Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование физико-химических характеристик глутаматсвязывающих мембранных белков ЦИС и их функций в протеолипсомах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование физико-химических характеристик глутаматсвязывающих мембранных белков ЦИС и их функций в протеолипсомах"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи

БЕСЕДИН Владимир Иванович

УДК 612.822.1+612.815.1

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ГЛУТАМАТСВЯЗЫВАЮЩИХ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ ЦНС И ИХ ФУНКЦИЙ В ПРОТЕОЛИПОСОМАХ

03.00.04 — биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД 1987

Работа выполнена в Отделе нейрофизиологии человека (рук. — академик Н. П. Бехтерева) Научно-исследовате'льского института экспериментальной медицины АМН СССР.

Научный руководитель: старший научный сотрудник, кандидат биологических наук С. А. Дамбинова.

Официальные оппоненты: профессор И. П. Лапин, докт. мед. наук В. С. Гуревич.

Ведущее научное учреждение — Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. I шнград.

на .заседании Специализированного Ученого совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук (К 001.23.01) в Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины АМН СССР (197022, Ленинград, Кировский пр., 69/71).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института по адресу: Ленинград, ул. акад. Павлова, 12.

Защита состоится

1987 г. в

час.

Автореферат разослан

1987 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, канд. биол. наук

Ж. Г. Александрова

- - I

' | ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для понимания тонких механизмов деятельности головного мозга млекопитающих, включая мозг человека, необходимо дальнейшее изучение метаболических процессов, лежащих в основе проведения высокоскоростных сигналов в ДОС (Бехтерева, 1980, 1987). Б настоящее время многие особенности метаболизма нейронов и превращений нейромедиаторов в синапсах изучены достаточно полно. Вместе с тем, при детальном анализе функций нейронов оказывается, что большинство неизученных вопросов, касающихся механизмов высокоскоростной передачи сигналов, связаны с необходимостью углубленного исследования молекулярной организации нейрональной мембраны, природы и свойств ее важных структурных компонентов - рецепторов для нейромедиаторов (Дамбинова, IS83, 1986; Сергеев, Иимановский, 1986).

В последние годы в качестве одного из основных возбуждающих нейромедиаторов головного мозга предлагается L-глутамат ( Snyder, 1961; ?oeter, Fagg, 196*0. Были представлены доказательства существования глутаматных рецепторов на мембранах нейронов ( Curtis, Watklns, I960; Watklns, Evans ,. 1981; Mono-gham, Cotman, 1986; Крышталь и др., 1984, 1986). Интерес к этому типу рецепторов резко возрос после появления работ, касающихся широкой распространенности глутаматергических путей в разных структурах головного мозга: нервных клетках зрительной и моторной зоны коры больших полушария, нейронах гип-покампа, гипоталамуса, мозжечка и полосатого тела и др.СРошт, 1983, 198*0. Зто обстоятельство позволяет предполагать, что глутаматные рецепторы принимают участие в осуществлении высших функций мозга человека, например, в развитии мыслительных процессов и в механизмах памяти ( Bsuflry, lynch, 198*1) - Кроме того, для клинической неврологии имеют значение сведения о связи нарушения функции глутаматных рецепторов и раепростране-н:;л гипервозбуждения в ряде подкорковых структур мозга, в частности, при эпилепсии ( Kel&rum, 1980, I9S1»; Bradford, Peterson, 1986; Раевский, Георгиев, 1986). В связи со сказанным становится понятной актуальность изучения глутаматных рецепторов как для оо^етеоретичееккх проблем нейробиологии, например, эволюция хемореце:щ;:и, так и для практической медицины, с

цель» выработки оптимальных фармакологических средств, воздействующих избирательно на глутаматергические системы мозга, пораженные при эпилепсии.

Глутаматные рецепторы ЦНС изучены значительно меньше, чем рецепторы других нейромедиаторов головного мозга. В большей степени это касается молекулярной природы и функциональной организации рецепторов глутамата. Практически не изучены их физико-химические свойства, пространственная организация и функции рецепторов глутамата в разных модальных системах, например, протеолигюсомах.

Вместе с тем очевидно, что решение этих задач не будет полным без изучения структуры и функции изолированных препаратов глутаматных рецепторов. Несмотря на то, что анализ молекулярных свойств очищенных глутаматных рецепторов имеет ряд трудностей методического характера, тем не менее существует возможность изучения функции этих рецепторов в разных модельных системах с помощью биохимических подходов. Исследование функции указанных рецепторннх макромолекул путем реконструкции их в замкнутые искусственные фосфолилидные мембраны - липосомы и/или плоские бисдои позволяет получить данные о молекулярной организации хеморецелторного хомплекса, отражающие его функцию "в чистом виде". С практической точки зрения, исследования функции глутаматных рецепторов в протеолигюсомах могут найти применение для направленного транспорта лекарственных препаратов в головной мозг млекопитающих.

Исследования глутаматных рецепторов в Отделе иеГфофизио-логии человека НИИЭМ АМН СССР проводятся в рамках программы "Фундаментальные науки - медицине" по разделу 02.11.08 (изучение механизмов функционирования хеморецептивных мембран) и "Мозг" по разделу 4.1.3 (физиолого-биохимические основы устойчивых патологических состояний ЦНС).

Цели и задачи исследования.

Основной целью работы является изучение физико-химических свойств глутаматсБЛЗывашцих мембранных белков головного мозга крыс и исследование их функции в протеолипосомах.

Были поставлены следующие задачи:

I. Выделить и очистить препараты глутаматсвязывающих мембранных белков из синаптических мембран коры больших полушарий головного мозга крыс.

2. Провести анализ физико-химических овойств очищенных препаратов глутаматсвязываюцих мембранных белков.

3. Исследовать кинетику транспорта катионов ^на+, ^Са++ и НЪ*' в протеолипосомах, содержащих встроенные глутаматсвяч зывающие мембранные белки.

1». Изучить возможность направленного транспорта протеоли-посом в головной нозг крыс линии Крушинского-Молодкиной.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Солюбилизированный и счищенный препарат глутаматсвязы-вавдих мембранных белков представляет собой гликопротеид-липид-ный комплекс, состоящий из нескольких субъединиц с молекулярной массой 14 кД и соответствует по своим кинетическим параметрам связывания физиологическому рецептору глутамата.

2. Наиболее устойчивой информацией препарата глутамат-связывающих мембранных белков является тетрамер с молекулярной массой 52-60 кД , который под воздействием нейромедиатора может ассоциировать в более высокомолекулярные компоненты.

3. Моделирование ионофорной функции глутаматных рецепторов головного мозга свидетельствует об избирательном накоплении ионов, Яа+ в протеолипосомах, содержащих встроенные глута-матсвяэывакцие мембранные белки.

Разработана экспериментальные подходы к направленному транспорту лекарственных препаратов, инкапсулированных в про-теолипосомы, в головной мозг крыс линии Крушинского-Молодкиной, обладавших генетической склонностью к аудиогенным судорогам.

Научная новизна и теоретическое значение работы.

Выполненное исследование является одним из первых, проводимых у нас в странс и за рубежом, посвященных изучению молекулярной природы и свойств глутаматных рецепторов головного мозга млекопитающих. Биохимическая характеристика препаратов глутакатсвязывающих мембранных бстпов, изолированных от синап-тически;; мембран, позволяет дополнить факты, касающиеся меха-ни?мов функционирования одного из наиболее значимых нейроре-цспгороз, которые до сих пор изучаются преимущественно с помощью электрофизиологичесп/." подходов. Впервые продемонстрирована возможность изучения метаболической регуляции ионселектив-ной функции этих белков, реконструированных в протеолипосомы, и их пространственной и;таяизации з протеолипосомах с помощью моноклональных антител к ГМЕ. Впервые обнаружено, что выделен-

т 6 -

ный и очищенный из яда паука Дг£1сра 1оЬага нейротоксин -аргиопин способен не только блокировать ионселективную функцию глутаматных рецепторов насекомых, но и влиять на рецепторное связывание 1-%-гвутамата с очищенными фракциями ГМБ мозга крыс. Это свидетельствует об эволюционной близости глутаматных рецепторов у беспозвоночных и позвоночных. Полученные данные дополняют и расширяют общетеоретические представления о ходе эволюции химических факторов переноса информации в разнообразных биологических системах.

Научно-практическое значение полученных результатов.

Полученные результаты могут оказаться полезными для выяснения механизмов патогенеза некоторых заболеваний нервней системы, в частности, эпилепсии и поиска новых антиэпилепгических фармакологических препаратов.

Разработанная нами методика реконструирования глутамат-связывающих мембранных белков в липосомы позволяет создать модельную систему, не которой можно изучать избирательное действие разных биологически активных веществ на ионтранспортирую-цую и нейромедиаторузнапцую функции рецептора. Это расширяет возможности скрининга фармакологических препаратов, которые селективно воздействуют на разные этапы глутаматергичесхой передачи и обладают выраженным противосудорожным эффектом.

Данные, полученные в экспериментах с крысами линии Крушин-ского-Молодкиной, у которых имеется наследственная предрасположенность к аудиогенным судорожным припадкам, позволяют сделать вывод о том, что протеолипосомы с инкапсулированными в них лекарственными препаратами могут служить перспективными векторами для направленного транспорта этих препаратов в головной мозг. Протеолипосомы не обладают токсичностью и способствуют пролонгированному терапевтическому эффекту ряда фармакологических средств ентиэпилептического действия, включая пептидные препараты.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на совместном заседании Отдела нейрофизиологии человека (рук .отдела - академик Н.П.Бехтерева) и Отдела биохимии (рук.отдела -академик АМН СССР А.Н.Климов) НИИ экспериментальной медицины АМН СССР.

Основные результаты работы доложены на Ш Советско-Шведском симпозиуме по физико-химической биологии (Тбилиси, 1981г),

на 15 конференции ФЕБО (Москва, 1984 г.), на 5 Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986 г.), на 6 Конгрессе Европейского нейрохимического общества ( Прага, 1986 г.).

Публикации . Материалы диссертационной работа отражены в двух отчетах по темам НИР: "Изучение некоторых биохимических характеристик глутаматсвязывающих рецепторов мембран различных ' структур головного мозга при разных функциональных состояниях", номор гос. регистрации 02830042641 (1980-1982) и "Изучение молекулярных, ионофорных и фармакологических свойств глутамата рецепторов ЦНС", номер гос. регистрации 02860065534 (1982-1985).

Объем и структура диссертации . Диссертация изложена на 142 стр. и состоит из введения, обзора литературы ( главы I, 2), методов исследования ( глава 3), материалов собственных исследований ( главы 4, 5), обсуждения результатов и выводов. Работа иллюстрирована 31 рисунками и содержит 7 таблиц. Список литературы представлен 30 отечественными и 124 иностранными ссылками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Опыты проводили на беспородных самцах крыс. Синаптические мембраны выделяли из коры головного мозга методом дифференциального центрифугирования с модификациями (гик1п et а1 1974). Чистоту выделенных препаратов синаптаческих мембран контролировали элег.тронномикроскопически и по активности ферментов маркеров : на"1', К^-АТРазн, цитохромоксклазы и глутаматдекарбоксила-зы.

Оолюбилизэдйю слнадтических мембран проводили в буфере содержащем 0,6-процентный тритон Х-100 или 0,5-процентнкЙ деэок-сихолат натрия, 50 ыМ трис-ЕС1, рН 7,4; I мМ дитиотриэтол; 0,1 (¿Л йенилметилсульфонилфторид (ФМСФ).

Для выделения фракции нпзкомолекулярннх мембранных белков и одновременного отдаления избытка дезоксихолата натрия использовали гельфильтрацию на сеФадексе 0-25. Колонку уравновешивали п дотировали буф», ром трис-НС1 50 М, рН 7,4, содержащим

С,I % дйзоксг.холат натрия (Даабкнова, Бесьдан, 1982).

Аффинную хроматографа» прсшмдиля на муталат-оейарозе 'ИЗ. Бс-дки, обладающее сродством :: гяутакату отделяли путем повышения ионной силы рабочего буфера ( I M SaCI). А''-lniiHyv хроматограф» на Кое-А-агарозе проводили, используя коммерческий аппарат £ирмы (Дамбиноае, Беседан, 1582). Дополнительную очистку препаратов ГГ.ТБ проводили на жидкостном хроматографе высокого давления ¡Тирглн 'Gilsau" (ФраягрО на колонках Т S К-ЗШО,

Гомогенность выделенного ГТ.1Б контролировали методами натавяого и SD3 -сдакгр&Торзза в ШАГ, иэоэлектро-.Тюхубироваияя.'А|.ИН0И!СЛ01'И1:Й состав очищенных ШБ определяли посла их гидролиза 6 к KCl в течение 72 ч с использованием анализатора AAA-86I. Определение содержания углеводов проводили по методу ( Dubois , I&56). Аминосахара определяли по ( w»lborgJ963), опаловые кислоти по (Туманова, 1902), липеды определяли по (Frings, 1970), (Т'ОсТюдишщы идентифицировала методом ' ТСХ на силак£геле ловеличине JRf (Зубер, 1982). Для анализа H -концевой аминокислоты использовали дансильниЗ метод (Grey, 1972).

Флуоресцентные измерения были выполнены на спектро^луориметре " Hitachi " (Япония). Спектры кругового дихроизма регистрировали при 20 на дихрографеliark-lll~S (Франция).

Иодирование Г7/Ш проводили яо методу ( Чард,1981), с использованием хлорамина Т, Авторациографио иодированных препаратов провопили непосредственно аппликацией гелей на рентгеновскую пленку (PT-I, СССР), которую проявляли через 2 суток.

Протеолипосомы готовили по методу, описанному в работе (Босе'дин и ДР., 1985). Изучение юшатикк поглощения катионов и е6ЕЪ +

и протеолкпосомами проводили путем равновесного связывания

о применением фильтров фирмы " Amicon " (E.1-I0, модель 2.Голландия).

Моноклоняльные антитела к ШБ мотили флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) по методу ( KaacheJ98I).

Глутаматсвязывающую активность очищенных препаратов ШБ проверяли путем инкуйащш их с X -%-глутаматем. I Испытание действия препаратов аргкопина и эндогенного Фактора ин-. тибирующего связнзанлв Ь-глутамата (®С) на развитие судиогенного судорожного припадка проводи.™ у крыс линии Крушикского-Ислодкиной. При тестировании крыс, которым вводили в субокципительну» цистерну гМ03га инкапсулированные в прстзолипосо№ исследуемые препараты, оп-..раделшш степень припадка и длительность латентного периода. Отбирали г.рыо, у которых наблюдали один тип припадка - двигательное возбуждение, заканчивающееся тоническим напряжением всел мускулатурн.

- ? -

Статистическую обработку данных проводили напараштричооким путем определения среднего отклонения (Ашиарпн п др., .975).

РЕЗУЛЬТАТЫ И IJX ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и очистка изолированных препаратов глутаматсвязывающих мембранных белков ^ГМЬ)

Известно, что выделение и очистка рецепторных макромолекул для нейромедиаторов - аминокислот являвтся одной из основных возможностей их идентификации и четкого разграничения хе-морецепторных процессов от ферментативного метаболизма и транспорта аминокислот в синапсах. К настоящему времени имезтся лиаь несколько удачных попыток выделить и очистить глутаматные рецепторы из синоптических мембран головного мозга (Michaelis et al.f 196';). Однако до сих пор убедительных данных в пользу принадлежности выделенных ГМБ к физиологическим рецепторам глу-тамата не представлено.

При выделении ГИБ ш столкнулись с двумя основными трудностями. Первая - это термолабильность рецгпторнопо белка и зторая - его высокая склонность к спонтанной агрегации. Для преодоления указанных трудностей все стадии выделения и очистки проводили при 4°С и использовали определенную концентрации детергента в рабочем Оуфере, кроме того все стадии очистки проводили с максимально возможной скоростью. Время полуинактивации очкденного ГМБ составляло Зб-'й час после выделения.

Наиболее оптим&чьным оказалось использование Яа-дезокси-холата для содюбняизации. Предварительные эксперименты показали, что эти детерге! :ы удаляли практически всю глутаматзвязы-ваюцуи активность с плазматических синалтических мембран, что свидетельствовало о вероятном близком расположении глутамат-узнагаих рецепторных компонентов к поверхности мембраны. Эти данные не согласуются с предположением Михаелис ( Michaelia et sl., I97S) о прочной связи глутаматсвязывающих белков с мембранным матриксом.

Фракционирование солкбилизирозанных тотальных синалтических белков в градиенте глицерина 5-15% выявило три основных пика, причем наибольший ¡фоцект связывания радиоактивного глу-таматз соответствовал низхонолекулярной зоне градиента в об-

ласти 60000-12000 дальтон. Преинкубация синаптических белков с избытком немеченного глутамата перед центрифугированием в градиенте глицерина сдвигала зону радиоактивности в легкую область градиента, что свидетельствовало в пользу специфичности связывания радиоактивного глутамата с солюбклизированными белками.

' Низкомолекулярные фракции глутаматсвязывающих белков, выделенные гель-фильтрацией, составляли около % общих синаптических белков и обладали высокой удельной активностью связывания радиоактивного глутамата. Дальнейшую очистку белков проводили двуступенчатой аффинной хроматографией.

Исходя из профилей элюции низкомолекулярных мембранных белков через глутамат-сефарозу, можно сказать, что I— пик соотэетствует мембранным белкам, не связавшимся на сорбен-' те, в то время как второй пик снимается при повышенной ионной силе. Это свидетельствует о сродстве фракции мембранных белков к глутамату. Поскольку присоединение глутамата к сефарозе идет через аминогруппы (Туркова, 1981) и связывающие участки имеют • хорошую стерическую доступность, то можно предполагать, что сохранение карбоксильных групп на "пришитой" молекуле глутамата играет важную роль во взаимодействии нейромедиатора с узнающим центром рецепторной макромолекулы.

Следующий этап очистки (5елков, обладающих сродством к глутамату, проводили на КонА-агарозе, Выделенные глутамат-связывающие белки сорбировались на КонА-агарозе и снимались в присутствии 0, % раствора е<-метил-Д-маннопиранозида. Кон А-растительный лектин - связывался обычно с углеводными группировками белковых молекул, следовательно анализируемая фракция мембранных белков представляла собой гликопротеин. Эти результаты подтверждают данные Михаелиса ( ШсЬаеНв е1;е1., 1979) о гликопротеиновой природе глутаматсвязывающих мембранных белков .

Исследование глутаматсвязываюцей активности выделенных после аффинной хроматографии мембранных белков показало, что на последней стадии очистки связывание 1-^Н-глутамата с фракцией ГМБ превышало более чем в 500 раз активность исходных «Реакций синаптических белков. Оказалось, что очищенные ГМБ имели при есз-электрофорезе гомогенный пик в области 14 кД и содержали минорные высокомолекулярные компоненты.

Это побудило нас провести дополнительную очистку ГМБ • методом гель-фильтрации с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Типичные хроматограммы очищенных препаратов состояли из спектра белковых компонентов, содержащихся в. очищенном препарате ГМБ, которые можно было разделить на высокомолекулярные и низкомолекулярные фракции, соответствующие по молекулярным массам 112, 54 и 14 кД. Определение глутамат-связывавщей активности в каждой фрахции свидетельствует о том, что все они обладают высоким сродством к 1-^Н-глутамату. Возможно, что высокомолекулярные компоненты представляют собой конгломераты из субъединиц, имеющих массу 14 кД, т.к. их предполагагмые молекулярные массы кратны 4 и 8 субъединицан ГМБ.

3 последние годы появились сообщения, подтверждающие предположение о том. что нативныЛ глутаматный рецептор существует внутри синаптической мембраны в агрегироваккош состоянии. Предполагает, что выделенная при солюбилизации фракция глутаматсвязывающих мембранных белков (ГМБ) с молекулярной массой 13,8 кД является только фрагментом (субъединиизй) полного хеморецепторного комплекса. Эти выводы сделаны на основании измерений молекулярного размера участков сиНалтических мембран, специфически связывающих ь-глутамат и квисквелат методом радиационной инактивации ( Ввгйэ1еу et в1., 1965).

Для выявнения параметров связывания ь-%-глутамата с низкомолекулярной фракцией солюбилизированного рецептора были использованы условия иикубацки, аналогичные для связывания с синаптическими мембранами (Дамбинова, Городинский, 1-984). Оказалось, что в этих условиях насыщение связывающих участков при низких концентрациях т<-%-глутамата не достигалось. 3 связи с этим бь!ли использованы более высокие концентрации связывающегося лиганда. Анализ дг-.чных в координатах Скэтчар-да ( Зсв1;сЬвг<1, 1949; Барфаломеев, 1585), по крайней мере на линейном участке связывания, свидетельствовал о наличии однородной популяции глутаматсвязывающих участков с Кд ЕОО-ЮСО н!1 и В„„„„ 160-200 пмоль/кг белка.

М Сш О '

Как было ранее показано А.л.Городинским (1985), в мемб-раносвязанной форме глутг.катсвязкваявде рецепторные участки имели следующие параметры: К 180-2С0 нМ и Вмакс 1,5-4,5 пмоль/ мг белка. Легко видеть, что после солюбилизации глутаматного

- 12 -

' >

рецептора на синоптических мембран характер связывания ней-ромедиатора резко изменяется. Подобный эффект наблвдали Ми-хазлио и со авт. ( М1еЬм11я «г «1., 1981), которые показали, что Кд для очищенного рецепгорного белка, связывающего глута-к«, колебалось х пределах 650-800 нМ, в то время как мембра-иосвязанный рецептор имел Кд около 200-300 иМ. Авторы предположили, что такое снижение сродства медиатора к рецептору обусловлено, по-видимому, изменением микроокружения бедка, в частности, нарушением белок-липидного взаимодействия. С навей точки »рения, в подобный эффект может вносить вклад также нарушение стехиометрии субъединиц рецептора и их пространственно! организации в ходе выделения и очистки.

Химический состав очищенных препаратов глутаматсвязывающих мембранных белков головного мозга крыс

Для описания структурной и пространственной организации гаутама»них рецепторов головного мозга необходимо исследование химического состава компонентов, составляющих макромолекулу рецептора. В настоящее время попытка анализа аминокислотного состава глутаматсвязыв&юцего мембранного белка и >-концевой аминокислоты представлена в работе U их оазиса и др. ( Micba-•11а at al.( 1984). Однако критерии гомогенности выделенного мембранного белка у этих авторов были явно недостаточны для проведения такого исследования, так как практически были представлены лишь данные, касающиеся частично очичейНой фракции ГМБ 13700 дадьтон, обнаруженные при SDS-электрофорезе.

Гомогенность выделенных фракций ГМБ контролировали с помощью метода изоэлектрофокусирования, позволяющего увидеть незначительные примеси чужеродных компонентов.

По данным разделения фракции ГМБ с молекулярной массой 14 ' кД а градиенте рН 3,5*9,5, низкомолеку-

лярная фракция ГМБ содержит единственную полосу, соответствующую изоэлектрической точке при рН 4,7.

Другим критерием гомогенности выделенного препарата ГМБ 'является определение в-концевой аминокислоты. Мы попытались определить и-концевую аминокислоту с помощью дансилхлоридно-го метода по Грэю ( Gray, 1967). Исследование дансильных производных аминокислот методом тонкослойной хроматографии

на полиамидных пластинах до и после гидролиза ГИБ обнаружило, что на Я-концевок участке белка, по-видимому, находится тирозин. Полученные нами результаты подтвердили ранее описанные данные Михаэлиса и соавт. (ШсЬмИя а1., 1981) о тому что на * -концевом участке очищенной низкомолекуляркой фракции ГКБ находится тирозин.

В таблицах I и 2 представлен химический состав (липиды и аминокислоты) очищенных глутаматсвязывавдих мембранных белков. Суммирование молекулярной массы общих аминокислотных остатков. обнаружило, что она составляет около 10 кД.. Эти данные соответствуют в общей виде результатам, полученным при электрофорезе и высокоэффективной хроматографии очищенной фракции ГМБ. Поскольку молекулярная масса субъединицы составляет 14 кД . можно предположить, что остальной вклад в молекулу ГМБ вносят углеводные и липидные компоненты.

Действительно, содержание углеводов в макромолекуле глу-таматного рецептора не превывает 2,2% от содержания общего белка. Наибольшая доля в углеводном компоненте мембранного рецептора приходится на галактозу (6,82), маннозу (б.3£). глюкозу и

В-ацетилглюкозамин (10,;$). Остальные углеводы и сиаловые кислоты представлены в незначительных количествах.'

Важная роль лилидных компонентов в поддержании структуры и функции глутаматного рецептора не вызывает сомнений: полная или частичная делипидизация мембранного белка ведет к инактивации и потере чувствительности к глутамату. Среди идентифицированных липидов, экстрагируемых из глакопротеидлипидных комплексов рецептора, были обнаружены холестерин и фосфолипиды. содержание которых не превышает 1,05 мг на мг белка. Большинство фосфолипидов приходится на фосфатидилэтаноламин. фосфа-тидилхолин и др. в незначительных количествах.

Следует отметить, чтовсостав очищенных препаратов ГМБ могут входить фракции пептидов, обладающих высоким сродством к глутаматному рецептору (Дамбинова и др.. 1984»). Одна из этих фракций, специфически ингибируюдая связывание Ь-глутамата с синаптическими мембранами (Городинский, 1985), обнаруживалась в составе ГМБ, прошедшего все стадии очистки, включая высокоэффективную жидкостную хроматографию. Удаление "примесных" пептидов с белковой фракции требует специальных приемов осаждения и промывки препарата ГМБ.

Таблица I

Химический состав синаптических мембран и солюбилизированного глутаматного рецептора

Фракции Содержание липида: мг на 1мг белка Основные лип иды Соотношение фос— фол ипид/холестерин, моль/моль

Синаатические мембраны 1.2 X, ФХ. с§ ТГ, 1,3

Солюбилиэирован-ный и очищенный глутаматный рецептор 0,1 Й. ФХ. X 1.7

$Х - фосфатидилхолин, $3 - фосфатидилэтаноламин, С$ - сфинги-миелин, X - холестерин, ТГ - триглицерин.

Таблица 2

Аминокислотный состав очищенного глутаматсвязызающего белка, выделенного из синаптических мембран коры головного мозга крыс

Число ос- ■ Число ос- Число ос-

Амино- татков на Амино- татков ва Амино- • татков на кислоты I остаток кислоты I остаток кислоты I остаток

серина серина серина

Асп 3,8 Иле 5,8 Оксипролин 1.2

Тре 2.1 Леи 6,5 Тир' 3,0

Сер 1,0 Фен 7,2 Три 6,0

Глу Гис 2,6 Цис 1,2

Гли 4,5 Лиз 5,0 З-Метилги- 2.1

стидин

Ала 4,4 Арг 1,2

Вал • 6,3 Про 1,3

Данные по определенно аминокислотного состава ГМБ были использованы при расчете формы и конформации глутаматного рецептора (Дамбинова, Хромов-Борисов, 1985), основанной на сопоставлении объемов полярных и неполярных аминокислотных остатков.

$изико-химические свойства очищенных препаратов ГМБ

Для уточнения механизма олигомеризации ГМБ нами была проведена серия экспериментов, характеризующих физико-химические свойства макромолекулы рецептора.

Поскольку по данным аминокислотного анализа в молекуле ГМБ имеется приблизительно один цистеиновый остаток, нельзя, исключить возможности о л иго м ер и з ац ии «п осре дС тво'м Образования-дисульфидной связи. В связи с этим было проведено исследование седиментационних характеристик ГИБ в градиенте сахарозы в присутствии высоких концентраций дитиотриэтола - реагента, расщеп-ляоцего дисульфидные связи. При этом выявлено, что гидродинамические параметры форм ассоциированного ГМБ (3,5 Э) не изменились и соответствуют молекулярному вьсу макромолекулы порядка 28 кД , в то время, как молекулярная масса оубъединицы в денатурирующих условиях в присутствии додецидсульфата натрия составляет I*) кД (2,1 3). Этот факт подтверждает предположение о том, что оЛигомеризация глутаматных рецепторов происходит за счет гидрофобного взаимодействия и. согласуется с данными, полученными методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Кроме того полученные данные позволяют предположить, что степень агрегированности рецепторного белка определяется степенью диссоциации молекулы рецептора, которая происходит при изменении концентрации белка.

Вполне вероятно, что макромолекула глутаматного рецептора состоит из несвязанных дисульфидными мостиками диссоциированных компонентов, которые ассоциируются под действием нейро-медиатора, так как было обнаружено, что при добавлении неме- • ченного глутамата степень агрегированности ГМБ повышается. В этом случае не исключено, что механизм регуляции ионной проницаемости могут представить ассоциации-диссоциации субъединиц рецепторной макромолекулы под влиянием глутамата.

Вывод о том, что олигомеризация происходит «а счет гидрофобного взаимодействия, подтверждают данные исследования спектров кругового дихроизма ГМБ, спектров флуоресценции, характеризующих внутримолекулярный г эренос энергии с тирозина на триптофан и с триптофана на ЖГЦ при разной температуре и концентрации мочевины.

Исследование влияния различных концентраций мочевины

на спектры флуоресценции, характеризующие внутримолекулярный перенос энергии с тирозина на триптофан показали, что вклад флуоресценции тирозина в спектр собственной флуоресценции белка максимален в растворе 4 М мочевины и отсутствует в растворах 2 М и 8 N мочевинц. Слабая флуоресценция триптофана и отсутствие флуоресценции тирозина при концентрации мочевины 2 Н указывают на то, что ГИБ находился в агрегированном состояния. Это подтверждается также спектрами флуоресценции моченного фхуороиэотиацианатом (£ИТЦ) ГМБ, характеризующими перенос энергии с триптофана на МГЦ в зависимости от температуры. При этом флуоресценцию возбуждали при 290 нм (триптофан), а регистрировали при 340 и 560 нм (триптофан и ЗИТЦ соответственно). В том случае, когда ГМБ находился в растворе 2 М мочевины при нагревании образца, наблюдался излом в координатах Арреыиуса. что указывает на существование при этой концентрации упорядоченной структуры. Кроме того, расчет соотношения элементов вторичной структуры ГМБ при 20°С на основании спектров кругового дихроизма показах, что в случае 2 М мочевины доля е£, £ и нерегулярной конформации (с поправкой на ароматические аминокислотные остатки белка) составляла 1б, 24 и 602 соответственно.

При высокой концентрации мочевины (6 М) ГМБ не имеет упорядоченных элементов вторичной структуры, т.е. полностью денатуирован и находится в конформации беспорядочного клубка. Об этом свидетельствуют данные КД и переноса энергии с триптофана на 5ИТЦ при изменении температуры и незначительная флуоресценция тирозина и триптофана.

Для того, чтобы выяснить вопрос, какова стехиометрия субъединиц рецептора в нативном состоянии, мы провели анализ фракций ГИБ.с помощью проникающей высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для ГМБ мозга крыс наблюдали спектр белковых пиков на хроматограмме, состоящей из нескольких компонентов разной молекулярной массы. Определение молекулярной массы основных пиков свидетельствует о том, что они представляют собой агрегаты, состоящие из низкомолекулярных субъединиц с массой МкД .. Кроме того, бихо обнаружено, что каждый из выделенных пиков при повторной гельфильтрации снова давал спектр белковых пиков, аналогичных исходному. Замена буфера элации (0,01 М.фосфатного, рН 7,4). аа буфер с более высокой ионной силой

(0,05 К Трис.НС! рН 7,4) приводила к снижение уровня высокомолекулярной компоненты и увеличение компонента с массой 1%

кД ..

Это обстоятельство объясняется, по-видимому, свойствами ГИБ, состоящих преимущественно из гидрофобных аминокислот ■ легко агрегирующих в олигоиерный комплекс за счет образования гидрофобных связей.

Изучение функции глут&натсвязывакцих мембранных белков методой встраивания в липосомы

Для оценки степени нативности очищенных ГИБ можно использовать реконструкцию функции рецептора в модельных системах 1а г«го ; либо путем встраивания их в липосомы, либо путей воссоздания структуры рецептора в бислойной жипкжвой мембране. Б этом случае обычно удается подойти не только х иэучеяию пространственной организации макромолекулы рецептора, но и рассмотреть механизмы регуляции избирательной трансаортной функции в контролируемых условиях. Использование липосом для; этой цели в биохимических экспериментах по вклвчевшв радиоактивной метки оказалось более предпочтительным, так как не требовало дорогостоящей сложной системы электрофизиологкческой регистрации транспорта катионов через искусственнуо мекбрану.

. Б связи со сказанным, моделирование функции я структурной организации хеморецепторного комплекса мы проводили методой реконструкции ГИБ в липосомах. Были исследэваны ляаосомы с различным липидным составом. Оказалось, что процент встраивания ГМЬ в липосои! зависит от наличия холестерина; высокое его содержание резко снижало радиоактивность белковых фракций в зоне флотирующих липосом (белок - ГМБ - предварительно метился Липосомы, состоящие из одних фосфолдаидов, обладали наибольшей способностью встраивать ГМБ. Способность встраивать ГМБ контролировали также путем аффинной хроматографии на Со п-А-агарозе. Липосомы, содержащие гликопротеквы на внешней поверхности липосом, составляли около 35% от общей популяции протеолипосом.

Как выяснилось, моделирование транспортной функции глу-такатных рецепторов зависит существенно от концентрации встроенного в липосомы ГМБ, а также от концентрации вейроиедиатора

в среде инкубации. Оказалось, что количество ГМБ для реконструкции функции рецептора не должно быть ниже определенного предела (50 мкг/мл), так как при сравнительно низких концентрациях белка активации транспорта катионов в присутствии Ь-глутамата не происходило.

Изменение ионной проницаемости протеолипосом в присутствии и отсутствии Ь -глутамата измеряли по поглощению ионов а, ^ КЪ, ^Са. D качестве контроля использовали "пустые" липосомы и липосоиы со^встроенним альбумином. Накопление радиоактивности регистрировали в разные временные интервалы путем промывания протеолипосом на фильтрах Amicon . Данные накопления радиоактивных катионов протеолипосомами в присутствии и отсутствии 1 -глутамата свидетельствуют об эффективности транспортних функций Г.МБ в первые минуты аппликации медиатора.

Зависимость поглощения катионов протеолипосомами в присутствии Ь-глутамата различалась для одно- и двухвалентных катионов. Наибольший эффект избирательноЛ индукции транспорта нейромедиатором наблюдался для катионов в то время

как для Hb + скорость поглощения оставалась на исходном уро не. Динамика накопления отличалась от описанной

для одновалентных ионов: радиоактивность проб в этом случае появлялась позднее, через несколько минут после начала инкубации, что скорее всего можно связать с неспецифическим накоплением его в протеолипосомах.

Подтверждением тому, что ГМБ в протеолunoсомах ориентирован аналогично клеточным рецепторам в интактных мембранах., являются эксперименты с монокл опальными антителами (МКАТ). полученными к ГМБ мозга крыс . Блокирующий эффект МКАТ на_тракс-порт ионов в протеолипосомах появлялся в концентрации 10"° + 10"^ М и был обратимым, причем реакция У.КАТ с лнлосомамн, содержащими ГМБ, требовала длительной инкубации, и эффект постепенно снижался при отмывке протеолипосом. По-видимому, блокирующий эффект моноклональных антител к ГМБ на поглощение

х) Автор приносит глубокую благодарность ст.лаб. O.Ü.Павловой и лаб. О Jl.PyH0E0:i за возможность*работы с моноклональ-ными антителами, полученными к ГМ-.козга крыс.

ОО

ионов "На?" объясняется конкуренцией иммуноглобулина О и глутамата за связывающие участки на макромолекуле встроенного белка, либо экранированием этих участков при взаимодействии антител с антигенными детерминантами, не включающими активный центр рецептора.

Полученные результаты согласуются с данными 1И.сЬве11в ег а1. о нативности выделенных ГМБ и способности их регулировать избирательный транспорт катионов Иа+.

Таким образом, эти данные свидетельствуют в пользу селективности функции ГМБ, реконструированных в липогомах. Очевидно, выделенный и очищенный рецептор сохраняет частично нативнув конфигурацию и пространственную ориентацию в липидном окружении. Особенно важно подчеркнуть тот факт, что исследования с аргиопином - известным блокатором Иа+-хгшалов у беспозвоночных - подтверждают точку зрения, что ГМБ представляют собой макромолекулярную структуру, способную организовать в липосо-мах функционально нативный рецепторный комплекс, управляющий избирательным транспортом ионов На+. Причем, создается впечатление, что ионофорный канал глутаматных рецепторов из нервно-мышечных синапсов беспозвоночных и головного мозга млекопитающих имеет сходства в пространственной организации и составе структурных компонентов, составляющих рецепторный комплекс.

Изучение возможности направленного введения протеолипосом, содержащих пептидные препараты в головной мозг крыс линии КМ

В перспективе современных проблем, касающихся направлений доставки лекарств в головной мозг человека, лежат уникаль-ше возможности, связанные с разработкой и использованием систем специальных переносчиков фармакологических веществ, в ка-1естве которых могут выступать протеолипосомы. Как видно из теоретических предпосылок, они могут способствовать оптимизации действия лекарств, направляя их непосредственно '¿'заданные участки нервной системы и исключая быструю инактивацию препаратов. Кроме того, известно, что липосомы способны вызывать 1ролонгированный эффект за счет ме, :енного локального выхода 1рименяемого лекарства и обладают важным свойством биодегра-;ации в организме.

Известно, что развитие аудногенной судорожной активности у крыс линии Круиикского-Молодкиной связано с нарушением нормального Функционирования систем проведения афферентных импульсов в пределах слуховых структур мозга, включая нейрональные реле УШ пары черепно-мозговых нервов в nucleua oohleario С Uelûrvua et »1., 1981). /.ля понимания феномена аудиогенных судорог необходимо знать, что возбуждающие аминокислоты ( Ь -глутамат и L-аспартат) участвуют в синаг.тичгской передаче в этих структура. Имеются и другие свидетельства участия этих аминокислот в «Нормировании аудиогенных судорсжко-пароксизмаль-ьых реакций. Например, обнаружено, что аудиогенные судороги у генетически чувствительных к ним мышей JUA/2 могут быть предотвращен« вецествами, которые блокируют возбуждение, связанное с действием агоииста ИМДА на глутаматные рецепторы: самым мощным из них оказалась 2-амино-7-«1оо£оногептановад кислота (lieiarum, i960; Раевский, Георгиев. IS86).

С другой стороны, ьельзя не обратить внимание на роль природных пептидных факторов, специфически ингибируюцих связывание 1,-глутрата в регуляции функции глутаматных рецепторов (Городинский, Дамбпновс., IS8Ï).

/ля решения вопроса о фармакологическом действии природных пептидов мы провели исследование свойств узнающих участков, лежащих в основе активирования рецепторного связывания с помощью конкурентных и неконкурентных ингибиторов пептидной природы. В опытах по определению кинетических параметров связывания L -^Н-глутамата с очищенными фракциями PME нами были использованы fHC (фактор ингиОирусвязывание Ь -^Н-глутамата -выделенный А.И.Городинским) л аргиопин (нейротоксин из яда паука Argiopa lobata - пред.'ставлеьниП д.х.н. 2.Б.Гришиным) Ху|. Процесс связывания Ь --,Н-глутам?л'й с очищенными Г МБ имел классическую форму кривой насыщения. Пои увеличении концентрации ?ИС в инкубационной среде от 0,1 мяг/мл до 10 мхг/мл, наклон кривых в координатах Скэтчарда изменялся, что соответствовало возрастанию константы диссоциации К^ от 800 н.М до 2200 нК, причем величина Вмакс практ/чосг/ не менялась. Это означало, что

х) Автор благодарит мл .н.с., к.б.н. Л.'Л.Городинского (Н/ШМ АМН СССР, Ленинград) и вед.н.с., д.х.-.i. Z. 2 .Гришина (Институт биоорганической химии, Москва) за иредостаплей^з пептидов и" интерес к работе.

при увеличении концентрации ¿ИС в инкубационной среде, по-видимому, снижалось сродство ьеЯромедиатора х рецептору, без существенного снижения количества участков связывания.

Напротив, анализ реакции связывания Х-^Н-глутамата с очищенными фракциями ГМБ при увеличении концентрации аргиопи-на в инкубационной среде показал, что наклон кривой в координатах Ск&тчарда не изменил своего характера, а лишь уменьшилось количество участков связывания. По-видимому, в основе этого явления лежит обратимое взаимодействие аргиопина с такими группами макромолекула рецептора, которые не принадлежат активному центру узнающего участка рецептора глутамата.

Казалось целесообразным провести сравнительный анализ системных эффектов этих пептидов, которые могут оказаться полезными для дальнейшего поиска фармакологических средств про-тивосудорожного действия. Поведенческие реакции контролировали по типу судорожного припадка и в этих экспериментах наблюдали за следующими параметрами: длительностью, интенсивностью, латентным периодам с момента подачи звукового сигнала до развития судорог.

В таблице 3 представлены данные сравнительного анализа системных эффектов ЗИС и аргиопина на развитие тоникоклоничес-ких судорог у крыс КМ. Внутримозговое введение аргиопина показало, что высикоочищенный пептид из яда паука 1оЬа1а обладает более мощным ингибирувщим эффектом на поведенческие реакции, практически полностьп подавляя развитие клонической фазы судорожной активности. Через 30 мин после введения аргиопина у крыс развивалась кататония и торможение ответов на внешние стимулы (свет, звук), что, по-видимому, свидетельствует о высокой токсичности препарата в исследуемых концентрациях.

Результаты этой серии экспериментов свидетельствуют о вовлечении глутаматных рецепторов в формирование аудиогенного зудорохного припадка у крыс КМ. Эти данные хорошо согласуются г результатами исследования Ме1йгит и др. (1984), которые показали, что специфические антагонисты глутаматных рецепторов эффективно предотвращают развитие судорожной активности разного происхождения, в том числе, аудиогенных судорог у мишей.

Естественно, что роль эндоген IX пептидов в генезе и пред-зтвращении судорожных явлений требует дальнейшего исследования, (собенно ото касается возможности практического применения порченных данных в плане фармакологической терапии эпилептических

Таблица 3

Сравнительная аналкз системных эффектов и аргиолина на развитие тонпко-клокических

судорог у крлс линии КЧ

Время Контроль глс Аргиолян ■1ИС инкапсулированный Аргиопин инкапсулированный

I час X + (сек) 12,5 ¿0, ,4 - _ Л*,С ± 1,0 12,8 ± 0,6

'X + (сек) - 102,5 4 4,3 107,5 г 7,5 103,3 ¿3,4 115 4 3,5

Р + ЬР 00 100 13,3 ± 6,2 6,6 ± Л,5 50 ± 9,1 40 4 8,9

'Р + й*р СО 0 100 100 60 4 10,3 50 4

5 час X + (сек) 12,6 ± 0. 11,5 ± 0,7 II 4 0 13,5 4 1.5 14 4 1,0

•х + (сек) - 86,6 1,6 30 ± 2,7 83,7 4 2,9 86,2 4 1,8

р + (?) 100' 27,2 -1 8,1 20 * 7,3 43,3 ± 9,0 33,3 4 8,6

? + ДР СО 0 54,б ± 14,8 83,3 4 15,2 8г(. 6 ± 10,0 90 4 9,4

20 час л + г* (сек) 12,8 ¿0, 37 15,1 ± 0,4 14,6 10Н 12,9 4 0,6 16,5 4 0,28

'х 4 (сек) - 75 ± 2,8 70,5 4 2,6 73,1 4 2,9 66,7 4 1,5

р + АР С*) 100 100 100 100 90 4 5,4

'р + ¿р (Ю 0 20 ± 7,3 1)0 ± 8,9 56,6 4 9,0 85,2 4 б,8

м м

X - - время до начала двигательной актизноста * группе резистентных крыс (сек).

1Х - Зу - время до качала двигательной активности в группе крыс, реагировавшие на введенный препарат удлинением латентного периода (сек).

Р - ДР - количество крыс, дакшх припадок (5 от контроля).

'р - £? - количество крыс, даггзих припадок с задержкой латентного периода (X от общего количества

го^гку ппчпп"': с 1

состояний. Первые попытки в атом направлении представлены в наших исследованиях. Можно надеяться, что полная очистка ФЙС, установление его первичной структуры, а также изучение природных компонентов яда пауков могут лечь в основу создания лекарственных средств, специфически влияющих на глутаматергические пути головного мозга млекопитающих.

В этом случае, одним из важных вопросов, заслуживающих внимания при фармакологической коррекции эпилепсии с помощью . синтетических пептидов является необходимость их длительного присутствия в организме и постепенной утилизации в процессе жизнедеятельности организма. Такая возможность предусмотрена при введении пептидов в липосомах, способных создавать "депо" и проникать через гематоэнцефаличесхий барьер. Вместе с тем подобные исследования имеют свои сложности и требуют существенной разработки применительно к ткани головного мозга, в частности, изучения системного направленного транспорта лекарственных веществ в протеолипосоках.

Нами были проведены предварительные исследования по оценке возможности введения липосом, содержащих пептиды, в мозг крыс линии КМ с целью предотвращения развития судорожной активности, либо изменения длительности латентного периода. Оказалось, что введение крысам КМ в субокципитальную цистерну

крыс 30 мкл протеолипосом, содержащих 10 икг ФИС, приводило к снижению порога возбудимости у животных. Другими словами, у крыс снизилась чувствительность к звуку и требовалось затратить больше времени для проявления судорожной активности. Характер судорог при этом изменился в сторону меньшей выраженности клонических судорог.

Особого внимания заслуживает тот факт, что динамика инактивации введенных пептидов нарастала через 5 час и приближалась к максимальному эффекту через 20 час после введения. Это свидетельствует в пользу медленного выхода пептидоз из липосом в головном мозгу экспериментальных животных. Так, через I час после инъекции инкапсулированных в липосомы ФИС дг/аргиопина количество крыс, дающих аудиогенные судороги составляло соответственно 50 и через 5 час - 20 и 30$, а через 20 час 100 и 85%. Вполне вероятно, что арглопни в этом случае медленнее дифундирует через липидную оболочку, в связи с чем его эффект менее выражен в исследуемый период времени. Необходимо

отметить, что в эти/, экспериментах токсичность аргиопина на состояние и поведение крнс оказалась гораздо слабее, по сравнение с опытами, в которых аргиопин вводили в мозг непосредственно в физрастворе. Очевидно, это также подтверждает предположение о концентрационной зависимости его эффектов, т.к. в случае введения аргиопина в лнпосомах концентрация пептида нарастает в головном мозгу постепенно.

Отметим, что у некоторых крыс припадок при озвучивания не наступач совсем. Контрольное введение "пустых" протеолипосом £ мозг крыс КМ не вызывало подобных изменений. В таблице 3 представлены данные влияния липоссм, содержащих 411С и аргиопин на длительность латентного периода у крыс КМ в процессе развития судорожного припадка. Видно, что введение пептидов в липосомах непосредственно в мозг существенно удлиняет эффект, возможно вследствие постепенного попадания вещества в локальный обмен головного мозга. Дальнейшая разработка путей доставки пептидов г мозг позволит создать новые лекарственные (ормы пролонгированных противосудорожных препаратов и повысить эффективность их действия.

23 и В О Д и

•I. Из головного мозга крыс выделены и очищены в 500 раз глутаматсвязывающие мембранные белки, субъединица которых имеет молекулярную массу 14 кД и кинетические параметры связывания Кд - 600 нМ и Бкакс - 2С0 пколь/мг белка.

■ 2. Субъединеда глутаматного рецептора головного мозга представляет собой гликопротеид, содержащий больсэе количество кислых гидрофобных аминокислот, на Н -концевом участке которого находится тирозин. 3 составе молекулы имеются липидние компоненты.

3. Субъединицы ГМЕ способны к спонтанно:! агрегации с образованием устойчивых тетр&меров с молекулярной массой 56-60 кД, Теоретический расчет (ормц, конформации белков показывает, что ГМБ относятся к интегральным гидрофобным белкам с выраженной асимметрией. , вклад «¿-спиралей - 16#, ^-структур 245.

4. Моделирование ионофорной функции ГМБ путей встраивания их е липосомы, свидетельствует о том, что они сохраиязт

нативность и способность избирательно регулировать транспорт ионов в а+ при аппликаций неЯромедиатора.

5. Природные ингибиторы пептидной природы (<ШС и аргио-пин) способны эффективно ингибировать рецепторкое связывание

L -%-глутамата с очинёнными препаратами ГМБ и могут служить в качестве основы для создания фармакологических противооудо-рокных средств нового класса для лечения эпилепсии.

6. Выявлена возможность использования лротеолипосои для направленной доставки пептидных препаратов в мозг крыс линии Крушииского-Молодкиной с генетической склонность» к аудиоген-ным судорожным припадкам. При инъекции препаратов $ИС и аргио-пина, инкапсулированных в протеолипосомн обнаружен пролонгированный э{фект и меньшая токсичность ввенных пептидов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

I. Дамбинова С.А., Беседин В.И., Демина М.Н., Городинский А.И. Исследование синаптических белков нервных клеток, специфически связывающих глутамат. - Тезисы Ш Советско-шведского симпозиума "$изико-химическая биология", Тбилиси, 1981, * с.181-182.

I. Дамбинова С.А., Беседин В.И. Выделение и очистка оинапти-ческих белков специфически связывающих глутамат, выделенных из мембран головного мозга крыс. - Нейрохимия, т.1, 6 4, 1982. .

!. Дамбинова С.А., Беседин В.И., Городинский А.И., Павлова О.И., Маргулис H.H. Функция глутаматных рецепторов в мембранных везикулах, протеолипосомах и клетках нейробяастомы 2а. Фи-, зиологич.ж.СССР, т.70, № 7, 1984, с.952-960. t. Дамбинова С.А., Беседин В.И., Павлова О.И., Городинский А.И., Маргулис М.Н. Структура и свойства ионных ханалов управляемых Ь-глутаматом. Тезисы 16-ой конференции ФЕБО, Москва, 1984, с.345. ^

. Дамбинова С.А., Беседин В.П., Демина М.К. Молекулярная организация глутаматчувствительных хемовозбудимых мембран нервных клеток. Физико-химические хроажтеристшш очищенных глу-таматсвязывающих белков. Биохимия, т.49, & 2, 1984.

. Дамбинова С.А., Беседин В.И., Городинский А.П., Сурнина'М.В.

Теоретические и прикладные аспекты.исследования глутамат-ных рецепторов мозга человека в модельных системах. Тезисы доклада I Всесоюзной конференции "Принципы и механизмы деятельности мозга человека" Ленинград, 1965, с.120-121.

7. Беседин В.И., Кузнецов A.C., Дамбинова С.А. Молекулярная организация глутаматчувствительных хемовозбудимых мембран нервных клеток. Изучение функции глутаматсвязывающих мембранных белков методом встраивания в лилосомы. Биохимия, т.50, вып.З, & X, 1985.

Ö. Дамбинова С.А., Беседин В.И., Сурнина М.В., Павлова О.И., Маргулис М.К., Городинский А.И. Глутаматные рецепторы ЦНС: Теоретические и прикладные аспекты их исследования. Тезисы доклада 5 Всесоюзного биохимического съезда. Киев, 1986, с .149-150.

9.-ДамОинова С.А., Беседин Б.Й.. Городинский А.И., Сурнияа Н.В. Маргулис М.П. Теоретические и прикладные аспекты биохимического исследования глутаматных рецепторов. Тезисы доклада У1 Конгресса Европейских нейрохимических обществ. Прага, 1986, с.199-200.