Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Метилотрофные бактерии как основа биотехнологического получения стабильно меченых биологически активных соединений
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология
Автореферат диссертации по теме "Метилотрофные бактерии как основа биотехнологического получения стабильно меченых биологически активных соединений"
РГ ь ОД - - Д2.03
На правах рукописи
С КЛАДИ ЕВ Дмитрий Анатольевич
МЕТИЛОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ КАК ОСНОВА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПОЛУЧЕНИЯ СТАБИЛЬНО МЕЧЕНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
03.00.23 - БИОТЕХНОЛОГИЯ
АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЁНОЙ СТЕПЕНИ ДОКТОРА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК
МОСКВА 2000
Работа выполнена в Государственном Научном Центре ГосНИИгенетика и в Московской Государственной Академии тонкой химической технологии.
Научный консультант доктор химических наук, член-корреспондент АМН
ШВЕЦ Виталий Иванович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, член-корреспондент РАН
ГАЛЬЧЕНКО Валерий Фёдорович доктор химических наук, профессор
ЗВОНКОВА Елена Николаевна доктор химических наук, член-корреспондент РАН
МЯСОЕДОВ Николай Фёдорович
Ведущая организация
Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (ГосНИИсинтезбелок), Москва, Большая Коммунистическая ул., 27.
Защита состоится 2000 г. в70"*°часов на заседании Диссертационн
совета Д. 053.34.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева, Москва, 125190, Миусская пл.,
С диссертацией можно ознакомиться в научно-информационном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.
Автореферат разослан ЛЬ марта 2000 г.
Учёный секретарь Диссертационного совета Д. 053. 34.13, кандидат биологических наук ' ¿^ ' И.И. ГУСЕВА
Е otLS'b-dte, 0
/ / о и / . /)
ВВЕДЕНИЕ
Настоящая работа посвящена исследованию научных основ использования ¡етилотрофных бактерий для биотехнологического получения биологически кгивных соединений, меченных атомами стабильных изотопов, олучаемые меченые соединения предназначены для использования как в труктурно-функциональных биохимических и фармакокинетических научных сследованиях, так и в различных областях медицины.
Основные открытия естествознания последней четверти XX века не были ы возможны без огромных успехов в электронном приборостроении и в области энких химических технологий. Именно благодаря разработке всё более совер-юнного научного оборудования, позволяющего регистрировать и анализировать сё более тонкие молекулярные взаимодействия, пополняются наши знания. И менно на фоне развития мирового рынка особо чистых реактивов появляются озможности сравнительно легко обнаруживать, выделять, исследовать и одифицировать практически любые биологические соединения и структуры. 1аркирование био-молекул для проведения таких работ может осуществляться элько на молекулярном уровне. Применение радиоизотопов в таких кспериментах ограничивается опасностью для объекта исследования, а также из-1 наведённых радиационных эффектов на соседние молекулы. Использование табильной изотопной метки не имеет ограничений, ем не менее каталоги изотопно меченых соединений предлагают весьма граниченный круг веществ, а высокие цены ещё более сдерживают применение в аучной и медицинской практике препаратов, представленных на этом секторе ирового рынка особо чистых реактивов. Вместе с тем, нельзя представить себе альнейший прогресс в естественных науках и медицине без расширения приме-ения именно этой методологии - методологии стабильных изотопов.
Данная работа демонстрирует возможности использования биосинтетичес-зго потенциала метилотрофных бактерий для существенного асширения спектра производства биологически активных соединений (БАС), еченных атомами именно стабильных изотопов (СМ).
Метилотрофы один из излюбленных объектов биотехнологических сследований, благодаря хорошим ростовым и биосинтетическим свойствам при оступности и низкой стоимости ростовых субстратов, непатогенности этих икроорганизмов, наличию весьма специфических, но достаточно хорошо зученных ферментативных и регуляторных систем.
Общая схема предлагаемого подхода к получению СМ БАС н основе использования метилотрофных бактерий, представлена на рисунке 1 Первый этап состоит в культивировании метилотрофных бактерий на ростовы средах с низкомолекулярными источниками изотопной метки для конверси атомов стабильных изотопов в компоненты «метилотрофной» биомасс! (метилотрофы - первичные продуценты СМ биомассы). Источниками изотопно метки были наиболее доступные низкомолекулярные соединения, содержащи изотопы водорода - дейтерий - Р (2Н), углерода - "С, азота -15Ы. Поскольку сред| не содержат немеченых соединений, основным продуктом, получаемым на это: этапе, является биомасса метилотрофов, тотально меченая по соответствующс му типу атомов. После частичного разрушения (автолиза) этой СМ биомассы приготовлении из неё полноценных ростовых сред, на втором этапе проводите культивирование вторичных гетеротрофных продуцентов, синтезирующих спець фические целевые СМ БАС в значительных количествах. Таким образок предлагаемая схема может быть использована для получения любых классо меченых органических соединений, накапливаемых в клетках микроорганизме! либо секретируемых в ростовую среду.
Поскольку стоимость всех соединений, включающих атомы стабипьн изотопов, весьма высока, мы провели исследования, направленные существенное снижение потерь изотопно меченых материалов. В результате бь отработана методика реутилизации тяжёлой воды из культуральных жидкостей также показана возможность использования любых препаратов СМ биомасс > приготовления следующих партий полноценных стабильно меченых ростовых ср
_Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в разрабс
эффективной системы для получения любых СМ БАС, которые могут 61 синтезированы клетками микроорганизмов разной таксономической принадл ности, на основе использования биотехнологического потенциала метилотроф» бактерий. В соответствии с этим в работе ставились следующие основные задач
1. Определить условия, позволяющие культивировать различные метилотрофны бактерий на средах из тяжёлой воды с дейтеро-метанолом в качестве единственного источника углерода и энергии. Изучить возможность получения БАС тотально меченных дейтерием, 13С, "л, а также наработать препараты тотальн меченой биомассы метилотрофов для выделения и исследования! СМ БАС,
2. Разработать методику приготовления полностью дейтерированных полноценн ростовых сред на основе высокодейтерированной биомассы метилотрофов, а также иных вариантов сред, тотально меченых стабильными изотопами.
Рис. 1. Общая схема получения стабильно меченых БАС на основе использования метилотрофных бактерий. КЖ - культуральная жидкость, БМ - биомасса,! АЛ - автолизат.
3. Проверить приемлемость этих сред для наработки разнообразных СМ БАС, синтезируемых различными гетеротрофными микроорганизмами.
4. Изучить распределение изотопов водорода при культивировании археобактери на высокодейтерированной ростовой среде.
5. Отработать метод реутилизации тяжёлой воды и образцов стабильно меченой биомассы использованных микроорганизмов.
Актуальность темы определяется всё более расширяющимся использов нием в разнопрофильных научных исследованиях и медицинской практи! различных СМ БАС. Эта тенденция наблюдается несколько последних лет, сдерживается только всё ещё высокой стоимостью самих СМ соединений и, большей степени, ценой научных приборов для их детекции и исследовани Предлагаемая технология может частично решить первую из названых проблем.
Научная новизна. Впервые было проведено широкое исследование возм жности использования разных групп метилотрофных бактерий в качест! «первичного объекта» для биотехнологического мечения БАС атомами стабильнь изотопов. Впервые проведена адаптация нескольких метилотрофов к полность дейтерированным ростовым средам. Отработана методика культивирован! адаптированных бактерий в условиях лабораторного ферментёра на тяжёловоднс ростовой среде с дейтеро-метанолом в качестве единственного источника углер да для получения тотально дейтерированной биомассы. Впервые показано, ч' клетки облигатного метипотрофа Methylobacillus flagellatum KT синтезируют зкзоп ли%уктаны, как на обычных, так и на высокодейтерированных средах. Изуче! распределение дейтериевой и 13С метки в аминокислотах метилотрофов. Onpei лён способ приготовления полноценных тотально дейтерированных ростовь сред, обеспечивающих нормальный рост и биосинтез целевых продуктов разл« ными гетеротрофными микроорганизмами. Проведён анализ динамики изменен уровня дейтерия в культурапьной жидкости в процессе роста гапобактерк Впервые биосинтетическим путём получены разнообразные высокомеченные БА Практическая значимость предлагаемой комплексной, практически безотхс ной технологии, состоит в том, что она позволяет относительно быстро получа широкий спектр органических соединений с максимальным содержанием атом дейтерия, 13С, 15N. Получены в униформно дейтерированном виде нуклеозидь инозин и тимидин (продуценты Bacillus subtillis и Bacillus amylollquefaciens), а так тотально дейтерированные липиды Halobacterium salinarium и 5-зндотокс Bacillus thuringiensis. Усовершенствованы методики выделения и очист пептидного антибиотика зервамицина, синтезируемого мицелиальным . гриб
sricelopsis salmasinnemata. Впервые биосинтетическим путём наработан ально 15Ы-мечейный зервамицин и показана возможность получения его логов, полностью дейтерированных и с двойной меткой 13C+15N.
В целом, использование предлагаемого комплексного, практически отходного подхода, позволяет относительно быстро получать широкий спектр динений, тотально меченных дейтерием,13с, 1SN. Такими соединениями могут гь различные аминокислоты, белки, сахара и полисахариды, нуклеозиды, [иллярные токсины, жирные кислоты и антибиотики, требующихся для >ведения самого разного рода научных и медицинских исследований.
Основные результаты исследований, изложенные в диссертации, получены ором в Институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов. Часть íot по выделению и весь анализ молекулярного и изотопного состава |учаемых соединений проводился совместно с сотрудниками и аспирантами )едры Биотехнологии МГАТХТ им. М.В. Ломоносова.
Апробация работы состоялась на заседании Межлабораторного семинара ;НИИ генетика 1 июля 1999 года. Материалы исследований представлялись на дующих научных конференциях: Vil Международная конференция по стабиль-и изотопам, 1989г., Тбилиси (СССР); Международный симпозиум "Interbiotech" Ог., Братислава (ЧССР); VII Международный Конгресс по генетике >мышленных микроорганизмов 1994г., Квебек (Канада); VII и VIII Международные ипозиумы по Ci соединениям - 1992г., Варвик (Великобритания) и 1995г., Сан-зго (США); Конференция по трансмембранным белкам 1998г., Лондон ликобритания); VI Международная научно-практическая конференция "Науко-сие химические технологии-99", 1999г., Москва (Россия).
Объём и структура диссертации. Работа изложена на 204 страницах, содержит таблиц и 36 рисунков. Работа включает следующие разделы: введение, обзор ературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список -ированных публикаций (409 названий). Основные главы обзора литературы :вящены анализу новейших данных по вопросам получения и использования <ёлой воды и более сложных дейтерированных, а также 13С- и 15И-меченных БАС ручных исследованиях и медицинской практике. Рассмотрены также вопросы, данные с использованными модельными микроорганизмами -гилотрофными и галофильными бактериями, бациллами, I мицелиапьными |бами (каждый из этих разделов обзора предшествует соответствующей главе, держащей результаты собственных исследований).
б
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использованы микроорганизмы из Всесоюзной коллекции промышлен! микроорганизмов (ВКПМ) ГосНИИгенетика, часть штаммов получена в х выполнения данных исследований.
Название Генотип 1 Фенотип
Methylobacillus flagellatum КТоблигатный метилотроф
MFK //е Не, продуцент L-лейцина
MFK5 прототроф
MFK5D* прототроф, адаптирован к D20+CD30D-cpefle
MFK5-1, 5-2, 5-3* прототрофы, повышена секреция ЭПС
MFK5-3D* прототроф, повышена секреция ЭПС, адаптирован к D20+CD30D-cpefle
Brevibacterium methylicum факультативный метилотроф
В5652 leu, продуцент L-фенилаланина
B5652D* leu, продуцент L-фенилаланина, адаптирован к D20+CD30D-cpefle
L+D* прототроф, адаптирован к D20+CD30D-cpeAe
Methylobacterium extorquens ф а культативный метилотроф
8РМ прототроф, продуцент р-полиоксибутирата
6077* прототроф, продуцент С30-каротиноида
6077D* прототроф, адаптирован к D20+CD30D-cpefle
Гетеротрофные микроорганизмы
Bacillus subtillis В3157 his tyr ade ига, продуцент инозина
Bacillus subtillis 18D* his tyr ade ига, адаптирован к 020-среде, продуцент дейтеро-инозин
Bacillus amyloliquefaciens BS643 ade ига, продуцент тимидина
Bacillus thuringiensis kurstahi прототроф, продуцент 5-эндотоксина
Halobactorium halobium ET1001 прототроф, синтезирует бактериородопсин
Halobacterium halobium 353П прототроф, накапливает бактериородопсин и бакгериоруберин
Emericellcpsis salmosynnemata 336IMI 58330 прототроф, накапливает пептаибол зервамицин НЕ
* - отмечены бактериальные штаммы, полученные в ходе данной работы. В работе применяли реактивы квалификации не ниже «ХЧ», для приготоши тяжёловодных ростовых сред - только безводные соли. В качестве источн стабильных изотопов использовали тяжёлую воду 020 (99,85ат.% О), С[ (99,5ат.% О), "СНзОН (99,0ат.% 13С), 15ЫН4С1 {99,5ат.% 15М) и йС1 (99,5ат.% Э) автолизе клеток.
Основная ростовая среда для метилотрофов - минимальная среда М9 содер: Н20, метанол (0,3-2об.%) как единственный источник углерода и энергии. В получения дейтерированных БАС и дейтерированной биомассы использо среду того же состава, но приготовленную из й20 с дейтеро-метанолом СР300.
1я культивирования микроорганизмов на тяжёловодных ростовых средах пользовали специально разработанное и изготовленное микробиологическое ¡орудование - пробки-ловушки - модифицированные аналоги хлоркапьциевой убки. В отличие от традиционных, эти пробки обеспечивают обычный уровень ерильной аэрации выращиваемых культур, но препятствуют нежелательному азбавлению дейтериевой метки тяжёлой воды за счёт поглощения |ров атмосферной влаги.
'льтивирование микроорганизмов проводили в стандартных для каждого вида ловиях. При использовании высокодейтерированных сред температуру льтивирования снижали на 5-8°С.
>аненили бактериальные культуры, адаптированные к высокодейтерированным >едами, в бакпечатках на агаризованных средах соответствующих составов. »щеление и очистку целевых БАС, в том числе СМ БАС, осуществляли андартными методами.
зтолиз стабильно меченой биомассы для использования в качестве ростовых ■бстратов в составе полноценных сред вели в мягких слабо кислых условиях, :ключающих обратный изотопный обмен ОоН.
зентификацию стабильно меченых соединений проводили сопоставлением их гсктральных и хроматографических характеристик с литературными данными, а кже подтверждали данными масс-спектрометрического анализа, спектроскопии ИР.
гепени включения дейтерия в аминокислоты определяли методом масс-шктрометрии электронного удара у метиловых эфиров дансил-аминокислот, >торые химически стабильны и дают интенсивные пики молекулярных ионов. Мы ¡пользовали модификацию метода получения таких производных, закпюча-иуюся в прямой обработке препаратов культуральной жидкости или гидролизата )лка дансилхпоридом и диазометаном. В результате применения этого подхода (аоалось получать чётко интерпретируемые масс-спектры в присутствии ледовых количеств низкомолекулярных метаболитов и сопутствующих линокислот не прибегая к их предварительному хроматографическому разделению очистке.
пределение уровня содержания дейтерия в тяжёловодных ростовых средах эоводили на дифракционном спектрофотометре ДСФ после осаждения клеток.
РЕЗУЛЬТАТЫ If ОБСУЖДЕНИЕ СТАБИЛЬНО МЕЧЕНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, СИНТЕЗИРУЕМЫЕ МЕТИЛОТРОФНЫМИ БАКТЕРИЯМИ - ПЕРВИЧНЫМИ ГТ Р О ДУ ЦЕ ИТ А М И СМ БАС 1.Получение высокодейтерированных БАС, синтезируемых облигатными метилотроФными бактериями.
Использование облигатных метклотрофных баетерий в качестве прод\ центов СМ БАС представляет особы» интерес. Облигатность этих микроорганизме исключает возможность разбавления изотопной метки метанола атомами каки: либо иных источников углерода и энергии. Это особенно важно при получени униформно дейтерированных и униформно 13С-меченых соединений, а также CI БАС, несущих эти изотопы в составе множественной изотопной метки.
Определение степени природной устойчивости облигатных метипотрофны бактерий штамма M.flaaellatum КТ к тяжёлой воде и дейтеро-метанолу мы пров< дили впервые. Культивирование бактерий в пробирках, содержащих различны концентрации этих и обычных - протонированных - компонентов ростовых сре показало, что полностью дейтерированный метанол (CD3OD) в концентрации 1об.' в обычной водной среде снижает выход биомассы лишь на 20%. Это наблюден» можно трактовать как ■ проявление довольно высокой устойчивости клеток дейтерированному аналогу единственного источника углерода и энергии, которь могут использовать данные метилотрофные бактерии (рис.2).
Повышение доли ОгО в сред напротив, приводит к заметно!» ингибированию роста бактерий уя при концентрации 50об.% и ей более усиливается при 85об." особенно если в среде прису ствует СРзОО. Таким образом, з опыты показали значительну
1Р%С030Р
Рис. 2. Зависимость накопления биомассы М.Ааде11а№т (00) от концентрации тяжёлой воды и дейтеро-метанола.
! 1 чувствительность М.Паде1Шит КТ 0 высокодейтерированным ростовь , средам. Дальнейшее изучен!
ростовых характеристик штам> 11 М.Аадс!Шит КТ было продолже! на минимальных средах п|
'нцентрациях Р20, которые позволяли получать достаточное количество био-1ссы для анализа её изотопного состава.
Для определения степени включения дейтерия в аминокислоты методом масс-1ектрометрии электронного удара использовали метиловые эфиры дансил-1инокислот, которые химически стабильны и дают интенсивные пики молеку-|рных ионов в масс спектрах. Мы использовали собственную модификацию гтода получения метиловых эфиров даксил-аминокислот заключавшуюся в пря-зй обработке препаратов культуральной жидкости, полученной после отделения 1вток, дансилхлоридом и диазометаном. В результате применения этого подхода 1апось получить чётко интерпретируемые масс-спектры электронного удара этиловых эфиров дансил-аминокислот на фоне низкомолекулярных метаболитов, >исутствующих в среде, и сопутствующих аминокислот не прибегая к их юдварительному хроматографического разделению или очистке. При ерификации аминокислот диазометаном не исключено дополнительное М-гтилирование по а-ЫНг-группе аминокислот, что приводит к появлению в масс-1ектре метиловых эфиров дансил-аминокислот пиков, соответствующих ►единениям с молекулярной массой на 14 массовых единиц больше исходных, педует подчеркнуть, что протоны (дейтероны) при гетероатомах в МН2-, и ЭОН-группах аминокислот, за счёт лёгкости диссоциации могут обменивать ся на ;йтерий даже при растворении аминокислот в й20 и поэтому трудно поддаются 1Чному подсчёту при определения степеней дейтерированности.
1« .. Данный подход мы
зр
Г -соом
, М+-
применили для изучения уровня включения дейтерия в БАС, синтезируемые клетками облигатного метилотрофа М.ПадеИаЪт. Исследовали секретируемые аминокислоты из препаратов-лиофипизиро-
Рис. 3. Схема фрагментаций молекул г-Ьеи-ОН и масс-спектры препаратов, выделенных из культу-ральных жидкостей М.ЛадеНа^т: А - Н20-среда, Б - 50% 020- среда.
ванных интактных ЮК, свободных от белков и полисахаридов. На рисунке приведены масс-спектры Z-Leu-OH, выделенного из ЮК M.flagellatum 50об.%-ис йгО-среды. Присутствие в масс-спектре этого дериватизованного образца КЖ nni молекулярного иона Z-Leu-OH с М+. при m/z 283 (269+14) (вместо m/z 279 (265+1 для обычного Z-Leu-OH) свидетельствует о том, что степень включения дейтерия молекулы секретируемого лейцина составляет 45%.
При выделении аминокислот из фракции суммарных белков биомассы метилотрофных бактерий M.flagellatum мы использовали остаток после исчерпывающего отделения пигментов и липидов экстракцией органическими растворителями. Во всех случаях гидролиз белков проводили в условиях, предотвращающих реакции обратного изотопного обмена (Do>H). Полученные в результате гидролиза смеси свободных аминокислот также дериватизовали DnsCI (ZCI) и CH2N2. Как видно из рис. 4, до одиннадцати индивидуальных аминокислот могут быть идентифицированы в масс-спектре гидролизата белка, полученного таким путём.
Рис. 4. Масс-спектры гидролизатов клеточных белков М.Ладе1Шит КТ: из протонированной биомассы (А), из биомассы, полученной на среде, содержащей 50об.% 020 и 1об.% СР300 (Б).
тбор бактерий М.АадеНаЬлп КТ. адагггированых к высокодейтерированным средам. этребовал проведения исследований по поиску оптимальных путей получения 1ких форм. Для проведения адаптации метилотрофа М.Яаде1Шит КТ был выбран рототрофный штамм ГЛРК5. Мы использовали ступенчатый режим увеличения энцентрации й20 в ростовых средах, так как полагали, что постепенное привыкание» клеток к высокодейтерированной среде позволит легче преодолеть гмеченное выше бакгериостатическое действие тяжёлой воды.
Ступенчатый режим увеличения концентрации Р20 в среде предполагал на аждом этапе уменьшение остаточной доли протия примерно в два раза:
50% - 75% - 90% - 100%. акие среды для первых трёх этапов приготовляли из необходимых объёмов ысокодейтерированной и обычной среды. В качестве источника углерода и нергии во всех перечисленных вариантах сред использовали СОзОЭ.
В многочисленных экспериментах по адаптации метилотрофа М.Паде11а№т КТ ыпо установлено, что более воспроизводимые результаты получаются на твёрдых редах. На каждый этап бактериям требуется три дня, что на один день больше, чем ри росте на протонированных средах. Как было отмечено в литературе для иных ¡икроорганизмов, клетки М.Паде11а№т КТ адаптировались к 020-среде только при емпературе несколько ниже обычной для роста метилотрофа - 37°С вместо птимальной - 42°С.
Необходимо подчеркнуть, что наибольшие затруднения для роста культуры в роцессе ступенчатой адаптации вызвал переход от 75% 020 к более высоким онцентрациям. Для преодоления этого «70%-ного барьера» мы применяли три заимодополняющих приёма: введение в среду, автолизата высокодейтериро-анной биомассы другого метилотрофа В.теМуНсит, увеличении содержания макроэлементов и снижение концентрации СРзСЮ до 0,3об.%. Эти модификации 020-ред позволяла бактериям легче достигать устойчивого роста на 100%-ной Э20-реде.. Впоследствии адаптированную культуру М.ЯадеШит КТ, получившую |бозначение МРК50, выращивали на высокодейтерированной среде уже без (обавления дейтеро-автолизата.
Аналогичный подход применяли и при получении адаптированных форм иных итаммов метилотрофных бактерий. Следует отметить, что адаптация факультативных метилотрофных бактерий (проводившаяся тем же методом) всегда фоходила легче, чем у облигатного метилотрофа М.АадеНаЫт КТ.
Культивирование М.ПадеПаМт КТ МРК5Р на высокодейтерированной среде е условиях лабораторного ферментера. Получение значительных количестс микробной биомассы в колбочных опытах проблематично. Проведение экспери ментов в ферментере - принципиальный шаг к разработке промышленной техно логии любого биотехнологического процесса. Как и в колбах, культивирование бактерий М.ЛадеИаЬлп КТ МЯКбО в ферментере в 020+С0300-среде вели пp^ пониженной температуре (37°С), в ходе эксперимента контролировали значение оптической плотности (СЮ) и уровень рН. На основе кривых роста (рис.2 определили, что время генерации культуры в условиях культивирования н; дейтеро-среде в ферментере - Ючас., лишь немного превышает обычное дл! данного вида метилотрофов время генерации при культивировании е накопительном режиме - 8час. Вместе с тем заметно увеличивается протяжённости лаг-фазы - около бОчас. Предположительно, задержка начала роста культуры н: дейтеро-среде объясняется большей чувствительностью клеток метилотрофа I резким перепадам концентраций ростовых субстратов, например, дейтеро метанола.
В ходе ферментации бактерий М.Ладе1Шит КТ МРК50 были проведены дв< подпитки культуры дейтеро-метанолом. Добавка 1об.% чистого СРзСЮ I логарифмической фазе роста не повлияла на скорость деления клеток - она и та была максимальной в тот момент. Вторая добавка (в начале перехода
стационарной фазе вносили 10об.% ный раствор СОзОЭ в свежей дейтерс среде) простимулировала рост куль туры. Вместе с тем внесение свеже среды не смогло уменьшит негативное влияние накопившихся культуральной жидкости п роду кто жизнедеятельности - угол наклон кривой роста заметно меньше, чем логарифмической фазе (рис. 5).
Определение содержания дейте
20 40 60 80 100 120 140
время культевирования(час) Рия в культуральной жидкости в конц
Рис. 5. Кривые роста М.ПадеПаШт в условиях опыта показало очень незначительно оГ=:о0::и^Гн:= доГоГсозоо. разбавление тяжёлой воды - лишь д
5,8ат.% Э, что позволяло сделать заключение об униформном характере ечения полученной дейтеро-биомассы.
Следует отметить, что в ходе проведенных культивирований в ферментере ыход сырой дейтерированной биомассы М.Ладе1Шит КТ МРК50 достигал Юг/л. аким образом, именно в ходе данной работы впервые была проведена наработка ейтеро-биомассы облигатных метилотрофных бактерий в лабораторном юрментере на среде с максимальным содержанием дейтерия. Этот результат озволил продолжить работу в направлении получения униформно ейтерированных полноценных ростовых сред для культивирования вторичных родуцентов СМ БАС.
Изучение биосинтеза экзополисахаридов метилотрофом М.ЛадеНаЬ/т КТ.
В литературе имеются данные о способности некоторых представителей рода \ethylobacillus синтезировать значительные количества экзополисахаридов (ЭЛС) ри росте на средах с метанолом. Бактерии М.ПадеПаШт КТ также способны бразовывать сильно ослизнённые колонии на твердых средах. В связи с этим редставлялось перспективным подтвердить способность клеток М.ЛадеПаШт КТ екретировать именно ЭПС, а также предпринять попытку культивирования даптированных бактерий этого вида для биосинтетического получения униформно ейтерированных полисахаридов, а также простых Сахаров.
Проведённый ТСХ-анализ состава препаратов, выделенных из недейтери-ованных культуральных жидкостей М.Ладе/Шит КТ, обнаружил единственное ятно со значением И*, равным 0,53, что совпадало со значением Рг стандартной
фруктозы. При обработке пластин реактивом на основе мочевины пятно окрашивалось в синий цвет что также характерно для кетоз.
Присутствие фруктозы во всех образцах ЭПС было подтверждено и методом ВЭЖХ: мономер соответствует по времени выхода фруктозе (рис.|б). Таким образом, метилотрофные бактерий М.ЛадеНаШт КТ синтезируют и накапливают в ростовой среде ЭПС - полифруктан.
5
«о и —-— , А
риб ара фру глга сах мал
« о! 1 у\ 2 5 ЧГ \Х М^Л— о о к ^-12.51 ОТ
12 5 в 7 8 Э 10 11 12 13 ми»<
ис. 6. Хроматограммы гидролизата ЭПС М.ЯадеПаШт (А) и смеси этого гидролизата с раствором стандартов Сахаров шбозы, арабинозы, фруктозы, глюкозы, сахарозы, мальтозы
На следующем этапе исследования было необходимо определить у слови культивирования бактерий М.Паде1Шит КТ, способствующие накоплению ЭПС н обычных (протонированных) ростовых средах, выбрать штамм с повышенны уровнем биосинтеза ЭПС, а затем провести его адаптацию к дейтеро-среде.
От прототрофного штамма М.Ладе1Шит КТ МЯК5 была проведена селекци наиболее ослизнённых форм. Изучение роста и накопления ЭПС показало, чт максимальный уровень в ЮК обнаруживается у мутанта (обозначенного МРК5-3) приходится на 24-32 часа. Были отмечены различия в динамике накопления ЭПС клеток исходного штамма, и у отобранных мутантов: последние медленнее входят лог-фазу роста и позже начинают синтез полисахаридов, что напоминает синте вторичных метаболитов, усиливающийся на поздней лог-фазе роста. Важн отметить, что клетки мутанта МИК5-3 отличаются высокой способность! конвертировать метанол в полисахариды. Именно этот штамм был использован дальнейшем для получению высокодейтерированных ЭПС.
Изучение влияния состава ростовой среды на уровень секреции ЭПС был проведено для бактерий отобранного штамма при различных соотношение углерода (по метанолу) и азота (ЫН4С1), а также при избытке солей капьци: Необходимо отметить, что уменьшение содержания азота на фоне нормальног содержания в среде СаС12(1мМ) приводило к некоторому повышению способност клеток синтезировать ЭПС. Кроме того, повышение концентрации ионов кальцк способствовало более эффективному усвоению бактериями источника азота. Пр этом продуктивность по ЭПС от концентрации СаС12 практически не зависела.
Важнейшим этапом работы было получение форм М.АадеИаМт КТ, способнь синтезировать дейтеро-ЭПС на высокодейтерированной среде. Адаптацию бактери штамма МРК5-3 к 020+С0300-среде проводили на серии твердых агаризованнь сред с постепенно увеличивающимся содержанием Р20. Штамм, отобраннь результате данных пассажей, получил обозначение М.ЛадеПаШт КТ МЯКб-ЗО.
Изучение мономерного состава дейтеро-ЭПС имело как теоретический, так практический интерес. Было необходимо и весьма интересно установить - сохр няется ли у клеток М.Ааде1Шит КТ МЯКБ-ЗО способность синтезировать ЭПС того м состава. Практический интерес, в данном случае, определялся тем, что униформ! дейтерированную фруктозу следует рассматривать как наиболее ценнь источник углерода (исключающий катаболитную репрессию многих струкгурнь генов) для введения дейтериевой метки на последующих этапах культивирован! практически любых гетеротрофных микроорганизмов.
Из данных таблицы 1, видно, что при культивировании бактерий штамма РК5-30 на ЭгО+СОзСЮ-среде выход биомассы снижался в 2,6 раза по сравнению с зычной средой. При этом очень важно отметить, что конверсия метанола в ЭПС 1а Н20" и "на 020" практически не отличалась -1,0 и 0,9. Важно подчеркнуть, что
Таблица 1.
Сравнительные характеристики биосинтеза ЭПС бактериями М.Ладе/Шит КТ.
Штаммы М.Ааде11а№т Состав среды Конверсия метанола в биомассу, А/В (%) Конверсия метанола в ЭПС, с/В (%) Относительная продуктивность с/А
МРК5-3 н2о+сн3он 11.1 1.0 9.0
МРК5-30 ОгО+СЭзОО 4.3 0.9 20.9
А - выход биомассы (г/л); В - концентрация метанола (1об.%);
с - концентрация ЭПС в культуральной жидкости (г/л).
(а 020-среде клетки продуцировали относительно больше дейтеро-ЭПС (9,0 - 20,9). озможно этот факт является отражением "ощущения бактериями" высокодейтери-ованных ростовых условий как неблагоприятных.
Для определения химического состава дейтеро-ЭПС метилотрофа полисаха->иды осаждали обычным ацетоном (так как обратный обмен РоН лаловероятен). Полный кислотный гидролиз дейтеро-ЭПС проводили в НгЭОд, так :ак в результате гидролиза связи С-0 не затрагиваются.
Исследование мономерного состава дейтеро-ЭПС, полученных при культиви-овании М.АадеПаЫт КТ на дейтеро-средах, показано преимущественное наличие в олимере фруктозы с незначительным присутствием рибозы - около 2% (по ,анным ВЭЖХ анализа). Полученные результаты подтверждают сделанный нами, анее вывод, о том, что бактериальные культуры, хорошо адаптированные к :ысокодейтерированным ростовым средам, сохраняют в этих условиях прежнюю егуляторную организацию клеточного метаболизма.
Для оценки степени включения дейтерия в молекулы биосинтетически юлученной фруктозы использовали метод ПМР-спектроскопии. На основании :равнения ПМР-спектров пентаацетатов стандартной, а также полученной нами 5иосинтетической дейтерированной и недейтерированной фруктозы было гстановлено, что препарат дейтеро-фруктозы содержит лишь около 11% протия. Гаким образом, предлагаемым способом была получена кристаллическая униформно дейтерированная фруктоза со степенью включения дейтерия 89ат.%. Зыход целевого продукта составлял до 100 мг/л ферментационной среды.
Наряду с исследованиями состава экзополисахаридов М.ЛадеНаШт КТ, на1 были начаты эксперименты по изучению изменений в жирнокислотном составе е биомассы, получаемой на высокодейтерированных средах. Предварительш опыты показами, что изотопный состав среды существенно влияет на соотношен жирных кислот (табл. 2). При этом ингибирование синтеза циклопропановых кисл на дейтеро-среде может оказаться удобным в работе по выделению индив дуальных униформно дейтерированных жирных кислот.
Таблица 2.
Соотношение жирных кислот в биомассе М.ЛадеИаЫт КТ, получаемой на средах разного изотопного состава.
Жирные кислоты НгО-среда 020-среда
пальмитиновая Cl6:0 44 45
пальмитолеиновая Ci6:i 10 51
метипенгексадекановая (циклопропановая) Cl7:0 36 3
метил ге ксадека новая '-Ci7:0 5 3
2. Получение высокодейтерированных БАС, синтезируемых Факультативными метилотрофными бактериями.
В данном разделе мы рассмотрим биосинтетические возможнос представителей факультативных метилотрофных бактерий видов Brevibacteríu methylicum и Methylobacterium extorquens при росте на стабильно меченых среда Выбор штаммов определялся довольно хорошей изученностью i микробиологических, биохимических и генетических особенностей. Так, заран< было известно, что лейцин-зависимый мутант B.methylicum leu секретирует в сред L-фенилапанин, а отобранный нами штамм M.extorquens 6077 - накапливает клетках Сзо-каротиноид и р-полиоксибутират.
Исследования каждой группы микроорганизмов, проведённые в рамк; данной работы, начинались с изучения влияния дейтеро-метанола и тяжёлой вод на ростовые и биосинтетические процессы. В первых же опытах с B.methylicu было установлено, что CD3OD лишь незначительно снижает уровень накоплен биомассы на природной воде (табл. 3, среда 2). Изучение возможности получем дейтеро-Ь-фенилаланина начали с определения основных ростовых параметре штамма-продуцента на средах с различными концентрациями D20. Данны представленные в таблице 3, показывают наличие довольно слабо бактериостатического эффекта при возрастании концентрации DzO в среде. Так, i полностью дейтерированной среде (опыт 10) время генерации увеличивается до 4,
Таблица 3.
Влияние изотопного состава среды на рост бактерий B.methylicum leu и на уровень накопления L-фенилапанина в культуральной жидкости
Номер Компоненты среды Величина Время ге- Выход Секреция опыта (об.%) лаг-фазы нерации биомассы Ь-РИе (среда) НгО - ОгО СН30Н-С0300 (час) (час) (%) (%)
1 100 0 2 0 24,0 2,2 100 100
2 100 0 0 2 30,3 2,4 92,3 99,1
3 75 25 2 0 32,1 2,4 90,6 96,3
4 75 25 0 2 34,7 2,6 85,9 97,1
5 50 50 2 0 40,5 3,0 70,1 98,0
6 50 50 0 2 44,2 3,2 60,5 98,8
7 25 75 2 0 45,8 3,5 56,4 90,4
8 25 75 0 2 49,0 3,8 47,2 87,6
9 0 100 2 0 60,5 4,4 32,9 79,5
10 0 100 0 2 64,4 4,9 30,1 71,5
11* 0 100 0 2 39,9 2,9 87,2 95,0
* Данные для бактерий адаптированного штамма B.methylicum leu D.
4асов, продолжительность лаг-фазы - до 64 часов. В целом бактериостатический эффект дейтерия приводит к снижению выхода биомассы метилотрофа всего в гри раза по сравнению с обычным уровнем (опыт 1). Таким образом, факультативные метилотрофы В.теФуНсит гораздо более устойчивы к высоким сонцентрациями Э20, чем облигатный метилотроф М.Паде11ай1т КТ. Результатов наших определений достаточно для констатации этого факта, однако для эбоснованного предложения какого-либо объяснения требуются дополнительные исследования физиологии и биохимии клеточных процессов при росте различных сультур метилотрофов на средах с максимальными концентрациями тяжёлой воды 1 дейтеро-метанола.
Включение дейтерия в аминокислоты на среде, содержащей природную зоду и СБзОО (табл. 3, опыт 2,) крайне низкое - не более 4%. Полученный результат иожет быть обусловлен прежде всего сильным разбавлением дейтериевой метки 5а счёт протекания как биохимических процессов, связанных с постадийным эаспадом дейтеро-метанола при его усвоении клетками метилотрофов, а также реакциями изотопного обмена и диссоциации СЭзСЮ в Н20. Так, из четырёх атомов цейтерия в молекуле С03СЮ лишь атом при гидроксильной группе -00 самый подвижный и поэтому легко диссоциирует в водной среде с образованием С030Н. Гри оставшихся атома дейтерия в составе СРзОН поступают в цикл ферментативного окисления метанола, который приводит к потере дейтерия за счёт образования соединений более окисленных, чем метанол. Таким образом,
полученный результат по определению уровня включения дейтерия из CD3OD в фенилаланин, соответствует классическим представлениям о пути ферментативного окисления метанола до формальдегида & клетках факультативного метилотрофа B.methylicum leu.
На основании данных об уровнях накопления фенилаланина (табл. 5), можно сделать заключение, что клетки гораздо меньше - лишь на треть - теряют способность синтезировать эту целевую аминокислоту и секретировать её в культуральную жидкость, чем снижается уровень накопления их биомассы в тех же условиях. Это обстоятельство позволило продолжить работу по изучению возможности получения униформно меченого дейтеро-Ьфенипаланииа, синтезируемого метилотрофом B.methylicum leu. Так масс-спектр КЖ, полученной в опыте с 100% D2O и СНзОН, показывал, что в молекулах фенилаланина только шесть атомов из восьми обсуждаемых биосинтетически замещены на дейтерий - М+. с m/z 418 вместо 412. Эти два незамещенные атома водорода могли происходить не только из природного метанола, но и из лейцина, поскольку в среду эту аминокислоту вносили в природном виде. Следует подчеркнуть, что в этом масс-спектре есть пик обогащенного дейтерием бензильного фрагмента с m/z 97 вместо 91 в контроле, то есть местами локализации атомов дейтерия в молекуле фенилаланина являются положения С1-С6 ароматических атомов и сопредельное с ними положение при углеродном атоме ß. Причем, как миниум четыре из них могут быть локализованы в самом бензольном кольце молекулы фенилаланина.
Изучение уровня включения дейтерия в аминокислотные остатки суммарного белка биомассы B.methylicum leu представлялось важным, поскольку данный штамм метилотрофных бактерий рассматривался как перспективный продуцент для наработки тотально дейтерированного белка и аминокислот. Включение дейтерия в аминокислоты белков определяли тем же методом, что и для аминокислот КЖ, но после гидролиза выделенного белка биомассы. Из результатов, представленных в таблице 4, видно, что для глицина, аланина, фенилаланина и тирозина уровень дейгерирования близок к максимальному - 90% и 97,5%. Низкое содержание дейтерия в (изо-)лейцине (49%), а также в синтезируемых de novo и метаболически связанных с лейцином, объясняется, очевидно, присутствием природного лейцина, добавляемого в среду из-за ауксотрофности штамма B.methylicum leu. Уровни изотопного обогащения валина и лейцина, фенилаланина и тирозина совпадают, включение дейтерия в глицин и серин, аспарагиновую и глутаминовую кислоты также близки.
Таблица 4.
Степени изотопного включения дейтерия в аминокислоты белка биомассы
Метиловые Молекулярные Молекулярные Изотопное включе-
зфиры массы массы деитеро- ние 0 в амино-
дансилпроизвод- протонированных аминокислот (М+.) кислоты*
ных аминокислот аминокислот, (М+.) (%)
Эпз-С1у-ОМе 322,2 324,0 90,0
Эп5-А!а-СМе 336,4 340,3 97,5
Эпз-Уа1-0Ме 364,5 368,5 50,0
Эпз-!.еи(11е)-0Ме 378,5 383,4 49,0
Эпэ-РЬе-ОМе 412,0 419,6 95,0
Эпэ-Авр-ОМе 394,5 396,5 66,6
Эп5-ТугЧОпв)-ОМе 662,0 668,5 92,8
Эп5-1.уз-(0п5)-0Ме 627,1 632,4 58,9
При подсчете степени дейтерирования аминокислот, легко обмениваемые протоны при гетероатомах в МН2-, М-, -СООН группах не учитывались.
1_еи(11е) Va1 А>.р
А
т.
Л *
50% ОзО
Рис.7. Масс-спектры производных аминокислот гидролизатов белка биомассы В.теМуНсит, полученной на средах разного изотопного состава.
*
500
П1/1
Итак, проведенные исследования показали высокую эффективность [спользования штамма факультативных метилотрофных бактерий В.теМуИсит 1еи ¿ля получения высокодейтерированных аминокислот.
В ходе работы с другим Факультативным метил от ро Фом M.extorquens оказалось, что бактерии способны образовывать колонии и пересеваться на всех вариантах 020-сред вплоть до полностью тяжёловодной с дейтеро-метанолом. При этом, однако, наблюдались значительные изменения во внешнем виде колоний: они становились мельче и практически полностью теряли свой насыщенный вишнёвый цвет. В ряде случаев на поверхности агаризованной 100%-ной 020-среды возле колоний или зон роста бактерий по штрихам наблюдалось образование прозрачных кубических кристаллов. Мы предположили, что данные фенотипические изменения свидетельствует о значительном снижении уровня содержания окрашенных каротиноидов и, напротив, о повышении уровня синтеза поли-р-гидроксибутирата (ПОБ) в клетках метилотрофа M.extorquens.
В экспериментах по определению состава биомасс M.extorquens, выросших в жидкой Н20-среде с метанолом и й20-среде с дейтеро-метанолом было установлено, что концентрация каротиноидов во втором случае примерно в 5 раз ниже, чем в клетках контрольного образца (0,065 против 0,322 мг/г АСВ клеток). Так как в анализируемых пробах совпадают пики поглощения при Хдонм, можно заключить, что и на недейтерированкой и на высокодейтерированной среде в клетках метилотрофных бактерий происходит биосинтез одного и того же пигмента - диметилового эфира 4,4-диаполикопиновой кислоты.
Сравнение фиксированных препаратов клеток с помощью светового
микроскопа показало увеличение содержания «суданофипьных» гранул, в
дейтеро-биомассе (рис. 8). Такой вид характерен для клеток с повышенным
уровнем синтеза ПОБ, поскольку именно его включения видны благодаря сильно: ' ' '"--¡¡Ж"-}
- - * %МУ преломлению света.
Таким образом, хотя для факультативных метилотрофных бактерий M.extorquens на й20-среде не требуется специального адаптационного периода, как и для B.fnethy licum, вместе с тем в случае данной культуры наблюдаются существен-
с
ные изменения клеточного метаболизма.
Рис. 8. Внутриклеточные включения ПОБ у культур M.extorquens.
3. Получение униформно 13С- и "N-меченных аминокислот, синтезируемых метилотрофными бактериями.
Из литературных данных следует, что введение стабильного изотопа ,3С не приводит к негативным последствиям для любых типов клеток. При получении "С-БАС, синтезируемых облигатным метилотрофом M.flagellatum Не, мы использовали единственно возможный вариант источника метки - 13С-метанол. Культивирование бактерий на стандартной протонированной минимальной среде с "СНзОН не вызывало затруднений. Ростовые характеристики (время генерации и величина лаг-фазы) не изменялись, за исключением некоторого снижения выхода биомассы - до 78% по сравнению с ростом на контрольной среде. Мультикомпонентные смеси аминокислот, полученные в ходе этих культивирований - как из культуральной жидкости, так и из белковых гидролизатов биомассы, - использовали для оценки уровня включения 13С (табл. 5). В связи с тем, что штамм M.flagellatum Не ауксотроф по изо-лейцину, эту аминокислоту добавляли в среду в немеченом виде. Как и следовало ожидать, уровень изотопного обогащения изо-лейцина, а также метабо-лически связанных с ними аминокислот существенно снижен. На основании этих данных можно сделать вывод о сохранении на высокодейтерированных средах минорных путей метаболизма, связанных с биосинтезом (изо-)лейцина de novo.
Таблица 5.
Степень включения изотопа 13С (ат.%) в аминокислоты M.flagellatum Не.
Аминокислоты культу рал ьная жидкость белок биомассы
Апанин 35 95
Валин 50 50
Глицин 60 90
Лейцин / изо-лейцин 38 49
Фенилаланин 95 81
Тирозин - 54
Серин - 73
Аспарагиновая кислота - 33
Глютаминовая кислота - 40
Лизин - 54
Несмотря на то, что в таблице 6 приведены данные только для 10 13С-меченные секретируемых аминокислот, не вызывает сомнения, что и в остальных уровни изотопного включения сопоставимы. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности использования конверсии 13СН3ОН для получения максимальных уровней включения стабильного изотопа 13С в аминокислоты.
Как отмечалось выше, введение 15К1-метки в компоненты биомассь метилотрофных бактерий не вызывает никаких трудностей: замена в стандартно! минимальной среде обычного источника азота на 15№ЦС1 не приводит ни I изменениям ростовых характеристик, ни к снижению уровня, накопления биомассь • около 11 г/л КЖ.
Одной из целей, настоящего исследования было- получение дважды мечены: БАС, несущих униформые метки 13С+15М. Мы проводили введение этих меток I компоненты биомасс культивируя облигатные метнпотрофные бактерии на среде I 13С-метанолом и 15М-хлоридом аммония. Получение дважды меченой 13С+1^ биомассы облигатных метилотрофных бактерий М.Паде1Шит КТ МЯК5 был* начато с экспериментов по оптимизации состава ростовой среды, поскольку мь впервые использовали одновременно два дорогостоящих меченых ростовы: субстрата - "СНзОН и 15МН4С1. Исходя из соображений максимальной эффек тивности использования этих соединений, провели сравнение уровня накоплена биомассы при различных концентрациях источникоа углерода и азота. Был установлено, что снижение концентрацию источника углерода до 0,5об.% ведёт снижению выхода биомассы, а увеличение - не сопровождается пропорцис нальным ростом культуры. Повышение концентрации источника азота до Зг/. также не даёт пропорционального увеличения-, роста биомассы. Таким образок можно заключить, что стандартные условия (1,0об.% метанола и "Шл хлорид аммония) следует считать оптимальными для культивирования метилотроф М.АадЫШит КТ МЯК5 и на дважды меченой среде.
В опытах по культивированию М.Ладс1Шит на 13С+15М-среде М1 контролировали уровень образования ЭПС. Важно напомнить, что в случа использования' униформно дважды меченой биомассы М.АадеНаШт в качеств основы для полноценной ростовой среды дл» каких-либо гетеротрофнь микроорганизмов, может потребоваться- внесение дополнительных количест источника углерода. Разумеется, это соединениетакже должна содержать ту же 13< метку в униформном виде, что и- все остальные компоненты среды - продукт автолизата меченой биомассы метилотрофных. бактерий.
Итак, полученные нами данные позволяют утверждать, что метилотрофн: бактерии вполне могут быть использованы, в качестве «первичных» организм) аккумулирующих стабильную метку низкомолекулярных ростовых факторов тотально меченые биологически активные соединения биомассы.
к Получение высокомеченных полноценных ростовых сред на основе стабильно леченой биомассы метилотрофных бактерий.
Биотехнологическое получение индивидуальных БАС обычно подразумевает ¡ультивирование специфических штаммов-продуцентов на средах определённого :остава, способных обеспечить максимальный уровень конверсии субстратов в »елевой продукт. Практически во всех высокотехнологичных процессах чспользуют полноценные среды. В данной работе мы рассмотрели зозможность применения в качестве полноценных стабильно меченых сред >втолизаты биомасс метилотрофных бактерий, выращенных на юответствующих изотопно меченых минеральных средах. Поскольку для эазличных групп гетеротрофных микроорганизмов понятия «полноценная среда» :ущественно различаются, было использовано несколько совершенно разных зрганизмов, которые являются продуцентами различных классов СМ БАС.
Для превращения дейтеро-биомассы в полноценную ростовую среду, свежие слетки подвергали мягкому автолизу в условиях, исключающих возможность обратного изотопного обмена D«H уже включённых в состав «биомолекул» атомов дейтерия, а также исключающих проникновение в образцы природной воды. Для ¡втолиза дейтерированной биомассы использовали растворы DCI в D20. Автолиз 3С-, 1SN-, 13С+15М-меченной и биомассы, не несущей изотопных меток, проводили »алогичным методом, но, соответственно, с использованием недейтерированных эеагентов. Применение именно "щадящего" режима частичного разрушения полимеров биомассы позволяло получать автолизаты, обеспечивавшие наибольший выход целевых СМ БАС гетеротровных штаммов-продуцентов.
Получаемые униформно СМ автолизаты доводили до уровня питательной ценности стандартных полноценных ростовых сред, например, приготовленных на эснове дрожжевого экстракта - 1,25%-раствора препарата Nutrient Broth фирмы :<Difco». Вместе с тем. в состав полноценных сред обычно входит глюкоза как ¡дополнительный источник углерода. Поскольку при мечении по дейтерию и по 13С внесение немеченной глюкозы приводит к существенному разбавлению метки в синтезируемых БАС, в качестве дополнительного источника углерода использовали препараты униформно меченых экзополисахаридов M.flagellatum.
В заключение первой части работы можно сказать, что метипотрофные бактерии оказалось эффективным «первичным продуцентом» СМ БАС и что они могут являться единым источником всех ростовых факторов для приготовления тотально меченых полноценных ростовых сред.
СТАБИЛЬНО МЕЧЕНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, СИНТЕЗИРУЕМЫЕ ВТОРИЧНЫМИ ПРОДУЦЕНТАМИ.
Вторая часть данного исследования посвящена разработке методов получения индивидуальных стабильно меченых БАС, синтезируемых гетеротрофными микроорганизмами. Следует подчеркнуть, что в качестве источника изотопной метки во всех случаях использовали автолизаты униформно стабильно меченой биомассы метилотрофных бактерий. Для выделения стабильно меченых аналогов специфических целевых БАС мы использовали несколько штаммов-продуцентов БАС, относящихся к разным таксономическим группам.
6. Получение стабильно меченых биологически активных соединений бацилл.
Грамположительные бактерии, относящиеся к роду Bacillus, являются одними из наиболее широко используемых объектов в практике микробиологических производств. Эти микроорганизмы обычно характеризуются высокими скоростями роста, высокими уровнями конверсии доступных ростовых субстратов в целевой продукт и способностью секретировать значительные количества различных соединений в культурапьную среду. Детальная проработанность генетических и генно-инженерных методов работы с бациллярными объектами позволила к настоящему времени усилить наиболее важные свойства этих бактерий и создать большое количество штаммов-продуцентов ценнейших БАС с высокими технологическими свойствами. Для получения СМ БАС бациллы интересны тем, что являются продуцентами многих ферментов, антибиотиков, витаминов, токсинов, производных нуклеиновых кислот.
Отбор форм Bacillus subtilis. синтезирующих дейтеро-инозин начали с изучения возможности культивирования штамма-продуцента на высокодейтери-рованной ростовой среде. В работе использовали мутантный полиауксотрофньш штамм, являвшийся результатом длительной генетико-селекционной работы проведённой в лаборатории генетики бацилл ГосНИИгенетика. Бактерии этогс штамма стабильно наследуют изменения регуляции метаболических путе( биосинтеза пуринов, приводящие к сверхпродукции инозина. Исследуемый штамм проявлял максимальную продуктивность (до 45мг/мл при конверсии глюкозы е инозин 25%) только на богатых ферментационных средах. Поскольку продуцен1 инозина являлся полиауксотрофным штаммом, нуждавшимся для роста е тирозине, гистидине и аденике, все эксперименты по его культивированию можнс
5ыло проводить либо на среде, содержащей перечисленные ростовые факторы, либо на полноценной среде. Для получения дейтеро-инозина было неприемлемо внесение в среду необходимых количеств дейтеро-глкжозы, дейтеро-аминокислот и дейтеро-аденина. Поэтому все исследования проводили на зысокодейтерированной полноценной ростовой среде, приготовленной из )втолизатов дейтеро-биомассы метилотрофа B.methylicum, но с добавлением 1еобходимогоколичества природной немеченой глюкозы.
Посев клеток штамма-продуцента инозина на серию агаризованных юлноценных дейтеро-сред с разным уровнем содержания тяжёлой воды (75 - 90 -100% D2O) показал, что рост культуры на всех трёх средах практически не лпичался от роста на обычной немеченой полноценной среде. Таким образом >ыло установлено, что для культивирования B.subù'Hs на высокодейтерированных юлноценных средах адаптации не требуется.
Поскольку в этом эксперименте были получены многочисленные отдельные :олонии штамма-продуцента инозина на максимально дейтерированной среде, 5ыла проведена работа по отбору наиболее продуктивных форм. Среди 25 1езависимых клонов отобрали штамм (обозначенный B.subtillis 18D), ^растеризующийся максимальным уровнем биосинтеза целевого продукта. 1менно этот штамм был использован в дальнейшей работе в качестве продуцента »ейтеро-инозина.
Изучение ростовых и биосинтетических характеристик продуцента дейтеро-шозина B.subtilis D18 было начато с культивирования бацилл на тяжёловодной «инимальной ферментационной среде с глюкозой при различных температурных >ежимах и с отличающимися условиями аэрации. В серии независимых вариантов >пыта уровень секреции дейтеро-инозина варьировал в очень широких пределах, (остигая, вместе с тем, величины 12мг/мл. В этих же опытах было показано, что 'сипение аэрации культуры и снижение температуры культивирования :пособствуют более высокому среднему уровню накопления дейтеро-инозина.
Для изучения роста штамма B.subtilis 18D в условиях, обеспечивающих лаксимальный выход дейтеро-инозина, использовали полноценную ферментационную среду (FM), а также её высокодейтерированный аналог (FMT) из яжёлой воды и автолизата дейтеро-биомассы метилотрофных бактерий. Кривые, сражающие динамику роста культуры, уровень ассимиляции глюкозы и гакопления инозина в культуральной жидкости, представлены на рисунке 9.
Накопление 2u инозина в КЖ -
(Г/л)
Конверсия
глюкозы,
г/я
Рис.Э. Кривые роста B.subtilis D18 (а), динамика утилизации глюкозы (б), накопление инозина в КЖ (в) на протонированной среде (1 .светлые метки) и на тяжеловодной среде (2, закрашенные метки).
120 "
Титр
10-
клстох, кл/ил |- 10»
- 10«
20 40 60 SO 100
время культивирования (час)
Продолжительность лаг-фазы, величина времени генерации, а также выход биомассы на этих двух средах отличаются незначительно, что подтверждает наши наблюдения о способности культуры B.subtilis расти без адаптационного периода при переносе клеток с обычной полноценной среды на полноценную дейтеро-среду. Однако, уровень накопления инозина на тяжёловодной FMT-среде он был снижен до 4,4г/л, тогда как на FM-среде достигал величины 18,3г/л после пяти суток культивирования. Такое снижение секреции дейтеро-инозина на FMT-среде, на наш взгляд, коррелируют со снижением степени конверсии глюкозы на дейтеро-среде. По всей вероятности, это связано с ингибированием отдельных реакций углеводного обмена у B.subtilis D18, поскольку зафиксированы существенные различия в содержании моносахаридов в биомассах штамма-продуцента, собранных с обычной полноценной и с дейтерированной сред.
Степень дейтерированности инозина определяли по его молекулярной массе. Масс-спектр дейтерированного образца имеет пик, соответствующий катионизированному молекулярному иону инозина МН+. с miz 274 вместо m/z 269 в контроле. Пики типичных фрагментов рибозы [CsHsOJ+c m/z 136 (вместо протонированной рибозы m/z 133) и гипоксантина [C5H4ONJ+ 138 (вместо m/z 136) (рис. 10). Таким образом, молекула дейтеро-инозина содержит 5 атомов дейтерия (три - в рибозной части молекулы, два - в гипоксантине) из 8 водородов, что составляет 62,5% относительно общего количества атомов водорода по скелету молекулы. Поскольку протоны в С'1-С'5 положениях рибозной части молекулы инозина могли происходить из глюкозы, логично предположить, что характер
50-
100-,
ноли,,
¡¿Ж1А
ce^Wv; он он +
269
177
54
с;,
51
1
» 136 •
84
215
[мч-1г|+ 374
î^l ,, H 9 Рис. 10. Масс-спектры FAB инозина (А)
4 и дейтеро-инозина (Б), секретиру-
емогоклетками B.subtilis D18 при росте на средах разного изотопного состава.
биосинтетического включения дейтерия в этой части молекулы определяется в основном реакциями гексозомонофос-фатного шунта, то есть непосредственно связан с ассимиляцией глюкозы и других Сахаров.
Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали эффективно-сть использования автоли-затов высокодейтерированной биомассы метипотрофных бактерий в составе полноценной среды для препаративного получения высокодейтериро-ванного инозина. Разработанная схема позволяет получать 5-7 граммов
50 IÖ0 2(Ю , 300 дейтеро-инозина с 1 литра культураль-
т /г
ной жидкости.
Биосинтез дейтеро-тимидина клетками Bacillus amyloliguefaciens также не этребовап специальной адаптации культуры к высокодейтерированной элноценной среде. В ходе стандартного трёхдневного культивирования зафикси-эвали наличие секретируемого тимидина в культуральных жидкостях как на задиционной ферментационной среде, так и на дейтеро-среде того же состава, ыход дейтеро-тимидина (по данным ТСХ), синтезируемого клетками штамма-родуцента этого нуклеозида, был лишь в 2,5 раза ниже, чем в обычных условиях.
Получение униформно дейтерированного 8-эндотоксина. синтезируемого летками Bacillus thuringiensis. определялось интересом к исследованию юзможности наработки высокомеченных белковых препаратов с инсектицидными :войствами. 8-эндотоксин способен к формированию кристаллов в клетке с >бразованием параспоральных включений. Свойства кристаллов, их форма и >азмеры отличаются у различных культур и служат одним из характеристических
признаков штаммов B.thuringiensis. В настоящее время всё более интенсивно изучаются молекулярные механизмы инсектицидного действия препаратов 5-зндотоксина, в частности, взаимодействие с рецепторами кишечника насекомых. Возможностей для проведения такого рода исследований появляется всё больше по мере развития методов высокого разрешения. ЯМР исследования являются одним из наиболее серьёзных конкурентов рентгеновской кристаллографии при детальном изучении структуры белков - жидкофазные ЯМР позволяют устанавливать конформационные изменения и динамические свойства белков. Можно считать, что к настоящему времени разработаны основные подходы и, отчасти, методы для введения в исследуемые биополимеры изотопных меток, требуемых в экспериментах высокого разрешения.
Получение кристаллов высокодейтерированного б-зндотоксина был проведено путём культивирования штамма-продуцента на полноценной дейтерс среде. Для выращивания бактерий B.thuringiensis использовали три вариант полноценных сред: стандартная ДПС-среда. немеченая Н?0-среда. содержаща эквивалентное количество автолизата обычной метилотрофной биомассы природной воде и высокодейтерированная Р;0-среда с автолизатом дейтерс биомассы в тяжёлой воде. За время культивирования B.thuringiensis в пробирках идентичных условиях во всех вариантах опьгга была достигнута примерн одинаковая плотность клеточной суспензии и уровень накопления токсина - окол 1мг/мл, что подтвердило наши данные об отсутствии необходимости специальног адаптационного периода для культур Bacillus. Определение содержания дейтери в КЖ 020-среды в конце культивирования дало величину 96,8ат.%, что указывал на очень незначительное разбавления изотопной метки, другими словами - н тотальный характер мечения дейтерием молекул всех компонентов биомассы молекул белка 5-эндотоксина.
Микроскопирование полученных клеточно-споровых суспензий продемо! стрировало, наличие во всех трёх образцах типичных клеток, спор и нормальны характерных бипирамидальных кристаллов 5-эндотоксина. Вместе с тем, был отмечено существенное увеличение доли более крупных кристаллов, образу» щихся на тяжёловодной среде. На рис. 11 приведены размеры белковь бипирамид (а - ширина, h - высота), а на рис. 12 распределение значена (засчитанных объёмов этих кристаллов (V« = 2/3a2h). Увеличение линейнь размеров кристаллов, полученных на высокодейтерированной среде, приводит росту их объёма примерно в 1,6 раза по сравнению с контрольными значениям недейтерированных вариантов (2,11Т0,74мкм3 против 1,32+ 0,43мкм3).
2,0
а 1,5 {ок») 1,0
0,5
2,0
а 1,5 (ыкм) 1,0
0,5
2,0
а 1,5 (мкм) 1,0
0,5
0
29
ДПС-среда
Н20-среда
020-среда - * « * ф-
1,0
1,5
3,0
3,5
2,0 2,5
(1 (мкм)
Рис. 11. Размеры бипирамидапьных белковых кристаллов 5-эндотоксина В.^иппд'юпв'ш, образующихся на средах разного изотопного состава.
Рис.12. Распределение объёмов белковых кристаллов 5-эндотоксина, полученных на средах разного изотопного состава.
Сравнительная оценка уровня биологической активности природных и высокодейтерированных препаратов белковых кристаллов в отношении личинок непарного шелкопряда не выявила существенных различий в инсектицидной наивности. Чтобы объяснить данные противоречия - больший или меньший >бъём бипирамид 5-эндотоксина при совпадающей активности препаратов - можно федположить, что эти различия связаны с изменением структуры самого дейте-»ированного белка или с изменением плотности его упаковки в кристаллах.
Таким образом, в данной работе впервые были получены кристаллы тотально ^итерированного биологически активного 5-эндотоксина В.Ушляд/елз/з.
1 2 3 4 5 6 объём кристалла (мкм3)
7. Получение СМ БАС археобактерий На/оЬаМепит ваИпапит.
Археобактерии - древнейшая группа микроорганизмов, общий предшествеь ник про- и зукариотических организмов, сохранивших способность использоват энергию света для частичного энергетического обеспечения метаболизма клеток. I последние годы усиливается интерес не только к фоточувствительности, но и изучению отдельных белков и ферментных систем археобактерий, благодаря и необычным свойствам - полной неспособности расти на средах, содержащих мене 200-240г/л №С1, а также благодаря способности использовать как единственны источник углерода и азота только аминокислоты. В данной работе мы проверял возможность применения автолизатов дейтеро-биомассы метипотрофов в качеств единственного источника всех ростовых субстратов для выращивания Н.заИпапш и для получения униформно дейтерированных БАС.
В предварительных экспериментах было установлено, что исключение V состава высокодейтерированной среды цитрата натрия не оказывает видимог влияния на рост бактерий двух штаммов Н-ваНпапит 353П и Н.&аЧпапит ЕТ100' Таким образом, при приготовления высокодейтерированной среды для Н.заИпапш использовали тяжёлую воду, обычный состав солей, протонированный глицерин микроэлементы, а пептон и дрожжевой экстракт заменяли эквивалентны количеством автолизата дейтеро-биомассы метилотрофных бактерий.
Анализ кривых роста археобактерий на средах разного изотопного состэе показал (табл. 6) существенное увеличение лаг-фазы и времени генерации I-тяжёловодных средах, тем не менее, уровни накопления биомассы, во всс трёх культурах были практически одинаковые.
Таблица 6.
Ростовые характеристики бактерий Н.заИпапит на средах разного состава.
Параметры роста Н20 + протон. 020 + протон. 020 + дейтерс
автолизат автолизат автолизат
лаг-фаза (сутки) 1 5 6,5
время генерации (часы) 3,5 13 15,7
накопление биомассы ( х 10" кл/мл) 0,78 0,78 0,85
Белковые компоненты биомасс, полученных в описанных выше опыта использовали для сопоставления аминокислотного состава Н.заИпапит методе ионообменной хроматографии на автоматическом аминокислотном анализатор Преобладающими аминокислотами во всех трёх образцах являлись аспарагинова (15,29-17,27%) и глутаминовая (18,30-20,86%) кислоты. В целом было отмечено, чт качественный и количественный аминокислотный состав белка для всех тре
эразцов практически одинаков и соответствует данным других исследо-этелей (Цапу 1978). Следует подчеркнуть - отсутствие различий в содержании гдельных аминокислот в образцах с различным уровнем дейтерированости 5идетельствует об идентичности процессов биосинтеза аминокислот (и, 1димо, белков) у галобактерий на обычных и высокодейтерированных средах.
Для введения селективной стабильной изотопной метки в молекулы глков в качестве модельной системы использовали фоточувствительный белок ¡ктериородопсин (БР), синтезируемый клетками Н-ваНпапит ЕТ1001. В случае БР, ¡лективно обогащенные стабильными изотопами остатки функционально важных юматических аминокислот позволяют применять спектральные методы >1Сокого разрешения для получения детальной информации о структуре, о [кономерностях формирования хромофорного центра и о его функционировании.
Специфическое мечения БР проводили введением трёх дейтеро-аминокислот [■-[2,3,4,5,6-05]-фенилаланина, 1_-[3,5-02]-тирозина и 1_-[2,4,5,6,7-05]-триптофана тем культивирования археобактерий на синтетической среде, содержащей все :тапьные аминокислоты в обычном - протонированном виде. При исследовании
Рис. 13. Масс-спектр дериватизированного гидролизата БР, содержащего [2,3,4,5,6-05]-фенилаланин, [3,5-02]-тирозин и [2,4,5,6,7-05]-триптофан.
дропизата БР, в масс-спектре препарата было показано присутствие пиков элекулярных ионов обогащенных дейтерием Dns-Phe-OMe с М+' m/z 417 (вместо lz с 412 для нативного Dns-Phe-OMe), Dns-Tyr-OMe с М+- с m/z 429 (вместо m/z с 428 контроле) и Dns-Trp-OMe с М+- m/z 456 (вместо m/z с 451 в контроле). Полученные шные свидетельствует о высокой эффективности мечения БР по остаткам Phe и р. Уровень изотопного обогащения Туг снижен (степень дейтерированости Dns-rr-OMe составляет 50%), вероятно, вследствие возможного D^H обмена при шической дериватизации тирозина в Dns-Tyr-OMe. Пики молекулярных ионов юизводных других аминокислот: Dns-Gly-OMe (М+ с m/z 322), Dns-Ala-OMe (М+ с
m/z 336), Dns-Val-OMe (M+ с m/z 364) и Dns-Leu(lle)-OMe (М+ с m/z 378), как и следовало ожидать, соответствуют обычной массе, то есть не дейтерированы.
Одной из особенностей археобактерий является наличие в липида: дигидрофитольных групп, образующих простые эфирные связи с глицерином. Мь выделяли и использовали зл-2,3-ди-0-Фитанипглицерин (ФП в качестве удобно! модели для оценки уровня дейтериевой метки в клетках H.salinarium Сравнивали биомассу галобактерий, полученную на средах разного изотопноп состава: опыт 1 - Н20 и недейтерированный автолизат; опыт 2 - D20 (99,85ат.% D) i недейтерированный автолизат; опыт 3 - D20 (85,0ат.% D) и дейтеро-автолизат опыт 4 • D20 (99,85ат.% D) и дейтеро-автолизат. Определение включения дейте риевой метки проводили методом плазменно-десорбционной масс-спектрометра позволяющим переводить большие интактные термолабильные молекулы и твёрдого состояния в газовую фазу. Полученные этим методом масс-спектрь содержат также пики осколочных (фрагментных) ионов, что делает анали высокоинформативным. Во всех четырёх образцах в диапазоне низких значеки m/z (от 90 до 300) наблюдалась интенсивная фрагментация, причём следуе отметить, что зафиксированные осколочные ионы, в большинстве случае совпадают с литературными данными о фрагментации ФГ при ионизации методо! электронного удара (таблица 7).
В масс-спектре недейтерированного образца (опыт 1), был отмечен пи молекулярного иона ФГ при m/z 653. В масс-спектре из опыта 2 пик молекулярног иона отсутствоап, однако из анализа фрагментных ионов следовало, что изотопна замещение при культивировании на 020-среде с недейтерированным автолизато составляет не менее 60%. В масс-спектре 3-его образца (85% D20 и дейтер« автолизат) зарегистрирован пик молекулярного иона при m/z 722, что соответствуе уровню мечения 80,5%. Наиболее полное обогащение ФГ дейтерием, как следовало ожидать, было достигнуто в 4-ом опыте - анализ фрагментных ионе показал, что изотопное замещение достигает 97,4%. В частности, при m/z 400 идентифицирован наиболее крупный фрагментный ион, образовавшийся результате разрушения одной простой эфирной связи. Таким образо* прослеживается корреляция между уровнем содержания дейтерия в среде уровнем его включения в биомассу.
Полученные данные свидетельствуют о возможности достижения уровь тотальной дейтерированности БАС, синтезируемых клетками H.salinarium nf использовании автолизата дейтеро-биомассы метилотрофов в качесп единственного источника ростовых субстратов.
Таблица 7.
Анализ масс-спектров 5л-2,3-ди-0-фитанипглицерина.
т/г Эмпирическая формула Структура иона (фрагмента) Степень обоп-
Ш биомассы, выращенной на 100% НгО н протовираванном автолнзате (опыт 1)
108.9 ч/у 0
113.2 С«Н]7 Г^У
124.8 СбНиК*
128.6 СдН|9
148.8 С,Н,<№+
186.8 С нНгу
653. С43Н87ОГ аъ - о - енг-^уч-уч/уч/у си, - о - аулУ'Л''чЛЛ/У сида
676.3 С„Н87ОзЫа"
ЗИз биомассы,вырате1шой на 99.85%(ат.) 1>зО н протеинроваииом автолнзате (опыт 2)
147.6 Г^У 68.0
207.3 СпН.оОнКа^ 61.0
222.2 60.0
266.2 СиНаОг? ИДЯ С,бН,50!8На+ 77.7
55.0
282.1 С„НвЕЬГ нлн СрНиОиЛа* 78.6
/у\/у\/у\у 57.4
326.7 СгоНпОг? .^уч/^ч/^/ч/^чон 72.4
№ биомассы, выращенной на 85% 5>гО п дейтгрированком автолнзате (опыт 3)
63.1 С41Ш5+ Л 68.0
80.8 С5Н1Ию 89.0
148.2 ОНяО^Ыа' 72.0
164.1 СУВД^а* л^л 74.0
172.8 СцН5018 77.4
220.8 СмИУ^ 82.0
280.3 С.ДоОг (/Ч/у^уч/у 73.8
722.0 С43Н171>7оОз+ си, - о - сгу^^у^Л^У ст>1 - о - ¿пои 80.5
Иэ биомассы, выращенной на 99.85% (ат.) ОгО н дейтеркровалпом автолипате (опыт 4)
103.1 СзЩВДЯа* Л' 82.7
113.2 еда,«* 94.7
129.0 ГЛ' 94.1
149.4 С^ЦОпКа 78.8
172.6 СцВД»,,* ч/у^у 76.5
219.3 СиНзОп /учхуч/^ 76.9
400.8 С23Н,В«02" 97.4
В нескольких опытах г культивированию Н-ваНпапит жидкой дейтеро-среде Наряду определением уровня накопл ния биомассы, проводит точные измерения содержан» дейтерия в культуральнс жидкости. Из данных, п ре дета
Рис.14. Анализ динамики изотопного разбавления ленных на рисунке 14, видно, ч-дейтерия тяжёлой воды в процессе за время культивирования ко культивирования Н.Байпапит.
центрация деитерия в сред постоянно убывала, но снизилась с исходного уровня 97,74±0,03ат% лишь I 1,30ат.%. Анализ изменения этой величины, проведённый с применением програ мы Ма1са1, позволил сравнить две нуль-гипотезы: снижение содержания дейтер! происходит - А - по линейному закону, Б - по логарифмическому закону на перве этапе (16 дней) и по линейному в последующие дни (рис. 14). Минимальн; дисперсия для линейной зависимости (у(х)=а1+Ь1х, где а1=97,061, Ь1=-0,04 составляет 0|=0,1217. По гипотезе Б дисперсия на логарифмическом участ (у(х)=а2+Ь21п(х+1), где а2=97,74, Ь2=-0,287) составляет 02=0,0113, и на последующ! линейном участке (16-22 день) (у(х)=а3+Ь3х, где а3=98,420, Ь3=-0,091) 03=0,031. Таю образом, наилучшее совпадение экспериментальных данных с расчётньи наблюдается в случае «непикейной» гипотезы. При этом дисперсия д логарифмического участка имеет минимальное абсолютное значение. I основании этого анализа можно заключить, что динамика изотопного разбавлен тяжёлой воды, имеет нелинейный характер то есть наблюдается снижен скорости падения концентрации дейтерия во времени. «Нелинейная» гипоте хорошо согласуется и косвенно подтверждается результатами тР-эксперимент по противоположно направленному изотопному обмену Н^Р в молекулах белке помещаемых в высокодейтерированную тяжёлую воду (СаЫаих е1 а!.,1997).
Таким образом, культивирование Н.эаНпагшт в тяжёловодной среде * приводило к падению уровня дейтерия ниже 96,5ат%, что убедителы демонстрирует приемлемость применённого в данной работе оборудования ц! получения тотально дейтерийрованных биологически активных соединений дал при длительном культивировании штаммов-продуцентов.
Получение стабильно меченых пептаиболов. синтезируемых клетками теллиального гриба Emericellopsis salmasinnemata.
Отличительной особенностью пептаиболов - пептидных антибиотиков -ляется наличие в молекулах значительного количества аминоизомасляной слоты (Aib), изо-валина, а также концевого аминоспирта Фениапанинола. !птаибол зервамицин (Zrv) - 16-ти членный пептид - продуцируемый грибом salmosynnemata, в последнее время привлекает внимание как один из антибио-ков, способных встраиваться в мембраны кпеток-мишений и формировать ансмембранные ионные каналы. Для изучения взаимосвязи между структурой и юлогическими функциями пептаиболов in situ с помощью изотоп-чувствительной ¡ектроскопийной техники широко используют изотопно меченые препараты, гастота строения молекул Zrv позволяла многим исследователям проводить 1ямой химический синтез этого пептаибола, в том числе - специфически меченого абильными изотопами. При получении тотально меченого Zrv мы применили юсинтетический подход, состоявший в культивировании продуцента на среде с ютовыми субстратами, тотально меченными стабильными изотопами.
Работы по получению СМ препаратов Zrv начали с изучения динамики 1копления пептаибола культурой-продуцентом в обычных условиях. Такое ¡следование было необходимо, поскольку одной из особенностей биосинтеза Zrv тяется (пока необъяснимое) резкое падение его внутриклеточного содержания >сле достижения максимальной концентрации. Эта особенность могла привести к >тере меченых субстратов при получении СМ аналогов целевого пептаибола.
Для определения Zrv в реальном масштабе времени мы разработали юстой, надёжный и быстрый микроаналитический метод, позволяющий получать >стоверные данные об уровне накопления антибиотика в биомассе. Этот метод с зименением обращённо фазовой высокоэффективной жидкостной хромато-1афии позволял к тому же разделять два основных типа зервамицина, гличающихся моноаминокислотной заменой, которые обычно накапливает гльтура E.salmosynnemata. Наилучшие условия для хроматографического анализа »рвамицинов ZrvlIB и ZrvllA отмечались при использовании буфера, включающего детонитрил:изо-пропанол:0,1М ацетат аммония - 39:1:60. Получаемые результаты гличались хорошей воспроизводимостью, точность метода для количественных змерений была оценена как 5%.
Следует подчеркнуть, что подбор оптимальных условий экстракции Zrv из иомассы особенно важен при выделении изотопно меченых препаратов.
Мы применили метод экстракции смесью хлороформа с метанолом (пс Фольчу), что позволяло за 4 часа извлекать из биомассы то же количестве зервамицина, что и традиционным методом за три дня, избегая при это!У выделения большого количества липидов и других соединений, затрудняющиэ дальнейшую очистку пептаибола.
По кривым роста и данным о динамике накопления (рис. 15), видно, чте
максимальное количество антибио
400
сырая
бионасса
гриба
(иг)
200
100
2 4 6 8 10
время культивирования (сутки)
Рис. 15. Рост Е.5а1тозуппета1а и изменения внутриклеточного содержания зервамицина.
тика в биомассе содержаться посл< 8 суток роста гриба, и чте продолжение культивировании приводит к падению его внутрикле точной концентрации. Так как I культурапьной жидкости Те\ такж< не обнаружен, вероятно, о» разрушается.
Молекулы 2гя содержат 4 ип1 5 остатков А1Ь в зависимости о~ типа пептаи-бола. Получение несущего "Ы-меченые остатки АН (15М-А1Ь-2п/), проводили н;
полноценной среде с глюкозой, пептоном и дрожжевым экстрактом и N-Aib (2г/л] Очищенный препарат специфически меченого зервамицина содержал т о л ь к i 15N-Aib, так как данные ЯМР- и МС-определений не обнаружили в молекула немеченых остатков Aib. Выход 15N-Aib-Zrv составил 0,12мг/мл среды, чп соответствует включению в молекулы антибиотика 3% добавленной 1SN-Ait Данный эксперимент показал, что присутствие в ростовой среде специфичесш для пептаиболов аминокислоты полностью блокирует её синтез de novo.
Получению униформно меченого 15N-Zrv предшествовал подбор условий обеспечивающих наибольший уровень биосинтеза 15№-пептаибола. Как и следовал! ожидать, рост культуры E.salmosynnemata на полноценой среде с 15М-автолизато| вместо пептона и дрожжевого экстракта (BP+YE), а также на синтетической среде 1!1^-автолизатом вместо суммы аминокислот был устойчивым (табл. 8). При это1 максимальный выход униформно 15Ы-меченого целевого продукта - н полноценной среде - составил около 1,1мг на 1г сырой биомассы гриба, KOTopyt можно получить при культивировании в 10мл полноценной среды, что примерн соответствует лучшей продуктивности культуры гриба на немеченых средах.
Таблица 8.
Уровень накопления биомассы Еза/тояуллетаГа и зервамицина на ростовых средах разного состава.
СРЕДА сырая биомасса (г/л) зервамицин (мг/г) сухой биомасы
Синтетическая 76,3 0.08
Синтетическая + 1ЬЫ-гидролизат* 67,2 0.27
Полноценная 80,1 3.5
Полноценная + 151Ч-гидролизат** 86,4 3.7
** - "N-автолизат метилотрофных бактерий вместо BP+YE.
Определение уровня включения "N-метки в молекулы зервамицина прово-1или с привлечением метода протонного Я MP. Сигналы протонов амидных групп, также, что более очевидно, сигнал протона индольного кольца триптофана 10,56ррт) представляют собой дублеты, что чётко свидетельствует об ниформном мечении пептаибола по 15N (рис. 15). Этот вывод подтверждается езультатами МС-анализа. Масса природного Zrv составляет 1861,0, тогда как на гасс-спектре 15М-меченого препарата есть единственный пик 1881,4, свдетель-твующий о том, что все 19 атомов азота замещены на тяжёлые.
Поверка антибиотической активности 15М-зервамицина и 15М-А|Ь-зервамицина эиотесте с Micrococcus luteus выявила полное совпадение с уровнем активности иродных препаратов.
Для получения униформно дейтерированного Zrv использовали полноценные еды с автолизатом дейтеро-биомассы метилотрофов, а также сравнивали сколько способов адаптации клеток гриба к дейтерию. Было установлено, что во ех случаях рост культуры - как на твёрдых, так и в жидких дейтеро-средах, сильно
ослаблен. Биосинтез Zrv на дейтеро-среде (0,22мг/мл КЖ) наблюдали только при добавлении глицерина, вместо обычно используемой глюкозы. Добавлении 13C+1sN-9nC к
13С+151Ч-полноценной среде также способствует синтезу Zev.
1
JU
Alu
JLL
LJL_
Рис. 16.1Н-ЯМР-спектр природного (1) и 15М-меченного препарата (2) зервамицина.
9. Очистка тяжёлой воды от продуктов жизнедеятельности клеток для её повтор ного использования не только существенно снижеат стоимость получаемы: дейтерированных соединений, но и приближает предлагаемый подход I безотходной технологической схеме. Методика отрабатывалась на культурвльны: жидкостях нескольких из использованных микроорганизмов, наибольши< трудности возникали с КЖ археобактерий из-за экстремально высокого содержани! солей. Для перегонки использовались КЖ, оставшиеся после проведение нескольких опытов и имевшие остаточный уровень содержания дейтерия 90,ОС 95,07ат.%. О чистоте получаемой 020 судили по УФ-спектрам поглощения образцо! и по уровню их электрического сопротивления, сравниваемого со стандарте» (18МОм). УФ-спектры, полученные при второй и третьей перегонке, говорят I наличии значительного количества примесей, а небольшое сопротивлени* показывает, что эти примеси токопроводящие. Качественная реакция I нингидрином подтвердила| предположение^, что примесями являлись амины образовавшиеся в процессе деструкции аминокислот. Перегонка с безводны*
СиЭ04 позволила связать примеа и получить достаточно чистун основную фракцию, пригодную дл: дальнейшего дообогащения п дейтерию.
Вся униформно мечена биомасса, накопленная в ходе куль ивирования различных микроорг низмов на СМ средах, подвергала! автолизу, аналогично автолизу би массы метилотрофных бактери
1 - исходная 020 {&9.85ат.%)
2 - основная фракция второй перегонки
3 • основная фракция третьей перегонки Л - основная фракция гштой перегонки
с безводным СивСМ $ -перввя фракция пятом перегоню«
220
260
длина волны (нм)
300 Полученные автолизаты использ
вались для приготовления полн ценных стабильно меченых рост
Рис. 17. UV-спектры образцов тяжёлой воды на разных стадиях очистки.
вых сред для гетеротрофных пр дуцентов - Bacillus и Emericellopsi. Итак, мы предложили и на практике убедились в работоспособности подхо, к получению различных биологически активных соединений с использовани< метилотрофных бактерий в качестве основы для введения стабильных изотопш меток в биомолекулы, синтезируемые различными микроорганизмами .
Варианты стабильно меченых БАС, полученных в данной работе.
МЕЧЕНЫЙ ПРОДУКТ МЕТКА ПРОДУЦЕНТ
жомасса 13С, 1ЬМ> 13С+15М МеЩЬЬасШиз Паде1Шит
.-аминокислоты 0, ис МеМу/оЬасШиз ЯадеПаШт
)ПС 0, ис 1Ле01у!оЬасИ1и5 Ладе1Шит
фруктоза + рибоза 0, ис МеИ1у1оЬасШиз ПадсПа^т
жомасса 0 ВгеуШа^епит те01уНсит
.-аминокислоты 0 Вгеу/ЬаМспит те#1уПсит
,-фенилапанин 0 ВгеуШаМепит теШуЧсит
жомасса Э Ме№у1оЬас(епит ехгогдиелэ
¡-полиоксбутират Э МеМу/оЬасТепит еЯогдиепв
1Н03ИН 0 ВасШиэ 5иЬйПв
жомасса 0, ис ВасШиэ зиЬйЧэ
•имидин 0 ВасШиэ ату1оНдиеГааепБ
жомасса □ ВасШиэ М1иппд1епв1$
.-эндотоксин Э ВасШиз №иппд1епз1'з
.-аминокислоты 0 На!оЬас1епит заИпапит
■рабиноза + рибоза 0 На!оЬаМепит заПпапит
¡л-2,3-ди-0-фитанил глицерин Э На1оЬа&епит заПпалит
жомасса 0, 1Ч ЕтепсеНорв/э salmasinnemata
¡ервамицин Р, 'Ч 13с+15ы ЕтепсеНорз/з ва1тазтпета1а
ВЫВОДЫ
1. Разработана концепция использования биотехнологического потенциала летилотрофных бактерий для получения различных классов стабильно меченых >иологически активных соединений. В рамках предложенной концепции пучены способности представителей основных групп метипотрофных бактерий осуществи ять конверсию низкомолекулярных стабильно меченых ростовых :убстратов в компоненты биомассы. Показано, что облигатные метилотрофные Зактерии характеризуются более высокой чувствительностью к полностью цейтерированной среде с дейтеро-метанолом как единственным источником углерода и энергии, чем факультативные метилотрофы.
2. Предложен метод дансильной модификации препаратов культурапьной кидкости и гидролизатов клеточных белков, позволивший изучить особенности /ровня включения стабильных изотопов в секретируемые и внутриклеточные аминокислоты облигатных метипотрофных бактерий Мсй)у!оЬасШи5 АадеИаШт и факультативного метилотрофа Srev/bacfer/um теМуИсит на средах разного изотопного состава. Отмечена чёткая корреляция между уровнем включения метки и уровнем её концентрации в ростовой среде.
3. Установлено, что облигатный метилотроф М.ЯадеНагит ЮГ секретирует полисахариды, состоящие из мономеров одного типа - фруктозы, причём данное свойство сохраняется при культивировании метилотрофа и на высокодейтери-
( ,
рованных средах. Показано, что культивирование факультативного метилотрофа Мев1у1оЬа&егшт е^огдиенэ на высокодейтерированной среде усиливает его способность накапливать р-полиоксибутират.
4. Впервые при культивировании на полностью дейтерированной среде в условиях лабораторного ферментёра получены десятки граммов тотально дейтерированной биомассы облигатного метилотрофа МеФу1оЬасШиэ АадеИаХит. Апробированы условия автолиза препаратов стабильно меченой биомассы метилотрофных бактерий для использования в составе полноценных ростовых сред для гетеротрофных микроорганизмов-продуцентов различной таксономической принадлежности.
5. Показано, что представители рода ВасШи$ обладают высокой природной устойчивостью к высокодейтерировакной полноценной ростовой среде. Впервые на такой среде отобран штамм В.гиЫШз - продуцент дейтеро-инозина. Показано, что клетки штамма В.ату1о1'щие{ааепз, продуцирующие тимидин, сохраняют это свойство при культивировании на высокодейтерированной ростовой среде. При выращивании на полноценной дейтеро-среде культуры В.итппд'юпз'я получены кристаллы биологически активного тотально дейтерированного 6-эндотоксина.
6. Проведено изучение влияния состава высокодейтерированных сред на рост культур галобакгерий На1оЬааепит ваИпапит. Получены и исследованы высокодейтерированные препараты липидов и аминокислот археобактерий. При изучении распределения изотопов водорода в процессе культивирования галобактерий на высокодейтерированной среде показан нелинейный характер разбавления дейтерия тяжёлой воды протием.
7. Изучены особенности накопления клетками мицелиального гриба ЕтепсеЧорв'^ 5а1таз'тпета1а пептидного антибиотика зервамицина. В ходе исследования усовершенствован метод определения зервамицина, оптимизированы пути выделения и очистки стабильно меченых препаратов этого антибиотика. Впервые биотехнологическим путём получены препараты селективно меченого 15Ы-АШ- и тотально 151\|-мечекного зервамицина, показана возможность получения тотально дейтерированного и 13С+15И-меченного антибиотика.
8. Показана возможность полной утилизации тотально меченых биомасс в качестве компонентов высокомеченных ростовых сред. Определён способ очистки тяжёлой воды из культуральных жидкостей, что позволяет проводить её реутилизацию для существенного снижения стоимости целевых тотально дейтерированных БАС.
:новное содержание диссертации изложено в следующих публикациях: Складнее Д.А., Цыганков Д.Ю., Кузнецов Э.В., Баев М.В., Говорухина Н.И., эоценко Ю.А. Влияние некоторых органических соединений на рост метило-юфных бактерий Methylobacterium МВ1. II Биотехнология, 1989, №5, 559-64. Баев М.В., Складнее Д.А., Стеркин В.Э. Ингибирование ассимиляции метанола |ри нарушении процесса fed-batch культивирования факультативного (етипотрофа Methylobacterium МВ1. // В сб.тез.докл.Всесоюзной конференции Лимитирование роста микроорганизмов», 1989, Пущино, стр.10. Складнев Д.А., Шкпяр Н.Л., Баев М.В., Стеркин В.Э. Лимитирование роста нутантных штаммов облигатных метипотрофных бактерий Methylobacillus lagellatum с измененным аминокислотным составом. II Сб.тез.докл. Всесоюзной онференции "Лимитирование роста микроорганизмов", 1989, Пущино, стр.56. Skladnev D.A. Using of Methylobacillus flagellatum for the production of labelled ompounds. Methabolic pathway of isotopic enrichment. II Proceeding of the Intern, iymposium «Interbiotech», 1990, Bratislava, ChSSR, p.39. Skladnev D.A., Baev M.V. The bacterial carotenoid production from methanol. II 'roceeding of VI Eur. Conf. «Biomass for energy, Industry and environment», Athens, Greece, 1991,1317-21.
Skladnev D.A., Baev M.V., Shilova S.Yu., Tsygankov Yu.D., Kamaukhova E.N., ?eshetova O.S. Determination of methanol bioconvertion by methylotroph Methyloba-:illus flagellatum by means of mass spectrometry. II Proceeding of the VI Eur. Conf. Biomass for energy, Industry and environment», Athens, Greece, 1991,1384-88. Baev M.V., Kuznetsov E.V., Skladnev D.A., Govorukhina N.I., Sterkin V.E., Tsygankov Yu.D. Growth and enzymological characteristics of a pink-pigmented facultative methylotroph Methylobacterium sp. MB1.// Folia Microbiol.(Praha),1992,37(2), 93-101. Tsygankov Yu.D., Bashkirova E.V., Seebrijski I.G., Kazakova S.M., Skladnev D.A. Circular map of obligate methylotroph Methylobacillus flagellatum. II Proceeding of the VII Symp. on Microbial growth on Ci compounds, 1992, Warwick, UK, p.B75. Kamaukhova E.N., Skladnev D.A., Reshetova O.S. MS and NMR analysis of stable-isotope labeled amino acids generated by methylotroph microorganisms. II J.Pharm. Belg., 1992, 47(3), 216.
0. Мосин О.В., Карнаухова Е.Н., Пшеничникова А.Б., Складнев Д.А., Акимова О.Л. Биосинтетическое получение дейтерий-меченного L-фенилаланина, секретиру-емого метилотрофным мутантом Brevibacterium methylicum. II Биотехнология, ¡993, №9,16-20.
11. Мосин О.В., Карнаухова Е.Н., Складнее Д.А., Акимова ОЛ., Цыганков Ю.Д. Штамм Brevibactenum methylicum - продуцент униформно меченной дейтерием аминокислоты L-фенилаланина. // Заявка РФ № 93055824 от 15.12.1993.
12. Karnaukhova E.N., Reshetova O.S., Semenov S.Y., Skladnev D.A., Tsygankov Yu.D. 2H- and 13C-labeled amino acids generated by obligate methylotrophs. // Biosynthesis and MS monitoring. Amino Acids, 1994, 6(1), 165-76.
13. Mosin O.V., Karnaukhova E.N., Pshenichnikova A.B., Skladnev D.A., Reshetova O.S. Electron impact spectrometry in bioartalysis of stable isotope labeled bacteriorho-dopsin. //VI Intern. Conf. on Retinal Proteins, 1994, Leiden, The Netherlands, p.115.
14. Mosin O.V., Karnaukhova E.N., Skladnev D.A. Application of methylotrophic bacteria for preparation of stable isotope labeled amino acids. II 7-th Intern. Symp. on the Genetics of Industrial Microorganisms, 1994, Quebec, Canada, p.163.
15. Matveev A.V., Mosin O.V., Skladnev D.A., Yurkevich A.M., Shvets V.I. Methylotrophic adaptation to highly deuterated substrates. // 8-th Intern. Symposium on Microbial Growth on CrCompounds, 1995, San Diego, USA, p.79.
16. Mosin O.V., Karnaukhova E.N., Skladnev D.A., Shvets V.I. Preparation of D- and 13C-amino acids via bioconvertion of Ci-substrates. II 8th International Symposium on Microbial Growth on Ci-Compounds, 1995, San Diego, USA, p.80.
17. Shvets V.I., Yurkevich A.M., Mosin O.V., Skladnev D.A. Preparation of deuterated inosine suitable for biomedical application. // Karadeniz Journal of Medical Sciences, 995, 8(4), 231-32.
18. Казаринова Л.А., Королькова H.B., Миронов A.C., Мосин О.В., Складнее Д.А., Юркевич A.M. Способ получения высокодейтерированных нукпеозидов и нуклеотидов. II Заявка РФ № 95118778 от 14.11.1995.
19. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Юркевич A.M., Швец В.И. Исследование биосинтеза аминокислот штаммом Brevibactenum methylicum на средах, содержащих тяжелую воду. II Биотехнология, 1996, №3, 3-12.
20. Mosin O.V., Skladnev D.A., Egorova Т.А., Shvets V.I. Biotechnological potential of methylotrophs for the preparation of deuterated amino acids. IIVIII Intern. Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division, Jerusalem, Israel, 1996, p.18.
21. Kazarinova L.A., Preobrazhenskaja E.S., Mosin O.V., Skladnev D.A., Yurkevich A.M., Shvets V.I. Production of deuterated inosine by Bacillus subtilis. IIVIII Intern. Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division, Jerusalem, Israel, 1996, p.23.
. Мосин О.В., Егорова Т.А.,Чеботаев Д.В., Схладнев Д.А., Юркевич A.M., ШвецВ.И. Получение бактериородопсина, меченного по остаткам ароматических минокислот L-фснилапанина, L-тирозина и L-триптофана. II Биотехнология, 996, №3,14-20.
. Мосин О.В.,Казаринова Л.А.,Преображенская Е.С., Складнее Д.А., Юркевич A.M., Uncu В.И. Рост бактерии Bacillus subtilis и биосинтез инозина на высокодейте-жрованной среде. II Биотехнология, 1996, №4,19-25.
. Скпаднев Д.А., Мосин О.В., Егорова Т.А., Ерёмин C.B., Швец В.И. Метило-рофные бактерии - источники изотопно-меченных D- и 13С-аминокислот. II Биотехнология, 1996, №4, 25-34.
. Мосин О.В., Складнее Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. Методы получения амино-:ислот и белков, меченных стабильными изотопами 2Н, 13С, 15N, 180. II Биотехнология, 1996, №10, 24-40.
. Мосин О.В., Скпаднев Д.А., Егорова Т.А., Юркевич A.M., Швец В.И. Масспектро-етрическая оценка уровня включения 2Н и 13С в молекулы аминокислот бактери-пьных объектов. II Биоорганическая химия. 1996,22(10-11), 856-69. . Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Юркевич A.M., Швец В.И. Методы олучения 2Н- и 13С-меченых белков, аминокислот и нуклеозидов. II Тезисы онференции памяти Н.И. Преображенского. 1996, стр.86.
. Skladnev D.A., Egorova Т.А. Stable isotopes labeled bacteriorhodopsin for compu-ers. II VII Тезисы Международной Конференции по ретинальсодержащим белкам, 996, Зихрон Яков (Израиль), 1997, стр.207.
. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.l. Biosynthesis of 2H-labeled phenylalanine by a ew mutant of RuMP facultative methylotroph Brevibacterium methylicum. II iiosciense, biotechnology and bioengineering. 1998, 62(2), 225-229. . Мосин O.B., Складнев Д.А., Швец В.И. Включение [2,3,4,5,6-2Н5]-фенилапанина, 5,5-2Н2]-тирозина и [2,4,5,6,7-2Н5]-триптофана в молекулу бактериородопсина На-ibacterium salinarium. II Прикладная биохимия и микробиология, 1999,35(1 ),34-42. . Мосин О.В., Складнев Д.А., Швец В.И. Биосинтез 2Н-меченого инозина. II 1звестия РАН, серия Биология, 1999, №4,403-13. Англ. вариант 1999,26(4),331-340. . Мосин О.В., Складнев Д.А., Швец В.И. Исследование физиологической даптации бактерий к тяжёлой воде. //Биотехнология, 1999, №4, 21-31. . Скпаднев Д.А., Смирнова Т.А., Николаенко М.А., Азизбекян P.P., Лапшина М.Б., трахова Е.С. Получение высокодейтерированных кристаллов 5-эндотоксина
Bacillus thuríngiensis на тяжёловодной полноценной ростовой среде, приготовленной из автолизата высокодейтерированной биомассы метилотрофных бактерий. II Биотехнология, 2000, №1,23-29.
34. Лапа С.А., Пшеничникова А.Б., Складнев Д.А. Биосинтетическое получение дейтерированных жирных кислот облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillus flagellatum KT. H VI Международная научно-практическая конференция "Наукоёмкие химические технологии-99", 1999,184-86.
35. Мишина И.М., Пономарёва Е.В., Страхова Е.С., Складнев Д.А. Биосинтетическо получение высокодейтерированного 5л-2,3-ди-0-фитанилглицерина из клеток Halobactcrium salinaríum. II VI Международная научно-практическая конференции "Наукоёмкие химические технологии-99", 1999,188-89.
36. Рогожкина Е.А., Лапшина М.Б., Ерёмин C.B., Швец В.И., Складнев Д.А. Изучени* процессов культивирования мицелиального гриба Emericellopsis salmosynne-mata - продуцента пептидного антибиотика зервамицина IIB. Разработка экспресс анализа с применением метода ВЭЖХ. II Химико-фармацевтический журнал, 2000, в печати.
37. Рогожкина Е.А., Лапшина М.Б., Ерёмин C.B., Швец В.И., Складнев Д.А. Биотехнологическое получение JH-, 15М-стабипьномеченных препаратов зервамицина IIB из Emericellopsis salmosynnemata. II Химико-фармацевтический журнал, 2000, в печати.
38. Мишина И.М., Пшеничникова А.Б., Складнев Д.А., Швец В.И. Биосинтетическое получение дейтерированных экзогенных углеводов метилотрофных бактерий Methylobacillus flagellatum KT. //Прикладная биохимия и микробиология,
2000, в печати.
39. Складнев Д.А., Цыганков Ю.Д., Мишина И.М. Способ получения униформно дейтерированной фруктозы. II Заявка №2000103007 от 2.2.2000.
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Складнев, Дмитрий Анатольевич
I. ВВЕДЕНИЕ.
И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Введение.
1.1. Стабильные изотопы основных элементов, входящих в биологически активные соединения.
1.2. Изотопный состав и общие свойства БгО и НгО.
1.3. История изучения влияния БгО на биологические объекты.
2. Применение тяжёлой воды в биологических и медицинских исследованиях.
2.1. Исследования, основанные на использовании физических свойств БгО.
2.2. Исследование механизмов действия антибиотиков с применением БгО.
2.3. Исследование структур различных белков с применением БгО.
2.4. Изучение ориентации белков в мембранах.
2.5. "Пурпурные мембраны" и фоточувствительные белки в В20.
2.6. Использование БгО при изучении фотореакций.
2.7. Использование БгО при исследованиях биосинтеза холестерина и жирных кислот.
2.8. Высокоточные методы измерения изотопного НЮ состава биомолекул.
2.9. Стабилизирующее действие тяжёлой воды на органические молекулы.
2.10. Терапевтическое действие БгО.
2.11 .Высокоточные методы измерения объёма жидкости в живых организмах.
3. Применение дейтерированных биологически активных соединений в биологических и медицинских исследованиях.
3.1. Применение низкомолекулярных дейтерированных биологически активных соединений в научных экспериментах.
3.2. Применение индивидуальных дейтерированных белков в научных исследованиях.
3.3. Исследования биологической активности дейтерированных клеточных структур.
3.4. Новые свойства дейтерированных аналогов биологически активных соединений.
4. Получение стабильно меченых биологически активных соединений.
4.1 Получение стабильно меченых биологически активных соединений путём химического и ферментативного синтеза.
4.2. Получение меченых биологически активных соединений иными методами.
4.3. Микроводоросли как продуценты дейтерированных соединений.
4.4. Культивирование иных микроорганизмов на с высокодейтерированных средах.
4.5. Культивирование микроорганизмов для производства стабильно меченых биологически активных соединений.
5. Получение и применение иных изотопных вариантов стабильно меченых биологически активных соединений.
1-3 if
5.1. Получение и использование С- и N-меченных биологически активных соединений.
5.2. Использование О-меченных биологически активных соединений.
5.3. Использование в исследованиях и получение множественно изотопно-меченых биологически активных соединений.
6. Основные свойства и биотехнологический потенциал метилотрофных бактерий.
6.1. Особенности С ¡-метаболизма метилотрофных бактерий.
6.2. Биотехнологические возможности метилотрофов.
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Химикаты.
Микроорганизмы и методы их культивирования.
Оборудование и приборы.
Методы получения и исследования стабильно меченых соединений.
IUI. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
7. Общая схема предлагаемого подхода к получению стабильно меченых биологически активных соединений на основе использования автолизатов стабильно меченой биомассы метилотрофных бактерий.
8. Разработка специального оборудования для работы с тяжёловодными ростовыми средами.
СТАБИЛЬНО МЕЧЕНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, СИНТЕЗИРУЕМЫЕ МЕТИЛОТРОФНЫМИ БАКТЕРИЯМИ.
9. Получение высокодейтерированных биологически активных соединений, синтезируемых облигатными метилотрофными бактериями.
9.1. Определение природной устойчивости облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillusßagellatum к высокодейтерированным ростовым средам.
9.2. Изучение уровней включения дейтерия в аминокислоты M.flagellatum.
9.3. Отбор форм метилотрофных бактерий M.flagellatum, адаптированных к высокодейтерированным средам.
9.4. Культивирование M.flagellatum на высокодейтерированной среде в лабораторном ферментёре.
9.5. Изучение биосинтеза экзополисахаридов метилотрофом M.flagellatum KTMFK5D.
9.5.1. Определение химического состава экзополисахаридов.
9.5.2. Отбор штамма-продуцента экзополисахаридов.
9.5.3. Изучение влияния состава ростовой среды на уровень секреции ЭПС.
9.5.4. Получение высокодейтерированных ЭПС бактерий M.flagellatum KT.
9.5.5. Определение химического и изотопного состава ЭПС M.flagellatum KT, получаемых на высокодейтерированных средах.
10. Получение высокодейтерированных биологически активных соединений, синтезируемых факультативными метилотрофами.
10.1. Определение природной устойчивости факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum к высокодейтерированным средам.
10.2. Изучение уровней включения дейтерия в секретируемые аминокислоты.
10.3. Изучение уровней включения дейтерия в аминокислоты белка биомассы.
10.4. Изучение ростовых и биосинтетических свойств факультативных метилотрофных бактерий Methylobacterium ext or quens на высокодейтерированных средах.
11. Получение униформно 13С- и 151Ч-меченных БАС, синтезируемых метилотрофными бактериями.
11.1. Изучение уровня включения С в аминокислоты, синтезируемые метилотрофами.
11.2. Изучение ростовых характеристик M.flagellatum на N-и на
13C+15N
-меченной среде.
12. Получение высокомеченных полноценных ростовых сред на основе стабильно меченой биомассы метилотрофных бактерий и изучение возможности их применения.
12.1. Подбор условий для автолиза стабильно меченых биомасс метилотрофов.
12.2. Определение питательной ценности стабильно меченых автолизатов метилотрофных бактерий.
СТАБИЛЬНО МЕЧЕНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, СИНТЕЗИРУЕМЫЕ ВТОРИЧНЫМИ ПРОДУЦЕНТАМИ.
13. Получение стабильно меченых биологически активных соединений, синтезируемых бациллами.
Введение к главе 13 (обзор литературы).
13.1. Отбор форм Bacillus subtilis, синтезирующих дейтеро-инозин.
13.2. Выделение и изучение уровня включения дейтерия в дейтеро-инозине.
13.3. Синтез дейтеро-тимидина клетками Bacillus amyloliquefaciens.
13.4. Получение униформно дейтерированного 5-эндотоксина Bacillus thuringiensis.
14. Получение стабильно меченых биологически активных соединений, синтезируемых археобактериями Halobacterium salinarium.
Введение к главе 14 (обзор литературы).
14.1. Отбор форм H.salinarium, адаптированых к высокодейтерированным средам.
14.2. Оптимизация состава высокодейтерированной ростовой среды.
14.3. Выделение и исследование липидов археобактерий H.salinarium.
14.4. Выделение и исследование белковых аминокислот Н. salinarium.
14.5. Синтез бактериородопсина, меченного дейтеро-аминокислотами.
14.6. Изучение распределения изотопов водорода при культивировании H.salinarium на высокодейтерированной полноценной ростовой среде.
15. Получение стабильно меченого антибиотика зервамицина, синтезируемого культурой мицелиального гриба Emericellopsis salmasinnemata.
Введение к главе 15 (обзор литературы).
15.1. Оптимизация метода выделения и очистки зервамицина.
15.2. Опримизациа условий и состава ростовых сред для биосинтеза зервамицина.
15.3. Получение зервамицина, униформно меченого дейтерием.
15.4. Получение зервамицина, меченного 15N-Aib.
15.5. Получение униформно 15КГ-меченного зервамицина.
15.6. Определение биологической активности стабильно меченых препаратов зервамицина.
16. Реутилизация использованной тяжёлой воды и стабильно меченых биомасс.
V. ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Метилотрофные бактерии как основа биотехнологического получения стабильно меченых биологически активных соединений"
Настоящая работа посвящена исследованию научных основ использования метилотрофных бактерий для биотехнологического получения биологически активных соединений, меченных атомами стабильных изотопов. Получаемые меченые соединения предназначены для использования как в структурно-функциональных биохимических и фармакокинетических научных исследованиях, так и в различных областях медицины.
Основные открытия естествознания последней четверти XX века не были бы возможны без огромных успехов в электронном приборостроении и в области тонких химических технологий. Именно благодаря разработке всё более совершенного научного оборудования, позволяющего регистрировать и анализировать всё более тонкие молекулярные взаимодействия, пополняются наши знания. И именно на фоне развития мирового рынка особо чистых реактивов появляются возможности сравнительно легко обнаруживать, выделять, исследовать и модифицировать практически любые биологические соединения и структуры. Маркирование био-молекул для проведения таких работ может осуществляться только на молекулярном уровне. Применение радиоизотопов в таких экспериментах ограничивается опасностью для объекта исследования, а также из- за наведённых радиационных эффектов на соседние молекулы. Использование стабильной изотопной метки не имеет ограничений. Тем не менее каталоги изотопно меченых соединений предлагают весьма ограниченный круг веществ, а высокие цены ещё более сдерживают применение в научной и медицинской практике препаратов, представленных на этом секторе мирового рынка особо чистых реактивов. Вместе с тем, нельзя представить себе дальнейший прогресс в естественных науках и медицине без расширения применения именно этой методологии - методологии стабильных изотопов.
Данная работа демонстрирует возможности использования биосинтетического потенциала метилотрофных бактерий для существенного расширения спектра производства биологически активных соединений (БАС), меченных атомами именно стабильных изотопов (СМ).
Метилотрофы - один из излюбленных объектов биотехнологических исследований, благодаря хорошим ростовым и биосинтетическим свойствам при доступности и низкой стоимости ростовых субстратов, непатогенности этих микроорганизмов, наличию весьма специфических, но достаточно хорошо изученных ферментативных и регуляторных систем. выделение СМ продукта I культивирование & приготовление культивирование метилотрофов на ^ СМ биомасса ( О полноценных СМ ^ вторичных
СОзСЮ и ЭгО ростовых сред продуцентов с? £
-О- приготовление выделение полноценных СМ СМ продукта ц ростовых сред регенерация БгО и обогащение по дейтерию &
Общая схема предлагаемого подхода к получению СМ БАС (тотально дейтерированных) на основе использования метилотрофных бактерий, представлена на схеме. Первый этап состоит в культивировании метилотрофных бактерий на ростовых средах с низкомолекулярными источниками изотопной метки для конверсии атомов стабильных изотопов в компоненты «метилотрофной» биомассы (метилотрофы -первичные продуценты СМ биомассы). Источниками изотопной метки были наиболее доступные низкомолекулярные соединения, содержащие изотопы водорода - дейтерий -Б (2Н), углерода - 13С, азота -15К Поскольку среды не содержат немеченых соединений, основным продуктом, получаемым на этом этапе, является биомасса метилотрофов, тотально меченая по соответствующему типу атомов. После частичного разрушения (автолиза) этой СМ биомассы и приготовлении из неё полноценных ростовых сред, на втором этапе проводится культивирование вторичных гетеротрофных продуцентов, синтезирующих специфические целевые СМ БАС в значительных количествах. Таким образом, предлагаемая схема может быть использована для получения любых классов меченых органических соединений, накапливаемых в клетках микроорганизмов, либо секретируемых в ростовую среду.
Поскольку стоимость всех соединений, включающих атомы стабильных изотопов, весьма высока, мы провели исследования, направленные на существенное снижение потерь изотопно меченых материалов. В результате была отработана методика реутилизации тяжёлой воды из культуральных жидкостей, а также показана возможность использования любых препаратов СМ биомасс для приготовления следующих партий полноценных стабильно меченых ростовых сред.
Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в разработке эффективной системы для получения любых СМ БАС, которые могут быть синтезированы клетками микроорганизмов разной таксономической принадлежности, на основе использования биотехнологического потенциала метилотрофных бактерий. В соответствии с этим в работе ставились следующие основные задачи:
1. Определить условия, позволяющие культивировать различные метилотрофные бактерий на средах из тяжёлой воды с дейтеро-метанолом в качестве единственного источника углерода и энергии. Изучить возможность получения БАС, тотально меченных дейтерием, 13С, 15>1, а также наработать препараты тотально меченой биомассы метилотрофов для выделения и исследования МС БАС.
2. Разработать методику приготовления полностью дейтерированных полноценных ростовых сред на основе высокодейтерированной биомассы метилотрофов, а также иных вариантов сред, тотально меченых стабильными изотопами.
3. Проверить приемлемость этих сред для наработки разнообразных СМ БАС, синтезируемых различными гетеротрофными микроорганизмами.
4. Изучить распределение изотопов водорода при культивировании археобактерий на высокодейтерированной ростовой среде.
5. Отработать метод реутилизации тяжёлой воды и образцов стабильно меченой биомассы использованных микроорганизмов.
Актуальность темы определяется всё более расширяющимся использованием в разнопрофильных научных исследованиях и медицинской практике различных СМ БАС. Эта тенденция наблюдается несколько последних лет, и сдерживается только всё ещё высокой стоимостью самих СМ соединений и, в большей степени, ценой научных приборов для их детекции и исследований. Предлагаемая технология может частично решить первую из названых проблем.
Научная новизна. Впервые было проведено широкое исследование возмо-жности использования разных групп метилотрофных бактерий в качестве «первичного объекта» для биотехнологического мечения БАС атомами стабильных изотопов. Впервые проведена адаптация нескольких метилотрофов к полностью дейтерированным ростовым средам. Отработана методика культивирования адаптированных бактерий в условиях лабораторного ферментёра на тяжёловодной ростовой среде с дейтеро-метанолом в качестве единственного источника углерода для получения тотально дейтерированной биомассы. Впервые показано, что клетки облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum KT синтезируют экзополифруктаны, как на обычных, так и на высокодейтерированных средах. Изучено распределение дейтериевой и 13С метки в аминокислотах метилотрофов. Определён способ приготовления полноценных тотально дейтерированных ростовых сред, обеспечивающих нормальный рост и биосинтез целевых продуктов различными гетеротрофными микроорганизмами. Проведён анализ динамики изменения уровня дейтерия в культуральной жидкости в процессе роста галобактерий. Впервые биосинтетическим путём получены разнообразные высокомеченные БАС.
Практическая значимость предлагаемой комплексной, практически безотходной технологии, состоит в том, что она позволяет относительно быстро получать широкий спектр органических соединений с максимальным содержанием атомов дейтерия, 13С, 15N. Получены в униформно дейтерированном виде нуклеозиды - инозин и тимидин (продуценты Bacillus subtillis и Bacillus amyloliquefaciens), а также тотально дейтерированные липиды Halobacterium salinarium и 5-эндотоксин Bacillus thuringiensis. Усовершенствованы методики выделения и очистки пептидного антибиотика зервамицина, синтезируемого мицелййальным грибом Emericelopsis salmasinnemata. Впервые биосинтетическим путём наработан тотально 15N-меченный зервамицин и показана возможность получения его аналогов, полностью дейтерированных и с двойной меткой 13C+15N.
В целом, использование предлагаемого комплексного, практически безотходного подхода, позволяет относительно быстро получать широкий спектр соединений, тотально меченых дейтерием, 13 С, 15N. Такими соединениями могут быть различные аминокислоты, белки, сахара и полисахариды, нуклеозиды, бациллярные токсины, жирные кислоты и антибиотики, требующихся для проведения самого разного рода научных и медицинских исследований.
Основные результаты исследований, изложенные в диссертации, получены автором в Институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов. Часть работ по выделению и весь анализ молекулярного и изотопного состава получаемых соединений проводился совместно с сотрудниками и аспирантами кафедры Биотехнологии МГАТХТ им. М.В. Ломоносова.
10
Апробация работы состоялась на заседании Межлабораторного семинара ГосНИИ генетика 1 июля 1999 года. Материалы исследований представлялись на следующих научных конференциях: VII Международная конференция по стабильным изотопам 1989г., Тбилиси (СССР); Международный симпозиум «Interbiotech» 1990г., Братислава (ЧССР); VI Европейская Конференция «Биомасса для энергетики, промышленности и окружающей среды», 1991, Афины (Греция); VII Международный Конгресс по генетике промышленных микроорганизмов 1994г., Квебек (Канада); VII, VIII Международные Симпозиумы по Ci соединениям - 1992г., Варвик (Великобритания), 1995г., Сан-Диего (США); VIII Международный Конгресс по бактериологии и прикладной микробиологии, 1996г., Иерусалим (Израиль); VII Международная Конференция по ретинальсодержащим белкам, 1996г., Зихрон Яков (Израиль); Конференция по трансмембранным белкам 1998г., Лондон (Великобритания); VI Международная научно-практическая конференция "Наукоёмкие химические технологии-99", 1999г., Москва (Россия).
Объём и структура диссертации. Содержание работы изложено на 204 страницах, содержит 25 таблиц и 36 рисунков. Работа включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, список цитированных публикаций (405 названий). Основные главы обзора литературы посвящены анализу новейших данных по вопросам получения и использования тяжёлой воды и более сложных дейтерированных биологически активных соединений. Далее обсуждаются возможности применения и множественно меченных БАС в научных исследованиях и медицинской практике. Рассмотрены также вопросы, связанные с использованными модельными микроорганизмами - метилотрофными и галофильными бактериями, бациллами, мицелиальными грибами (каждый из этих разделов обзора предшествует соответствующей главе, содержащей результаты собственных исследований).
11
Использованные сокращения и обозначения.
АЛ - автолизат микробной биомассы.
КЖ - культуральная жидкость свободная от клеток.
БМ - биомасса микроорганизмов.
БгО-среда - ростовая среда, приготовленная из высокообогащённой тяжёлой воды с безводными солями и, по возможности, не содержащая недейтерированных компонентов, за исключением водного (Н2О) раствор микроэлементов - 0,1об.%. Другие названия: дейтеро-среда, тяжеловодная среда, высокодейтерированная среда.
НгО-среда - ростовая среда, приготовленная их природной воды. Другие названия: обычная среда, протонированная среда, немеченная среда, контрольная среда.
С-среда - ростовая среда, приготовленная их природной воды и содержащая только 13С-меченные источники углерода.
51Ч-среда - ростовая среда, приготовленная их природной воды и содержащая только 151\[-мсченные источники углерода.
ВР+УЕ - сухой преарат для приготовления полноценных ростовых сред, включающий бакто-пептон и дрожжевой экстракт.
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Введение.
Основное внимание в обзоре литературы уделяется данным, которые могли бы по возможности наиболее подробно проиллюстрировать современное состояние дел в области использования стабильных изотопов в научной и практической сферах современной биологии и медицины. Соответственно, более внимательно рассмотрены вопросы, связанные с исследованиями биологического действия основного источника дейтериевой метки -тяжёлой воды. В последующих разделах представлены результаты разнообразных исследований, успешное завершение которых определялось применением тех или иных биологически активных соединений, меченных стабильными изотопами. Далее рассматриваются основные пути получения стабильно меченых биологически активных соединений. Заключительная глава обзора посвящена описанию основных характеристик тех биологических объектов и модельных систем, которые исследовались в ходе выполнения части данной диссертационной работы.
Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Складнев, Дмитрий Анатольевич
V. выводы.
1. Разработана концепция использования биотехнологического потенциала метилотрофных бактерий для получения различных классов стабильно меченых биологически активных соединений. В рамках предложенной концепции изучены способности представителей основных групп метилотрофных бактерий осуществлять конверсию швкомолекулярных стабильно меченых ростовых субстратов в компоненты биомассы. Показано, что облигатные метилотрофные бактерии характеризуются более высокой чувствительностью к полностью дейтерированной среде с дейтеро-метанолом как единственным источником углерода и энергии, чем факультативные метилотрофы.
2. Предложен метод дансильной модификации препаратов культуральной жидкости и тидролизатов клеточных белков, позволивший изучить особенности уровня включения стабильных изотопов в секретируемые и вну триклеточные аминокислоты облигатных метилотрофных бактерий М&ку1оЬаеШт АщеЯМит КТ и факультативного метилотрофа Вге\ч.ЬшЯептп теИгуИсит на средах разного изотопного состава. Отмечена чёткая корреляция между уровнем включения метки и уровнем её концентрации в ростовой среде.
3. Установлено, что облигатный метилотроф Ме(Ьу1оЬасШт Ах^еИайтг КТ секретирует полисахариды, состоящие из мономеров одного типа - фруктозы, причем данное свойство сохраняерся при культивировании метилотрофа и на высокодейтерированных средах. Показано, что культивирование факультативного метилотрофа МеЛкуЫЬа&егшт ехШциет на высоко дейтерированной среде усиливает его способность накапливать р-полиоксибутират.
4. Впервые при культивировании на полностью дейтерированной среде в условиях лабораторного ферментёра получены десятки граммов тотально дейтерированной биомассы облигатного метилотрофа М&куЫЪасШих АацсНаШт КТ. Апробированы условия автолиза препаратов стабильно меченой биомассы метилотрофных бактерии для использования в составе полноценных ростовых сред для гетеротрофных микрооргашемов-продуцентов различной таксономической принадлежности.
5. Показано, что представители рода jBacillus обладают высокой природной устойчивостью к высокодейтерированной полноценной ростовой среде. Впервые на такой среде отобран штамм Bacillus subtilis - продуцент дейтеро-инозина. Показано, что клетки штамма Bacillus amyloliquefaciens, продутщрутощие тимидин, сохраняют это свойство при культивировании на высокодейтерированной ростовой среде. При выращивании на полноценной дейтеро-среде культуры Bacillus thuringiensis получены кристаллы биологически активного тотально дейтерированного 5-эндотоксина.
6. Проведено изучение влияния состава высокодейтерированных сред на рост культур галобактерий Halobacterium saünarium. Получены и исследованы высокодейтерированные препараты липидов и аминокислот археобактерий. При изучении распределения изотопов водорода в процессе культивировангам галобактерий на высокодейтерированной среде показан нешшейный характер разбавления дейтерия тяжёлой воды протаем.
7. Изучены особенности накопления клетками мицелиального гриба Emericellopsis sabiwsinnemata пептидного антибиотика зервамицина. В ходе исследования усовершенствован метод определения зервамицина, оптимизированы пути выделения и очистки стабильно меченых препаратов этого антибиотика. Впервые биотехнологическим путём получены препараты селективно меченого 15Ы-аминожомасляной кислотой и тотально 15Н-меченного зервамицина, показана возможность получения тотально дейтерированного и иС+151Ч-меченного антибиотика.
8. Показана возможность полной утилизации тотально меченых биомасс в качестве компонентов высокомеченных ростовых сред. Определён способ очистки тяжёлой воды из культуральных жидкостей, что позволяет проводить её реутилизиащ-по для существенного снижения стоимости целевых тотально дейтерированных БАС.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Складнев, Дмитрий Анатольевич, Москва
1. Березин И.В., Рабинович М.Л., Синицын А. Исследование возможностей кинетического метода определения глюкозы. Биохимия, 1977, 24(9), 1631-36.
2. Варшавский Я.М. О распределении изотопа углерода 13С в биологических системах. Биофизика, 1988, 33, №2, 351-55.
3. Владимирова М.Г., Семененко В.Е. Интенсивная культура одноклеточных водорослей, 1962, Изд-во АН СССР.
4. Говорухина Н.И., Клецова Л.В., Цыганков Ю.Д., Троценко Ю.А., Нетрусов А.И. Характеристика нового облигатного метилотрофа. Микробиология, 1987, 56(5), 849-54.
5. Говорухина Н.И., Троценко Ю.А. Содержание поли-|3-оксибутирата у метилотрофных бактерий с различными путями первичной ассимиляции метанола. Прикладная биохимия и микробиология, 1991, 27(1), 98-101.
6. Гринберг Т.А., Дерябин В.В., Старухина А.А., Малашенко Ю.Р.
7. Экзополисахариды метилотрофных бактерий. Микробиологический журнал, 1987, 49(2), 101-11.
8. Денько Е.И. Действие тяжёлой воды (D20) на клетки животных, растений и микроорганизмы. Успехи Современной Биологии, 1970, 70(4), 41-64.
9. Ершов А.В., Музалевский А.И., Королькова Н.В., Тяглов Б.В., Миронов А.С.
10. Очистка тимидина, полученного биотехнологическим путём. Биотехнология, 1997, №9-10,20-23.
11. Казакова С.М., Казанцева Д.И., Цыганков Ю.Д. Оптимизация условий нитрозогуанидинового мутагенеза облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum КТ. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1986, №8, 28-32.
12. Казаринова Л.А., Преображенская Е.С., Шакулов Р.С., Марков В.Ф., Щипанов Н.П., Гуляева Д.А., Савина Н.Н. Штамм бактерий Bacillus subtillis -продуцент инозина. 1993, Патент РФ №2003678.
13. Казаринова JI.А., Королькова Н.В., Миронов A.C., Мосин О.В., Складнев Д.А., Юркевич A.M. Способ получения высокодейтерированных нуклеозидов и нуклеотидов. Заявка РФ № 95118778 от 14.11.1995.
14. Карпов A.M., Альбицкая О.Н. Разработка промышленных линий для производства и переработки микроводорослей. Биотехнология, 1989, 5(3), 376-80.
15. Клецова JI.B., Чибисова Е.С., Цыганков Ю.Д. Температурочувствительный мутант облигатного метилотрофа Methylobacillus flagellatum KT, дефектный по глюкозо-6-фосфатдегидрогеназе. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1987, №7, 39-44.
16. Королькова Н.В., Миронов A.C., Гарибян A.M. , Полануер Б.М.,Тяглов Б.В. Штамм Bacillus amyloliquefaciens продуцент тимидина. 1997,Патент РФ№2088659.
17. Кочетков Н.К., Бочков А.Ф., Дмитриев Б.А. Методы химии углеводов. 1967, "Химия", М.
18. Крылов И.А., Красноштанова A.A., Манаков М.Н. Кислотный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. 2. Кинетика гидролиза белковых фракций дрожжей и бактерий серной кислотой. Биотехнология, 1996(a), №3, 45-49.
19. Крылов И.А., Красноштанова A.A., Манаков М.Н. Кислотный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. 3. Кинетика кислотной экстракции белковых веществ из клеток дрожжей и бактерий. Биотехнология, 1996(6), №3, 50-55.
20. Лазарева A.B., Окон М.С., Кутышенко В.П., Цоглин Л.Н., Каюшин Л.П., Семененко В.Е., Сибельдина Л.А., Чекулаева Л.Н. Массовое культивирование микроводорослей в тяжёлой воде. Физиология растений, 1974, 21(2), 359-65.
21. Мосин О.В., Казаринова JI.A., Преображенская Е.С., Складнев Д.А., Юркевич A.M., Швец В.И. Рост бактерии Bacillus subtilis и биосинтез инозина на высокодейтерированной среде. Биотехнология, 1996, №4, 19-26.
22. Мосин О.В., Карнаухова E.H., Пшеничникова А.Б., Складнев Д.А., Акимова O.JI. Биосинтетическое получение дейтерий-меченного L-фенилаланина, секретируемого метил отрофным мутантом Brevibacterium methylicum. Биотехнология, 1993, №9, 16-20.
23. Мосин О.В., Карнаухова E.H., Складнев Д.А., Акимова O.JL, Цыганков Ю.Д. Штамм Brevibacterium methylicum продуцент униформно меченной дейтерием аминокислоты L-фенилаланина. Заявка РФ № 93055824 от 15.12.1993.
24. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Юркевич A.M., Швец В.И. Исследование биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum на средах, содержащих тяжёлую воду. Биотехнология, 1996, №3, 3-12.
25. Мосин О.В., Егорова Т.А., Чеботаев Д.В., Складнев Д.А., Юркевич A.M., Швец В.И. Получение бактериородопсина, меченного по остаткам ароматических аминокислот L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана .Биотехнология, 1996, №3, 14-20.
26. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. Методы получения аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами 2н, I3c, 15n, 18о. Биотехнология, 1996, №10, 24-40.
27. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Юркевич A.M., Швец В.И.2 13
28. Масспектрометрическая оценка уровня включения Ни С в молекулы аминокислот бактериальных объектов. Биоорганическая химия. 1996, 22(10-11), 856-69.
29. Мосин О.В., Складнев Д.А., Швец В.И. Включение 2,3,4,5,6-2Н5.-фенилаланина, [3,5-2Н2]-тирозина и [2,4,5,6,7-2Нз]-триптофана в молекулу бактериородопсина Halobacterium salinarium. Прикладная биохимия и микробиология, 1999, 35(1), 34-42.
30. Мосин О.В., Складнев Д.А., Швец В.И. Биосинтез 2Н-меченого инозина. Известия РАН, серия Биология,1999,№4,403-13. Англ. вариант 1999,26(4),331-340.
31. Мосин О.В., Складнев Д.А., Швец В.И. Исследование физиологической адаптации бактерий к тяжёлой воде. Биотехнология, 1999, №4, 21-31.
32. Пшеничникова А.Б., Карнаухова E.H., Звонкова E.H., Швец В.И. Методы получения дейтерированных аминокислот. Биоорганическая химия,1995,21(3),163.78.
33. Складнев Д.А., Мосин О.В., Егорова Т.А., Ерёмин С.В., Швец В.И. Метилотрофные бактерии источники изотопно-меченных D- и !3С-аминокислот. Биотехнология, 1996, №4, 25-34.
34. Складнев Д.А., Цыганков Ю.Д., Мишина И.М. Способ получения униформно дейтерированной фруктозы. Заявка РФ № 2000103007 от 10.3.2000(6).
35. Смирнова Т.А., Миненкова И., Шамшина Т., Константинова Т.Е., Кузнецова Н.И., Кузин А.И., Николаенко М., Клицунова Н., Ганушкина Л., Шагов Е., Азизбекян P.P. Характеристика природных штаммов Bacillus thuringiensis. Биотехнология, 1993, №11-12, 12-16.
36. Шатенштейн А.И., Варшавский Я.М., Дыхно Н.М., Звягинцева Е.Н., Израилевич Е.А., Калиначенко В.Р., Яковлева Е.А. Изотопный состав воды. 1954, Изд.АН СССР.
37. Abrahamsson S., Dinh-Nguyen N., Hellgren L.G., Vincent J.G. 1982,Patent SE426011B.
38. Agarwalla S., Mellor I.R., Sansom M.S., Karle I.L., Flippen-Anderson J.L., Uma K., Krishna K., Sukumar M.I., Balaram P. Zervamicins, a structurally characterized peptide models for membrane ion channels. Biochem.Biophys.Res.Commun.,1992,186(1),8-15.
39. Allison S.D., Chang В., Randolph T.W., Carpenter J.F. Hydrogen bonding between sugar and protein is responsible for inhibition of dehydration-induced protein unfolding. Arch.Biochem.Biophys.,1999,365(2),289-98.
40. Anastasis P., Freer I., Overton K.H., Picken D., Rycrot D.S., Singh S.B. On the role of leucine in terpenoid methabolism. J.Chem.Soc.Perkin Trans.,1987,1(11),2427-36.
41. Anderson R.E., Dunham W.R., Sands R.H., Bearden A.J., Crespi H.L. On thenature of the iron sulfur cluster in a deuterated algal ferredoxin. Biochim.Biophys.Acta,1975, 408(3),306-18.
42. Anderson T., Dawes A. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbiological Rev.,1990,54(4),350-472.
43. Antony C. The Biochemistry of Methylotrophs, A.P.,N.Y., London,1982.
44. Anthonyl C., Ghosh M., Blake C.C.F. Structure and function of methanol degidrogenase and related quinoproteins containing pyrroloquinoline quinone. Biochem. J., 1994, 304(3),665-74.
45. Aoki R., Momose H., Kondo Y., Muramatsu N., Tsuchiya Y. Studies of inosine fermentation production of inosine by mutants of Bacillus subtilis. J.Gen.Appl. Microbiol., 1963,9(4),3 87-95.
46. Argade P.V., Rothschild K.J., Kawamoto A.H., Herzfeld J., Herlihy W.C. Resonance Raman spectroscopy of specifically s-15N.-lysine-labeled bacteriorhodopsin. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1981,78(3), 1643-46.
47. Argoudelis A.D., Dietz A., Johnson L.E. Zervamicins I and II, polypeptide antibiotics produced by Emericellopsis salmosynnemata. J.of Antibiotics,1974,27(5),321-28.
48. Armstrong G.A. Eubacteria show their true colors: Genetics of carotenoid pigment biosynthesis from microbs to plants. J.Bacteriol., 1994,176(16),4795-802.
49. Arndt K., Hofmann D., Gehre M., Krumbiegel P.I5N investigation into the effect of a pollutant on the nitrogen metabolism of Tetrahymena pyriformis as a model for environmental medical research. Environ.Health Perspect,1998,106(8),493-97.
50. Aull J.L., Crespi H.L., Williams D.E., Evanochko W.T. Growth of Lactobacillus casei in deuterated media. Purification of deuterated thymidylate synthase and proton nuclear magnetic resonance studies. Biochim.Biophys.Acta,1982,709(2),310-17.
51. Aull J.L., Crespi H.L., Williams D.E., Evanochko W.T. Growth of Lactobacillus casei in deuterated media. Purification of deuterated thymidylate synthase and proton nuclear magnetic resonance studies. Biochim.Biophys.Acta,1982,709(2),310-17.
52. Baenziger J.E., Darsaut T.E., Morris M.L. Internal dynamics of the nicotinic acetylcholine receptor in reconstituted membranes. Biochemistry, 1999,38(16),4905-11.
53. Baev M.V., Kuznetsov E.V., Skladnev D.A., Govorukhina N.I., Sterkin V.E., Tsygankov Y.D. Growth and enzymological characteristics of a pink-pigmented facultative methylotroph Methylobacterium sp. MB1. Folia Microbiol (Praha),1992, 37(2),93-101.
54. Baker M.T., Ronnenberg Jr.W.C., Ruzicka J.A., Chiang C-K., Tinker J.H.1.hibitory effects of deuterium substitution on the metabolism of sevoflurane by the rat. Drug Metaholism and Disposition, 1993,21,1170-71.
55. Balaram P., Krishna K., Sukumar M., Mellor I.R., Sansom M.S. The properties of ion channels formed by zervamicins. Eur.Biophys.J., 1992,21 (2), 117-28.
56. Barber J. Deuterated products from culture in a deuterated medium. 1997, Патент Великобритании №2304343.
57. Barth A., Mantele W. ATP-Induced phosphorylation of the sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase: molecular interpretation of infrared difference spectra. Biophys.J., 1998,75(1),538-44.
58. Batey R.T., Inada M., Kujawinski E., Puglisi J.D., Williamson J.R. Preparation of isotopically labeled ribonucleotides for multidimensional NMR spectroscopy of RNA. Nucleic Acids Res.,1992,20(17),4515-23.
59. Bayley T.M., Alasmi M., Thorkelson Т., Krug-Wispe S., Jones P.J.H., Bulani J.L., Tsang R.C. Influence of formula versus breast milk on cholesterol synthesis rates in four-month-old infants. Pediatr.Res., 1998,44(1),60-67.
60. Beldarrain A.,Lopez-Lacomba J.L.,FurrazoIa G.,Barberia D.,Cortijo M. Thermal denaturation of human y-interferon. A calorimetric and spectroscopic study. Biochemistry, 1999,3 8(24),7865-73.
61. Belova L.L., Sokolov A.P., Morgunov I.G., Trotsenko Yu.A. Purification and characterization of citrate synthase from Methylobacterium extorquens a methylotrophic producer of polyhydroxybutyrate. Biochemistry(Mosc.), 1997,62(1), 71-76.
62. Benedict M., Pigford Т., Levi H. Nuclear Chemical Engineering, 2nd ed., 1981,McGraw-Hill,N.Y.
63. Berneburg M., Grether-Beck S., Kurten V., Ruzicka Т., Briviba K., Sies H., Krutmann J. Singlet oxygen mediates the UVA-induced generation of the photoaging-associated mitochondrial common deletion. J.Biol.Chem., 1999,274(22), 15345-49.
64. Bhatti M., MacRobert A., Meghji S., Henderson В., Wilson M. A study of the uptake of toluidine blue О by Porphyromonas gingivalis and the mechanism of lethal photosensitization. Photochem.Photobiol., 1998,68(3),370-76.
65. Blake G.A., Qi C., Hogerheijde M.R., Gurwell M.A., Muhleman D.O. Sublimation from icy jets as a probe of the interstellar volatile content of comets. Nature, 1999, 398(6724), 213-16.
66. Bodamer O., Hoffmann G., Visser G., Janecke A., Linderkamp O., Leonard J., Fasoli L., Rating D. Assessment of energy expenditure in metabolic disorders. Eur. J.Pediatr., 1997,156(1 ),S24-28.
67. Boehringer Sohn C H CMBH. 1976, Patent DE 2516836.
68. Bogusky M.J., Schiksnis R.A., Leo G.C., Opella S.J. Protein backbone dynamics by solid-state and solution I5N NMR spectroscopy. J.Magn.Res., 1987,72(1),186-90.
69. Bourque et al., Production of poly-ß-hydroxybutyrate from methanol: characterization of a new isolate of Methylobacterium extorquens. Appl.Microbiol.Biotechnol.,1992, 37(1),7-12.
70. Borchert S., Patil S.S., Marahiel M.A. Identification of putative multifunctional peptide synthetase genes using highly conserved oligonucleotide sequences derived from known synthetases. FEMS Microbiol.Lett., 1992,71(2), 175-80.
71. Born T.L., Zheng R., Blanchard J.S. Hydrolysis of N-succinyl-L,L-diaminopimelic acid by the Haemophilus influenzae dapE-encoded desuccinylase: metal activation, solvent isotope effects, and kinetic mechanism. Biochemistry, 1998,37(29), 10478-87.
72. Bose S., Crespi H.L., Blanke M.I., Katz J. J. Comparative studies of photo synthetic processes in ordinary and fully deuterated algae. Plant Cell Physiol.,1967,8,545-55.
73. Bowen W.D., Iverson S.J. Estimation of total body water in pinnipeds using hydrogen-isotope dilution. Physiol.Zool.,1998,71(3),329-32.
74. Bradshaw J.P., Bushby R.J., Giles C.C., Saunders M.R. Orientation of the headgroup of phosphatidylinositol in a model biomembrane as determined by neutrondiffraction. Biochemistry, 1999,3 8(26),8393-401.
75. Braun T.F., Poulson S., Gully J.B., Empey J.C., Van Way S., Putnam A., Blair D.F. Function of proline residues of MotA in torque generation by the flagellar motor of Escherichia coli. J.Bacteriol.,1999,181(11),3542-51.
76. Brever D., Mason F.G., Taylor A. The production of alamethicins by Trichoderma spp. Can.J.Microbiol.,1987,33(3),619-25.
77. Brown A.D. Microbial Water Stress Physiology: Principles and Perspectives. 1990, John Wiley and Sons, Chichester, New York, Brisbane,'Toronto,Singapore,313.
78. Brown H.J., Gibbons N.E. The effect of magnesium, potassium, and iron on the growth of red halophilic bacteria. Can. J.Microbiol., 1955,1(6),486-94.
79. Bu'Lock J.D. Industrial aspects of biochemistry. 1974,North Holland Publ., 1,293-342.
80. Bulygina E.S., Galchenko V.F., Govorukhina N.I., Netrusov A.I., Nikitin D.I., Trotsenko Y.A., Chumakov K.M. Taxonomic studies on methylotrophic bacteria by 5S ribosomal RNA sequencing. J.Gen.Microbiol.,1990,136(3),441-46.
81. Burkholder W.J., Thatcher C.D. Validation of predictive equations for use of deuterium oxide dilution to determine body composition of dogs. Am.J.Vet.Res., 1998,59(8),927-937.
82. Busujima U.K., Shimiba S., Narita K., Okada S. Biosynthesis with deuterated microorganisms. Chem.Pharm.Bull., 1988,36(5),1828-32.
83. Butko P., Huang F., Pusztai-Carey M., Surewicz W.K. Interaction of the delta-endotoxin CytA from Bacillus thuringiensis var. israelensis with lipid membranes. Biochemistry,1997,36(42),12862-68.
84. Campbell J., Weiner W.C., Chess E.K. Biomedical inveronment. Mass Spectrom., 1990,19, 520-22.
85. Cardillo R. Pattern of incorporation of leucine samples asymmetrically labelled with13
86. C in the C5- isopropyl unit of Echiruline and flavoglaucine. J.of Chem.Soc.D., 1977,474-76.
87. Chakrabarti G., Kim S., Gupta M.L. Jr., Barton J.S., Himes R.H. Stabilization of tubulin by deuterium oxide. Biochemistry,1999,38(10),3067-72.
88. Chanatry J.A., Schafer P.H., Kim M.S., LeMaster D.M. Synthesis of alpha, beta-deuterated 15N amino acids using a coupled glutamate dehydrogenase-branched-chain amino acid aminotransferase system. Anal.Biochem.,1993,213(1),147-51.
89. Chistoserdov A.Yu., Tsygankov Yu.D. Broad host range vectors derived from RSF1010::Tnl plasmid. Plasmid,1985,16(1),128-35.
90. Chorney W., Scully N.J., Crespi H.L., Katz J.J. The growth of algae in deuterium oxide.Biochem. Biophis.Acta,1960,37(1),280-87.
91. Clandinin M.T., Cook S.L., Konrad S.D., Goh Y.K., French M.A. The effect of palmitic acid on lipoprotein cholesterol levels and endogenous cholesterol synthesis in hyperlipidemic subjects. Lipids 1999,S121-24.
92. Cordone L., Ferrand M., Vitrano E., Zaccai G. Harmonic behavior of trehalose-coated carbon-monoxy-myoglobin at high temperature. Biophys.J., 1999,76(2), 1043-47.
93. Cotten M., Fu R., Cross T.A. Solid-state NMR and hydrogen-deuterium exchange in a bilayer-solubilized peptide: structural and mechanistic implications. Biophys.J., 1999, 76(3),1179-89.
94. Cotten M., Tian C., Busath D., Shirts R.B., Cross T.A. Modulating dipoles for structure-function correlations in the gramicidin A channel. Biochemistry, 1999,38(29), 9185-97.
95. Crainic R., Simpson K. 1994, Patent WO 9421298.
96. Crescenzi V. Microbial polysaccharides of applied Interest: Ongoing research activities in Europe. Biotechnology Progress, 1995,11(3),251-59.
97. Crespi H.L. Biosyntesis and uses of deuterated proteins. Synthesys and Applyed of Isotopic Labeled Compounds. 1986, Ed. R.R.Muccino,Elsevier, 111-112.
98. Crespi H.L. The isolation of deuterated bacteriorhodopsin from fully deuterated Halobacterium halobium. Methods in Enzymology,1982,88(1),3-12.
99. Crichton R.R., Engleman D.M., Haas J., Koch M.H., Moore P.B., Parfait R., Stuhrmann H.B. Contrast variation study of specifically deuterated Escherichia coli ribosomal subunits. Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1977,74(12),5547-50.
100. Croncholm T., Curstedt T. Heterogeneity of the sn-glycerol-3-phosphate pool in isolated hepatocytes, demonstrated by the use of deuterated glycerols and etanol. Biochem.J.,1984, 224(2),731-39.
101. Cundliffe E. How antibiotic-producing organisms avoid suicide. Annual Review of Microbiology, 1989,43(2),207-3 3.
102. Curry J., Trelese S.F. Influence of deuterium oxide on the rate of photosynthesis. Science, 1935,82,18.
103. Darmaun D., Robert J.J., Bier D.M., Mathews D.E., Young V.R. Study in vivo of the metabolism of non-essential amino acids using stable isotopes. Annales-d' Endocrinologie., 1985, 46(4/5),355-56.
104. Daub G.H. Syntheses with stable isotopes. In: Stable Isotopes, Proc.of the 3d Intern. Conference, Ed. by Klein E.R., Academic Press,N.Y., 1979,3-10.
105. Demain A., Martin D. Secondary metabolism in fungies. Microbiol.,1992,44, 230-51.
106. Demain A. Fungal secondary metabolism: regulation and functions. Published for the British Mycological Sosiety, Cambridge University Press,1996,233-54.
107. DeRosa M., Gambacorta A. The lipids of Archaebacteria. Prog.Lipid Res.,1988, 27(1),153-75.
108. D'Souza C., Nakano M.M., Zuber P. Identification of comS, a gene of the srfA operon that regulates the establishment of genetic competence in Bacillus subtilis. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1995,92(2),646.
109. Descomps B., Sebedio J.L., Perkins E.G. Utilization of stable isotopes to study lipid metabolism in humans. New trends in lipid and lipoprotein analyses. 1995, Ed. Sebedio J.L. AOCS Press, Champaign, USA,299-308.
110. Dhara K.P., Yamamoto E., Bokelman G.H., Wooten J.B. Incorporation of 2-13C.-ferulic acid, a lignin precursor in L. leucocephala. J.C.S.Chem.Commun., 1988,1626-28.
111. Di BuonoM., Hannah J., Katzel L., Jones P. Weight loss due to energy restriction suppresses chole-sterol biosynthesis in overweight, mildly hypercholesterolemic men. J.Nutrition, 1999,129(8), 1545-48.
112. Downs J., Harrison D.E.F. Studies on the production of pink pigment in Pseudomonas extorquens NCIB 9399 growing in continuous culture. J.Appl.Bacteriol.,1974,37,65-74.
113. Du J., Knowles B.H., Li J., Ellar D.J. Biochemical characterization of Bacillus thuringiensis cytolytic toxins in association with a phospholipid bilayer. Biochem.J., 1999,338(1),185-93.
114. Eaton R.P., Allen R.C.,Schade D.S. beta-lipoprothein secretion in man: investigation by analysis of 75Se-amino acid incorporation into apoprothein. In: Lipoprothein kinetics and modeling. Acad.Press, N.Y., 1982,77-97.
115. Egorova-Zachernuk T.A., Shvetz V.I., Verslius K., Heerma W., Lugtenburg J., Raap J. Preparation of site-specific isotopically-labelled Zervamicin, the peptaibols, produced by E.salmosynnemata. J.Pept.Sci.,1996,12(6),956-68.
116. Ehrenberg B., Lewis A., Crespi H.L. Resonance Raman spectroscopy of chemically modified and isotopically labelled purple membranes. II. Kinetic studies. Biochim.Biophys. Acta,1980, 593(2),454-62.
117. Ellis K.J., Wong W.W. Human hydrometry: comparison of multifrequency bioelectrical impedance with 2H20 and bromine dilution. J.Appl. Physiol., 1998,85(3),1056-62.
118. Enei, H., Matsui, H., Nakazawa, H., Okumura, S., Yamada, H. Culture conditions for the preparation of cells containing high tyrosine phenol lyase activity. Agric.Biol.Chem., 1973,37(3), 493-98.
119. Eremin V.A., Chekulaeva L.N., Kharat'ian E.F., Ostrovskii D.N. Growth of Micrococcus lysodeikticus bacteria on deuterated medium. Mikrobiologija, 1978,47(4),629-36.
120. Esposito G., Fogolari F., Damante G., Formisano S., Tell G., Leonardi A., Dilauro R., Viglino P. Hydrogen-deuterium exchange studies of the rat thyroid transcription factor 1 homeodomain. J.of Biomolecular NMR, 1997,9(4),397-407.
121. Fahmy K. Binding of transducin and transducin-derived peptides to rhodopsin studiesby attenuated total reflection-Fourier transform infrared difference spectroscopy. Biophys.J., 1998,75(3), 1306-18.
122. Faleev N.G., Ruvinov S.B., Saporovskaya M.B., Belikov V.M., Zakomyrdina L.N. Preparation of a-deuterated amino acids by E. coli cells containing tryptophanase. Izv.Akad.Nauk USSR, Khim., 1989,10,2341-43.
123. Finley J.W., Vanderpool R.A., Korynta E. Use of stable isotopic selenium as a tracer to follow incorporation of selenium into selenoproteins. Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,1995, 210(3),270-77.
124. Finn R.K., Tannahill A.L., Laptewicz J.E. Production of heteropolysaccharide by fermentation of methanol. 1977, US Patent №4,016,085.
125. Flaumenhaft E., Bose S., Crespi H.L., Katz J.J. Deuterium isotope effects in cytology. Int.Rev.Cytol., 1965,18,313-61.
126. Foster R.T., Lewanczuk R., Caille G. Enhancement of the efficacy of nifedipine by deuteration. 1998,US Patent №5,846,514.
127. Franzin C.M., Macdonald P.M. Detection and quantification of asymmetric lipid vesicle fusion using deuterium NMR. Biochemistry, 1997,36(9),2360-70.
128. Fuma S., Fujishima Y., Corbell N., D'Souza C., Nakano M.M., Zuber P., Yamane K. Nucleotide sequence of 5' portion of srfA that contains the region required for competence establishment in Bacillus subtilus. Nucleic Acids Res.,1993,21(1),93-97.
129. Geiser F., Coburn D.K. Field metabolic rates and water uptake in the blossom-bat Syconycteris australis (Megachiroptera). J.Comp.Physiol.B.,1999,169(2),133-38.
130. Gochnaker M.B., Kushner D.J. Growth and nutrition of extremly halophilic bacteria. Can. J.Microbiol., 1969,15(10), 1157-65.
131. Goshe M.B., Anderson V.E. Hydroxyl radical-induced hydrogen/deuterium exchange in amino acid carbon-hydrogen bonds. Radiat.Res.,1999,151(1),50-58.
132. Gottrand F. Measurement of energy expenditure of children in habitual living conditions. Arch.Pediatr.,1998,5(9), 1020-22.
133. Gould S.J., Zhang Q. Cytosinine: pyridoxal phosphate tautomerase, a new enzyme in the blasticidin S biosynthetic pathway. J.Antibiot., 1995,48(7),652-56.
134. Graslund A., Ehrenberg A., Rupprecht A., Strom G., Crespi H. Ionic base radicals in gamma-irradiated oriented non-deuterated and fully deuterated DNA. Int.J.Radiat.Biol.Relat. Stud.Phys.Chem.Med., 1975,28(4),313-23.
135. Gregory R.B, Rosenberg A. Protein conformation dinamics measured by hydrogen isotope exchange techniques. Methods in Enzymol., 1986,131 (2),448-508.
136. Gretebeck R.J., Shoeller D.A., Socki R.A., Davis-Street J, Gibson E.K., Shultz L.O., Lane H.W. Adaptation of the doubly labelled water method for subject consuming isotopically enriched water. J.Appl.Physiol., 1997,82(2),563-70.
137. Griffiths D., Feeney J., Roberts G., Burgen A.S.V. Preparation of selectively deuterated aromatic amino acids for use in 'H NMR studies of proteins. Biochim.Biophys.Acta, 1976,446,479-85.
138. Groleau D., Bourque D., Pomerieau Y. Methylobacterium extorquens microorganism useful for the preparation of poly-p-hydroxybutyric acid polymers. US Patent, 1994, №5,302,525
139. Gschwind R.M., Kessler H., Gemmecker G. A new multi-quantum version of the
140. HBHA(CBCACO)NH experiment with enhanced sensitivity for partially deuterated samples. J.Magn.Reson., 1999,137(1),285-88.
141. Gulcicek E.E., Harrison D.H., Shen S. Determination of the relative percentage deuteration of the ribosomal protein S4 by electrospray ionization mass spectrometry. Arch.Biochem. Biophys., 1994,308(1),24-30.
142. Hadener A., Tamm C. J.Labeled Comp. and Radiopharm.,1987,24(7),1291-306.
143. Halliday D, Bodamer OA Measurement of glucose turnover—implications for the study of inborn errors of metabolism. Eur J Pediatr 1997 Aug; 156 Suppl 1 :S35-38
144. Hamaya T., Horikoshi K. 1989, Patent JP 01179689.
145. Han X., Li G., Li G., Lin K. FTIR study of the thermal denaturation of alpha-actinin in its lipid-free and dioleoylphosphatidylglycerol-bound states and the central and N-terminal domains of a-actinin in D20. Biochemistry, 1998,37(30), 10730-37.
146. Haon S., Auge S., Tropis M., Milon A. Low cost production of perdeuterated biomass using methylotrophic yeasts. J.Labelled Comp.Radiopharmaceuticals, 1993,22,1053-63.
147. Heumann H., Lederer H., Baer G., M R.P., Kjems J.K., Crespi H.L. Spatial arrangement of DNA-dependent RNA polymerase of Escherichia coli and DNA in the specific complex. A neutron small angle scattering study. J.Mol.Biol.,1988,201(1), 115-25.
148. Hilkert A.W., Douthitt C.B., Schluter H.J., Brand W.A. Isotope ratio monitoring gas chromatography/Mass spectrometry of D/H by high temperature conversion isotope ratio mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom.,1999,13(13),1226-30.
149. Hilger A., Sattler J., Littkowsky I. Studies on the a growth-associated accumulation of poly-p-hydroxybutyric acid with Methylobacterium rhodesiamun Z.Zentralbl. Mikrobiol.,1991, 146(1),83-88.
150. Homer RJ, Kim MS, LeMaster DM The use of cystathionine gamma-synthase in the production of alpha and chiral beta deuterated amino acids. Anal.Biochem.,1993,215(2),211-15.
151. Hoppe W., May R., Stockel P., Lorenz S., Erdmann V.A., Wittmann H.G., Crespi H.L., Katz J.J., Ibel K. Neutron scattering measurements with the label triangulation method on the 50S subunit of E.coli ribosomes. Brookhaven Symp.Biol.,1976,27(IV), 38-48.
152. Hill R.B., Flanagan J.M., Prestegard J.H. 'H and 15N magnetic resonance assignments, secondary structure, and tertiary fold of Escherichia coli DnaJ(l-78). Biochemistry, 1995, 34(16),5587-96.
153. Homma Y., Murase Y. 1990, Radioactivity in deuterated compounds. J.Radioanalytical Nuclear Chem. 146(1),205-10.
154. Horner M.A., Powell R.A. Internal structure of home ranges of black bears and analyses of home range overlap. J.Mammal., 1990,71(2),402-10.
155. Hruby V.J. Synthesis and use of specific isotopically labelled peptide hormons for studying of conformation dynamics and hormon-protein interactions.Synth, and Appl.Isot. Label.Comp., 1985,4(2),287-92.
156. Ikeda Y., Naganawa H., Kondo S., Takeuchi T. Biosynthesis of bellenamine by Streptomyces nashvillensis using stable isotope labeled compounds. J.Antibiot.(Tokyo), 1992,45(12),1919-24.
157. Inoue K., Yamada H., Imoto T., Akasaka K. High pressure NMR study of a small protein, gurmarin. J.Biomol.NMR, 1998,12(4),535-41.
158. Ishii K., Shiio I. Regulation of purine nucleotide biosynthesis in Bacillus subtilis. Agr.Biol.Chem., 1973,37(2),287-300.
159. Jen W.C., Jones G.A., Brewer D., Parkinson V.O., Taylor A. The antibacterial activity of alamethicins and zervamicins. J.Appl.BacterioL, 1987,63(4),293-98.
160. Jennings G., Bluck L., Wright A., Elia M. The use of infrared spectrophotometry for measuring body water spaces. Clin.Chem., 1999,45(7), 1077-81.
161. Jensen R.A., Calhoun D.H. Intracellular roles of microbial aminotransferases: Overlap enzymes across diffrent biochemical pathways. Crit.Rev.Microbiol., 1981,8,229-38.
162. Jochi P., Dennis P.P. Characterization of paralogous and orthologous members of the superoxide dismutase gene family from genera of halophilic Archaebacteria. J.Bacteriol., 1993,175(6), 1561-71.
163. Jochi P., Dennis P.P. Structure, function, and evolution of the family of superoxide dismutase proteins from halophilic Archaebacteria. J.Bacteriol.,1993,175(6),1572-79.
164. Jones J.G., Bellion E. Methanol oxidation and assimilation in Hansenula polymorpha.
165. An analysis by l3CNMR in vivo. Biochem.J., 1991,280(2),475-81.
166. Jones P.J.H. Regulation of cholesterol biosynthesis by diet in humans source American J.of Clinical Nutrition, 1997,66(2),438-46.
167. Jones P.J.H., Ausman L.M., Croll D.H., Feng J.Y., Schaefer E.A., Lichtenstein A.H. Validation of deuterium incorporation against sterol balance for measurement of human cholesterol biosynthesis. J.Lipid Res., 1998,39(5), 1111-17.
168. Jordan P.M., Akhtar M. Biochem. J.,1970,116(2),277-86.
169. Kahana Z. E., Lapidot A. Biosynthesis of L-15N. aspartic acid and L-[15N]-alanine by immobilized bacteria, Analyt. Biochem.,1982,126,389-93.
170. Kahana Z.E., Lapidot A. Microbial production of L-15N.-glutamic acid and its gas chromatography-mass spectrometry analysis. Analyt.Biochem.,1983,132(1),160-64.
171. Kakinuma K., Yamagishi M., Fujimoto Y., Ikekawa N., Oshima N. Biosyntheyic mechanism of i«-2,3-Di-0-phitanylglycerol, core membrane lipid of the archaebacterium Halobacterium halobium. J.Am.Chem.Soc., 1990,112(10),2740-45.
172. Kahana Z.E., Lapidot A. Adaptation of biotechnological processes for preparation of compounds labeled with stable isotopes. In: Synthesis and Applications of Isot. Label. Compounds. Ed. Muccino, R. R., Elsevier, 1986,511-12
173. Kanaizumi T., Nakano H., Shiratori T. Out line of measurement of gastric emptying using by radioisotope and its problems awaiting solution. J.Smooth Muscle Res., 1994, 30(1),1-8.
174. Karle I.L., Flippen-Anderson J.L., Agarwalla S., Balaram P. Crystal structure of Leu-1.-Zervamicin, a membrane ion-channel peptide: implication for gating mechanisms. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1991,88,5307-11.
175. Karle I.L., Flippen-Anderson J.L., Agarwalla S., Balaram P. Conformation of the flexible bent helix of Leu-1.-Zervamicin in crystal C and a possible gating action for ion passage. Biopolymers,1994,34(4),721-35.
176. Karnaukhova E.N., Skladnev D.A., Reshetova O.S. MS and NMR analysis of stableisotope labeled amino acids generated by methylotroph microorganisms. J.Pharm.Belg., 1992,47(3), 216-17.
177. Karnaukhova E.N., Reshetova O.S., Semenov S.Y., Skladnev D.A., Tsygankov
178. Yu.D. H- and 1JC-labeled amino acids generated by obligate methylotrophs. Biosynthesis and MS monitoring. Amino Acids, 1994, 6(1), 165-76.
179. Katz J.J. The biology of heavy water. Scientific American, 1960(7), 106-15.
180. Katz J.J. Chemical and biological studies with deuterium. 39th Annual Priestly Lecture, 1965, Pennsylvania State University, 1-110.
181. Katznelson H., Lochhead A.G. Growth factors requirement of halophilic bacteria. Can. J.Research, 1952,64(1 ),97-103.
182. Khaled M.A., Lukaski H.C., Watkins C.L. Determination of total body water by deuterium NMR. Amer.J.of Clinic.Nutr., 1987,45(1), 1-6.
183. Kigawa T., Muto Y., Yokoyama S. Cell-free synthesis and amino acid-selective stable isotope labeling of proteins for NMR analysis. J.Biomol.NMR,1995,6(2),129-34.
184. Kigawa T., Yabuki T., Yoshida Y., Tsutsui M., Ito Y., Shibata T., Yokoyama S. Cell-free produc-tion and stable-isotope labeling of milligram quantities of proteins. FEBS Lett.,1999,442(1),15-19.
185. Kliender R. Studies on the incorporation of (2S, 3R)-4,4,4-2H3.-valine and (2S, 3S)-[4,4,4-2H3]-valine into (3-lactam antibiotics. J.Am.Chem.Soc., 1974,96(12),4054-56.
186. Kleinkauf H., Dohren H. Nonribosomal biosyntesis of peptide antibiotics. Eur.J. Biochem., 1990,192(1),1-15.
187. Koenigs L.L., Trager W.F. Mechanism-based inactivation of P450 2A6 by furanocou-marins. Biochemistry,1998,37(28),10047-61.
188. Kok N., Roberfroid M., Robert A., Delzenne N. Involvement of lipogenesis in the lower VLDL secretion induced by oligofructose in rats. Br.J.Nutr.,1996,76(6),881-90.
189. Konrad S.D., Cook S.L., Goh Y.K., French M.A., Clandinin M.T. Use of deuterium oxide to measure de novo fatty acid synthesis in normal subjects consuming different dietary fatty acid compositionl. Biochim.Biophys.Acta,1998,1393(1),143-52.
190. Koo C.W., Blanchard J.S. Chemical mechanism of Haemophilus influenzae diaminopimelate epimerase. Biochemistry,1999,38(14),4416-22.
191. Kostova I.P., Changov L.S., Keuleyan E.E.,Gergova R.T.,Manolov I.I. Synthesis, analysis and in vitro antibacterial activity of new metal complexes of sulbactam. Farmaco,1998,53(12),737-40.
192. Kotyk A., Lapathitis G. Extracellular acidification by Saccharomyces cerevisiae in normal and in heavy water. Folia Microbiol, 1998,43(6),623-25.
193. Krishna K., Sukumar M.I., Balaram P. Sructural chemistry and membrane modifying activities of the fungal polypeptides Zervamicins, Antiamoebins and Efrapeptins. Pure and Appl.Chem.,1990,62(7),1417-20.
194. Krishna K., Sansom M., Sukumar M.I., Balaram P. Structural chemistry and membrane modi-fying activity of the fungal polypeptides Zervamicin. Pure and Appl. Chem., 1990,62(8), 1417-20.
195. Krinsky N.I. Carotenoid protection against oxidation. Pure Appl.Chem., 1979,51(4), 649-60.
196. Kumagai H., Kashima N., Torii H., Yamada H., Enei H., Okumura S.
197. Agric.Biol.Chem., 1972,36(2),472-75.
198. Kumar N.S., Venkateswerlu G. Endogenous protease-activated 66-kDa toxin from Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki active against Spodoptera littoralis. FEMS Microbiol.Lett., 1998,159( 1), 113-20.
199. Kushaza S.C., Kates M. Effect of glucerol on carotenogenesis in the halophile Halobacterium cutirubrum. Can.J.Microbiol., 1979,25(11),1288-91.
200. Kushner D.J., Baker A., Dunstal T.G. Biotechnological potential of heavy water and deuterated compounds, 1996,US Pat.
201. Kyle D.J., Gladue R., Vail P. Biodeuteration: a novel method for the production of deuterated lubricants. J.Soc.Tribologists and Lubrication Engineers, 1988,45(2),355-59.
202. Lambert C.P., Ball D., Leiper J.B., Maughan R.J. The use of a deuterium tracer technique to follow the fate of fluids ingested by human subjects: effects of drink volume and tracer concentration and content. Exp.Physiol.,1999,84(2),391-99.
203. Lane H.W., Gretebeck R.J., Smith S.M. Nutrition, endocrinology, body composition during space flight. Nutrition Research, 1998,18(11), 1923-34.
204. Lany J.K. Light energy conversion in Halobacterium halobium. Microb.Rev.,1978,42(4), 682-706.
205. Le Coutre J., Gerwert K. Kinetic isotope effects reveal an ice-like and a liquid-phase-type intramolecular proton transfer in bacteriorhodopsin. FEBS Lett., 1996,398(2-3), 333-36.
206. Leb run L., Junter G.A., Jouenne T., Mignot L. Exopolysaccharide production by free and immobilized microbial cultures. Enz. and Microb.Technology, 1994,16(12),1048-54.
207. Lederer H., Mortensen K., May R.P., Baer G., Crespi H.L., Dersch D., Heu mann
208. H. Spatial arrangement of sigma-factor and core enzyme of Escherichia coli RNA . polymerase. A neutron solution scattering study. J.Mol.Biol.,1991,219(4),747-55.
209. Lederer H., May R.P., Kjems J.K., Schaefer W., Crespi H.L., Heumann H. Deuterium incorporation into Escherichia coli proteins. A neutron-scattering study of DNA-dependent RNA polymerase. Eur.J.Biochem.,1986,156(3),655-59.
210. Lee K.M., Ramalingam K., Son J.K., Woodard R.W. J.Org.Chem., 1989,54(13), 3195-98.
211. Lee A.L., Urbauer J.L., Wand A.J. Improved labeling strategy for 13C relaxation measurements of methyl groups in proteins. J.Biomol.NMR, 1997,9(4),437-40.
212. Lee R.E., Armour J., Takayama K., Brennan P.J., Besra G.S. Mycolic acid biosynthesis: definition and targeting of the Claisen condensation step. Biochim.Biophys. Acta,1997,1346(3),275-84.
213. Lee W.N., Lim S., Bassilian S., Bergner E.A. Calibration of isotope ratio mass spectrometry working standard for 2H/1H ratio analysis. J.Mass Spectrom., 1998,33(7), 627-30.
214. LeMaster D. M. Deuterium labeling in NMR structural analysis of larger proteins. Quartely Rev.Biophys.,1990(a),23(2),133-74.
215. LeMaster D.M. Uniform and selective deuteration in twodimensional NMR of proteins. Annu.Rev.Biophys.Biophys.Chem., 1990(6), 19(2),243-66.
216. Lichtenstein A.H., Cohn J.S., Hachey D.L., Millar J.S., Ordovas J.M., Schaefer E.J. Comparison of deuterated leucine, valine, and lysine in the measurement of human apolipoprotein A-I and B-100 kinetics. J.Lipid Res.,1990,31(9),1693-701.
217. Litvinenko L.A., Kravchuk L.A., Petrikevich S.B., Sakharovskii V.G., Ivanitskaia I.G., Guliamova D.E. Effect of heavy water on the growth, glucose assimilation and stability of Escherichia coli to freezing-thawing. Mikrobiologija,1992,61(6),1030-37.
218. Liepins A. 1993, Patent US 5223269.
219. Liu Chi-Li, Marrone P.G., Payne J.M., Gurtler H., Petersen A.S. Bacillus thuringiensis mutants which produce high yields of crystal delta-endotoxin,1999,US Patent №5,874,289.
220. Liu X.Q., Sano Y. Effect of Na+ and K+ ions on the initial crystallization process of lysozyme in the presence of D20 and H20. J.Protein Chem., 1998,17(5),479-84.
221. Lubben M., Prutsch A., Mamat B., Gerwert K. Electron transfer induces side-chain confor-mational changes of glutamate-286 from cytochrome bo3. Biochemistry, 1999,38(7),2048-56.
222. MacDonald R.E., Green R.V., Lany J.K. Light-activated amino acid transport systems in Halobacterium halobium envelope vesicles: role of chemical and electrical gradients. Biochemistry, 1977,16(14),3227-35.
223. Malm D., Tollersrud O.K., Vonen B., Florholmen J. The effect of fructose metabolism on the accumulation of inositol phosphates in rat pancreatic islets. Scand.J.Clin.Lab. Invest., 1996,56(2), 129-34.
224. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spr.Harb.,N.Y.,1982.
225. Mann L.R., Moses V. Properties of Escherichia coli grown in deuterated media. Folia Microbiol., 1971,16(4),267-84.
226. Marcus M.A., Lewis A., Crespi H. L. Physiological and structural investigations of bacteriorhodopsin analogs. Biochem.Biophys.Res.Commun.,1977,78(2),669-75.
227. Matthews D.E., Motil K.J., Rohrbaugh D.K., Burke J.F., Young V.R., Bier D.M. Measurement of leucine metabolism in man from a primed, continuous infusion of L-l-13C.-leucine. Am.J.Physiol.,1980,238(5)E473-79.
228. Matthie J., Zarowitz B., De Lorenzo A., Andreoli A., Katzarski K., Pan G., Withers P. Analytic assessment of the various bioimpedance methods used to estimate body water. J.Appl.Physiol., 1998,84(5), 1801-16.
229. Marahiel M.A., Nakano M.M., Zuber P. Regulation of peptide antibiotic production in Bacillus. Mol.Microbiol.,1993,7(5),631-36.
230. Mathis P., Shenck C.C. The functions carotenoid in photosynthesis. In: Carotenoid Chemistry and Biochemistry. Ed. by G.Britton, T.Goodwin, Perg.Press, Oxford, 1982,3 39-47.
231. Matveev A.V., Mosin O.V., Skladnev D.A., Yurkevich A.M., Shvets V.I.
232. Methylotrophic adaptation to highly deuterated substrates. 8th Intern. Symp. on Microbial Growth on Cj-Compounds, 1995, San Diego, USA, p.79.
233. Maugeais C., Ouguerram K., Krempf M., Magot T. Kinetic study of apo B100 containing lipoprotein metabolism using amino acids labeled with stable isotopes: methodological aspects. Clin.Chem.Lab.Med.,1998,36(10),739-45.
234. May B., Dennis P.P. Unusual evolution of a superoxide dismutase-like gene from the extreme halophilic archeabacterium Halobacterium cutirubrum. J.Bacteriol., 1990,172(11), 3725-29.
235. Merck and Co., Inc. 1977, US Patent 4,028,405.
236. Michalczuk L., Ribnicky D.M., Cooke T.J., Cohen J.D. Regulation of indole-3-acetic acid biosynthetic pathways in carrot cell cultures. Plant Physiology, 1992,100(3), 1346-53.
237. Middendorf H.D., Randall J.T., Crespi H.L. Neutron spectroscopy of hydrogenous and biosynthetically deuterated proteins. Basic Life Sci.,1984,27,381-400.
238. Miller A.T., van Alstyne H.M. 1994, Heavy water: a distinctive and essential component of CANDU. Atomic Energy of Canada Ltd. report №10962,11.
239. Misra S., Govindjee R., Ebrey T.G., Chen N., Ma J.X., Crouch R.K. Proton uptake and release are rate-limiting steps in the photocycle of the bacteriorhodopsin mutant E204Q. Biochemistry, 1997,36(16),4875-83.
240. Miyakoshi S., Haruyama H., Shioiri T., Takahashi S., Torikata A., Yamazaki M. Biosynthesis of griseolic acids: incorporation of 13C-labeled compounds into griseolic acid A. J.Antibiot.(Tokyo),1992,45(3),394-99.
241. Mochan N., Mahadevan A. Response of plants and microorganisms to heavy water. Ind.Rev.of Life Sci., 1993,13( 1 ),3-18.
242. Moore A.C. Ph.D.Dissertation, University of California USA, Berkeley, 1976.
243. Moore P.B., Engelman D.M. The production of deuterated E.coli. Brookhaven Symp.Biol., 1976,27,12-23.
244. Moses V., Hansen O.H., Calvin M. Response of Chlorella to a deuteriumenvironment. Biochim.Biophys.Acia, 1958,28(1),62-70.
245. Mosin O.V., Karnaukhova E.N., Pshenichnikova A.B., Skladnev D.A., Reshetova
246. O.S. Electron impact spectrometry in bioanalysis of stable isotope labeled bacterio-rhodopsin. VI Intern. Conf. on Retinal Proteins, 1994, Leiden, The Netherlands, p.l 15.
247. Mosin O.V., Karnaukhova E.N., Skladnev D.A., Shvets V.I. Preparation of D- and 13C-amino acids via bioconvertion of Ci-substrates. 8th International Symp. on Microbial Growth on CrCompounds, 1995, San Diego, USA, p.80.
248. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.I. Biosynthesis of 2H-labeled phenylalanine by a new mutant of RuMP facultative mrthylotroph Brevibacterium methylicum. Biosciense, biotechnology and bioengineering. 1998, 62(2), 225-229.
249. Mudambo K.S., Scrimgeour C.M., Rennie M.J. Adequacy of food rations in soldiers during exercise in hot, day-time conditions assessed by doubly labelled water and energy balance methods. Eur.J.Appl.Physiol., 1997,76(4),46-51.
250. Mukohata Y., Ihara K., Uegaki K., Miyashita Y., Sugiyama Y. Australian Halobacteria and their retinal-proteinion pumps. Photochem.Photobiol., 1991,54(6), 1039-45.
251. Murphy R.C., Anderson F.S., Clay K.L. In vitro and in vivo studies of amino acids labeled with i80 at the carboxyl moiety. In: Stable Isotopes, Proc.of the 3d Intern. Conference, Ed. by Klein E. R., Academic Press, N.Y.,1979,139-146.
252. Nagasawa T., Utagawa T., Goto J., Kim C., Tani Y., Kumagai H., Yamada H. Eur.J. Biochem., 1981,117(1),33-40.
253. Narbad A., Hewlins M.J., Callely A.G. 13C-NMR studies of acetate and methanol metabolism by methylotrophic Pseudomonas. J.Gen.Microbiol.,1989,135(6),1469-77.
254. Neelis H.J., De Leenheer A.P. Microbial production of carotenoids other than p-carotene. In Biotechnology of Vitamins, Pigments and Growth Factors. Ed. by E.J.Vandamme, Elsevier Appl.Sci.,1989,43-80.
255. Nelson J.E., Ruo T.I. Assay of stable isotope labeled urea in biological fluids by selected ion monitoring. Clinica Chemica Acta,1988,175(1),59-65.
256. Nesvera J., Patek M., Hochmanova J., Chibisova E.S., Serebrijski I.G., Tsygankov Yu.D., Nertusov A.I. Transformation of a new Gram-positive methylotroph, Brevibacterium methylicum, by plasmid DNA. Appl.Microbiol.Biotechnol.,1991,35(3), 777-80.
257. Nona D.A., Blake M.I., Crespi H.L. Effects of deuterium oxide on the culturing of Penicillum janczewskii. J.Pharm.Sci., 1968,57(6),975-79.
258. Obata H., Muryoi N., Kawahara H., Yamade K., Nishikawa J. Identification of a novel ice-nucleating bacterium of Antarctic origin and its ice nucleation properties. Cryobiology, 1999,38(2),131-39.
259. Ogrel A., Bloemhoff W., Lugtenburg J., Raap J. Total synthesis of zervamicin IIB and its deuterium-labelled analogues. J.Pept.Sci., 1997a,3(3), 193-208.
260. Ogrel A., Bloemhoff W., Lugtenburg J., Raap J. Synthesis of zervamicin IIB and isotopically-labelled C-terminal fragment of zervamicin IIB: an approach to the synthesis of Aib-containing peptide. Liebigs Annalen-Recneil, 1997b, 1,41 -47.
261. Okar D.A., Felicia N.D., Gui L., Lange A.J. Labeling of recombinant protein for NMR spectroscopy: global and specific labeling of the rat liver fructose 2,6-bisphosphatase domain. Protein Expr.Purif.,1997,11(1),79-85.
262. Omori H., Nio Y., Takeda H., Tamura K. Application for therapeutic use of deuterium oxide (D20) against human pancreatic cancer. Gan.To.Kagaku Ryoho,1996,23(12),1665-68.
263. Omura S. Trends in the search for bioactive microbial metabolites. J.of Industrial Microbiology, 1992,10(1), 13 5-56.
264. Onishi H., McCance M.E., Gibbons N.E. A synthetic medium for extremly halophilic bacteria. Can.J.Microbiol,1965,11(4),365-73.
265. Orechov V.Yu., Abdulaeva G.V., Musina L.Yu., Arseniev A.S. 'H-^N-NMR studies of bacteriorhodopsin Halobacterium halobium. Eur.J.Biochem.,1992,210(1),223-29.
266. Oren A. Enzyme diversity in halophilic archaea. Microbiología,1994,10(3),217-28.
267. Ostafin M., Haber J., Doronina N.V., Sokolov A.P., Trotsenko Yu.A. Methylobacterium extorquens strain PI4, a new methylotrophic bacteria producing poly-p-hydroxybutyrate (PHB). Acta Microbiol.Pol.,1999,48(1),39-51.
268. O Sullivan J., Ball C. Biochemistry and genetic regulation of commercially important antibiotics. 1985,Addison-Wesley Publ.,Massachusets,l-15.
269. Otte S, Schalk J, Kuenen JG, Jetten MS Hydroxylamine oxidation and subsequent nitrous oxide production by the heterotrophic ammonia oxidizer Alcaligenes faecalis. Appl.Microbiol.Biotechnol., 1999,51(2),255-61.
270. Packard C.J. The role of stable isotopes in the investigation of plasma lipoproteinmetabolism. Baillieres Clin.Endocrinol.Metab., 1995,9(4),755-72.
271. Parhofer K.G., Hugh P., Barrett R., Bier D.M., Schonfeld G. Determination of kinetic parameters of apolipoprotein B metabolism using amino acids labeled with stable isotopes. J.Lipid Res., 1991,32(8), 1311-23.
272. Partridge J., Dennison P.R., Moore B.D., Hailing P.J. Activity and mobility of subtilisin in low water organic media: hydration is more important than solvent dielectric. Biochim.Biophys.Acta, 1998,1386(1),79-89.
273. Petersen K.F., Krssak M., Navarro V., Chandramouli V., Hundal R., Schumann W.C., Landau B.R., Shulman G.I. Contributions of net hepatic glycogenolysis and gluconeogenesis to glucose production in cirrhosis. Am.J.Physiol., 1999,276(3),529-35.
274. Pfeifer F., Betlach M. Genome organization in Halobacterium halobium: a 70kb island of more (AT) rich DNA in the chromosome. Mol.Gen.Genet.,1985,198(3),449-55.
275. Phillips J.E., Wong L.B., Yeates D.B. Bidirectional transepithelial water transport: measurement and governing mechanisms. Biophys.J., 1999,76(2)869-77.
276. Pipkin P.A., Minor P.D. Studies on the loss of infectivity of live type 3 poliovaccine on storage. Biologicals, 1998,26(1), 17-23.
277. Pluta P.L., Crespi H.L., Klein M., Blake M.I., Studier M.H., Katz J.J. Biosynthesis of deuterated riboflavin: structure determination by NMR and mass spectrometry. J.Pharm. Sci., 1976,65(3),362-66.
278. Pollegioni L., Blodig W., Ghisla S. On the mechanism of D-amino acid oxidase -structure/linear free energy correlations and deuterium kinetic isotope effects using substituted phenylglycines. J.ofBiol.Chem., 1997,272(8),4924-34.
279. Polo L., Presti F., Schindl A., Schindl L., Jori G., Bertoloni G. Role of ground and excited singlet state oxygen in the red light-induced stimulation of Escherichia coli cell growth. Biochem. Biophys.Res.Commun.,1999,257(3),753-58.
280. Pomper B.K., Vorholt J.A., Chistoserdova L., Lidstrom M.E., Thauer R.K. A methenyl tetrahydromethanopterin cyclohydrolase and a methenyl tetrahydrofolate cyclo-hydrolase in Methylobacterium extorquens AMI. Eur.J.Biochem., 1999,261(2), 475-80.
281. Rae H.K. Canada's heavy water story. 1991, In: Shemilt L.W. ed., Chemical Engineering in Canada: a Historical Perspective. Canadian Society of Chemical Engineering, 334-365.
282. Raghavan C.V., Super D.M., Chatburn R.L., Savin S.M., Fanaroff A.A., Kalhan
283. S.C. Estimation of total body water in very-low-birth-weight infants by using1 Ranthropometry with and without bioelectrical impedance and H2 O. Am.J.Clin.Nutr.,1998,68(3),668-74.
284. Rambal C., Pachiaudi C., Normand S., Riou J.P., Louisot P., Martin A. Effects of specific dietary sugars on the incorporation of 13C label from dietary glucose into neutral sugars of rat intestine and serum glycoproteins. Br.J.Nutr.,1995,73(3),443-54.
285. Rampe D., Foster R.T., Lewanczuk R. Deuterated analogs of verapamil and nifedipine.Eur.J.ofMed.Chem.,1993,28(2),259-63.
286. Ruepp A., Muller H.N., Lottspeich F., Soppa J. Catabolic ornithine transcarbomylase of Halobacterium halobium (salinarium): purification,characterization, sequence determination, and evolution. J.Bacteriol., 1995,177(5), 1129-36.
287. Ryter S.W., Tyrrell R.M. Singlet molecular oxygen ((1)02): a possible effector of eukaryotic gene expression. Free Radic.Biol.Med., 1998,24(9), 1520-34.
288. Sakai Y., Mitsui R., Katayama Y., Yanase H., Kato N. Organization of the genes involved in the ribulose monophosphate pathway in an obligate methylotrophic bacterium, Methylomonas aminofaciens 77a. EMS Microbiol.Lett.,1999,176(1),125-30.
289. Samuel D. Methodology of oxyden isotopes. In: Oxygenases. Ed. by Hayaishi G., Academic Press, N.Y., 1972,31-86.
290. Sansom M.S. Alamethicin and related peptaibols model ion channels. Eur.Biophys.J., 1993,22(2),105-24.
291. Sansom M.S., Kerr I.D., Mellor I.R. Ion channels formed by amphipathic helical peptides. A molecular modelling study. Eur.Biophys.J., 1991,20(4),229-40.
292. Sansom M.S., Balaram P., Karle I.L. Ion channel formation by zervamicin-IIB. A molecular modelling study. Eur.Biophys.J., 1993,21(6),369-83.
293. Sapienza C., Doolittle W.F. Unusual physical organization of the Halobacterium genome. Nature,1982,295,384-89.
294. Sato K., Mizutani T., Hiraoka M., Shimizu S. Carotenoid containing moiety from a facultative methylotroph, Protaminobacter ruber. J.Ferment.Technol, 1982,60,111-15.
295. Saxild H.H., Nygaard P. Genetic and physiological characterization of Bacillus subtilis mutants resistant to purine analogs. J.Bacteriol.,1987,169(7),2977-83.
296. Schoeller D.A. Incorporating tracer-tracee differences into models to improveaccuracy. JPEN J.Parenter.Enteral.Nutr., 1991,15(3),64-67.
297. Schwanke U., Strauss H., Arnold G., Schipke J.D. Analysis of respiratory water a new method for evaluation of myocardial energy metabolism. J.Appl. Physiol.,1996,81(5),2115-22.
298. Seip S., Lanz R., Gutknecht R., Flukiger K., Erni B. The fructose transporter of Bacillus subtilis encoded by the lev operon: backbone assignment and secondary structure of the IIB(Lev) subunit. Eur.J.Biochem.,1997,243(1-2),306-14.
299. Serebrijski I.G., Gomelsky M., Bashkirova E., Chistoserdov A., Tsygankov Yu. Refined genetic map of the obligate methylotroph Methylobacillus flagellatum. Mol.Gen.Genet.,1998,258(1-2),133-38.
300. Serebrijski I.G., VasinV.M., Tsygankov Yu.D. Two new members of the Bio B superfamily: cloning, sequencing and expression of bioB genes of Methylobacillus flagellatum and Corinebacterium glutamicum. Gene,1996,175(1),15-22.
301. Schneider A., Marahiel M.A. Genetic evidence for a role of thioesterase domains, integrated in or associated with peptide synthetases, in non-ribosomal peptide biosynthesis in Bacillus subtilis. Arch.Microbiol., 1998,169(5),404-10.
302. Schnepf E., Crickmore N., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., Feitelson J., Zeigler D.R., Dean D.H. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol.Mol. Biol.Rev., 1998,62(3),775-806.
303. Shi Y., Wang S., Krueger S., Schwarz F.P. Effect of mutations at the monomer-monomer inter-face of cAMP receptor protein on specific DNA binding. J.Biol.Chem.,1999, 274(11),6946-56.
304. Shibata K., Watanabe A. Cell respiration and carbon dioxide assimilation in heavy water. Acta phytochim.1936,9,107-14.
305. Shimba S.,Unno K.,Okada S. Differential cellular isotope effects of deuterium on photosynthetic metabolism of carbon in Chlorella ellipsoidea. Plant Cell Physiol., 1990,31(1),159-61.
306. Shimba S.,Unno K.,Okada S. Characteristics of the photosynthetic metabolism of carbon in deuterated Chlorella ellipsoidea C-27. Plant Cell Physiol., 1993,34(2),255-62.
307. Shimba S.,Unno K.,Okada S. Study on biodistribution of deuterated biomolecules in mice at new diagnostic radio-imaging agents. Chem.Pharm.Bull.,1990,38(9),2610-13.
308. Shimizu S., Sato K., Hiraoka M., Yamashita F., Kobayashi T. Carotenoid formation by a facultative methylotroph Protaminobacter ruber. J.Ferment.Technol., 1982,60(1), 163-66.
309. Simpson N.E., He Z., Evelhoch J.L. Deuterium NMR tissue perfusion measurements using the tracer uptake approach: I. Optimization of methods. Magn.Reson.Med., 1999,42( 1),42-52.
310. Shvets V.I., Yurkevich A.M., Mosin O.V., Skladnev D.A. Preparation of deuterated inosine suitable for biomedical application. Karadeniz Journal of Medical Sciences, 1995,8(4), 231-32.
311. Skladnev D.A., Baev M.V. The bacterial carotenoid production from methanol. Proceeding of the VI Eur. Conf. «Biomass for energy, Industry and environment», Athens, Greece, 1991,1317-21
312. Skladnev D.A., Egorova T.A. Stable isotopes labeled bacteriorhodopsin for computers. VII Тезисы Международной Конференции по ретинальсодержащим белкам, 1996, Зихрон Яков (Израиль), 1997, стр.207.
313. Skladnev D.A. Using of Methylobacillus flagellatum for the production of labelled compounds. Methabolic pathway of isotopic enrichment. Proceeding of the Intern. Symposium «Interbiotech», 1990,Bratislav,ChSSR,39.
314. Skye G.E., Potts R., Floss H.G. Stereochemistry of the tryptophan syntetase reaction. J.Amer.Chem.Soc., 1974,96(5), 1593-98.
315. Smirnoff W.A. A stainingg method for differentiating spores, crystals and cells of Bacillus thuringiensis (Berliner). J.of Insect Pathology, 1962,'4,384-88.
316. Smith D.E., Su J.Y., Jucker F.M. Efficient enzymatic synthesis of 13C, 15N-labeled DNA for NMR studies. J.Biomol.NMR, 1997,10(3),245-53.
317. Southgate G., Goodvin P.M. The regulation of EPS production and of enzymesinvolved in Ci assimilation in Methylophilus methylotrophys. J.Gen.Microbiol., 1989,135,2859-67.
318. Stachelhaus T., Marahiel M.A. Modular structure of genes encoding multifunctional peptide synthetases required for non-ribosomal peptide synthesis. FEMS MicrobioLLett.,1995,125(1),3-14.
319. Stachelhaus T., Schneider A., Marahiel M.A. Rational design of peptide antibiotics by targeted replacement of bacterial and fungal domains. Science, 1995,269(5220), 69-72.
320. St Lawrence K.S., Lee T.Y. An adiabatic approximation to the tissue homogeneity model for water exchange in the brain: II. Experimental validation. J.Cereb.Blood Flow Metab., 1998(a), 18( 12), 13 78-85.
321. St Lawrence K.S., Lee T.Y. An adiabatic approximation to the tissue homogeneity model for water exchange in the brain: I.Theoretical derivation. J.Cereb.Blood Flow Metab.,1998(6),18(12),1365-77.
322. Stockman B.J., Reily M.D., Westler W.M., Ulrich E.L., Markley J.L. Concerted two-dimentional NMR approaches to Hydrogen-1, Carbon-13, and Nitrogen-15 resonance assignments in proteins. Biochemistry, 1989,28(2),230-36.
323. Stoeckenius W., Lozier R.H., Bogomolni R.A. Bacteriorhodopsin and the purple membrane of halobacteria. Biochem.Biophys.Acta,1979,505(2),215-78.
324. Stolinski M., Murphy J.L., Jones A.E., Jackson A.A., Wootton S.A. Stable-isotope method for determining the gastrointestinal handling of l-13C.-palmitic acid. Lipids, 1997,32(3), 337-40.
325. Strain H.H., Thomas M.R., Crespi H.L., Blanke M.I., Katz J.J. Chloroplast pigments and photosynthesis in deuterated green algae. Ann.N.Y.Acad.Sci., 1960,84,617-33.
326. Surmely J.F., Paquot N., Schneiter P., Jequier E., Temler E., Tappy L. Nonoxidative fructose disposal is not inhibited by lipids in humans. Diabetes Metab.,1999,25(3),233-40.
327. Szybalski W., Bryson E. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. J.Bacteriol.,1952,64(2),489-99.
328. Takahashi M., Tsutsui H., Tagawa H., Igarashi-Saito K., Imanaka-Yoshida K., Takeshita A. Microtubules are involved in early hypertrophic responses of myocardium during pressure overload. Am.J.Physiol., 1998,275(2),H341-48.
329. Takeda H., Nio Y., Omori H., Uegaki K., Hirahara N., Sasaki S., Tamura K., Ohtani H. Mechanisms of cytotoxic effects of heavy water (deuterium oxide: D20) on cancer cells. Anticancer Drugs,1998,9(8),715-25.
330. Takeda N., Nakano K., Kato M., Taniguchi Y. Pressure-induced structural rearrangements of bovine pancreatic trypsin inhibitor studied by FTIR spectroscopy. Biospectroscopy, 1998,4(3), 209-16.
331. Tappy L., Paquot N., Tounian P., Schneiter P., Jequier E. Assessment of glucose metabolism in humans with the simultaneous use of indirect calorimetry and tracer techniques. Clin.Physiol., 1995,15( 1), 1 -12.
332. Thomson J.F. Biological effect of deuterium. International Series of Monographs on Pure and Applied Biology, Pergamon Press, N.Y.,1963,19,1-133.
333. Tsygankov Yu.D., Kazakova S.M., Chistoserdov A.Yu. The development of gene transfer systems in Methylobacillus flagellatum KT. J.Biochemistry Abstracts, 1988, 17(11),88-100.
334. Tounian P., Schneiter P., Henry S., Delarue J., Tappy L. Effects of dexamethasone on hepatic glucose production and fructose metabolism in healthy humans. Am.J.Physiol., 1997,273(1), E315-20.
335. Toyama H., Anthony C., Lidstrom M.E. Construction of insertion and deletion mxa mutants of Methylobacterium extorquens AMI by electroporation. FEMS Microbiol. Lett., 1998,166(1), 1-7.
336. Toyama H., Lidstrom M.E. pqqA is not required for biosynthesis of pyrroloquinoline quinone in Methylobacterium extorquens AMI. Microbiology,1998,144(1),183-91.
337. Tropis M., Bardou F., Bersch B., Daffe M., Milon A. Composition and phase behaviour of polar lipids isolated from Spirulina maxima cells grown in a perdeuterated medium. Biochim.Biophys.Acta, 1996,1284(2), 196-202.
338. Uegaki K., Nemoto N., Shimizu M., Wada T., Kyogoku Y., Kobayashi Y. 15Nlabeling method of peptides using a thioredoxin gene fusion expression system: anapplication to ACTH-(l-24). FEBS Lett.,1996,379(1),47-50.
339. Ulrich W.P., Vogel H. Polarization-modulated FTIR spectroscopy of lipid/gramicidin monolayers at the air/water interface. Biophys.J.,1999,76(3),1639-47.
340. Unno K., Shimba S., Okada S. Modification of thermal response of Chlorella ellipoidea by deuteration. Chem.Pharm.Bull., 1989,37,3047-49.
341. Unno K., Okada S. Alterations in the heat response of Chlorella ellipsoidea by deuteration. Plant Cell Physiol.,1991,32,113-120.
342. Unno K., Okada S. Deuteration causes the decreased induction of heat-shock proteins and increased sensitivity to heat denaturation of proteins in Chlorella. Plant Cell Physiol., 1994,35, 197-202.
343. Unno K., Busujima H., Shimba S., Narita K., Okada S. Characteristics of growth and deuterium incorporation in Chlorella ellipsoidea growth in deuterium oxide. Chem.Pharm. Bull.,1988,36(5),1828-33.
344. Unno K., Ando I., Hagima N., Yokogaki S., Koike C., Okada S. Growth delay and intracellular changes in Chlorella ellipsoidea as a result of deuteration. Plant Cell Physiol.,1992,33(7),963-69.
345. Vancauwenberge J.E., Slininger P.J., Bothast R.J. Bacterial conversion of glycerol to beta-hydroxypropionaldehyde. Appl.Env.Microbiol., 1990,56(2),329-32.
346. Vanek Z., Hostalek Z., Spizek Z. Overproduction of microbial products facts and ideas. Biotech.Adv., 1990,8(1 ), 1 -27.
347. Vasdev S., Gupta I.P., Sampson C.A., Longerich L., Parai S. Deuterium oxide normalizes blood pressure and elevated cytosolic calcium in rats with ethanol-induced hypertension. Canadian J.of Cardiology,1993,9,802-08.
348. Vasdev S., Prabhakaran V.M., Whelan M., Ford C.A., Longerich L., Parai S. Fructose-induced hypertension, hyperglyceridemia and elevated cytosolic calcium in rats: prevention by deuterium oxide. Artery, 1994,21,124-27.
349. Vetter W. In: Biochemical Applications of mass-spectrometry. Eds. Walles G.R.,
350. Dormor O.C., 1980, First supplementary volume, Wiley Interscience, N.Y.,439.
351. Vidakovic M., Sligar S.G., Li H., Poulos T.L. Understanding the role of the essential Asp251 in cytochrome p450cam using site-directed mutagenesis, crystallography, and kinetic solvent isotope effect. Biochemistry,1998,37(26),9211-19.
352. Vining L.C. Secondary metabolism. Biotecnology, 1986,4,20-38.
353. Vining L.C., Shapiro S.I., Ahmed Z.U., Vats S., Doull J.J. Regulation of secondary metabolite formation. Com.J.Microbiol., 1985,30(5),798-804.
354. Walker T.E., Matheny C. An efficient cmemomicrobiological synthesis of stable isotope-labeled L-Tyrosine and L-Phenylalanine. J.Org.Chem., 1986,51 (6), 1175-79.
355. Wang J., El-Sayed M.A. Temperature jump-induced secondary structural change of the membrane protein bacteriorhodopsin in the premelting temperature region: a nanosecond time-resolved Fourier transform infrared study. Biophys.J., 1999,76(5),2777-83.
356. Wang Y., Hollingsworth R.I. A solvent system for the high-resolution proton nuclear magnetic resonance spectroscopy of membrane lipids. Anal.Biochem.,1995,225(2), 242-51.
357. Wang Z., Benkovic S.J. Purification, characterization, and kinetic studies of a soluble Bacteroides fragilis metallo-p-lactamase that provides multiple antibiotic resistance. J.Biol.Chem.,1998, 273(35),22402-28.
358. Weiland B., Huttermann J. Free radicals from X-irradiated 'dry' and hydrated lyophilized DNA as studied by electron spin resonance spectroscopy: analysis of spectral components between 77K and room temperature. Int.J.Radiat.Biol.,1998, 74(3),341-58.
359. Wenzel M. Erhohte gehirn-affmitiit von 13IJ-markierten N-(alkyl)-amphetaminen nach deuterierung. J.Labelled Compounds Radiopharmaceuticals, 1989,27,1143-55.
360. Wenzel M. 1974, Patent DE 2253086.
361. Werman M., Levi B. Fructose consumption May accelerate aging skin's elasticity and softness may be affected. Journal of Nutrition, 1998.
362. Wesche J., Elliott J.L., Falnes P.O., Olsnes S., Collier R.J. Characterization of membrane translocation by anthrax protective antigen. Biochemistry,1998,37(45), 15737-46.
363. White R.H. Biosynthesis of the sulfonolipid 2-amino-3-hydroxy-15-methylhexadecane-1-sulfonic acid in the gliding bacterium Cytophaga johnsonae. J.Bacterid.,1984,159(1),42-46.
364. Whiteley H.R., Shnepf H.E. The molecular biology of parasporal crystal body formation in Bacillus thuringiensis. Ann.Rev.Microb., 1986,40,549-76.
365. Whittaker M.M., Ballou D.P., Whittaker J.W. Kinetic isotope effects as probes of the mechanism of galactose oxidase. Biochemistry, 1998,37(23),8426-36.
366. Wong C.H., Whitesides G.M. Enzyme-catalyzed organic synthesis: regeneration of deuterated nicotinamide cofactors for use in large-scale enzymatic synthesis of deuterated substrates. J.Amer.Chem.Soc., 1983,105(15),5012-14.
367. Woese C.R., Kandler O., Wheelis M.L. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucaria. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1990,87,4576-79.
368. Wood M.J., Komives E.A. Production of large quantities of isotopically labeled protein in Pichiapastoris by fermentation. J.Biomol.NMR, 1999,13(2), 149-59.
369. Wright A.D., Sampson M.B., Michalczuk L., Slovin J.P., Cohen J.D. Indole-3-acetic acid biosynthesis in the mutant maize orange pericarp, a tryptophan auxotroph. Science,1991,254(5034),998-1000.
370. Yamamoto T., Palmer G., Crespi H.L. Resonance raman studies of a c type algal cytochrome. Deuterium shifts and a comparison with mammalian cytochrome c. Biochim. Biophys.Acta, 1976, 439(1),232-39.
371. Yang J.L., Wang L.C., Chang C.Y., Liu T.Y. Singlet oxygen is the major species participating in the induction of DNA strand breakage and 8-hydroxydeoxyguanosine adduct by lead acetate. Environ.Mol.Mutagen., 1999,33(3), 194-201.
372. Yang S.W., Cordell G.A. Deuterium labeling and mass fragmentation studies of saturosporine. Journal ofNatural Products,1997,60(3),236-41.
373. Yee A.A., O'Neil J.D.J. Uniform 15N-labelling of a fungal peptide: the structure and dynamics of an Alamethicin by 15N- and 'H-NMR spectroscopy. Biochemistry, 1992, 32(12),3135-43.
374. Yuan T., Ouyang H., Vogel H.J. Surface exposure of the methionine side chains of calmodulin in solution.A nitroxide spin label and two-dimensional NMR study. J.Biol. Chem., 1999,274(13),8411-20.
375. Zavodszky P., Kardos J., Svingor, Petsko G.A. Adjustment of conformational flexibility is a key event in the thermal adaptation of proteins. Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1998,95(13), 7406-11.
376. Zhang D., Mauzerall D. Volume and enthalpy changes in the early steps of bacteriorhodopsin photocycle studied by time-resolved photoacoustics. Biophys.J., 1996,71(1),381-88.
-
Складнев, Дмитрий Анатольевич
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2000
-
ВАК 03.00.23
- Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н/D/ и 13С, с высокими степенями изотопного обогащения
- Особенности метаболизма метилотрофов
- Новая облигатная метилотрофная бактерия Methylophilus sp. В-7741 как продуцент дейтрированной биомассы и экзополисахарида
- Антагонистические взаимоотношения в смешанных культурах метанотрофных бактерий
- Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных в кремнийорганические золь-гель матрицы микроорганизмов
