Исследование структуры и динамики каналообразующего антибиотика зервамицина-IIB в мембрано-моделирующих средах методом спектроскопии ЯМР

Шенкарев, Захар Олегович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование структуры и динамики каналообразующего антибиотика зервамицина-IIB в мембрано-моделирующих средах методом спектроскопии ЯМР
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование структуры и динамики каналообразующего антибиотика зервамицина-IIB в мембрано-моделирующих средах методом спектроскопии ЯМР"

На правах рукописи

ШЕНКАРЕВ ЗАХАР ОЛЕГОВИЧ

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ И ДИНАМИКИ КАНАЛООБРАЗУЮЩЕГО АНТИБИОТИКА ЗЕРВАМИЦИНА-ПВ В МЕМБРАНО-МОДЕЛИРУЮЩИХ СРЕДАХ МЕТОДОМ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР

Специальность: 03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

МОСКВА-2005 г

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук в лаборатории структурной биологии.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор, А.С. Арсеньев

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор, К.В. Шайтан

Ведущая организация:

Институт экспериментальной кардиологии ГУ РКНПК МЗ РФ.

Защита состоится " 22 " декабря 2005 г в 15-30.

На заседании диссертационного совета Д 501.001.96

при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова

по адресу: 119992, Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, Биологический ф-т,

кафедра биофизики, аудитория «Новая»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического ф-та МГУ

Автореферат разослан" 21 " ноября 2005 г.

доктор химических наук В.П. Анаников

Ученый секретарь Совета

доктор биологических наук, профессор

енделева у '

JUW-Y

БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

XA*f0*ff<f

Актуальность темы. Пептаиболы - уникальные антибиотические пептиды, продуцируемые микопаразитическими грибами родов Entericellopsis, Trichoderma и родственных им. Эти пептиды содержат большое количество нестандартных а,ос-диалкилированных аминокислот, например, Aib (U, а-аминоизомасляная кислота) и Iva

(J, D-изовалин), ацетилированный N-конец и С-концевой аминоспирт, например, Phi (F1, L-фенилаланинол). Пептаиболы состоят из 5-20 остатков и часто содержат иминокислотные остатки, такие как Pro (пролин) или Hyp (О, L-4-транс-гидроксипролин). Общая гидрофобность этих пептидов и способность образовывать амфифильные спиральные структуры в биологических мембранах придают пептаиболам мембранную и антибиотическую активности.

Пептаиболы очень активны против грамположительных микроорганизмов, против бактерий класса Mollicutes (включая микоплазмы и спироплазмы), а также против различных экзо- и эндопаразитов, таких как амебы, малярийный плазмодий, гельминты и нематоды. Кроме этого некоторые пептаиболы обладают цитотоксической (противоопухолевой) и нейролептической (по отношению к млекопитающим) активностями. Основная природная функция этих пептидов связана с микопаразитизмом и защитой растений от патогенов. Пептаиболы, продуцируемые грибами-симбионтами растений, вероятно, участвуют в разрушении клеточных стенок фитопатогенных грибов, в усилении вторичного метаболизма у растений, а также в защите растений от вирусов и бактерий.

Биологические свойства пептаиболов коррелируют с каналообразующей активностью в модельных мембранных системах. Каналы, образованные этими пептидами, обладают рядом интересных свойств: несколькими хорошо определенными уровнями проводимости, катион-анионной селективностью и потенциал-зависимостью. Это позволяет рассматривать пептаиболы как простые модели для потенциал-зависимых ионных каналов. Вероятно, именно способность образовывать ионные каналы в мембранах клеток-мишеней лежит в основе антибиотического действия этих пептидов.

на основе грибов рода Trichodermä) для биоконтроля растительных патогенов. Кроме того, структурные исследования пептаиболов чрезвычайно важны для решения ряда фундаментальных задач биофизики: (1) определения механизмов действия мембраноактивных антимикробных пептидов, (2) описания структуры и механизмов работы ионных каналов на молекулярном уровне.

Цель исследования. В данной диссертационной работе исследовали зервамицин-IIB (Zrv-IIB) - основной компонент смеси пептаиболов, продуцируемых грибом Emericellopsis salmosynnemata. Несмотря на небольшую длину (16 остатков) Zrv-IIB проявляет биологическую и канапообразующую активности, сравнимые с активностью длинных (наиболее активных) пептаиболов, например, апаметицина (Alm, 20 остатков). Целью настоящей работы являлось исследование структуры и динамики Zrv-IIB методом ЯМР-спектроскопии в различных средах, моделирующих биологическую мембрану.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать структуру Zrv-IIB в изотропных средах, моделирующих биологическую мембрану, - органические растворители с низкой полярностью (метанол, смеси хлороформ-метанол и метанол-вода).

2. Прямыми методами ЯМР-спектроскопии исследовать систему водородных связей в спирали Zrv-IIB в метаноле и взаимодействие HN- и СО-групп основной цепи пептида с растворителем.

3. Установить наличие или отсутствие высокоамплитудных шарнирных движений в спирали Zrv-IIB, а также выявить возможный тип межмолекулярных взаимодействий между спиралями пептида в метаноле.

4. Исследовать структуру Zrv-IIB в анизотропной среде, моделирующей биологическую мембрану, - растворе мицелл DPC. Определить структуру комплекса Zrv-IIB/мицелла DPC.

5. Используя полученные данные, разработать модель, описывающую механизм мембранной активности зервамицина, и выявить структурные детерминанты, ответственные за высокую активность этого пептаибола.

Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые. 1. Определена структура Zrv-IIB в органических растворителях и растворе мицелл DPC; показано, что пептид связывается с поверхностью мицеллы, при этом N-конец молекулы заглубляется внутрь мицеллы.

2. Прямыми методами ЯМР-спектроскопии определена система водородных связей пептаибола. Впервые наблюдалась бифуркационная водородная связь, включающая в себя две СО-группы (Leu8, Aib9) и одну NH-группу (Aib12). Показано, что подвижность пептида тесно связана с изменениями в системе водородных связей.

3. Установлено отсутствие высокоамплитудных шарнирных движений в спирали Zrv-IIB в метаноле.

Полученные данные позволили предположить, что особую роль в активности зервамицина, по сравнению с другими пептаиболами, играет стабильность его спиральной структуры. Отсутствие высокоамплитудных шарнирных движений, система устойчивых водородных связей и последовательность р-изгибов (P-bend ribbon), в С-концевой части молекулы, придают пептиду длину (~ 26 А) достаточную для того, чтобы пронизывать гидрофобную часть мембраны и образовывать трансмембранные ионные каналы из связок спиралей. В отличие от длинных пептаиболов, в молекулах которых шарнирные движения эффективно уменьшают как обшую длину, так и дипольный момент спирали, Zrv-IIB обладает дипольным моментом (~ 50 D) достаточным для высокоэффективного потенциал-зависимого действия. В то же время, увеличение амфифильности и полярного угла спирали зервамицина позволяет формировать, в среднем, большие связки и, соответственно, каналы с большим сечением пор, что также усиливает биологическую активность пептида.

Настоящая диссертационная работа выявляет принципы структурной организации спиральных мембраноактивных антимикробных пептидов и указывает на особую роль подвижности в их функционировании. Результаты проведенных исследований, несомненно, будут полезны при дизайне новых или модификации природных антибиотических агентов, - задаче, которая приобрела особую важность в последнее время в связи с распространением патогенных микроорганизмов, резистентных к "классическим" антибиотикам. Результаты представленного исследования открывают путь к пониманию работы ионных каналов на молекулярном уровне.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях: XLII Научная конференция МФТИ (Москва, 1999); Open Russian-Swedish Conference "NMR in Protein-Protein and Protein-DNA Recognition" (Moscow, Russia 2000); X International Conference on New Information Technology in Medicine and Ecology (Gurzuf, Ukraine, 2002); XI International Conference on New Information Technology in Medicine, Biology, Pharmacology and Ecology (Gurzuf, Ukraine, 2003);

Совместный симпозиум РФФИ-NWO, Ten years Dutch Russian scientific co-operation (The Hague, The Netherlands, 2003); XII International Conference on New Information Technology in Medicine and Ecology (Gurzuf, Ukraine, 2004). Апробация диссертации была проведена на заседании научного семинара Лаборатории структурной биологии Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук 5 сентября 2005 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 2 работы в отечественных журналах и 5 в зарубежных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержит 2 таблицы и 19 рисунков. Библиографический указатель содержит 353 источника литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первичные структуры пептидов, использованных в работе, а также некоторых

других пептидов, приведены в таблице 1. Все пептиды были любезно предоставлены к.х.н. Овчинниковой Т.В. (ИБХ РАН) и Складневым Д.А. (ГосНИИгенетика). Природный зервамицин IIB (Zrv-IIB) и его 15N- и '3C-15N-Me4eHbie аналоги были выделены из культуры гриба Emericellopsis salmosynnemata (штамм 336, IMI 58330), выращенной либо на обычной среде, либо на средах, обогащенных изотопами |3С и l5N. Спин-меченые аналоги зервамицина IIA (Zrv-IIA) были получены методом твердофазного химического синтеза.

Табл. 1. Аминокислотные последовательности пептаиболов и химические структуры спиновых меток Зервамицин IIB (Zrv-IIB), зервамицин IIA (Zrv-IIA), спин-меченые аналоги Zrv-IIA (Zrv-T0 и Zrv-T16), антиамебин-I (Ant), аламетицин-RßO (Alm). Мотив, ответственный за спираль-изгибающие движения в апаметицине, показан серым цветом._

Пептид_Последовательность/Химическая структура_

Ac-Trp-Ile-Gln-Iva'-Ile-Thr .Е, Íln-Aib-Hyp-Aib-Pro-Phl1'

Ac-Trp-Ile-Gln-Aib'-Ile-Thr Alt? -Leu-Aib-Kyp14- ;in-Aib-Hyp-Aib-Pro-Phll1 Ac-Trp-Ile-Gln-Aib'-Ile-Thr V -Л..- Цп-Aib-Hyp-Aib-Pro-CT16

NT-Trp-Ile-Gln-Aib'-Ile-Thr-MV -teu-Aib«®ipw- Iln-Aib-Hyp-Aib-Pro-Phl1'

Ac-Phe-Aib-Aib-Aib4-1va-Gly Lcj7 -Aib-Aib-Hyp1®- "Iln-Iva-Hyp-Aib-Pro-Phl1,

Zrv-IIB Zrv-IIA Zrv-TI6 Zrv-TO Ant Alm

Ac-Aib-Pro-Aib-Al a-Aib-Ala-Gln-Aibe-Val-Alb '

Спиновые метки

4-карбокси-ТЕМРО (NT)

-»•h-РЛИ-

ral-Aib-Aib-Gln-Gln-Phl

—N.

4-амино-ТЕМРО (CT)

1. Исследование структуры Zrv-IIB в органических растворителях.

Полное отнесение *Н сигналов для Zrv-IIB в метаноле получено по стандартной процедуре, используя DQF-COSY, TOCSY и NOESY спектры. Наличие одного набора сигналов в спектрах указывало на отсутствие примесей и cis-trans-изомеров пептидных связей Хаа-Pro. Ггага-ориентация пептидных связей Aib9-HypIC, Aibl2-Hyp13 и Aib14-Pro15 была установлена на основании наблюдения характеристических контактов ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) в NOESY спектрах. Анализ констант спин-спинового взаимодействия (КССВ) и интенсивностей ЯЭО показал, что пирролидиновые кольца остатков Hyp10 и Hyp13 имеют Up конформацию, а кольцо Prols находится в усредненном Twist состоянии. Анализ КССВ 3Jh"hP и 3JnhP выявил, что наиболее заселенный ротамер боковых цепей остатков Gin3, Leu8, Gin" and Phi16 имеет угол = -60°, в то время как боковые цепи Тгр1, Не2 и Не5 - свободно вращаются вокруг С"-Ср связи. Анализ интенсивностей кросс-пиков ЯЭО между протонами СТН2 и CONH2 групп боковой цепи Gin" выявил подвижность этой боковой цепи вокруг связей Ср-Сг или С-С5. В моделях каналов, образованных зервамицином, эта боковая цепь играет важную роль в стабилизации олигомеров, формирующих канал (связки спиралей), и участвует в прохождении ионов через пору.

Тф1

Gin3 Thr6

<н

¿у- ¿у-

.¿4- Ер_I ггуМе_I ггуНВ_I 7гуРРС_

Длина молекулы (А) 22.3-26.2 24.5-28.1 26.0 - 26.8

Угол изгиба (градусы) 39-55 30-39 16-23

РРВ код_I 1РЬг_ I 1Я9Ц_I 11Н9_

Рис. 1. Пространственные структуры Zгv-UB и структурная статистика, полученные в метаноле (ггуМе), метаноле с учетом системы водородных связей (7гуНВ) и в растворе ПРС мицелл (ггуРРС). Структуры показаны в ленточном представлении._

Gin /Нур

Нур1: Phll6/Prol:

Сводка данных ЯМР, полученных для ХгчАШ в метаноле, представлена на

рис. 2А. Молекула, рассчитанная по этим данным (рис. 1, колонка ггуМе),

представляет собой правозакрученную спираль, изогнутую на Hyp10 под углом ~ 43°. Спираль имеет длину ~ 24 А. Все полярные боковые группы сосредоточены на одной (выпуклой) стороне спирали, а гидрофобные боковые группы расположены на вогнутой стороне. Полярная сторона дополнительно усилена экспонированными СО-группами остатков Aib7, Hyp10, и HN-группой Aib14, которые не участвуют в формировании внутримолекулярных водородных связей. Концы спирали также полярны из-за наличия СО- и HN-групп, не участвующих в формировании водородных связей. N-конец молекулы представляет собой а-спираль, а С-конец - спираль, сформированную последовательностью (3-изгибов (P-bend ribbon, 3 io-спираль с пропущенными водородными связями на остатках Pro/Hyp), молекула заканчивается витком а-спирали. Однако система водородных связей в спирали не может быть точно определена по данным спектроскопии 'Н-ЯМР. Так, в рамках полученной структуры необъяснимыми остались низкие температурные коэффициенты у HN-групп Gin3 и Aib14 (рис. 2А). Более того, хотя характеристические ЯЭО-контакты и указывают на тип спирали в молекуле, эти результаты не могут считаться однозначными.

CD,ОН

Б DPC

Л* W I « J I Т I L l! O-Q LOUP FOH 4 3 5 0 57 5.««! 7.1 5j0 •<

0 0 0 0 10 6 5 12« Эв «11 О МО 48/лТ, И>Ы°С 0.7 3,4 24 «7 5.« 1» *3 1.12.5 34 М 24 1J

.л«)

■вНш

«ja.hour

ДЛЯ

AcWIQJ I I I L I О Q V О I Г (я

5.0 5.7 4.5 1Л 5.3 (.2 М 5.5(5 0|

011 1 31 53 43 41 45 43 17 77 12 2

АЙ/лТ, ррЫ°С ia7 1-t3 5J0.7 5J4il2 7 2.7 2J) 2.72.0 13 07

<С"'М> шшШШШ^тоТ

dm4.nI dMV.ht I <С„ам>

»О

Zrv-IIB

различных средах.

Метанол,

концентрация пептида 10шМ, рН 5 8, 30 С (Б) Раствор DPC мицелл, концентрация пептида 1 8тМ,

рН 4 8, 30°С. Карта ЯЭО контактов построена на основании ЫОЕ8У спектров с тш 200 мс (метанол) и 100 мс (мицеллы) Число ограничений на расстояние показано для каждого остатка на верхних частях рисунков Белым, серым и черным цветом показаны соответственно внутриостаточные, последовательные и средней дальности (1<|Н|<4) ЯЭО-контакты. Далеких ЯЭО-контактов в спектрах не наблюдалось. Значения КССВ ^нж« , температурные коэффициенты химических сдвигов амидных протонов основной цепи и времена Н-0 полуобмена (0 обозначает время полуобмена меньше 5 минут) показаны в соответствующих строках Времена Н-И полуобмена для пептида в метаноле показаны в минутах, а в мицеллах в часах Слева отмечены ЯЭО-контакты, наличие которых позволяет сделать вывод о типе спирали в молекуле_

Метанол моделирует лишь малую часть свойств мембраны, это изотропный раствор с низкой полярностью, в то время как мембранное окружение анизотропно. Более того, при образовании каналов из связок мономеров пептид оказывается еще в более гетерогенном окружении, образованном жирными цепями и полярными головками липидов, соседними пептидами и молекулами воды и ионами, заполняющими пору. С целью проследить конформационные изменения, возникающие в молекуле Zrv-IIB при изменении полярности окружения, структура этого пептида была исследована в бинарных растворах различной полярности от смеси CD30H/H20 (1:1, v/v) до смеси CDCl3/CD3OH (9:1, v/v). Выход за эти пределы делал пептид нерастворимым.

Для Zrv-IIB во всех использованных растворах химические сдвиги алифатических и ароматических протонов, а также КССВ 3Jhnh" и 3Jh0hP практически не менялись. В случае амидных протонов основной цепи при переходе от метанола к смеси метанол/хлороформ (1:9, v/v) значительный сдвиг в сильное поле наблюдался только для экспонированных в растворитель HN-групп Тгр1 и Не2 (около 0.7-0.5 мд) и в меньшей степени для HN-групп Gin3, Iva4 и Aib14 (0.2-0.1 мд). Все остальные HN-группы демонстрировали изменение химического сдвига меньше, чем 0.05 мд. Детальное сравнение 200 мс NOESY спектров в метаноле, смеси метанол/вода (1:1, v/v) и смеси метанол/хлороформ (1:9, v/v) не выявило значительных изменений в системе кросс-пиков ЯЭО.

Таким образом, в отличие от других пептаиболов, таких как аламетицин, Zrv-IIB имеет определенную структуру в метаноле, и эта структура сохраняется при значительном изменении полярности раствора, что говорит о ее большой стабильности.

2. Исследование 1ЗС-151Ч-меченого Zrv-IIB в метаноле.

Полное отнесение 13С и 15N сигналов пептида было осуществлено, используя полученное ранее отнесение 'Н сигналов. Наличие одного набора сигналов в спектрах указывало на отсутствие примесей, а гомоядерные и гетероядерные эксперименты позволили установить степень включения изотопов в пептид. Степень включения изотопа 15N была не меньше 95% для различных HN-групп в пептиде. Изотоп ,3С был включен в меньшем количестве, но не менее 90% для различных С°- и СО-групп.

Индексы химического сдвига (CSI) для ядер 'Н", |3С° и |3СО стандартных остатков в N-концевой части пептида соответствовали конформации а-спирали и были в полном согласии со структурой, полученной ранее (рис.ЗА). Как видно из рисунка а-спиральная часть пептида заканчивается на остатке Leu8. Полученное стереоспецифическое отнесение ,3СРН3 групп остатков Aib (рис.ЗБ) позволило подтвердить эмпирическое правило, сформулированное на основании исследований других пептаиболов, позволяющее проводить стереоспецифическое отнесение метальных групп остатков Aib. Так, |3С-сигналы pro-R l3Cpz метальных групп остатков Aib9, Aib12 и Aib , находящихся перед остатками Pro/Hyp в конформации ß-изгиба (ß-bend ribbon), и |3С-сигнал pro-S |3Ср| метальной группы остатка Aib7, находящегося в а-спиральной конформации, были расположены в диапазоне от 27 до 29 мд, а остальные четыре группы в диапазоне от 24 до 26 мд.

W1 I2 Q3 J4 Is T« U7 L'

Рис 3 (А) Индексы химического сдвига (CSI) для стандартных аминокислотных остатков в Zrv-IIB в метаноле. (Б) Регион метильных групп остатков Aib ,3C-HSQC спектра Zrv-IIB в метаноле. Показано отнесение для всех сигналов Сигналы, принадлежащие одному остатку, соединены линией 1 ,3С-сигналы метильных групп остатков Aib расположены в двух различных спектральных регионах j

Прямое наблюдение системы водородных связей в п С-5N-меченом Zrv-IIB.

Используя 13С-15Ы-меченый Zrv-IIB в метаноле и дальний HNCO эксперимент,

напрямую наблюдали водородные связи CO...HN типа (рис.4). Полученная система

водородных связей, во многом совпадает с результатами 'Н-ЯМР, однако имеется и

несколько существенных отличий.

N-конец пептида начинается с а-спиральной водородной связи между СО Ас0 и

HN Iva4. Ранее не предполагалось, что эта HN-группа может участвовать в образовании

водородной связи из-за быстрого обмена с растворителем. В то же время анализ HNCO

спектра показал, что HN-протон Gin3 (также быстро обменивающийся с растворителем,

но имеющий меньший температурный коэффициент, чем HN-протон Iva4) не участвует

в формировании Зю-спиральной водородной связи с СО Ас0 (величина 3hJNc меньше, чем предел детектирования - 0.05 Гц).

Оказалось, что HN-группа Aib14 (несмотря на быстрый обмен с растворителем) формирует водородную связь с СО-группой Gin11, стабилизирующую р-изгиб. Более того, С-конец молекулы завершается еще одним р-изгибом с водородной связью HN Phi16 - СО Hyp13, а не витком а-спирали, как предполагалось ранее.

Н - через водородные связи; В - через бифуркационную водородную связь. Срезы через кросс-пики ядер, участвующих в формировании бифуркационной водородной связи, показаны снизу и справа от спектра На Нижней панели показана система водородных связей, основанная на анализе НЙСО спектра Водородные связи разделены на а- и Зю-спиральные, бифуркационная водородная связь с NN А1Ь12 показана пунктиром Экспонированные НИ- и СО-группы показаны треугольниками и звездочками, соответственно.

Таким образом, Zrv-IIB a-спирален от N-конца до Leu8, а С-конец представляет собой спираль, сформированную последовательностью ß-изгибов (ß-bend ribbon). Подобная система водородных связей характерна для кристаллических структур 16-ти членных пептаиболов: Leul-зервамицина, антиамебина-I и гомологичных ему цефаиболов.

Наиболее интересная водородная связь наблюдается в середине молекулы Zrv-IIB, в этой бифуркационной связи один донор HN Aib12 связан с двумя акцепторами СО Leu8 и СО Aib9, чему соответствуют два кросс-пика в дальнем HNCO спектре (соответствующие 3hJNc равны -0.09 и -0.08 Гц). Маленькие значения КССВ через бифуркационную водородную связь могут быть объяснены либо геометрией двух водородных связей, сформированных одновременно, либо динамическим обменом (быстрым по временной шкале ЯМР) между двумя обычными водородными связями (а Зю). Такие водородные связи никогда не наблюдались в кристаллических структурах пептаиболов, и очень редко встречаются в молекулах белков (4.2 % от всех водородно-связанных HN-групп). Необходимо отметить, что ранее методом ЯМР не наблюдались бифуркационные водородные связи такого типа. Напротив, бифуркационные связи, соединяющие два донора с одним акцептором, встречаются довольно часто в молекулах белков (35.5 % от всех водородно-связанных СО-групп). Сила водородных связей в спирали Zrv-IIB, связь с динамическим поведением пептида.

Величина КССВ через водородную связь зависит от длины связи и от других геометрических параметров, например, средняя величина 3hJNC- в ß-структурах белков (где водородные связи обычно короче, в среднем на 0.1 А) равна -0.65 Гц, а в a-спиралях (где водородные связи длиннее) —0.38 Гц. Кроме того, величины ^незначительно зависят от динамики белка или пептида.

Средняя величина 3hJNc- для Zrv-IIB (исключая бифуркационную водородную связь) равна -0.41±0.09 Гц (рис.5). Такие большие значения КССВ указывают на то, что спираль зервамицина имеет стабильность, сравнимую со стабильностью спиралей в глобулярных белках. Однако значения 31,Jnc не равномерно распределены по последовательности Zrv-IIB, на полярной стороне молекулы эти КССВ имеют меньшие величины. Более того, заметна прямая корреляция между пониженными значениями 3hJNc и обменным процессом в микро-милли секундном диапазоне, обнаруженным

ранее в нашей лаборатории на полярной стороне спирали зервамицина (Korzhnev et al 2001) (рис.5). Сравнение величин КССВ Jnc* и вкладов обменного процесса (Rex) в поперечную релаксацию ядер говорит о том, что этот обменный процесс включает в себя изменение геометрии водородных связей или перестройку системы водородных связей (например, а <-»• Зш) для трех HN-групп Thr6, Leu8 и Aib14. Высокая скорость обмена HN-протона Aib14 на дейтерий растворителя указывает на возможное динамическое размыкание-замыкание этой связи, в то время как в случае HN-групп Thr6, Leu8 возможна динамическая перестройка системы водородных связей (а *-* Зю).

0.0 1—1

ко.2 >_|

■ 0.4

Q11 ОП Uli U14

X ы

Рис. 5. Значения -^с- (Гц) через водородные связи (белые

прямоугольники) и вклад обменного процесса в поперечную релаксацию ядер N (1/с) для тех же НЫ-групп (черные прямоугольники) Водородные связи, на которые влияет обменный процесс, показаны вверху рисунка.

FI16

Уточнение структуры Zrv-IlB в метаноле.

Расчет структуры пептида был повторен, используя ограничения на водородные связи. Для выяснения типа бифуркационной водородной связи (HN Aib12 - СО Leu8, Aib9) (переключение между акцепторами, или две связи одновременно) было проведено три цикла расчета структуры в программе DYANA с последующей энергетической минимизацией в программе FANTOM, используя силовое поле ЕСЕРР/2. В этих циклах водородная связь с HN Aib12 была ограничена как а-спиральная (HN Aib12 - СО Leu8), Зю-спирапьная (HN Aib12 - СО Aib9), или бифуркационная (HN Aibl2 - СО Leu8, Aib9). Оказалось, что структуры с бифуркационной водородной связью (одновременно две водородные связи HN Aib 12 -СО Leu8, Aib9) в среднем имели на 10 кКал/Моль меньшую энергию, чем структуры с

отдельной а-, или 3,о-спиральной связью. Эти расчеты подтвердили присутствие бифуркационной водородной связи в молекуле Zrv-IIB в метаноле.

Уточненная структура Zrv-IIB в метаноле показана на рис. 1 (колонка ZrvHB). Эта структура значительно отличается от структуры, полученной ранее, спираль

молекулы изгибается на Hyp10 в меньшей степени (средний угол изгиба равен 34°), что приводит к удлинению спирали.

Взаимодействие HN и СО групп основной цепи Zrv-IIB с растворителем.

На рис. 4 показаны не участвующие в образовании водородных связей HN- и СО-группы в молекуле Zrv-IIB (треугольники и звездочки, соответственно). Как видно из рисунка, С-конец молекулы более полярен, чем N-конец (4 свободных СО группы, против 3 свободных HN-групп). Для детального исследования вопроса о способе взаимодействия спирали Zrv-IIB с растворителем, использовались параметры ЯМР, чувствительные к образованию водородных связей (HN- и СО-группами основной цепи): вторичный химический сдвиг HN-протона (AS'HN) и прямая КССВ через пептидную связь (%с )- На рис. 6 приведены значения этих параметров для Zrv-IIB в метаноле вместе с площадью поверхности атомов кислорода карбонильных групп (SEXP), доступной растворителю в полученных структурах.

со

▼ ТУ

с'0>- wl q3 15 u7 u9 qi1 013 р15 ™с0 11 j4 т6 l8 010 ш2 u14

1 j'i11 'f

¿71

„„„w1 q3 15 u7 u9 qll 013 p15 hn* |2 j4 t6 l8 olo u12 u14 fi1«

' O.Oi

i—I-O.

<-o el

WW*

q conh.

conh.

0 0

Рис. 6 (А) Площадь поверхности доступная растворителю у кислорода карбонильных групп в наборе структур 2гч-ПВ (черные прямоугольники). Стрелки обозначают экспонированные карбонилы, формирующие гидрофильный регион в середине спирали. (Б) Прямые КССВ через пептидную связь '^с- КССВ для пептидных (В) Вторичный химический сдвиг амидных протонов

связей Pro/Hyp не были определены (A81HN=8hn - 5%с). AS'HN для остатков Aib и Iva (квадраты и кружок, соответственно) вычислены в предположении, что S^rc для этих остатков равен 8.40 мд. Значения AS'HN на N-конце молекулы соединены линией. (Г) Водородные связи в 20-ти лучших структурах Zrv-IIB в метаноле, и поверхности полярной (выпуклой) и гидрофобной (вогнутой) сторон спирали зервамицина Полярные области показаны черным цветом и аннотированы._

Все HN-протоны зервамицина имеют отрицательные вторичные сдвиги (рис.бВ).

N-концевой Тгр1 и С-концевой Phi16 имеют крайние значения AS'HN, что типично для

спиралей и является проявлением эффекта "конца спирали". Однако сигнал амидного

протона Leu8, также значительно смещен в сильное поле, более того, S'HN на N-конце зервамицина уменьшаются монотонно от Тгр1 до Leu8. Это можно объяснить тем, что свободные карбонилы Thr6 и Aib7 поляризуют середину спирали, приводя к формированию псевдо С-конца спирали на Leu8 (аналогичная картина S'HN наблюдается в середине спирали аламетицина). Таким образом, химические сдвиги HN-протонов в N-концевой части Zrv-IIB соответствуют регулярной а-спирали. В то же время AS'HN в С-концевой части пептида соответствуют нерегулярной, изломанной спирали, что характерно для последовательности, содержащей остатки Pro/Hyp.

КССВ Jnc через пептидную связь в Zrv-IIB (рис.бБ) имеют однородные значения -15.0±0.8 Гц, что характерно для спиралей. Значения 'Jnc для N- и С-концевых остатков выходят за пределы этого диапазона из-за эффекта "конца спирали". В общем, абсолютные значения 'jNC- монотонно возрастают от N-конца пептида к С-концу, что указывает на увеличение частоты и силы водородных связей между СО-группами на С-конце молекулы и растворителем. С другой стороны, равномерность в значениях этих КССВ указывает на отсутствие участков сильной гидратации в середине спирали и на то, что водородные связи с растворителем у свободных карбонилов Thr6, Aib7 и Hyp10 имеют силу, сравнимую с силой внутримолекулярных водородных связей. В спирали аламетицина наблюдается совсем другая ситуация, у этого пептаибола в метаноле имеется два участка сильной гидратации в середине спирали (СО-группы Aib10 и Gly").

Площади поверхности атомов кислорода карбонильных групп в наборе структур Zrv-IIB (Рис.бА) и кристаллических структурах длинных пептаиболов (аламетицина и трихотоксина), доступные растворителю (SEXP), также подтверждают вывод о разных способах взаимодействия этих пептидов с растворителем. В середине спиралей аламетицина и трихотоксина имеются только две экспонированные СО-группы, сильно взаимодействующие с растворителем (СО Aib10/Aib9 (SEXP ~ 6 А2) и СО Gly1'/Ala10 (S£XP ~ 20 А2)), в середине спирали зервамицина, напротив, находится несколько экспонированных карбонилов (СО Aib7, Aib9 и Hyp10 с небольшим SEXP < 15.0 А2 (рис.бА)), которые значительно увеличивают полярный регион на поверхности спирали, сформированный боковыми группами Hyp10, Gin11 и Hyp13 (рис.бГ).

Полученные на этом этапе исследований данные свидетельствуют о том, что в отличие от длинных пептаиболов, спираль Zrv-IIB имеет стабильность, сравнимую со стабильностью спиралей глобулярных белков, а в середине спирали находится бифуркационная водородная связь. Наличие процесса конформационного обмена на полярной стороне в спирали Zrv-IIB не противоречит ее высокой стабильности. Флуктуации в структуре зервамицина (если они присутствуют) соответствуют переходным формам, и спиральный мономер пептида представляет собой основную форму Zrv-IIB в метаноле.

3. Исследование спин-меченых аналогов зервамицина в метаноле.

Межмолекулярные взаимодействия в Zrv-IIB и спин-меченых аналогах.

Для характеристики межмолекулярных взаимодействий Zrv-IIB изучали зависимость химических сдвигов и полуширин сигналов HN-протонов от концентрации (0.1 - 18.1 мМ) пептида в метаноле. Химические сдвиги и полуширины сигналов при увеличении концентрации пептида изменялись практически линейно в пределах 0.03 мд и 0.5 Гц, причем для амидных протонов экспонированных в растворитель (Тгр1, Не2 и Gin3), зависимость была наибольшей. Химические сдвиги и полуширины сигналов HN-протонов остатков Thr6, Leu8 and Aib14, участвующих в обменном процессе (рис.5), практически не менялись в указанном диапазоне концентраций, что указывает на отсутствие сильных межмолекулярных взаимодействий на полярной стороне спирали Zrv-IIB.

Рис 7 Зависимость от концентрации 2ту-Т\6 скорости релаксации ^ для протонов НЫ Тгр1 (нижняя кривая) и Н*1 Тгр' (верхняя кривая). Точки в диапазоне концентраций 0.05 -1.6 мМ линейно аппроксимированы. Этот рисунок иллюстрирует влияние межмолекулярного парамагнитного усиления релаксации на скорости релаксации в спин-меченых пептидах.

1 1.5 2 2.5 [Zrv-T16] [ИМ]

3.5

Детальное исследование взаимодействия между мономерами зервамицина в растворе проводили на спин-меченом аналоге 7лу-1\Ь (спиновая метка на С-конце пептида), измеряя межмолекулярное парамагнитное усиление релаксации (рис. 7). Наиболее сильные вклады межмолекулярной релаксации обнаружены для протонов

HN-групп и боковых цепей остатков Trp1, lie2, Gin3 и Iva4. Рассчитанные расстояния наибольшего сближения (d0) между нитрооксидом спиновой метки и HN-протонами этих остатков составили только 2.1, 4.2, 5.2 и 6.1 А, что примерно соответствует сумме радиусов Ван-дер-Ваальса и относительной доступности растворителю этих групп. Таким образом, в метаноле при концентрациях ниже 1.5 мМ зервамицин находится в состоянии мономера, однако нелинейность кривых при больших концентрациях (рис. 7) указывает на межмолекулярные взаимодействия между N-концом и С-концом пептида. Видимо, эти взаимодействия модулируются спиральным макро-диполем молекулы и приводят к наблюдаемой в толуоле агрегации пептида по принципу N-конец к С-концу (Milov et al 2002).

Измерение расстояний: протон - спиновая метка в спин-меченых аналогах Zrv-IIB.

2.5р 2

Л 1.5

1 0.5 о 2015 10 £ 5 0 ■

Zrv-T16 4 5(78

Zrv-TO 11 12 14

-ЛГ1п

ХЫ

„ 1.4 " В 1-2

1.0 0.8

I » .

jh*

=fc

4 5 6 7 8 9 11 12 9 11 12 14 Zrv-T16 Zrv-T0

Рис. 8. (А-Э) Внутримолекулярное парамагнитное усиление скоростей продольной и поперечной релаксации в спин-меченых аналогах зервамицина (Е-Н) Рассчитанные значения тс и г для векторов НЫ-протон - нитрооксид. Полученный диапазон значений г показан прямоугольниками Соответствующие расстояния в структуре ггу-ИВ (I) показаны треугольниками. Расстояния в структуре ггу-НВ (1), с оптимизированным положением спиновых меток, показаны звездочками (I) Структура зервамицина со спиновыми метками (показаны конусами). Указаны характерные расстояния (1) Структура зервамицина с оптимизированным положением спиновых меток

Парамагнитное усиление релаксации в спин-меченых аналогах зервамицина

позволило измерить средние расстояния между НЫ-протонами основной цепи и

спиновыми метками, находящимися на М- или С-конце молекул пептидов. Полученные

данные и согласование их со структурой 7гу-ИВ в метаноле показаны на рис. 8. Эти

расстояния усреднены как (<г6>6), следовательно, они ближе к расстояниям

наибольшего сближения между протоном и спиновой меткой, чем просто к среднему расстоянию. Как мы видим в случае Zrv-IIB, отличие измеренных (усредненных) расстояний от расстояний в структуре зервамицина в метаноле не велико (< 4 А), что разительно отличается от случая аламетицина, где разница в расстояниях была > 10 А. Более того, эта небольшая разница в случае зервамицина может быть объяснена, если принять во внимание подвижность спиновых меток и неспособность их к формированию водородных связей.

Эти данные свидетельствуют о том, что Zrv-IIB в метаноле, в отличие от длинного пептаибола аламетицина, не совершает высокоамплитудных движений изгибающих спираль. Видимо, особая стабильность Zrv-IIB вызвана заменой Gly" (аламетицин) на Aib7 (зервамицин) в ответственном за шарнирные движения мотиве Gly"-Leu-Aib-Pro14 (самый стерически свободный остаток заменен на самый стерически ограниченный).

4. Исследование структуры Zrv-IIB в растворе DPC мицелл.

Исследование зервамицина в изотропных средах неполярных растворителей позволило детально охарактеризовать его структуру и динамику. Однако эти растворы лишь частично моделируют свойства мембраны, их объединяет с мембраной только гидрофобность, близкая к таковой у углеводородного региона бислоя. Бислойные мембраны анизотропны, они имеют как гидрофобную часть, так и окружающие ее полярные области. Это свойство мембран очень важно для действия амфифильных пептидов. Однако исследование структур пептидов и белков в мембраносвязанном состоянии методом ЯМР в растворе невозможно из-за очень медленной реориентации мембранных везикул, что ведет к значительному уширению линий. В этом отношении мицеллы детергентов представляют собой разумный компромисс, они обладают анизотропией и реориентируются достаточно быстро для наблюдения сигналов связанных белков и пептидов. Стехиометрия комплекса Zrv-IIB/мщелла DPC.

Формирование комплекса между Zrv-IIB и DPC наблюдали, измеряя коэффициент трансляционной диффузии мицелл DPC, в растворе без пептида, и измеряя коэффициент трансляционной диффузии Zrv-IIB, в растворе, содержащем как пептид, так и детергент. Коэффициент диффузии мицеллы DPC равен 1.20±0.02 хЮ"10

м2/с, что соответствует радиусу Стокса 23.1 ±0.5 Ä. В то же время коэффициент диффузии зервамицина в присутствии DPC (отношение пептид-детергент (P:D) = 1:40) был равен 1.06±0.02 хЮ"10 м2/с, что соответствовало радиусу 26.2±0.5 А. Эти данные свидетельствуют о том, что при связывании Zrv-IIB с мицеллой образуется комплекс,

* имеющий большие размеры чем мицелла DPC.

Мицелла DPC в условиях ЯМР эксперимента состоит из 55±5 молекул

* детергента. Предполагая, что пептид равномерно распределен между мицеллами (действительно, в результате исследования не было найдено никаких признаков агрегации молекул зервамицина), можно сделать вывод о том, что в условиях эксперимента (70 мМ DPC, P:D = 1:40) одна мицелла в среднем несет на себе 1.6 (±0.3) молекул пептаибола, которые связаны с 66 (±12) молекулами детергента. Структура Zrv-IIB в растворе DPC мицелл.

Структура пептида в DPC была получена, используя туже схему, что и в метаноле. Сводка данных ЯМР представлена на рис. 2Б, а структура на рис. 1 (колонка ZrvDPC). Молекула представляет собой амфифильную правозакрученную спираль, изогнутую на Hyp10 под углом ~ 20°. Спираль пептида имеет длину -26 А. По этим и другим параметрам структура очень близка к уточненной структуре Zrv-IIB в метаноле. Участие всех HN протонов (за исключением Тгр1, Не2 и Gin3) в образовании внутримолекулярных водородных связей было подтверждено как медленной скоростью обмена на дейтерий растворителя, так и низкими температурными коэффициентами (рис.1 Б). Все полярные боковые группы сосредоточены на одной (выпуклой) стороне спирали, а гидрофобные боковые группы формируют вогнутую сторону. Анализ КССВ 3JHa i/ показал, что боковые цепи Тгр1, lie2, Gin3 и Не5 -подвижны, а наиболее заселенный ротамер боковых цепей остатков Thr6, Leu8, Gin" и

' Phi16 имеет угол = -60°. Эти результаты практически совпадают с данными по динамике боковых цепей, полученными в метаноле.

* Положение молекулы Zrv-IIB относительно поверхности мицеллы.

Молекулы 5-доксилстеариновой кислоты и 16-доксилстеариновой кислоты встраиваются в мицеллу таким образом, что их спиновые метки располагаются в положениях близких к поверхности мицеллы и ее центру, соответственно. Вызываемая этими метками парамагнитная релаксация мицеллосвязанных пептидов, значительно

уширяет сигналы и, соответственно, уменьшает их интенсивность. Это позволяет определить способ связывания пептида с мицеллой и построить модель комплекса пептид/мицелла.

Относительное уменьшение интенсивности в спектре >ЮЕ8У в присутствии 16-доксилстеариновой кислоты для различных остатков Хт\-НВ показано на рис. 9. (Присутствие 5-доксилстеариновой кислоты вызывало аналогичное уменьшение интенсивности, но с большей амплитудой.) Как видно, представленный график имеет явно выраженную спиральную периодичность, при этом, сигналы с гидрофобной поверхности спирали зервамицина ослаблены сильнее, что указывает на поверхностный тип связывания пептида с мицеллой. Более того, сигналы >1-концевых остатков пептида более уширены, что говорит о большем погружении ТЧ-конца молекулы в мицеллу. На рис. 9 представлена также модель комплекса 2гу-ПВ/мицелла БРС, построенная по экспериментальным данным.

Рис. 9. Относительное изменение интенсивности (%) в спектре КЮЕвУ тт=100 мс, вызванное спиновой меткой 16-доксилстеариновой кислоты На вклейке изображена модель комплекса ггу-ПВ/ОРС, центр дуги (пунктир, радиус 26 А) соответствует центру мицеллы.

Полученные на этом этапе исследований результаты свидетельствуют о том, что ггу-ПВ связывается с поверхностью мицеллы БРС в конформации, близкой к конформации в метаноле. При связывании гидрофобная сторона спирали пептида обращена к мицелле, а полярная сторона экспонирована в воду. По сравнению с другими частями молекулы, Ы-конец пептида сильнее заглублен в мицеллу. Вероятно, подобный тип связывания имеет место и для бислойной мембраны (что подтверждено более поздними экспериментальными исследованиями методом твердотельного ЯМР на ориентированных мембранах (ВесЬ^ег ег а1 2001)). Для перевода пептида в трансмембранное (ТМ) положение необходимо наличие внешнего потенциала, или значительное уменьшение толщины мембраны.

5. Модель действия Zrv-IIB.

Распределение электростатического потенциала и потенциала молекулярной гидрофобности на поверхности мономера Zrv-IIB показаны на рис. 10. Как видно, молекула представляет собой амфифильную спираль с большим полярным участком на выпуклой стороне спирали и полностью гидрофобна с вогнутой стороны. Полярность С-конца молекулы дополнительно усилена экспонированными карбонилами остатков Aib7, Aib9, Hyp10, Aib14 и Pro15, полярными боковыми группами Hyp10, Gin11 и Hyp13 и С-концевой спиртовой группой Phi16. Спираль имеет длину -26 А, достаточную для того, чтобы пронизать гидрофобный регион мембраны, и дипольный момент около 50 D, достаточный для сильного взаимодействия спирали с трансмембранным потенциалом. Таким образом, молекула Zrv-IIB идеально подходит для формирования потенциал-зависимых ионных каналов из связки спиралей, в которых полярные стороны формируют внутренность поры, а гидрофобные стороны контактируют с липидами и соседними пептидами в связке.

Особую роль в образовании "жесткой и длинной" спиральной конформации мономера Zrv-IIB играют остатки Aib. Эти остатки расположены в ключевых местах последовательности: 1) перед каждым из остатков Pro/Hyp, что необходимо для формирования "длинной" спирали из последовательности Р-изгибов (P-bend ribbon) на С-конце пептида (эта спираль длиннее чем а-спираль на -0.5 А на остаток), 2) в последовательности Aib7-Leu-Aib-Hyp'°, что предотвращает движения изгибающие спираль вокруг остатка Нур!0.

Предполагая, что способ начального связывания пептида с поверхностью мембраны моделируется структурой комплекса Zrv-IIB/мицелла DPC, можно предложить модель действия Zrv-IIB. Эта модель - модель «ре-ориентации-встраивания (preorientation/insertion model) показана на рис. 10В.

Zrv-IIB не имеет определенной конформации в водном растворе, а при его присоединении к поверхности мембраны формируется спираль, эта спираль распологается параллельно поверхности с N-концом чуть более заглубленным в гидрофобный регион мембраны. Затем трансмембранный электрический потенциал переводит мономер зервамицина в трансмембранное (ТМ) состояние. Различие в энергии между ТМ и поверхностно-связанным состоянием пептида невелико, поэтому

на мембране одновременно присутствуют пептиды в обоих состояниях. ТМ мономеры пептида агрегируют и формируют каналы из связок спиралей. Каналы имеют энергию сравнимую с энергией мономеров, и поэтому они метастабильны, периодически распадаются и собираются вновь. Через эти каналы происходит ток ионов и вытекание цитоплазматического содержимого из клетки-мишени. »

Рис 10 (АБ) Распределение электростатического потенциала и потенциала молекулярной гидрофобности на поверхности мономера Zrv-IIB.

(В) модель ире-ориентации-встраивания (preorientation/insertion model) описывающая мембранную активность Zrv-IIB._

Рассмотрим подробнее ключевые аспекты предложенной модели. Потенциал-зависимая активация канаюв зервамицина.

В рамках модели яре-ориентации-встраивания потенциал-зависимая активация пептида связана с реориентацией жесткого спирального диполя из поверхностно связанного состояния в ТМ состояние и переноса N-конца молекулы через мембрану. Большие структурные перестройки в молекуле пептида и изменение угла изгиба спирали в ходе этого процесса представляются маловероятными из-за жесткости спирали зервамицина. Простые расчеты показывают согласие предложенной модели и экспериментальных данных. Так, дипольный момент -50 D, при длине спирали -26 А, соответствует зарядам +0.4е и -ОАе на N- и С-конце пептида, соответственно, что прекрасно согласуется с экспериментальной величиной воротного заряда а = 0.41.

Более того, большая потенциал-зависимость действия ггу-ПВ (Уе = 4.52 мВ), соответствующая таковой у аламетицина, легко может быть объяснена, учитывая жесткость спирали зервамицина. В случае аламетицина значительные спираль-изгибающие движения (вероятно, сохраняющиеся и в мембранно-связанном состоянии) приводят к эффективному уменьшению дипольного момента, которое может достигать 25% (от ~70 О до ~50 Б). Таким образом, динамические движения в "длинном" аламетицине (20 остатков) сближают его по величине дипольного момента и общей длине спирали с "коротким" зервамицином (16 остатков). Ассиметрия волыпамперной характеристики 2п>-ПВ.

Ассиметрия вольтамперной характеристики пептида может быть объяснена из относительной полярности С-концевой части молекулы (рис. 10). Видимо, экспонированные карбонильные группы, и полярные боковые цепи в этой части молекулы формируют множественные водородные связи с головками липидов, создавая тем самым своеобразный якорь на поверхности мембраны. Это позволяет проникать пептиду в глубь бислоя только Ы-концевой частью, что соответствует экспериментально наблюдаемой активации только си-положительным потенциалом и инактивации в присутствии си-отрицательного потенциала. Потенциал-независимое поведение 2п>-ПВ.

Потенциал-независимое поведение 2гу-\\В, наблюдаемое в везикулярных системах при больших отношениях пептид-липид (Р:Ь), может быть объяснено из статистических и энергетических соображений. Активация внешним трансмембранным потенциалом в 100 мВ (типичное значение для активации каналов зервамицина) приводит к дополнительной стабилизации ТМ состояния на 0.8 кКал/Моль (мембрана толщиной 30 А, |ЛЭ ~ 50 О), что сравнимо с характерной энергией тепловых движений (ЯТ ~ 0.6 кКал/Моль). Подобная небольшая разница в энергии ведет к увеличению заселенности ТМ состояния меньше чем в 4 раза. Аналогичное увеличение концентрации пептида в ТМ состоянии может быть достигнуто увеличением концентрации мембраносвязанного пептида. Таким образом, ТМ потенциал не является необходимым условием для формирования каналов 7гу-ПВ.

Результаты подобных расчетов прекрасно согласуются с имеющимися экспериментальными данными. Так, в мембранах составленных из ЭОРС (сН-С18:1-РС)

или сН-С16:1-РС (толщина гидрофобного региона ~ 25 А) имеется равновесие между поверхностно связанным и ТМ состояниями зервамицина, смещенное в сторону поверхностно связанного пептида. В более тонких мембранах составленных из БЬРС (<Н-С12:0-РС) или БСРС (сИ-С10:0-РС) (толщина гидрофобного региона ~ 19 А) равновесие смещается в сторону ТМ состояния (ВесЬн^ег е1 а12001). Структура каналов зервамицина.

Взаимодействия Ы-конец к С-концу между спиралями зервамицина, наблюдаемые при больших концентрациях в метаноле, модулируются дипольным моментом спиралей пептида и, вероятно, не имеют отношения к агрегации ТМ мономеров пептида в мембране в процессе формирования каналов. Ассиметрия вольтамперной характеристики указывает на то, что пептиды в связке должны быть ориентированы параллельно. Хотя в этом случае отталкивание спиральных диполей должно дестабилизировать связки, этот эффект может быть скомпенсирован поляризацией молекул воды внутри поры, как это предложено для аламетицина СПе1етап е1 а12002).

Так как молекулы 2гу-11В изогнуты, существует два различных способа их упаковки в ТМ связку, либо путем ассоциации М-концевых спиралей пептидов, либо путем ассоциации С-концевых спиралей. Анализ структуры 2гу-ПВ в метаноле показывает, что боковые цепи аминокислотных остатков на 1Ч-конце молекулы подвижны, а конформация боковых цепей на С-конце фиксирована. Эта ситуация не меняется и при присоединении пептида к поверхности мицеллы БРС. Подобное распределение подвижности в молекуле должно стабилизировать ассоциацию С-концов мономеров зервамицина, так как в этом случае должны уменьшаться потери энтропии при олигомеризации пептидов. Боковые цепи на С-конце молекулы, возможно, имеют заранее определенную конформацию, необходимую для сборки канала. Таким образом, можно предположить, что сборка мономеров Zтv-ПB в канал (связку спиралей) происходит путем ассоциации С-концевых частей молекул, как это предлагалось ранее (БалБотп е1 а1 1993), что отличается от возможной Ы-концевой упаковки мономеров аламетицина в каналы.

Большая площадь полярной стороны у амфифильной спирали зервамицина (рис. 10) делает более выгодным формирование пор с большим радиусом и,

соответственно, с большим числом мономеров (13 - 14 у зервамицина, против 10-11 у аламетицина).

Селективность каналов зервамицина.

В отличии от длинных пептаиболов Хп-ПВ взаимодействует с растворителем большой полярной областью, сформированной из полярных боковых цепей и экспонированных СО-групп основной цепи, и эти группы по отдельности не формируют сайтов сильной гидратации. Возможно, именно увеличенный (по сравнению с аламетицином) полярный регион на поверхности спирали ггу-ПВ и другой тип взаимодействия пептид/растворитель приводят к изменению селективности каналов этого пептида по отношению к одновалентным катионам. Каналы аламетицина имеют селективность (К+ > Ш"1), в то время как каналы зервамицина имеют другую селективность (Ыа+ > К*). Увеличение полярной стороны ведет к усилению взаимодействия пептида с ионами, имеющими меньший радиус СМа*), что говорит о частичной их дегидратации при проходе через канал.

Выводы

1. В изотропных средах, моделирующих биологическую мембрану, - органических растворителях (метанол, смеси хлороформ-метанол и метанол-вода), определена пространственная структура пептидного антибиотика Zrv-ГГВ. Показано, что пептид представляет собой изогнутую на остатке Hyp10 амфифильную спираль и изменение полярности раствора не меняет структуру пептида.

2. Прямыми методами ЯМР-спектроскопии определена система водородных связей в спирали Zrv-IIB и тип взаимодействия HN- и СО-групп основной цепи пептида с растворителем. N-концевой фрагмент Zrv-IIB (остатки Trp1 - Leu8) образует а-спираль, а С-концевой фрагмент (Aib9 - Phi16) имеет конформацию спирали, сформированной последовательностью ß-изгибов (ß-bend ribbon). В середине спирали Zrv-IIB отсутствуют участки сильной гидратации, что объясняет уникальную селективность канала Zrv-IIB.

3. Впервые методами ЯМР наблюдали бифуркационную водородную связь между одной NH-группой (Aib12) и двумя СО-группами (Leu8, Aib9). Показано, что подвижность Zrv-IIB тесно связана с изменениями в системе водородных связей.

4. Используя спин-меченые производные Zrv-IIB, установлено отсутствие высокоамплитудных шарнирных движений в спирали этого пептида. В метаноле спирали Zrv-IIB взаимодействуют по принципу N-конец к С-концу.

5. В анизотропной среде - мицеллах DPC, определены пространственная структура Zrv-IIB и структура комплекса Zrv-IIB/мицелла DPC. Показано, что спираль пептида расположена на поверхности мицеллы, а N-конец молекулы заглублен в гидрофобную часть мицеллы.

6. На основании полученных данных предложена модель, описывающая механизм мембранной активности зервамицина.

Основные научные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. TA.Balashova, Z.O. Shenkarev, A.A.Tagaev, T.V.Ovchinnikova, J.Raap, A.S.Arseniev "NMR Structure of the channel-former Zervamicin IIB in isotropic solvents." (2000) FEBS Letters 466:333-336.

2. Z.O. Shenkarev. T.A. Balashova, R.G. Efremov, Z.A. Yakimenko, T.V. Ovchinnikova, J. Raap, A.S. Arseniev "Spatial Structure of Zervamicin IIB Bound to DPC Micelles: Implications for Voltage-Gating" (2002) Biophysical Journal 82:762-771.

3. Д.А. Складнее, E.A. Рогожкина, E.B. Кондакова, В.И. Швец, H.B. Свищева, З.А. Якименко, З.О. Шенкарев. Т.В. Овчинникова, Я. Раап "Получение изотопно модифицированного 13C+15N пептидного антибиотика зервамицина ИВ" (2002) Биотехнология 5:32-40.

4. T.V. Ovchinnikova, Z.O. Shenkarev. Z.A. Yakimenko, N.V. Svishcheva, A.A. Tagaev, D.A. Skladnev, A.S. Arseniev "Biosynthetic Uniform 13C,15N-Labelling of Zervamicin IIB. Complete 13Cand l5N NMR Assignment" (2003) J. Peptide Sci. 9:817-826

5. Z.O. Shenkarev. T.A. Balashova, Z.A. Yakimenko, T.V. Ovchinnikova, A.S. Arseniev "Peptaibol Zervamicin IIB Structure and Dynamics Refinement from Transhydrogen Bond J Couplings" (2004) Biophysical Journal 86:3687-3699

6. Z.O. Shenkarev. A.S. Paramonov, T.A. Balashova, Z.A. Yakimenko, M.B. Baru, L.G. Mustaeva, J. Raap, T.V. Ovchinnikova, A.S. Arseniev "High stability of the hinge region in the membrane-active peptide helix of zervamicin: paramagnetic relaxation enhancement studies" (2004) Biochem Biophys Res Commun. 325:1099-105.

7. З.О. Шенкарев. A.C. Парамонов, T.A. Балашова, Т.В. Овчинникова, А.С. Арсеньев. "Высокая стабильность шарнирного региона в спиральном каналообразующем антибиотике зервамицине ИВ в растворе метанола, по данным парамагнитного усиления ЯМР релаксации" XII International Conference on New Information Technology in Medicine and Ecology, Gurzuf, Ukraine, 2004. (2004) Успехи современного естествознания, 6(2), прил.1: стр. 62-63.

8. З.О. Шенкарев. Т.А. Балашова "Пространственная структура антибиотика канало-образователя Зервамицина ИВ в растворах с различной диэлектрической проницаемостью" Тезисы докладов XLII Научной конференции МФТИ. Москва, 1999.

9. Z.O. Shenkarev. T.A. Balashova, A.S. Arseniev "NMR Structure of the channelformer Zervamicin IIB in isotropic solvents and DPC micelles: possible mechanism of voltage activation." Open Russian-Swedish Conference "NMR in Protein-Protein and Protein-DNA Recognition". Moscow, Russia, 2000, book of abstracts, p. 36.

10. Z.O. Shenkarev. T.A. Balashova, A.S. Arseniev "NMR Structure of the channelformer antibiotic Zervamicin IIB in membrane mimic media. Possible mechanism of action" X International Conference on New Information Technology in Medicine and Ecology. Gurzuf, Ukraine, 2002, book of abstracts, p.: 371-373.

11. Z.O. Shenkarev. T.A. Balashova, T.V. Ovchinnikova, A.S. Arseniev "Structure and Dynamics of Simple Peptide Ion Channel Zervamicin-IIB in Membrane Mimic Media" XI International Conference on New Information Technology in Medicine, Biology, Pharmacology and Ecology. Gurzuf, Ukraine, 2003, book of abstracts, p.: 346-348.

»23877

РНБ Русский фонд

2006-4 25194

Отпечатано на полиграфическом участке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук Печать офсетная. Усл.пл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 781

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Шенкарев, Захар Олегович

Оглавление.

Список использованных сокращений.

Введение.

ЧАСТЬ I. Обзор литературы: Пептаиболы как мембраноактивные антимикробные пептиды.

1 Мембраноактивные антимикробные пептиды.

1.1 Спектр активности и специфичность действия АП.

1.2 Структура АП и модели их мембранной активности.

1.3 Структурно-функциональные зависимости на примере а-спиральных АП.

1.4 Перспективы использования АП.

2 Пептаиболы: структура, механизмы биосинтеза и биологическая активность.

2.1 Структуры пептаиболов и их классификация.

2.2 Биосинтез пептаиболов.

2.3 Биологическая активность пептаиболов.

2.3.1 Активность против бактерий и паразитов.

2.3.2 Активность против грибов, роль в защите растений.

2.3.3 Активность против клеток животных и митохондрий.

2.3.4 Факторы, определяющие активность, связь с образованием каналов в модельных мембранах.

2.4 Пространственная структура пептаиболов.

2.4.1 Элементы вторичной структуры, встречающиеся в пептаиболах.

2.4.2 Роль остатка Pro и другие структурные факторы, отвечающие за активность пептаиболов.

2.4.3 Структура и динамика длинных пептаиболов: аламетицин, хрисоспермин и трихотоксин.

2.4.4 Структура и динамика коротких пептаиболов: зервамицин, антиамебин, цефаибол, ампуллоспорин и харзианин.

2.4.5 Структуры пептаиболов в рамках BS модели.

3 Взаимодействие пептаиболов с модельными мембранами.

3.1 Структурные исследования взаимодействия пептаиболов с мембранами.

3.1.1 Начальное связывание длинных пептаиболов с бислойными мембранами

3.1.2 Положение спирали длинных пептаиболов относительно мембраны.

3.1.3 Моделирование структуры аламетицина в мембране.

3.1.4 Механизм перехода в ТМ состояние и наблюдение пор в мембранах.

3.1.5 Влияние состава бислойной мембраны и трансмембранного потенциала.

3.1.6 Структурные исследования взаимодействия коротких пептаиболов с модельными мембранами.

3.2 Свойства каналов пептаиболов и модели их устройства.

3.2.1 Потенциал-зависимая и потенциал-независимая проводимость пептаиболов в плоских мембранах.л.:.

3.2.2 Система уровней проводимости пептаиболов.

3.2.3 Селективность каналов пептаиболов.

3.2.4 Каналы пептаиболов в везикулах и целых клетках.

3.2.5 Модели каналов пептаиболов.

ЧАСТЬ II. Экспериментальные исследования.

4 Материалы и методы.

4.1 Исследование структуры Zrv-IIB в органических растворителях.

4.1.1 Приготовление образцов, ЯМР-спектроскопия и отнесение сигналов.

4.1.2 Расчет пространственной структуры и энергетическая минимизация.

4.2 Исследование 13С-15М-меченого Zrv-IIB в метаноле.

4.2.1 Приготовление образцов, ЯМР-спектроскопия, отнесение сигналов и определение степени включения меток.

4.2.2 Исследование взаимодействия пептида с растворителем и прямое наблюдение системы водородных связей.

4.2.3 Уточнение пространственной структуры Zrv-IIB в метаноле.

4.3 Исследование спин-меченых аналогов зервамицина в метаноле.

4.3.1 Приготовление образцов и ЯМР-спектроскопия.

4.3.2 Измерение расстояний: протон - спиновая метка.

4.4 Исследование структуры Zrv-IIB в растворе DPC мицелл.

4.4.1 Приготовление образцов, ЯМР-спектроскопия и отнесение сигналов.

4.4.2 Расчет пространственной структуры и определение положения пептида относительно поверхности мицеллы.

4.5 Подготовка рисунков, депонирование экспериментальных данных и полученных структур.

5 . Результаты и обсуждения.

5.1 Исследование структуры Zrv-IIB в органических растворителях.

5.2 Исследование 13С-15>Т-меченого Zrv-IIB в метаноле.

5.2.1 ЯМР-характеризация 13С-'^-меченого Zrv-IIB, определение степени включения изотопных меток и отнесение метальных групп остатков Aib.

5.2.2 Прямое наблюдение системы водородных связей в 13С-15М-меченом Zrv-IIB в метаноле.

5.2.3 Сила водородных связей в спирали Zrv-IIB, связь с динамическим поведением пептида.

5.2.4 Уточнение структуры Zrv-IIB в метаноле.

5.2.5 Взаимодействие HN- и СО-групп основной цепи Zrv-IIB с растворителем.

5.3 Исследование спин-меченых аналогов зервамицина в метаноле.

5.3.1 Межмолекулярные взаимодействия в Zrv-IIB и спин-меченых аналогах.

5.3.2 Измерение расстояний: протон — спиновая метка в спин-меченых аналогах Zrv-IIB.

5.4 Исследование структуры Zrv-IIB в растворе DPC мицелл.

5.4.1 Стехиометрия комплекса Zrv-IIB/DPC мицелла.

5.4.2 Структура Zrv-IIB в растворе DPC мицелл.

5.4.3 Положение молекулы Zrv-IIB относительно поверхности мицеллы.

5.5 Модель действия Zrv-IIB.

5.5.1 Потенциал-зависимая активация каналов зервамицина.

5.5.2 Ассиметрия вольтамперной характеристики Zrv-IIB.

5.5.3 Потенциал-независимое поведение Zrv-IIB.

5.5.4 Структура каналов зервамицина.

5.5.5 Селективность каналов зервамицина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование структуры и динамики каналообразующего антибиотика зервамицина-IIB в мембрано-моделирующих средах методом спектроскопии ЯМР"

Актуальность темы. Пептаиболы — уникальные антибиотические пептиды, продуцируемые микопаразитическими грибами родов Emericelopsis, Trichoderma и родственных им [1]. Эти пептиды содержат большое количество нестандартных а,а-диалкилированных аминокислот, например, Aib (U, а-аминоизомасляная кислота), ацетилированный N-конец и С-концевой аминоспирт [2-4]. Пептаиболы состоят из 5-20 остатков и часто содержат иминокислотные остатки, такие как Pro (пролин) или Hyp (О, L-4-транс-гидроксипролин). Общая гидрофобность этих пептидов и способность образовывать амфифильные спиральные структуры в биологических мембранах придает пептаиболам мембранную и антибиотическую активности [5].

Пептаиболы очень активны против грамположительных микроорганизмов [6,7], против бактерий класса Mollicutes (включая микоплазмы и спироплазмы) [8], а так же против различных экзо- и эндо- паразитов, таких как амебы [9], малярийный плазмодий [10], гельминты [11,12] и нематоды [13]. Кроме этого некоторые пептаиболы обладают цитотоксической (противоопухолевой) [13] и нейролептической (по отношению к млекопитающим) [14,15] активностями. Основная природная функция этих пептидов связана с микопаразитизмом и защитой растений от патогенов. Пептаиболы, продуцируемые грибами симбионтами растений, вероятно, участвуют в разрушении клеточных стенок фитопатогенных грибов [16,17], в усилении вторичного метаболизма у растений [18], а так же в защите растений от вирусов и бактерий [19,20].

Биологические свойства пептаиболов коррелируют с каналообразующей активностью в модельных мембранных системах. Каналы, образованные этими пептидами, обладают рядом интересных свойств: несколькими хорошо определенными уровнями проводимости, катион-анионной селективностью и потенциал-зависимостью [21]. Это позволяет рассматривать пептаиболы как простые модели для потенциал-зависимых ионных каналов [21]. Вероятно, именно способность образовывать ионные каналы в мембранах клеток-мишеней лежит в основе антибиотического действия этих пептидов [5].

Исследование структуры и динамики молекул пептаиболов, а также связи между структурой и активностью этих пептидов имеет чрезвычайную важность как для решения фундаментальной задачи медицины — поиска (создания) новых антибиотических агентов на основе природных антимикробных пептидов, так и для решения фундаментальной задачи биотехнологии — создания новых агентов (например, на основе грибов рода Trichoderma) для биоконтроля растительных патогенов. Кроме того, структурные исследования пептаиболов чрезвычайно важны для решения ряда фундаментальных задач биофизики: (1) определения механизмов действия мембраноактивных антимикробных пептидов, (2) описания структуры и механизмов работы ионных каналов на молекулярном уровне.

Цель исследования. В данной диссертационной работе исследовали зервамицин-IIB (Zrv-IIB) — основной компонент смеси пептаиболов, продуцируемых грибом Emericellopsis salmosynnemata. Несмотря на небольшую длину (16 остатков) Zrv-IIB проявляет биологическую [6,10,22] и каналообразующую [21,23-25] активности, сравнимые с активностью длинных (наиболее активных) пептаиболов, например, аламетицина (Aim, 20 остатков). Целью настоящей работы являлось исследование структуры и динамики Zrv-IIB методом ЯМР-спектроскопии в изотропных средах, моделирующих биологическую мембрану, — растворах органических растворителей с низкой полярностью (метанол, смеси хлороформ-метанол и метанол-вода), и в анизотропной среде, моделирующей биологическую мембрану, — растворе мицелл додецилфосфохолина (DPC).

Основные задачи исследования:

1. Исследовать структуру Zrv-IIB в изотропных средах, моделирующих биологическую мембрану, — органические растворители с низкой полярностью (метанол, смеси хлороформ-метанол и метанол-вода).

2. Прямыми методами ЯМР-спектроскопии определена система водородных связей в спирали пептаибола. Впервые наблюдалась бифуркационная водородная связь, включающая в себя две СО-группы (Leu8, Aib9) и одну NH-группу (Aib12). Показано, что подвижность пептида тесно связана с изменениями в системе водородных связей.

3. Установлено отсутствие высокоамплитудных шарнирных движений в спирали Zrv-IIB в метаноле.

Полученные данные позволили предположить, что особую роль в активности зервамицина, по сравнению с другими пептаиболами, играет стабильность его спиральной структуры. Отсутствие высокоамплитудных шарнирных движений, система устойчивых водородных связей и последовательность Р-изгибов ((3-bend ribbon), в С-концевой части молекулы, придают пептиду длину 26 А) достаточную для того, чтобы пронизывать гидрофобную часть мембраны и образовывать трансмембранные ионные каналы из связок спиралей. В отличие от длинных пептаиболов, в молекулах которых шарнирные движения эффективно уменьшают как общую длину, так и дипольный момент спирали, Zrv-IIB обладает дипольным моментом 50 D) достаточным для высокоэффективного потенциал-зависимого действия. В то же время, увеличение амфифилыюсти и полярного угла спирали зервамицина позволяет формировать, в среднем, большие связки и, соответственно, каналы с большим сечением пор, что также усиливает биологическую активность пептида.

ЧАСТЬ I. Обзор литературы: Пептаиболы как мембраноактивные антимикробные пептиды.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Шенкарев, Захар Олегович

Выводы

1. В изотропных средах, моделирующих биологическую мембрану, — органических растворителях (метанол, смеси хлороформ-метанол и метанол-вода), определена пространственная структура пептидного антибиотика Zrv-IIB. Показано, что пептид представляет собой изогнутую на остатке Hyp10 амфифильную спираль и изменение полярности раствора не меняет структуру пептида.

2. Прямыми методами ЯМР-спектроскопии определена система водородных связей в спирали Zrv-IIB и тип взаимодействия HN- и СО-групп основной цепи пептида с растворителем. N-концевой фрагмент Zrv-IIB (остатки Trp1 - Leu8) образует а-спираль, а С-концевои фрагмент (Aib9 - Phi16) имеет конформацию спирали, сформированной последовательностью Р-изгибов ф-bend ribbon). В середине спирали Zrv-IIB отсутствуют участки сильной гидратации, что объясняет уникальную селективность канала Zrv-IIB.

Благодарности

Мне хотелось бы выразить глубокую благодарность и признательность моему научному руководителю, профессору, д.х.н. Александру Сергеевичу Арсеньеву, который обеспечил возможность выполнения настоящей диссертационной работы, оказывал своевременную помощь и поддержку и проявлял неустанное благожелательное внимание на протяжении всего времени моей работы в лаборатории.

Хочу поблагодарить весь коллектив нашей лаборатории за помощь в выполнении экспериментальной работы и плодотворные обсуждения. Особую признательность хочу выразить сотрудникам лаборатории Т.А. Балашовой, Э.В. Бочарову, И.В. Масленникову и А.Г. Соболю, а также студентам К.Д. Надеждину и А.С. Парамонову.

Приношу свою глубокую благодарность сотрудникам Лаборатории инженерии белка ИБХ РАН профессору, Д.А. Долгих и Е.Н. Люкмановой за неоценимую помощь в работе.

Хочу поблагодарить весь коллектив УНЦ ИБХ РАН и особенно его сотрудников А.А. Тагаева ti З.А. Якименко за помощь в подготовке образцов для исследований. Отдельную благодарность хочу выразить руководителю УНЦ ИБХ РАН Т.В. Овчинниковой, без непосредственного участия которой выполнение работы было бы невозможным.

Благодарю коллектив Группы молекулярного моделирования нашей лаборатории и особенно руководителя группы Р.Г.Ефремова и сотрудников группы П.Е. Волынского и Д.Е. Нольде за помощь в освоении новых методов.

Выражаю свою благодарность профессору Лейденского университета Я.Рапу, участвовавшему в финансировании начального этапа работы по проекту.

Отдельную благодарность хочу выразить Российскому Фонду Фундаментальных исследований (РФФИ), за финансирование работ по исследованию зервамицина.

Заключение

Полученные в диссертационной работе результаты выявляют основные принципы, использованные природой при конструировании спиральных антимикробных пептидов, действующих на мембраны клеток, а также механизмы формирования ионных каналов этими пептидами.

В рамках работы на примере пептаибола зервамицина была показана возможная роль динамической подвижности пептида в его антимикробной и каналообразующей активностях.' Исследование структуры и динамики зервамицина в различных средах, моделирующих биологическую мембрану, показало, что пептид имеет стабильную спиральную структуру, не совершает высокоамплитудных шарнирных движений вокруг центрального остатка гидроксипролина и взаимодействует с растворителем большим полярным регионом, состоящим как из экспонированных СО-групп основной цепи, так и из полярных групп боковых цепей. Сравнение со структурами других пептаиболов позволило предположить, что именно эти структурные свойства зервамицина ответственны за его высокую биологическую и каналообразующую активности.

Проведенное в рамках диссертационной работы изучение структуры зервамицина в комплексе с мицеллой DPC позволило установить способ взаимодействия пептида с мицеллами и предсказать возможный тип взаимодействия пептида с биологическими мембранами. На основании проведенных исследований была предложена модель действия зервамицина, объясняющая все известные на сегодня экспериментальные данные.

Результаты диссертационный работы указывают на возможный способ увеличения активности синтетических антимикробных и каналообразующих пептидов путем включения в их последовательности нестандартных остатков, таких как Hyp и Aib. Это имеет огромное практическое значение для ряда задач медицины, биотехнологии и биофизики. Вероятно, в будущем рациональный дизайн новых антимикробных агентов позволит преодолеть многие болезни, вызванные патогенными микроорганизмами, резистентными к "классическим" антибиотикам.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Шенкарев, Захар Олегович, Москва

1. Chugh,JK, Wallace,В А (2001): Peptaibols: models for ion channels. Biochem.Soc.Trans. 29(4): 565-570.

2. Whitmore,L, Chugh,JK, Snook,CF, Wallace,BA (2003): The peptaibol database: a sequence and structure resource. J.Pept.Sci. 9(11-12): 663-665.

3. Whitmore,L, Wallace,BA (2004): Analysis of peptaibol sequence composition: implications for in vivo synthesis and channel formation. Eur.Biophys.J. 33(3): 233-237.

4. Whitmore,L, Wallace,BA (2004): The Peptaibol Database: a database for sequences and structures of naturally occurring peptaibols. Nucleic Acids Res. 32: D593-D594.

5. Duclohier,H, Wroblewski,H (2001): Voltage-dependent pore formation and antimicrobial activity by alamethicin and analogues. J.Membr.Biol. 184(1): 1-12.

6. Jen,WC, Jones,GA, Brewer,D, Parkinson,VO, Taylor,A (1987): The antibacterial activity of alamethicins and zervamicins. J.Appl.Bacteriol. 63(4): 293-298.

7. Bruckner,H, Graf,H (1983): Paracelsin, a peptide antibiotic containing alpha-aminoisobutyric acid, isolated from Trichoderma reesei Simmons. Part A. Experientia 39(5): 528-530.

8. Nagaraj,G, Uma,MV, Shivayogi,MS, Balaram,H (2001): Antimalarial activities of peptide antibiotics isolated from fungi. Antimicrob.Agents Chemother. 45(1): 145-149.

9. Schiell,M, Hofmann,J, Kurz,M, Schmidt,FR, Vertesy,L, Vogel,M et al (2001): Cephaibols, new peptaibol antibiotics with anthelmintic properties from Acremonium tubakii DSM 12774. J.Antibiot. (Tokyo) 54(3): 220-233.

10. Vertesy,L, Kurz,M, Schiell,M, and Hofmann,J. (2003): Cephaibols: novel antiparasitics from Acremonium tubakii process for their production, and use thereof. патент USA №6582949 .

11. Metzger,JW, Schlegel,B, Fleck,W, Dornberger,K, Ihn,W, Schade,W, and Grafe,U. (1995): Chrysospermins, active peptides from apiocrea chrysosperma having a pharmacological effect and a use thereof, патент USA №5432157.

12. Ritzau,M, Heinze,S, Dornberger,K, Berg,A, Fleck,W, Schlegel,B et al (1997): Ampullosporin, a new peptaibol-type antibiotic from Sepedonium ampullosporum HKI-0053 with neuroleptic activity in mice. J.Antibiot.(Tokyo) 50(9): 722-728.

13. Grigoriev,PA, Schlegel,B, Kronen,M, Berg,A, Hartl,A, Grafe,U (2003): Differences in membrane pore formation by peptaibols. J.Pept.Sci. 9(11-12): 763-768.

14. Lorito,M, Farkas,V, Rebuffat,S, Bodo,B, Kubicek,CP (1996): Cell wall synthesis is a major target of mycoparasitic antagonism by Trichoderma harzianum. J.Bacteriol. 178(21): 63826385.

15. Engelberth,J, Koch,T, Kuhnemann,F, Boland,W (2000): Channel-Forming Peptaibols Are Potent Elicitors of Plant Secondary Metabolism and Tendril Coiling . Angew.Chem.Int.Ed Engl. 39(10): 1860-1862.

16. Yun,BS, Yoo,ID, Kim,JH, Kim,YH, Lee,SJ, Kim,KS et al (2000): Peptaivirins A and B, two new antiviral peptaibols against TMV infection. Tetrahedron Lett 41: 1429-1431.

17. Kim,YH, Yeo,WH, Kim,YS, Chae,SY, Kim,KS (2000): Antivral activity of antibiotic peptaibols, chrysospermins В and D, produced by Apiocrea sp 14 against TMV infection. J.Microbiol.Biotech. 10(4): 522-528.

18. Sansom,MS (1991): The biophysics of peptide models of ion channels. Prog Biophys Mol Biol 55(3): 139-235.

19. Argoudelis,AD and Johnson,LE. (1975): Antibiotics Zervacin I and Zervacin II and process for preparing the same, патент USA №3907990.

20. Balaram,P, Krishna,K, Sukumar,M, Mellor,IR, Sansom,MS (1992): The properties of ion channels formed by zervamicins. Eur.Biophys. J. 21(2): 117-128.

21. Kropacheva,TN, Raap,J (1999): Voltage-dependent interaction of the peptaibol antibiotic zervamicin II with phospholipid vesicles. FEBS Lett. 460(3): 500-504.

22. Kropacheva,TN, Raap,J (2002):. Ion transport across a phospholipid membrane mediated by the peptide trichogin GA IV. Biochim.Biophys.Acta 1567(1-2): 193-203.

23. Ganz,T (2003): Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nat.Rev.Immunol. . 3(9): 710-720.

24. Zasloff,M (2002): Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415(6870): 389-395.

25. Garcia-01medo,F, Molina,A, Alamillo,JM, Rodriguez-Palenzuela,P (1998): Plant defense peptides. Biopolymers 47(6): 479-491.

26. Thomma,BP, Cammue,BP, Thevissen,K (2002): Plant defensins. Planta 216(2): 193-202.

27. Veronese,P, Ruiz,MT, Coca,MA, Hernandez-Lopez,A, Lee,H, Ibeas,JI (2003): In defense against pathogens. Both plant sentinels and foot soldiers need to know the enemy. Plant Physiol 131(4): 1580-1590.

28. Matsuzaki,K (1999): Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-defense? Magainins and tachyplesins as archetypes. Biochim.Biophys.Acta 1462(1-2): 1-10.

29. Oren,Z, Shai,Y (1998): Mode of action of linear amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides. Biopolymers 47(6): 451-463.

30. Dalla,SM, Menestrina,G (2003): Liposomes in the study of pore-forming toxins. Methods Enzymol. 372: 99-124.

31. Epand,RM, Epand,RF (2003): Liposomes as models for antimicrobial peptides. Methods Enzymol 372: 124-133.

32. Duclohier,H, Molle,G, Spach,G (1989): Antimicrobial peptide magainin I from Xenopus skin forms anion-permeable channels in planar lipid bilayers. Biophys. J. 56(5): 1017-1021.

33. Kagan,BL, Selsted,ME, Ganz,T, Lehrer,RI (1990): Antimicrobial defensin peptides form voltage-dependent ion-permeable channels in planar lipid bilayer membranes. Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 87(1): 210-214.

34. Brogden,KA (2005): Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat.Rev.Microbiol. 3(3): 238-250.

35. Shai,Y (2002): Mode of action of membrane active antimicrobial peptides. Biopolymers 66(4): 236-248.

36. Wade,D, Boman,A, Wahlin,B, Drain,CM, Andreu,D, Boman,HG et al (1990): All-D amino acid-containing channel-forming antibiotic peptides. Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 87(12): 4761-4765.

37. Giangaspero,A, Sandri,L, Tossi,A (2001): Amphipathic alpha helical antimicrobial peptides. Eur.J.Biochem. 268(21): 5589-5600.

38. Tossi,A, Sandri,L, Giangaspero,A (2000): Amphipathic, alpha-helical antimicrobial peptides. Biopolymers 55(1): 4-30.

39. Papo,N, Shai,Y (2003): Can we predict biological activity of antimicrobial peptides from their interactions with model phospholipid membranes? Peptides 24(11): 1693-1703.

40. Powers,JP, Hancock,RE (2003): The relationship between peptide structure and antibacterial activity. Peptides 24(11): 1681-1691.

41. Kobayashi,S, Hirakura,Y, Matsuzaki,K (2001): Bacteria-selective synergism between the antimicrobial peptides alpha-helical magainin 2 and cyclic beta-sheet tachyplesin I: toward cocktail therapy. Biochemistry 40(48): 14330-14335.

42. Tam,JP, Lu,YA, Yang,JL, Chiu,KW (1999): An unusual structural motif of antimicrobial peptides containing end-to-end macrocycle and cystine-knot disulfides. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 96(16): 8913-8918.

43. Beven,L, Duval,D, Rebuffat,S, Riddell,FG, Bodo,B, Wroblewski,H (1998): Membrane permeabilisation and antimycoplasmic activity of the 18-residue peptaibols, trichorzins PA. Biochim.Biophys.Acta 1372(1): 78-90.

44. Beven,L, Helluin,0, Molle,G, Duclohier,H, Wroblewski,H (1999): Correlation between anti-bacterial activity and pore sizes of two classes of voltage-dependent channel-forming peptides. Biochim.Biophys.Acta 1421(1): 53-63.

45. Dathe,M, Kaduk,C, Tachikawa,E, Melzig,MF, Wenschuh,H, Bienert,M (1998): Proline at position 14 of alamethicin is essential for hemolytic activity, catecholamine secretion from chromaffin cells and enhanced metabolic activity in endothelial cells.

46. Biochim. Biophys.Acta 1370(1): 175-183.

47. Yan,H, Hancock,RE (2001): Synergistic interactions between mammalian antimicrobial defense peptides. Antimicrob.Agents Chemother. 45(5): 1558-1560.

48. Craik,DJ, Daly,NL, Mulvenna,J, Plan,MR, Trabi,M (2004): Discovery, structure and biological activities of the "cyclotides. Curr.Protein Pept.Sci. 5(5): 297-315.

49. Nicolas,P, Vanhoye,D, Amiche,M (2003): Molecular strategies in biological evolution of antimicrobial peptides. Peptides 24(11): 1669-1680.

50. Мог,A, Hani,K, Nicolas,P (1994): The vertebrate peptide antibiotics dermaseptins have overlapping structural features but target specific microorganisms. J.Biol.Chem. 269(50): 31635-31641.

51. Hara,T, Mitani,Y, Tanaka,K, Uematsu,N, Takakura,A, Tachi,T et al (2001): Heterodimer formation between the antimicrobial peptides magainin 2 and PGLa in lipid bilayers: a cross-linking study. Biochemistry 40(41): 12395-12399.

52. Yeaman,MR, Yount,NY (2003): Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance. Pharmacol.Rev. 55(1): 27-55.

53. Huang,HW (2000): Action of antimicrobial peptides: two-state model. Biochemistry 39(29): 8347-8352.

54. Lee,MT, Chen,FY, Huang,HW (2004): Energetics of pore formation induced by membrane active peptides. Biochemistry 43(12): 3590-3599.

55. Heller,WT, He,K, Ludtke,SJ, Harroun,TA, Huang,HW (1997): Effect of changing the size of lipid headgroup on peptide insertion into membranes. Biophys.J. 73(1): 239-244.

56. Bezrukov,SM, Rand,RP, Vodyanoy,I, Parsegian,VA (1998): Lipid packing stress and polypeptide aggregation: alamethicin channel probed by proton titration of lipid charge. Faraday Discuss. Ill: 173-183.

57. Keller,SL, Bezrukov,SM, Gruner,SM, Tate,MW, Vodyanoy,I, Parsegian,VA (1993): Probability of alamethicin conductance states varies with nonlamellar tendency of bilayer phospholipids. Biophys.J. 65(1): 23-27.

58. Killian,JA (1998): Hydrophobic mismatch between proteins and lipids in membranes. Biochim.Biophys.Acta 1376(3): 401-415.

59. Sperotto,MM (1997): A theoretical model for the association of amphiphilic transmembrane peptides in lipid bilayers. Eur.Biophys.J26: 405-416.

60. Hall,JE, Vodyanoy,I, Balasubramanian,TM, Marshall,GR (1984): Alamethicin. A rich model for channel behavior. Biophys.J. 45(1): 233-247.

61. Zhang,L, Rozek,A, Hancock,RE (2001): Interaction of cationic antimicrobial peptides with model membranes. J.Biol.Chem. 276(38): 35714-35722.

62. Hancock,RE, Scott,MG (2000): The role of antimicrobial peptides in animal defenses. Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 97(16): 8856-8861.

63. Shai,Y (1999): Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipid bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides. Biochim.Biophys.Acta 1462(1-2): 55-70.

64. Hsu,ST, Breukink,E, Tischenko,E, Lutters,MA, de Kruijff,B, Kaptein,R et al (2004): The nisin-lipid II complex reveals a pyrophosphate cage that provides a blueprint for novel antibiotics. Nat.Struct.Mol.Biol. 11(10): 963-967.

65. Breukink,E, de Kruijff,B (1999): The lantibiotic nisin, a special case or not? Biochim.Biophys.Acta 1462(1-2): 223-234.

66. Finlay,BB, Hancock,RE (2004): Can innate immunity be enhanced to treat microbial infections? Nat.Rev.Microbiol. 2(6): 497-504.

67. Epand,RM, Vogel,HJ (1999): Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim.Biophys.Acta 1462(1-2): 11-28.

68. Bulet,P, Stocklin,R, Menin,L (2004): Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates. Immunol.Rev. 198: 169-184.

69. Laederach,A, Andreotti,AH, Fulton,DB (2002): Solution and micelle-bound structures of tachyplesin I and its active aromatic linear derivatives. Biochemistry 41(41): 12359-12368.

70. Rozek,A, Friedrich,CL, Hancock,RE (2000): Structure of the bovine antimicrobial peptide indolicidin bound to dodecylphosphocholine and sodium dodecyl sulfate micelles. Biochemistry 39(51): 15765-15774.

71. Baumann,G, Mueller,P (1974): A molecular model of membrane excitability. J.Supramol.Struct. 2(5-6): 538-557.

72. Boheim,G (1974): Statistical analysis of alamethicin channels in black lipid membranes. J.Membr.Biol. 19(3): 277-303.

73. Chen,FY, Lee,MT, Huang,HW (2003): Evidence for membrane thinning effect as the mechanism for peptide-induced pore formation. Biophys.J. 84(6): 3751-3758.

74. Chen,FY, Lee,MT, Huang,HW (2002): Sigmoidal concentration dependence of antimicrobial peptide activities: a case study on alamethicin. Biophys.J. 82(2): 908-914.

75. Fox,RO, Jr., Richards,FM (1982): A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-A resolution. Nature 300(5890): 325-330.

76. Ludtke,SJ, He,K, Wu,Y, Huang,HW (1994): Cooperative membrane insertion of magainin correlated with its cytolytic activity. Biochim.Biophys.Acta 1190(1): 181-184.

77. Papo,N, Shai,Y (2003): Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochemistry 42(2): 458-466.

78. Yang,L, Harroun,TA, Weiss,TM, Ding,L, Huang,HW (2001): Barrel-stave model or toroidal model? A case study on melittin pores. Biophys.J81(3): 1475-1485.

79. Zemel,A, Fattal,DR, Ben Shaul,A (2003): Energetics and self-assembly of amphipathic peptide pores in lipid membranes. Biophys.J84(4): 2242-2255.

80. Bessin,Y, Saint,N, Marri,L, Marchini,D, Molle,G (2004): Antibacterial activity and pore-forming properties of ceratotoxins: a mechanism of action based on the barrel stave model. Biochim.Biophys.Acta 1667(2): 148-156.

81. Bechinger,B, Skladnev,DA, Ogrel,A, Li,X, Rogozhkina,EV, Ovchinnikova,TV et al (2001): 15N and 3IP solid-state NMR investigations on the orientation of zervamicin II and alamethicin in phosphatidylcholine membranes. Biochemistry 40(31): 9428-9437.

82. Wakamatsu,K, Takeda,A, Tachi,T, Matsuzaki,K (2002): Dimer structure of magainin 2 bound to phospholipid vesicles. Biopolymers 64(6): 314-327.

83. He,K, Ludtke,SJ, Huang,HW, Worcester,DL (1995): Antimicrobial peptide pores in membranes detected by neutron in-plane scattering. Biochemistry 34(48): 15614-15618.

84. He,K, Ludtke,SJ, Worcester,DL, Huang,HW (1996): Neutron scattering in the plane of membranes: structure of alamethicin pores. Biophys.J. 70(6): 2659-2666.

85. Ludtke,SJ, He,K, Heller,WT, Harroun,TA, Yang,L, Huang,HW (1996): Membrane pores induced by magainin. Biochemistry 35(43): 13723-13728.

86. Saint,N, Marri,L, Marchini,D, Molle,G (2003): The antibacterial peptide ceratotoxin A displays alamethicin-like behavior in lipid bilayers. Peptides 24(11): 1779-1784.

87. Uematsu,N, Matsuzaki,K (2000): Polar angle as a determinant of amphipathic alpha-helix-lipid interactions: a model peptide study. Biophys.J. 79(4): 2075-2083.

88. Tieleman,DP, Borisenko,V, Sansom,MS, Woolley,GA (2003): Understanding pH-dependent selectivity of alamethicin K18 channels by computer simulation. Biophys.J. 84(3): 1464-1469.

89. Dathe,M, Wieprecht,T (1999): Structural features of helical antimicrobial peptides: their potential to modulate activity on model membranes and biological cells. Biochim.Biophys.Acta 1462(1-2): 71-87.

90. Zhang,L, Benz,R, Hancock,RE (1999): Influence of proline residues on the antibacterial and synergistic activities of alpha-helical peptides. Biochemistry 38(25): 8102-8111.

91. Jacob, J, Duclohier,H, Cafiso,DS (1999): The role of proline and glycine in determining the backbone flexibility of a channel-forming peptide. Biophys.J. 76(3): 1367-1376.

92. Menestrina,G, Voges,KP, Jung,G, Boheim,G (1986): Voltage-dependent channel formation by rods of helical polypeptides. J.Membr.Biol. 93(2): 111-132.

93. Zasloff,M, Martin,B, Chen,HC (1988): Antimicrobial activity of synthetic magainin peptides and several analogues. Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 85(3): 910-913.

94. Duclohier,H (2004): Helical kink and channel behaviour: a comparative study with the peptaibols alamethicin, trichotoxin and antiamoebin. Eur.Biophys.J. 33(3): 169-174.

95. Eisenberg,D (1984): Three-dimensional structure of membrane and surface proteins. Annu.Rev.Biochem. 53: 595-623.

96. Barlow,DJ, Thornton,JM (1988): Helix geometry in proteins. J.Mol.Biol. 201(3): 601-619.

97. Blundell,T, Barlow,D, Borkakoti,N, Thornton,J (1983): Solvent-induced distortions and the curvature of alpha-helices. Nature 306(5940): 281-283.

98. Nicholls,A, Honig,B (1990): A rapid finite difference algorithm, utilizing successive over-relaxation to solve the Poisson-Bolzmann equation. J.Comp.Chem. 12: 435-445.

99. Efremov,RG, Alix,AJ (1993): Environmental characteristics of residues in proteins: three-dimensional molecular hydrophobicity potential approach. J.Biomol.Struct.Dyn. 11(3): 483-507.

100. Tieleman,DP, Hess,B, Sansom,MS (2002): Analysis and evaluation of channel models: simulations of alamethicin. Biophys.J. 83(5): 2393-2407.

101. Papo,N, Shai,Y (2005): Host defense peptides as new weapons in cancer treatment. Cell MoLLife Sci 62(7-8): 784-790.

102. Reddy,KV, Yedery,RD, Aranha,C (2004): Antimicrobial peptides: premises and promises. Int. J.Antimicrob.Agents 24(6): 536-547.

103. Peschel,A (2002): How do bacteria resist human antimicrobial peptides? Trends Microbiol. 10(4): 179-186.

104. Selsted,ME (2004): Theta-defensins: cyclic antimicrobial peptides produced by binary ligation of truncated alpha-defensins. Curr.Protein Pept.Sci 5(5): 365-371.

105. DeGray,G, Rajasekaran,K, Smith,F, Sanford,J, Daniell,H (2001): Expression of an antimicrobial peptide via the chloroplast genome to control phytopathogenic bacteria and fungi. Plant Physiol 127(3): 852-862.

106. Wiest,A, Grzegorski,D, Xu,BW, Goulard,C, Rebuffat,S, Ebbole,DJ et al (2002): Identification of peptaibols from Trichoderma virens and cloning of a peptaibol synthetase. J.Biol.Chem. 277(23): 20862-20868.

107. Archer,SJ, Ellena,JF, Cafiso,DS (1991): Dynamics and aggregation of the peptide ion channel alamethicin. Measurements using spin-labeled peptides. Biophys.J. 60(2): 389-398.

108. Mueller,P, Rudin,DO (1968): Action potentials induced in bimolecular lipid membranes. Nature 217: 713-719.

109. Cafiso,DS (1994): Alamethicin: a peptide model for voltage gating and protein-membrane interactions. Annu. Rev. Biophys.Biomol. Struct. 23: 141-165.

110. Sansom,MS (1993): Alamethicin and related peptaibols—model ion channels. Eur.Biophys.J. 22(2): 105-124.

111. Wallace,BA (2000): Common structural features in gramicidin and other ion channels. Bioessays 22(3): 227-234.

112. Sansom,MS (1993): Structure and function of channel-forming peptaibols. Q.Rev.Biophys. 26(4): 365-421.

113. Jiang, Y, Ruta,V, Chen,J, Lee, A, Mackinnon,R (2003): The principle of gating charge movement in a voltage-dependent K+ channel. Nature 423(6935): 42-48.

114. Jiang,Y, Lee,A, Chen,J, Ruta,V, Cadene,M, Chait,BT et al (2003): X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature 423(6935): 33-41.

115. Wada,S, Iida,A, Asami,K, Fujita,T (1996): Ion channel-forming property of trichorovin-XII, an 11-residue peptaibol from the fungus Trichoderma viride, in planar lipid bilayer membranes. Bioorg.Med.Chem.Lett. 6(19): 2275-2278.

116. Toniolo,C, Peggion,C, Crisma,M, Formaggio,F, Shui,X, Eggleston,DS (1994): Structure determination of racemic trichogin A IV using centrosymmetric crystals. Nat.Struct.Biol. 1(12): 908-914.

117. Bechinger,B (1997): Structure and functions of channel-forming peptides: magainins, cecropins, melittin and alamethicin. J.Membr.Biol. 156(3): 197-211.

118. Bechinger,B (1999): The structure, dynamics and orientation of antimicrobial peptides in membranes by multidimensional solid-state NMR spectroscopy. Biochim.Biophys.Acta 1462(1-2): 157-183.

119. North,CL, Franklin,JC, Bryant,RG, Cafiso,DS (1994): Molecular flexibility demonstrated by paramagnetic enhancements of nuclear relaxation. Application to alamethicin: a voltage-gated peptide channel. Biophys.J. 67(5): 1861-1866.

120. Degenkolb,T, Berg,A, Gams,W, Schlegel,B, Grafe,U (2003): The occurrence of peptaibols and structurally related peptaibiotics in fungi and their mass spectrometric identification via diagnostic fragment ions.J.Pept.Sci. 9(11-12): 666-678.

121. Toniolo,C, Crisma,M, Formaggio,F, Peggion,C, Epand,RF, Epand,RM (2001): Lipopeptaibols, a novel family of membrane active, antimicrobial peptides. Cell Mol.Life Sci. 58(9): 1179-1188.

122. Kirschbaum,J, Krause,C, Winzheimer,RK, Bruckner,H (2003): Sequences of alamethicins F30 and F50 reconsidered and reconciled. J.Pept.Sci. 9(11-12): 799-809.

123. Reiber,K, Neuhof,T, Ozegowski,JH, von,DH, Schwecke,T (2003): A nonribosomal peptide synthetase involved in the biosynthesis of ampullosporins in Sepedonium ampullosporum. J.Pept.Sci. 9(11-12): 701-713.

124. Leclerc,G, Rebuffat,S, Goulard,C, Bodo,B (1998): Directed biosynthesis of peptaibol antibiotics in two Trichoderma strains. I. Fermentation and isolation. J.Antibiot.(Tokyo) 51(2): 170-177.

125. Finking,R, Marahiel,MA (2004): Biosynthesis of nonribosomal peptides 1. Annu.Rev.Microbiol 58: 453-488.

126. Wei,X, Yang,F, Straney,DC (2005): Multiple non-ribosomal peptide synthetase genes determine peptaibol synthesis in Trichoderma virens. Can. J Microbiol 51(5): 423-429.

127. Rebuffat,S, Conraux,L, Massias,M, uvin-Guette,C, Bodo,B (1993): Sequence and solution conformation of the 20-residue peptaibols, saturnisporins SA II and SA IV.1.t.J.Pept.Protein Res. 41(1): 74-84.

128. Jaworski,A, Bruckner,H (2001): Sequences of polypeptide antibiotics stilboflavins, natural peptaibol libraries of the mold Stilbella flavipes. J.Pept.Sci. 7(8): 433-447.

129. Goulard,C, Hlimi,S, Rebuffat,S, Bodo,B (1995): Trichorzins HA and MA, antibiotic peptides from Trichoderma harzianum. I. Fermentation, isolation and biological properties. J.Antibiot.(Tokyo) 48(11): 1248-1253.

130. Dornberger,K, Ihn,W, Ritzau,M, Grafe,U, Schlegel,B, Fleck,WF et al (1995): Chrysospermins, new peptaibol antibiotics from Apiocrea chrysosperma AplOl. J.Antibiot. (Tokyo) 48(9): 977-989.

131. Jaworski,A, Kirschbaum,J, Bruckner,H (1999): Structures of trichovirins II, peptaibol antibiotics from the mold Trichoderma viride NRRL 5243. J.Pept.Sci. 5(8): 341-351.

132. Lee,SJ, Yeo,WH, Yun,BS, Yoo,ID (1999): Isolation and sequence analysis of new peptaibol, boletusin, from Boletus spp. J.Pept.Sci. 5(8): 374-378.

133. Augeven-Bour,I, Rebuffat,S, Auvin-Guette,C, Goulard,C, Prigent,Y, Bodo,B (1997): Harzianin HB I, an 11-residue peptaibol from Trichoderma harzianum: isolation, sequence, solution synthesis and membrane activity. J.Chem.Soc.Perkin.Transl 1587-1594.

134. Rebuffat,S, Goulard,C, Bodo,B (1995): Antibiotic peptides from Trichoderma harzianum: harzianins HC, proline-rich 14-residue peptaibols. J.Chem.Soc.Perkin.Transl 1849-1855.

135. Wilhelm,C, Anke,H, Flores,Y, Sterner,О (2004): New peptaibols from Mycogone cervina. J.Nat.Prod. 67(3): 466-468.

136. Hou,CT, Ciegler,A, Hesseltine,CW (1972): New mycotoxin, trichotoxin A, from Trichoderma viride isolated from southern leaf blight-infected corn. Appl.Microbiol. 23(1): 183-185.

137. Harman,GE, Howell,CR, Viterbo,A, Chet,I, Lorito,M (2004): Trichoderma species-opportunistic, avirulent plant symbionts. Nat. Rev.Microbiol. 2(1): 43-56.

138. Elad,Y (2003): Biocontrol of foliar pathogens: mechanisms and application. Commun.Agric.Appl.Biol.Sci 68(4A): 17-24.

139. Irmscher,G, Jung,G (1977): The hemolytic properties of the membrane modifying peptide antibiotics alamethicin, suzukacillin and trichotoxin. Eur.J.Biochem. 80(1): 165-174.

140. Irmscher,G, Bovermann,G, Boheim,G, Jung,G (1978): Trichotoxin A-40, a new membrane-exciting peptide. Part A. Isolation, characterization and conformation. Biochim. Biophys.Acta 507: 470-484.

141. Matsuzaki,K, Shioyama,T, Okamura,E, Umemura,J, Takenaka,T, Takaishi,Y et al (1991): A comparative study on interactions of alpha-aminoisobutyric acid containing antibiotic peptides, trichopolyn I and hypelcin A with phosphatidylcholine bilayers.

142. Biochim.Biophys.Acta 1070(2): 419-428.

143. Nagaoka,Y, Iida,A, Kambara,T, Tachikawa,E, Asami,K, Fujita,T (1995): Effect of lipophilicity of trichosporin-Bs on ion-channel formation and catecholamine-releasing activity. Biol.Pharm.Bull. 18(4): 640-642.

144. Wada,S, Iida,A, Asami,K, Tachikawa,E, Fujita,T (1997): Role of the Gln/Glu residues of trichocellins A-H/B-II in ion-channel formation in lipid membranes and catecholamine secretion from chromaffin cells. Biochim.Biophys.Acta 1325(2): 209-214.

145. Peltola,J, Ritieni,A, Mikkola,R, Grigoriev,PA, Pocsfalvi,G, Andersson,MA et al (2004): Biological effects of Trichoderma harzianum peptaibols on mammalian cells.

146. Appl.Environ.Microbiol. 70(8): 4996-5004.

147. Matha,V, Jegorov,A, Kiess,M, Bruckner,H (1992): Morphological alterations accompanying the effect of peptaibiotics, alpha-aminoisobutyric acid-rich secondary metabolites of filamentous fungi, on Culex pipiens larvae. Tissue Cell 24(4): 559-564.

148. Mathew,MK, Nagaraj,R, Balaram,P (1981): Alamethicin and synthetic peptide fragments as uncouplers of mitochondrial oxidative phosphorylation. Effect of chain length and charge. Biochem.Biophys.Res.Commun. 98(2): 548-555.

149. Krishna,K, Sukumar,M, Balaram,P (1990): Structural chemistry and membrane modifying activity of the fungal polypeptides zervamicins, antiamoebins and efrapeptins. Pure&Appl.Chem. 62(7): 1417-1420.

150. Das,MK, Raghothama,S, Balaram,P (1986): Membrane channel forming polypeptides. Molecular conformation and mitochondrial uncoupling activity of antiamoebin, an alpha-aminoisobutyric acid containing peptide. Biochemistry 25(22): 7110-7117.

151. Okuda,M, Iida,A, Uesato,S, Nagaoka,Y, Fujita,T, Takaishi,Y et al (1994): Fungal metabolites. 10. The effect of peptide antibiotics, trichosporin-Bs, on the respiratory activity of mitochondria. Biol. Pharm. Bull. 17(4): 482-485.

152. Takaishi,Y, Terada,H, Fujita,T (1980): The effect of two new peptide antibiotics, the hypelcins, on mitochondrial function. Experientia 36(5): 550-552.

153. Matic,S, Geisler,DA, Moller,IM, Widell,S, Rasmusson,AG (2005): Alamethicin permeabilizes the plasma membrane and mitochondria but not the tonoplast in tobacco (Nicotiana tabacum L. cv Bright Yellow) suspension cells. Biochem.J. 389(3): 695-704.

154. Raj,PA, Das,MK, Balaram,P (1988): Conformations and Mitochondrial uncoupling activity of synthetic Emerimicin fragments. Biopolymers 27: 683-701.

155. Leclerc,G, Goulard,C, Prigent,Y, Bodo,B, Wroblewski,H, Rebuffat,S (2001): Sequences and antimycoplasmic properties of longibrachins LGB II and LGB III, two novel 20-residue peptaibols from Trichoderma longibrachiatum. J.iVar/.Prod. 64(2): 164-170.

156. Nagaoka,Y, Iida,A, Kambara,T, Asami,K, Tachikawa,E, Fujita,T (1996): Role of proline residue in the channel-forming and catecholamine-releasing activities of the peptaibol, trichosporin-B-VIa. Biochim.Biophys.Acta 1283(1): 31-36.

157. Kaduk,C, Duclohier,H, Dathe,M, Wenschuh,H, Beyermann,M, Molle,G et al (1997): Influence of proline position upon the ion channel activity of alamethicin. Biophys.J. 72(5): 2151-2159.

158. Duclohier,H, Snook,CF, Wallace,В A (1998): Antiamoebin can function as a carrier or as a pore-forming peptaibol. Biochim.Biophys.Acta 1415(1): 255-260.

159. Fonteriz,RI, Lopez,MG, Garcia-Sancho,J, Garcia,AG (1991): Alamethicin channel permeation by Ca2+, Mn2+ and Ni2+ in bovine chromaffin cells. FEBS Lett. 283(1): 8992.

160. Guihard,G, Falk,S, Vachon,V, Laprade,R, Schwartz,JL (1999): Real-time fluorimetric analysis of gramicidin D- and alamethicin-induced K+ efflux from Sf9 and Cfl insect cells. Biochemistry 38(19): 6164-6170.

161. Sakmann,B, Boheim,G (1979): Alamethicin-induced single channel conductance fluctuations in biological membranes. Nature 282(5736): 336-339.

162. Marshall,GR, Hodgkin,EE, Langs,DA, Smith,GD, Zabrocki,J, Leplawy,MT (1990): Factors governing helical preference of peptides containing multiple alpha,alpha-dialkyl amino acids. Proc.Natl.Acacl.Sci U.S.A 87(1): 487-491.

163. Bavoso,A, Benedetti,E, Di,BB, Pavone,V, Pedone,C, Toniolo,C et al (1988): Long, chiral polypeptide 3(10)-helices at atomic resolution. J.Biomol.Struct.Dyn. 5(4): 803-817.

164. Kumita,JR, Weston,CJ, Choo-Smith,LP, Woolley,GA, Smart,OS (2003): Prevention of peptide fibril formation in an aqueous environment by mutation of a single residue to Aib. Biochemistry 42(15): 4492-4498.

165. Nguyen,HH, Imhof,D, Kronen,M, Grafe,U, Reissmann,S (2003): Circular dichroism studies of ampullosporin-A analogues. J.Pept.Sci 9(11-12): 714-728.

166. Toniolo,C, Polese,A, Formaggio,F, Crisma,M, Kamphuis,J (1996): Circular Dichroism Spectrum of a peptide 3(10)-helix. J.Am.Chem.Soc. 118: 2744-2745.

167. Yoder,G, Keiderling,TA, Formaggio,F, Crisma,M, Toniolo,C (1995): Characterization of beta-bend ribbon spiral forming peptides using electronic and vibrational CD. Biopolymers 35(1): 103-111.

168. Anders,R, 0hlenschlager,0, Soskic,V, Wenschuh,H, Heise,B, Brown,LR (2000): The NMR solution structure of the ion channel peptaibol chrysospermin С bound to dodecylphosphocholine micelles. Eur.J.Biochem. 267(6): 1784-1794.

169. Anders,R, Wenschuh,H, Soskic,V, Fischer-Fruhholz,S, 0hlenschlager,0, Dornberger,K et al (1998): A solution NMR study of the selectively 13C, 15N-labeled peptaibol chrysospermin С in methanol. J.Pept.Res. 52(1): 34-44.

170. Cordier,F, Grzesiek,S (1999): Direct Observation of Hydrogen Bonds in Proteins by Interresidue 3hJNC' Scalar Couplings. J.Am.Chem.Soc. 121: 1601-1602.

171. Bunkoczi,G, Schiell,M, Vertesy,L, Sheldrick,GM (2003): Crystal structures of cephaibols. J.Pept.Sci. 9(11-12): 745-752.

172. Karle,IL, Flippen-Anderson,JL, Agarwalla,S, Balaram,P (1991): Crystal structure of Leul.zervamicin, a membrane ion-channel peptide: implications for gating mechanisms. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 88(12): 5307-5311.

173. Aubry,A, Bayeul,D, Bruckner,H, Schiemann,N, Benedetti,E (1998): The crystal state conformation of Aib-rich segments of peptaibol antibiotics. J.Pept.Sci. 4(8): 502-510.

174. Kronen,M, Gorls,H, Nguyen,HH, Reissmann,S, Bohl,M, Suhnel,J et al (2003): Crystal structure and conformational analysis of ampullosporin A. J.Pept.Sci. 9(11-12): 729-744.

175. Karle,IL, Balaram,P (1990): Structural characteristics of alpha-helical peptide molecules containing Aib residues. Biochemistry 29(29): 6747-6756.

176. Gessmann,R, Bruckner,H, Petratos,K (2003): Three complete turns of a 3(10)-helix at atomic resolution: the crystal structure of Z-(Aib)l 1-OtBu. J.Pept.Sci 9(11-12): 753-762.

177. Blasio,BDi, Pavone,V, Saviano,M, Lombardi,A, Nastri,F, Pedone,C et al (1992): Structural characterization of the beta-bend ribbon spiral: crystallographic analysis of two long (L-Pro-Aib)n sequential peptides. J.Am.Chem.Soc. 114: 6273-6278.

178. Li,SC, Goto,NK, Williams,KA, Deber,CM (1996): Alpha-helical, but not beta-sheet, propensity of proline is determined by peptide environment. Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 93(13): 6676-6681.

179. Cordes,FS, Bright,JN, Sansom,MS (2002): Proline-induced distortions of transmembrane helices. J.Mol.Biol. 323(5): 951-960.

180. Tieleman,DP, Shrivastava,IH, Ulmschneider,MR, Sansom,MS (2001): Proline-induced hinges in transmembrane helices: possible roles in ion channel gating. Proteins 44(2): 6372.

181. Sansom,MS, Weinstein,H (2000): Hinges, swivels and switches: the role of prolines in signalling via transmembrane alpha-helices. Trends Pharmacol.Sci 21(11): 445-451.

182. Bright,JN, Sansom,MS (2003): The Flexing/Twirling Helix: Exploring the Flexibility about Molecular Hinges Formed by Proline and Glycine Motifs in Transmembrane Helices. J.Phys.Chem.B 107: 627-636.

183. Jiang,Y, Lee,A, Chen,J, Cadene,M, Chait,BT, Mackinnon,R (2002): The open pore conformation of potassium channels. Nature 417(6888): 523-526.

184. Jin,T, Peng,L, Mirshahi,T, Rohacs,T, Chan,KW, Sanchez,R et al (2002): The (beta)gamma subunits of G proteins gate a K(+) channel by pivoted bending of a transmembrane segment. Mol.Cell 10(3): 469-481.

185. Deupi,X, 01ivella,M, Govaerts,C, Ballesteros,JA, Campillo,M, Pardo,L (2004): Ser and Thr residues modulate the conformation of pro-kinked transmembrane alpha-helices. BiophysJ. 86(1): 105-115.

186. Chugh,JK, Bruckner,H, Wallace,BA (2002): Model for a helical bundle channel based on the high-resolution crystal structure of trichotoxinA50E. Biochemistry 41(43): 1293412941.

187. Iida,A, Uesato,S, Shingu,T, Nagaoka,Y, Kuroda,Y, Fujita,T (1993): Fungal metabolites. 7. Solution structure of an antibiotic peptide, trichosporin B-V, from trichoderma-polysporum. J.Chem.Soc.Perkin.Transl 3: 375-379.

188. Rebuffat,S, Prigent,Y, uvin-Guette,C, Bodo,B (1991): Tricholongins BI and BII, 19-residue peptaibols from Trichoderma longibrachiatum. Solution structure from two-dimensional NMR spectroscopy. Eur.J.Biochem. 201(3): 661-674.

189. Esposito,G, Carver,JA, Boyd,J, Campbell,ID (1987): High-resolution 1H NMR study of the solution structure of alamethicin. Biochemistry 26(4): 1043-1050.

190. Kelsh,LP, Ellena,JF, Cafiso,DS (1992): Determination of the molecular dynamics of alamethicin using 13C NMR: implications for the mechanism of gating of a voltage-dependent channel. Biochemistry 31(22): 5136-5144.

191. Spyracopoulos,L, Yee,A, CNeiljJD (1996): Backbone dynamics of ans alamethicin in methanol and aqueous detergent solution determined by heteronuclear 1H-15N NMR spectroscopy. J.Biomol.NMR 7: 283-294.

192. Yee,AA, CNeil,JD (1992): Uniform 15N labeling of a fungal peptide: the structure and dynamics of an alamethicin by 15N and 1H NMR spectroscopy. Biochemistry 31(12): 3135-3143.

193. Dempsey,CE (1995): Hydrogen bond stabilities in the isolated alamethicin helix: pH-dependent amide exchange in methanol. J.Am.Chem.Soc. 117: 7526-7534.

194. Yee,AA, Marat,K, 0'Neil,JD (1997): The interactions with solvent, heat stability, and DC-labelling of alamethicin, an ion-channel-forming peptide. Eur.J.Biochem. 243(1-2): 283291.

195. Yee,A, Babiuk,R, 0'Neil,JD (1995): The conformation of an alamethicin in methanol by multinuclear NMR spectroscopy and Distance Geometry/Simulated Annealing. Biopolymers 36: 781-792.

196. Franklin,JC, Ellena,JF, Jayasinghe,S, Kelsh,LP, Cafiso,DS (1994): Structure of micelle-associated alamethicin from 1H NMR. Evidence for conformational heterogeneity in a voltage-gated peptide. Biochemistry 33(13): 4036-4045.

197. Condamine,E, Rebuffat,S, Prigent,Y, Segalas,I, Bodo,B, Davoust,D (1998): Three-dimensional structure of the ion-channel forming peptide trichorzianin ТА VII bound to sodium dodecyl sulfate micelles. Biopolymers 46(2): 75-88.

198. Yee,A, Szymczyna,B, CNeil,JD (1999): Backbone dynamics of detergent-solubilized alamethicin from amide hydrogen exchange measurements. Biochemistry 38(20): 64896498.

199. Gibbs,N, Sessions,RB, Williams,PB, Dempsey,CE (1997): Helix bending in alamethicin: molecular dynamics simulations and amide hydrogen exchange in methanol. Biophys.J. 72(6): 2490-2495.

200. Sessions,RB, Gibbs,N, Dempsey,CE (1998): Hydrogen bonding in helical polypeptides from molecular dynamics simulations and amide hydrogen exchange analysis: alamethicin and melittin in methanol. Biophys.J. 74(1): 138-152.

201. Vinogradova,0, Sonnichsen,F, Sanders,CR (1998): On choosing a detergent for solution NMR studies of membrane proteins. J.Biomol.NMR 11(4): 381-386.

202. Karle,IL, Flippen-Anderson, JL, Agarwalla,S, Balaram,P (1994): Conformation of the flexible bent helix of Leul-zervamicin in crystal С and a possible gating action for ion passage. Biopolymers 34(6): 721-735.

203. Sansom,MS, Balaram,P, Karle,IL (1993): Ion channel formation by zervamicin-IIB. A molecular modelling study. Eur.Biophys.J. 21(6): 369-383.

204. Korzhnev,DM, Bocharov,EV, Zhuravlyova,AV, Orekhov,VY, Ovchinnikova,TV, Billeter,M et al (2001): Backbone dynamics of the channel-forming antibiotic zervamicin IIB studied by 15N NMR relaxation. FEBS Lett. 495(1-2): 52-55.

205. Karle,IL, Perozzo,MA, Mishra,VK, Balaram,P (1998): Crystal structure of the channel-forming polypeptide antiamoebin in a membrane-mimetic environment. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A 95(10): 5501-5504.

206. Snook,CF, Woolley,GA, 01iva,G, Pattabhi,V, Wood,SF, Blundell,TL et al (1998): The structure and function of antiamoebin I, a proline-rich membrane-active polypeptide. Structure. 6(6): 783-792.

207. Galbraith,TP, Harris,R, Driscoll,PC, Wallace,В A (2003): Solution NMR studies of antiamoebin, a membrane channel-forming polypeptide. Biophys.J. 84(1): 185-194.

208. Gessmann,R, Benos,P, Bruckner,H, Kokkinidis,M (1999): The crystal structures of the synthetic C-terminal octa- and dodecapeptides of trichovirin. J.Pept.Sci. 5(2): 83-95.

209. Yantorno,R, Takashima,S, Mueller,P (1982): Dipole moment of alamethicin as related to voltage-dependent conductance in lipid bilayers. Biophys.J. 38(2): 105-110.

210. Schwarz,G, Savko,P (1982): Structural and dipolar properties of the voltage-dependent pore former alamethicin in octanol/dioxane. Biophys.J. 39(2): 211-219.

211. Rizzo,V, Stankowski,S, Schwarz,G (1987): Alamethicin incorporation in lipid bilayers: a thermodynamic study. Biochemistry 26(10): 2751-2759.

212. Vodyanoy,I, Hall,JE, Vodyanoy,V (1988): Alamethicin adsorption to a planar lipid bilayer. Biophys.J. 53(5): 649-658.

213. Milov,AD, Tsvetkov,YD, Gorbunova,EY, Mustaeva,LG, Ovchinnikova,TV, Raap,J (2002): Self-aggregation properties of spin-labeled zervamicin IIA as studied by PELDOR spectroscopy. Biopolymers 64(6): 328-336.

214. Schwarz,G, Savko,P, Jung,G (1983): Solvent-dependent structural features of the membrane active peptide trichotoxin A40 as reflected in its dielectric dispersion. Biochim.Biophys.Acta 728(3): 419-428.

215. Roy,G (1975): Properties of the conductance induced in lecithin bilayer membranes by alamethicin. J.Membr.Biol. 24(1): 71-85.

216. Woolley,GA, Deber,CM (1989): A lipid vesicle system for probing voltage-dependent peptide-lipid interactions: application to alamethicin channel formation. Biopolymers 28(1): 267-272.

217. Matsuzaki,K, Takaishi,Y, Fujita,T, Miyajima,K (1991): Hypelcin A, an alpha-aminoisobutiric-acid containing antibiotic prptide, induced fusion of egg yolk-L-alphaphosphatidilcholine small unilamelar vesicles. Colloid and Polimer Science 269(6): 604611.

218. Rebuffat,S, Duclohier,H, uvin-Guette,C, Molle,G, Spach,G, Bodo,B (1992): Membrane-modifying properties of the pore-forming peptaibols saturnisporin SA IV and harzianin HA V. FEMS Microbiol.Immunol. 5(1-3): 151-160.

219. Auvin-Guette,C, Rebuffat,S, Vuidepot,I, Massias,M, Bodo,B (1993): Structural elucidation of Trikoningins KA and KB, peptaibols from Trichoderma koningii. J.Chem.Soc.Perkin.Transl : 249-255.

220. Lucaciu,M, Rebuffat,S, Goulard,C, Duclohier,H, Molle,G, Bodo,B (1997): Interaction of the 14-residue peptaibols, harzianins HC, with lipid bilayers: permeability modifications and conductance properties. Biochim.Biophys.Acta 1323(1): 85-96.

221. Auvin-Guette,C, Rebuffat,S, Prigent,Y, Bodo,B (1992): Trichogin A IV, an 11-residue lipopeptaibol from trichoderma longibranchiatum. J.Am.Chem.Soc. 114: 2170-2174.

222. Matsuzaki,K, Nakai,S, Handa,T, Takaishi,Y, Fujita,T, Miyajima,K (1989): Hypelcin A, an alpha-aminoisobutyric acid containing antibiotic peptide, induced permeability change of phosphatidylcholine bilayers. Biochemistry 28(24): 9392-9398.

223. Vogel,H (1987): Comparison of the conformation and orientation of alamethicin and melittin in lipid membranes. Biochemistry 26(14): 4562-4572.

224. Fringeli,UP, Fringeli,M (1979): Pore formation in lipid membranes by alamethicin. Proc.Natl.AcadSciU.S.A 76(8): 3852-3856.

225. Haris,PI, Chapman,D (1988): Fourier transform infrared spectra of the polypeptide alamethicin and a possible structural similarity with bacteriorhodopsin. Biochim.Biophys.Acta 943(2): 375-380.

226. Schwarz,G, Stankowski,S, Rizzo,V (1986): Thermodynamic analysis of incorporation and aggregation in a membrane: application to the pore-forming peptide alamethicin. Biochim.Biophys.Acta 861(1): 141-151.

227. Schwarz,G, Gerke,H, Rizzo,V, Stankowski,S (1987): Incorporation kinetics in a membrane, studied with the pore-forming peptide alamethicin. Biophys.J. 52(5): 685-692.

228. Stankowski,S, Schwarz,UD, Schwarz,G (1988): Voltage-dependent pore activity of the peptide alamethicin correlated with incorporation in the membrane: salt and cholesterol effects. Biochim.Biophys.Acta 941(1): 11-18.

229. Barranger-Mathys,M, Cafiso,DS (1994): Collisions between helical peptides in membranes monitored using electron paramagnetic resonance: evidence that alamethicin is monomelic in the absence of a membrane potential. Biophys.J. 67(1): 172-176.

230. Wille,B, Franz,B, Jung,G (1989): Location and dynamics of alamethicin in unilamellar vesicles and thylakoids as model systems. A spin label study. Biochim.Biophys.Acta 986(1): 47-60.

231. Archer,SJ, Cafiso,DS (1991): Voltage-dependent conductance for alamethicin in phospholipid vesicles. A test for the mechanism of gating. Biophys.J. 60(2): 380-388.

232. Cascio,M, Wallace,BA (1988): Conformation of alamethicin in phospholipid vesicles: implications for insertion models. Proteins 4(2): 89-98.

233. Woolley,GA, Wallace,В A (1993): Temperature dependence of the interaction of alamethicin helices in membranes. Biochemistry 32(37): 9819-9825.

234. Woolley,GA, Epand,RM, Kerr,ID, Sansom,MS, Wallace,В A (1994): Alamethicin pyromellitate: an ion-activated channel-forming peptide. Biochemistry 33(22): 6850-6858.

235. Le,DT, el,HM, Rebuffat,S, Rajesvari,MR, Bodo,B (1986): Fluorescence studies of the interaction of trichorzianine A IIIc with model membranes. Biochim.Biophys.Acta 858(1): 1-5.

236. Baneijee,U, Zidovetzki,R, Birge,RR, Chan,SI (1985): Interaction of alamethicin with lecithin bilayers: a 31P and 2H NMR study. Biochemistry 24(26): 7621-7627.

237. Latorre,R, Miller,CG, Quay,S (1981): Voltage-dependent conductance induced by alamethicin-phospholipid conjugates in lipid bilayers. Biophys.J. 36(3): 803-809.

238. Dempsey,CE, Handcock,LJ (1996): Hydrogen bond stabilities in membrane-reconstituted alamethicin from amide-resolved hydrogen-exchange measurements. Biophys.J. 70(4): 1777-1788.

239. Bak,M, Bywater,RP, Hohwy,M, Thomsen,JK, Adelhorst,K, Jakobsen,HJ et al (2001): Conformation of alamethicin in oriented phospholipid bilayers determined by (15)N solid-state nuclear magnetic resonance. Biophys.J. 81(3): 1684-1698.

240. North,CL, Barranger-Mathys,M, Cafiso,DS (1995): Membrane orientation of the N-terminal segment of alamethicin determined by solid-state 15N NMR. Biophys.J. 69(6): 2392-2397.

241. Barranger-Mathys,M, Cafiso,DS (1996): Membrane structure of voltage-gated channel forming peptides by site-directed spin-labeling. Biochemistry 35(2): 498-505.

242. Okazaki,T, Sakoh,M, Nagaoka,Y, Asami,K (2003): Ion channels of alamethicin dimer N-terminally linked by disulfide bond. Biophys.J. 85(1): 267-273.

243. Sakoh,M, Okazaki,T, Nagaoka,Y, Asami,K (2003): N-terminal insertion of alamethicin in channel formation studied using its covalent dimer N-terminally linked by disulfide bond. Biochim.Biophys.Acta 1612(1): 117-121.

244. La,RP, Biggin,PC, Tieleman,DP, Sansom,MS (1999): Simulation studies of the interaction of antimicrobial peptides and lipid bilayers. Biochim.Biophys.Acta 1462(1-2): 185-200.

245. Kessel,A, Cafiso,DS, Ben-Tal,N (2000): Continuum solvent model calculations of alamethicin-membrane interactions: thermodynamic aspects. Biophys.J. 78(2): 571-583.

246. Kessel,A, Schulten,K, Ben-Tal,N (2000): Calculations suggest a pathway for the transverse diffusion of a hydrophobic peptide across a lipid bilayer. Biophys.J. 79(5): 2322-2330.

247. Jayasinghe,S, Barranger-Mathys,M, Ellena,JF, Franklin,C, Cafiso,DS (1998): Structural features that modulate the transmembrane migration of a hydrophobic peptide in lipid vesicles. Biophys.J 74(6): 3023-3030.

248. Fringeli,UP (1980): Distribution and diffusion of alamethicin in a lecithin/water model membrane system. J.Membr.Biol. 54(3): 203-212.

249. Tieleman,DP, Sansom,MS, Berendsen,HJ (1999): Alamethicin helices in a bilayer and in solution: molecular dynamics simulations. Biophys.J. 76(1): 40-49.

250. Huang,HW, Wu,Y (1991): Lipid-alamethicin interactions influence alamethicin orientation. Biophys.J. 60: 1079-1087.

251. Kikukawa,T, Araiso,T (2002): Changes in lipid mobility associated with alamethicin incorporation into membranes. Arch.Biochem.Biophys. 405(2): 214-222.

252. He,K, Ludtke,SJ, Heller, WT, Huang,HW (1996): Mechanism of alamethicin insertion into lipid bilayers. Biophys.J. 71(5): 2669-2679.

253. Wu,Y, He,K, Ludtke,SJ, Huang,HW (1995): X-ray diffraction study of lipid bilayer membranes interacting with amphiphilic helical peptides: diphytanoyl phosphatidylcholine with alamethicin at low concentrations. Biophys.J. 68(6): 2361-2369.

254. Stankowski,S, Schwarz,G (1989): Lipid dependence of peptide-membrane interactions. Bilayer affinity and aggregation of the peptide alamethicin. FEBS Lett. 250(2): 556-560.

255. Keller,SL, Gruner,SM, Gawrisch,K (1996): Small concentrations of alamethicin induce a cubic phase in bulk phosphatidylethanolamine mixtures. Biochim.Biophys.Acta 1278(2): 241-246.

256. Brumfeld,V, Miller,IR (1990): Electric field dependence of alamethicin channels. Biochim.Biophys.Acta 1024(1): 49-53.

257. Helluin,0, Dugast,JY, MoIle,G, Mackie,AR, Ladha,S, Duclohier,H (1997): Lateral diffusion and conductance properties of a fluorescein-labelled alamethicin in planar lipid bilayers. Biochim.Biophys.Acta 1330(2): 284-292.

258. Ide,T, Yanagida,T (1999): An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels. Biochem.Biophys.Res.Commun. 265(2): 595-599.

259. Kropacheva,TN, Salnikov,ES, Nguyen,HH, Reissmann,S, Yakimenko,ZA, Tagaev,AA et al (2005): Membrane association and activity of 15/16-membered peptide antibiotics: Zervamicin IIB, ampullosporin A and antiamoebin I. Biochim.Biophys.Acta 1715(1): 6-18.

260. Nagaoka,Y, Iida,A, Kambara,T, Asami,K, Fujita,T (1996): Role of Gln7 in the ion-channel-forming properties of the peptaibol trichosporin-B-VIa. Chem.Commun. 10791080.

261. Grigoriev,P, Schlegel,R, Dornberger,K, Grafe,U (1995): Formation of membrane channels by chrysospermins, new peptaibol antibiotics. Biochim.Biophys.Acta 1237(1): 1-5.

262. Duclohier,H, Alder,GM, Bashford,CL, Bruckner,H, Chugh,JK, Wallace,BA (2004): Conductance studies on trichotoxinA50E and implications for channel structure. Biophys.J. 87(3): 1705-1710.

263. Eisenberg,M, Hall,JE, Mead,CA (1973): The nature of the voltage-dependent conductance induced by alamethicin in black lipid membranes. J.Membr.Biol. 14(2): 143-176.

264. Mayer,M, Kriebel,JK, Tosteson,MT, Whitesides,GM (2003): Microfabricated teflon membranes for low-noise recordings of ion channels in planar lipid bilayers. Biophys. J. 85(4): 2684-2695.

265. Taylor,RJ, de,LR (1991): "Reversed" alamethicin conductance in lipid bilayers. Biophys. J. 59(4): 873-879.

266. Мак,DO, Webb, WW (1995): Two classes of alamethicin transmembrane channels: molecular models from single-channel properties. Biophys.J. 69(6): 2323-2336.

267. You,S, Peng,S, Lien,L, Breed,J, Sansom,MS, Woolley,GA (1996): Engineering stabilized ion channels: covalent dimers of alamethicin. Biochemistry 35(20): 6225-6232.

268. Hall,JE (1975): Access resistance of a small circular pore. Gen.Physiol. 66(4): 531-532.

269. Boheim,G, Hanke,W, Jung,G (1983): Alamethicin pore formation: Voltage-dependent flip-flop of a-helix dipoles. Biophys.Struct.Mech 9: 181-191.

270. Jaikaran,DC, Biggin,PC, Wenschuh,H, Sansom,MS, Woolley,GA (1997): Structure-function relationships in helix-bundle channels probed via total chemical synthesis of alamethicin dimers: effects of a Gln7 to Asn7 mutation. Biochemistry 36(45): 1387313881.

271. Woolley,GA, Biggin,PC, Schultz,A, Lien,L, Jaikaran,DC, Breed,J et al (1997): Intrinsic rectification of ion flux in alamethicin channels: studies with an alamethicin dimer. Biophys.J. 73(2): 770-778.

272. Rink,T, Bartel,H, Jung,G, Bannwarth,W, Boheim,G (1994): Effects of polycations on ion channels formed by neutral and negatively charged alamethicins. Eur.Biophys.J. 23(3): 155-165.

273. Boheim,G, Hanke,W, Eibl,H (1980): Lipid phase transition in planar bilayer membrane and its effect on carrier- and pore-mediated ion transport. Proc.Natl.AcadSci.U.S.A 77(6): 3403-3407.

274. Bruner,LJ, Hall,JE (1983): Pressure effects on alamethicin conductance in bilayer membranes. Biophys.J. 44(1): 39-47.

275. Opsahl,LR, Webb, WW (1994): Transduction of membrane tension by the ion channel alamethicin. Biophys.J. 66(1): 71-74.

276. Aguilella,VM, Bezrukov,SM (2001): Alamethicin channel conductance modified by lipid charge. Eur.Biophys.J. 30(4): 233-241.

277. Cantor,RS (2002): Size distribution of barrel-stave aggregates of membrane peptides: influence of the bilayer lateral pressure profile. Biophys.J. 82(5): 2520-2525.

278. Dan,N, Safran,SA (1998): Effect of lipid characteristics on the structure of transmembrane proteins. Biophys.J. 75(3): 1410-1414.

279. Hanke,W, Boheim,G (1980): The lowest conductance state of the alamethicin pore. Вiochim.Biophys.Acta 596(3): 456-462.

280. Koide,N, Asami,K, Fujita,T (1997): Ion-channels formed by hypelcins, antibiotic peptides, in planar bilayer lipid membranes. Biochim.Biophys.Acta 1326(1): 47-53.

281. Starostin,AV, Butan,R, Borisenko,V, James,DA, Wenschuh,H, Sansom,MS et al (1999): An anion-selective analogue of the channel-forming peptide alamethicin. Biochemistry 38(19): 6144-6150.

282. Asami,K, Okazaki,T, Nagai,Y, Nagaoka,Y (2002): Modifications of alamethicin ion channels by substitution of Glu-7 for Gln-7. Biophys.J. 83(1): 219-228.

283. Lougheed,T, Zhang,Z, Andrew,WG, Borisenko,V (2004): Engineering charge selectivity in model ion channels. Bioorg.Med.Chem. 12(6): 1337-1342.

284. Borisenko,V, Sansom,MS, Woolley,GA (2000): Protonation of lysine residues inverts cation/anion selectivity in a model channel. Biophys.J. 78(3): 1335-1348.

285. Bezrukov,SM, Vodyanoy,! (1993): Probing alamethicin channels with water-soluble polymers. Effect on conductance of channel states. Biophys.J. 64(1): 16-25.

286. Ternovsky,VI, Grigoriev,PA, Berestovsky,GN, Schlegel,R, Dornberger,K, Grafe,U (1997): Effective diameters of ion channels formed by homologs of the antibiotic chrysospermin. Membr. Cell Biol. 11(4): 497-505.

287. Vodyanoy,I, Bezrukov,SM, Parsegian,VA (1993): Probing alamethicin channels with water-soluble polymers. Size-modulated osmotic action. Biophys.J. 65(5): 2097-2105.

288. Matsue,T, Shiku,H, Yamada,H, Uchida,I (1994): Permselectivity of voltage-gated alamethicin ion channel studied by microamperometry. J.Phys.Chem. 98: 11001-11003.

289. Grigoriev,PA, Berg,A, Schlegel,R, Grafe,U (1997): Differences in ion permeability of an artificial bilayer membrane caused by ampullosporin and bergofungin, new 15-membered peptaibol-type. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 44: 155-158.

290. Duval,D, Riddell,FG, Rebuffat,S, Platzer,N, Bodo,B (1998): Ionophoric activity of the antibiotic peptaibol trichorzin PA VI: a 23Na- and 35C1-NMR study. Biochim.Biophys.Acta 1372(2): 370-378.

291. Miller,IR, Doll,L (1990): Release of ions from large unilamellar vesicles by alamethicin and by melittin. Bioelectrochemistry and Bioenergetics 24: 323-333.

292. O'Reilly,AO, Wallace,BA (2003): The peptaibol antiamoebin as a model ion channel: similarities to bacterial potassium channels. J.Pept.Sci. 9(11-12): 769-775.

293. Tieleman,DP, Berendsen,HJ, Sansom,MS (1999): Surface binding of alamethicin stabilizes its helical structure: molecular dynamics simulations. Biophys.J. 76(6): 3186-3191.

294. Tieleman,DP, Berendsen,HJ, Sansom,MS (2001): Voltage-dependent insertion of alamethicin at phospholipid/water and octane/water interfaces. Biophys.J. 80(1): 331-346.

295. Tieleman,DP, Berendsen,HJ, Sansom,MS (1999): An alamethicin channel in a lipid bilayer: molecular dynamics simulations. Biophys.J. 76(4): 1757-1769.

296. Ranee,M, Sorensen,OW, Bodenhausen,G, Wagner,G, Ernst,RR, Wuthrich,K (1983): Improved spectral resolution in COSY 1H NMR spectra of proteins via double quantum filtering. Biochem.Biophys Res.Commun. 117(2): 479-485.

297. Griesinger,C, Otting,G, Wuthrich,K, Ernst,RR (1988): Clean TOCSY for 'H spin system identification in macromolecules. J.Am.Chem.Soc. 110: 7870-7872.

298. Jeener,J, Meir,CN, Bachman,P, Ernst,RR (1979): Investigation of exchange processes by two-dimensional NMR spectroscopy. J.Chem.Phys. 71: 4546-4553.

299. Marion,D, Ikura,M, Tschudin,R, Bax,A (1989): Rapid recording of 2D NMR spectra without phase cycling. Application to the study of hydrogen exchange in proteins. J.Magn.Reson. 85: 393-399.

300. Piotto,M, Saudek,V, Sklenar,V (1992): Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions. J.Biomol.NMR 2(6): 661-665.

301. Lippens,G, Dhalluin,C, Wieruszeski,JM (1995): Use of a water flip-back pulse in the homonuclear NOESY experiment. J.Biomol.NMR 5: 327-331.

302. В artels,С, Xia,T, Billiter,M, Guntert,P, Wuthrieh,K (1995): The program XEASY for computer-supported NMR spectral analysis of biological macromolecules. J.Biomol.NMR. 6: 1-10.

303. Wuthrich,K (1986): NMR of Proteins and Nucleic Acids : John Wiley and Sons, New York.

304. Program Insight II; Accelrys San Diego, CA, USA. (2000).

305. Grzesiek,S, Bax,A (1992): Improved 3D triple-resonance NMR techniques applied to a 31-kDa protein. J.Magn.Reson. 96: 432-440.

306. Clubb,RT, Thanabal,V, Wagner,G (1992): A constant-time 3-dimensional triple-resonance pulse scheme to correlate intraresidue 1HN, 15N, and 13 С1 chemical-shifts in 15N-OC'-labeled proteins .J.Magn.Reson. 97: 213-217.

307. Brown,LR, Farmer,ВТ (1989): Rotating-frame nuclear Overhauser effect. Methods Enzymol. 176: 199-216.

308. Koradi,R, Billeter,M, Wuthrich,K (1996): MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures. J.Mol.Graph. 14(1): 51-55. Program SYBYL; Tripos,Inc. St.Louis, MO, USA. (1992).

309. Wishart,DS, Case,DA (2001): Use of chemical shifts in macromolecular structure determination. Methods Enzymol. 338: 3-34.

310. Baxter,NJ, Williamson,MP (1997): Temperature dependence of 1H chemical shifts in proteins. J.Biomol.NMR 9(4): 359-369.

311. Cornilescu,G, Ramirez,BE, Frank,K, Clore,GM, Gronenborn,AM, Bax,A (1999): Correlation between 3hJNC' and Hydrogen Bond Length in Proteins. J.Am.Chem.Soc. 121: 6275-6279.

312. Baker,EN, Hubbard,RE (1984): Hydrogen bonding in globular proteins. Prog.Biophys.Mol.Biol. 44(2): 97-179.

313. Barfield,M (2002): Structural dependencies of interresidue scalar coupling (h3)J(NC') and donor (1)H chemical shifts in the hydrogen bonding regions of proteins. J.Am.Chem.Soc. 124(15): 4158-4168.

314. Scheurer,C, Bruschweiler,R (1999): Quantum-chemical characterization of nuclear spin-spin couplings across hydrogen bonds. J.Am.Chem.Soc. 121: 8661-8662.

315. Markwick,PR, Sprangers,R, Sattler,M (2003): Dynamic effects on j-couplings across hydrogen bonds in proteins. J.Am.Chem.Soc. 125(3): 644-645.

316. Jaravine,VA, Alexandrescu,AT, Grzesiek,S (2001): Observation of the closing of individual hydrogen bonds during TFE-induced helix formation in a peptide. Protein Sci. 10(5): 943-950.

317. Juranic,N, Ilich,PK, Macura,S (1995): Hydrogen bonding networks in proteins as revealed by the amide 1JNC' coupling constant. J.Am.Chem.Soc. 117: 405-410.

318. Llinas,M, Klein,MP (1975): Charge relay at the peptide bond. A proton magnetic resonance study of solvation effects on the amide electron density distribution. J.Am.Chem.Soc. 97: 4731-4737.

319. Juranic,N, Moncrieffe,MC, Likic,VA, Prendergast,FG, Macura,S (2002): Structural dependencies of h3JNC' scalar coupling in protein H-bond chains. J.Am.Chem.Soc. 124(47): 14221-14226.

320. Asakura,T, Taoka,K, Demura,M, Williamson,MP (1995): The relationship between amide proton chemical shifts and secondary structure in proteins. J.Biomol.NMR 6: 227-236.

321. Blanco,FJ, Herranz,J, Gonzalez,C, Jimenez,MA, Rico,M, Santoro,J et al (1992): NMR chemical shifts: a tool to characterize distortions of peptide and protein helices. J.Am.Chem.Soc. 114: 9676-9677.

322. Brown,LR, Bosch,K, Wuthrich,K (1981): Location and orientation relative to the micelle surface for glucagon in mixed micelles with dodecylphosphocholine. Biochim.Biophys.Acta 642: 296-312.

323. Lauterwein,J, Bosch,C, Brown,LR, Wuthrich,K (1979): Physicochemical studies of the protein-lipid interactions in melittin-containing micelles. Biochim.Biophys.Acta 556(2): 244-264.

Информация о работе

Шенкарев, Захар Олегович
кандидата физико-математических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.02

Диссертация

Исследование структуры и динамики каналообразующего антибиотика зервамицина-IIB в мембрано-моделирующих средах методом спектроскопии ЯМР - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы