, Wallach, 1975] в липидной фазе эритроцитарных мембран зарегистрирован структурный переход около 38 °С, который обратим лишь частично и сопровождается ослаблением белок-липидных взаимодействий. В наших экспериментах повышение температуры протеолиза до 38-39 °С скачкообразно и полностью блокировало влияние расщепления наружных белков розовых теней на анизотропию флуоресценции DPH. Этот результат подтверждает вывод о том, что проте-олиз-индунируемое снижение микровязкости в гидрофобной зоне линвдной фазы теней отражает устранение иммобилизующего влияния белков на лигощное окружение в мембранах эритроцитов с интактными белок-липидными взаимодействиями.

Влияние протеолиза белков на липидную фазу силаптическнх мембран

При обработке синаптических мембран проназой регистрируется (рис. 8) рост анизотропии флуоресценции ИРН, снижение степени эксимеризации и увеличение полярности микроокружения пирена при Хвозб = 337 нм. Протеолиз сопровождается также выраженным тушением флуоресценции зондов, при этом оптическая плотность пирена в мембранах при X = 337 нм не менялась. Эти эффекты наблюдались при введении зондов в мембраны как до, так и после протеолиза и не были обусловлены непосредственным влиянием проназы на липидньш бислой. Последний вывод следует из отсутствия эффектов проназы на липосомах.

проназа/контроль

L^a без ЭДТА ~шш 1 мМ ЭДТА

Рис. 8. Влияние протеолиза белков сшапгпческих мембран на параметры флуоресценции пирена (И, 1еЛт, I1/!3) и ОРН (1ВРН, Н . интенсивнось флуоресценции пирена в изобестиче-ской точке (Ал=445 нм), остальные обозначения параметров те же, что на рис. 6.

В качестве причины тушения при протеолизе рассматривалась активация ПОЛ, продукты которого могут быть тушителями флуоресценции липофильных зондов, в том числе пирена [Viani et al., 1991]. Кроме того, регистрируемые в ходе протеолиза изменения других флуоресцентных характеристик (снижение 1еДт, рост rs, увеличение Т'Л3), также обычно сопутствуют окислительному процессу в липидах [Владимиров, Добрецов, 1980; Richter, 1987]. Действительно, уровень ТБК-активных продуктов ПОЛ в синаптических мембранах после протеолитической обработки значительно (5-ти кратно) возрастал, но не менялся, если в среде протеолиза присутствовали ангиоксиданты ионол или ЭДТА. В то же время не наблюдалось накопления продуктов ПОЛ при инкубации с проназой липосом из фосфатидилхо-лина. Следовательно, сама проназа не обладает прооксидантными свойствами и активация ПОЛ в мембранах является результатом протеолиза.

Поскольку действие ЭДТА основано на хелатировании металлов переменной валентности [Minotti, Aust, 1987], инициированный протеолизом окислительный процесс в липидах, по-видимому, опосредован высвобождением белоксвязанного железа присутствующего в виде примесей в препаратах мембран. При этом не происходит химическая модификация молекул пирена, о чем свидетельствует отсутствие влияния протеолиза на оптическую плотность зонда, а также независимость эф-

фекгов от последовательности введения зонда в мембраны: до или после протеоли за. Этот факт отличает протеолиз от ряда других индукторов ПОЛ, например, сис темы Ре2+-аскорбат в синаптических мембранах [Viani et al., 1991], когда высокоак тивные интермедиаты вступали в реакцию с пиреном, сопровождающуюся тушени ем флуоресценции и снижением оптической плотности зонда.

Для выявления первичных эффектов протеолиза, не осложненных окислитель ным процессом, изучалось влияние обработки проназой мембран в условиях подав ления ПОЛ. Инкубация мембран с проназой в присутствии 1 мМ ЭДТА (см. рис. 8 приводит к достоверному снижению анизотропии флуоресценции DPH и увеличе ншо степени эксимеризации пирена. При этом не меняются усредненные по лшшд ной фазе полярность микроокружения пирена и интенсивность флуоресценции обо их зондов. Такие же эффекты наблюдались и в присутствии 10 мкМ ионола. .

Рост выхода эксимеров пирена и снижение анизотропии флуоресценции DPH отсутствии тушения можно считать следствием увеличения усредненной подвижне сти зондов в ответ на снижение микровязкости липидов. На это указывает одннакс вый характер флуоресцентных изменений двух зондов с разными типам подвижне сти и неодинаковой преимущественной локализацией в липидяом бислос. Являете ли расщепление мембранных белков единственной причиной снижения микровя: кости, не связанного, например, с активацией эндогенных фосфолипаз? Ингибито фосфолипазы А2 бромофенацилбромид [Bradford et al., 1983] в среде протеолиза г. устранял изменения степени эксимеризации пирена как в присутствии, так и 6f ЭДТА, а активация фермента ионами Ca2f на фоне ЭДТА, также оказалась не эс] фективной. Это делает маловероятной опосредованную роль активации фосфолиш в протеолиз-иццуцируемое увеличение текучести липвдной фазы. Таким образга именно расщепление белков вызываег снижение микровязкости липидов синапт) ческих мембран.

Далее была проанализирована околобелковая лихшдная зона, размеры которс в наших экспериментах ограничивались радиусом Ферстера для пары трипгофани." пирен (до 3 им). В обработанных проназой мембранах как в отсутствии, так и в пр) сутствии ЭДТА (рис. 9), изменения спектральных характеристик пирена вбли: белков (Лвозб = 280 нм) оказались такими же, и даже более выраженными, как и всей популяции молекул зонда (/.возб - 337 нм) при активации ПОЛ (см. рис.? Кроме того, регистрируется уменьшение величины тушения белковой флуоресце ции пиреном (Qup) после протеолиза. Параллельное изменение интенсивное флуоресценции в изобестической точке (Ii) и Q^ позволяет говорить о снижен! эффективности переноса энергии с белков на зонд в мембранах после расщеплен] белков. По-видимому, продукты ПОЛ не ответственны за эти эффекты, посколь они воспроизводятся при ингибировании окислительного процесса в липидах. К эффициент эксимеризации а также вибронная структура спектра испускания пире в прибелковом липиде также не зависисят от ПОЛ.

Снижение эффективности переноса энергии при протеолизе, по-видимому, обусловлено удалением из мембраны части белков и, соответственно, уменьшением пула прибелковых липидов. При этом, доля молекул пирена, способной возбуждаться за счет переноса энергии должна снижаться. Падение выхода эксимеров может быть результатом либо роста локальной микровязкости полярных зон ануляр-ных липидов, либо снижения локальной концентрации пирена вблизи белков из-за протеолиз-индуцированного перераспределения зонда в другие лшшдные домены. В настоящее время нет адекватного способа дифференцировать все эти возможности и дать более однозначную интерпретацию данному результату, поскольку неизвестен ни коэффициент распределения пирена между свободным и связанным с белками липидными пулами, ни его изменение при расщеплении белков. Можно только констатировать, что свойства и поведение бислойных и прибелковых липидов значительно различаются по ответу на протсолиз.

проназа/контроль

1 без ЭДТА ■ 1мМ ЭДТА

Рис. 9. Влияние протеолиза на параметры флуоресценции пирена в прибелковом липидном пуле (Х.возб = 280 нм) и на тушение белковой флуоресценции пиреном (Qtrj,) в синапти-ческих мембранах без и в присутствии 1 мМ ЭДТА.

'e/lm

ВЫВОДЫ

1. Интенсивность флуоресценции пирена в изобестической точке спектра испускания при 440-445 нм может использоваться для определения диапазона концентраций зонда в биологических мембранах, в котором эксимеризапия контролируется преимущественно диффузией и зависит от микровязкости липидного окружения, а также для оценки тушения флуоресценции пирена в мембранах, не зависящей от микровязкостя липидов.

2. При температурах выше 30 °С для эритроцитарных и 35 °С для синаптических мембран изменение коэффициента эксимеризации пирена (1е/1т) обусловлено температурно-индуцированным перераспределением зонда в полярные области липидного бислоя и увеличением гетерогенности его распределения в мембранах.

В этих условиях измерение текучести суммарной липндной фазы мембран и лг пидной зоны вблизи мембранных белков с помощью пирена некорректны.

3. Бислойный и прибелковый липидные пулы синаптических мембран различаютс по полярности, температурпо-зависимому перераспрсделешпо пирена и ответу ь расщепление мембранных белков нроназой.

4. Протеолитическое расщепление белков наружной поверхности эритроцитарны мембран вызывает снижение микровязкости в центральной зоне липидного бш лоя и не затрагивает существенно область полярных головок липидов. Эффект протеолиза в липидной фазе отсутствуют у мембран с нарушенными бело! лшшдными взаимодействиями.

5. Протеолиз белков синаптических мембран активирует ПОЛ, опосредованное вь свобожденисм мембраносвязанных металлов переменной валентности.

6. В условиях иигибироваиия ПОЛ протеолиз синаптических мембран приводит снижению упорядоченности и микровязкости, липидов, не связанному с актив; цией эндогенных фосфолипаз.

7. Результаты проведенного исследования подтверждают представление о том, чт белки оказывают упорядочивающее и иммобилизующее влшпше на липиды природных мембранах. Степень этого влияния значительно меньше в эритрощ тарных мембранах, чем в синаптических.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Самойленко С.Г., Окунь И.М., Аксенцев СЛ., Конев С.В. Влшпше температур: на полярность анулярного и бислойного липида синаптических мембран // Ъис физика.-1992.-T.37.-N2.-C.290-294.

2. Самойленко С.Г., Калер Г.В., Аксенцев СЛ., Конев С.В:'Влияние температуры и распределение пирена в липосомах из фосфатидипхолина // Биофизика.-1993 T.38.-N4.-C.649-653.

3. Aksentsev S.L., Samoilenko S.G., Kaier G.V., Konev S.V. Effect of proteolysis on tli state of lipid phase in rat brain synaptosomal membranes // Arch.Biochem.Biophys 1995.-V.316.-N 1 .-P.47-51.

4. Калер Г.В., Самойленко С.Г., Аксенцев СЛ. Тушение флуоресценции пирена биологических мембранах // Ж.прикл.спекгроск.-1997.-Т.64.-К2.-С.204-208.

5. Самойленко С.Г., Калер Г.В. Влияние протеолиза мембранных белков на состой гше липидной фазы синаптических мембран // Тез.докл. 1-го Респ. Съезда БОФБ Минск, 1994.-С.156.

6. Самойленко С.Г., Калер Г.В. Гемоглобин и продукты его деградации - эффектш ные тушители флуоресценции зондов в эритроцитарной мембране // Тез.докл. I! го Респ. Съезда БОФБ.-Минск, 1996.-С.120.

РЭЗГОМЭ

Самойленка Святлана Генадзьеуна

Даследаванис бялок-лшщных узаемадзеянняу у б!ялапчных мембранах метадам! нратэолпу i флгоарэсцэнтпых зондау

Ключавыя словы: прыродныя мембраны, лтщная фаза, анулярпы л i гхщ, пра-тэсшз, палярнасць, мжравязкасць, бялок-лкндныя узаемадзеятп, флюарэсцэнтныя зонды.

На 1заляваных мембранах эрытрацытау чалавека i сшаитычпых мембранах мозга папукоу вывучауся уплыу пратэолпычнага расшчаплення бялкоу на фхз1чны стан лнццау пры дапамозе флюарэсцэнтных зондау nipona i дыфенгпгексатрыена.

Пры выкарысташн штэпауиасш флюарэсцэнцьп шрэна у ¡забестычиым пункце спектра выпраменьвання i тугпэння ёдыстым калием распрацаваны метадыч-ны падыход, яй дазваляе здаходзщь умовы, у яюх зонд раунамерпа размсркавапы у шшдиай фазе, а яго эюлмерызацыя каптрашоецца лпкравязкасцю акружэння. Пака-зана, hito втлб1ралыгае расшчапленне бялкоу вонкавай nasepxHi эрытрацытарных мембран праназай выклйсае пашжэнне м1кравязкасщ у идрафобпай зоне, а не f во-бласщ палярных галовак лгащнага б)слого. Пратэол1з бялкоу сшаптычных мембран aKTbiBipye пераюснае аыс ленде лпцдау (ПАЛ), апасродкаванае металам) пераменнай валентнасщ. Ва умовах шпб1равання ПАЛ апрацоука праназай прыводзщь да па-тжэння М1кравязкасщ 6icnoio. Выяулена адрозненне пам!ж бклошшм i прыбялко-вьш липдпым! пулам! сшаптычных мембран па палярнасш, тэмпературна-залежнаму пераразмеркаванню п!рэна i адказу на пратэол13. BbiiiiKi даследавання пацвярджаюць уяуленне аб упарадкоуваючым i ¡мабьтзуючым уплыву бялкоу на лшды у прыродных мембранах. Ступень гэтага уплыву значна слабей у эрытрацы-тарных, чым у сшаптычных мембранах.

Распрацаваныя эксперыментальныя падыходы могуць выкарыстоувацца у медыка-бгялапчных работах патагенетычнага i дыягнастычнага напрамку.

РЕЗЮМЕ

Самойленко Светлана Геннадьевна

Исследование белок-липидных взаимодействий в биологических мембранах методами протеолиза и флуоресцентных зондов

Ключевые слова: природные мембраны, липидная фаза, анулярный лиши протеолиз, полярность, микровязкость, белок-липидные взаимодействия, флуорес цешпые зонды.

На изолирова1П1ЫХ мембранах эритроцитов человека и синаптических мембре нах мозга крыс изучалось влияние протеолитического расщепления белков на физп ческое состояние лшшдов с помощью флуоресцентных зондов пирена и дифенш гексатриена.

Используя интенсивность флуоресценции пирена в изобестической точке спеь тра испускания и тушение иодистым калием, разработан методический подход, пс зволяющий находить условия, в которых зонд равномерно распределен по лшш; ной фазе, а его эксимеризация контролируется микровязкостью окружения. Показе но, что избирательное расщепление белков наружной поверхности эритроцитарны мембран проназой вызывает снижение микровязкости в гидрофобной зоне, но не области полярных головок лшшдного бислоя. Протеолиз белков синаптически мембран активирует перекисное окисление липидов (ПОЛ), опосредованное метш лами неременной валентности. В условиях ингибирования ПОЛ обработка проназо приводит к снижению микровязкости бислоя. Выявлены различия между бисло! ным и прибелковым липидными пулами синаптических мембран по полярносп температурыо-зависимому перераспределеншо пирена и ответу на протеолиз. Рс зультаты подтверждают представление об упорядочивающем и иммобилизующе] влиянии белков на липиды в природных мембранах. Степень этого влияния значт тельно слабее в эритроцитарных, чем в синаптических мембранах.

Разработанные экспериментальные подходы могут быть использованы в медт ко-биологических работах патогенетического и диагностического направления.

SUMMARY

Samoilenko S.G.

The investigation of protein-lipid interactions in biological membranes by methods of proteolysis anil fluorescent probes

Key words: natural membranes, lipid phase, annular lipid, proteolysis, polarity, microviscosity, protein-lipid interactions, fluorescent probes.

' The influence of proteolysis on the state of lipid phase in isolated membranes from human erythrocytes and rat brain synaptosomes has been investigated using the fluorescent probes pyrene and diphenylhexatriene.

Using intensity of pyrene fluorescence at the isobestic point of emission spectrum and quenching with potassium iodide, a new methodical approach has been developed for finding conditions at which the probe is moving unrestrictedly throughout the bilayer while excimerization is controlled by microviscosity of microenvironment. It is shown that selective splitting with pronase of the proteins located at the external surface of erythrocyte membranes results in a decrease of microviscosity in the hydrophobic rather than polar zone of the lipid bilayer. Splitting proteins in isolated brain synaptic membranes activates lipid peroxidation mediated by metals of variable valency. Under inhibition of peroxidation the treatment with pronase leads to a decrease in bilayer microviscosity. Differences have been revealed between bilayer and annular lipids as described by polarity, temperature-dependent redistribution of pyrene and responses to proteolysis. The results support an idea on ordering and immobilizing effect of proteins on lipids in natural membranes. This effect is significantly weaker in erythrocyte than in synaptic membranes.

The elaborated experimental approaches can be applied in medical and biological works in pathogenetic and diagnostic directions.