Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение пространственной структуры фрагмента С2 бактериородопсина методом спектроскопии ЯМР

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение пространственной структуры фрагмента С2 бактериородопсина методом спектроскопии ЯМР"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ Р Т 0 '1 ФИЭИК0~ТЕХНИЧЕСКИИ ИНСТИТУТ_

На правах рукописи УДК 577.322.4 577.322.3 543.422.23

СОБОЛЬ Александр Григорьевич

ИЗУЧЕНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ "СТРУКТУРЫ ФРАГМЕНТА С2 БАКТЕРИОРОДОПСИНА МЕТОДОМ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР

оз.оо.о2 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ДОЛГОПРУДНЫЙ - 1993

Работа выполнена в Институте биоорганической химии вы. H.H. Шемякина в D.A.Овчинникова РАН.

Научный руководитель: -доктор химических наук А.С.Арсевьев

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

В.Л.Флорентьев

кандидат Яизико-математических наук, ведущий научный сотрудник

В.И.Шейчеико

Ведущая организация: Институт химической физики им. H.H.Семенова РАН

Защита состоится 21 декабря хээз г. в к часов зо минут на заседании специализированного совета К обз.91.10 при Московском ОЕизико-техническом институте по адресу: 141700 г.Долгопрудный Московской области. Институтский переулок, 9, МФТИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан "\Ч " ноября 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

В.Б.Киреев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем. Одной из задач, стоящих перед методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в структурных исследованиях биологических макромолекул является поиск подходов к изучению структуры все более и более крупных белков. Пр'движение по этому пути сопряжено с решением большого количества технических, теоретических и практических задач.

Характерной ситуацией является далеко не полное использование информации, содержащейся в спектрах ЯМР (особенно количественной информации) или, наоборот, невозможность получить информацию из-за перекрывания сигналов в спектрах. Для мембранных белков эти и множество других проблем дополняются необходимостью подбора среды, моделирующей мембранное окружение, но отличающуюся от мембраны тем, что позволяет применять всю мощь современных методик ЯМР высокого разрешения.

В настоящей работе представлены результаты развития подходов к решению вышеперечисленных проблем на примере бактериородопсина (БР) и его химотриптического фрагмента сг.

Бактериородопсин - основной белок пурпурных мембран галофильных микроорганизмов Halobacterium haloblum, состоящий из полипептилной цепи длиною 248 аминокислотных остатков и хромофора ретиналя, связьнног; альдиминной связью с остатком Lys*16. Поглощение света хромофором запускает фотоцикл, который приводит к переносу протона через клеточную мембрану.

Исследование структуры бактериородопсина методом ЯМР представляет интерес как с точки зрения изучения механизма мембранного транспорта, так и с точки зрения разработки подходов к установлению структуры мембранных белков методом ЯМР.

Данная работа представляет часть проводимых в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и D.А.Овчинникова РАН исследований структуры и функционирования бактериородопсина.

Цель работ. 1) Разработка подходов к использованию количественной информации, содержащейся в спектрах ядерного эффекта Оверхаузера (nofsy) белков, для установления х пространственной структуры. 2) Разработка методики измерения времен спин-решеточной релаксации индивидуальных -"ротонов

макромолекул, использующей преимущества двумерных методов ЯМР. э) Поиск среда для солюбилизации бактериородопсина и его фрагментов,, моделирующей мембранное окружение и позволяющей использовать ,;етодики ЯМР высокого разрешения. Подбор протокола виде.- эния и солюбилизации фрагментов бактериородопсина, сохраняющего структуру, близкую к нативной. 4) Исследование пространственной структуры фрагмента (i-7i) бактериородопсина методами ЯМР,

Научная новизна и практическая значимость работ. На основании детального анализа Факторов, влияющих на объемы сигналов протонов в двумерных спектрах ядерного эфЕекта Оверхаузера (ЯЭО), предложена методика определения локальной структуры полипептидной цепи с использованием матрицы релаксации дипептидной единицы. Данный подход нашел применение и продолжает использоваться при расчете пространственной структуры пептидов и бетаов по данным ЯЭО.

Впервые предложена методика измерения времен спин-решеточной релаксации индивидуальных протонов и метальных групп сложных биологических макромолекул. Экспериментально показана применимость предложенной методики к детальным структурным исследовае:ям макромолекул.

Показано, что, будучи солюбилизированным в смеси хлороформ/метанол (i:i), 0,1 и lício<( бактериородопсин обладает компактной пространственной структурой, а фрагменты бактериородопсина сохраняют свою вторичную структуру. Методов 'н-ЯМР изучена пространственная структура химотриптического Фрагмента са бактериородопсина (остатки 1-7 х в первичной последовательности).

Апробация работ и публикации. Основные результата диссертационной работы доложены и обсуждены на пгх летней школе Ампера" с ".ССР, Новосибирск, 1987), "vn Всесоюзном симпозиуме пс химии белков и пептидов" (СССР, Таллин, 1987), "v Международно! конференции по ретиналь-содержащим белкам" (Франция, Дурдан, 1992), "xv Мездународной конференции по магнитному резонансу е биологических системах" (Израиль, Иерусалим, 1992) и др.

По материалам диссертации опубликовано ? работ во всесоюзные и международных изданиях.

Сбъел и структура работы. Диссертационная работа изложена не

213 страницах, содержит * таблицы и 57 рисунков.

Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, экспериментальной части и выводов. Библиографи-i включает 1вэ наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I. Основные параметры спектров ЯМР, их измерение и использование при исследовании структуры белков.

Первая глава, являющейся литературным обзором, посвящена вопросам использования количественной информации, содержащейся в спектрах ЯМР белков.

Б первом разделе главы описаны основные эксперименты многомерной импульсной спектроскопии ЯМР и их количественные характеристики. Во втором разделе рассматриваются основные параметры спиновых систем, их взаимосвязь со структурой белког и способы их определения методами спектроскопии ЯМР. Особое внимание уделено количественной информации, получаемой при анализе спектров ядерного эффекта Оверхаузерэ.

Глава и. Использование количественной информации, содержащейся в noesy спектрах, для установления пространственной структуры пептидов и белков.

Изучение детальной пространственной структуры полипзптидов и белков методом ЯМР все в большей степени опирается на использование количественной информации, содержащейся в спектрах. Данная глава посвящена рассмотрению предложенного автором диссертации подхода к использование количественной информации из спектров hoesy для установления локальной структуры полипептидов.

В первом разделе рассматриваются экспериментальные аспекты использования количественной информации из спектров noes", даются рекомендации по выбору схемы эксперимента, подбору экспериментальных параметров и цифровой обработке спектров.

Второй раздел содержит анализ влияния таких параметров исследуемой системы, как времена спин-решеточной релаксации протонов и время вращательной коррелящии бежа на объемы

сигналов в спектрах иоебу и погрешности математического моделирования объемов сигналов. Анализ проводился на основании результатов математического моделирования объемов кросс-пиков с использованием полной матрицы релаксации молекулы. Расчеты проводились с использованием координат атомов грамицидина а в мицеллах додецилсульфата нзтгия, полученных ранее методом ЯМР. Использовалось предположение об изотропно вращающейся жесткой глобуле с' учетом быстрых движений мотальных груш. Это предположение справедливо для грамицидина а и большинства белковых молекул, изучаемых методом ЯМР высокого разрешения.

Показано, что для моделирования объемов кросс-пиков ЯЭО в спектрах лоебу макромолекул нет необходимости измерять времена т( всех протонов и можно ограничится характерш'ми для однотипных протонов значениями. Тем не менее всегда надо помнить о влиянии продольной релаксащш на экспериментальные спектры ЯМР, приводящем к асимметрии спектров.

В третьем разделе проводится сравнительный анализ различных упрощенных математических моделей определения пространственной структуры полипептидов. В качестве упрощенных моделей рассматривается двухцентровое приближение и два. варианта усечения полной матрицы релаксации молекулы до матрицы Г"лаксации дипептидной единицы.

На основании полученных результатов предлагается методика определения локальной структуры полипептидной цепи (углов *>, * и *) по данным ядерного эффекта Овзрхаузера с использованием матрицы релаксации дипептидной единицы. •

Методика была опробована на тестовых расчетах локальной структуры вртх. Она позволяет определить углы %> и ф с точностью порядка 20°, однозначно определить ротамеры боковых цепей вокруг связи са-сР для большинства остатков при среднеквадратичном отклонении межпротонных расстояний от реальных на 0,2 Я.

Данной алгоритм был реализован, как соит-^вная часть программы со^отши. он был успешно применен для расчета локельной структуры инсектотоксина 1а скорпиона вигьия Еиреия, грамицидина а, фрагмег^а 66-72 интерлейкина-2 в комплексе с моиоклональным антителом к интерлейкину-2, фрагментов (1-36), (31-65) и (163-231) бактериородопсина.

Глава in. Измерение времен продольной релаксации макромолекул.

Применение обычных одномерных методик ЯМР для измерения времен спин-решеточной релаксации в биологических макромолекулах встречается с непреодолимой проблемой перекрывания сигналов в спектрах ЯМР. В этом случае вполне естественно попытаться воспользоваться преимуществом двумерной спектроскопии ЯМР для преодоления перекрывания сигналов и измерения времен продольной релаксации индивидуальных протонов.

Предложена • импульсная последовательность двумерной спектроскопии ЯМР, сочетающая в себе общеизвестную методику '"инверсия-восстановление'' (ir) и гомоядерную корреляционную спектроскопию (cosy):

180° - т - 90* - t - 90* - t2

Модификации этой методики для измерения времен тх и т2 отдельных ядер могут быть осуществлены на базе гомо- и гетероядерных методик двумерной спектроскопии ЯМР. Приведен теоретический анализ влияния предложенной импульсной последовательности на двухсшшовую систему.

Импульсная последовательность позволяет определять времена неселективной спин-решеточной релаксации индивиду альте протонов в биологических макромолекулах, если для данного протона в двумерном спектре есть хотя бч один кросс-пик (или компонент*, кросс-пика), не перекрытый с другими кросс-пиками и соотношение стнал/шум достаточно высоко. На практике эти условия выпо.'члютея для большинства протонов в спектрах белков среднего размера и олигонуклеотидов.

Предложенная импульсная последовательность была опробована на измерении времен продольной релаксации грамицидина а.

Всего времена неселективной спин-решеточной релаксации были измерены для 82 индивидуальных протонов и метальных групп из ю1, имеющихся в грамицидине а. Для проверки стандартной одномерной методикой ir были измерены времена спин-решеточной релаксации is протонов, сигналы которых были хорошо разрешены в одномерных спектрах ЯМР грамицвдина а. Результаты, получение методиками ir-cosy и ir, отличаются не более чем на 20%.

Практическая значимость методики продемонстрирована экспериментом по определению экспонированных в растворитель

протонов грамицидина а.

Глава IV.- Изучение пространственной структуры фрагмента сг бактериородо..сина.

Бактериородопсин - основной белок пурпурной мембраны

Halobacterium haloblum, СОСТОЯЩИЙ ИЗ ПОЛШЮПТИДНОЙ ЦЗШ ДЛИНОЮ .

248 аминокислотных остатков и хромофора ретиналя, связанного альдиминной связью с остатком Lye216 (рис. 1). Поглощение света хромофором запускает фотоцикл, который приводит к переносу протона через клеточную мембрану. Методом электронной диффракции на двумерных кристаллах пурпурной мембраны было показано, что бактериородопсин имеет семь трансмембранных сегментов. Дополнительные результаты, полученные селективными химическими и ферментативными модификациями, частичным протеолитическиы рчсщеплением, связыванием мококлональных антител, направленным мутагенезом, тритиевой планиграфией и методом ЯМР позволили получить информацию о локализации и взаимодействии трансмембранных сегментов и поверхностных петель в первичной последовательности бактериородопсина (рис. 1). На настоящий момент наиболее детальная информация о пространственной структуре бактериородопсина получена при помощи электронной криомикроскопии.

Исследование детальной струк-да мембранных белков в мембранном окружении методом ЯМР высокого разрешения практически невозможно из-за большого раьмера этих объектов (мембран, везикул). Таким образом, основной проблемой для применения ЯМР высокого разрешения является, подбор среды, имитирующей мембранное окружение, и приемлемого протокола переноса мембранного белка в нативной конформации в эту- среду. Удобной средой для исследования пространственной структуры бактериородопсина и его фрагментов оказалась смесь хлороформ-метанол их, о,х и Licio<. Спектр КД бактериородопсина, растворенного в этой среде, имеет форму, похожую на спектр Оактзриородопыла в пурпурной мембране, и, практически, совпадает со спектром бактериородопсина в мицеллах Triton x-ioo, для которого сохраняется фотоцикл. Перовод бактериородопсина (или его фрагментов) из мембраны в смесь

А В С . Р Р 6

»«в ТАААОООАЭРЕр

= А v 5 р

0 в

А

-к

I

_м

31 5 ..К

W

.VI

м и "О

УУА м

, А 0О<

107 Т

128Т

~ТГ

Л

.IV

1Ы _ А Т5 .

.Н

н у р о о 1

V

о р » л

р<Э 1

V

я р

е а

У

V

У

V

■Л'

, N

и_*

3 Р е v

°А0'

v/

А

с

Рис.1. Первичная последовательность бактериородопсина. Трансмембранные сегменты выделены прямоугольниками и обозначены буквами А-с. Стрелками указаны места расщепления полипептидной цепи: а - ограничениям кислотным гидролизом, в -боргидридом натрп, с - химотртасином и р -папаином.

хлороформ-ыетанол 1:1, 0,1 м ысю4 осуществляется гель-фильтрацией на еерЬааех ш-во.

Исследование фторсоОерхатг аналогов батериороОопсина летоОол "к-ЯИР.

. Исследование г.хзстранствешой структуры . бактериородопсина методом 'н-ЯМР сталкивается о серьезной проблемой перекрывания сигналов в протонных спектрах ЯМР. Поэтому для получения информации, характеризущей пространственную структуру бактериородопсина в смеси хлороформ-метанол 1:1, 0,1 н Ысю4, использовались фторсодержащие аналоги бактериородопсина. С этой целью получены производные бактериородопсина, в которых все остатки триптофана или все остатки фенилаланина были заменены на б-фтортриптофан и з-фторфенилалашн, соответственно. Наличие в спектрах "г-ЯМР небольшого числа сигналов и высокая чувствительность позволяют изучать довольно большие белки, в значительной мере ослабив проблему перекрывания сигналов. Наличие в первичной последовательности бактериородопсина в остатков триптофана и хз остатков фенилаланина позволяет в общей сложности ю.,::ть 21 репортерную группу, которые находятся в различных фрагментах молекулы (рис. 1).

На рис. 2 приведены 19г-ЯМР спектры фгорсодержащих аналогов бактериородопсина ([ з - грье ] ре тинилбактериоопсина и

[б-гтгр]ре тинилбактериоопсина). Спектры были получены с использованием спиновой развязки от протонов, что существенно улучшило разрешение в спектрах "г-ЯМР. Отнесение сигналов в спектрах "г-ЯМР (рис. 2) было выполнено преимущественно сравнением спектров фрагментов бактериородопсина, полученных расщеплением ретинилбактериоопсина химотрипсином (с1 (72-248)ретинилбактериоопсин и сг - (1-71)бактериородопсин), папаином ((1-231)ретинилбактергоопсин), папаином и боргидридом (вр2 - (1бз-231)рстинилбактериоопсин), боргидридом (В1 - смесь (1-155(бактериородопсина и (1-164)бактериородопсинь ч вг - смесь (15б-248)ретинилбактериоопсина и (1б5-248;ретишшЗактеркоопсина) и ограниченным кислотным гидролизом (а2 (1-3б)бактериородопсин)

В спектрах "г-ЯМР фторированных производных Оак'|еряородопсина (рис. 2) обращзет на себя внимание различная, от 8-12 Гц (для РЬе*7, РЬе230, Тгр10 И Тгр12) ДО 60-80 ГЦ (ДЛЯ

Рис. 2. Спектры и отнесение сигналов "г-яМР фторированных аналогов бактериородопсина: (а) [з-грне]ретинилбактериоопсина и (б) [б-птр^рэтинилбактериоопсина в смеси хлороформ/метанол (1:1), 0,1 М Ысю4. Цифры соответствуют номе^рм остатков рьс и тгр в аминокислотной последовательности бактериородопсина.

тгр" , тгр138 и Phe"s и/или Phe") полупшрина СИГН8Л0В. Полуширина сигнала I9f остатка фторфенилаланина и фтортриптофана определяется подвижностью ароматического кольца и/или динамическими характеристиками его окружения. Наличие в спектрах фторированных аналогов бактериородопсина узких сигналов свидетельствует оО отсутствии стерических ограничений, препятствущих свободному врагэнию боковых цепей соответстующих аминокислотных остатков. В большинстве случаев это можно интерпретировать как экспонированность соответствующей боковой цепи в растворитель. Широкие сигналы в спектрах подтверждают предположение о том, • что бактериородопсин в смеси хлорофог;' меганол 1:1, 0,1 м Liciot обладает третичной структурой. Косвенно это подтверждается также обужением сигналов в "f-ямр спектрах фрагментов бактериородопсина (см. рис. з). Обуженле сигналов наблюдалось для всех исследованных фрагментов бактериородопсина кроме фрагмента ci (см. рис. з г). Это, возможно, объясняется сохранением третичной структуры этим фрагментом (см. рис. 4). Из модели расположения трансмембранных сегментов в молекуле бактериородопсина следует, что расщепление бактериородопсина химотрипсином приводит к образовагго фрагмента ci, в котором трансмембранные сегменты c-g расположены компактно, вероятно так же, как и в нативной молекуле бактериородопсина (см. р-с. 4). Напротив, для фрагмента bi может сохраняться взаимодействие лишь между соседними по аминокислотной последовательности трансмембранными сегментами, многие группы на поверхности трансмембранных сегментов становятся окспонированньмн в растворитель и их подвижность увеличивается. Это приводит к уменьшению полуширины сигналов тех остатков Phe, чья подвижность была ограничена внутримолекулярными взаимодействиями в бактериородопсина.

Еще одно экспериментальное подтверждение наличия у бактериородопсина третичной структуры в смеси хлороформ-метанол 1:1, 0,1 м ысю4 было получено при анализе влияния спиновой метки ковалентно связанной с остатком Mat1", на "f-ЯМР спектры [э-фюрфенилаланин]бактериородопсина. Такая модификация бактериородопсина приводит к уширению сигнала 19f остаткэ phe230 с и до гл Гц. Устранение неспаренного электрона в результате восстановления нитроксильного радикала аскорбиновой кислотой

Рис.з. Спектры "г-ЯМР (а) [з-гриеи щшилОактериоопсина (пе<:-{Р)Б0) и его фрагментов, полученных р~сцеплением

ООРГИДРИДОМ НаТрИЯ (0) В1 И (В) В2, ХИМ0ТРШ1СИН0М (Г) С1 и (д)

сг и ограниченным кислотным гидролизом (е) А2. Сигналы пронумеровны в соответствии с их химическими сдвигами в спектре бактериородопсина. Кружками обозначены сигнал!, сохранившие свои химические сдвиги при расщеплении и относяищсся к группа сигналов 8-11.. Треугольниками отмечены сигналы, значительно изменившие свои химические сдвиги в результате расщопления. Звездочками отмечены минорные сигналы, вероятно обусловленные химической или конформэционной гетерогешюстью образцов. "

Рис.4. Схема расщепления полипептидной цепи Сактериородопсина на фрагменты а-химотрипсином (ch) и Соргидридом натрия (кавн^). a-g обозначают семь трансмембранных фрагментов.

приводит к обужению сигнала Phe"30 (11 Гц), Расстояние между неспаренным электроь^м спиноьой метки Met"3 и . ядром фтора остатка Phe230, расчитанноа по уравнению Соломона-Бломбергена, равно i3±i к.

Сохранение химических сдвигов большинства сигналов в спектрах "F-fflu' фрагментов бактериородопсина по сравнению с химическими сдвигами в целой молекуле бактериородопсина говорит о сохранении вторичной структуры этими фрагментами (см. рис. з). Исключение составляют химические сдвиги остатков, расположенных в непосредственной близости от мест расщепления полипептидной цепи (Phe", Phe153, Phe"\ Phe15£ и Phe230). Сохранение вторичной структуры фрагментами подтверждается результатами, полученными методом КД.

Таким образом, было показано, что бактериородопсин в смеси хлороформ-метанол 1:1, 0,1 н Licio4 обладает третичной структурой, а его фрагменты сохраняют как минимум вторич: ую структуру. Для изучения детальной пространственной структур методом спектроскопии 1н-ямр целый бактериородопсин слишком велик (без применения 15н н 13с обогащения). Но используя тот факт, что отдельные фрагменты сохраняют, как минимум, вторичную структуру, возможна' реконструкция пространственной структуры бактериородопсина из пространственных структур его фрагментов. Детальная пространственная структура таких фрагментов бактзриородопскяз, как сг, вг и отдельных трапемембранных

сегментов (a-g) может быть изучена методом 'н-ЯМР спектроскопия.

Изучение пространственной структуры фрагмента сг бактериородопсина летоОол 1н-ЯНР.

Отнесение сигналов (установление соответствий мевду сигналами в спектрах ЯМР и. конкретными ядрами в химической структуре молекулы) является ключевым моментом в установлении пространственной структуры молекулы методом спектроскопии ЯМР. Установление таких соответствий является необходимым условием для интерпретации данных ЯЗО в терминах расстояний ч/ли ограничений на расстояния) между конкретными ядрами.

Отнесение сигналов в .макромолекулах как правило осложняется перекрыванием сигналов в спектрах ЯМР. Для того, чтобы несколько упростить задачу отнесения, вначале было проведено отнесение сигналов в спектрах ЯМР Фрагмента (1-зб)бактериородспсинэ, химические сдвиги сигналов которого практически совпадают с химическими сдвигами соответствующих сигналов в спектрах Я\2 фрагмента сг ((1-71)бйлтвриородопсина).

Для фрагмента (1-эб)бактериородопсина в смгзи хлороформ/метанол (i:i), o,i м Licio4 были получены спектры tocsy, noesy и dqf-cosv. Отнесение сигналов было произведено следующим образом. Вначале, в спектрах dqf-cosv к tocsy онли выделены спиновые системы большинства остатков различных типов. Провести полное выделение спиновых систем в спектрах не удалось из-за сильного перекрывания сигналов. Затем спиновые системы ароматических боковых цепей были поставлены в соответствие со сгшно! ими системами нн-сан-с"нг ароматических остатков, используя кросс-пики кое между ароматическими и с^н2 протонами. Спиновая система Gin3 является уникальной в аминокислотной последовательности фрагмента. Она была выделена на основании кросс-пиков noe мевду nch и сгн2 протонами. Таким образом, для установления соответствия между выделенными спиновыми системами и конкретными аминокислотными остатками первичной последовательности методом последовательного отнесения, е наше" распоряжении оказалось достаточное число стартовых точек: Gin3, туг", Phe*7, два триптофана, три аланина и несколько других остатков. Анализируя наличие в спектре noesy кросс-пиков мевду протоном nh ii-i остатка и нн, с"н и с^н протонами остатка i (dKH(i,i+J)' dan(i'i+:I) И ds»(i'i+1" бкл0 обнаружено, что

большей часть отнесения может быть проведена на основании только dm(i,i+i) (рис. 5.а) и dp>i(i,i+i) связей. Сильное перекрывание сигналов не позволило выявить d-связи для некоторых остатков. Эта проблема была преодолена на основании идентифицированных спиновых систем и принципа самосогласованности-отнесения.

Часть проанализированных d-связей приведена на рис. 5 а. Полипептидчая цепь фрагмента (1-эб)бактериородопсин содержит од»ш остаток пролина (ргов) . Цис- и транс-конфигурацию пептидной связи х-рго можно различить анализируя кросс-пики в спектре noesy. Присутствие интенсивного кросс-пика между сан протонами остатка пролина и предпролинового остатка присуще цис-конфигурации связи х-рго. Для транс-конфигурации характерно наличие кросс-пика между с"н протоном предпролинового остатка и сан протоном остатка пролина. Используя это правило, было устаноЕчено, что пептидная связь Arg7-Proe находится в транс-конфигурации.

Вторичная структура полипептидной цепи может быть определена сравнением между теоретическими и экспериментальными d-связями (рис. 5). Каноническая а-спираль (»>=-57°, ^=-47°) имеет характерную картину d-связей, приведенную в правой колонке на рис. 5. Дополнительная информация о вторичной структуре может быть полечена из анализа скоростей обмена амидных протонов на дейтроны растворителя. Как правило, замедленный обмен говорит об образовании водородной связи, а время полуобмена тем больше, чем стабильнее такая связь. Таким образом, вторичная структура (1-зб)бактериородопсина представляет собой протяженную а-спираль, начинающуюся остатком Pro8 и заканчивающуюся в районе Met32. На к-конце наблюдается замедленный обмен для амидных протонов остатков lie*, Thr5 и Giy6, что означает пзличие . J этом участке структурированности и будет обсуядено ниже.

Отнесение сигналов в спектрах фрагмента сг проводилось по процедур*;, аналогичной описанной вшле. .В качестве вспомогательной информации попользовалось лнесениз сигналов для фрагментов (1-Зб)бактериородопсш, полученное в настоящей работе. Для того, чтобч упростить процедуру отнесешя, были получепы ЯМР спек'хш фрагмента сг, в котором р-протош всех остатков лейцина были заменены на дейтерий. Принимая во внимание, что для биосинтеза дейтерирова1икзго с? использовался

15 10 15 29 25 30 35

рЕАа1ТСМ>ЕИ1Н[.Л11СТ*1.НС[.СТ1.ГГ1.УКСНСУ50 а сготраль на ошнсша □ пшсо

, _ . Н-С1. ^«Лк •

■■а 01а1**а«»а о

ошкша ов»

Ряс.5. Аминокислотная последовательность и а-связи с участием га, сан и с"н фрагмента (1-зб)0актериородопсина (а) и (1-71)бактериородопсина (б). Толщина линий характеризует интенсивности кросс-пиков ЯЭО в спектре моеэу . Кружком отмечены а-связи, которым соответствуют перекрытые кросс-пики ЯЭО. В правой части диаграммы показан лабор а-связеЯ, характерных для канонической праБой «-спирали. Квадратами под аминокислотной последовательностью обозначены остатки с замедленным обменом амидных протонов га на дейтерий растворителя. Пустые квадрат соответствуют остаткам, для которые кросс-пики ЯЭО с участием амидных протонов т присутствуют только в первом после растворения образца в дейтерировзнном растворителе спектре коезх.

лейцгч, дейтерированный по а и ß положениям, можно было ожидать также исчезновения кросс-пиков, обусловленных сан протонами остаткоз лейцина. Однако, эти сигналы присутствуют в спектрах <рис. fi), ч.'о объясняется трансашшироваш^.ч в процессе биоск теза. Использование дейтерированного аналога фрагмента сг позволило выделить спиновые системы остатков лейцина.

Данные о d-свяэях и скоростях дейтерообмена для фрагмента са приведены на рисунке 5 б. Анализ кросс-пиков с участием протонов остатков пролила в спектрах koesy позволил установить, что все четыре пептидные связи х-рго находятся в траке-конфигурации. Анализ совокупности полученных данных позволяет выделить два участка стабильной «-спирали.

Первая «-спираль, как и в случае фрагмента (1-зб)бактериородопсина, начинается с pro8 и заканчивается Met32. Спираль дестабилизирована в середине, о чем говорит быстрый дейтерообмен амидных протонов остатков Leu2 и ты24 (см. рис. 5 б). Отчасти, эта нестабильность может быть объяснена отсутствием значительных стерических ограничений в районе Giy21-Giy23. Спираль терминирована остатками Pro и Giy, что соответствует типичной роли этих остатков в «-спиралях.

Вторая «-спираль начинается в районе Lys41 и заканчивается в районе Leu62. Находящийся в середина «-спирали остаток Pro50 дестабилизирует систему водородных связей (см. рис. ъ б). Наблюдаемые для остатков Ala3' и l;s40 6^(1,1+3) связи (см. рис. 5 б) отражают тенденцию к продолжению a-спирали на н-конце.

Как и в фрагменте (1-Зб)иактериородопсина, наблюдался замедленный обмен амидных протонов остатков Не4, Thrs и Giy6. Участки Met32-Asp38 и Tyr64-Phe71 не стабилизированы устойчивыми водородными связями.

Наблюдалось образование водородных связей между он-группзми боковых "елей остатков треонина и серина с карбонильными группами основной цепи для остатков, находящихся в «-спирали. Во фрагменте сг в a-спиралях расположены 5 остатков треонина (в положениях 17, 24, 46, 47 И 55) И Ser59. СИГНЭЛЫ ПрОТОНОЗ гидроксильных групп были обнаруженг и отнесены для остатков Thr17, Thr47, ThrS5, Thr67 и ser59. Для остальных остатков треонина и серина таких сигналов обнаружено не было, что, возможно, объясняется быстрым обменом с растворителем или

1

» :

цф о».**

иг, т ^|

'I

К

о 0 В

%

т

«•С «

и. и а.л

г. с /х

Рис.б. ын/с?н область спектра тосзу фрагмента (а) сг бактериородопсина и (б) сг, /з-протоны остатков лейцин, которого были заменены нэ дейтерий. Отнесение га/Л; кросс-пиков приведено (а) для всех остатков и (б) только для остатков лейцина. Использовано однобуквенное обозначение типов аминокислотных оста лез.

перекрыванием с другими сигналами в спектре. При анализе спектров NOESY был обнаружен интенсивный кросс-пик между он боковой цепи остатка Thr17 и Сн протоном остатка Ala" ц-з остьток), что говорит о возможном замыкании ' сродной связи с боковой цепи Thr" на карбонильную группу о, ¡ка Leu" и/или Ala". Полностью аналогичная ситуация наблюдалась для остатка Thrss. Пледует отметить, что, в случае фрагмента (1-зб)бактериородопсина, такая же ситуация наблюдалась и для остатка Thr2'. Вероятно, конкуренция боковых цепей остатков тренчина с амидными протонами основной цепи за образование водородной связи вызывает ускорение дейтерообмена в районе остатков треонина (см. рис. 5 б).

Никаких подтверждений тому, что фрагмент С2 образует структуру типа "шпилька" обнаружено не было.

По~ полученным из спектров ядерного эффекта Оверхаузера данным произведен расчет пространственной структуры фрагмента (1-зб)бактероиродопсина (а2), который состоял из следующих этапов:

- анализ локальной структуры и оценка времени корреляции вращательного движения молекулы т (программа confornmr);

- расчет пространственной структуры по методу дистанционного геометрического алгоритма (программа diana);

- систематический перебор всех возможных ротамеров боковых цепей остатков и селекция конформаций боковых цепей, обладающих минимальной конформационной энергией и приводящих к согласованию теоретических и экспериментальных обьемов кросс-пиков ЯЗО;

- расчет по программе diana с дополнительными ограничениями, полученными на предыдущем этапе;

- минимизация конформационной энергии а2 с потенциалами есерр/2 и статистический анализ полученного набора конформаций.

Из результатов расчета следует, что участок Froe-Met'J находится в конформации a-спирали, как видно .из рис. 7 и распределения углов т и а также суш^ (рис. в). На

участке Giy^-ser35 А2 реализуется набор неупорядоченных структур, Остатки ' Aia2-Giy6 пептида образуют структуру, состоящую из двух семичленных циклов, стабилизированную двумя водородными связями Thr5 nh...o-c Gin3 и Ile* nh...o=c Ala2. Однозначно определился торсионный угол я для 12% (13 из ie)

Рис.7. Стереоизображение 16 совмещенных по.атомам с , n, с и со конфороций фрагмента (1-Зб)бактериородопсина, полученных после расчета по программе día.- а и минимизации конформэционной энергии по программе cohforkmr с использованием потенциалов ЕСЕРР/2. Конформации совмещены по атомам основной цепи остатков Pro"-Met32. Цифрами обозначены атомы с" остатков Pro8 и Met32.

-III

ш

. 1 1— — « • 1 ........1 1

11. i * 11 •

1 1

-iit >и

.г- |

I;;1!.

1 ' 1. ■ 1 (.1|,Н

i •

ш

jV"4'"

-^rrt

ы .: , , .

; |¡.;ih,'V,«i.....в1Г|.5

• ' 'i UjL

• i'

til,.

" 1!1 ' г г • 1 с ¡и,' : 1 1 Ч

1 . • » » 1. « i' . 1:

II Ull » 11 )l ))

номер остатка

P-ic.8. Торсионные углы «>,, *|f и x' в ie

конформациях фрагмента ■ (i-з з )Оактериородопсина, полученных с

использованием программы diana и лучших по величине минимизируемой штрафной функции.

аминокислотных остатков а-спирали. Амидная группа остатка не" принимает участие в водородной связи типа с-о^. .™1<3, что приводит ' к замедлению скорости обмена протона нн. Экспериментальные данные и результаты расчета свидетельствуют об образовании водородных связей ьеи" с=о...нт,о тьг17 и С1уг1 с-о...нт,о ТЪг24.

Полученные результаты находятся в соответствии с результатами, полученными для трансмембранного сегмента А в составе молекулы ви в пурпурной мембране методами электронной микроскопии (ливо на участке Рго"-ме^2 не превышает 1,34 А). Следовательно, положение в аминокислотной последовательности и протяженность <х-спирального участка определяется, в основном, аминокислотной последовательностью и, в меньшей степени, окружением.

ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ влияния параметров эксперимента и свойств исследуемой молекулы белка на объемы кросс-пиков в двумерном спектре ядерного эффекта Оврпхаузера и точность математического моделирования объемов кросс-пиков. На основании результатов анализа предложена методика определения локальной структуры белков по данным ядерного эффекта Оверхаузера с использованием формализма "полной матрицы релаксации". Предложенный алгоритм был реализован как составная часть программы сонрокот® и успешно применен при расчете структуры целого ряда пептидных молекул.

2. Предложена и теоретически обоснована методика измерения времен спин-репе точной релаксац.-л индивидуал!, лых протонов и метальных групп сложных биологических макромолекул (т-созу). Работоспособность и высокая эффективность методики подтверждена измерением времен спин-решеточной релаксации грамицидина а и сравнением с результатами, полученными традиционной методикой

(и*).

3. Б качестве среды для съемки спектров ЯМР высокого разрешения для бактериородопсина и его фрагментов подобрана смесь хлороформ-метанол (1:1), о,1 м ысю^. Методами "к-ЯМР и спиновой метки показано, что в этой среде бактериородопсин

обладает компактной третичной структурой, а фрагменты бактериородопсина.сохраняют свою вторичную структуру.

4. Получены двумерные спектры 'н-ЯМР фрагментов (i-зб) и (1-71) бактериородопсина в смеси хлороформ-метанол (isi), 0,1 и ь1сю4. С использованием спектров дейтерированного по э положениям остатков лейцина фрагмента (i-7i) бактериородопсина проведенс отнесение сигналов в спектрах 'Н-ЯМР, измерены объемы 324 кросс-пиков ядерного эффекта Оверхаузера и скорости обмена протонов амидных групп нн со средой. На основании этих данных в структуре фрагмента (i-7i) бактериородопсина локализованы два a-спиральных участка: Pro'-Met32 И Lys*1-Leu42, дестабилизированный остатком Pro50.

5. По данным спектроскопии ЯЫР проведана реконструкция пространственной структуры тран^мембранного фрагмента (1-зб) бактерлородопсина. Анализ полеченных конформаций показал, что участок Pro8-Met32 имеет конформацию правой «-спирали с rmsd между положением атомов основной цепи о,25 К . Структура этого участка согласуются с наличием «-спирали Proa-Met32 в электронно-микроскопической модели бактериородопсина. Остатки Aiaz-Giy* образуют конформацию, стабилизированную двумя водородными СВЯЗЯМИ Thrs NH. . .0=С Gin3 И Ile' НН. . .0=С Ala2 fiuisD координат атомов ось.иной цепи остатков Aia2-Giy4 0,25 к). Йонформации бокових цепей однозначно определились для 72% аминокислотных остатков «-спирали.

Основное содержание диссертации опубликовано в работах:

- 1. Arsenlev A.S., Sobol A.«., Bystrov V.F. Tj Relaxation Measurement by Two-Dimensional NMR Spectroscopy. - J. Maqn. Reson., 1986, V.70, N 3, p.427-435.

2. Соболь А.Г., Арэеньев A.C. Принципы количественного анализа двумерных спектров ядерного эффекта Овер-Ааузера при построении пространственной структуры пептидов и белков. -Биоорган. ХИМИЯ, .1988, Т.14, N 8, с.997-1013.

3. Ломизе А.Л., Соболь Л.Г., Арсеньов A.C. Методика определения локальной конформации белков по данным спектроскопии 'н-ЯМР. -- Биоорган, химия, i99o, т.16, n 2, с.379-201.

4. By-itrov V.P., Araeniev A.S., Barsukcv X.L., Lomizñ A.L.,

Abdulaeva G.V., Sobol A.G., Maalennikov I.V., Golovanov A.P. 2D-MMR for 3D-structure of membrane spanning polypeptides> Gramicidin A and fragments of Bacteriorhodopsin. in: Protein Structure and Engineering, ed. Jardetzky О., НАТО ASI Series, Series At Life Scienes, 1989, v.183, Plenum Press, N. Y. and London, p.111-138.

5. Абдулаева- Г.В., Соболь А.Г., Арсеньев A.C., Цетлин В.И., Шстров В.Ф. 19г-ЯМР-Исследованиа [з-фторфенилаланин]бактв-

РИОРОДОПСИНЭ. - БИОЛ. МеМбраНЫ, 1991, Т.8, N 1, С.30-43.

6. Первушин К.В., Соболь Л.Г., Мусина JI.D., Абдулаева Г.В., Арсеньев A.C. Пространственная структура (1-зв)бактериородоп-сина, солюбилизированного в смеси метанол-хлороформ и мицеллах додецилсульфата натрия. - Мол. биология, 199*, т.26,

N б, С.1397-1415.

7. Sobol A.G., -Arseniev A.b., Abdulaeva G.V., Husina L.Yu., Bystrov V.F. Sequence-specific resonance assignment and secondary structure of (l-71)bacterioopsir.. - J. Bio NMR, 1992, v.2• N. 2. p.161-171.

8. Sobol A.G., Arseniev A.S., Bystrov V.F. Spin-lattice relaxation measurement by two-dimensional NMR spectroscopy. IXth Ampere Summer School, Novosibirsk, 1987, Abstracts, p.135.

9. Соболь А.Г., Арсеньев а,С. Т'юличественная информация в noesy спектрах ЯМР о пространственной структуре и внутримолекулярной подвижности, полипептидов, vn Всесоюзный симпозиум по гимии белков и пептидов, Таллин, 1987, Сборник

ТСЗИСОВ, С.224.

10.Arseniev A.S., Maslennikov I.V., Orekhov V.Yu., Pervushin K.V., Sobol A.G. Bacteriorhodopsin spatial structure, an NMR approach. XV International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems, Jerusalem, 1992, Abstracts, p.23.

11.Arseniev A.S., Maslennikov I.V., Orekhov V.Yu., Pervushin K.V., Sobol A.G., Kozhich А.Т., Abdulaeva G.V. High resolution NMR analysis of Bacteriorhodopsin structure. V-th International Conferene on Retinal Proteins, Dourdt i, 1992, Abstracts, p.12.

МФТИ /6. (U395 yw.ti,' rup.€o