Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бактериородопсин: сопряжение фотохимических превращений с трансмембранным переносом протонов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Бактериородопсин: сопряжение фотохимических превращений с трансмембранным переносом протонов"

о

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

а- ь/ОЪЧЪ

^ М-*?*

V¡2.0?.

I На правах рукописи

м

КАУЛЕН Андрей Дмитриевич

БАКТЕРИОРОДОПСИН: СОПРЯЖЕНИЕ ФОТОХИМИЧЕСКИХ ПРЕВРАЩЕНИИ С ТРАНСМЕМБРАННЫМ ПЕРЕНОСОМ ПРОТОНОВ

(03.00.04 — биологическая химия)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва — 1989

Работа выполнена в Межфакультетской проблемной научно-исследовательской лаборатории молекулярной биологии и бмоорганической химии им. А. Н. Белозерского, МГУ.

Официальные оппоненты:

чл.-корр. АН СССР, доктор биологических наук, профессор И. С. КУЛАЕВ,

чл.-корр. АН СССР, доктор химических наук, профессор Ю. А. ЧИЗМАДЖЕВ,

доктор биологических наук В. А. ШУВАЛОВ

Ведущая организация — Институт биоорганической химии АН СССР им. М. М. Шемякина.

Защита состоится « » 1989 г. в часов мин. на

заседании специализированного совета Д.053.05.32 по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

Доклад разослан « » 1989 г.

Ученый секретари специализированного совета кандидат биологических наук

Е. В. ПЕТУШКОВА

6БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ • Актуальность, цель и задач!и исследования. Подтверждение основных постулатов хемиосмотической теории сопряжения окислительного и фотосинтетического фосфорилирования к середине 70-х годов обусловило выдвижение на первый план в области биоэнергетики исследований, связанных с выяснением механизмов функционирования мембранных протонных насосов, то есть механизмов преобразования химической или световой энергии в процессе активного трансмембранного переноса Н+, выяснения механизмов внутрибелко-вого перемещения Я*.

Одним из наиболее интенсивно исследуемых объектов является бактериородопсин (Бр), светозависимая протонная помпа галофиль-ных бактерий на1оЬаавг1ит НаГоЫит, ответственная за своеобразный тип фотосинтеза, наблюдаемого у этих бактерий. Интерес к этому белку обусловлен кажущейся простотой устройства (одна полипептидная цепь 26 кД), необычайно высокой стабильностью и 'легкостью исследования в режиме одного оборота при запуске короткими вспышками света. Принципы функционирования, выявляемые при изучении Бр , могут оказаться полезными для исследования других протонных помп. Вместе с тем, Бр входит в группу рети-нальсодержащих протеидов, хромофорной группой которых является ретиналь, образующий' протонированное основание Шиффа с е-ш2-группой лизина. Кроме Бр, в эту группу входят различные родопсины, обеспечивающие зрительную рецепцию, а такие галоро-допсин - светозависимая хлорная помпа. Сравнительное изучение этих-протеидов открывает новые перспективы в иссл довании механизмов рецепции, акку»4у.чящщ энергии и активного транспорта в биомембранах. Наконец, Бр привлек внимание как потенциальный объект применения в биотехнологии - для получения високочуьст-

витальных материалов для долговременного и оперативного хранения информации и для использования в качестве фотоэлектрических преобразователей. Все это обусловило создание МГУ и АН СССР в 1973 г. целевой программы "Родопсин", в рамках которой было 'выполнено и настоящее исследование.

• Целью настоящей работа являлось выяснение основных принципов функционирования Бр, а именно, выявление последовательности и взаимосвязи стадий переноса зарядов, установление топологии. протоннных путей, выяснение - молекулярных механизмов, лекащих в основе стадий переноса заряда. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать метод,позволяющий исследовать кинетику генерации мембранного потенциала Бр, и установить фазы генерации потенциала;'

■ 2. Путем сравнения кинетик и ингибиторного анализа определить соотношение ме*ду электрогенными стадиями и отдельными реакциями фотохимического цикла;

3. Установить стехиометрию переноса протона Бр, то есть количество Н\ тршслоцируемых через мембрану при каздом обороте фотоцикла;

4. Соотнести фазы электрического ответа со стадиями переноса протона;

5. С целью детализации молекулярных механизмов функционирования Бр определить рН-зависимости фотохимических превращений Бр и фаз^ генерации потенциала; попытаться найти агенты,• влия-ади9 на отдельные стадии транспорта Н4.

Настоящая работа проводилась в Межфакультетской' ПНИЛ им. А.Н.Белозерского МГУ с 1974 г., то есть с момента, когда появились данные о том, что Бр, впервые описанный У.Стокениусом

(США) в 1971 г., функционирует в качестве светозависимого протонного насоса. В это не время, стали известии его основные биохимические характеристики и появились первые сообщения о тем, что при поглощении кванта света Бр претерпевает цикл фотохимических превращений, который сопровождается трансмембранным переносом Н4 (Оев1;ег1геИ;, згоескегиив 1973, Ъоахех» е1:.з1., 197??).

Научная новизна и научно-практическая ценность. В результате комплексного подхода, включающего: а) использование нового оригинального метода пряной регистрации электрического тока, позволяющего исследовать кинетику образования потенциала с разрешением 100 не, <3) регистрации фотохимических превращений Бр с помощь» обычной импульсной спектроскопии, в) исследование быстрой кинетики изменения концентрации Н*" в окруяшмцой молекулы Бр водной среде с применением рН-индикаторов, впервые выявлены и расшифрованы отдельные стадии внутримембранного переноса заряде 8 Бр; обнаружена стадия первичного разделения .зарядов, обусловленная запасанием световой энергии на первой стадии фотохимических превращений Бр и ряд стадий, обусловленных трансмембранным переносом Н+. Установлен двухтактный принцип функционирования Бр как протонной помпы. Выявлено наличие двух протонных путей - входного и выходного. Покачано, что кчвдпй оборот фота-цикла сопровождается тршемвмбранннм переносом одного Н+. Обнаружены причины, приведшие к появлению в литературе ошибочных представлений о . двухпротонном мвх&лиЕМс.. Предложена модель . функционирования Бр. Сделан вывод 'о локализации хромофорной ■ группы вблизи поверхности молекулы Бр, обршцвннон ь клетке к

наружной среде. Изучен махашзм действия ниього класса ингиби- . -.торов Бр.-- ионое поливалентных металлов. ЦолучыШ дашще о конформационных превращениях белковой части Ьр при «го фунниио •

нировании. Выявлена реакция протежирования основания Шиффа за счет внутрибелкового донора протонов; обнаружена зависимость . этого процесса от наличия карбоксильной группы у Asp- 96. Обнаружено сопряжение между процессом изомеризации хромофорной группы и поглощением Н+ при фотоцикле. Опровергнуты общепринятые представления о неспособности темноадаптированчой формы Бр, содержащей. /З-цис-ретиналь, транслоцировать Н+. Предложена модель двух состояний Бр - активного (протонтранспортирущего) и неактивного* предположительно различающихся степенью протони-рованности протонакцепторной группы выходного протонного .пути. Переход между этими формами зависит от изомерного состояния хромофорной группы Бр. Большой интерес представляет также прямая демонстрация функционирования молекул рН-буферов в качестве переносчиков Н+ мезду мембраной и водной фазой.

Все изложенные результаты получены впервые и подтверждены в' более поздних работах советских и зарубежных лабораторий. Полученные данные имеют важное теоретическое значение ,для прогресса нашего понимания механизма функционирования как Бр, так и других протонных насосов. Они вошли в монографии и учебные пособия по биоэнергетике (Skulachev V.P. Membrane bioenergetice, 1988, Скулачев В.П. Биоэнергетика мембранных' преобразователей энергии, 19S9), используются в спецкурсах по биоэнергетике. Данные: об изменении параметров фотохимических превращений Бр при замене хромофорной группы -на синтетические аналоги рётиналя, при одиночных аминокислотных заменах и при действии различных ингибиторов представляют интерес с точки прения 'придания Бр спойгть. делшщи его удовлетворительным материалом для создания греС-ЛрйРОМТвЛ'Й СВО'ГОЕЭП.С-НОрГЧК V. устроПстг для долговре -. у-:-.-.:, т;1 с lie p'.r.ii'H^rv. хрчн'.'ни.я ■ ' - ;■ -

Апробация. Результаты диссертационной работы были доложены на- IX съезде ФЕБО (Будапешт, 1 -974), X Всесоюзном симпозиуме по биохимии митохондрий (Москва 1975), XII съезде ФЕБО (Дрезден, 1978), Советско-шведском симпозиуме по физико-химической биологии (Москва-Пувдно, 1978), I Советско-швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функции" (Тбилиси, 1979). II Всесоюзном симпозиуме "Липвды биологических мембран" (Ташкент, 1980), Международной шкЪле Шеско по исследованию бак-териородопсина (Сегед, 1980), I Европейской биоэнергетической коференции (Болонья, 1980), Всесоюзной конференции "Пути использования солнечной энергии" (Черноголовка, 1981), Межреспубликанских школах-конференциях по биоэнергетики (1982, 19641988), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1932), III Советско-швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функции" (Ташкент, 1983), XVI конференции ФЕБО (Москва, 1984), V Всесоюзном биохимическом съезде (Киер, 1986), IV Меж-•дународной биоэнергетической конференции (Прага, 1936), II Международной ' конференции "Ретинальсодержащие белки" (Иркутск, 1986), IV Советско-чешском семинаре "Динамика и активность макромолекул" (Ереван, 1988), XXI нмадской конференции "Молекулярная физиология ретинальсодёржащих белков" (Киото, 1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОВСУЗДЕШЕ

Генерация избранного потенциала }вр ь модельной система. Разработанная метода;а прямой регистрам генерации мембранного потенциала Бр заключается во 'встраивании мембранах препьратов Бр в ИЛМ, в результате чего последняя приобретает фотоэлектрическую активность. Разность потенциалов регистрируется с немощью хлорсерьбряных макроэлектродов и обычной элы<<грометричее-

кой техники. В качестве мембранных препаратов Бр обычно использовали либо липосомы, содержащие в сеоих мембранах Бр в мономерном. состоянии, либо пурпурные мембраны (ПМ), участки цито-плазматической мембраны галобактерий, содержащие в качестве белка только Бр и имеющие кристаллическую структуру. Встраивание липосом в азолектиновую ИЛМ инициируется при нейтрализации отрицательных поверхностных зарядов с помощью Са . В случае Ш лучшие результаты получаются при встраивании их в лецитшовую ИЛМ; в особенности, если последней придан положительный поверх-ноотгый заряд за счет введения октадециламина. Освещение ИЛМ со . встроенным Бр индуцирует генерацию электрического тока и разности потенциалов величиной до 200-300 мВ, что доказывает способность Бр функционировать в качестве молекулярного генератора, способного образовывать разность потенциалов, достаточную для синтеза АТФ.

Анализ функционирования фотоактивной ИЛМ показывает, что на ее поверхности приклеены замкнутые Бр-содеркащие мембранные образования. Сама же ИЛМ выступает в качестве контактного электрода. Для обеспечения максимальной стабильности эксперимента разработано ■ применение армированных ИЛМ - коллодиевой пленки, пропитанной раствором фосфолипидов в декане. Основное достоинство описанного метода заключается р. том, что он позволяет проводить измерения кинетики генерации потенциала с разрешением в 100 не, и, таким образом, позволяет исследовать механизм генерации разности потенциалов Бр в режиме однократного срабатывания, обеспечивэшего по сравнению со стационарным про-цегсом значительно большую легкость интерпретации наблюдаемых

ЛНЛ'.НИЙ.

Эпрктрогриные стадии фотоцикпа _ Бр. Г> одат на. ' лпзврнукз

вспышку на ИЛМ со' встроенными ПМ или Бр-линосомами наблюдается генерация разности потенциалов, • величина которой монет достигать 100 мВ. Фотоответ имеет сложную кинетику. В нем отчетливо можно выделить 4 фазы. На рис.! фотоотве? представлен с переключением временных шкал для лучшего визуального выявления его основных фаз; представлены также изменении оптической плотности при 412 и 570 нм, характеризующие основные процессы фотоцикла Бр - соответственно появление* и исчезновение коротковолнового интермедиата М412 с депротонированным основанием Шиффз хромофорной группы и выцветание и восстановление основной полосы поглощения Бр. Уже сравнение кинетик оптических и электрических ответов позволяет сделать предварительные заключения о связи электрических процессов с теш или иными стадиями фотоцикла.

Первой стадией фотоэлектрического"ответа является небольшая по амплитуде (не превышающая для светоадаптироваяного препарата Ъ% от амплитуды всего фотоответа) фаза с направлением, противо-•положном направлению электрического фотоответа на включение постоянного света. Скорость нарастания этой фазы определяется временным разрешением регистрирующей системы. Эта фаза получила йазвание "отрицательной". Ее генерация обусловлена образованием первичного батоинтермэдиата К590 фотоцикла Бр -и ее природа будет обсуждена более подробно ниже. ,

Вторая микросекундаая (мкс) фаза ¿меет такое же направление, как и фотоответ на включение постоянного ^ета. Амплитуда этой фазы составляет около' 20яб от амшшт.да всего фотоответа, а полуаремя нарастания заключено в пределах 30-50 мкс. то есть сравнило с сбразоввддея пнтермедаата Ы (регистрируемого по узе -личению плотности при 412 ш или ь качестве медленной компоненты обесцвечивания' при Ь70 нм).

ную вспышку (вертикальная стрелка лв, 11/2=15нс, 532 нм, 5 мДж/см2) в системе "1ЛМ-Ш" с кинетикой оптических изменений в суппензии ПЫ при 412 нМ ( образование и релаксация интермедиата М412) и при 570 нм (обесцвечивание и восстановление• основной полосы поглощения Бр). Условия: 100 мМ ЛаС1, рН 6, 23 °С. На вставке дан начальный участок электрического ответа- Фотоцикл Бр приведен в основном по (Б-Ьоескепиш ег а1., 1979) Указаны максимумы поглощения »¡термедиатов в нм, . изомерное состояние ретиналя н степень иротонированности основания Шиф^а хромофорной rf.vnr.ij. Значения дпны дян 'ксщттной температуры.

Третья миллисекундная (мс) фаза имеет такое же направление, как и вторая, составляет около' 80% от амплитуды всего фотоответа и имет полувремя нарастания 7-10 мс, что находится в том же временном диапазоне, что релаксация интермедиата М и восстановление исходного состояния Бр.

Четвертая фаза представляет из себя разряд образовавшейся разности потенциалов к исходному нулевому уровню, заключена в секундном диапазоне и определяется постоянной времени системы ИЛМ со встроенными мембранными препаратам Бр.

Дальнейший анализ подтвердил связь мкс- и мс-фаз соответственно с образованием и исчезновением интермедиата М.

Замена Е^О на замедляет мкс-фззу и образование М в ~5 раз, а мс-фазу и исчезновение М - менее чем в 2 раза.

При понижении рН (рК"'3,7 для Бр-лютосом) амплитуда мкс- и мс-фаз синхронно уменьшается, одновременно снижается количество интермедиата М, образуемого в ответ на вспышку, а Бр переходит • в' так называемую "синюю" кислотную форму с максимумом поглощения при 605 нм.

При нейтральном рН длительное выдерживание в темноте приводит к переходу части молекул транс-Бр в 13-цис-Бр. Этот процесс, . так ' называемая "темновая адаптация", - сопровождается уменьшением количества интермедиата М, образуемого в ответ на вспышку света, так как 13-цис-Бр » этих условиях не способен образовывать при фотоцикле интермедцат м. Параллельно амплитуда мко- и мс-фаз фотоэлектрического отвегт уменьшаются.

Проведенный наш совместно о Б.И.Мицнером (КИТХТ) анализ аналогов Бр, получг.еных. путем замены ретшаля на его синтвти-. ческие аналоги, одновначно свидетельствует о том, что необходимым условием генерации мкс- и мс-фаз■потенциала является обра-

зование интермедиата М при фотоцикло Бр.

При действии на Бр солей лантаноидов и ряда других поли -валентных металлов, глутаральдегида и формальдегида в релаксации интермедиата М чоквлямтся медленные компоненты с полувременем релаксации от сотен миллисекунд до нескольких секунд. .Одновременно в фотоэлектрическом ответе ингибируется мс-фаза -амплитуда ез уменьшается. Это обусловлено тем, что ее скорость становится сравнимой со скоростью пассивного разряда мембраны.

При протеолитическом отщеплении 17-аминокислотного С-концевого участка Бр релаксация М412 ускоряется, одновременно ускоряется мс-фаза потенциала.

Подача на ИЛМ разности потенциалов от внешнего источника'той же полярности, что и генерируемая Бр, вызывает замедление мс-фазы. одновременно на Бр-липосомах релаксация интермедиата М замедляется по мере увеличения на их мембранах разности потенциалов той же полярности.

• Всо эти наблюдения свидетельствуют о том, что мкс-фаза генерации потенциала связана со стадией образования депротонирован-ного интермедиата м, а мс-фаза - с исчезновением М и восстановлением исходной формы Бр. Учитывая, что по литературным данным (см. рис.1) исходно протонированное основание Шиффа хромофорной группы депротонируется при восстановлении исходной формы Бр, логично было бы предположить, что именно Я1", высвобовдаемый при дзпротсшмровании основания Шффа, переносится через мембрану и что мкс-фаза обусловлена выбросом этого Н4 из молекулы Бр, а мс-фаза - протониравгшием основания Шиффа Н4, поглощенным на противоподоиюй поверхности молекулы Бр.

Протон^анспоррше ^азы^^

Рял аатороп м модемы«« системах, Оли: ких ныаой (ьлг «ь .а!..

1981,1985, Гр1б81, 1983,1985, Р.ауПе1Л, 198.3,1985,1986), И В суспензии ориентированных электрическим полем Ш (КевгШе1у1 & 0141103, 1980, Кез2Шв1у1 е1; а!., 1982) подтвердили наличие обнаруженных нами компонентов фотоэлектрического ответа Бр. Однако, в отличие от нас Кестхеи и соавт. считали, что мс-фаза в основном связана с выбросом который после денротонирования основания Шиффа продолжает двигаться внутри молекулы белка и выделяется в среду только при образовании последнего интерме/иата фотоцикла 0640. Это мнение основывалось на работе (Ьои1ег е1: а1., 1976), показавших, что Н.+ в среде появляется значительно позже, чем образуется интермедиат М. Для разрешения этого противоречия нами была проведена работа по изучению фотоиидуцируе-мых изменений рН в суспензии ЕМ. Вторым вопросом, который мог быть решен в этой работе и решение которого также необходимо для установления природы электрогенных Фаз, является вопрос о стехиометрии транспорта Н+ - к 1981 г. накопились данные о возможности переноса при фотоцикле не одного, а двух Н*(данные суммированы'в обзоре 81;оескеп1ие еЬ а1., 1981).

Нами было обнаружено, что запаздывание выброса из бежа по сравнению с образованием интермедиа^ М 'на саком деле наблюдается, но только если концентрация индикатора мала и в среде отсутствует какой-либо рН-буфер (рис.?.). Увеличение концентрации рН-индикатара приводит к ускорению фронта нарастания рН-ответа. Подобным действием обладает таЛже сашк равнообр-.з-ные соединения,- имеющие свойства рН-бу^еров. Следует отметить, что ни буфера, ни индикатор не влияют на кинетику чбразования и релаксации М412. Маловероятно, чтобы используемые гвдрофяльгше молекулы, буферов могли как-то симулировать дркж>шш Н4 внутри молекулы Бр. Механизм ускорения рН- о'^нтсз, по-видимому, ".иялч-

Рис,.г. А - ызаяние концентрации рН-млдакатора на регистрируемую с помогал» него кинетику изменений Ш*"3 ta-rl ¡v суспензии Ш в ответ на лазорну» р.сп«шку (лк): а.о.в.г - соотевтственно 25,50, tOO,200 икМ п-нитрсф^од. 1Ш2 - кинетика образования и распада M4í2f Условия: 25 мМ NaCI, pU 6,8, о tí - вхпяте ковдел-трааша pH-6y<í»ip3 itn кинетику изменений №* 1: я.О.в.г.д - соответственно О, 0.2. 0,4, í. 3 Ш MES- Усяда«: JOO мкм п-НИГ^Ч-'НЭЛ. ico мМ N¡201, рН 5 R - этгет рН-зшдикатора на дэбавлокйй веЛналого южгл'гтач К i (« а - 500. »в!

нпа, 26 WKK п-ннтр^яод, I»j бл. гь Х> - кашлеиал среда. О - ДПбМДОЙ 'W wndü Jblk'VV.

чается в способности этих соединений ускорять передачу Н+ от ИМ на рН-индикатор. Дополнительном- свидетельством в пользу того, что запаздывание pH-ответов обусловлена процессами, происходящими не в белке, а в водной фазе, служит замедление регистрируемого выброса Н* при увеличении вязкости за счет повышения концентрации глицерола или сахарозы. Повышение вязкости не влияет на процесс образования М, а релаксация М параллельно с поглощением Н4 замедляется. Юнг и Маклафлин в 1987 г. теоретически обосновали увеличение эффективного ковффициента диффузии Н* буферными молекулами при наличии в среде фиксированного буфера - мембранных белков.

Итак, выброс Н+ из бежа происходит по крайней мере но позже, чем образование интермедиата М, и Н* не перемещается, как предполагалось, длительное время внутри молекулы Ер.

При определении величины стехиометрии И1 /М мы столкнулись с тем, что в условиях, обычно применяемых для _регистрации фото-• индуцируемйх pH-ответов, ответ индикатора на добавку малых количеств HCl или КОН носит сложный характер: после быстрого изменения поглощения наблюдается сравнительно медленная (t1/2 ~4 сек при комнатной температуры) частичная релаксация ответа (рис.2). Доля релаксационной фазы уменьшается .при увеличении концентрации буфера или индикатора,, а также после удаления растворенного С02 кипячением среды инкубации и значительно возрастает при увеличении концентрации ка[ "Зонатного буферп. Эта релаксация обусловлена наличием карОсгчиюго буфера и медленной скоростью установления рапш-ьесия между угольной кислотой и растворенным С02- Тек как рн .льет Кр развиваются в мс-шкало, очевидно, что при калибре,ьк- ¡ьооуодимо учитивьть юлько быструю компоненту ответа шдакач Грон^ця юлиер.: ьку тзлим об-

разом и экстраполировав амплитуду рН-отЕетов и спектральных ответов самого Бр к нулевому моменту времени, мы определили, что отношение Н+/М412 в 0,1-4 М Nací не превышает 1. Величина этого отношения не зависит от концентрации буфера и интенсивности возбуадавдего света.

Незнание эффекта карбонатного буфера и использование калибровки по плато в работе Govindjee et al., 1980, го-видимому, и привели к завышенным значениям К*УМ и к гипотезе о двухпротон-ном • механизма функционирования Бр. Определенный акустическим методом (Ort & Parson, 1978) квантовый выход выброса К1" 0,45 в сравнении с квантовым выходом фотоцикла 0,3 (Goldsmidt et al., 1977, Hurley & Ebrey, 1Э78) на самом деле свидетельствует не о двухпротонном механизме переноса Н4, а о недостаточно верном определении квантовых выходов и, прежде Есего, по-видимому, о заниженном квантовом выходе фотоцикла: в 1985 г. Остерхельт и соавт. привели величину квантового выхода фо'тоцикла - 0.6. ■ Обусловленная карбонатным буфером ошибка е определении' стехиометрии Н+/МИ произошла и для зрительного родопсина (Bennett, 1980). Каш было показано, что в процессе образования коротковолновой формы Ми связывается только ГН*.

Наши данные навели мост между регистрацией рН-изменений с помощью акустического метода и с помощью рН-индикатора. Акустические измерения проводятся исходно в среде с высокой концентрацией буфера и поэтому регистрируемый выброс Н* близок к скорости образования интермедиата М.

Специальное внимание было уделено проблеме экспонированного в волную фазу С-концевого участка молекулы Бр. Если в 1978 г. в совместной работе с лабораторией I).А.Овчинникова нами было покарано, что протеелитическое отщепление ряда гидрофильных

экспонированных в'водную фазу участков молекулы Бр не приводит к утере Бр электрогенных свойств (АЪйи1аеу et а1., 1978), то позднее Говиндьи и др. (1982) обнаружили, что протеолитическое отщепление С-хвоств в 2 раза уменьшает величину отношения Н^/М, и сделали вывод о регуляторной роли С-хвоста. Мы подтвердили наличие двухкратного уменьшения измеряемой величины стехиометрии, но обнаружили два простых способа - ультразвуковая обработка и добавление 0,01$ тритона Х-100 - приводящие к увеличению рН-отввта в опытном образце до уровня конроля. Было заключено, что все это явление обусловлено агрегацией ПМ, усиливающейся после удаления С-концевого участка, содержащего большое количество отрицательно заряженных аминокислотных остатков.

Таким образом, можно заключить, что нет никаких оснований считать, что и при каждом обороте фотоцикла переносится более одного н+.

Связь электрогенных и протонтранспортних фаз фотоцикла Бр. -На рис.3 представлена суммарная картина соотношения трех процессов - выброса и поглощения Н+', образования и релаксации интермедиата М412 и генерации разности электрических потенциалов при фотоцикле Бр, а также схема, позволяющая понять возможный механизм взаимосвязи всех этих процессов. Учитывается, что при фотоцикле Бр переносится только 1 НГ*, и этот Н* является протоном основания Шиффа хромофорной группы. Предполагается, что'у Бр существует два протонных пути - входной и выходной; овязь между ними осуществляется хромофорной группой. Поглощение кванта света приводит к изомеризации хромофора, в результате чего основание Шиф$а оказывает!■,.1 в новом окружении, в котором его рК резко уменьшается. Ео^ьжьио причины генерации отрицательной фазы потенциала оу'ау* рысил, грмш ник*, основание Шиффа

ЦИТССЛАЗМА.

400 МС

-J::c.3. Слева - взаимосвязь фотоиндуцируемых -процессов - образования и распада интермедиата М412, выделения и поглощения Н* в суспензии ПМ и- генерации разности потенциалов в системе "ИЛМ-Бр". /1С0 м!<1 NaCi, 4 мМ MES, 0,1 мМ п-нитрофенол, рН 6,8, 5 °С/. Справа - предполагаемая схема расположения ретйналя и генерации основных электрогенных.фаз. На 1-ой стадии "первичного разделения зарядов" происходит изомеризация ретиналя и образование.батойнтермедиата. На 2-ой стадии при образовании М412 происходит перенос Н"1" от основания .Шнффа на наружную поверхность ПМ., На 3-ей ста' дай при восстановлении исходного состояний Бр.Н4" переносится к основанию Шиффа с цитоплазматичесг ко!! поверхности ПМ.

депротонируется, происходит коротковолновый сдвиг спектра поглощения Бр, образуется интершдиат М. Высвободившийся If* выделяется на наружной поверхности ПМ. Перенос Н+ на поверхность мембраны и представляет из себя мкс-фазу генерации разности потенциалов. Рецротонирование основания Шиффа осуществляется Н4 с цитоплазматической поверхности гад через входной протонный путь. Этот процесс является источником мс-фазы генерации разности потенциалов. В четыре ^аза большая амплитуда мс-фазы по сравнению с гясс-фззой обусловлена тем, что источник II4 - основание ПЩфа хромофорной группы находится ка расстоян'-.и в четыре раза более близком к наружной, чем к цитоплазматической поверхности ПМ. Это заключение основывается на предположении о постоянстве диэлектрической проницаемости по толщине мембраны. Подобное предположение выглядит вполне естественным, так как мы имеем дело с полностью мембранным белком, не имеющим обширных экспонированных в водную фазу участков, по которым осуществлял-■ ей бы перенос Н+. Наш вывод о близости ре тин а ля к наружной поверхности ПМ в последнее время получает подтверждение в работах по анализу расположения ретиналя с помощью метода гигантского комбинационного рассеяния света (Набиев и др.; С985), в работах по флуоресцентному переносу энергии (Luder & Th-лпав, 1987), в иммунохимических исследованиях (Втюрина и др., 1964). где с помощью антител определено, что Ши-194, к которому по данным (Hwang et al., 1979) пришивается фотоакт;шний аналог ретиналя, находится на наружной поверхности Пм'.

Цредпологаемое расположение ретиналя, то есть т ,а -¿\&, к которому он присоединен, ьолизн нарумюй поверхности ИМ лучше -согласуется не. с общепринятой сг-мт-толбовой модели-) bp, предполагающей, что в Бр присутствуй n:mi¿» л ,чш{,лчишв трач

рашше сегменты, а с деЕЯТистолбовой моделью (Jap et al., 1983), согласно которой тршсмембранный тяж, в который входит Ьув-216 является не а-сшфалью, а ß-структурой.

Интермедиат Р фотоцикла Бр; сопрявение процесса поглощения при фотоцикле с изомеризацией хромофорной группы. Хотя стехиометрия Н*/М не превышает 1, тем не менее вто полностью не исключает возможности трансмембранного ■ переноса 2Н4 при одном обороте фотоцикла. Подобная возможность неоднократно обсуждалась в литературе и базировалась на гетерогенности пула интер-медиата М. Например, , при деухэкспоненциальном приближении процесса гибели М вблизи О °С выделяется два компонента с t=30-5Q и 100-140 мс, а поглощение Н* описывается одной вкспонентой с

1=160-190 мс. Можно предположить, что протонтранслоцирующей. »

функцией обладает только долгоживущая форма М и что при фотоцикле с участием этой формы переносится 21^, так как вклад медленного компонента в процесс релаксации М составляет 60-80%.

Дальнейший анализ этой проблемы привел нас к заключению, что наличие или отсутствие корреляции между временем жизни М и процессом поглощения Н+ не может служить основанием для вывода о способности той или иной фракции М транспортировать Н*, так как М превращается в исходную форму Бр не непосредственно, а через интермедиат Р, причем Н4 из среды связывается белком только на стадии превращения Р в Бр.

Первые указания hdi существование этого интермедиата были полученц при сравнении кинетик оптических изменений при длинах волн 400 и 570 нм (рис.4А). Б условиях, когда отсутствует интермедиат 0640,функция и место которого в фотоцикле до настоящего времини остается окончательно невыясненной, не только кинетика п^гло'ссот.я Н* и» сэБПЯлает-с релаксацией оптических из-

100-1

«1 о

\ А -И

- V х

• V \ —570 нм

\ \ \

нм V» N.

1114 1» —ь

о

юо

100

100-

700 мо

8 мс

700 мс

8 мс т

. • лв ' в

Рис.4. Сравнение кинетик четырех фотоиндуцируешх процессов в

суспензии Ш: образования и распада Н412 (400 ни), шцьетмпш и восстановления основной полосы поглощения (570 им)■ изменения [К*"] в водной фазе и восстановления у Бр способности образовывать М412 в ответ на вторую всшшшу света, давк-мую через различные промежутки времени после первой 01412-11). А,А' - 1 М На01рН 7,0, 0,5.о0.- Б,Б' - добавлен и,01% тритон Х-100. А,Н -вертикальной стрелкой атнечеи иоывнт лазерной вспнщки. А",Б' -вертикальной стрелкой отазчен момент насыщаиций фотовспышки. Направление вверх соответствует увеличению поглощения при 400 нм, увеличению [Н+] и уменьшений! поглощения при ¡570 им.

7 20 ~ ' .

менений при 400 нм, но и релаксация оптических изменений при 570 нм не совпадает с релаксацией оптических изменений при 400 нм. I? дальнейшем было обнаружено, что восстановление у Бр способности к повторному вступлению в фотоцикл, сопровождающийся образованием интермедиата М, коррелирует не с релаксацией оптических сигналов при 400 и 570 нм, а с кинетикой поглощения Я1". Было заключено, что М превращается в Бр не непосредственно, а через интермедиат, неспособный образовывать при фотовозбуждении интермедиат М.

При нейтральном рН тритон Х-100 в низких концентрациях .резко увеличивает различия в кинетиках этих процессов (рис.4Б): рас-.пад М несколько ускоряется; а в релаксации оптических изменений при 570 нм появляется медленный компонент с 1=600-900 мс. Такой же компонент появляется в кинетике поглощения Н4.' Дифференциальный спектр долгоживужего компонента (рис.5А) резко отличается от дифференциального спектра интермедиата М и характеризуется выраженным обесцвечиванием в области поглощения Бр и небольшим приростом поглощения в области 330-350 нм.

Кинетика фотоиндуцируемого нарастания оптической плотности, при 335 нм (ряс.5) состоит из двух хорошо отличных фаз - медленной, идентичной по скорости образованию М, и быстрой, в свою ' очередь включающую компоненты, сравнимые по скорости с образованием интермедиатов К и Ь. Дифференциальный спектр быстрой компоненты представлен• на рис.БА значками х. Он хорошо согласуется с коротковолновым максимумом дифференциального спектра интермедиата Р и,, по-видимому, обусловлен (3-полосой' 13-цис-ретинальсодержащей хромофорной группы, [»-первых-, он близок к диДО^наиальнсму спектру между темно- и, светоадяптиройашюми ПМ. к> вторых, у аде-, л; и* у траис-ротинэлей. набл! «даются в

лА. /усл.ед./

оЛеоо

а

°0с^Ьоооеоо?

о

о

о о о

Р О

<ь °

о о ~ о

Рис.б. А - дифференциальный сш;итр интермидиата Р (Ш waCi, 0,01 S тритона Х-100, 4 °С, рН 7,0). Для срг^ненил приведен дифференциальный спектр (а) быстрой к. .тюнинги (см. вставку) нарастания оптической плотности а коротковолновой областг после лазерной вспышки (появлешз ft полосы 1.4 цие ил.-.леьою хромофора), В - сравнение .спектров ноглощанш! Бр, с/.ш ркыцвро только полностью транс-региналь (светла дянтирсч-жшые III/.), Бр, содержащего только 13-цие-ротингии (¡смиои-т '[ймтшдшггировыишь ПМ) и интермедиата Р.

спектрах поглощения коротковолновые р-полосы. В-третьих, нами было показано, что инициация фотоцикла 13-цис-Вр сопровождается выцветанием этой полосы. Кушмиц и Хесс (1982) и Лани и Водяной (1986) использовали эту полосу как индикатор 13-цис-хромофора и пришли к выводу о наличии транс-13-цис изомеризации при фотоцикле транс-Бр и галрродопсина.

Итак, анализ появления и исчезновения р- полосы приводит к выводу, что 13-цис-состояние хромофора, появляющееся на ранних стадиях фотоцикла не позднее образования интермедиата Ь существует вплоть до интермедиата Р. Только на стадии перехода Р в Бр ретинэль возвращается в исходное транс-состояние.

Если поглощение Н* не коррелирует с релаксацией оптических изменений ни при 400,ни при 570 нм, то наблюдается прекрасное совпадение кинетики поглощения Н+ с релаксацией оптических из-• менений в области 0-полосы, то есть с исчезновением интерме- . диата Р и 13-цис-транс-изомеризациеЯ хромофора (рис.бА).

Кинетический анализ позволил определить абсолютный спектр поглощения интермедиата Р (рис.ББ).. Интермедиат Р имеет а-макстум при С50+5 нм и коэффициент экстинкции, составляющий в максимуме поглощения 70+10% от коэффициента экстинкции в максимуме поглощения транс-Бр. В'области коротких длин волн интер-медиат Р имеет большее поглощение, чем Бр. Мы полагаем, что ето превде всего обусловлено наличием (З-полосы, характерной для 13-цис-рвтиналевого хромофора. Положение а-максимума Р вблизи а-максимума Бр однозначно свидетельствует о том, что хромофорная группа в Р протонирована, а так как Н4 из среда поглощается только при гибели Г, то соответственно донором Н+ должна леляпся какая-то внутрибелковая группа. Вклад в электрогенез сп-.дии М•■- >Г сроним по амплитуде с мик(к»секундной фазой элект-

- гз -

. . рн

Рис.6. А - сравнение клкетик поглощения Нь и релаксации (3-полосы (335 нм) в ответ на лазерную вспшк.,' в отсутствие (а) и в присутствии (б) 0,01% тритона .Х-100 (1М ИаС1, 0,1 мМ

• рН-ИНДИКатбр пиранин, 0,5 ^ КН2Р04, рН 7,2. 4 °0). Б -сравнение кинетик изменения поглощения при 335 , 400 ч 570 нм с кинетикой восстановления у Бр способности к повторным фотоциклическим превращениям, бклмчйицим . интермедиа*!? 'а (М412-1Г) в суспензии ИМ гфи высоких значениях рН ( т К-фосфат-боратныЯ буфер, рН 10,5, 4 °С). В - рН.-зависимость

• релаксации оптических изменений црг 400 шл (распад М4Ш) и ; релаксации р-полоси ищ 335 ш (косстыиаьлышо гсгосяого

состояния Бр - распад питерминч'О Г'.

. рического фотоответа, то есть донорная группа расположена между цитоплвзматической поверхностью Бр и основанием Шиффа на расстоянии не превышающем 1ОА от последнего.

Время жизни Р увеличивается при высоких значениях рН пропорционально уменьшению концентрации Н4 (рис.бВ). Дифференциальный • спектр, подобный спектру Р, был зарегистрирован при высоких значениях рН Шкробом и Родионоеым в 1978 г. (продукт С), а также Дончхази и соавт. в 1986 г. (интермедиат К350). Авторы ошибочно рассматривали зтот интермедиат как аналог М о основным максимумом поглощения в коротковолновой области. По нашим дан-■ кым, через, кинетически выделяемую форму интермедиата Р при высоких значениях рН релаксирует прежде всего короткоживущая форма М, время кивни которой практически не зависит от рН. (рис.ЯВ), что обусловлено наличием исходно протонироввнного 'Енутрибелкового донора. На рис.бБ отчетливо видно, как восстановление у Бр способности к повторным фотоциклическим превращениям коррелирует на с исчезновением интермедиата М, а с релаксацией коротковолновой [3-полосы. •

В приведенной ниже гипотетической схеме суммированы .наши представления о стадиях переноса И4 при фотоцикле Бр. При поглощении ¿такта света происходит изомеризация хромофорной группы ••'.'из полностью транс- в 13-иис-состояние (1). На стадии.превращения -штермедивта ь в интермедиат М (2) основание Щиффа депрото-. 1гиту';'тся -и ¡Г*' внсрьенйается на наружную поверхность ПМ. Ключе-\йМ моментом в' дальнейшем процессе релаксации Бр в исходное сосг^ячио йллж.'Тел то, что ро*1ротонирювание основания Шиффа при .• .<3> :прзд№етзу^т обратной цио-транс изомеризации хро-

'оигл'^пкк! -I4; .га наруяней среды, репротошфованкд ли &1ЬЪь т^-.У'-.'.'^ог./П' на С73Д1ГЛ препражвгия интермедаата К

интермедиата Р в фотоцикле Бр

'в интермидаат Р. Источником' Н+ является внутрибелковая прстоп-донорная груша. Ее роль может играть одна из протолитических. групп НН входного протошгрово дяцего пути. В результате образуется состояние, напоминающее по распределению зарядов на хрс- ■ мофоре исходное состояние Бр, но содержащее ротиналь в 13-цис-формо. В этом,, состоянии роль противокона можо? играть сама., группа й*. Да последней стадии фотоцикла при превращении тетер-* , . медиата Р в исходную форду.Вр происходит два сопряжениях г-иаууг . собой процесса - обратная изсйаеризглшя хромофорной грушгц (!»■) я соответственно возврат ос.юватля ВЬ«фц>а л своему протаесшот/ V" ,

и протонирование грущш к" (4) протоном с цитоплазматической поверхности ПМ. Замедление перехода Р в Бр по мере увеличения рН свидетельствует в пользу того, что протонирование ЕГвызывает быструю 13-цис-транс изомеризашю хромофорной группы.

В 1989 г. вышли две работы из. лаборатории Стокениуса (Коиуаша е1; а1., Ройог et. а1), в которых подтверждены наш выводы о функции и месте интермэдиата Р в фотоциклэ. С помощью ИК-спектроскопии показано, что 'у этого интермэдиата хромофор находится в 13-цис-15-анти состоянии. Авторы, однако, считают, что вместо символов Р или И350 следует применять символ N. так. как в 1975 г. на основании косвенных данных такой интермедиат N. правда, с максимумом поглощения при 520 нм был постулирован' Лозие и соэвт. в фотоцикле, посла интермедиата М. -Его .существование дальнейшими работами подтверздено не было. Ещё одно отличие нашей работы от работы Стокениуса и сотр. заключается в том, что последние предлагают новую схему фотоцикла, согласно которой источником долгокивуких форм М является сам .интермедиат Р, находящийся в темноте в рН-зависимом. равновесии с исходной Формой Бр. Пит данные о неспособности интермедиата Р вступать в фотоцикл, включающий интермедиат М, (рис.4 и 6) противоречат подобной схеме. .' •

Икгибирование релаксации интерцэдиата М солями поливалентных металлов и конфорыационные превращения Бр при фотоцикле. Нами оыл обнаружен один из■первых и весьма эффективный ингибитор фотоцикла Бр - ионы лантана. Интерес к нему был обусловлен тем, что, во-первых, он не влияет на спектр поглощения Бр, то есть не.затрагивает белек-хромофорного взаимодействия, но замедляет до секундных времен релаксацию интермедиата М и ингибирует соотгстственко ме-Фюу потенциала, и, во-вторых, ингиСирование

Рис.7. Л - ингибировшгие распада интэрчедиата М412 сслями поливалентных металлов при различных рН. Релаксация М412 у контрольных ПМ практически постоянна в диапазоне рН от 3 до 7,5. Соли добавлены в насыщающих концентрациях - 1л1С1д - 0,6 мМ, А1С13 и 2пС12' - 5 мМ. Б,В - сравнение кинетики ■ фотоиндуцируемых изменений сеторассеяния в суспензии ПМ с кинетикой, фотохимических превращений - .исчезновением штормедиата М (400 нм) и, исчезновением интермедиата Р (335 нм). Б - 1М МаС1, 0,015* тритон Х-100, рН 7,0, 4 °С. 50 мМ •.К-фосфэт-бораттшй буфер, рН'10,2, 4 °С.

. - 2В -

бистро и легко обращается при связывании его с помощью ЭДТА. В дальнейшем било обнаружено, что ингибируицим действием обладают соли других лантаноидов и ряда поливалентных металлов. Ингиби-рование фотоциклических превращений обусловлено взаимодействием с цитоплаэматической поверхностью белковой молекулы. Специальными экспериментами было продемонстрировано, что и в замедленном препарате Бр протонирование основания Шиффа осуществляется К+, поглощенным на цитоплазматической поверхности ПМ.

Модификация доступных карбоксильных групп моно- и диаминами или аргинином в присутствии водорастворимых карбодиимидов приводит к появлению в релаксации М медленных компонент. Однако подобная модификация предотвращает значительно более сильное ингибируххцеа действие ионов лантана i Значительно отличаются рН-оптимумы фотоцикла для различных металлов: например, в-случае ■ солей железа фотоцикл эффективно ингибируется уже при рН 2,5, практически максимальное шгибирование достигается солями аллю-миния при рН 5-6, а цинк и лантан аффективны при рН>7. Общей закономерностью является - чем ниже рК гидролиза иона металла, тем ниже рН, при котором наблюдается заметное ингибирование. Все металлы-ингибиторы являются хорошими комплексообразователй-ми. Насыщающая ингибирующая концентрация лютеция (0,5 мМ) значительно меньше, чем насыщающая концентрация более слабого комплексообразоватвля аллюминия (10,мМ). Мы-полагаем, что ингибирование солями металлов фотоцикла Бр обусловлено образованием смешанных координационных соединений, в которые входят аминокислотные группы Бр (по-видимому, карбоксильные) и 0Н~-ионы. ' Эти координационные соединения будут уменьшать подвижность белковых груш и могут препятствовать протеканию конформационных превращений Бр на стадии перехода иктермадиата М в Р, то есть

на стадии внутрибелкового протонирования хромофорной группы.

В пользу наличия таких конформационных превращений свидетельствует ряд фактов. Нами било подтверждено интасирущее действие на релаксацию интермедиата М такого сшивающего агента как глутаральдегид. Продемонстрировано ингибирование им мс-фззы генерации -мембранного потенциала и фазы поглощения Н* при фотоцикле. Глутаральдегид не влияет на скорость фотохимических пре--вращепиЯ синей кислотной фор?*ы Бр, у которой отсутствует депро-тонирование основания Шиффа и иятермедиат L или его ан?лог возвращается в исходную форму Бр. Время жизни М увеличивается также при увеличении вязкости и гидростатического давления.

В пользу конформационных превращений бежа на стадии перехода М в Р свидетельствуют обнаруженные нами сигналы изменения светорассеяния в суспензии Ш, сопутствующие фото циклическим превращениям Бр. В сигнале выделяется 3 фазы. Первая фаза уменьшения светорассеяния связана с образованием интермедиата М. Вторая фаза противоположного знака ■ (светорассеяние увеличивается) обусловлена переходом М—>Р. Третья фаза релаксации светорассеяния к исходному уровню связана с восстановлением исходного состояния Бр. Вторая и третья фазы особенно отчетливо выделяются в условиях, благоприятствующих выявлению интермедиата Р - при нейтральном рН в присутствии низкой концентрации • тритона и при щелочном рН (рис.7). Природа сигналов изменения! светорассеяния, учитывая, что они исчезают при тщательно^ ультразвуковой обработке или при солюбилизацш ПМ в тритоне X-100, вероятно, заключается в изменении формы всей ПМ при фотоциклических превращениях Бр в результате синхронных конформационных изменений входящих в нее молекул Бр. К такому же выводу о.' причинах изменения светорассеяния независимо пришел Зего

- зо -

(ВНР) в 1987 г. \

Таким образом, существует ряд свидетельств, что стадия фотоцикла М—>Р, связанная с протонированием основания Шиффа внут-рибелковым донором, включает значительные конформационные перестройки молекулы Бр и за счет этого может подавляться агентами, способными взаимодействовать с поверхностными участками молекуЛы. .

Участие аспартата-9в в функционировании Бр. В последние годы в лаборатории X.Кораны (США) с помощью метода направленного мутагенеза получен ряд препаратов Бр, содержащих одиночные замены аминокислотных остатков. Особое внимание привлекли препараты с заменами остатков аспарагиновой кислоты, так как по данным ИИ-спектроскопии протонированность СООН-групп четырех таких остатков меняется при фотоцикле Бр. Нами был исследован фо.то-цикл и кинетика генерации потенциала Бр с Авр-96, замененным на остаток Glu или Авп. Препараты получены из лаборатории Х.Кора-ны. По данным Кораны и сотр. (Mogi et al., 1983) у Бр с заменой Авр9б—>Аеп, включенного б липосомы, при нейтральном рН значительно подввлена способность к фэтоиндуцируемому образованию на мембранах градиента рН. Наш обнаружено, что это обусловлено резким замедлением распада интермедиать М412. Если у контрольного Бр и Бр с заменой Авр9б—>Glu, не приводящей к исчезновению СООН-группы, в широком диапазоне рН сохраняется независимость кинетики распада М412 от величины рН в водной фазе, то при замене Аердб—>Авп в логарифмической шкале нвблвдается практически линейное замедление t1/2 распада Ы412 с повышением рН (рис.8). Одновременно о замедлением релаксации Ы412 йнгибирует-ся'мо-фаза генерации мембранного потенциала. У контрольного ,Ер также обнаруживается появление форм интермедиата M, распад ко-

Рис.8. Влияние замени Asp-96 на 01и или Аеп на фотоцикл Вр и транспорт Н+. А - зависимость t1/2pacnafla Ы412 от рН. Условия: 2М NaCl, 5 мМ к-цитрат-фосфат-боратный буфер, 5 °С. Полученные в клетках E.coii мутантные и контрольный Бр реконструированы с галобактериальяыми липидами. Препарат имеет структуру близкую к ГШ. Б,В - зависимость от рН фотоэлектрических ответов в системе "ИЛМ-Бр". Условия:- 0,1 М NaCl, 5 мМ к-цитрат-фосфат-боратннй буфер, 23 °С.

торых замедляется при повышении рН, но это явление отчетливо выражено только при рН>10. При указанных аминокислотных заменах процессы образования М412 и' выброса Н4 из белка существенных изменений не претерпевают.

Очевидно, что при замене Абр96~>Азп нарушается Ы—>Р переход фотоцикла, заключающийся во внутрибелковом протонировании хромофорной группы. Пока еще рано делать окончательные выводы о том, каким образом СООН-группа Аер96 участвует в этом процессе. Одно из предположений заключается в том, что сам остаток АврЭб и является внутриболковым донором протонов ИН. Замена его на Авп, лишающая его протондонорных свойств, иприводит к тому, что протонирование основания Шиффа при фотоцикле начинает лимитироваться концентрацией Н+ в водной фазе. В то же время нельзя исключить, что участие АврЭб в реакции протонирования основания Шиффа является не столь прямым.

"Отрицательная" фаза фотоэлектрического ответа. Первой фазой фотоэлектрического ответа транс-Вр является небольшая по амплитуде (не превышающая 5% от всей амплитуда ответа) фаза с направлением, противоположным последующим протонтранспортным положительным фазам, и поэтому названная нами "отрицательной" (рис.1 и 8). Время нарастания этой фазы лимитируется разрешением регистрирующей аппаратуры (100 не), но уже этого оказалось достаточным, чтобы- заключить, что эта фаза может быть связана только о образованием первичного интермедиата К. Позднее венгерские исследователи (Огоша а1., 1984) подтвердили, что . Еремя нарастания отрицательной фазы, как и образования К, находится в шкосекундном диапазоне.

Отрицательная' фаза остается у синей кислотной формы Бр, ,в • которую переходит Бр лри понижении рН. Синяя кислотная форма не

обладает протонтранспортирующей вктиеностью и не образует -при фотоцикле депротонированный интермедиат М. При фотоцикле интер-медиат ь возвращается в исходную форму, и этот процесс сопровождается релаксацией отрицательного потенциала к нулевому уровню. При дальнейшем понижении рН Бр сноеэ переходит в пурпурную форму.На самом деле этот процесс обусловлен связыванием анионов С1~, причем, по нашим данным, переход сопровождается кооперативным связыванием 3-х анионов С1- каждой молекулой Бр. Фотоэлектрический отпет второй пурпурной формы состоит также из отрицательной фазы, однако, в несколько раз большей по амплитуде, чем у синей формы. В. фотоцикле пурпурной кислотной формы обнаруживаются только батоинтермедиат(ы). Наблюдается прекрасная корреляция кинетики релаксации отрицательной фазы- с кинетикой релаксации батоинтермедиатв. Сама отрицательная фаза у пурпурной кислотной формы носит, по-видимому, сложный характер, и на "обычную" отрицательную фазу синей кислотной формы накладывается еще один процесс. Это отчетливо еидно (рис.9) в том случае, если образование - пурпурной кислотной формы индуцируется при более высоких значениях рН с помощью ионов фтора. Отрицательная фаза имеет довольно медленную компоненту, скорость которой увеличивается при понижении рН.

ЕЩе одна небольшая по амплитуде отрицательная фаза, впервые описанная (Опюв et а!., 1984), обнаруживается в фотоэлектрическом ответе синей кислотной формы Бр. Эта фаза составляет около 20% от амплитуды всей отрицательной фазы, имеет на_ растения 1,5-2 икс и, по-Еидимому, обусловлена переходом К—>Ь. Подобная фаза также хорошо выявляется в фотоэлектрическом ответе нейтральной пурпурной формы Бр при замедлении мко-фазы в 0о0; в НоО выделение этой фазы является, правда, не столь

-J0J

мВ

7

лв i 6 л_

лв

Г

20 НКС

—i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i 'i Ч ГШ МКСТ"100 МсН П80 МКСТШ нсН

лв

лв

-18 -20 -30—40 i i i i i i—i—г

лв

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Т I I I I I I I I I I I I

мв пеа MKcTtee мсгп гш wccT~iea ксН пеа ккстчеа нсЧ

8-

"18 v

мВ

лв

K-»L

h 10 МКС А ' 10 №СС "4

Рис.9. "Отрицательные" фазы фотоэлектрических ответов Бр в системе "ИЛМ-Бр". а - траяс-Бр при рН 6, tí - 13-цис-Бр при рН 6, в - синяя кислотная форма Бр при рН 2, г - пурпурная кислотная форма Бр при рН 0,3, в.е.ж - пурпурная кислотная форма Бр в присутствии 200 мМ КР при рН 3, 2 и 1,6 соответственно. Состав среда: 100 м&1 маС1, б мЫ MES, 3 мМ .цитрат, 22 °С. Изменения рН производили добавлением HCi. а,и -электрогенность К~>1 перехода (указан стрелкой), з -фотоэлектрический ответ Бр при pD 5.G в среде с D20. и -фотоэлектрический ответ Бр в среда с HgO при рН 2.

однозначным.

Причины генерации отрицательной фазы, очевидно, следует искать в процессах происходящих в самой хромофорной группе или ее ближайшем окружении. Наиболее вероятными- причинами могут быть фотоиндуцируемый сдвиг электронной плотности вдоль молекулы ретиналя (которая согласно многочисленным работа по круговому и линейному дихроизму наклонена под углом 20-30° *к плоскости ПШ и/или изомеризация хромофорной группы.

Сдвиг положительно заряженного основания Шиффа в направлении, противоположном транспорту• при фиксированном положении основной части ретиналя, мог бы давать изменение потенциала, сравнимое по величине с отрицательной фазой. Однако в это объяснение природы отрицательной фазы не укладывается наличие такой же фазы у фотоцикла 13-цис-Бр.

Темновая адаптация препарата, при которой в образце.накапливается 13-цис-Бр и соответственно уменьшается количество транс-Бр, приводит к уменьшению амплитуд положительных мкс- и мс-фаз фотоэлектрических ответов, но к увеличению амплитуды отрицательной фазы. Наличие быстрой отрицательной фазы у фотоответа 13-цис-Бр было подтверждено прямым способом- встраиванием в ШМ апомембран е.. после дующей регенерацией их 13-цис-ретиналем. Следует отметить, что фотохимические превращения 13-цис-Бр включают образование только батоинтермедиата(ов). Последние в основном превращаются в исходный 13-цис-Бр, а частично - в транс-Бр (Sperling et al., 1977). Для фотоответов 13-цис-Бр, получаемых как при регенерации апомембран, так и из сравнения' ответов темно- и светоадаптированных препаратов Бр (рис.8,12), кроме отрицательной фазы, характерно наличие сравнимой с ней по амплитуде положительной мс-фазы. Скорость этой фазы .близка к

скорости релаксации батоинтермедиатов фотоцикла 13-цис-Бр. Рв-' лаксация фотоэлектрического ответа к исходному уровню определяется постоянной времени Ш1М со встроенным Бр.

Положительная мс-фаза фотоответа 13-цис-Бр, по нашему мнет нию, обусловлена тем, что часть молекул 13-цис-Бр переходит в . транс-Бр, отлича»«дайся по распределению зарядов. Этот переход эквиеаляп'ен сдвигу положительного заряда на 50-100^ толщины ПМ по направленны от цитоплйзматической к наружной поверхности.

Отрицательная фаза наблюдается в. фотоответах самых разнообразных аналогов Бр, регенерированных из апомэмбран и аналогов транс-ретиналя, и облздощнх протонтранспортирущей активностью, Фотоэлектрические фотоответы 13-цис-аналогсв Бр с пониженной способностью л переходу в транс-Бр (замена иононового кольца на фенильнов или фторфешльное, введение тройной овяьи,в полиеновую цепь) состоят только кз отрицательных фаз. '.

Тапш образом, для транс- и 13-цйс-Бр и их аналогов, о также . обеих кислотных форм Бр образование первичных батоинтермедиатов сопровождается генерацией отрицательной фазы. Это первичное разделение зарядов nociii' одичаковый характер, независимо от то. го, ¡шляется ли фотоцикл Бр протошшреносящим или нет. Интересно, что первой фазой фотоэлектрического ответа зрительного родопсина по нашим данным также являе7сл,отрицательная фаза,,составляющая \% от величины полного ответа и связанная о ранними стадиями фотоцикла - образованием бато- или люмиродопсина. В литературе также сущоствует указание на наличие аналогичной фавн первичного разделения зарядов у х'алородопсина (Der ei al., 1985).

Для транс-Ьп и сшей кислотной формы легко представить, чтр при сильном закиолен:ш наружной среды 'трсуоннереносящая актив-'

ность нарушается вследствие ингибироваяия процесса депротошро-вания основания Шиффа, вместе с тем, первичные процессы запасания световой энергии и разделения зарядов могут не претерпевать изменений. Дальнейшие■эксперименты показали, что и в самом деле сходство первичного разделения зарядов у транс- и 13-цис-Бр носит не случайный характер: 13-цис-Бр в принципе способен осуществлять трансмембраншй перенос Н4. Для него при высоких значениях рН реализуется ситуация, подобная переходу между синей" кислотной и нейтральной пурпурной формами транс-Бр.

Образование интерыедиата И в фотоцикле 13-цис-Бр. Принято считать, что светоадаптированные ГШ' содержат только транс-Бр, а выдержанные в темноте (при 35 °С t1/2=20 мин) - эквимолярную смесь транс- и 13-цис-Бр (Sperling et al., 1977). ЕслИ транс-Бр обладает фотоциклом, включающим депротонированннй интермедиа* М, и способен осуществлять трансмембранный перенос Н4", то 13-цис-Бр Н*" не транспортирует и интермедиат Н не образует. При фотоцикле 13-цис-Бр образуются только длинноволновые-интермедиа ты. Филологическое значение процессов- темновсй,и световой адаптации неизвестно. Вполне возможно, что причиной темновой адаптации является сама изомеразная активность Бр, обеспечивающая нормальное протекание протонтранспортного цикла, а физиологически значимым является процесс световой адаптации - перевод всех молекул Бр в более активную протонтранспортирующую форму.

В противоположность общепринятой точке зрения нами обнаружено, что при достаточно высоких значениях рН 13-цис-Бр способен при поглощении одного. кванта света вступать в фотохимические превращения с'образованием депротонированного интермедиата М. Вначале. это было показано для мономерного солюбилизированного тритоном Х-1СЮ препарата.Бр (рис.10). В отличие от ПМ, у кото-

МОО нм

, хЮО

¿А400 Ш» х10°

Пурпурные мембраны

светоадапгированные ^ \^емноадаптированные

Солюбшш зированный Бр

^светоадаптя.-* ——-у рованный ч

- - - \,темноадап-Ч\тированный

1—I—г-

20 ИС

Т

лв

т—I—г-

г с

1 -

о>

д'вЧ

4 <

-1 -

Темноадаптированный солюбшгазированный Бр

быстрая фаза релаксации

ме;дленная фаза

релаксации

303

400

500

600

-1 700

нм

Рис.10. А,Б - влияние световой и темноЕой адаптации на амплитуду и кинетику релаксации интермедиата Ы412 в суспензии Ш и солюбилизированного тритоном Х-1Ш Бр при рН 7,5. В -дифференциальные спектры быстрой и медленной фаз релаксации • (соответствующих быстрой и медленной разверткам на рис.1 ОБ) » фотоиндуцируемых спектральных изменений у темноадвптированного солюбилизироЕвнного тритоном Х-100 Бр. Состве среда: 60 мМ К-цитрат-фосфат-боратный бу*вр, рН 7,5, 23 °СГ Б,В. - добавлен 2% тритон Х-100.

4

рых световая адаптация при рН 7 сопрвождается ростом амплитуды оптического сигнала при 400 нм (то есть количества образующейся формы М) в 2 раза, без изменения кинетики распада И, у мономэр-ного Бр меняется кинетика релаксации сигнала, а не его амплитуда. Дальнейший анализ привел к выводу о том, что короткоживу-щая, исчезащая в мс-области форма М частично обусловлена фото- ' циклом 13-цис-Бр, а долгоживущая, исчезающая в секундной шкале форма М - фотоциклом транс-Бр.

Макимуш дифференциальных спектров форм М из фотоциклов 13-цис- и транс-Бр расположены при одних и тех же длинах волн (рис.10). 13-цис-Бр постепенно теряет способность образовывать М при уменьшении рН ниже 7 (рис.11). Появление у 13-цис-Бр способности при достаточно еысоких значениях рН образовывать при ■фотоцикле интермедиат М была продемонстрирована также для молекул Бр, входящих в мембрану протеолипоссм (рК~7,б) и в Ш (рК"'8,Б при высокой ионной силе и рК"Э,5 при низкой ионной силе). Эффективность образования М у 13-цис-Бр выше в тритоновом препарате и липосомах, чем в ГОЛ, то есть, возможно,определенные ограничения на втот процесс накладывает жесткая структура ПМ.

Прямым образом наличие формы М в фотоцикле 13-цис-Бр продемонстрировано при использовании регенерированных 13-цис-ретиналем белых мембран - мембран, содержащих бвктериоопсин и выделенных из штамма н, каГоЬгит лЛ, не синтезирущего рети- • наль (рис.11). Отчетливо видно появление у 13-цис-Бр способное- . ти образовывать М при высоких рН.

Для мономерного Бр с помощью рН-индикаторв обнаружено, чтп фотоцикл 13-цис-Бр, включающий обрвзоЕешю интермедиЕта М сопровождается выделением и поглощением Н4", причем как и в случае транс-Бр поглощение К- из среда также осуществляется не не

см -

о

о

'к

о о

-3- -I <

I—г—г—1—:—г

К 80

—I—I—I—г

ИС

т—Г—I-1--1-1-1-1-г

дв ■

11

Л£

80 МС

мсв/мт

2-

I -

солюбялп зированнкй

Бр-липосомы

0_|-5-5--5-1-[-г-1

4 £ 6 7 8 9 10 рН П Рис.11. Появление у )3-цис Бр при высоких значениях рН едосоЗ-

ности образовывать при фотоцикло интермедиат М. А,Б - индуцируемые лазерной вспышкой изменения оптической плотности при 400 ьм в суспензии белых мембран, восстановленных 13-цис-ретиналем (а), после «того сЕетсадаптировашых (б) и вслед за этим темно-адаптированных. (в). В - зависимость ст рН отношения амплитуд ^оточндуцируемых изменений при 400 га светоадаптированного (Мсв) и тешоадапгировынного (М^,) препаратов. 'Гемновую к светог вую адаптация проводили при рН 6, после чего рИ изменяли до необходимого значения. Состав ср?да: 60 мМ К-цитрат-фосфат-боратный буфер. . .

MB MB

Рис.32. А.Б - появлений у 13-цис-Бр способности к трансмембран-вому переносу Н+ при высоких значениях рН. Представлены Индуци-руеше лазерной всштой ответы свето- я темнсадзпяфэвянных препаратов ¡Бр-лшюсом в системе "ЮТ-Бр". 13-цкз-Бр - вччяслкн -ный вклад молекул 13-цис-Вр в электрический otbsî зжшгзадатв-. рованного Бр. Для определения этого вклада ira ответ темдоэдзп-тировшшого Бр виттеа ответ свгтоэдадтировяннэго препарата, уменьшенный в два раза. В - стека фотоциклов транс-Бр и 13-иис-Бр. Предполагается,■что груши таг входят в состав выходного протонного лути.-

стадии гибели М, а на последующей стадии превращения длинноволнового интермодиата в.исходную форму Бр.

В системе "ИЛМ-Бр-липосоМы" из сравнительного анализа фотоэлектрических ответов темно— и светоадаптированных препаратов Бр (рис.12) следует, что. при повышении рН 13-цис-Бр приобретает способность генерировать электрический потенциал, и основные фазы его фотоэлектрического ответа практически неотличимы от фотоотватов транс-Бр при нейтральном рН.

• Выявляется определенная англогия между рН-заЕИСнмым переходом 13-цис-Бр из формы, способной образовывать М и транспортировать Н*, в неактивную форму с переходом транс-Бр в синюю кислотную форму, также не способную образовывать М и транспортировать Н4. Сходны алектрические ответы неактивных форм 13-цис- и транс-Бр, в которых преобладает отрицательная фаза. Фотоциклы обеих форм сопровождаются образованием длинноволновых янтермедиатов.

Мы полагаем, что как транс-Бр, так и 13-цис-Бр могут существовать в двух формах (см. схему на рис.12), отличающихся про-тонированностью группы ¥(*')■'Эта группа является акцептором Н4 с основания Шиффа и, вероятно, входит в соствв выходного протонпереносящего пути. Лротоннрование этой группы предотвращает депротонирование основания Шиффа при фэтоцикле, а соответственно предотвращает образование интермедиата М и транспорт 1С. Согласно предварительным данным группы у и У являются различными группами.'

выводи

1. В результате применения нового метода прямой регистрации ' меморанного потенциала в комплексе с анализом спектральных превращений и фотоивдуцируемых изменений рН в водной фазе

исследованы стадии образования мембранного потенциала бактерио-родопсином и установлена их связь с его фотохимическими превращениями и с процессами поглощения ионов Н+ белком и шброса Н4 из белка. • •

2. Показано, что при каадом обороте фотоцикла бэктериородоп-сина переносится не более одного Н+. Обяарукесы причины, которые могли приводить к завышенным значениям стехиометрии транспорта Н* в исследованиях других авторов.

3. В течение фотоштла бяктерщхдогскна шделетае Н+ из белка происходит не позднее стадии образования интермедиата М с депротонированным основанием Шиффа хромофорной группы. Выделение Н4" сопровождается генерацией трансмембранного потенциала, составляющего около 20% от полного потенциала, генерируемого в результате одного оборота фотоцикла. Только при фотоцикле бактериородопсина, включащего образование депротониров&нного коротковолнового интермедиата М, происходит генерация трансмембранного потенциала, обусловленного переносом Н4.

4. Поглощение Н+ белком при релаксации исходного состояния бактериородопсина и протонирования хромофорной группы вносит основной вклад (около 80Я)в генерацию трансмембранного электрического потенциала.

5. Предложена модель функционирования бактериородопсина, включающая два протонных пути - входной и выходной, связь между • которыми осуществляется посредством хромофорной группы, являющейся источником переносимого Н4". Генерация основной части потенциала на стадии поглощения Н* обеспечивается положением хромофорной группы вблизи поверхности выброса К* - наружной поверхности пурпурной мембраны.

6. обнаружено, что превращение депрогашровзнного интерме-

диата М в исходную форму бактериородопсина происходит через образование ранее неисследованного интермедиата, обозначенного как интермедиат Р. Интермедиат Р (другие названия N. й350) имеет спектр поглощения, близкий спектру поглощения исходной форш Сактериородопсинано сдвинутый в коротковолновую область' . на 10 нм; коэффициент молярной экстинкции Р на 3056 меньше, чем у исходной формы.

7. Переход интермедиата М в интермедиат Р обусловлен прото-нированием хромофорной группы внутрибелковым донором И4. При превращении интермедиата Р в исходную форму одновременно изоме-ризуется хромофорная группа и поглощается Н+ из наружной среды. Предложен возможный механизм сопряжения этих процессов.

а. Обнаружена группа эффективных' ингибиторов фотоцикла бак-териородопсина - солей лантаноидов и ряда других поливалентных металлов, препятствующих фотохимическим превращениям на стадии распада интермедиата М. Предполагается, что механизм их действия заключается в блокировашш конформэционных изменений, сопровождающих процесс внутрибелкового протонирования хромофорной группы.

£. Наличие карбоксильной группы у Авр-96 существенно для внутрибелкового протонирования хромофорной • группы: замена посредством направленного мутагенеза Авр-96 на Авп,- но ре на аш, приводит к ' нарушению нормального протекания процесса ' релаксации интермедиата М.

'10. Обнаружено, Что образование первичных Оатоинтермедаатов . при фотоциклах различных форм бактериородопсина сопровождается •первичным разделением зарядов, выражающимся в генерации небольшой по амплитуде разности потенциалов обратного знака по отношению к потенциалу, генерируемому в результате трансмембранногЬ

переноса Н4. Первичное разделение зарядов имеет сходный характер для протонпереносящих фотоцщслое и для фотоциклов, не со-провозвдащихся переносом Н4.

11. Бактериорадопсин с полностью транс-ретиналем и бактериородопсин с 13-цис-ретиналем могут вступать в зависимости от рН как в цикл фотохимических превращений, сопровождающий- ■ ся образованием интермедиата М и транспортом н4, твк и в фотоцикл, при котором интермедиат М не образуется и Н4 на транспор-' тируется. Появление протонтранспортного фотоциклв у бактериородопсина о 1З-цис-региналем происходит при значительно более высоких значениях рН, чем.в случае бактериородопсина с транс-ретиналем. Согласно предложенной модели, необходимым условием вступления бактериородопсина в протонтранспортный фотоцикл является депротонированность акцепторной группы выходного протонного пути.

Автор искренне благодарен Владимиру Петровичу Скулачеву, Лелю Александровичу Драчеву, всем сотрудникам отделов биоэнергетики и новых физических методов, без помощи и поддержки которых эта работа не .могла бы быть выполнена.

Сокращения: Бр - бактериородопсин

транс-Бр - Бр, содержащий в качестве хромофорной .

группы полностью транс-ретиналь 13-цис-Бр - Бр, содержащий в качестве хромофорной группы 13-цис-ретиналь ' ПМ - пурпурные мембраны ШМ '- искусственная липидная мембрана

ПЕРЕЧЕНЬ ОСНОВНЫХ РАБОТ, опубликованных по теме диссертации: Драчев Л.А., Каулен А.Д., Кондрашмн A.A., Либермак Е.А., Немечек И.Б., Остроумов С.А.. Семенов A.D., Скулачев Е.П., Ясайтис A.A. Генерация электрического тока цитохромоксидазой, К*-АТФаэой и бактериородопшюм. Докл.АН СССР, 1974, т.218, *2, с.131-484.

2. Brachev L.A., Kaulen A.D., Cstroumov S.A., Skulachev V.P. Eleetrogenesis bу bacteriorhodopsin incorporated in a planar phospholipid membrane. PEBS Lett., 1974. v.39, n1, p.43-45.

3. Drachev L.A., Jasaitie A.A., Kaulen A.D., . Kondrashin" A.A., Liberman E.A., NereeoeVc l.B., Ostroumov S.A., Semenov .A.Yu., Skulachev V.}'. Direct measurement oi electric current generation by -sytochrome oxidase, H+-ATJ?aue and bacterio-rhodojisln. Nature, 1974, v.ZA9. p.321-3^4.

4. lXraohev L.A., Prolov V.U., Kaulen A.D., Liberman E.A., Oatro'JSBOV S,A., Plakunova V.G., Semenov A.Yu., Skulachev V.P. SUoonstitution oi biologioal inoleoular generators ol eleotrio current. Bao t eri orho dop б in. J.Biol.Chem., 1976, v.251 ( N22, p.7059-7065. .. '

[>. Драчев Л.А., Каулен А.Д., Скулачев В.П. Временные характеристики бактериородопсина как молекулярного генератора электрического тока. Мол. биол., 1977, т.И, вып.6, 0.1377-1387.

6. Draehev L.A., Kaulen A.D., Skulachev V.I1. Time resolution of the intermediate stop« i^i the bacteriorhodopain-Hnked electrogenefis. PEES Lutt.,1978, v.87, N1 ,■ p.161-167- .

7. Abdulaev N.G., Peigina M.Yu., Kiselev A.V., . Ovchinnikov Yu.A., Drachev L.A., Kaulen A.D., Khitrina L.V., Skulaohev У.Р. Produots of limited proteolytic oi bacteriorhodopsin generate a

. тетЬгаце potential. PEBS Iptt.,1978, v.90, N2, p.190-194, ,

е. Войцицкий В.М. Драчев .:.А., Каулен А.Д., Скулачбв В.П. Образование разности потенциалов мембранными препаратами бактериородопсина, ассоциированными с поверхностью раздела липкд-вода. Докл. AR СССР, .1979, Т.245, *6, с.726-729. ■ 9. Войцицкий В.М., Драчев Л.А.,.Каулен А.Д., Скулачев В.П. „Фотоэлектрические ответы бактериородопсина в системах липид-вода. Бкоорган. химия, 1979, т.6, *6, с. 1184-1195,

lOi Dra<?hev L.A., Kaulen A.D., Semenov A.Yu., Severina I.I,, Sloüaohev-V.F. Lipid.-impregnated filters as tool for study Lig the eleotrio current-generating proteins. Analyt.Bioohem.,

1979, v.96, p.250-262.

11. Драчев Л.А., Каулен А.Д., Скулачев В.П., -Хитрина JI.B., Чекулаевз Л.Н. Особенности фотохимических превращений бактерио-родопсяна при низких значениях pH. Биохимия, 19B1, v.4G, КБ, с.897-903.

12. Драчев Л.А., Каулен А.Д., Скулачев В.П., Хитрина Л.В., Чекулаева Л.Н. Фазы фотоэлектрического ответа бактериородопси-на. Биохимия, 1981, т.46, вып.6, с.998-1005.

13. DracheV L.A., Kaulen A.D., Khitrina L.Y., Skulachev V.P. Fast eta^es of photoelectric processes In biological membranes. • I< Baoteriorhoclopsin. Eur. J.Biochem.1981, v.117, p.461-470.

14. Хитрина Л.В., Драчев. Л.А., Каулен А.Д., Чекулаева Л.Н. 'Кнгибирование бактериородопсина формалином и лантаном. Биохимия, -1982', Т.47, ВЫП.И, с.1763-1772.

■ 15. Drachev L.A., Kattien A.D., Skulachev Y.P., Voytsitsky V.M. . Baoteriorhodopsin-rnediated photoelectric responses in lipid/water systems. J.Membrane Biol., 1982, v.65, p.1-12.

. 16. Ovohinnikov Yu.A., Abdulaev N.G., Dergachev A.E. Drachev A.L., Drachev .L.A., Kaulen A.D., Khitrina L.V., Lazarova Z.I'., Skulachev V.P. Photoeleotric and Bpectral respomsos of bacteriorhodopsin modified by carbodiimide and amine derivatives. Eur.J.Biochem., 1982, ^.127, p.325-332.

17. Хитрина Л.В., Драчев Л.А., Каулен А.Д. Электрогенность медленных фаз фотохимического цикла модифицированного.бактерио-родопсина. Тезисы докладов I всесоюзного биофизического съезда, Москва, 1982,. т.1, с.286. - ' '

18. Драчев k-.il., Драчев Л.А., Каулен А.Д., Хитрина Л.В., Чекулаева Л.Н. Влияние анионов на спектральный переход бакте-риородопсина при низких значениях pH. Биоорган, хишя, 1983, т.9, £12, с.1606-1610.

19. Каулен А.Д. Модификация кинетики фотоэлектрического и фотохимического циклов бактериородопсина ионами лантана, формальдегидом и. глутаральдегидом. Тезисы докладов ill советско-швейцарского симпозиума "Биологические мембраны. Структура и ■ функция", Ташкент,' 1983, с.70.

20. Драчев Л.А., Каулен"А.Д., Скулачев В.П. Стадии переноса Н+ бактериородопсином и локализация ретиналя. Тезисы докладов 16-ой конференции ФЕБО, Москва, 19В4, с.291..

'2.1. Каулен А.Д.^ Драчев Л.Л., Лрачев Л.А. Быстрые изменения

pH E суспензии пурпурных мембран и фоторецепторных дисков. Там т, с.291.

¿2. Draohev A.I,., Draohev L.A., Kaulen A.D., Khitrina L.V. The action of lantanum ione and fonnaldehyde on the proton-pmiping function of baoteriorhodopsin. Eur.J.Bioohem., 1984,

23. Draohev I.A., Kaulen A.D., Skulaohev V.T. Correlation of photochemical cycle, H+ release and uptake, and eleotrio events in baote-riorhodopB-in. FEBS Lett., 1984, v.178, N2', .p.331-335.

24. Драчев Л.А., Каулэн А.Д., Скулачев В.П. Природа' электрогеншх фаз фотоцкклэ бактериородопсина и локализация ретшшля. Декл.АН СССР, 1965, Т.281 , Й1, с.176-180.

25. Аодулаев Н.Г., Киселев A.B., Овчинников Ю.А., Драчьв JI.A., Иаулен А.Д., Скулачев В.П. С-концевой участок не влияет на протонтрайолоцирующую активность бактериородопсина. Риол.мзмбраны, 1965, т.2, JS6, с.453-459. .

::6. Каулан А.Д., Драчев Л.А. Перенос протона и электрогенше стадии в фотоцикле бактериородопсина и зрительного рододсина. Тезисы докладов V всесоюзного биохимического съезда, 1935, т.1, с.193.

£7- Ovohirmikov Yu.A., Abdulaev >1.G., -Kiselev A.V., Draohev I.A., Kaulen A.D., Slcuiachev V.I'. The water-expoeed C-terminal cequer.ot.- of baoteriorhodopsin does not ei'feot H+ pumping. iTJSS Lett., 198Ö, v.194, N1, p.16-20.

2a. Каулен А.Д., Драчев Л.А., Хитрина Л.В., Зорина В.В. Злек-рогенные и протонтранспортируюндее фазы бактериородопсина.' Тезисы II международной конференции "Ретинальсодержащие белки", Иркутск, 1936, с.75.

£9. Draohev Ii.А.", Kaulen A.D., Skulaohev Y.P., Zorina.Y.V. Protonation of a no.vel intermediate V in involved in the M—>bR btßp of the baoteriorhodopein photooyole. FEBS Lett., 1986, v.209, N2, p.316-320.

30. Kaulen A.ß., Draohev i.A. ihotoeleotroohemioal oyole of Ььс teriorho Jnpalii. foure European Bioenergetioe Conference. Short reportsv Cciigroae ed., Prague, 1986, v.4, p..124.

31. Каулен А.Д., Зорина B.B. Новый интермедиат. фотсцикла бактериородопсина, 1 ответственный за поглощение протонов из преды. Биол.мембраны, 19fi7, т.4, Ю, с.831-837. '

32. Skulaohev V.Р., Draohev L.A., Kaulen A.D., Khitrin*.

L.V., Zorina V.V., Danshina S.Y. Proton transport and eleotro-genous phases in the baoteriorhodopsin photooyole. In: "Retinal proteins", ed. Ovchinriikov Yu.A., VNU Science Press, Utrecht, 1987, p.531-552.

•33. Drachev L.A. ,• Kaulen'A.D., Skulachev V.P., Zorina V.V. The mechanism of H+ transfer by baoteriorhodopsin.The properties and the function of intermediate p. FEBS, Lett., 1987, 'v.226, N1, p.139-144.

34. Драчев А.Л., Драчев Ji.A., Каулен А.Д., Хитрина JI.В.. Кооперативность перехода солюбилизированного бактериородопсина в кислотную пурпурную форму под действием анионов 01". Биоорган.химия, 1989, т.14, >63, с.318-320.

• 35. Драчев А.Л., Драчев Л.А., Каулен А.Д., Скулачев В.П., Хитрина Л.В.' 'Фазы фотоэлектрического . ответа 13-цис-Оактериародапста. Биохимия, 1988, т.53, вып.5, с.707-713.

36. Драчев Л.А., Каулен А.Д., Хитринэ Л.В. Соли поливалентных металлов как ингибиторы фотохимических превращений бактериородопсина. Биохимия, 1938, т.53, вып.4, с.663-667.

37. Зорина В.В., Каулен А.Д. Сопряжение процесса поглощения протона . бактериородопсшом: при фотоцикле с изомеризацией хромофорной группы. Биол.мембраны, 1988, т.5, М, с.400-407.

38. Каулен Л.Д., Драчев Л.А. Кинетика транспорта протона и динамика конформационных изменений бактериородопсина в процессе фотоцикла. Тезисы докладов советско-чешского'семинара "Динамика и активность ■ биологических макромолекул: лазерный и компьютерный эксперимент", Ереван, 1988, с.28-29.

39. Brachev L.A.. Kaulen A.D., Skulachev V.P., Zorina V.V. Electrogenic photooyole of the 13-cde retinal-containing bacteriorodopsin with an M intermediate involved. PEES bett., 1988, v.239, N1, p.1-4.

40. Prachev L.A., Drachev A.L., Chekulaeva L.N., Evstigneeva R.P.,. Kaulen A.D., Khitrina b.V., Khodonov A.A., Lazarova Z.R., Mitzner B.I., An investigation of the electrochemical cycle of baoteriorhodopsin analogs with the modified ring. Archives■ bioehem.Biophys., 1989, v.270, N1, p.184-197.

41. Зорина В.В., Каулен А.Д. Образование интермедиата типа М в. фотощгкле адаптированного к темноте 13-цис-бактериородопсикз. I. ' еол»х?и.тазировп1шь:й .бактяриородспсин. Ниол.мембркин, 1983, т!5, Ю, с'.'Н0-91 Я. V

42. Каулен А.Д., Зорина В.В. Образование интермедиата типа М ь фотоцикло адаптированного к темноте 13-цис-бактериородопсша. II. Бактериородопс-инсодерхащие протеолипосомн и пурпурные мембраны. Биол. мембраны, 1988, т.5, JS11, с.1135-1144.

43. Slculachev V.P., Drachev L.A., Kaulen A.D., Zorina V.V. Slightly blue-shifted forms of baoteriorhodopsin: photocyole intermediate and dark-adapted bR^g. Proceedings of the YumadA Conference XXI, 1988, p.117-123.

44. 'Каулен А.Д. Особенности фотосинтеза у галобактерий: свйтозапясимая протонная помпа - бактериородопсин. Сборник' научных трудов "Архебактерии", ред. Заварзин Г.А., Пущино, ,196'3, с.Ю4-110..

4b. Drachev Ъ.А., Kaulen A.D., Zorina V.V. Light-scattering ohangos in t.tve baoteriorhodopsin photocyole. FEBS Lett., 1989, v.243, Ы1, p.5-7.

46. Каулен А.Д., Драчев Л.А., Зорина В.В. Анализ кинетики изменения светорассеяния в суспензии пурпурных мембран. Еиол.мембраны, 1939, т.6,' Jfö, с.149-152. .

47. HoUK., Draohev L.A., Mogi Т., Qtto П., Kaulen A.D., Heyn M.K, Skulachev V.P., Khorana H.G. Tho Asp~36—>Asn mutation of bacteriorhodopcin elowe down the decay of M and the re-protonation phase of the charge translocation. Proo.Natl.Acad. Sol.USA, 19B9, v. , N . -

43. Драчев JUA., Каулен Л.Д., Корана Х.Г.-, Моги Т., Otto X., Скулачов в.П., Хейн М.П., Хольц М. Участие.карбоксильной группы остатка аспэрагшювоЛ кислоты-96 во входном протонном- пути бактериородопсина. Биохимия, 1989, т.54, Jfö, с.

49. Каулен А.Д. Интермодиат фотоцикла бэктердародопсина P-N-fi350: вопрос о его месте в фотоцикле и фотохимической активности. Биол.мембраны, 1989, т.6, т, о.677-682.

50. Kaulen АД). 13-oit!-Bactej.-iorhodopsin photocyole: proton transport and M-type intermediate formation. Abstracts of International symposium "Molecular organization of biological

■ structures", Mosocw, IS39, v.1, p.40. .

*

Д-15328 Подписано к печати 28/У1-89 г. Заказ 571 ■ , _ ■ Формат 60 х В4/.Т6 Тираж 130

Типография ВАСХЩШ Москва, Б.-1арит0ньёвск;0ГпорТ~~21 / j

J