Структурно-функциональное состояние мембранных белков и мембраноактивных пептидов по данным ЯМР-спектроскопии

Шенкарев, Захар Олегович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональное состояние мембранных белков и мембраноактивных пептидов по данным ЯМР-спектроскопии
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональное состояние мембранных белков и мембраноактивных пептидов по данным ЯМР-спектроскопии"

, \ ■__J

На правах рукописи

"М553614

ШЕНКАРЕВ Захар Олегович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ И МЕМБРАНОАКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ ПО ДАННЫМ ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ

03.01.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

2 3 ОК-Т 2014

Москва 2014

005553614

Работа выполнена в лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный консультант: Доктор химических наук, профессор

Арсеньев Александр Сергеевич,

заведующий Отделом структурной биологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им.

академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Официальные оппоненты: Доктор физико-математических наук, профессор

Кутышенко Виктор Павлович,

заведующий Лабораторией ЯМР-исследований биосистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и

экспериментальной биофизики РАН

Доктор биологических наук, Веселовский Александр Владимирович,

заведующий Лабораторией структурной биоинформатики Федерального государственного бюджетного учреждения Научно-исследовательского института биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича

Доктор химических наук, Каплун Александр Петрович,

профессор кафедры органической химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Российский университет дружбы народов»

Защита состоится «13» ноября 2014 г. в 14 часов 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Россия, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, Биологический факультет МГУ, Кафедра биофизики, аудитория «новая».

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова и на сайте http://wvyw.bio. т5и.ги/сИ55е11айоп8/у!еуу.рЬр?1Р=б40

Автореферат разослан « 13 » октября 2014г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Страховская М.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Клеточная мембрана является одним из основных компонентов живой клетки. Мембраны, отделяя внутреннее содержимое от внешней среды, обеспечивают целостность клетки и ее органелл, а также участвуют во множестве жизненно важных процессов, включая фотосинтез, дыхание, транспорт питательных веществ, передачу сигналов, проведение ферментативных реакций, генерацию и поддержание трансмембранного (ТМ1) электрического потенциала и т.д. За большинство из этих функций ответственны специальные молекулы - интегральные и периферические мембранные белки (МБ) и мембраноактивные пептиды (МП). Гены интегральных МБ составляют до трети всех белковых последовательностей, закодированных в геномах прокариот и эукариот, и именно МБ (такие как рецепторы, транспортеры, ионные каналы и т.д.) являются мишенями для действия свыше половины известных в настоящее время лекарственных препаратов. Несмотря на высокую научную и практическую значимость, структура и механизмы функционирования МБ и МП в настоящее время остаются малоизученными. Так, например, из более чем 90,000 известных к 2014 году белковых структур менее 2% относятся к интегральным МБ.

Как и в случае водорастворимых глобулярных белков основную роль в стабилизации пространственной структуры и функционировании мембранных биомолекул играют нековалентные взаимодействия: электростатические, ван-дер-ваальсовые и имеющие энтропийную природу гидрофобные взаимодействия. Однако, для стабилизации «нативной/активной» структуры МБ и МП требуется присутствие биологической мембраны или подходящей мембраномоделирующей среды (миметика мембраны). В мембранах пространственная структура и функция МБ и МП во многом определяются межмолекулярными взаимодействиями с компонентами липидного бислоя (фосфолипидами, стеринами и т.д.). Для описания механизмов работы МБ и МП на молекулярном уровне необходимо также учитывать внутримолекулярную динамику (конформационную подвижность), которая может играть большую роль во взаимодействии лигандов с рецепторными МБ, в работе ионных каналов и в антибиотическом действии МП. При этом динамика и конформация молекул МБ и МП могут значительно зависеть от свойств мембранного окружения.

Исследование структуры и динамики МБ и МП, а также установление связи между структурой, динамикой и функцией этих молекул является актуальной задачей современной биофизики. Структурные исследования МБ и МП важны для решения ряда прикладных задач биотехнологии, фармакологии и медицины, в том числе для разработки новых лекарственных препаратов. Одним из наиболее мощных методов структурного анализа является ЯМР-спектроскопия высокого разрешения, которая позволяет изучать пространственную структуру и внутримолекулярную динамику МБ в мембраноподобном окружении. В настоящее время ЯМР-спектроскопия является практически единственным методом, который позволяет определять пространственную структуру небольших гидрофобных или амфифильных пептидных молекул, неподдающихся кристаллизации.

Основные трудности в изучении МБ и МП методами ЯМР-спектроскопии связаны с подбором оптимальной мембраномоделирующей среды, способной сохранять «нативную» пространственную структуру и агрегационное состояние мембранной

1 Полный список использованных сокращений и обозначений приведен в конце автореферата.

- 1 -

биомолекулы, а также обеспечивать достаточное качество ЯМР-спектров, необходимое для структурных исследований. Существующие среды, основанные на органических растворителях или мицеллах детергентов, во многих случаях не отвечают этим требованиям. Среды, содержащие бислойные мембраны, например, липидные везикулы, обладают слишком большими размерами и не могут напрямую использоваться в ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. Расширение арсенала

мембраномоделирующих сред, а также решение проблемы рационального выбора оптимального миметика мембраны необходимо для проведения корректных структурно-функциональных исследований МБ и МП методами ЯМР-спектроскопии.

Целью работы являлось изучение принципов структурной организации и механизмов функционирования мембраноактивных пептидов и интегральных спиральных мембранных белков. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать подходы применения для ЯМР-исследований МБ и МП новой мембраномоделирующей среды, - липид-белковых нанодисков (ЛБН), которые представляют собой стабилизированные в растворе фрагменты липидного бислоя.

2. Исследовать структуру и динамику ряда модельных МБ и МП в различных мембраномоделирующих средах. Изучить роль ковалентных взаимодействий (внутримолекулярная циклизация) и различных нековалентных взаимодействий (электростатические, гидрофобные), включая взаимодействия с липидной мембраной, в формировании «нативной/активной» пространственной структуры МБ и МП.

3. Изучить механизмы формирования пространственной структуры интегральных МБ в мембраномоделирующем окружении (процессы фолдинга in vitro).

4. Установить молекулярные механизмы мембранной активности ряда МП и роль динамики и специфических межмолекулярных взаимодействий (взаимодействий с участием конкретных функциональных групп) в их функционировании.

5. Изучить роль внутримолекулярной динамики в функционировании мембранных рецепторов. Изучить механизмы регуляции их работы мембраноактивными пептидными лигандами.

В качестве модельных объектов использовали МП трех групп: мембраноактивные гидрофобные антибиотики, водорастворимые мембраноактивные антимикробные пептиды и мембраноактивные нейротоксины.2 Исследованные молекулы отличались по основным структурно-функциональным параметрам: типу пространственной структуры (спиральные, ß-структурные и т.д.), содержанию дисульфидных связей или других внутримолекулярных циклов, заряду (от нейтрального до +6), а также степенью

2 Двухкомпонентный лантибиотик лихеницидин (Lcha/Lchß) из грамположительной бактерии Bacillus licheniformis: (поро)каналообразующие антибиотики пептаиболы антиамебин I (Ааш-1) и зервамицин IIB (Zrv-IIB), продуцируемые грибами рода Emericellopsis\ циклотиды Kalata В1 и В7 (КВ1 и КВ7) из растения Olclenlandia affinis\ антимикробные пептиды аурелин из мезоглеи сцифоидной медузы Aurelia aurita и ареницин-2 (Аг2) из целомоцитов морского многощетинкового червя Arenicola marina; токсин VSTx 1 из яда паука Grammostola spaíulata\ нейротоксин II (NTII) из яда кобры Naja oxiana\ бактериальный КЛканал KcsA (Streptomyces lmdans)\ бактериородопсин грамположительной психрофильной бактерии Exigiiobacterium sibiricum (ESR); потенциалочувствительный домен К+-канала KvAP (ПЧД-KvAP, архея Aeropyrum pernix)\ TM домен тирозинкиназы ЕгЬВЗ человека (ТМ-ЕгЬВЗ). Образцы МП любезно предоставлены сотрудниками учебно-научного центра ИБХ РАН, руководитель д.х.н. Овчинникова ТВ., кроме КВ1 и КВ7 (предоставлены проф. JI. Скжелдалом, Норвежский институт наук о живом, г. Аас).| Образцы токсинов NTII и VSTxl, а также все образцы интегральных МБ получены в отделе] биоинженерии ИБХ РАН, руководитель академик Кирпичников М.П.

-2-

гидрофобности (от практически нерастворимых гидрофобных антибиотиков до хорошо растворимых нейротоксинов). В качестве модельных интегральных мембранных белков использовали потенциалочувствительный домен К+-канала KvAP (ПЧД-KvAP, архея Aeropyrum perrtix), а также ряд спиральных МБ, имеющих различную топологию и олигомеризационное состояние в мембране и содержащих от 2-х до 8-и ТМ спиралей.2

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Для структурно-динамических ЯМР-исследований МБ и МП предложена новая мембраномоделирующая среда, - липид-белковые нанодиски. Разработан новый метод ренатурации (фолдинга) рекомбинантных интегральных МБ, основанный на инкапсуляции денатурированных мембранных белков в нанодиски.

2. Определен относительный вклад гидрофобных и электростатических взаимодействий с липидным бислоем, а также конформационной подвижности молекул МП в образование комплексов пептид-мембрана, и установлена их роль в молекулярных механизмах действия МП.

3. Предложены механизмы образования пептид-пептидных и пептид-липидных пор в мембране антибиотическими мембраноактивными пептидами с разным типом пространственной укладки (спиральные Aam-1/Zrv-IIB и p-структурный ареницин-2).

4. В молекуле потенциалочувствительного домена (ПЧД) К+-канала KvAP обнаружены «медленные» (мкс-мс) межспиральные движения, - предшественники конформационных перестроек, происходящих при потенциалозависимой активации. Показано, что стабильность «нативной» конформации ПЧД зависит от внутримолекулярных электростатических взаимодействий и двумерной упаковки липидного бислоя, окружающего домен.

5. Обнаружено состояние МБ, сходное с состоянием «расплавленной глобулы» водорастворимых белков и являющееся одним из возможных интермедиатов процесса фолдинга МБ in vitro. Показано, что в отличие от водорастворимых белков фолдинг МБ может сопровождаться одновременным увеличением энтальпии и энтропии системы.

6. Предложен молекулярный механизм действия нейротоксина VSTxl, согласно которому токсин связывается с интерфейсным регионом липидного бислоя и образует комплекс с участками ПЧД, погруженными в мембрану. Молекула токсина блокирует движения ПЧД, необходимые для потенциалозависимой активации К+-канала.

Научная новизна:

Показано, что в отличие от сред на основе детергентов ЛБН хорошо моделируют гидрофобную и электростатическую компоненту взаимодействия МБ(МП)/мембрана. Предложен оригинальный метод «скрининга» мембраномоделирующих сред для ЯМР-исследований, основанный на использовании ЛБН в качестве среды сравнения. Разработан новый метод фолдинга политопных (состоящих из нескольких ТМ спиралей) и субъединичных интегральных МБ в средах на основе ЛБН, и выявлена зависимость эффективности процесса фолдинга от липидного состава нанодисков.

В работе впервые описано влияние конформационной подвижности на активность порообразующих пептидов различных структурных семейств и показано, что повышенная подвижность может ослаблять как начальное присоединение пептидов к мембране, так и последующие процессы порообразования. Установлено, что конформация и динамика Р-структурных МП, стабилизированных дисульфидными связями, может значительно

меняться при взаимодействии с липидной мембраной.

Результаты исследования антибиотических МП, принадлежащих различным семействам, выявили структурные детерминанты, ответственные за биологическую активность пептидов, что позволило предложить новые молекулярные модели их действия на мембраны.

Исследование ПЧД-KvAP и его взаимодействия с токсином VSTxl позволило впервые наблюдать функционально важные мкс-мс межспиральные движения в рецепторном МБ, а также предложить новую модель действия «вольт-сенсорных» токсинов, которая меняет существующую концепцию, предполагающую прямое взаимодействие токсина с «датчиком потенциала» спиралью S4 ПЧД.

Исследование ПЧД в различных средах позволило обнаружить новое «расплавленное» состояние МБ, которое характеризуется компактной упаковкой, небольшими изменениями вторичной структуры, частичным разрушением третичной структуры и увеличением подвижности основной цепи МБ в пс-нс временном диапазоне.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе данные дают новую информацию о принципах структурной организации молекул МБ и МП и о структурных аспектах их взаимодействия с мембраной. Раскрыта роль внутримолекулярной циклизации, гидрофобных и электростатических взаимодействий с липидами, конформационной подвижности, специфических взаимодействий с липидными мишенями и двухвалентными катионами в следующих процессах: формирование комплекса пептид-мембрана, олигомеризация МП и образование пор в мембране. Показано, что для описания конформации МП в липидном бислое и механизмов их действия требуется учитывать совокупность структурно-динамических факторов. Показано, что в стабилизации молекул МБ в отличие от водорастворимых глобулярных белков большую роль играют внутримолекулярные электростатические взаимодействия, а также упаковка окружающего липидного бислоя. В отличие от водорастворимых белков процессы фолдинга МБ in vitro могут быть эндотермическим и сопровождаться увеличением энтальпии и энтропии системы.

Результаты структурно-динамических исследований антибиотических МП могут использоваться при разработке новых антибиотиков, - задаче, которая приобрела особую важность в последнее время в связи с распространением патогенных микроорганизмов, резистентных к "классическим" антибактериальным препаратам. Данные о механизмах функционирования потенциалозависимых ионных каналов и их регуляции природными лигандами, а также данные о механизмах процесса фолдинга интегральных МБ in vitro, полученные в работе, будут полезны при рациональном дизайне новых лекарственных препаратов, действующих на мембранные рецепторы и ионные каналы. Разработанные в рамках диссертации новые подходы применения мембраномоделирующих сред на основе ЛБН открывают перспективы получения стабильных препаратов МБ для биотехнологии и биомедицины, а также для структурно-функциональных исследований мембранных биомолекул в нативном окружении.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены на 43 конференциях и симпозиумах, основными из которых являются: 33-й, 36-й и 38-й Конгрессы FEBS (Афины, Греция, 2008, Турин, Италия, 2011 и Санкт-Петербург, 2013); Международные конференции по магнитному резонансу "EUROMAR-2009", "EUROMAR-2010" и

-4-

"EUROMAR-2014" (Гётеборг, Швеция, 2009, Флоренция, Италия, 2010, Цюрих. Швейцария, 2014); 4-ая конференции Европейского нейрохимического общества (ESN, Лейпциг, Германия, 2009); 23-й Конгресс Международного нейрохимического общества (Афины, Греция, 2011); 2-й и 3-й Российско-греческий симпозиум «Biomaterials and nanobiomaterials: recent problems and safety issues» (Ираклион, Греция, 2011, 2012); 2-й и 4-й Международные симпозиумы «Nuclear magnetic resonance in condensed matter. NMR in life sciences» (Санкт-Петербург, 2005,2007); VIII международный семинар по магнитному резонансу «спектроскопия, томография, и экология». (Ростов-на-Дону, 2006); II международная конференция «Химия, структура и функция биомолекул» (Минск, Беларусь, 2006); Международная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009); IV, V и VI Российские Симпозиумы «Белки и пептиды». (Казань, 2009, Петрозаводск, 2011, Уфа, 2013); 42, 48, 50, 53, 54, 55 Научные конференции МФТИ (Долгопрудный, 1999, 2005, 2007, 2010, 2011, 2012); VIII и X чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006, 2011); XVI, XIX-XXVI зимние молодежные научные школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004, 2007-2014 годы).

Публикации и патенты По теме диссертации опубликовано 64 работы, в том числе 23 статьи в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах и 1 глава в книге. По результатам работы получено 3 патента на изобретение РФ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 351 странице, и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), обсуждения результатов (главы 2-5), заключения (глава 6), экспериментальной части (глава 7) и выводов. Работа иллюстрирована 108 рисунками и включает 17 таблиц. Библиографический указатель содержит 540 источников литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Обзор литературы

В главе приведено описание современного состояния по применению методов ЯМР-спектроскопии высокого разрешения для структурных исследований белков и пептидов, включая мембранные биомолекулы. Приведено описание взаимодействий, стабилизирующих пространственную структуру МБ и МП. Рассмотрены свойства мембраномоделирующих сред, включая ЛБН. В отдельных частях главы 1 приведены данные о структурных особенностях и предполагаемых механизмах действия антибиотических мембраноактивных пептидов и потенциалозависимых ионных каналов.

1.1 Взаимодействия, стабилизирующие пространственную структуру, и факторы, определяющие активность мембранных белков и мембраноактивных пептидов

Также как и в случае водорастворимых белков и пептидов в стабилизации пространственной структуры МБ и МП участвуют ковалентные (дисульфидные связи и другие внутримолекулярные циклы) и нековалентные (электростатические, ван-дер-ваальсовые и гидрофобные), включая внутримолекулярные и межмолекулярные, взаимодействия. Межмолекулярные взаимодействия можно условно разделить на неспецифические, например, взаимодействия МБ(МП)/мембрана, и специфические, в которых задействованы конкретные функциональные группы. Кроме того, наряду со

структурными факторами большую роль в функционировании мембранных биомолекул может играть внутримолекулярная динамика или конформационная подвижность.

По структурной организации мембраноактивные пептиды подразделяют на две большие группы. К первой группе относятся линейные молекулы, не содержащие внутримолекулярных ковалентных циклов, например, фузионные пептиды вирусов, пептиды, способные проникать в клетку (cell penetrating peptides) и несколько семейств антимикробных пептидов. Предполагается, что линейные пептиды обладают значительной конформационной подвижностью в водном растворе и приобретают «активную» структуру только при взаимодействии с мембраной. В подавляющем большинстве случаев «активная» структура линейных пептидов представлена спиральной конформацией. К другой группе относятся в основном Р-структурные молекулы, стабилизированные дисульфидными связями, такие как, дефенсины, цитотоксины, нейротоксины, а также мембраноактивные антибиотики, содержащие неканонические внутримолекулярные циклы. Считается, что пространственная структура подобных пептидов практически полностью определяется внутримолекулярными взаимодействиями и незначительно меняется при образовании комплекса с липидным бислоем.

Основной вклад в стабилизацию «активной» пространственной структуры линейных пептидов вносят различные неспецифические взаимодействия с биологической мембраной. Эти же факторы определяют топологию взаимодействия с бислоем и тип мембранной активности для циклических молекул. Так, важную роль гидрофобных взаимодействий иллюстрирует тот факт, что, несмотря на большое структурное разнообразие, большинство мембраноактивных пептидов образуют амфифильные структуры в присутствии мембраны. С другой стороны, селективность действия мембранолитических пептидов по отношению к клеткам различных организмов зависит от липидного состава мембран и определяется, в основном, электростатическими взаимодействиями. Например, катионные антимикробные МП направленно атакуют бактериальные клетки, внешняя мембрана которых содержит большую долю отрицательно заряженных липидов, в отличие от электрически нейтральных мембран клеток эукариот. Значительное влияние на активность антибиотических МП может также оказывать упаковка и физические свойства липидного бислоя, например, наличие в составе мембраны молекул стеринов или липидов, влияющих на спонтанную кривизну бислоя, таких как фосфатидилэтаноламин.

В настоящее время для описания мембранолитического действия МП в основном используют модели, учитывающие только неспецифические взаимодействия пептид/мембрана (см. Рис. 9 и 18). Однако, активность пептидов некоторых семейств, таких как антигрибковые дефенсины растений, лантибиотики и д.р. в значительной степени зависит от специфических взаимодействий с молекулами-мишенями, например, гликосфинголипидами, липополисахаридами и компонентами клеточной стенки. Кроме того, определенную роль в действии антибиотических МП может играть конформационная подвижность. В частности, изменение подвижности может приводить к появлению значительного энтропийного вклада (-TMS) в свободную энергию переходов МП между водным окружением и различными состояниями пептида в мембране.

За исключением небольшого семейства Р-структурных белков, большинство интегральных мембранных белков имеют в своем составе одну (битопные МБ) или несколько (политопные МБ) трансмембранных спиралей. Принципы структурной

организации спиральных МБ кардинально отличаются от таковых у водорастворимых белков. Во-первых, несмотря на наличие остатков СуБ, в ТМ доменах мембранных белков не формируются дисульфидные связи, и ковалентные взаимодействия не участвуют в стабилизации их пространственной структуры. (Тем не менее, дисульфидные связи могут отвечать за стабилизацию и олигомеризацию внеклеточных доменов МБ). Во-вторых, в отличие от водорастворимых белков, обычно содержащих гидрофобное ядро, стабилизированное гидрофобными и ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями, внутренние регионы интегральных МБ, как правило, имеют большую полярность, чем внешняя поверхность, обращенная к липидной мембране. Таким образом, особую роль в стабилизации «нативной» пространственной структуры МБ могут играть внутримолекулярные электростатические взаимодействия (водородные связи, солевые мостики), а также взаимодействия с анизотропным окружением, включающим как неполярный регион жирнокислотных цепей, так и полярные участки, содержащие головки фосфолипидов и молекулы воды. Значительное влияние на активность МБ также может оказывать взаимодействие со специфическими липидами и кофакторами.

Относительная слабость межспиральных взаимодействий обуславливает конформационную подвижность молекул интегральных МБ и сравнительно низкую стабильность их структуры в мембраномоделирующих средах. Повышенная внутримолекулярная динамика МБ часто имеет функциональное значение. Типы конформационных изменений, наблюдаемые в этих молекулах, имеют различную амплитуду: от простой подвижности боковых цепей и петлевых участков до полной перестройки третичной структуры молекулы в ответ на внешний сигнал, такой как изменение ТМ потенциала или связывание лиганда.

Таким образом, в настоящее время предполагается, что за стабилизацию пространственной структуры и функционирование МБ и МП в основном ответственны неспецифические взаимодействия с мембраной, при этом роль специфических взаимодействий и внутримолекулярной динамики остается мало изученной. 1.2 Свойства различных мембраномоделирующих сред

Как уже отмечалось, для стабилизации «нативной/активной» пространственной структуры молекул МБ и МП, а также для их исследования методами структурной биологии необходимо использование специальных миметиков мембраны. Структура и динамика мембранных молекул может подвергаться значительным изменениям при изменении свойств мембраномоделирующего окружения. Ниже кратко суммированы основные свойства мембраномоделирующих сред, важные с точки зрения их применения в ЯМР-спектроскопии высокого разрешения.

1.2.1. Изотропные среды, - растворители с низкой полярностью или их смеси, обладают низкой вязкостью, что обеспечивает «удобные» релаксационные характеристики солюбилизированных молекул (быстрая реориептация в растворе, низкие скорости поперечной релаксации Ко, узкие линии в спектрах ЯМР, большая чувствительность). Эти свойства позволяют использовать методы ЯМР-спектроскопии на натуральном содержании изотопа |3С, применение которых в анизотропных средах лимитировано чувствительностью экспериментов. Как следствие, органические растворители широко используются в ЯМР-исследованиях при установлении химической и пространственной структуры гидрофобных природных соединений, содержащих неканонические или модифицированные остатки. С другой стороны, эти среды не позволяют «адекватно»

моделировать мембрану, имеющую как полярные, так и гидрофобные регионы, и имеют ограниченное применение при изучении интегральных МБ.

1.2.2. Анизотропные мембранные миметики: мицеллы детергентов и небольшие сферические липид/детергентные бицеллы. Эти среды хорошо моделируют жирнокислотные цепи и полярные головки липидов и во многих случаях способны поддерживать «нативную» пространственную структуру и активность МБ. Как следствие, мицеллы и бицеллы, имеющие размеры до 6 нм, широко

используются для ЯМР-исследований. Однако, из-за wjjMMHHH

низкой чувствительности и спектрального разрешения A -k^WtHi' ^ *

подобные работы зачастую требуют применения изотопно-меченых (2H,I3C,I5N) препаратов МБ. Исследование немеченых препаратов, например, выделенных из природных источников, обуславливает применение дейтерированных (2Н-меченых) детергентов и липидов. Кроме того, значительная поверхностная кривизна, высокая динамическая подвижность и отсутствие латерального давления в детергент-содержащих системах может приводить к серьезным искажениям нативной структуры солюбилизированного белка, а также к диссоциации функционально-важных белковых комплексов или к агрегации молекул МБ.

1.2.3. Среды, содержащие липидный бислой, -везикулы (липосомы) или «большие» бицеллы. обладают "идеальными" мембраномоделирующими g свойствами. Однако низкая стабильность (слияние

липосом) и большой размер (от 30 нм) делает Ж^ •Oiia.HHjB^.

невозможным их применение в ЯМР-спектроскопии / Ш д^^ЩЖ/М

высокого разрешения. В то же время липидные везикулы ^

могут быть использованы в ЯМР-экспериментах для ^Spj^a

оценки энергетики взаимодействия пептид/мембрана и в ¿^jBng? ^В

некоторых случаях для анализа топологии подобных т/

взаимодействий. Липидные везикулы и бицеллы широко ^ >

применяются при исследовании МБ методами Ю нм

ЯМР-спектроскопии твердого тела. Eiic^i Классические миметики

гтт-ич мембраны (А) и липид-оелковыи

1.2.4. Липид-белковые нанодиски (ЛБН) или нанодиск (Б) Две молекулы MSp.

реконструированные незрелые липопротеиновые частицы экранирующие фрагмент мембраны высокой плотности представляют собой наноразмерные от растворителя, показаны в виде дискоидные частицы (обычно 10x4 нм, Рис. 1Б), тора

содержащие фрагмент бислойной липидной мембраны, гидрофобная часть которого экранирована от растворителя димером аполипопротеина или его синтетическим аналогом MSP (membrane scaffold protein). В отличие от традиционно используемых мембранных миметиков фрагмент липидной мембраны в составе ЛБН обладает повышенной стабильностью и сохраняет многие биофизические свойства, присущие настоящим бислойным системам, например, фазовый переход из жидко-кристаллического в гелевое состояние. Многочисленные исследования показали, что МБ, встроенные в нанодиски в

«нативном» состоянии, обладают стабильной пространственной структурой и сохраняют в полной мере свою функциональность (Bayburt&Sligar, 2010). Кроме того, молекулы МБ. встроенные в ЛБН, не могут самопроизвольно покидать мембрану нанодиска, что эффективно подавляет их нежелательную агрегацию и предотвращает распад функционально-важных белковых комплексов. Использование ЛБН, содержащих различные липиды и их смеси, позволяет изучать влияние липидного окружения на структуру и функцию мембранных биомолекул. Возможность применения ЛБН в качестве среды для ЯМР-исследований МБ и МП впервые рассмотрена в представленной работе.

2 Липид-белковые нанодиски — альтернативная среда для стабилизации

«нагивной» структуры и ЯМР-исследований МБ и МП

2.1 Возможность применения ЛБН для ЯМР-исследований интегральных ME3

Различные аполипопротеины и белки MSP позволяют формировать липид-белковые нанодиски диаметром от 6 до 20 нм. В работе в качестве белка MSP использовали рекомбинантный фрагмент 44—243 аполипопротеина А-1 человека, позволяющий формировать нанодиски диаметром ~ 10 нм и содержащие -150 молекул фосфолипида. Теоретические расчеты тензора вращательной диффузии для диска размером 10 х 4 нм дают значения времен корреляции вращательных движений Тд, тв и тс равные 56, 57 и 61 не (45°С), что соответствует изотропному вращению глобулярного белка радиусом RH ~ 4.7 нм и MW ~150-200 кДа. Вероятно, комплекс, образованный мембранным белком и нанодиском, должен демонстрировать схожие динамические и релаксационные свойства. Сравнение полученных оценок с результатами современных исследований глобулярных белков свидетельствует о теоретической возможности получения ЯМР-спектров МБ, встроенных в мембрану ЛБН, при условии использования изотопно-меченых белковых препаратов, методов, оптимизированных для подавления поперечной релаксации (TROSY, CRINEPT), и высокопольных (700-900 МГц) ЯМР-спектрометров.

Существующие методы реконструкции ЛБН in vitro основаны на добавлении к образцу аполипопротеина или MSP раствора липидов в детергенте и последующем постепенном удалении детергента с помощью диализа, гель-фильтрации или специального сорбента. В результате удаления детергента из реакционной смеси происходит самопроизвольное формирование ЛБН (Рис. 2А). При необходимости включения какого-либо МБ в состав ЛБ11 в реакционную смесь дополнительно добавляют целевой белок, солюбилизированный в мягком (неденатурирующем) детергенте.

В работе были проанализированы ЛБН, содержащие различные фосфолипиды и их смеси (DLPC, DLPG, DM PC, DOPC, DOPG. POPC, DLPC/DLPG 4:1). Полученные данные указали на необходимость использования соотношения MSP/липид ~ 1:75 для получения гомогенных препаратов ЛБН диаметром ~ 10 нм. Использование ненасыщенных или заряженных липидов приводило к увеличению диаметра нанодисков. Наибольший диаметр (11.6 нм) наблюдался для ЛБН/DOPG (анионный ненасыщенный липид). Все препараты ЛБН, за исключением ЛБН/DLPG. были стабильны не менее трех месяцев при комнатной температуре и не менее недели при температуре 45°С. Комплексы ЛБН/DLPG распадались с преципитацией липидов в течение нескольких дней, что, вероятно, было обусловлено сравнительно высокой растворимостью этого короткоцепочечного

' Все эксперименты по реконструкции ЛБН и комплексов МБ/ЛБН. а также последующий биохимический анализ полученных препаратов проведены совместно с к.б.н. Е.Н. Люкмановой (лаборатория биоинженерии белка ЙБХ РАН).

заряженного липнда. Теоретические предсказания об изотропной реориентации ЛБН в растворе и об отсутствии преимущественной ориентации нанодисков в магнитном поле

ЯМР-спектрометра были подтверждены методом

ж Аполипопрот

А (MSP;

Л'ЛЧ.

Р-ЯМР-спектроскопии.

Рис.

Мембранный белок/ детергент

2. (А) Схема

реконструкции комплекса МБ/ЛБН на примере К+-канала

KcsA. Две молекулы MSP, экранирующие фрагмент мембраны от растворителя, показаны в виде тора

(Б) Схема

«ко-трансляционной» инкапсуляции молекул МБ в нано диски в бесклеточной белоксиш езирующей системе.

Возможность применения ЯМР-спектроскопии для исследования МБ, интегрированных в мембрану ЛБН, была показана на примере К+-канала KcsA (Рис. 3). Для реконструкции комплексов KcsA/ЛБН использовали рекомбинантный '^-меченый гомотетрамер KcsA, выделенный из мембраны Е. coli в мягком неионном детергенте DDM. В 2D 'Н,'^-спектре комплекса KcsA/ЛБН/ОМРС, измеренном в Н20 (5% D20), наблюдалось 40-50 интенсивных сигналов с полушириной Av'Hn = 20-30 Гц, принадлежащих N- и С-концевым фрагментам канала, экспонированным в растворитель (Рис. ЗА). Инкубация препарата KcsA/JIEII/DMPC в 95%-ном D20 в течение 60 дней позволила ослабить интенсивность этих сигналов и наблюдать в 'H,I5N-спектрах широкие сигналы (Av'Hn

KcsA/ЛБН/ОМРС 5% D2O

50-80 Гц) от ТМ домена KcsA (Рис. ЗБ).

110

10,5 'Н.м. д. 8,5 8,0 7,5 7,0 9,5 9,0 8,5 8.0 7.5 7.0 15Чм.д.

Рис. 3. 2Э 'Н.'^-'геОВУ-Спектры комплексов КсбА/ЛБНЮМРС (0.1 мМ тетрамер КсвА, 45°С).

Альтернативным способом встраивания МБ в нанодиски является добавление предварительно сформированных «пустых» ЛБН в трансляционную среду бесклеточной

- 10-

белоксинтезирующей системы (ББС, системы сопряженной транскрипции-трансляции in vitro) (Рис. 2Б). В этом случае происходит ко-трансляционное встраивание синтезируемого МБ в ЛБН, и белок накапливается в растворимой фракции трансляционной среды. Для анализа возможности прямых ЯМР-исследований комплексов МБ/ЛБН, полученных в ББС, использовали ТМ домен тирозинкиназы ЕгЬВЗ человека (остатки 639-670, Рис. 4А). Анализ 3D HNCO и HNCA спектров |3С,'^-меченого варианта ТМ-ЕгЬВЗ в комплексе с ЛБН/DMPG показал наличие сигналов для всех 34 аминокислотных остатков домена (Рис. 4Б). Использование селективно |5М-меченых вариантов ТМ-ЕгЬВЗ позволило получить отнесение сигналов основной цепи для 27 остатков белка (Рис. 4ВГ).

110

115

120

125

ТМ-ЕгЬВЗ/ЛБН/DMPG TROSY •

♦ G32

< SW30 _

Д 1 10 20 30 40

" MGRTHLTMALTVIAGLWIFMMLGGTFLYWRGRRHHHHHH 639 650 660 670

(номера остатков в полноразмерном рецепторе) М1 G2 R3 Т4

HN.CA

L10

М21

о. ^ Q> L6 cí

Y29 _

О <¡¿, ш» Z Ц)

L23 L16 L6

M,Y © 4»

116

124

128

9 8 7 8.51 8.64 8.30 8.14 1Н, М.Д. 9.0 8.5 8.0

Рис. 4. (А) Последовательность ТМ-ЕгЬВЗ. цветом выделены отнесенные остатки. (Б) 2D TROSY спектр 'С-ТМ-ЕгЬВЗ в комплексе с ЛБН/DMPG. (В) Последовательное отнесение /V-концевых остатков по 3D HNCA спектру. (Г) TROSY спектры селективно '^-меченых вариантов ТМ-ЕгЬВЗ в ЛБН/DMPG.

Полученные результаты впервые показали возможность исследования МБ, инкапсулированных в мембрану ЛБН. включая белки, синтезированные в бесклеточных системах в присутствии нанодисков, методами ЯМР-спектроскопии высокого разрешения.

2.2 Фолдинг интегральных МБ in vitro в средах на основе нанодисков

Одной из основных проблем, затрудняющих структурно-функциональные исследования и прикладное применение МБ. является продукция достаточных количеств белковых препаратов, обладающих нативной пространственной структурой и активностью, а также имеющих достаточную временную и температурную стабильность. Большие количества рекомбинантных препаратов МБ могут быть получены в функционально-неактивной форме, характеризующейся неправильной упаковкой полипептидной цепи, например, в составе нерастворимых телец включения бактериальных клеток, или в виде осадка ББС. В этом случае для получения активных белковых препаратов необходима процедура ренатурации (фолдинга) in vitro с использованием мембраномоделирующих сред. К настоящему времени не существует универсальных приемов ренатурации спиральных МБ. Особую сложность представляет собой фолдинг политопных (состоящих из нескольких ТМ спиралей) и мультимерных мембранных белков, к которым относится большинство рецепторов и ионных каналов.

В работе предложен новый метод фолдинга спиральных интегральных МБ in vitro, основанный на использовании аполипопротеинов (MSP) и ЛБН. Изначально рекомбинантный белок, полученный в виде телец включения или осадка ББС, солюбилизируют в жестком (денатурирующем) детергенте (возможно, с добавлением хаотропных агентов). Этот этап приводит к получению мономерного денатурированного МБ. На втором этапе из раствора, содержащего денатурированный МБ, детергент(ы), липиды и MSP, удаляют детергент(ы), что приводит к сборке нанодисков, содержащих ренатурированный (функционально-активный) МБ.

Анализ применимости предложенного

Trp/Tyr свободный ESR, MSP ретиналь

ретиналь в активном ESR

ESR/DDM iE- coli + ретиналь -

0.01.0

О 0.5Н

0.0 1.0

ESR/DDM - SDS - 1 мин

ретиналь в частично ....... 60 мин

денатурированном ESR

ESR/MSP/DMPG/SDS/ретиналь (ББС)

ESRinBH/DMPG (ББС - Ренатурация в ЛБН ESR/nBH/DMPC (ББС - Ренатурация в ЛБН)

ESR/nBH/DMPG (£. coli • DDM ЛБН)

подхода для ренатурации политопных белков проводили на примере бактериородопсина ESR, содержащего 7 ТМ спиралей. Препарат ESR, получали либо в виде осадка ББС, либо выделяли из мембран Е. coli и затем осаждали в трихлоруксусной кислоте (ТХУ). В обоих случаях осадок, содержащий ESR, растворяли в жестком детергенте SDS, что приводило к денатурации МБ (Рис. 5). Сборку нанодисков, содержащих цвиттер-ионные (DMPC) или анионные (DMPG) липиды, проводили в присутствии кофактора аП-Гга/и-ретиналя. Согласно данным спектрофотомерии (поглощение при 534 нм), общая эффективность ренатурации ESR не зависела от способа продукции целевого белка и составила -30% в случае DMPC и -60% в случае DMPG. При этом доля активного родопсина по отношению к встроенному белку была примерно одинакова (-80%), а разница в выходах, в основном обуславливалась эффективностью

встраивания МБ в нанодиски (~ 40% -DMPC, -75% -DMPG).

Для опытов по ренатурации субъединичных белков использовали гомотетрамер К+-канала KcsA (tKcsA, 4*2ТМ). tKcsA, выделенный в мягких условиях (1% DDM) из мембран Е. coli, денатурировали до мономера (mKcsA) путем осаждения с помощью ТХУ и последующего растворения в жестком детергенте SDS. В процессе фолдинга из образца mKcsA/SDS формировались нанодиски, содержащие тетрамер tKcsA. Как и в случае с ESR эффективность ренатурации (образование тетрамера) значительно зависела от липидного состава ЛБН и в основном определялась эффективностью встраивания МБ в нанодиски (Табл. I). Наиболее эффективно процесс

-I-•-----'-)-•---*-•-г-

300 400 500 600

Длина волны, нм Рис. 5. UV-Vis спектры препаратов ESR в присутствии а//-/гаи5-ретиналя. (А) «Нативный» ESR. выделенный из мембран Е. coli. (Б) Денатурация ESR при добавлении в 0.2% DDM 10% SDS. (В) Смесь ESR/MSP/DMPC/SDS/ретиналь перед сборкой нанодисков. (Г) Нанодиски DMPC и DMPG, содержащие ренатурированный ESR. (Д) Нанодиски DMPG, собранные из «нативного» ESR в DDM. На каждой панели в скобках указан источник получения рекомбинантного белка (Е. coli или ББС).

ренатурации ЖсБА проходил при использовании цвиттер-ионного ненасыщенного липида РОРС, а использование насыщенного липида ОМРС для ренатурации оказалось крайне неэффективным. Этот результат на первый взгляд противоречит данным (п. 2.1) о том, что гомотетрамер 1КсяА, солюбилизированный в ООМ, может быть встроен в ЛБН/ОМРС с выходом ~ 70%. Вероятная причина наблюдаемого эффекта - наличие жесткого детергента 81)8 в среде для сборки ЛБН. Исследование процесса формирования «пустых» нанодисков из смеси детергентов, содержащей 808, показало, что в случае насыщенного липида ОМРС (по сравнению с РОРС) происходит неполное удаление жесткого детергента. Вероятно, замедленное удаление 808 при сборке ЛБН/ОМРС приводит к преципитации Кс5А.

Полученные результаты впервые показали возможность применения ЛБН для фолдинга политопных и субъединичных спиральных МБ in vitro.

Липидный состав ЛБН DOPE/DOPG(7:3) РОРС РО PC/DO PG(7:3) DMPC DMPG

Заряд полярных головок ±/- ± ±/- ± -

Насыщенность цепей Ненасыщ. Ненасыщ. Ненасыщ. Насыщ. Насыщ.

Формирование 10 нм ЛБН - + + - +

Выход инкапсуляции КсзА в ЛБН, % 31 90 49 7 55

Содержание ИСсзА, % 100 100 100 100 64

Табл. 1. Эффективность ренатурации тетрамера КсбА от липидного состава ЛБН. Значения рассчитаны относительно начального количества ИСсзА. Ошибка измерения не превышает 15%.

2.3 Возможность использования ЛБН для структурных и биофизических исследований водорастворимых мембраноактивных пептидов

Вопрос о применимости мембраномоделирующих сред на основе ЛБН для структурных и биофизических исследований водорастворимых мембраноактивных пептидов, таких как катионные антимикробные пептиды и пептиды, действующие на мембранные рецепторы со стороны гидрофобного региона бислоя, ранее не изучался. Этот вопрос не является тривиальным, так как ЛБН, в отличие от везикул, бицелл и мицелл, содержат дополнительную компоненту, - MSP, которая является анионным белком (заряд -6). В качестве модельного антимикробного пептида в работе использовали ареницин-2 (Аг2, заряд +6, Рис. 9). При добавлении даже малых количеств Аг2 к ЛБН, содержащим заряженные и незаряженные липиды (РОРС, DOPG, DLPC/DLPG 4:1), наблюдалось разрушение нанодисков, сопровождаемое образованием более крупных липопротеиновых частиц (диаметр ~ 15 нм) и агрегатов белка MSP (~ 6 им). Сходный процесс известен как «ремоделирование липопротеинов высокой плотности» (lipoprotein remodeling) и может происходить как in vitro, так и in vivo при взаимодействии липопротеинов с липофильными белками плазмы крови и в денатурирующих условиях (Jayaraman et al, 2005). Учитывая тот факт, что Аг2 не взаимодействует с липосомами РОРС (см. п. 3.3), мы можем предположить, что, наблюдаемое «слияние» нанодисков не связано напрямую с порообразующей активностью пептида, а вызвано его присоединением к периферическому участку липидной мембраны и/или к белку MSP, что приводит к образованию дефектов в структуре ЛБН.

Вторым модельным объектом исследования являлся нейротоксин II (NTII, заряд +4, 4 дисульфидные связи, Рис. 6), — ингибитор никотинового ацстилхолинового рецептора. Как предполагается, NTII связывается с мембраной, окружающей рецептор, в том числе и благодаря специфическому взаимодействию с полярной головкой фосфатидилсерина (PS), и только потом происходит образование лиганд-рецепторного комплекса (Lesovoy et al, 2009). Добавление к образцу токсина NTII препаратов ЛБН не приводило к их

- 13-

разрушению. NTII связывался с ЛБН, содержащими анионные липиды POPC/DOPG и POPC/DOPS (Рис. 6А). Отсутствие взаимодействия NTII с ЛБН на основе цвиттер-ионного липида РОРС косвенно указало на важность электростатических взаимодействий для образования комплекса пептид/мембрана. Анализ 2D 'H,i5N-TROSY спектров NTII в комплексе с ЛБН/POPC/DOPS не выявил изменений в конформации NTII при связывании с нанодиском. Полученные '^-релаксационные данные указали на значительную анизотропию взаимодействий в комплексе NTII/ЛБН (разброс значений тк от 2 до 31 не со средним 12.5 не, 40°С, соответствует R„ ~ 2.7 нм, MW ~ 34 кДа), что может объясняться наличием дополнительных степеней свободы у молекулы связанного токсина.

Для определения ориентации молекулы NTII на поверхности ЛБН анализировали: (1) перенос намагниченности (эффект ЯЭО) между протонами холиновой группы РОРС и HN-группами NTII и (2) парамагнитную релаксацию, вызванную спиновым зондом 5-DSA. Полученные данные показали, что токсин взаимодействует с поверхностью мембраны нанодиска в нескольких (минимум двух) ориентациях (Рис. 6Б), и обменные процессы между комплексами с различной топологией идут быстро по шкале хим. сдвигов ЯМР. При этом одна из возможных топологий согласуется со специфическим взаимодействием NTII с полярной головкой фосфатидилсерина в предполагаемом сайте связывания (Lesovoy et al, 2009). Следует отметить, что только эта ориентация NTII на мембране совместима с последующим взаимодействием нейротоксина с никотиновым ацетилхолиновым рецептором, для которого необходимо проникновение центральной петли токсина в лиганд-связывающий участок рецептора. На основании полученных данных можно сделать следующие выводы: (1) основную роль в стабилизации пространственной структуры NTII играют внутримолекулярные взаимодействия; (2) за образование комплекса пептид/мембрана в основном ответственны электростатические взаимодействия; (3) в комплексе NTII с мембраной POPC/DOPS неспецифические и

специфические межмолекулярные взаимодействия имеют сравнимую энергию.

I--I-- I I I 1

ф ____ -»---►________I_ ►

LE HNQQSSQPPTTKT SGETN YKKWWSDHRGTIIERG G PKVKPGVNLN

fc. ¥ - i ЛБН/POPC/DOPG (3:1) -о-ЛБН/POPC/DOPS (4:1) -о-ЛБН/РОРС -о-Разведение - - -

А —

RTDR NN 60

Преднасыщение N'(CH3)3 группы РОРС (Ослабление > 40%) PRE 5-DSA e=.J

(Ослабление > 35%) ¡¡ЫВ»

° 5 [ЛБН],мкМ 15 ? Мембрана нанодиска

Рис. 6. (А) Изотермы связывания NTII с ЛБН аппроксимированы уравнением равновесного распределения. Коэффициенты равновесного распределения (Кр), описывающие взаимодействие, в случае ЛБН/POPC/DOPG (3:1) и ЛБП/POPC/DOPS (4:1) равны ~ 2.13±0.07 и 1 07±0.07х 103 М соответственно. (Б) Возможная топология взаимодействия молекулы NTII с поверхностью мембраны ЛБН/POPC/DOPS. Структура NTII окрашена в соответствии с полученными экспериментальными данными. Остатки, формирующие предполагаемый сайт связывания с полярной головкой фосфатидилсерина, выделены голубыми кружками.

Полученные результаты впервые показали, что ЛБН могут применяться для исследования энергетики и топологии взаимодействия мембраноактивных пептидов с липидной мембраной. В ходе подобных исследований необходимо учитывать возможность взаимодействия пептидов с белковой компонентой нанодиска MSP.

Исследование антибиотических пептидов, содержащих внутримолекулярные циклы

3.1 Химическая и пространственная структура нового двухкомпонентного лантибиотика лихеницидина (Lcha/Lchp)

Индивидуальные гидрофобные (нерастворимые в воде) пептиды Lcha и Lch(3 ингибируют рост широкого числа грамположительных бактерий в мкМ концентрациях, при этом эквимолярная смесь Lcha/Lchp активнее каждого из пептидов в 20-50 раз. Определение химической структуры пептидов стандартными методами секвенирования было невозможно, что указывало на наличие неканонических аминокислотных остатков. В работе методами 'Н,13С ЯМР-спектроскопии на натуральном содержании изотопа 13С в изотропном мембраномоделирующем окружении (метанол, CD3OH) были определены химические и пространственные структуры Lcha и Lchp. Пептиды имеют в своем составе по 4 внутримолекулярных тиоэфирных цикла (остатки Lan и MeLan), а также включают ряд других модифицированных остатков (Рис. 7АБ). Пространственная структура Lcha (Рис. 7В) включает два структурированных домена: /V-концевой (1-10) и С-концевой (22-32), соединенные гибкими шарнирными регионами с центральным подвижным доменом. В метаноле домены не имеют фиксированной взаимной ориентации. Напротив, пептид Lchp (Рис. 7В) содержит подвижный /V-концевой домен (1-7), за которым следует структурированные а-спиральный (8-24) и С-концевой (25-32) домены.

А "

2-Oxobutyryl (OBu) О

Б Лихеницидин

R,=H

2,3-D¡dehydroalan¡ne (Dha)

R,=CH3 (Z)-2,3-D¡dchydrobutyrinc (Dhb)

R2=H (2S,6R)-Lanthionine (Ala-S-Ala)

R2=CH3

{2S,3S,6R)-3-Mcthyllanthioninc^—С (Abu-S-Ala)

(s, d)¿.»'H H'.,.¿(r, l)

/ 4 ✓ \ ?

NH HN С—<

I I I' ?

O ww ч/ч/w O

Лихеницидин

Lchf3

Мерсацидин (Mrs)

Lcha

Alas11 Alas21 P'o2S

Шарнирные регионы _

Рис. 7. (А) Химические структуры модифицированных аминокислотных остатков лантибиотиков Lcha и Lchp. (Б) Сравнение структур лантибиотиков Lcha, Lchp. мерсацидина и низина. Домены, связывающие липид II, обведены. (В) Пространственные структуры Lcha и Lchp в метаноле.

В /V-концевых доменах пептидов Lcha и Lchp выявлены процессы медленного (по шкале химических сдвигов ЯМР) конформационного обмена (характерные времена > 100 мс), вероятно, связанные с си-^чтау-изомерией частично двойных связей СО-СО и CO-NH iV-концевых остатков OBu , а также пептидной связи Lysl2-Prol3 (Lcha). Исследование пептида Lcha в бинарных растворах (от CD30H/H20 1:3 до CD30H/CDC13 2:3) указало на

сохранение процессов информационного обмена при изменении полярности окружения.

N- и С-концевые домены Lcha (Рис. 7Б) проявляют черты структурного сходства с мотивами низин-подобных и мерсацидин-подобных лантибиотиков. связывающих липид II (важнейший компонент биосинтеза клеточный стенки грамположительных бактерий). Полученные данные позволяют предложить возможный механизм действия лихеницидина. Вероятно, Lcha образует комплексы с липидом II с участием одного или двух рецепторных доменов, при этом шарнирные регионы делают возможным изменение их взаимной ориентации. Последующее вовлечение Lchp во взаимодействие с этим комплексом в соотношении 1:1 приводит к образованию пор в мембране. Следует отметить, что спиральный домен Lchp имеет длину (-23Á), достаточную для проникновения через гидрофобный регион липидного бислоя. Наличие специфической мишени в мембране (липид II) объясняет высокую активность комплекса Lcha/LchfS.

Высокая конформационная подвижность молекул Lcha/Lch(3 указывает на то, что внутримолекулярные ковалентные взаимодействия (тиоэфирные связи) являются не единственным фактором, ответственным за формирование «нативной» пространственной структуры этих антибиотиков в липидном бислое. Тем не менее, участие внутримолекулярных циклов в стабилизации рецепторных доменов Lcha и спирального домена Lchp говорит о важности ковалентных взаимодействий для биологический активности пептидов.

3.2 Пространственная структура, механизм взаимодействия с мицеллами DPC и двухвалентными катионами Мп2+ циклотидов Ka/ata В1 и Ka/ata В7

Циклические пептиды (циклотиды) Kalata В1 и В7 (KBI и КВ7, Рис. 8А), имеющие в своей структуре по 3 дисульфидные связи, демонстрируют широкий спектр антибиотической активности. Общая гидрофобность молекул циклотидов указывает на биологическую мембрану как на возможную мишень их действия. Циклотиды КВ1 и КВ7 исследовали в мембраномоделирующем окружении мицелл цвиттер-ионного и анионного детергентов (DPC и SDS, соответственно). Согласно данным ЯМР, КВ1 и КВ7 имеют схожую пространственную структуру (Рис. 8БВ), которая практически не меняется при взаимодействии с мицеллами. Было установлено, что пептиды взаимодействуют с поверхностью мицелл DPC гидрофобными участками, при этом интерфейс взаимодействия в случае КВ7 имеет меньшую площадь (Рис. 8БВ). Это согласуется с параметрами образования комплексов пептид/мицелла, рассчитанными по данным ЯМР (свободная энергия AG0 = -5.4±0.1 и -4.7±0.1 ккал-М"' и число молекул DPC, формирующих сайт связывания п = 4.9±0.1 и 3.1±0.1, для КВ1 и КВ7, соответственно).

Данные о парамагнитной релаксации в присутствии ионов Мп2+ выявили в молекулах циклотидов специфический сайт связывания двухвалентных катионов (Рис. 8БВ). На поверхности КВ1 частично гидратированный катион скоординирован заряженной боковой группой Glu3, боковой группой Asnl 1 и СО-группами Thr4 и Thr9. Расстояние от иона Мп2" до атомов кислорода этих групп составляет 4-8 Á. В случае КВ7 ион Mn2f скоординирован теми же группами, однако боковая цепь Asnl 1 заменена на ароматическое кольцо Tyrl 1, которое также может служить донором электронной плотности. Кроме того, в случае КВ7 катион контактирует с полярными головками детергента. Проведенный в рамках работы анализ известных структур циклотидов указал на то, что все пептиды этого семейства содержат сайт координации двухвалентных катионов, локализованный вблизи консервативного остатка Glu3, однако пептиды имеют

различное распределение гидрофобных участков на поверхности и, вероятно, по-разному взаимодействуют с биологической мембраной. Полученные результаты позволяют предположить, что взаимодействие с мембраной, возможно, включающее образование пор, играет ключевую роль в антибиотической активности циклотидов. Различия в активности пептидов могут быть объяснены различным способом начального взаимодействия с мембраной, а связывание двухвалентных катионов (например, Са2+), увеличивающее общий заряд пептидов на +2, может способствовать дестабилизации мембран, содержащих анионные липидьт.

Рис 8. Аминокислотная последовательность циклотидов К.В1 и КВ7 и пространственная структура тройных комплексов циклотид/мицелла ЭРС/МгГ\ Показан ион Мп2+ и возможная поверхность мицеллы.

Результаты исследования получили дальнейшее развитие в ряде более поздних работ. Так Д. Крейк и соавторы (2009-2013 г.г.) описали поры, сформированные ! циклотидами в модельных мембранных системах, и показали, что участок поверхности пептидов, окружающий боковую цепь С1иЗ, является основным детерминантом биологической активности. Кроме того, было высказано предположение о том, что сайт связывания катионов вблизи 01иЗ ответственен за взаимодействие с —МН3+ группой полярной головкой липида фосфатидилэтаноламина (Неппциеэ е1 а1, 2012). В настоящее время окончательный ответ о механизме мембранной активности циклотидов и о роли, которую в ней играет консервативный сайт, включающий С1иЗ. пока не получен.

Таким образом, показано, что основную роль в стабилизации пространственной структуры циклотидов играют внутримолекулярные взаимодействия, а за образование комплекса пептид/мембрана в основном ответственны неспецифические гидрофобные взаимодействия. Кроме того, важную роль в биологической активности циклотидов играет связывание двухвалентных катионов или положительно заряженных групп молекул липидов за счет специфических электростатических взаимодействий.

3.3 Пространственная структура, динамика, о л игом ер из а и ия в мембраномоделирутщем окружении и возможный механизм действия Ареницина-2

Новый катионный антимикробный пептид ареницин-2 (Аг2) проявляет широкий спектр антибиотической активности. Согласно данным, полученным в работе, Аг2 в воде находится в состоянии мономера и имеет конформацию р-шпильки, которая стабилизирована дисульфидной связью СуэЗ-Су520 (Рис. 9А). Сильная правая закрутка (~203° на 8 остатков) и изгиб р-листа молекулы (-30°) лишают ее явно выраженной амфифильности. Анализ скоростей релаксации ядер |51М показал, что основная цепь Аг2 в воде совершает значительные движения в пс-нс диапазоне (среднее значение параметра

- 17-

Отрицательный

Положительный'

порядка 5" = 0.76±0.04). При взаимодействии с мицеллами 1ЭРС, моделирующими мембрану, Аг2 формирует асимметричные димеры, образованные путем параллельной ассоциации Л^-концевых Р-тяжей (Рис. 9Б) и стабилизированные 7-ю межмолекулярными водородными связями. Взаимодействие с мицеллой и димеризация ведут к значительному уменьшению скрученности (до -52729° на 8 остатков, мономер А/В) и изгиба (до -6712°) Р-листа пептида, а также к уменьшению амплитуды пс-нс движений (в = 0.88±0.07). Однако, как в воде, так и в комплексе с мицеллой ЭРС, в пептиде наблюдались движения в мкс-мс диапазоне, связанные с изменением конформации Р-поворота. Поверхность димера Аг2 амфифильна, на плоских сторонах находятся гидрофобные участки, а все заряженные группы расположены по периметру. Благодаря этим свойствам, димер Аг2 имеет «трансмембранное» расположение в мицелле ЭРС, при котором А- и С-концевые регионы, а также фрагменты, формирующие Р-повороты, располагаются вне ее гидрофобного региона (Рис. 9В). Гидродинамический радиус комплекса Аг2ЛЭРС (Ян) равен ~ 27.7 А, что соответствует ~ 37 кДа.

А ^¿ЧсгоУ

\л/2

ьР

/012

V13

мономер В

к1б

мономер А

мономер В 1918 16

1918

мономер А

ЕЖ] 16-0ЭА

Ш Мп2+ I I 16-ОЗА/Мп2*

Рис 9. (А,Б) Пространственная структура и динамика основной цепи мономера и димера Аг2. Основная цепь пептида окрашена в соответствии со значениями параметров порядка пс-нс движений (5"). Справа показано распределение электростатического потенциала на поверхности мономера и димера. (В) Парамагнитное усиление релаксации НЫ-протонов. вызванное спиновыми зондами, и топология комплекса димер Аг2/мицелла ЭРС. (Г) Предполагаемый механизм мембранной активности ареницина.

Для моделирования взаимодействия Аг2 (заряд +6) с отрицательно заряженными мембранами использовали мицеллы и бицеллы ОРСЮОРО (10:3), содержащие

анионный фосфолипид. В этих средах наблюдалась дальнейшая агрегация димеров Аг2, сопровождаемая увеличением массы комплексов, содержащих пептид, до ~ 100 кДа. Данные ЯМР. полученные в вЭв и ОРС/ПОРС, не выявили прямых контактов димер-димер в высокомолекулярных агрегатах Аг2. Электрофоретический анализ подтвердил формирование тетрамеров Аг2 в окружении мицелл 808. Данные КД-спектроскопии показали, что Аг2 не взаимодействует с везикулами, содержащими цвиттер-ионные липиды, моделирующими мембраны эукариотических клеток, но эффективно взаимодействует с анионными везикулами, моделирующими бактериальные мембраны, и

в подобных средах сохраняет конформацию ß-структурного димера.

Полученные результаты впервые указали на возможность значительных изменений конформации и динамики ß-структурных МП, имеющих в своей структуре дисульфидные связи, при взаимодействии с липидной мембраной. Ранее подобные свойства были описаны только для линейных пептидов. Таким образом, внутримолекулярная циклизация является не единственным фактором, ответственным за формирование «активной» пространственной структуры Аг2. Тем не менее, результаты, полученные в работе, и данные (Andra et al, 2009) показали важность дисульфидной связи в молекуле пептида как для формирования конформации ß-шпильки, так и для мембранной и биологической активности. На основе полученных структурных данных и наблюдаемых уровней проводимости каналов ареницина в плоских бислойных липидных системах (БЛМ) была предложена модель мембранной активности пептида, включающая олигомеризацию димеров Аг2 с участием отрицательно заряженных групп фосфолипидов и формирование смешанных пептид-липидных («тороидальных») пор (Рис. 9Г). В рамках предложенной модели селективность действия ареницина на мембраны различных организмов определяется эффективностью процессов начального связывания пептида с поверхностью мембраны, а также олигомеризации его димеров, которые зависят от электростатических взаимодействий пептид/липид. В то же время в процессах димеризации молекул Аг2 и перехода димеров в ТМ состояние важную роль играют гидрофобные взаимодействия. Уменьшение подвижности Аг2 при связывании с мембраной вносит в свободную энергию дополнительный вклад конформационной энтропии (TAS ~ —9 ккал- М"1), препятствующий образованию комплекса пептид/мембрана. Возможно, именно благодаря этому эффекту взаимодействие Аг2 с незаряженными мембранами эукариотических клеток оказывается энергетически невыгодно, несмотря на большое число гидрофобных остатков в молекуле.

3.4 Аурелин: пространственная структура, взаимодействие с мицеллами DPC и липидными везикулами, возможная роль в качестве ингибитора К*-каналов4

Новый пептид аурелин проявляет сравнительно низкую антибактериальную активность и не имеет гомологии ни с одним из ранее известных семейств антимикробных пептидов. Согласно данным ЯМР, молекула аурелина в воде представляет собой компактную глобулу, стабилизированную тремя дисульфидными связями, и включает в себя несколько спиральных участков (Рис. 10В). Боковые цепи Hell, Phel5 и Phel8 формируют на положительно заряженной поверхности пептида (общий заряд +7/+5 при pH -5/7) небольшой гидрофобный участок. Лишь некоторые фрагменты основной цепи аурелина демонстрируют повышенную подвижность в пс-нс и мкс-мс диапазонах времен. Как оказалось, аурелин способен взаимодействовать с везикулами, содержащими анионные липиды (POPC/DOPG 3:1, Рис. 10Б). Увеличение ионной силы (100 мМ NaCl) уменьшало сродство пептида к мембране, но не блокировало связывание полностью. Взаимодействие аурелина с цвиттер-ионными везикулами РОРС не наблюдалось. Исследование в окружении мицелл DPC показало, что аурелин взаимодействует с мицеллой двумя а-спиральными участками (Рис. 10В), и при образовании комплекса пространственная структура пептида не меняется. Положительно

4 Исследование пространственной структу ры и динамики аурелина было проведено совместно с Гизатуллиной А.К. в рамках ее кандидатской диссертации (руководители Арсеньев A.C. и Шенкарев З.О., планируемая дата защиты диссертации декабрь 2014 г.)

- 19-

заряженные боковые цепи аурелина (Аг§6, Жвв, НЫО, Ащ24 и Ьуз28) проникают вглубь или контактируют с поверхностью мицеллы. Таким образом, пространственная структура аурелина стабилизирована внутримолекулярными взаимодействиями, а за образование комплекса пептид/мембрана, видимо, отвечают электростатические взаимодействия с полярными головками липидов.

Рис. 10. (А) Сравнение последовательности аурелина и токсинов ShK и BgK. Цветом выделены остатки токсинов, важные для взаимодействия с К+-каналами. (Б) Изотермы связывания аурелина с везикулами POPC/DOPG в бессолевом и солевом буфере аппроксимированы уравнением равновесного распределения (Кр = 50±4 и 6.3±0.2 х103М"', соответственно). (В) Модель комплекса аурелин/мицелла DPC. (Г) Модель комплекса аурелина с поровым доменом канала Kv 1 1 человека. Карбонильные группы Туг375 и Gly376 из субъединицы В канала, формирующие селективный фильтр, показаны красным. Пунктиром показаны водородные связи между этими группами и е-аминогруппой Lys28 и NH; группой Asn32 аурелина.

Антимикробная активность аурелина, вероятно, опосредована сродством пептида к поверхности отрицательно заряженных мембран бактериальных клеток. Как показано в многочисленных исследованиях, накопление молекул МП в наружном монослое мембраны уменьшает ее стабильность и в конечном итоге приводит к разрушению бислоя по ковровому механизму, напоминающему процесс мицеллизации бислоя детергентом (Shai, 2002). В случае аурелина умеренное сродство пептида к отрицательно заряженным липидным везикулам по сравнению с другими катионными антимикробными пептидами коррелирует со сравнительно низкой антибактериальной активностью.

Пространственная структура аурелина гомологична структурам токсинов морских анемон BgK и ShK, взаимодействующих с К+-каналами. Электрофизиологические эксперименты5 подтвердили способность аурелина блокировать токи через каналы Kvl.l, Kvl.3 и Shaker при слабокислых значениях рН (< 6). Моделирование структуры комплекса пептида с поровым доменом канала Kvl.l (Рис. ЮГ) показало, что, как и в случае токсинов анемон, положительно заряженная группа боковой цепи Lys28 аурелина блокирует селективный фильтр канала6. Кроме того, в формирование комплекса вовлечены специфические взаимодействия с участием других групп молекул аурелина и Kvl.l. Следует отметить, что потенциальный интерфейс взаимодействия аурелина с К+-каналом практически полностью совпадает с сайтом на поверхности пептида, ответственным за взаимодействие с мицеллой DPC (Рис. 10ВГ).

3 Электрофизиологические измерения проведены A.A. Беркут (лаборатория нейрорецепторов и нейроре-

гуляторов ИБХ РАН) и С. Пеньёром (лаборатория токсикологии Католического университета г. Лёвен).

6 Расчеты проведены к.ф.-м.н. А О. Чугуновым (лаборатория моделирования биомолекулярных систем ИБХ РАН)

4 Исследование линейных каналообразующнх антибиотиков Aam-I и Zrv-IIB

Мембраиоактивные антибиотики пептаиболы, продуцируемые почвенными полупаразитическими грибами родов Emericelopsis, Trichoderma и родственных им, активны против грамположительных бактерий, микоплазм, экзо- и эндопаразитов. Эти гидрофобные линейные пептиды содержат ацетилированный Л'-конец, нестандартные а,а-диалкилированные остатки (а-аминоизомасляная кислота, Aib; D-изовалин, Iva), стабилизирующие спиральную конформацию, а также С-концевой аминоспирт

Рис. 11. Последовательности некоторых пептаиболов из семейств зервамицина (2гу), антиамебина (Аат), цефаибола (СрЬ) и аламетицина (А1т). Полярные остатки и остатки в1у выделены жирным шрифтом. Мотив,

ответственный за спираль-изгибающие движения, показан серым. (Внизу). Нестандартные остатки, встречающиеся в молекулах пептаиболов.

Антиамебин I (Аат-1) и зервамицин ПВ ^гу-ПВ) представляют два структурных семейства 16-ти членных пептаиболов (Рис. 11). Эти семейства различаются строением Л'-концевого фрагмента (1-8), в то время как последовательности С-концевых регионов (9-16) практически идентичны. Биологические и функциональные свойства пептаиболов этих двух семейств значительно различаются. Так, ггу-ПВ, несмотря на небольшую длину, проявляет антибиотическую и каналообразующую активности, сравнимые с активностью длинных (наиболее активных) пептаиболов. например, аламетицина (А1т, 20 остатков). В модельных мембранах Zrv-llB формирует потенциалозависимые ионные каналы с характерным набором из десятков уровней проводимости (Бапзот, 1991). Напротив, Аат-1 демонстрирует на порядок меньшую противомалярийную, гемолитическую и каналообразующую активности. Проводимость Аат-1 в модельных мембранах слабо зависит от ТМ потенциала (Оис1оЫег е1 а1, 1998). Кроме того, несмотря на кажущуюся большую гидрофобность, Аат-1 демонстрирует значительно более низкое сродство к липидным везикулам, чем 2г\'-ПВ (КгорасЬеуа е1 а\, 2005). Несмотря на радикальные отличия в биологической и мембранной активности, кристаллографические исследования не выявили существенных различий в пространственной структуре 16-ти членных пептаиболов. Во всех случаях (Ьеи1-7гу, Аат-1 и СрЬ-А,В,С) наблюдались правозакрученные спирали, изогнутые на остатке НурЮ (Випкосг! е1 а1, 2003).

Данные КД-спектроскопии, полученные в работе (Рис. 12), показали, что Егу-ПВ в изотропных (метанол) и анизотропных (мицеллы ОРС) миметиках мембраны, а также в липосомах РОРС формирует правозакрученную спираль. Для Лат-1 спиральная конформация наблюдалась в липосомах РОРС и бицеллах ОМРСЮНРС, в то время как солюбилизация пептида в метаноле приводила к разрушению вторичной структуры. Качественный ЯМР-анализ ''ТЧ-меченых пептидов в воде выявил большую растворимость Аат-1 (-30 мкМ против ~4 мкМ у 7гу-ПВ), а также значительные отличия в конформации пептидов от наблюдаемой в мембраномоделирующих средах.

(например, L-фенилаланинол, Phl, Рис. 11).

4.1 Пространственная структура и динамика /п-ПН в органических растворителях и мицеллах 1)РС

Согласно данным ЯМР, молекула У.П/-ПВ в метаноле представляет собой правозакрученную спираль длиной -26.5 А, изогнутую на НурЮ под углом 30-40°. Исследование /,г\'-ПВ в бинарных растворах (от С030Н/Нг0 1:1 до СОСЬ/СБзОН 9:1) указало на сохранение пространственной структуры пептида при изменении полярности окружения. Схожая пространственная структура ггу-ПВ наблюдалась в комплексе с мицеллой ОРС (Рис. 13). Молекула 7гу-ПВ амфифильна, все полярные боковые группы сосредоточены на выпуклой стороне спирали, а вогнутая сторона - гидрофобна. Полярный регион в середине спирали дополнительно усилен экспонированными СО-группами остатков А1Ь7, А1Ь9 и НурЮ. Концы спирали также полярны из-за наличия СО- и НЫ-групп, не формирующих внутримолекулярные водородные связи. При этом С-концевой фрагмент молекулы имеет большую полярность. В соответствии с наблюдаемым распределением гидрофобных и полярных участков, 2гу-ПВ связывается с поверхностью мицеллы ЭРС так, что гидрофобная сторона спирали обращена к мицелле, а полярная сторона экспонирована в воду (Рис. 17А). При этом Л'-концевой участок пептида заглубляется в гидрофобный регион мицеллы.

Рис. 12. (А,Б) КД-спектры Aam-I и Zrv-IIB в мембраномоделирующих средах. Большая амплитуда КД-спектра Zrv-IIB связана с меньшим содержанием ахиральных аминокислот. (В) 2D 1 Н.ь1М-спектры Aam-I в воде, метаноле, мицеллах, бицеллах и ЛБН,

Используя дальний IINCO эксперимент и 13С,|51М-меченый Zrv-IIB, в метаноле напрямую наблюдали внутримолекулярные водородные связи CO..HN типа (Рис. 14). Как оказалось, Д'-концевой фрагмент молекулы Zrv-ПВ (Ac0-Aib9) имеет конформацию a-спирали (водородные связи i—>i+4), в то время как С-концевой фрагмент образует

Результаты исследования структуры и динамики Zгv-\\B. за исключением данных по релаксации ядер 'К' в окружении мицелл ЭРС, были получены в рамках кандидатской диссертации Шенкарева 3.0. (2005 г.)

-22 -

спираль, сформированную последовательностью р-изгибов («р-bend ribbon spiral») и стабилизированную Зю-спиральными связями (/—>/+5). Подобная система водородных связей наблюдается в кристаллических структурах 16-ти членных пептаиболов. В середине молекулы Zrv-IIB наблюдали бифуркационную водородную связь, в которой один донор UN Aib 12 связан с двумя акцепторами СО Leu8 и СО Aib9. Такие водородные связи очень редко встречаются в молекулах белков (4.2% от всех водородно-связанных HN-групп) и ранее методом ЯМР не наблюдались.

Zrv-IIB. DPC

Рис. 13 Пространственная структура и динамика Аат-1 в бицеллах "DMPC/DHPC и Zrv-IIB в мицеллах DPC. 1 NH-группы, совершающие значительные дви-,жения в нс-нс (S2<0.75), мкс-мс (Rux>0) и на двух "временных диапазонах, окрашены красным, синим и фиолетовым. На поверхности пептидов показан потенциал молекулярной гидрофобное™

Анализ величин КССВ через водородную связь ji1Jnc' (среднее значение, исключая

бифуркационную водородную связь, -0.41+0.09 Гц) показал, что спираль Zrv-IIB имеет

стабильность, сравнимую со стабильностью спиралей в глобулярных белках. Кроме того,

наблюдалась прямая корреляция между пониженными значениями 3IiJnc на полярной

стороне спирали Zrv-IIB и обменными процессами в мкс-мс диапазоне, обнаруженными

ранее (Korzhnev et al, 2001) (Рис. 14). Полученные данные позволяют предположить, что

эти обменные процессы включают в себя изменение геометрии или перестройку системы

водородных связей (например, а <-> Зю *-> связь с растворителем) для трех HN-rpynn

пептида Thr6, Leu8 и Aib 14. Наличие процесса конформационного обмена на полярной

стороне спирали Zrv-IIB не противоречит ее высокой стабильности. Флуктуации в

структуре зервамицина (если они присутствуют) соответствуют переходным формам, и

спиральный мономер пептида представляет собой основную форму Zrv-IIB в метаноле, ос-сп и ралЬ]--1 _

Ас

Зю-спираль

Рис. 14. (Вверху). Система водородных связей Zrv-\lB в метаноле. «Свободные» НЫ- и СО-группы показаны треугольниками и звездочками, соответственно.

0.4 (Внизу). Значения КССВ Лыс через водородные связи и „ вклад обменных процессов в поперечную релаксацию ¿л ядер (Якх) Для тех же НГ^-групп. Водородные связи, 2 на которые влияет обменный процесс, показаны вверху ил 03 15 Ц7 из 011 013 Р15 о: пигшжя 12 М Т6 1-8 010 Ш2 и 14 те рисунка.

Анализ данных ' ^-релаксации, полученных в окружении мицелл ЭРС (Рис. 13), выявил мкс-мс обменные процессы на полярной стороне спирали Zrv-IIB. вероятно, также вызванные флуктуациями в системе водородных связей. Небольшие (0.8-2 Гц) вклады Ярх наблюдались для трех НЫ-групп (0!п3. АШ7 и А1Ь14). Кроме того, для 11 (из 13) Н^групп основной цепи ггу-ИВ наблюдались движения в наносекундном диапазоне

(характерное время те=0.71±0.16 не), возможно, связанные с качением и скольжением спирали пептида относительно поверхности мицеллы.

ЯМР-исследование с использованием спин-меченых аналогов пептида показало, что Zrv-IIB в метаноле, в отличие от длинных пептаиболов, таких как аламетицин, не совершает высокоамплитудных движений, изгибающих спираль. По-видимому, особая конформационная стабильность Zrv-IIB вызвана заменой Glyll (Alm) на Aib7 (Zrv) в ответственном за шарнирные движения мотиве Glyl l-Leu-Aib-Prol4 (самый стерически свободный остаток заменен на самый стерически ограниченный).

Сравнение результатов ЯМР-исследования Zrv-IIB с данными, полученными методами КД-спектроскопии (Рис. 12Б), позволяет сделать вывод о том, что пептид имеет структуру «стабильной» правозакрученной спирали не только в изотропных и анизотропных миметиках мембраны, но и в системах, содержащих липидный бислой.

4.2 Пространственная структура и динамика Лат-/ в метаноле, бицеллах, мицеллах и нанодисках

Один из основных вопросов, который предстояло решить в ходе исследования антиамебина, был связан с конформацией Д/-концевого (1-8) фрагмента пептида в растворе. Эта часть молекулы (Рис. 11) содержит пять ахиральных остатков (4 Aib, 1 Gly), два L-остатка (Phe и Leu) и один D-остаток (Iva). Ранние ЯМР-исследования Аат-1 в DMSO (Das et al, 1986) и метаноле (Galbraith et al, 2003) указали на возможное формирование левозакрученной спиральной структуры на этом участке.

-3hjNC [Гц] Т I

А ш! 1 1

тШ1гт 1 1 1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213 14 15 16 HN-FUUUJ GL U U О Q J OUPPhl

ШШ М I I

СО- Ас F UUUJGL UUOQJ О 1н 0123456789 10 11 1213 "

[мд] "

U U G U О J U Phl I J T F U J L U. .Q, .О. , Р. W, , Q, , I , , U

5-'—1—1—1———1————————————

2.2

2.0

1.00

Aam-I

ШШ DPC ;

Ш МеОН I

" г' г' ь' б' 7' ъ' 9 1011 12'13'1415'16 1 ' 2' з' 4 ' 5' б' 7' 8 9'10 11 12 13 14 16 16

Рис. 15. (А) Система водородных связей в молекуле Aam-I в метаноле и соответствующие значения 'hJNc . (Б) Фрагмент "C-HSQC спектра Аат в метаноле, "с'-группы остатков Aib и Iva обозначены как S и R. (В) A8L,CP для Aam-I и Zrv-IIB в метаноле и анизотропных миметиках. Приведены рассчитанные заселенности правозакрученной конформации (PR, для метанола - курсив). Пунктирные линии показывают уровни, соответствующие полностью правозакрученной конформации (.Рц =1).

Для детального исследования пространственной структуры Aam-I анализировали КССВ, зависящие от конформации углов (р ("Jhnh\ Jhnc> Jhnc , JhV) и \|/ n, Jnc > 2JNCa) основной цепи, а также КССВ через водородную связь (3%с)- Полученные данные показали, что С-концевой сегмент пептида (9-16) имеет правозакрученную конформацию

«ß-bend ribbon spiral», идентичную наблюдаемой в молекуле Zrv-IIB (Рис. 15А). В то же время данные, полученные для Л-концевого сегмента Aam-I, выявили наличие конформационного обмена между право- и левозакрученной Зю-спиральными состояниями с примерно равной заселенностью. КССВ 3hJ\c на этом участке имели очень низкую амплитуду (~ -0.1 Гц). Следует отметить, что схожие быстрые (по шкале хим. сдвигов ЯМР) кооперативные переходы между право- и левозакрученной Зю-спиральными конформациями ранее наблюдались для poly-Aib последовательностей в растворе (Hummel et al, 1987), но не были описаны для молекул пептаиболов.

Согласно концепции, предложенной в работе, магнитная неэквивалентность ПС|! ядер остатков Aib и Iva (разница хим. сдвигов двух 13СР групп, А5ПС") может быть использована для качественного анализа конформации и динамики молекул пептаиболов. Статистический анализ ПСР хим. сдвигов в молекулах пептаиболов с известной пространственной структурой показал, что остаток Aib в правозакрученной последовательности Aib-Xxx демонстрирует значения Дб^С11 равные +4.01±0.55 м.д. Для последовательностей Aib-Pro(Hyp) наблюдались Д513СР равные -2.41 ±0.50 м.д. Предполагая, что (1) стерически ограниченный остаток Aib может находиться только в право- или левозакрученной спиральной конформации, (2) полученные значения соответствуют полностью правозакрученной конформации, и (3) в случае левозакрученной конформации значения Д513СР меняют знак, предложены эмпирические зависимости, связывающие значения Д5|3С(' с заселенностью правозакрученной конформации (PR). Аналогичные зависимости предложены для остатка Iva.

= 0.5 * (1 + ff^j) Р,Гт = 0.5 * (1 + ^j) (1)

-/г - o.5.(i-A,vV;;6f-"-) (2)

" + AJQmjö. - 2.4 м.д.

Анализ значений ДйпСр для Aam-I в метаноле подтвердил усреднение конформации основной цепи остатков Aib2, Aib3, Aib4 и Iva5 между право- и левозакрученным состояниями с примерно равной заселенностью (Рц ~ 0.5, Рис. 15БВ). Кроме того, оказалось, что остатки Aib8 и Ival2 также участвуют в сходных обменных процессах (PR = 0.83 и 0.81). Полученные результаты позволяют объяснить атипичный вид КД-спектра Aam-I в метаноле (Рис. 12А). Вероятно, вклады двух состояний Д-концевого сегмента с разным направлением закрутки спирали в КД-спектр взаимно уничтожаются и общий вид спектра в основном определятся структурой С-концевого сегмента. С другой стороны, значения Д513СР для Zrv-IIB в метаноле и мицеллах DPC практически не отличались друг от друга и соответствовали полностью правозакрученной конформации (Pr от 0.85 до 1.08), что подтверждает вывод о «конформационной стабильности» спирали Zrv-IIB.

Согласно данным 15Ы-релаксации, процессы перехода между право- и левозакрученной конформациями Д'-концевого сегмента Aam-I протекают в мкс-мс временном диапазоне. Большие значения REx (4.1 и 1.8 Гц), наблюдаемые для остатков Aib2 и Iva5, позволили предположить, что дипептидные фрагменты Phel-Aib2 и Aib4-Iva5, содержащие остатки L-Phe и D-Iva, являются центрами нуклеации процесса кооперативного изменения направления закрутки спирали. Большие значения REX (1-3 Гц) также наблюдались для остатков Aib8, Ival2 и Aibl4.

Моделирование пространственной структуры Aam-I методом Монте-Карло с использованием неявно заданной модели растворителя (октанол) показало, что наборы

структур с правой и левой закруткой А'-концевого сегмента имеют сравнимую минимальную энергию (Рис. 16). Разрушение системы водородных связей в середине молекулы в структурах с левой закруткой компенсировалось контактами Ван-дер-Ваальса между N- и С-концевыми ароматическими остатками (Phel и Phi 16). Эти контакты возникали благодаря сильному изгибу в шарнирном регионе (6-10), обусловленному левой закруткой остатка Aib8. Таким образом, процессы изменения направления закрутки сегмента Phel-Gly6 и остатка Aib8, вероятно, скоррелированны и могут сопровождаться высокоамплитудными спираль-изгибающими движениями (Рис. 16). Как уже отмечалось, подобные движения, не наблюдаются в молекуле Zrv-IIB.

Рис. 16. Моделирование процессов конформационного обмена в молекуле Aam-I. Показаны энергетически наиболее выгодные конформации: (А) полностью правозакрученная: (Б) с левой закруткой сегмента (1-5) и остатка Aib8; (В) с левой закруткой сегмента (1-5) и правой закруткой остатка AibS.

Взаимодействие с бицеллами DMPC/DHPC (1:4) приводило к стабилизации правозакрученной конформации Аат-1. Однако, даже в этом окружении для остатков Aib2-Iva5 наблюдалась небольшая доля левозакрученной структуры (PR от 0.68 до 0.87, Рис. 15В). Рассчитанная по данным ЯМР пространственная структура Aam-I в бицеллах (Рис. 13) представляет собой правозакрученную спираль длиной -26.7 А (угол изгиба на Hyp 10 -26°). А-концевой сегмент молекулы (1-8) образует Зю-спираль, но содержит несколько а-спиральных водородных связей. С-концевой сегмент (9-16) имеет конформацию «fi-bend ribbon». Полученная структура отличается от кристаллических структур 16-ти членных пептаиболов и структуры Zrv-IIB, в которых yV-концевой сегмент имеет полностью а-спиральную конформацию. Молекула Aam-I амфифильна, полярный регион сформирован на выпуклой стороне спирали группами основной и боковых цепей остатков Gly7, HyplO, Glnll и Нур13. Полярность С-концевого участка молекулы дополнительно усилена экспонированными карбонилами и С-концевой ОН-группой.

Анализ данных N-релаксации подтвердил наличие мкс-мс конформационных флуктуаций в молекуле Аат-1 в комплексе с бицеллой (Рис. 13). Очень большие вклады Rex (15-30 Гц) детектировали для Aib2, Aib8, Ival2 и Aibl4. Локализация обменных процессов в молекуле Aam-I частично повторяла их распределение, наблюдаемое в метаноле. Как и в случае Zrv-IIB для большинства остатков антиамебина наблюдались движения в наносекундном диапазоне (те=0.8±0.4 не), связанные с качением и скольжением спирали пептида относительно поверхности бицеллы.

Качественное сравнение 2D 'H,I5N -спектров Aam-I показало, что пептид имеет схожую конформацию и распределение мкс-мс обменных процессов в различных

анизотропных миметиках мембраны (бицеллы ОМРСЮНРС, мицеллы 1)11РС, ОРС, ЬМРС, ЬМРй, 805) и ЛБН на основе анионного липида ООРв (Рис. 12В). Вероятно, наблюдаемые конформационные флуктуации являются неотъемлемым свойством молекулы Аагп-1 и проявляются независимо от характеристик мембраномоделирующего окружения. Локализация этих движений на ахиральных остатках (АНэ, 01у) и 0-|уа указывает на то, что они связаны с изменением направления закрутки основной цепи пептида, которое в метаноле носит кооперативный характер. Следует отметить, что эти процессы протекают по-разному в мембранах ЛБН различного состава. Так, в мембранах на основе цвиттер-ионных липидов ОМРС и РОРС из-за значительного обменного уширения наблюдалось только 2-3 интенсивных сигнала от основной цепи пептида.

(Д) Модель комплекса Aam-1/DMPC/DHPC. HN-атомы, «чувствительные» к 16-DSA, Мгг' и обоим зондам, показаны красными, зелеными и желтыми сферами. (Е,Ж) Модели комплексов Aam-I/ЛБН. Показаны: вероятная локализация парамагнитных зондов, толщина гидрофобного региона мембраны и толщина региона полярных головок. Длина гидрофобного региона спирали Aam-I -2.5 нм.

Данные о топологии комплекса Аат-1/бицелла (Рис. 17БД) показали, что спираль пептида взаимодействует с поверхностью бицеллы, и ее /V-концевой участок заглубляется в гидрофобную область. Аналогичное расположение пептида, схожее с топологией комплекса Zrv-IIB/DPC, наблюдалось в мицеллах DPC, DHPC, LMPC, LMPG, SDS и ЛБН на основе DOPG (Рис. 17ВЕ). Периферический способ взаимодействия Aam-I с бицеллами OMPC/DHPC и ЛБН/DOPG согласуется с пространственной структурой пептида. Длина гидрофобного региона на вогнутой стороне спирали Aam-I (-25 А) не превышает толщину гидрофобного региона бислоя DMPC (diC14:0, -26.2 А) и DOPG (diC18:l, -27.1 А), что делает переход пептида в ТМ состояние энергетически невыгодным.

Известно, что встраивание спиральных пептидов (включая пептаиболы) в регион полярных головок липидной мембраны приводит к нарушению ее структуры и может вызывать значительное уменьшение толщины бислоя (Huang, 2006). Как предполагается, именно этот эффект делает возможным переход мономеров каналообразующих пептидов в ТМ состояние. Для исследования возможности подобных переходов в случае Aam-I были использованы нанодиски, содержащие смесь «короткоцепочечных» липидов DLPC/DLPG (4:1, diC 12:0, толщина гидрофобного региона -23.9 А). Данные ЯМР, полученные в этой среде (Рис. 12В), указали на изменения в структуре и динамике

jV-концевого (1-8) сегмента Aam-I и выявили присутствие динамического равновесия между поверхностносвязанным и ТМ состояниями пептида (Рис. 17Г). В ходе этих флуктуации С-концевой сегмент спирали Ааш-1, по-видимому, остается заякоренным на одной из сторон мембраны нанодиска, а /V-концевой участок молекулы переходит из середины гидрофобного региона в регион фосфатных групп на противоположной стороне мембраны (Рис. 17Ж). Таким образом, использование «тонких» нанодисков позволило впервые наблюдать переходы (поверхность <-> ТМ) для спирального пептида методами ЯМР-спектроскопии высокого разрешения. Ранее для исследования подобных переходов использовали методы КД-спектроскопии (Huang, 2006) и ЯМР-спектроскопии твердого тела (Bechinger et al, 2001) в ориентированных мембранах, которые позволяют только качественно характеризовать пространственную структуру пептида.

Наблюдаемый периферический тип взаимодействия Aam-I и Zrv-IIB с мицеллами детергентов, многие из которых имеют небольшую гидрофобную длину, например, DPC (С12:0) и DHPC (diC6:0), вероятно, отражает различия в структурной организации мицелл и нанодисков. Комплекс пептида с высоко-динамичной мицеллой детергента может быть представлен в виде смешанной мицеллы, в которой молекулы детергента экранируют гидрофобные участки пептида от растворителя. Топология такого комплекса в основном зависит от распределения полярных и неполярных регионов на поверхности пептида, а не от соотношения гидрофобной длины молекул пептида и детергента. Напротив, в случае ЛБН полужесткая двумерная «матрица» липидной мембраны допускает контакты между полярными регионами на поверхности пептида с гидрофобным регионом бислоя, если подобная топология комплекса пептид/мембрана является энергетически выгодной. Полученные данные характеризуют влияние мембраномоделирующих сред на структуру, динамику и топологию МБ, а также демонстрируют большой исследовательский потенциал ЛБН, позволяющих изучать такие состояния мембраноактивных пептидов, > которые в принципе не могут быть изучены в средах на основе детергентов. Результаты исследования показывают, что важную роль в стабилизации «активной» (спиральной) пространственной структуры пептаиболов и в образовании комплекса пептид/мембрана играют неспецифические гидрофобные взаимодействия с липидным бислоем.

4.3 Модель действия Zrv-IIB и Лат-1

Несмотря на различия в аминокислотной последовательности, Aam-I и Zrv-IIB имеют схожую пространственную структуру и топологию взаимодействия с частицами анизотропных миметиков мембраны. Кроме того, оба пептида способны спонтанно переходить в ТМ состояние в «тонких» мембранах, состоящих из diC 12:0 липидов (для Zrv-IIB подобные свойства были показаны методом ЯМР твердого тела (Bechinger et al, 2001)). Совпадение структурных свойств позволяет рассматривать мембранную активность Aam-I и Zrv-IIB в контексте одной модели (Рис. 18). В рамках предложенной модели пептиды не имеют определенной конформации в водном растворе, и на первом этапе происходит их присоединение к поверхности мембраны, сопряженное с формированием спиральной конформации. На втором этапе, ТМ электрический потенциал или утончение мембраны, вызванное связанными молекулами пептида, переводит мономеры Aam-1/Zrv-IIB в ТМ состояние. Далее, ТМ мономеры пептида агрегируют и формируют каналы из параллельных связок спиралей (так называемый Barrel-Stave механизм). Через эти каналы происходит ток ионов и вытекание цитоплазматического содержимого из клетки-мишени.

Полученные динамические данные позволяют объяснить различия в мембранной и антибиотической активности пептидов. Вероятно, особую роль в высокой активности 2гу-11В по сравнению с другими пептаиболами играет стабильность его спиральной структуры. Отсутствие высокоамплитудных шарнирных движений и система устойчивых водородных связей придает пептиду длину 26 А), достаточную для проникновения через гидрофобный регион мембраны, и дипольный момент (~ 50 О), необходимый для эффективного взаимодействия с ТМ потенциалом. С другой стороны, повышенная конформационная подвижность Аат-1, «закодированная» в первичной структуре последовательностью ахиральных (А1Ь, 01у) и 1>1уа остатков, по-видимому, приводит к значительному снижению эффективности трех основных этапов предложенного механизма порообразования (Рис. 18). Так, наличие высокоамплитудных процессов

конформационного обмена и вклад конформационной энтропии (ТДв--3 ккал-М ) в

свободную энергию образования комплекса пептид/мембрана, возникающий из-за упорядочивания конформации уУ-концевого фрагмента, повышает растворимость Аат-1 и уменьшает эффективность его взаимодействия с липидным бислоем. Пониженная эффективность связывания с бислоем в свою очередь приводит к ослаблению эффекта уменьшения толщины мембраны, а спираль-изгибающие движения уменьшают эффективный дипольный момент и взаимодействие Аат-1 с ТМ потенциалом. Оба этих фактора затрудняют переход молекул пептида в ТМ состояние. И, наконец, повышенная динамика Аат-1 также может препятствовать образованию ионопроводящих спиральных связок из-за ослабления специфических контактов между молекулами пептида.

5 Исследование потенциалочувствительного домена канала КуАР

Потенциал озависимые К.+-каналы присутствуют в клетках практически всех организмов, - от бактерий и архей до человека, и участвуют во многих жизненно-важных клеточных процессах, включая регуляцию осмотического баланса, возбудимость клеток и передачу нервного импульса. Ключевым функциональным элементом этих каналов являются потенциалочувствительные домены (ПЧД), находящиеся на периферии поры канала (Рис. 19). Роль датчика ТМ потенциала выполняет спираль 84 ПЧД. содержащая несколько (обычно 4) консервативных остатка А^/Ьуэ, положительные заряды которых переносятся через мембрану в ходе потенциалозависимой активации. Предполагается, что ПЧД в мембране ведут себя как структурно независимые домены, и их конформация подвергается значительным перестройкам в ответ на изменение ТМ потенциала. Несмотря на наличие нескольких кристаллических структур К. -каналов, а также обширных данных мутагенеза, молекулярные механизмы потенциалозависимой активации и регуляции работы К'-каналов различными лигандами в настоящее время остаются малоизученными. Объектом исследования являлся ПЧД прототипического К -канала КлАР из археи Аегоругит регтх.

Потенциало- Поровый чувствительный домен домен внеклеточный

интерфейс

Н-

^^внутриклеточный С интерфейс

Рис. 19. Схема строения одной субъедипицы (А)и гомотетрамера канала KvAP (Б). Показаны спирали ПЧД (S1-S4) и порового домена (S5, S6). Знаком «+» показаны остатки Arg, ответственные за потенциалозависимую активацию.

5.1 ЛБН как «среда сравнения» для скрининга детергент-содержащих мембраномоделирующих сред при ЯМР-исследованиях МБ*

Одним из важных и необходимых этапов в изучении структуры и динамики МБ методами ЯМР-спектроскопии является подбор оптимальной мембраномоделирующей среды. Эта среда должна сохранять пространственную структуру и функциональность инкапсулированной белковой молекулы и в то же время обеспечивать достаточное качество ЯМР-спектров, необходимое для структурных исследований. В настоящее время для скрининга мембранных миметиков чаще всего применяют два критерия: (1) КД-спектроскопия используется для оценки вторичной структуры МБ и (2) 2D -корреляционные спектры (HSQC или TROSY) используются для оценки качества спектров ЯМР. Однако, предположение о том, что ЯМР-спектр хорошего качества, наблюдаемый в мицеллах, бицеллах, или органических растворителях, соответствует нативной конформации МБ в липидном бислое, может оказаться ошибочным.

В работе на примере ПЧД канала KvAP был предложен новый подход для скрининга детергент-содержащих мембраномоделирующих сред, который может применяться в тех случаях, когда функциональное состояние МБ в окружении миметика мембраны не может быть проверено биохимическими или физико-химическими методами. В основе метода лежит тот факт, что химические сдвиги HN-групп белка очень чувствительны к его конформации. Как следствие 2D 'Н,|5М-спектр МБ, измеренный в системе, содержащей бислойную липидную мембрану (например, в ЛБН), может быть использован в качестве «спектра сравнения» для скрининга классических миметиков мембраны, которые больше подходят для детальных структурных исследований (Рис. 20).

Рекомбинантный ''N-ПЧД был выделен из мембраны Е. coli с помощью мягкого детергента DDM и встроен в ЛБН, содержащие DMPC, DMPG, или смесь POPC/DOPG (3:1). Сравнение 2D 'h,I5N-TROSY

спектров ПЧД в составе мембран ЛБН показало, что | заряд и степень насыщенности липидных молекул не оказывают большого влияния на структуру домена. Полученные спектры демонстрировали селективные уширения кросс-пиков, что свидетельствовало о наличии процессов конформационного (мкс-мс) обмена в молекуле. Анализ спектров ПЧД, полученных в «классических» мембраномоделирующих средах (мицеллах, бицеллах и органическом растворителе ТФЭ), позволил сделать вывод о том, что домен сохраняет «нативную» пространственную структуру, близкую к структуре в бислойной липидной мембране, только в средах на основе цвиттер-ионных (мицеллы DPC, бицеллы DMPC7DHPC 1:4) и слабокатионных (LDAO) детергентов. Спектры ПЧД в этих средах (Рис. 20БВ) были схожи со спектрами домена в составе ЛБН (Рис. 20А) и также демонстрировали значительные обменные уширения.

s Исследование ПЧД-KvAP в мицеллах цвиттер-ионных детергентов и ЛБН было проведено совместно с Парамоновым A.C. в рамках его кандидатской диссертации (руководители Арсеньев A.C. и Шенкарев З.О., 2009 г.)

В противоположность этому спектры ПЧД, полученные в мицеллах анионных детергентов (БОЗ. ЬМРО, ЬРРО) и в ТФЭ, характеризовались меньшей дисперсией 1 сигналов (Рис. 20ГД) и практически однородными интенсивностями кросс-пиков, но также имели хорошее качество. Проведенные структурные исследования (п. 5.3) показали, что в анионных детергентах происходит частичная денатурация («плавление») пространственной структуры домена. В то же время, КД-спектры ПЧД, измеренные в различных средах (Рис. 20Е), не выявили различий во вторичной структуре домена. За исключением ТФЭ во всех протестированных мембранных миметиках молекула домена содержала ~ 60% а-спирали. Полученные результаты выявили ограничения метода КД-спектроскопии для сравнительного анализа структуры спиральных МБ в различных мембраномоделирующих средах и указали на преимущество предложенного подхода, основанного на сравнении Ю 'Н,' М-спектров.

11 10 9 8 7 11 10 9 8 1Н[М.Д.] 11

105 110 115 120

105 110 115 120 125

'g £Г] DPC сЙ 6.8 g ri LDAO ОН 5.0 -. 4 - - -v-\3C ■ ■

|- LPPG DH 7.0 д LMPG рН 4.7<íS-

- А И

ЛБН/DMPG РН 7.0

со" 60 о

|40

0 20

Í о

£ -20

§■40

200 210 220 230 240 Длина волны, нм

Рис. 20. 2D Н N-TROSY спектры ПЧД канала KvAP в составе ЛБН/DMPG (А) и мицеллах (Б-Д). (Е) КД-спектры ПЧД в различных мембраномоделирующих средах.

5.2 Структура и динамика «нашивного» состояния ПЧД канала KvAP

Структуру и динамику «нативного» состояния ПЧД исследовали в смешанных мицеллах DPC/LDAO (2:1). Согласно данным ЯМР, вторичная структура ПЧД в мицеллярном окружении включает в себя пять спиралей (SI, S2, S23, S3b и S4) и три сегмента (SO, S3a и S45), содержащих неполностью сформированную спиральную структуру. Сравнение с кристаллической структурой ПЧД (Jiang et al, 2003, Рис. 21) выявило лишь небольшие различия. Так, в растворе наблюдались искажения в сегментах S3a и S45. и присутствовал дополнительный «псевдо-спиральный» участок S0. Следует отметить, что изгиб спирали (шарнирный регион) между участками S4 и S45. имеющими структуру слитной a-спирали в кристалле, ранее наблюдался в ходе ЭПР-исследования полноразмерного канала KvAP в липидной мембране (Cuello et al. 2003).

Вторичные химические сдвиги амидных протонов (Д5 Н , разница наблюдаемого сдвига и сдвига в конформации неупорядоченного клубка. Рис. 21) на участках S1, S2, S3b, S4, и S45 демонстрировали характерную периодичность (/J+3//+4), свидетельствующую об изгибе спиралей. При этом более короткие водородные связи на вогнутой стороне приводили к сдвигу сигналов в слабое поле (Д5'Нн > 0). Сравнение с кристаллической структурой ПЧД показало, что спирали SI, S2, S3b и S4 имеют схожий

-31 -

изгиб в мицеллах DPC/LDAO и в кристаллическом окружении. Нарушение периодичности A5'Hn на стыке сегментов S4 и S45 (Рис. 21) подтвердило предположение о том, что в растворе мицелл элементы S4 и S45 ведут себя как независимые спирали, возможно, соединенные гибким шарниром. Наблюдаемые значения A5'Hn выявили и другие взаимодействия в рамках третичной структуры ПЧД. Например, формирование межспирального солевого мостика Asp62-Argl33 (S1-S4) и наличие вблизи GlylOI связанной с белком молекулы воды (Рис. 22А) подтверждалось значительными вторичными сдвигами 'HN сигналов Val42, AlalOO и GlylOI (-1.45, +1.59 и +1.34 м.д.), а также наблюдаемыми контактами ЯЭО. Сравнение полученных данных с результатами структурных и биохимических исследований полноразмерного канала KvAP в липосомах и мембранах клеток (Cuello et al, 2003; Neale et al, 2007) показало, что пространственная структура ПЧД в окружении мицелл DPC/LDAO соответствует структуре домена, наблюдаемой в открытом или инактивированном состоянии канала при деполяризации мембраны (так называемое «активированное» состояние ПЧД).

-Я

Сравнение вторичной структуры ПЧД канала КуАР в мицеллах ОРС/ЬОАО (2:1, рН 4.7, 42°С) и ЬРРв (рН 5.5, 45°С) с кристаллической структурой изолированного домена (Х-Яау 1СЖ5). Шарнирный регион между Б4 и 845, выявленный в ЭПР-исследовании. заштрихован. Псевдо-спиральные элементы показаны волнистыми линиями. Проиллюстрирована корреляция между значениями Д8'НЫ для ПЧД в мицеллах и изгибом спиралей в кристаллической структуре домена. Зеленые (малиновые) сферы и стрелки обозначают |НМ сигналы, сдвинутые в слабое (сильное) поле. Для ОРС/ЬЭАО указана периодичность значений Л8|Н!д (остаток на период).

Согласно данным ЯМР (Рис. 22Б-Г). комплекс ПЧД/мицелла представляет собой мономер МБ, гидрофобная поверхность которого экранирована от растворителя слоем молекул детергента. Подобная топология комплекса согласуется с результатами анализа данных '51М-релаксции (тк ~ 18.4 не, 45°С, Ян ~ 32 А). Полученная оценка для гидродинамического радиуса совпадает с суммой радиуса поперечного сечения ПЧД 10 А) и длиной молекулы детергента (~ 20 А для ОРС и ЬБАО). ЯЭО-контакты между 'Нн протонами домена и протонами воды (Рис. 22Д) указали на наличие в структуре ПЧД двух полостей, заполненных растворителем с внеклеточной и внутриклеточной сторон мембраны. Полости разделяются гидрофобными остатками (Ьеи65, Уа166, А1а96, Ьеи97),

-32 -

располагающимися чуть ниже уровня солевого мостика Asp62-Argl33, при этом молекулы воды способны проникать на уровень, соответствующий середине гидрофобного региона бислоя. Структурная организация домена согласуется с концепцией «сфокусированного электрического поля», в рамках которой предполагается, что основное падение ТМ электрического потенциала происходит на небольшом участке в середине Г1ЧД, длина которого (5-10 А) значительно меньше толщины бислоя (~40 А, Ahern and Horn, 2005). Именно через этот участок и осуществляется перенос 4-х элементарных положительных зарядов в ходе потенциалозависимой активации.

"N [мд] g Парамагнитная релаксация g Доступность детерегнту

А 116.1 116.9 105.1 в присутствии 16-DSA A *S3b петля S1-S2

Нет ЯЭО с СН3 f ЯЭО с СН3 LDAO.

Доступность растворителю

Нет данных

мкс-мс движения

пс-нс движения петля S3-S4

3 l(TROSY) [a.u.]

■ ЛБН/POPC/DOPG 0-6 ПБН/DMPC |

■ ЛБН/OMPG I 0.5 ■ DPC/LDAO ll I

■ DPC S

o.4 m L

петля S1-S2

R120

A100

Ihnco > 2<lHNCO> S3a(.

ihnco < v^ihnco*

Рис. 22. (А) Данные ЯМР, полученные в мицеллах DPC/LDAO, подтверждают формирование межспирального солевого мостика Asp62-Argl33 и наличие связанной молекулы воды в ПЧД канала KvAP. Длины водородных связей и расстояния протон-протон (А), наблюдаемые в кристаллической структуре, показаны красным и зеленым цветами, соответственно. На вкладке показан фрагмент 3D l5N-NOESY спектра (т,„ 150 мс) ПЧД. Диагональные кросс-пики показаны красными крестиками. (Б-Д) Экспериментальные данные и предполагаемая топология комплекса ПЧД/мицелла. (Е.Ж) Распределение нс-пс и мкс-мс движений в молекуле ПЧД. (3) Нормализованные амплитуды некоторых HN сигналов ПЧД в различных мембраномоделирующих средах. Сигналы, отмеченные звездочками, не наблюдались из-за сильного уширения.

Анализ интенсивностей кросс-пиков в 3D HNCO спектре и данных о релаксации ядер 15N выявил регионы ПЧД с высокоамплитудной динамикой в нс-пс и мкс-мс временных диапазонах (Рис. 22ЕЖ). Значительные нс-пс движения наблюдались в N- и С-концевых регионах домена, петле S1-S2 и спиралях S23-S3a, в то же время петля S3b-S4 была стабильна в этом диапазоне. С другой стороны, мкс-мс конформационные

-33-

флуктуации наблюдались во всех 4-х спиралях домена (Рис. 22ЕЖ) на участках, формирующих межспиральные контакты, включая солевой мостик Asp62-Argl33 и остатки AlalOO, Gly 101, Leu65, Val66, Ala96, и Leu97. Подобная локализация указывает на способность спиралей ПЧД совершать скользящие движения друг относительно друга.

Для анализа динамики домена в средах, содержащих бислойную мембрану, сравнивали амплитуды отдельных HN сигналов в 2D 'H,15N-TR0SY спектрах, измеренных в мицеллах DPC, мицеллах DPC/LDAO и в нанодисках, содержащих DM PC, DMPG и POPC/DOPG (3:1). Во всех случаях (Рис. 22-3) сигналы AlalOO и Gly 101 имели низкую амплитуду, что указало на схожий характер мкс-мс движений. Вероятно, наблюдаемые обменные процессы отражают конформационную нестабильность, свойственную структуре домена, и также присутствуют в полноразмерном канале KvAP. Возможно, именно эти движения являются прообразами высокоамплитудных конформационных перестроек, происходящих в ПЧД при изменении ТМ потенциала. Полученные динамические данные согласуются с моделью, в которой переход ПЧД из состояния покоя в «активированное» состояние сопровождается скользящим движением сравнительно стабильной спиральной шпильки S3b-S4 («потенциалочувствительная лопасть») относительно спиралей S1 и S2 (Long et al, 2007). В то же время эти данные указывают на неприменимость ряда моделей, подразумевающих изменение конформации шпильки S3b-S4 (Vargas et al, 2012), для описания потенциалозависимой активации канала KvAP. Результаты исследования ПЧД канала KvAP позволили впервые описать «медленные» (мкс-мс) межспиральные движения в молекуле МБ.

5.3 Структура и динамика «расплавленного» состояния ПЧД канала KvAP

Низкая дисперсия сигналов в 2D 'H,15N- и 'Н,|3С-корреляционных спектрах ПЧД, солюбилизированного в мицеллах анионных детергентов, косвенно указала на разрушение межспиральных контактов в молекуле. Результаты ЯМР-исследования ПЧД в мицеллах лизо-фосфатидилглицерола LPPG показали, что солюбилизация в анионных детергентах изменяет вторичную структуру домена (Рис. 21). Так, в LPPG (по сравнению с DPC/LDAO) спиральный сегмент S0 имеет значительно большую длину (14 против 4 остатков), спираль S1 длиннее на 10 остатков, спираль S2 начинается на 4 остатка позже, спирали S23 и S3a объединены в одну спираль, имеющую более упорядоченную структуру, спираль S3b короче на 4 остатка, а сегмент S45 имеет большую длину и заканчивается практически на С-конце домена (Lysl47). Анализ вторичных химических сдвигов A5lHN в окружении LPPG выявил отсутствие изгиба спиралей, обусловленного формированием «нативной» третичной структуры, на всех участках домена за исключением С-концевого фрагмента спирали S1 (Рис. 21).

Согласно полученным динамическим данным внутримолекулярная подвижность в мицеллах LPPG имеет более равномерное распределение по различным участкам домена. Так, N- и С-концевые фрагменты ПЧД, экспонированные в растворитель в окружении DPC/LDAO, в LPPG формируют спирали, ассоциированные с поверхностью мицеллы, что значительно уменьшает их подвижность в пс-нс диапазоне. В то же время подвижность других участков домена в этом диапазоне времен значительно увеличилась (среднее значение ISN-{'H¡ ЯЭО, рассчитанное по спиралям S1-S4, уменьшилось с 0.71±0.09 до 0.63±0.08). Кроме того, в мицеллах LPPG не наблюдалось высокоамплитудных процессов мкс-мс конформационного обмена. Гидродинамические характеристики ПЧД в комплексе с мицеллой LPPG (tr ~ 17.3 не, 45°С, RH ~ 31 А) были сравнимы с характеристиками

домена в ОРС/ЬОАО. Однако, данные, полученные для вариантов ПЧД, спин-меченных по остаткам 112 (петля 83Ь-84) и 140 (С-концевой участок), показали, что при переходе из ОРС/ЬОАО в ЬРРС расстояние между спиралями домена значительно увеличивается, но сохраняются «остаточные» межспиральные контакты, например, между петлевыми участками Б34 и Б12, а также между /У- и С-концевыми участками (Рис. 23).

Рис. 23. Ослабление интенсив-ностей сигналов в 20 'Н,15Ы-Н80С спектрах спин-меченых аналогов ПЧД. вызванное парамагнитной релаксацией. Большее ослабление соответствует меньшему расстоянию протон/спин-метка. Стрелками схематически показано увеличение межспиральных расстояний при переводе домена из ОРС/ЬОАО в ЬРРО. Сплошной линией показаны теоретические значения, рассчитанные для кристаллической

15 35 55 Номер остатка 95 115 135 Структуры ДОМеНЗ.

Суммируя полученные результаты, можно сделать вывод, что в мицеллах ЬРРС ПЧД-КллАР находится в состоянии, напоминающем состояние «расплавленной глобулы» водорастворимых белков. По сравнению с «нативным» состоянием домена, наблюдаемым в ОРС/ЬОАО, «расплавленное» состояние характеризуется: (I) небольшими изменениями вторичной структуры, (2) частичным разрушением третичной структуры белка (диссоциация контактов спираль-спираль, уменьшение изгибов ТМ спиралей) и (3) увеличением подвижности основной цепи МБ в пс-нс временном диапазоне. Тем не менее, в «расплавленном» состоянии сохраняется компактная упаковка домена и, до некоторой степени, взаимная ориентация ТМ спиралей. Вероятно, «расплавленное» состояние ПЧД-КуАР отличается от денатурированного состояния МБ. наблюдаемого в жестких детергентах. Так, например, согласно данным ЭПР-спектроскопии, солюбилизация бактериородопсина в БЭЭ приводит к полному разрушению третичной структуры МБ (КпвИпатат е1 а1, 2012). Ранее состояние «расплавленной глобулы» для молекул МБ описано не было.

Тот факт, что инкапсуляция ПЧД-КуАР в ЛБН. содержащие анионные липиды (ЭМРО и РОРС/ООРО), не приводит к «плавлению» структуры домена, позволяет сделать предположения о возможных механизмах этого процесса. Связка из четырех спиралей, образующая ПЧД-КуАР, стабилизирована электростатическими взаимодействиями между заряженными боковыми цепями (например, Азр62-А^133, С1и45-А!£126 и 01и107-А^123, Рис. 22Ж). Вероятно, заряженные головки анионных детергентов конкурируют с отрицательно заряженными боковыми цепями белка при образовании солевых мостиков, что и приводит к частичной «денатурации» третичной структуры. Подобный процесс не возможен в бислое, содержащем анионные липиды. так как полужесткая двумерная «матрица» мембраны эффективно предотвращает контакты между полярными головками липидов и заряженными боковыми цепями из середины 1 М спиралей МБ. Таким образом, внутримолекулярные электростатические взаимодействия и двумерная упаковка липидного бислоя играют важную роль в стабилизации «нативной» структуры ПЧД.

Полученные результаты характеризуют влияние различных мембраномоделирующих сред на структуру и динамику МБ и демонстрируют преимущества ЛБН, которые, в отличие от сред на основе детергентов, позволяют исследовать зависимость структуры и динамики МБ от свойств липидных молекул (заряд полярных головок, длина и степень насыщенности жирнокислотных цепей и т.д.), формирующих бислой, а также изучать МБ в окружении, близком к нативному. В связи с этим следует отметить, что нативное окружение канала KvAP, мембрана археи Aeropyrum pernix, содержит преимущественно анионные липиды (Morii et al, 1999). Полученные данные также иллюстрируют тот факт, что ЯМР-спектры хорошего качества не всегда соответствуют «нативной» конформации МБ и указывают на необходимость осторожного применения лизо-фосфатидилглицеролов в качестве компонент мембраномоделирующих сред.

5.4 Формирование «нативной» пространственной структуры ПЧД-KvAP из «расплавленного» состояния (фолдинг in vitro)

Для исследования механизмов формирования «нативной» пространственной структуры ПЧД из «расплавленного» состояния образец домена в мицеллах LPPG титровали детергентом DPC (Рис. 24А). Относительное содержание двух форм белка оценивали по интенсивности характеристических кросс-пиков в 2D 'Н-'^-спектрах. При относительной молярной концентрации LPPG (%и>Р0) < 0.7 наблюдали смесь «нативной» и «расплавленной» формы с характерным временем обмена между ними более 20 мс. При ZLPPG ~ 0.55 заселенность двух состояний была примерно одинакова, а при xLPPG < 0.4 в спектрах в основном наблюдались сигналы «нативного» состояния. Таким образом, переход между «расплавленным» и «нативным» состояниями ПЧД обратим, и изменение свойств мембраномоделирующего окружения вызывает самопроизвольный фолдинг домена. Анализ полученной кривой позволил установить, что свободная энергия процесса фолдинга ПЧД в отсутствие денатурирующего детергента (AGf°) равна -8.4 ± 1.4 ккал/М. «Расплавленное» состояние может выступать в роли одного из интермедиатов процесса фолдинга МБ in vitro (перехода белка из денатурированного в структурированное состояние) и. возможно, играет роль так называемого «ядра фолдинга» (Booth et al, 2012). 1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

о.о

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 295 300 305 310 315 320

xlppg = [LPPG]/([LPPG]+[DPC]) T, К

Рис. 24. (А) Относительное содержание «расплавленной» формы ПЧД-KvAP при уменьшении концентрации LPPG в образце. (Б) Зависимость свободной энергии (ДО].) процесса фолдинга от температуры и модель формирования «нативной» структуры ПЧД-KvAP из «расплавленного» состояния.

Спектры ПЧД, полученные при xLPP° ~ 0.55, показали, что доля «нативного» состояния растет с увеличением температуры («эндотермический фолдинг»). Анализ температурной зависимости позволил оценить величину энтальпийного и энтропийного вклада в свободную энергию (AGF = АН - T AS) процесса фолдинга (Рис. 24Б). Как оказалось, фолдинг ПЧД-KvAP сопровождается увеличением энтальпии и энтропии

7Г

Содержание "расплавленной' формы ПЧД-KvAP (рН 7.0, 318К)

AGF = AGF° + mF-Xl-PPG AGf° = -8.4 ± 1.4 ккал/М mF= +14.8 ± 2.4 ккал/М

системы и при комнатной температуре энтальпийный и энтропийный вклады в AGF имеют сравнимую величину (+40 ±2 ккал/М). Рост энтальпии системы при формировании «нативной» структуры ПЧД-KvAP, вероятно, связан с разрушением энергетически благоприятных контактов домена с молекулами детергента, которые стабилизируют «расплавленное» состояние. В свою очередь высвобождение этих «лишних» молекул детергента в раствор (в форме мицелл) приводит к увеличению энтропии системы (Рис. 24Б). Можно предположить, что дальнейшее повышение температуры системы будет приводить к дальнейшему переходу связанных с МБ молекул детергента в раствор и к формированию агрегатов белка, стабилизированных гидрофобными контактами между спиральными регионами.

Полученные результаты иллюстрируют отличия в структурной организации МБ от глобулярных белков. В случае водорастворимых молекул процессы фолдинга обычно идут с понижением энтропии и энтальпии системы («экзотермический фолдинг»).

5.5 Взаимодействие токсина VSTxl с ПЧД-KvAP в мицеллах и нанодисках

Токсин VSTxl (заряд +3, 3 дисульфидные связи, Рис. 25) ингибирует потенциалозависимую активацию К+-каналов. Хотя точный механизм действия токсина не известен, предполагается, что VSTxl взаимодействует с ПЧД канала KvAP со стороны липидного бислоя (Lee et al, 2004) и при деполяризации мембраны блокирует домен в «активированном» состоянии (наблюдается при значениях ТМ потенциала близких к нулю), тем самым приводя к инактивации канала (Schmidt et al, 2009).

ECGKFMWK KNSNDCCKDLVCSSRWKWiVLASPF

H=c>-—I—C>-

10 15 20 25 [ЛБН] или [MSP]/2, mkM

ЛБН/РОРС

ЛБН/POPC/DOPG (3:1)

MSPx2

DPC/LDAO (2:1)

равновесное распределение

Кр(ЛБН. MSPx2J

xK/'M'1

0.39±0.02

2.68±0.24

0.10±0.01

Kp (липиды) xlO5 [vT1

2.6±0.2

I7.8±1.6

0.058±0.003

изотерма Ленгмюра

<106 M"1

0.06±0.01

0.13±0.02

0.05±0.02

9.6±1.5

34.5±3.9

3.2±0.9

K26

Рис. 25. (Вверху). Изотермы связывания VSTxl с ЛБН и MSP аппроксимированы уравнением Ленгмюра (сплошные линии) и уравнением равновесного распределения (пунктирные линии), параметры приведены в таблице. (Внизу). Топология взаимодействия токсина VSTxl (PDB код 1S6X) с мицеллой DPC/LDAO (2:1). Поверхность мицеллы показана пунктиром. Значение коэффициента равновесного распределения, описывающего это взаимодействие (Кр). приведено в таблице.

Титрование образца токсина растворами нанодисков различного липидного состава позволило оценить энергетику образования комплексов VSTxl/ЛБН. Токсин эффективно взаимодействовал с ЛБН, содержащими анионные липиды (POPC/DOPG 3:1), и с меньшей эффективностью образовывал комплексы с нанодисками на основе цвиттер-ионного липида РОРС (Рис. 25). Кроме того, наблюдалось слабое взаимодействие токсина

с белком MSP (заряд -6). Анализ данных с использованием изотермы Ленгмюра показал, что VSTx 1 имеет примерно одинаковую аффинность к сайтам на поверхности различных нанодисков и к молекуле MSP (параметр Кп), однако число сайтов связывания (и) значительно отличается. Так, ЛБН/РОРС может связать до 10 молекул токсина, а добавление в мембрану ЛБЫ отрицательно заряженных липидов увеличивает число сайтов связывания до 35 (~ 4 липида на токсин). Кроме того, каждая молекула MSP (в отсутствие фосфолипидов) способна связать до 1.6 молекул токсина, что ведет к практически полной компенсации заряда аполипопротеина.

Анализ данных ЯМР показал, что VSTxl очень слабо взаимодействует с мицеллами DPC/LDAO (2:1), содержащими смесь цвиттер-ионного и катионного детергентов (Табл. Рис. 25), но при этом имеет высокое сродство к анионным мицеллам LPPG (точный анализ энергетики взаимодействия невозможен). VSTxl связывается с мицеллой DPC/LDAO гидрофобным участком, включающим кластер ароматических и алифатических остатков (Рис. 25), и при образовании комплекса конформация основной цепи пептида не меняется. Положительно заряженные боковые цепи токсина (Lys4, Lys8, Arg24 и Lys26) проникают вглубь или контактируют с поверхностью мицеллы. Таким образом, пространственная структура VSTxl стабилизирована внутримолекулярными взаимодействиями, а за образование комплекса пептид/мембрана ответственны как электростатические, так и гидрофобные взаимодействия с липидами.

Титрование образцов l5N-n4fl-KvAP и 15N-VSTxl растворами немеченого токсина и немеченого домена, соответственно, позволило картировать сайты связывания взаимодействующих молекул в окружении мицелл DPC/LDAO. Наибольшие изменения химических сдвигов и амплитуд сигналов ЯМР детектировались на двух участках ПЧД-KvAP: в области петли S1-S2 и в области межспиральных контактов. Кроме того, наблюдалось значительное ослабление сигнала His 109 из спирали S3b, принадлежащей «потенциалочувствительной лопасти» (Рис. 26А). На молекуле токсина наибольшие изменения наблюдались на двух погруженных в мицеллу участках: петле Phe5-Lys8 и фрагменте (З-шпильки, включающем С-концевой участок токсина Ser22-Phe34 (Рис. 26А, ITN сигнал Lys4 в спектрах не наблюдался). Данные, полученные для вариантов ПЧД-KvAP, спин-меченных по остаткам 112 (петля S3b-S4) и 56 (петля S1-S2), позволили установить взаимную ориентацию молекул токсина и домена. При образовании комплекса петлевой участок Phe5-Lys8 молекулы VSTxl контактирует с петлей S1-S2 ПЧД-KvAP, а Р-шпилька и С-концевой участок токсина направлены в сторону «потенциалочувствительной лопасти» S3b-S4. Суммируя полученные результаты, можно предположить, что VSTxl при взаимодействии с ПЧД-KvAP образует комплекс с участком S1-S2 домена. Этот комплекс стабилизирован электростатическими взаимодействиями между остатками Lys4/Lys8 VSTxl и Glu53/Glu45 ПЧД-KvAP. При этом молекула токсина блокирует спираль S3b, тем самым ограничивая перемещение ковалентно связанного с ней «датчика потенциала» (спираль S4) при активации. Во взаимодействии VSTxl/S3b, вероятно, участвует солевой мостик между остатками Arg24/Lys26 токсина и Glul07 ПЧД-KvAP. Пространственная сближенность молекулы токсина со спиралью S3b согласуется с данными мутагенеза (Alabi et al, 2007). Участие ароматических и алифатических остатков VSTxl в формировании интерфейса взаимодействия с ПЧД указывает на возможное вовлечение гидрофобных взаимодействий в стабилизацию комплекса токсин/домен.

Рис. 26. (А) Молекулы ПЧД-К.уАР и У8Тх1 (РОВ коды ЮЯБ и 156Х) окрашены в соответствии с данными ЯМР, характеризующими образование комплекса домен/токсин в окружении мицелл ОРС/ЬЭАО (2:1. рН 5.0). Возможные границы поверхности мембраны (мицеллы) показаны пунктиром. Цветными стрелками схематически показан эффект парамагнитного усиления релаксации для НМ-групп У5Тх1 в присутствии спин-меченых вариантов ПЧД. (Б) Специфическое и неспецифическое взаимодействие ПЧД-КуАР/УБТх! в окружении ЛБН/РОРС/ООРС (3:1, рН 7.0). Зависимости интенсивности сигнала НЫ 5ег51 (специфический сайт связывания У5Тх1) и химического сдвига ''Ы11 Argl 17 (неспецифический сайт) от молярного соотношения У8Тх1/ПЧД-К.уАР аппроксимированы моделями с различным числом неспецифических сайтов связывания (сплошные линии Л'=1, пунктир Ы= 3).

Данные ЯМР также указали на наличие неспецифических взаимодействий между У8Тх1 и ПЧД-КуАР в окружении мицелл ЭРС/ЬЭЛО. Однако из-за низкого сродства к мицеллам сравнительный анализ энергетики специфических и неспецифических взаимодействий был невозможен. Исследование взаимодействия ПЧД-КуАР/У8Тх1 в окружении ЛБН/РОРС/ООРС (Рис. 26Б) позволило провести более детальный анализ. Как оказалось, константа взаимодействия со специфическим сайтом, локализованным на петлевом участке 51-82, в 50 раз меньше константы для неспецифического сайта(ов) (разница свободных энергий АО ~ 2.4 ккал/М). Несмотря на сравнительно большое сродство токсина к мицеллам ЬРРв, специфическое взаимодействие ПЧД-КуАР/У8Тх1 в этой среде не наблюдалось, что подтвердило вывод о «ненативной» пространственной

организации домена в мицеллах анионных детергентов.

В работе впервые были получены прямые структурные данные о локализации специфического сайта связывания токсинов паукообразных на ПЧД К4-каналов, и предложен механизм влияния «вольт-сенсорных» токсинов на процесс потенциалозависимой активации. Одним из важных этапов в действии У5'Гх1 является его начальное связывание с интерфейсом фосфолипидной мембраны, окружающей канал. Это придает молекуле токсина ориентацию, необходимую для эффективного взаимодействия с участками ПЧД, погруженными в мембрану.

6 Заключение. Обсуждение результатов

В работе в окружении различных мембраномоделирующих сред проведено исследование пространственной структуры мембраноактивных пептидов нескольких семейств (гидрофобные антибиотики, антимикробные пептиды, мембраноактивные нейротоксины). Полученные результаты позволили описать возможные изменения в конформации и динамике пептидов, возникающие при образовании комплекса с мембраной, и, таким образом, охарактеризовать роль различных внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействий в стабилизации «нативной/активной» пространственной структуры и мембранной активности этих молекул. Кроме того, результаты, полученные в работе, позволили сделать предположение о роли внутримолекулярной динамики пептидов в их мембранной активности.

Структуры некоторых из изученных пептидов (КВ1, КВ7, аурелин, VSTxl и NTII) являются жесткими и практически не меняются при взаимодействии с модельной мембраной. Полученные данные указывают на то, что эти молекулы стабилизированы в основном ковалентными взаимодействиями (дисульфидные связи, циклизация основной цепи), а также внутримолекулярными электростатическими (водородные связи, солевые мостики) и ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями. Преимущественная локализация гидрофобных остатков в отдельных областях на поверхности этих пептидов указывает на то, что гидрофобные взаимодействия, включая межмолекулярные взаимодействия с липидами, не вносят большого вклада в стабилизацию пространственной структуры, однако эти взаимодействия играют важную роль при формировании комплекса пептид/мембрана. Внутримолекулярная динамика, вероятно, не оказывает выраженного влияния на функцию «жестких» МП. Напротив, данные, полученные для Р-структурного антимикробного пептида ареницина-2 и спирального антибиотика пептаибола Aam-I, указывают на существенную роль конформационной подвижности в функционировании этих молекул и на значительный вклад межмолекулярных взаимодействий пептид/липид в формирование «нативной/активной» пространственной структуры.

На примере аурелина и ареницина-2 показано, что именно электростатические взаимодействия определяют селективность начального связывания и возможную дальнейшую олигомеризацию катионных МП в отрицательно заряженном бислое, моделирующем мембраны бактериальных клеток. Примеры VSTxl и NTI1 также указали на большую роль электростатических взаимодействий в связывании катионных нейротоксинов с мембраной. В то же время в случае пептидов, не обладающих большим положительным зарядом, таких как циклотиды КВ1 и КВ7 и пептаиболы Aam-I и Zrv-II, основным детерминантом мембранной активности являются гидрофобные взаимодействия. Эти взаимодействия также могут оказывать значительное влияние на топологию комплекса пептид-мембрана и в случае заряженных МП, например, обуславливая ТМ ориентацию димера ареницина.

Сопоставляя результаты исследования Aam-l и ареницина-2, можно выдвинуть предположение, что конформационная подвижность представляет собой дополнительное свойство, которое наряду с другими факторами (гидрофобность, амфифильность, заряд) определяет мембранную активность антибиотических МП и позволяет сдвигать профиль их активности от клеток организма-продуцента к чужеродным клеткам. Возможно, именно энтропийный вклад (-TxAS) в свободную энергию, связанный с уменьшением внутримолекулярной подвижности пептида при связывании с мембраной, предотвращает

взаимодействие ареницина, содержащего значительную долю гидрофобных остатков, с незаряженными мембранами эукариотических клеток. В случае Ааш-1 высокая конформационная подвижность затрудняет как начальное связывание пептида с мембраной, так и последующие процессы (поро)каналообразования, что приводит к ослаблению антибиотической активности Ааш-1 на порядок по сравнению с гомологичным, но «стабильным» пептидом Zrv-IIB. С другой стороны, в функционировании лантибиотика лихеницидина высокая внутримолекулярная подвижность пептида Lcha играет совершенно иную роль, и, вероятно, служит для изменения взаимной ориентации двух рецепторных доменов, соединенных гибким шарнирным участком.

Результаты исследования лихеницидина и циклотидов показывают неправомерность широко распространенной концепции, описывающей действие мембраноактивных пептидов только в рамках неспецифических взаимодействий пептид/мембрана. Так, в Lcha и KB 1/7 были выявлены сайты, ответственные за специфическое взаимодействие с липидом II (важнейшим компонентом биосинтеза клеточной стенки грамположительных бактерий) и двухвалентными катионами, соответственно. Эти сайты важны для биологической активности пептидов. Исследование взаимодействия NTII с нанодисками, содержащими фосфатидилсерин, также подтвердило возможное участие специфических взаимодействий с липидами мембран в функционировании нейротоксинов, действующих на мембранные рецепторы. С точки зрения роли специфических взаимодействий в функционировании МП наиболее интересным результатом работы являются данные, полученные для аурелина. Этот пептид одновременно обладает свойствами катионного антимикробного пептида, неспецифически действующего на мембраны, содержащие анионные липиды, и токсина-блокатора, способного взаимодействовать с поровым доменом К+-каналов благодаря высокоспецифическим межмолекулярным взаимодействиям. Подобный дуализм свойств не является уникальным и ранее был описан для дефензина сапецина В (Shimoda et al, 1994) и блокатора К+-каналов карибдотоксина (Yount et al, 2004). Совпадение некоторых биофизических характеристик у молекул антимикробных МП и токсинов-блокаторов указывает на возможное отсутствие четкой границы между этими двумя типами защитных молекул.

Результаты исследования потенциалочувствительного домена канала KvAP указали на важную роль внутримолекулярной динамики в функционировании рецепторных МБ. Так, в молекуле домена впервые для МБ наблюдали «медленные» (мкс-мс) межспиральные движения. Эти движения отражают конформационную нестабильность, свойственную структуре домена, и, возможно, являются прообразом высокоамплитудных конформационных перестроек, происходящих в ПЧД при изменении ТМ потенциала. Полученные структурно-динамические данные согласуются с концепцией «сфокусированного электрического поля» и с моделью, в которой переход ПЧД из состояния покоя в «активированное» состояние сопровождается скользящим движением сравнительно стабильной спиральной шпильки S3b-S4 («потенциалочувствительная лопасть») относительно спиралей SI и S2 (Long et al, 2007). Кроме того, исследование взаимодействия ПЧД-KvAP с токсином VSTxl показало, что для модуляции процесса потенциалозависимой активации ПЧД не требуется прямого контакта между молекулой токсина и «датчиком потенциала», - спиралью S4. Согласно полученным данным, токсин встраивается в интерфейсный регион липидного бислоя и из этого состояния связывается

с участком S1-S2 домена. Токсин оказывает свое блокирующее действие, препятствуя движению спирали S3b, ковалентно присоединенной к спирали S4. Полученные данные согласуются с результатами мутагенеза (Alabi et al, 2007), но в то же время меняют существующую концепцию действия «вольт-сенсорных» токсинов, предполагающую прямое взаимодействие токсина с «датчиком потенциала» спиралью S4 ПЧД.

Исследование ПЧД-KvAP в окружении анионных мицелл лизо-фосфатидилглицерола LPPG выявило ключевую роль электростатических взаимодействий (внутримолекулярных солевых мостиков) в стабилизации «нативной» структуры домена. Взаимодействие отрицательно заряженных групп детергента с положительно заряженными группами белка вызывает разрушение солевых мостиков и приводит к частичной «денатурации» («плавлению») пространственной структуры ПЧД-KvAP. Полученные данные подчеркивают принципиальные отличия пространственной организации мембранных белков от глобулярных, в стабилизации структуры которых существенную роль играют гидрофобные и ван-дер-ваальсовые взаимодействия в гидрофобном ядре. Проведенные исследования впервые позволили охарактеризовать состояние спирального МБ, которое по своим свойствам напоминает состояние «расплавленной глобулы» водорастворимых белков. Это состояние характеризуется значительным увеличением внутримолекулярной подвижности основной цепи белка в пс-нс диапазоне, что, вероятно, напрямую связано с разрушением третичных (межспиральных) контактов. Наблюдаемые обратимые переходы между «нативным» и «расплавленным» состояниями ПЧД-KvAP, вызванные изменением свойств мембраномоделирующей среды, указывают на то, что «расплавленное» состояние может выступать в роли одного из интермедиатов процесса фолдинга МБ in vitro (перехода белка из денатурированного в структурированное состояние). Отсутствие эффекта «плавления» ПЧД-KvAP в мембранах, содержащих анионные липиды, иллюстрирует важную роль двумерной упаковки липидного бислоя в стабилизации пространственной структуры спиральных МБ. Возможно, именно «рыхлая» структура бицелл и мицелл обуславливает низкую стабильность МБ в мембраномоделирующих средах на основе детергентов. Изучение температурной зависимости процесса фолдинга ПЧД-KvAP из «расплавленного» состояния показало, что в отличие от глобулярных белков формирование «нативной» структуры МБ в окружении мицелл детергентов сопровождается увеличением энтальпии и энтропии системы и является эндотермическим процессом. Рост энтропии системы в ходе фолдинга МБ, вероятно, связан с уменьшением количества молекул детергента, необходимых для солюбилизации «нативного» состояния МБ по сравнению с «расплавленным». Полученные данные согласуются с результатами исследования температурной зависимости процесса димеризации ТМ спиралей в детергент-содержащих средах (Mineev et al, 2014).

Результаты, полученные в работе, позволили сформулировать рекомендации по выбору оптимальных мембраномоделирующих сред для ЯМР-исследований МБ и МП. Так, на примере Zrv-IIB показано, что для исследования конформационно «жестких» МП могут использоваться различные среды, включая изотропные растворители. В то же время исследование конформационно подвижных молекул, например, Aam-I и ПЧД-KvAP, требует тщательной оптимизации состава детергент-содержащей среды или фосфолипидного состава мембраны нанодисков. Неправильный выбор среды может приводить к «ненативным» структурно-динамическим состояниям, таким как равновесие

между право- и левозакрученной спиральной конформацией, обнаруженное для Aam-I в метаноле, или «расплавленное» состояние ПЧД-KvAP, наблюдаемое в мицеллах LPPG. Данные, полученные для катионных МП ареницина и аурелина, выявили недостатки, свойственные детергент-содержащим средам. Эти пептиды не взаимодействовали с мембранами, содержащими цвиттер-ионные фосфолипиды, и в то же время образовывали комплексы с мицеллами цвиттер-ионных детергентов. Вероятно, мицеллы способны удовлетворительно моделировать только гидрофобную составляющую взаимодействия пептид/мембрана, а использование детергентов различного заряда для моделирования электростатической компоненты этого взаимодействия может приводить к недостоверным результатам.

Многие из выше перечисленных результатов не могли бы быть получены без применения новой мембраномоделирующей среды, — липид-белковых нанодисков. В работе впервые показана возможность применения ЛБН для структурно-динамических ЯМР-исследований МБ и МП. Полученные данные продемонстрировали большой исследовательский потенциал применения ЛБН, позволяющих изучать такие состояния мембранных биомолекул, которые не доступны для исследования в средах на основе детергентов. Например, только использование ЛБН позволило впервые методами ЯМР-спектроскопии высокого разрешения наблюдать динамические переходы между поверхностносвязанным и ТМ состояниями спирального пептида (Aam-I), вызванные изменением гидрофобной толщины бислоя. Из-за особенностей строения подобные переходы невозможно наблюдать в мицеллах и бицеллах, содержащих детергенты. Возможность использования для формирования ЛБН различных липидов и их смесей, а также подходы применения ЛБН, развитые в диссертационной работе, открывают новые перспективы для структурно-функциональных исследований мембранных биомолекул с атомным разрешением в практически нативном окружении.

ВЫВОДЫ

1. Для структурно-динамических исследований МБ и МП методами ЯМР высокого разрешения предложена новая мембраномоделирующая среда, — липид-белковые нанодиски, которая позволяет изучать «нативное» состояние мембранных биомолекул, что не всегда возможно в средах на основе детергентов. Показано, что инкапсуляция денатурированных МБ в нанодиски вызывает самопроизвольный фолдинг белка, и эффективность этого процесса зависит от липидного состава мембраны нанодиска.

2. Исследована структура и динамика ряда МП, принадлежащих трем классам: гидрофобные антибиотики, антимикробные пептиды и нейротоксины. Показано, что эффективность образования и топология комплекса пептид-мембрана, а также олигомеризация МП в мембраноподобном окружении зависят как от гидрофобных и электростатических взаимодействий МП с липидами, так и от конформационной подвижности пептидов, что требует учета совокупности структурно-динамических факторов для описания конформации и механизма действия МП.

3. Показано, что гомологичные спиральные антибиотики Aam-I и Zrv-IIB обладают разными динамическими характеристиками. Предложена модель мембранной активности Aam-I и Zrv-IIB, включающая образование пор, состоящих из спиральных мономеров пептидов. Повышенная конформационная подвижность Aam-I значительно ослабляет начальное присоединение пептида к мембране и последующие процессы порообразования.

4. Показано, что конформация и динамика Р-структурного МП ареницина-2, стабилизированного дисульфидными связями, может значительно меняться при взаимодействии с мембраной. Определена пространственная структура димера ареницина-2 в мембраноподобном окружении и предложена модель мембранной активности, включающая образование смешанных пептид/липидных пор, основным структурным элементом которых является Р-структурный димер ареницина.

5. Показано, что важную роль в мембранной активности и антибиотическом действии двухкомпонентного лантибиотика лихеницидина и циклотидов КВ1 и КВ7 играют специфические взаимодействия конкретных функциональных групп МП с липидными мишенями и двухвалентными катионами, соответственно.

6. Показано, что аурелин одновременно обладает свойствами антимикробного МП, неспецифически действующего на мембраны, и специфического токсина, блокирующего К+-каналы.

7. Показано, что важную роль в стабилизации «нативной» конформации ПЧД-KvAP играют внутримолекулярные электростатические взаимодействия (солевые мостики) и двумерная упаковка липидного бислоя, окружающего домен. В «нативном» состоянии, соответствующем структуре домена в открытом состоянии канала, обнаружены «медленные» (мкс-мс) движения спиралей ПЧД, - прообраз высокоамплитудных перестроек, происходящих при потенциалозависимой активации.

8. Для ПЧД. описано состояние, сходное с состоянием «расплавленной глобулы» водорастворимых белков, возможно, являющееся одним из интермедиаТов процесса фолдинга МБ in vitro. «Расплавленное» состояние характеризуется компактной упаковкой, небольшими изменениями вторичной структуры, частичным разрушением третичной структуры и увеличением подвижности основной цепи МБ в пс-нс временном диапазоне. Показано, что в отличие от глобулярных белков формирование «нативной» структуры МБ в детергент-содержащих средах может сопровождаться увеличением энтальпии и энтропии системы.

9. Предложен механизм молекулярного действия токсина VSTxl, влияющего на потенциалозависимую активацию К+-каналов. Показано, что токсин связывается с интерфейсным регионом липидного бислоя и впоследствии образует комплекс с петлевыми участками ПЧД-KvAP. Связанная молекула токсина блокирует активацию ПЧД, не образуя прямых контактов с «датчиком потенциала» спиралью S4.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Balashova T.A., Shenkarev Z.O., Tagaev А.А., Ovchinnikova T.V., Raap J., Arseniev A.S. "NMR Structure of the channel-former Zervamicin IIB in isotropic solvents." FEBS Letters (2000) 466:333-336.

2. Shenkarev Z.O., Balashova T.A., Efremov R.G., Yakimenko Z.A., Ovchinnikova T.V., Raap J., Arseniev A.S. "Spatial Structure of Zervamicin IIB Bound to DPC Micelles: Implications for Voltage-Gating" Biophysical Journal (2002) 82:762-771.

3. Складнев Д.А., Рогожкина E.A., Кондакова E.B., Швец В.И., Свищева Н.В., Якименко З.А. , Шенкарев З.О., Овчинникова Т.В., Раап Я. "Получение изотопно модифицированного 13C+15N пептидного антибиотика зервамицина ИВ" Биотехнология (2002) 5:32-40.

4. Ovchinnikova T.V., Shenkarev Z.O., Yakimenko Z.A., Svishcheva N.V., Tagaev A.A., Skladnev D.A., Arseniev A.S. "Biosynthetic Uniform 13C,'5N-Labelling of Zervamicin IIB. Complété 13C and 15N NMR Assignment" J. Peptide Sci. (2003) 9:817-826.

5. Shenkarev Z.O., Balashova T.A., Yakimenko Z.A., Ovchinnikova T.V., Arseniev A.S. "Peptaibol

Zervamicin IIB Structure and Dynamics Refinement from Transhydrogen Bond J Couplings" Biophysical Journal (2004) 86:3687-3699.

6. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Balashova T.A., Yakimenko Z.A., Baru M.B., Mustaeva L.G., Raap J., Ovchinnikova T.V., Arseniev A.S. "High stability of the hinge region in the membrane-active peptide helix of zervamicin: paramagnetic relaxation enhancement studies" Biochem. Biophys. Res. Commun. (2004) 325:1099-1105.

7. Shenkarev Z.O., Nadezhdin K.D., Sobol V.A., Sobol A.G., Skjeldal L., Arseniev A.S. "Conformation and mode of membrane interaction in cyclotides. Spatial structure of kalata B1 bound to a dodecylphosphocholine micelle" FEBS Journal (2006), 273:2658-2672.

8. Ovchinnikova T.V., Shenkarev Z.O., Nadezhdin K.D., Balandin S.V., Zhmak M.N., Kudelina I.A., Finkina E.I., Kokiyakov V.N., Arseniev A.S. "Recombinant expression, synthesis, purification, and solution structure of arenicin "Biochem. Biophys. Res. Commun. (2007) 360:156-162.

9. Ovchinnikova T.V., Shenkarev Z.O., Balandin S.V., Nadezhdin K.D., Paramonov A.S., Kokiyakov V.N., Arseniev A.S. "Molecular insight into mechanism of antimicrobial action of the beta-hairpin peptide arenicin: Specific oligomerization in detergent micelles" Biopolymers (2008) 89:455-464.

10. Shenkarev Z.O., Nadezhdin K.D., Lyukmanova E.N., Sobol V.A., Skjeldal L., Arseniev A.S. "Divalent cation coordination and mode of membrane interaction in cyclotides. NMR spatial structure of ternary complex kalata B7/Mn2+/DPC micelle" J. Inorg. Biochem. (2008) 102:1246-1256.

11. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Sobol A.G., Ovchinnikova T.V., Chupin V.V., Kirpichnikov M.P., Blommers M., Arseniev A.S. "Lipid-Protein Nanoscale Bilayers: a Versatile Medium for NMR Investigations of Membrane Proteins and Membrane-active peptides" J.Am.Chem.Soc. (2008)130:2140-2141.

12. Stavrakoudis A., Tsoulos I.G., Shenkarev Z.O., Ovchinnikova T.V. "Molecular dynamics simulation of antimicrobial peptide arenicin-2: ß-hairpin stabilization by noncovalent interactions" Biopolymers (2009) 92:143-155.

13. Шенкарев 3.O., Люкманова E.H., Соложенкин О.И., Гагнидзе И.Э., Некрасова О.В., Чупин В.В., Тагаев A.A., Якименко З.А., Овчинникова Т.В., Кирпичников М.П., Арсеньев A.C. "Липид-белковые нанодиски: возможность применения для ЯМР-исследований мембранных белков и мембраноактивных пептидов" Биохимия (2009) 74:933-945.

14. Shenkarev Z.O., Lyukmanova E.N., Paramonov A.S., Shingarova L.N., Chupin V.V., Kirpichnikov M.P., Blommers M.J.J., Arseniev A.S. "Lipid-Protein Nanodiscs as Reference Medium in Detergent Screening for High-Resolution NMR Studies of Integral Membrane Proteins" J.Am.Chem.Soc. (2010) 132:5628-5629.

15. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Lyukmanova E.N., Shingarova L.N., Yakimov S.A., Dubinny M.A., Chupin V.V., Kirpichnikov M.P., Blommers M.J.J., Arseniev A.S. "NMR Structural and Dynamic Investigation of the Isolated Voltage-Sensing Domain of the potassium channel KvAP: Implications for Voltage-Gating" J.Am.Chem.Soc. (2010) 132:5630-5637.

16. Shenkarev Z.O., Finkina E.I., Nurmukhamedova E.K., Balandin S.V., Mineev K.S., Nadezhdin K.D., Yakimenko Z.A., Tagaev A.A., Temirov Y.V., Arseniev A.S., Ovchinnikova T.V. "Isolation, structure elucidation, and synergistic antibacterial activity of a novel two-component lantibiotic lichenicidin from Bacillus licheniformis VK21" Biochemistry (2010) 49:6462-6472.

17. Хабибуллина Н.Ф., Люкманова E.H., Копеина Г.С., Шенкарев З.О., Арсеньев A.C., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. "Разработка и оптимизация сопряженной бесклеточной системы синтеза трансмембранного домена рецепторной тирозинкиназы ЕгЬВЗ" Биоорг. химия (2010) 36: 654-660.

18. Shenkarev Z.O., Balandin S.V., Trunov K.I., Paramonov A.S., Sukhanov S.V., Barsukov L.I., Arseniev A.S., Ovchinnikova T.V. "Molecular Mechanism of Action of ß-Hairpin Antimicrobial Peptide Arenicin: Oligomeric Structure in Dodecylphosphocholine Micelles and Pore Formation in Planar Lipid Bilayers. Biochemistry (2011) 50:6255-6265.

19. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Khabibullina N.F., Kopeina G.S., Shulepko M.A., Paramonov A.S., Mineev K.S., Tikhonov R.V., Shingarova L.N., Petrovskaya L.E., Dolgikh D.A., Arseniev A.S., Kirpichnikov M.P. "Lipid-protein nanodiscs for cell-free production of integral membrane proteins in a soluble and folded state: comparison with detergent micelles, bicelles and liposomes"

Biochim.Biophys.Acta (2012) 1818:349-358.

20. Shenkarev Z.O., Panteleev P.V., Balandin S.V., Gizatullina A.K., Altukhov D.A., Finkina E.I., Kokryakov V.N., Arseniev A.S., Ovchinnikova T.V. "Recombinant expression and solution structure of antimicrobial peptide aurelin from jellyfish Aurelia aurita" Biochem. Biophys. Res. Commun. (2012) 429:63-69.

21. Shenkarev Z.O., Lyukmanova E.N., Butenko I.O., Petrovskaya L.E., Paramonov A.S., Shulepko M.A., Nekrasova O.V., Kirpichnikov M.P., Arseniev A.S. "Lipid-protein nanodiscs promote in vitro folding of transmembrane domains of multi-helical and multimeric membrane proteins" Biochim. Biophys. Acta (2013) 1828:776-784.

22. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Lyukmanova E.N., Gizatullina A.K., Zhuravleva A.V., Tagaev

A.A., Yakimenko Z.A., Telezhinskaya I.N., Kirpichnikov M.P., Ovchinnikova T.V., Arseniev A.S. "Peptaibol Antiamoebin I Spatial Structure, Backbone Dynamics, Interaction with Bicelles and Lipid-Protein Nanodiscs, and Pore Formation in Context of Barrel-Stave Model" Chem Biodivers. (2013) 10:838-863.

23. Шенкарев 3.O., Люкманова E.H., Парамонов A.C., Пантелеев П.В., Баландин С.В., Шулепко М.А., Минеев К.С., Овчинникова Т.В., Кирпичников М.П., Арсеньев А.С. "Липид-белковые нанодиски: новые возможности для структурно-функциональных исследований водорастворимых мембраноактивных пептидов" Acta naturae (2014) 6:68-78.

Главы из книг:

24. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Nadezhdin K.D., Bocharov E.V., Kudelina 1.А., Skladnev D.A., Tagaev A.A., Yakimenko Z.A., Ovchinnikova T.V., Arseniev A.S. "Antiamoebin I in methanol solution: rapid exchange between right-handed and left-handed Зю-helical conformations" Peptaibiotics: Fungal Peptides Containing a-Dialkyl a-Amino Acids. C. Toniolo, H. Bruckner (Eds.) 401-424 (также опубликовано в Chem Biodivers. (2007) 4:1219-1242).

Патенты и патентные заявки:

25. Овчинникова Т.В., Арсеньев А.С., Баландин С.В., Нурмухамедова Э.К., Тагаев А.А., Темиров Ю.В., Финкина Е.И., Шенкарев З.О., Якименко З.А. Пептид LanAl, выделенный из бактерии Bacillus licheniformis VK21, обладающий антимикробным действием // Патент РФ № 2408732 от 16.08.2010.

26. Овчинникова Т.В., Арсеньев А.С., Баландин С.В., Нурмухамедова Э.К., Тагаев А.А., Темиров Ю.В., Финкина Е.И., Шенкарев З.О., Якименко З.А. Пептид LanA2, выделенный из бактерии Bacillus licheniformis VK21, обладающий антимикробным действием // Патент РФ №2408604 от 12.08.2010.

27. Люкманова Е.Н., Шенкарев З.О., Кирпичников М.П., Арсеньев А.С. Способ ренатурации мембранных белков // Патент РФ № 2500684 от 02.08.2013.

Тезисы основных докладов на международных конференциях:

28. Shenkarev Z.O., Balashova Т.А., Arseniev A.S. "NMR Structure of the channel-former Zervamicin IIB in isotropic solvents and DPC micelles: possible mechanism of voltage activation." Open Russian-Swedish Conference "NMR in Protein-Protein and Protein-DNA Recognition". Москва, 2000.

29. Nadezhdin K.D., Shenkarev Z.O., Sobol V.A., Arseniev A.S. "Membrane binding motif of plant cyclotides from Oldenlandia affinis" International symposium «Nuclear magnetic resonance in condensed matter. 2-nd Meeting. NMR in life sciences». Санкт-Петербург, 2005.

30. Надеждин К.Д., Шенкарев 3.O., Арсеньев А.С. "Структура тройных комплексов пептид/двухвалентный катион Мп2+/мицелла DPC для циклотидов Kalata В1 и Kalata В7 по данным спектроскопии ЯМР" VIII международный семинар по магнитному резонансу (спектроскопия, томография, и экология). Ростов-на-Дону, 2006.

31. Арсеньев А.С., Бочаров Э.В., Феофанов А.В., Ефремов Р.Г., Шульга А.А., Ермолкж Я.С., Франкевич

B.Е., Шенкарев З.О. "Структурная биология биологических мембран - пути и методы для рационального создания лекарственных препаратов". II международная конференция «Химия, структура и функция биомолекул». Минск, Беларусь, 2006.

32. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Nadezhdin K.D., Gagnidze I.E., Yurchenko Yu.Yu., Lyukmanova E.N., Bocharov E.V., Balashova T.A., Ovchinnikova T.V., Arseniev A.S. Structure and dynamics of channel forming peptide antibiotic Antiamoebin I in several membrane mimicking media. International symposium «Nuclear

magnetic resonance in condensed matter. 4-th Meeting. NMR in life sciences». Санкт-Петербург, 2007.

33. Shenkarev Z.O., Nadezhdin K.D., Lyukmanova E.N., Ovchinnikova T.V., Skjeldal L., Arseniev A.S. "The P-hairpin containing membrane-active antimicrobial peptides: from the spatial structure in membrane-mimicking media to mechanisms of action" 33-й Международный Конгресс FEBS, 11-ая Конференция IUBMB «Biochemistry of Cell Regulation». Athens, Greece, 2008.

34. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Lyukmanova E.N., Shingarova L.N., Tikhonov R.V., Chupin V.V., Arseniev A.S. NMR study of isolated KvAP voltage-sensing domain: application of lipid-protein nanoscale bilayers in screening of detergent media" 33-й Международный Конгресс FEBS, 11-ая Конференция IUBMB «Biochemistry of Cell Regulation». Athens, Greece, 2008.

35. Парамонов AC., Шенкарев 3.O., Лкжманова E.H., Шингарова Л.Н., Арсеньев АС. ЯМР-исследование изолированного вольт-сенсорного домена К+-канала KvAP в мицеллах детергентов. От динамики к возможным моделям потенциал-зависимой активации. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. Москва-Пущино. 2009.

36. Шенкарев З.О. Липид-белковые нанодиски - универсальная среда для стабилизации, ренатурации и структурных исследований мембранных белков и мембраноактивных пептидов. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. Москва-Пущино. 2009.

37. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Lyukmanova E.N., Shingarova L.N., Chupin V.V., Arseniev A.S. The Low-Amplitude Inter-Helical Motions in the Isolated Voltage-Sensing Domain of KvAP K+ Channel: Implications for Voltage-Gating. 4th ESN Conference on Advances in Molecular Mechansims of Neurological Disorders, Leipzig, Germany, 2009, J. Neurochem. llO(suppl.l), p. 83.

38. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Lyukmanova E.N., Shingarova L.N., Arseniev A.S. NMR study of isolated voltage-sensing domain from KvAP K+ channel: detergent screening, secondary structure and backbone dynamics. EUROMAR-2009, Magnetic Resonance Conference. Goteborg, Sweden.

39. Shenkarev Z.O., Lyukmanova E.N., Arseniev A.S. Lipid-protein nanodiscs in high-resolution NMR studies of integral membrane proteins and membrane active peptides. EUROMAR 2010. Florence, Italy.

40. Trunov K.I., Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Baurin P.V., Balandin S.V., Ovchinnikova T.V., Arseniev A.S. Spatial Structure and Backbone Dynamics of Asymmetric Dimer of P-Hairpin Antimicrobial Peptide Arenicin-2 in Membrane Mimicking Environment. EUROMAR-2010. Florence, Italy.

41. Shenkarev Z.O., Lyukmanova E.N., Paramonov A.S., Arseniev A.S. Lipid-protein nanodiscs - promising medium for stabilization in solution and structure-functional studies of membrane biomolecules. 2 Russian-Hellenic Symposium with International Participation and Young Scientist's School «Biomaterials and nanobiomaterials: recent problems and safety issues». Heraklion, Crete, Greece, 2011.

42. Paramonov A.S., Shenkarev Z.O., Altukhov D.A., Lyukmanova E.N., Shingarova L.N., Arseniev A.S. Investigation of the Structure and Dynamics of the Isolated Voltage-Sensing Domain of the K+ channel KvAP by NMR: Implications for Voltage-Gating. 36 FEBS Congress, Torino, Italy, 2011, FEBS Journal 278(1) SI p.472.

43. Ovchinnikova T.V., Shenkarev Z.O., Balandin S.V., Trunov K.I., Paramonov A.S., Sukhanov S.V., Barsukov L.I., Arseniev A.S. Oligomeric structure in DPC micelles and pore formation in planar lipid bilayers give the insight into molecular mechanism of antimicrobial action of P-hairpin peptide arenicin. 36 FEBS Congress, Torino, Italy, 2011, FEBS Journal 278( 1 ) SI p.124.

44. Shenkarev Z.O., Chugunov A.O., Balandin S.V., Panteleev P.V., Altukhov D.A., Trunov K.I., Gizatullina A.K., Kokryakov V.N., Efremov R.G., Arseniev A.S., Ovchinnikova T.V. Membrane-active peptide aurelin from jellyfish Aurelia aurita could act as a K+ channel blocker. NMR and computer modeling study. 23rd Biennial Meeting of the International Society for Neurochemistry, Athens, Greece, 2011,/ Neurochem. 118(suppl.l), p. 80.

45. Shenkarev Z.O., Lyukmanova E.N., Paramonov A.S., Arseniev A.S. Lipid-protein nanodiscs: alternative tool for production, stabilization, structure-functional studies and delivery of membrane biomolecules. 3rd Russian-Hellenic Symposium with International Participation and Young Scientist's School «Biomaterials and nanobiomaterials: recent problems and safety issues». Heraklion, Crete, Greece, 2012.

46. Paramonov A.S. Shenkarev Z.O. Lyukmanova E.N. Shingarova L.N. Shulepko M.A. Kirpichnikov M.P. Arseniev A.S. NMR study of the interaction between voltage-sensing domain of potassium KvAP channel with gating modifier toxin VSTxl. EUROMAR-2014. Zurich, Switzerland.

Тезисы основных докладов на российских конференциях:

47. Шенкарев З.О., Балашова Т А. "Пространственная структура антибиотика каналообразователя Зервамицина IIB в растворах с различной диэлектрической проницаемостью" XLII Научная конференция МФТИ. Москва-Долгопрудный, 1999.

48. Надеждин К.Д., Соболь В.А., Шенкарев З.О., Арсеньев A.C. "Исследование структуры пептида Kalata В1 в растворе мицелл DPC методом ЯМР-спектроскопии" XVI Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 2004.

49. Надеждин К.Д., Шенкарев З.О., Арсеньев A.C. "Структура циклических пептидов Kalata В1 и Kalata В7 из растения Oldenlandia Affínis по данным ЯМР-спектроскопии", XLVIII Научная конференция МФТИ. Москва-Долгопрудный, 2005.

50. Надеждин К.Д., Баландин С В., Шенкарев З.О., Коряков ВН., Арсеньев A.C., Овчинникова Т.В. "Новые антимикробные пептиды ареницины из морского кольчатого червя Arenicola Marina: гетерологичная экспрессия, очистка и исследование пространственной структуры методом ЯМР", VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова. Москва, 2006.

51. Парамонов A.C., Якименко З А. , Шенкарев З.О., Тагаев A.A., Складнев Д А., Арсеньев A.C., Овчинникова Т.В. "Биотехнологическое получение 15N и 13С,15Ы-меченного каналообразующего антибиотика антиамебина I и исследование его структуры методом ЯМР", VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова. Москва, 2006.

52. Шенкарев З.О., Журавлева A.B., Парамонов A.C., Надеждин К.Д., Свищева Н.В., Тагаев A.A., Овчинникова Т.В., Арсеньев A.C. "Исследование динамики каналообразующего антибиотика зервамицина ИВ в растворе мицелл DPC методом ЯМР", VIII чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова. Москва, 2006.

53. Надеждин К.Д., Шенкарёв З.О., Баландин С В., Овчинникова Т.В., Арсеньев A.C. «Исследование пространственной структуры и механизмов селективной олигомеризации ß-структурного антимикробного пептида ареницина 2» Юбилейная 50-ая Научная конференция МФТИ. Москва-Долгопрудный, 2007.

54. Шенкарев З.О., Люкманова E.H., Парамонов A.C., Надеждин К.Д., Шингарова J1.H., Чупин В В., Арсеньев A.C. «Мембранные нанодиски - новая среда для ЯМР исследований мембранных белков и мембрано-активных пептидов» XX Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2008.

55. Парамонов A.C., Шенкарев З.О., Люкманова E.H., Шингарова Л.Н., Чупин В В., Арсеньев A.C. «Исследование пространственной структуры и динамики вольт-сенсорного домена К+-канала KvAP». XXI Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2009.

56. Шенкарев З.О., Люкманова E.H., Парамонов A.C., Шингарова Л.Н., Соложенкин О.И., Арсеньев A.C. ЯМР исследования мембранных белков и мембраноактивных пептидов в составе липид-белковых нанодисков. IV Российский Симпозиум «Белки и пептиды». Казань, 2009.

57. Арсеньев A.C., Бочаров Э.В., Шенкарев З.О., Минеев К С., Парамонов A.C., Надеждин К.Д., Бочарова О.В., Люкманова E.H., Кирпичников М П. Структурная биология мембранных белков. V Российский симпозиум «Белки и пептиды». Петрозаводск, 2011.

58. Алтухов Д А., Парамонов A.C., Шенкарев З.О., Люкманова E.H., Шингарова Л.Н., Арсеньев A.C. Исследование взаимодействия токсина VSTxl с вольт-сенсорным доменом потенциалозависимого К+ канала KvAP методами ЯМР-спектроскопии. X чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова. Москва-Пущино, 2011.

59. Парамонов A.C., Шенкарев З.О., Люкманова E.H., Арсеньев A.C. Структурные исследования мембранных белков и мембраноактивных пептидов в составе липид-белковых нанодисков. X чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова. Москва-Пущино, 2011.

60. Шенкарев З.О. «Липид-белковые нанодиски: новые возможности для структурно-функциональных исследований мембранных белков.» XXIV Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2012.

61. Арсеньев A.C., Минеев К.С., Парамонов A.C., Надеждин К.Д., Дубинный М.А., Лесовой Д.М., Бочаров Э.В., Шенкарев З.О., Гончарук С.А., Бочарова О.В. «ЯМР взгляд на спираль-спиральные взаимодействия в трансмебранных белках и их влияние на функцию.» VI Российский Симпозиум «Белки и пептиды», Уфа, 2013.

62. Парамонов A.C., Шенкарев З.О., Люкманова E.H., Шингарова Л.Н., Арсеньев A.C. «Проблема формирования пространственной структуры мембранных белков in vitro: ЯМР спектроскопия как способ «визуализации» интермедиатов фолдинга». XXV Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2013.

63. Парамонов A.C., Шенкарев З.О., Люкманова E.H., Шулепко М.А., Шингарова Л.Н., Арсеньев A.C. «Исследование механизмов регуляции работы потенциалозависимых ионных каналов методами спектроскопии ЯМР» XXVI Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2014.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ Общие обозначения, экспериментальные методики

ББС, бесклеточная белоксинтезирующая система; МБ, мембранный белок МП, мембраноактивный пептид. КД, круговой дихроизм;

КССВ, константа спин-спинового взаимодействия;

ЛБН, липид-белковый нанодиск;

ТМ, трансмембранный;

ЭПР, электронный парамагнитный резонанс;

ЯЭО (NOE), ядерный эффект Оверхаузера;

HSQC/TROSY, 2D корреляционные спектры ЯМР;

MW, молекулярная масса;

PDB, база данных структур белков (www.Ddb.ore1:

Ri/R2, скорости продольной/поперечной релаксации ядерной намагниченности;

REx, вклад обменных процессов в R2 для ядер l5N,

Rh, гидродинамический радиус частицы, радиус Стокса;

S2, параметр порядка движений в пикосекундном суб-наносекундном диапазоне;

х„ характерное время пс-нс движений;

Тц, эффективное время корреляции вращательных движений.

Белки, пептиды, объекты исследования ПЧД-KvAP, потенциалочувствительный домен К+-канапа KvAP, архея Aeropyrum pernix-, Aam-I, антибиотик антиамебин I, гриб Emericellopsis minima; Аг2, пептид ареницин-2, морской пескожил Arenicola marina-, ESR, бактериородопсин, психрофильная бактерия Exiguobacterium sibiricum; KB 1 и КВ7, пептиды циклотиды Kalata В1 и В7, растение Oldenlandia affinis; KcsA, К+-канал, бактерия Slreptomyces li\idans\

Lcha/Lchß, двухкомпонентный лантибиотик лихеницидин, бактерия Bacillus licheniformis;

MSP, фрагмент 44-243 аполипопротеина Al человека (membrane scaffold protein);

NTII, нейротоксин И, яд кобры Naja oxiana;

TM-ErbB3, TM домен тирозинкиназы ЕгЬВЗ человека;

VSTxl, «вольт-сенсорный» токсин, яд паука Grammostola spatulata;

Zrv-IIB, антибиотик зервамицин-ИВ, гриб Emericellopsis salmosynnemata',

Липиды, детергенты 5/16-DSA, 5/16-доксил-стеариновые кислоты; DDM, ß-додецилмальтозид (С12); DHPC (di-C6:0-PC), дигексаноил-РС; DLPC (di-C12:0-PC), дилауроил-РС;

DLPG (di-C12:0-PG), дилауроил-PG; DMPC (di-C14:0-PC), димиристоил-РС;

DOPC (di-C18:l-PC), диолеоил-РС; DOPE (di-C18:l-PE), диолеоил-РЕ;

DOPG (di-C18:l-PG), диолеоил-PG; DOPS (di-C18:l-PS), диолеоил-PS;

DPC, додецилфосфохолин (С 12); LDAO, лаурил-диметил-аминоксид (С 12)

LMPC, (C14:0-PC), лизо-миристоил-РС; LMPG, (C16:0-PG), лизо-миристоил-PG;

LPPG, (C16:0-PC), лизо-пальмитоил-PG; PC, фосфатидилхолин;

POPC (C16:0,18:1-PC), пальмитоилолеоил-РС; PG, фосфатидилглицерол; SDS, додецилсульфат натрия (С 12); РЕ, фосфатидилэтаноламин;

PS, фосфатидилсерин;

Подписано в печать: 11.08.2014 Объем: 2,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 155 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Информация о работе

Шенкарев, Захар Олегович
доктора физико-математических наук
Москва, 2014
ВАК 03.01.02

Автореферат

Похожие работы