Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новая облигатная метилотрофная бактерия Methylophilus sp. В-7741 как продуцент дейтрированной биомассы и экзополисахарида

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Новая облигатная метилотрофная бактерия Methylophilus sp. В-7741 как продуцент дейтрированной биомассы и экзополисахарида"

На правах рукописи

/

1- Ч

НевоСуфоАлен Нарсис • - //Л- и

/ .-7/

■

I I

НОВАЯ ОБЛИГАТНАЯ МЕТИЛОТРОФНАЯ БАКТЕРИЯ METHYI.OPHIL.US ЭР. В-7741 КАК ПРОДУЦЕНТ ДЕЙТЕРИРОВАННОЙ БИОМАССЫ И ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА

03 00.23 - Биотехнология

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2003

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и в Государственном научном Центре ГосНИИгенетика.

Научные руководители:

Кандидат химических наук, доцент А.Б. Пшеничникова. Доктор биологических наук Д.А. Складнее.

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор E.H. Звонкова. Доктор биологических наук, профессор А.И. Нетрусов.

Ведущая организация:

РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Защита диссертации состоится 2Л-И ;_2003 г в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр-т Вернадского, дом 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Государственной академии тонкой химической технологии им М.В. Ломоносова по адресу: 119831, Москва, ул. Малая Пироговская, дом 1.

Автореферат разослан * • 2003 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

Кандидат химических наук, старший научный сотрудник А И. Лютик

77/£

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Широкое применение биологически активных соединений (БАС), меченных стабильными изотопами, а частности дейтерием, в структурных и фармакокинетических исследованиях обусловило необходимость поиска новых подходов к их получению. В последние годы особое внимание уделяется разработке методов биосинтетического получения стабильномеченых БАС.

Метилотрофные бактерии являются перспективным источником различных классов стабильномеченых БАС. Перспективность метилотрофов как продуцентов дейтерированной биомассы, аминокислот, жирных кислот, экзополисахаридов и других соединений обусловлена тем, что в качестве единственного источника углерода такие бактерии способны использовать С1-соединения, например, метанол. Это делает процесс культивирования более технологичным и позволяет получить необходимые БАС с высокой степенью включения дейтерия.

Важной проблемой биосинтеза дейтерированных соединений является токсичность дейтерированной воды как одного из основных источников дейтерия. Целый ряд вопросов, которые касаются практического использования различных штаммов-продуцентов БАС для роста и биосинтеза на высокодейтерированных средах, остаются до конца невыясненными из-за сложности их адаптации к оксиду дейтерия. Решение этой проблемы позволит резко увеличить возможности биосинтетического метода получения дейтерированных БАС.

Механизм и закономерности процесса адаптации и роста бактерий, в том числе метилотрофных, в высокодейтерированных средах (средах с высокими концентрациями оксида дейтерия и дейтерометанолом) не вполне понятны, хотя биологические эффекты дейтерия подробно изучались. В связи с этим, изучение биохимических и физиологических особенностей роста и биосинтеза в тяжелой воде у микроорганизмов продолжает быть актуальной задачей как для получения

Список сокращений

БАС - биологически активные соединения; ЭПС - экзополисахарид, ИЭД - изотопный эффект дейтерия; КЖ - культуральная жидкость, МДГ - метанолдегидрогеназа (КФ 1.1.99 8), ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ТСХ - тонкослойная хроматография. БХ - бумажная хроматография. ЯМР - ядерный м; фторуксусная

кислота, АСБ - абсолютно сухая биомасса.

различных дейтерированных соединений, так и в плане изучения биологически важного феномена адаптации к оксиду дейтерия.

Многие метилотрофные бактерии характеризуются способностью секретировать внеклеточные полисахариды (ЭПС). Дейтерированные ЭПС, полученные при культивировании этих микроорганизмов в высокодейтерированной среде, являются источниками дейтерированных углеводов, используемых в настоящее время как в качестве источника углерода для выращивания гетеротрофных микроорганизмов-продуцентов дейтерированных БАС, так и прямо в различных биомедицинских исследованиях. Так, для исследования метаболизма углеводов в организме человека в норме и при различных патологических состояниях часто используют дейтерированную глюкозу. Кроме этого, недавно был предложен новый метод измерения пролиферации Т-лимфоцитов с использованием для мечения ДНК дейтерированной глюкозы (Macallan et al., 1998).

Methylophilus sp. B-7741 - новая облигатная метилотрофная бактерия -выделена нами из смешанной метанолутилизирующей культуры, содержащей также грамположительные бактерии. Она имеет неподвижные клетки палочковидной формы размером 0.3 - 0.4X0.6 - 0.7 мкм и реализует рибулозомонофосфатный путь ассимиляции формальдегида.

Цель работы

Целью настоящей работы было изучение особенностей роста метилотрофных бактерий и биосинтеза ЭПС при замене метанола на дейтерометанол и воды на оксид дейтерия в культуральной среде с использованием в качестве модели новых облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. B-7741.

Научная новизна

Исследовано влияние содержания дейтерия в различных компонентах среды на ростовые характеристики и биосинтез ЭПС у новых метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741. Также исследовано влияние температуры и рН на рост и биосинтез ЭПС как в обычной, так и в дейтерированной среде и показана перспективность использования Methylophilus sp. В-7741 для получения высокодейтерированной биомассы и ЭПС. Показано, что в составе ЭПС, полученного из Methylophilus sp В-7741, присутствуют углеводные остатки глюкозы, галактозы и рамнозы. Обнаружен эффект перекрестной адаптации к дейтерированной среде клеток, предварительно адаптированных к другим

стрессам - осмотическому и окислительному, а также - возможное участие внеклеточных факторов в процессе адаптации к высокодейтерированной среде. Подробно изучено влияние присутствия дейтерия на активность метанолдегидрогеназы и обнаружен обратный изотопный эффект дейтерия растворителя в реакции, катализируемой этим ключевым ферментом ассимиляции метанола.

Практическая ценность работы

С использованием новых метилотрофных бактерий МеЩЬрМиэ эр. В-7741, получен дейтерированный ЭПС с включением 2Н 95 ат%, источник дейтерированных глюкозы, галактозы и рамнозы. Разработаны новые методы адаптации бактериальных клеток к высокодейтерированной среде. Методы адаптации основаны на получении инокупята в условиях окислительного или осмотического стрессов, то есть без расходования дейтерированной воды, а также использовании внеклеточных факторов адаптации к стрессовым условиям. Обнаруженный в настоящей работе антистрессовый эффект бесклеточной дейтерированной культуральной жидкости позволяет проводить культивирование в режиме рециркуляции. Применение разработанных методов адаптации позволит существенно сократить расход дорогостоящего оксида дейтерия на ступенчатую адаптацию продуцентов. В целом, новые облигатные метилотрофные бактерии МеМуЬрЬИив эр. В-7741 являются перспективными продуцентами тотально дейтерированных БАС.

Положения, выносимые на защиту

1 - Влияние дейтерометанола и оксида дейтерия на ростовые характеристики облигатных метилотрофных бактерий МеШу1орШ1и$ йр. В-7741.

2 - Установление возможности перекрестной адаптации к дейтерированной среде и другим стрессам - осмотическому и окислительному, а также возможности участия внеклеточных факторов в процессе адаптации метилотрофных бактерий к дейтерированной среде.

3 - Выявление влияния дейтерирования на активность МДГ Ме^уЬрЫиБ эр. В-7741.

4 - Влияния дейтерирования ростовой среды на биосинтез ЭПС у Ме^у/орМиэ эр. В-7741.

5 - Выделение ЭПС и установление его углеводного состава. Определение степени включения дейтерия в этот биополимер при максимальном дейтерировании ростовой среды.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на заседаниях кафедры биотехнологии МИТХТ, на 1-м Международном конгрессе "Биотехнология" (Москва, 12-16 окт. 2002 г.) и 18 апреля 2003 г. на научном семинаре кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ.

Публикации

По материалам диссертационной работы оформлено 3 статьи и 2 тезисов научных конференций.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена настраницах машинописного текста, содержит.^.4.рисунков и таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние дейтерометанола и оксида дейтерия на кинетику роста облигатных метилотрофных бактерия Ме&1у!орЫ1из ер. В-7741

Определение ростовых параметров МеМу/орМив ер. В-7741 в средах различного изотопного состава

Биосинтетическое получение высокодейтерированных БАС возможно только путем культивирования микроорганизмов на средах с возможно более полной заменой протия на дейтерий как в воде (2Н20 - вместо НгО), так и в составе всех ростовых субстратов, прежде всего - источника углерода. Соответственно, для культивирования метилотрофных бактерий используют высокообогащённый дейтерометанол С2Нз02Н вместо обычного метанола СНзОН.

Первым этапом нашего исследования было определение влияния полного замещения протия дейтерием в молекуле метанола и в воде на кинетику роста культуры и выход биомассы для неадаптированных клеток.

Концентрацию метанола (дейтерометанола) варьировали от 0,012 до 739,5 мМ. В Н20 удельная скорость роста достигает максимального значения ¡¡^ при 3 - 3,5 мМ метанола (дейтерометанола) и далее не меняется вплоть до 24 мМ. Дальнейшее увеличение концентрации метанола в ростовой среде приводит к уменьшению скорости роста. Для ростовых сред, содержащих оксид дейтерия, отмеченная закономерность сохраняется, однако значения ц^ достигаются при

более низких концентрациях метанола (дейтерометанола). Для математической обработки данных зависимости удельной скорости роста от концентрации субстрата (метанола или дейтерометанола) была выбрана следующая формула, хорошо отражающая наблюдаемое субстратное ингибирование:

Ks+S{ 1+А)

где fimax- максимальная удельная скорость роста, ч"1; S - концентрация субстрата, мМ; К,— константа Моно, мМ; К, - константа ингибирования, мМ.

В табл. 1 представлены параметры уравнения Моно и экономические коэффициенты для СНзОН и С2Нз02Н в качестве источника углерода, а также изотопные эффекты дейтерия (ИЭД) для этих параметров. ИЭД рассчитывали по формулам, аналогичным используемым при изучении ИЭД в ферментативных реакциях.

Таблица 1. Кинетические параметры роста Ме^уЬрМиэ эр. В-7741 и изотопные эффекты дейтерия субстрата и растворителя.

Цтах* Ks, Ртах/К;, к» у ** I X/Sl

Растворитель / Субстрат ч"1 мкМ ч'/мМ мМ Г/М^бстрата

Н20 / СН3ОН 0.48 500 0,96 1,60 21,2

Н20 / CzH30'H 0.36 360 1,00 1,50 21,2

ИЭДсубстрата 1.33 1,40 0,96 1,07 1,00

75%2Н20 / С2Н302Н _ 0,25 16,3 15,34 1,42 16,1

95%"Н20 / СгН302Н 0,12 - - - 9,94

99.7%¿HzO 1С2Н302Н 0,02 - - - 4,23

И ЗД *субстрата+растворитвля 1,92 30,7 0,06 1,13 1,32

* - для 75% ^Н20 / С^НзО'Н; ** - выход биомассы

Для сред, содержащих 95% и 99,7% 2Н20, в условиях сильного ингибирования роста оксидом дейтерия при концентрациях субстрата ниже 0,25 мМ значения ¡л, а следовательно и К„ определить не удалось из-за низкого накопления биомассы. Как и предполагали, ингибирование роста неадаптированных клеток тяжёлой водой становится сильнее с возрастанием ее концентрации в среде. При максимальной концентрации 2НгО (99.7%) рост неадаптированных клеток практически отсутствовал.

Снижение максимальной удельной скорости роста а«, при использовании дейтерированного субстрата является следствием уменьшения скорости его катаболизма, то есть объясняется возникновением нормального изотопного эффекта дейтерия. Небольшая величина ИЭД^„ах (1,33) свидетельствует о достаточно слабом негативном влиянии дейтерометанола на рост бактерий. Вместе с тем следует подчеркнуть, что уменьшение константы сродства Ks при замене метанола на дейтерометанол и воды на оксид дейтерия, а следовательно повышение сродства бактерий к дейтерированному субстрату обнаружено впервые. Наиболее вероятной причиной повышения сродства бактерий к дейтерометанолу представляется более высокое сродство к этому субстрату метанолдегидрогеназы - первого фермента в цепи утилизации метанола. Константы Михаэлиса МДГ из клеток факультативного метилотрофа Methylobactenum extorquons D303E для СН3ОН и С2Н302Н составляют 250 мМ и 193 мМ соответственно (Afolabi et al., 2001). Следовательно для МДГ из M. extorquens D303E ИЭДКт = 1,30, что очень близко к ИЭД&, полученному нами для Methylophilus sp. В-7741. Еще более сильное увеличение сродства Methylophilus sp. В-7741 к дейтерометанолу в присутствии 2НгО в среде может быть связано либо с изменением свойств мембран клеток (и как следствие -увеличение транспорта или диффузии субстрата в клетку), либо с увеличением сродства МДГ или других ферментов в цепи окисления метанола к их субстратам. Известно, что 2НгО сильно снижает Кт для многих ферментов. Важно отметить, что отсутствие изотопного эффекта дейтерия в субстрате на экономический коэффициент характеризует Methylophilus sp. В-7741 как перспективный продуцент дейтерированной биомассы, а также дейтерированных БАС.

Далее влияние изотопного состава субстрата на рост бактерий исследовали путём ступенчатого уменьшения соотношения СН30Н/С2Н302Н, при условии, что суммарная концентрация СН3ОН и С2Н302Н оставалась постоянной и равной 1 об.%. Влияние СН30Н/С2Н302Н на скорость роста, продолжительность лаг-фазы, и уровень накопления биомассы представлены на рис. 1.

Интересно отметить отсутствие изотопного эффекта на экономический коэффициент, а также слабые изотопные эффекты субстрата на продолжительность лаг-фазы и величину цт для соотношения СН30Н/С2Н302Н ниже 25%/75%.

Рис. 1. Влияние доли дейтерометанола (С2Н302Н) а субстрате на продолжительность лаг-фазы (1), величину ¡1 (2), и выход биомассы (3) МеЛу/орЬИыв эр В-7741. В контрольном опыте использовали ростовую среду с Н20 / СНзОН.

Влияние ступенчатой адаптации к дейтерированной среде на рост Ме^у1орЫ1из зр. В-7741

Для проведения адаптации клеток к высокой концентрации 2НгО, был применен ступенчатый режим увеличения концентрации 2НгО в ростовых средах (О - 75 - 95 - 99,85%), так как известно, что постепенное привыкание микроорганизмов к 2НгО оказывает благоприятной эффект на адаптацию. В полном соответствии с ранее полученными результатами, мы наблюдали более быстрый рост и высокий выход биомассы у клеток, предварительно ступенчато адаптированных к 2Н20, по сравнению с неадаптированными (табл. 2). При максимальной концентрации 2Н20 в среде скорость роста адаптированных клеток достигала 0,12 ч'\ а выход биомассы составлял около половины от уровня, характерного для обычной , недейтерированной среды.

В результате адаптации продолжительность лаг-фазы удалось сократить в три раза, а цтах и Тт повысить в 6 и 3 раза, соответственно (табл. 2).

Таблица 2. Влияние ступенчатой адаптации культуры МеМуЬрЫ/из Бр. В-7741 к 2Н20-содержащим средам на параметры ее роста в тех же средах. Н - неадаптированная культура; А - ступенчато адаптированная культура.

Лаг-фаза, ^■тах 1 У*/«

Изотопный состав ч Ч -1 Г/Мсубстрата

среда Н А Н А Н А

НгО / СН3ОН 1.5 - 0.48 - 21.2 -

Н20 / С^НзО^Н 2.5 - 0.36 - 21.2 -

75%^Н20/С2Н302Н 5 3 0.25 0.27 16.1 17.6

95%2Н20 / С2Н302Н 16 8 0.12 0.15 9.94 13.1

99.7%"Н20 / С'НзО'Н 48 16 0.02 0.12 4.23 11.6

Влияние рН и температуры на рост МеШуЬрЫШв вр. В-7741 в обычной и дейтерированной среде

Учитывая возможное влияние оксида дейтерия на свойства ростовых сред, представлялось целесообразным определить оптимальные условия для роста Ме№у1орЫ1из ер. В-7741 в дейтерированных средах. На рис. 2 представлено влияние рН (р2Н) на скорость роста в обычной и дейтерированных средах. Поскольку ионное произведение оксида дейтерия составляет 1,9-10""15 (в отличие от 1СГ14 для воды) величину р2Н определяли по уравнению р2Н=рН - 0,4. Различие в оптимальных значениях рН (р2Н) не превышают 0,5 ед. рН (р2Н).

В максимально дейтерированной среде (99,85% 2НгО) культура выросла только при оптимальной р2Н. Возможно, это связано с невозможностью адаптироваться к одновременному действию двух негативных, стрессовых факторов - 2Н20 и неоптимального рН.

На рис.3 представлено влияние температуры на скорость роста. Как и в случае оптимума рН, оптимальная температура (28 - 30°С) была сходной и для 'Н-среды, и для гН-среды. При субоптимальных температурах (6 - 23°С), зависимость роста от температуры хорошо следует закону Аррениуса. Константы уравнения Аррениуса очень близки для 1Н- и 2Н-сред (табл. 3). Полученные данные свидетельствует о том, что дейтерирование среды практически не влияет на зависимость роста Ме1Ьу1орЫ1и$ ер. В-7741 от температуры.

Рис. 2. Зависимость удельной скорости роста МеМу/орМив вр. В-7741 от рН в средах с разными уровнями содержания дейтерия: 1 - НгО / СН3ОН; 2 - 75%2Н20 / С2Н302Н; 3 - 99.7%2Н20 / С2Н302Н.

о.оН---1---1-.-1-.-,-,

О 10 20 30 40

Твмпература/'С

Рис. 3. Зависимость удельной скорости роста МеМуЬрМиэ В-7741 от температуры в средах с разным изотопным составом: 1 - Н20 / СН3ОН; 2 - 75%2Н20 / СгНз02Н.

]

| Таблица 3. Параметры уравнения Аррениуса для роста Ме№у!орЫ1из эр. В-7741 в

1Н- и 2Н-средах

Изотопный состав среды Еа, кДж/моль А, ч"1

Н20 / СНзОН 67.8 3.58x10"

75%*Н20 / С*Н302Н 66.3 8.90x1010

Таким - образом, для культивирования Ме(Ьу1орЫ!из зр. В-7741 в дейтерированных средах оптимальными являются те же значения рН и температуры, что и для культивирования в недейтерированных средах.

2. Изучение возможности перекрестной адаптации к дейтерированной

среде и другим стрессам, - осмотическому и окислительному, а также

возможности участия внеклеточных факторов адаптации

Влияние условий выращивания посевного материала на параметры

роста Ме^у/орМиз ер. в дейтерированной среде

Так как эффект дейтерированного источника углерода на рост

незначителен, адаптивный ответ на дейтерированную среду вызван в основном

присутствием гН20. Традиционно биологические эффекты дейтерия объясняют различным энергетическим потенциалом С-1Н- и С-2Н-связей в биомолекулах, однако изотопный эффект 2Н20 как растворителя в биологических системах в целом остается неизвестным. Возможно, что именно с этим эффектом (2Н20 как растворителя) связано также малоизученное явление адаптации к 2Н20-средам. Поскольку физико-химические свойства 2Н20 и 1Н20 различны, присутствие 2НгО в культуральной среде влияет на физиологию клетки и, следовательно, приводит к индукции адаптивного ответа, который можно сравнить с ответами, вызываемыми другими стрессовыми условиями. В таком случае, возникает вопрос, сохраняются ли в процессе адаптации к гН20 явления, характерные для адаптации к другим стрессам, например перекрестная адаптация и образование внеклеточных факторов адаптации.

В связи с этим, мы попытались определить, влияет ли на скорость роста Ме1Ьу1орЬНиз эр. В-7741, особенно в высокодейтерированной среде (2Н-среде), способ подготовки инокулята, а именно - получение такого инокулята в других стрессовых условиях. Как видно из данных, представленных в табл. 4, когда инокулят выращивали в условиях осмотического стресса (86мМ ЫаС1 в стандартной среде) или в условиях окислительного стресса (33 мкМ Н202 в стандартной среде), а затем клетки переносили в 2Н-среду, бактерии Ме^уЬрЬИиз эр. В-7741 росли так же, как клетки, предварительно адаптированные традиционным способом - проведением ряда пассажей с увеличением содержания оксида дейтерия в среде. Таким образом, обработка клеток МеШу1орЫ1из эр. В-7741 №С1 или Н202 приводит к повышению жизнеспособности культуры при дальнейшем пересеве ее на дейтерированные среды непосредственно с обычной - 1Н-среды, то есть наблюдается эффект перекрестной адаптации.

Наблюдения, показавшие что клетки, подвергнутые осмотическому или окислительному стрессу, растут в присутствии 2Н20 так же, как и адаптированные клетки, были сделаны нами впервые. Зто наблюдение указывает на возможное сходство в механизмах адаптации к вышеперечисленным трем стрессовым ситуациям.

Таблица 4. Влияние условий выращивания инокулята на рост МеМуЬрЬНиБ эр. В-7741 в 2Н-среде.

Условия выращивания инокулята Параметры роста в "'Н-среде

Лаг-фаза, ч Удельная скорость роста, ч"1

'Н-среда 49±1 0,02±0.01

Пассажи 0-75-95-99,7 об.% ^НгО 13±3 0,12±0.01

1 Н-среда + 86мМ ЫаС1 14±2 0,10±0.01

1 Н-среда + 33 мкМ Н202 13±3 0,12±0.01

Влияние дейтерирования ростовой среды на активность каталазы

Для проверки высказанного предположения о сходстве клеточного ответа на 2Н20-, осмотический и окислительный стрессы нами была измерена активность каталазы в клетках Мейу/орМог эр. В-7741, выращенных на 1Н- и 2Н-средах.

Таблица 5. Активность каталазы в экстрактах клеток МеМу/орМив эр. В-7741, выращенных в 1Н- и 2Н-средах.

Клеточный экстракт Активность каталазы, нмоль Н202/мин*мг белка

'Н-экстракт 0.13±0.03

^Н-экстракт 1.38±0.10

Активность каталазы, которая является основным ферментом, отвечающим за распад Н202 в растущих клетках, была в 2Н-клетках МеШу1орЫ1из эр. В-7741 на порядок выше, чем в 1Н-клетках (табл. 5). Это может быть связано с увеличением образования активных форм кислорода в клетках при выращивании в дейтерированной среде, вероятно, как следствие, ингибирования транспорта электронов в дыхательной цепи оксидом дейтерии. Таким образом, клеточная адаптация к 2Н20 сопровождается индукцией или активацией экспрессии некоторых генов, необходимых для выживания в данных неблагоприятных условиях.

Изучение биологического действия дейтерированной бесклеточной жидкости на рост Methylophilus sp. В-7741 в дейтерированной среде

Недавно было показано, что бактерии могут синтезировать внеклеточные факторы, участвующие в адаптации к неблагоприятным (или новым) условиям. В частности, у Е. coli биосинтез некоторых из этих факторов специфически индуцируется в ответ на попадание клеток в стрессовые условия.

С целью определения возможного участия внеклеточных факторов в адаптации к 2Н20 мы изучили влияние бесклеточных дейтерированных культуральных жидкостей на адаптацию Methylophilus sp. В-7741 к 2Н-среде (рис. 4 и 5), о чем судили по росту культур.

оп

2 5п

-Л-

20 40 60 60 100 120 140 160

Время, ч

о п

2 5л

200

Время, ч

Рис. 4. Влияние бесклеточной КЖ из экспоненциальной культуры Мейу/о-рЛ//ив эр. В-7741, выращенной в среде, содержащей 95% 2Н20, на рост Ме№у1орЫ1ив ер. В-7741 в среде, содержащей 95% 2НгО*: 1 - 100% свежей среды; 2 - 75% свежей среды + 25% КЖ.

•дэеда содержала 95% 2Н20 и 1 %С Нз02Н

Рис. 5. Влияние бесклеточной КЖ из стационарной культуры Ме/Лу/о-рЬИив эр. В-7741, выращенной в среде, содержащей 95% 2НгО, на рост Мейу/орЛ/'/ия эр. В-7741 в среде, содержащей 95% 2Н20*: 1 - 100% свежей среды; 2 - 75% свежей среды + 25% КЖ.

"среда содержала 95% 2Н20 и 1%С2Н302Н

Было обнаружено, что добавление дейтерированной КЖ из экспоненциальной фазы к новой ростовой среде приводит к увеличению скорости роста культур, а также к повышению выхода биомассы (рис. 4). В случае добавления дейтерированной КЖ из стационарной фазы также наблюдалось увеличение скорости роста и повышение выхода биомассы, но лаг-фаза удлинялась (рис. 5).

Таким образом, можно предположить, что неадаптированные клетки Ме№у1орЫ1из эр. В-7741, растущие в 2НгО-содержащей среде, выделяют внеклеточные факторы, которые повышают устойчивость неадаптированных клеток к аналогичным условиям.

Полученные результаты дают основания полагать, что 2НгО можно рассматривать как стрессовый фактор, механизм клеточной адаптации к которому радикально не отличается от механизмов адаптации клеток к другим стрессовым условиям. Применение разработанных методов адаптации позволит существенно сократить затрату времени и расход дорогостоящего оксида дейтерия на ступенчатую адаптацию.

3. Влияние дейтерирования на активность МДГ

Как показано выше, метилотрофные бактерии адаптируются к средам, содержащим 99,7 ат.% 2НгО, однако скорость роста и выход биомассы после адаптации остаются более низкими, чем в аналогичных средах, содержащих обычную воду. Возможно, биологический эффект дейтерия на адаптированные клетки вызван снижением активности дейтерированных ферментов Первым ферментом в цепи окисления субстрата у метилотрофных бактерий является хорошо изученный фермент МДГ - периплазматический хинопротеин, простетической группой которого является пирролохинолинхинон. Дальнейшие эксперименты были направлены на изучение влияния дейтерирования метанолдегидрогеназы на ее активность, а также изотопного эффекта дейтерия субстрата и растворителя в реакции, катализируемой этим ферментом.

Активность МДГ из экстрактов 1Н и 2Н - биомассы

Активность МДГ в экстракте биомассы, полученной в высокодейтерированной среде (2Н-фермент), в зависимости от условий реакции составила лишь 34 - 47% от активности в экстракте контрольной биомассы. Такое снижение активности при дейтерировании у некоторых ферментов было описано и ранее. Потеря активности белка в результате дейтерирования может быть обусловлена, например, нарушениями структурной организации белковых молекул. Таким образом, одной из причин ингибирующего действия дейтерия на рост метилотрофных бактерий является непосредственное уменьшение активности дейтерированной МДГ.

Таблица 6. Активность препаратов МДГ в присутствии субстрата и растворителя различного изотопного состава

Субстрат / растворитель Активность МДГ, мкмоль/мин мг белка

^-фермент 2Н-фермент

СН3ОН/Н20 5,83±0,29 2,00+0,17

С2Н302Н / н2о 4,25±0,06 1,45±0,12

СНзОН/^НгО 7,25±0,14 3,33±0,32

С'НзО^Н/'НгО 5,50±0,07 2,60±0,07

Изучение изотопного эффекта субстрата на реакцию, катализируемую МДГ

Изотопный эффект субстрата был сходным для 1Н- и для 2Н-ферментов (табл. 7). Интерпретация величин полученных изотопных эффектов для 1Н- и 2Н-ферментов достаточно сложна из-за участия в процессе, кроме фермента и субстрата, переносчиков электронов, ионов аммония и цианида. Очевидно, что наличие изотопного эффекта субстрата для МДГ связано со стадией отрыва атома водорода метальной группы в молекуле метанола.

Таблица 7. Влияние дейтерия в субстрате и растворителе на активность 1Н- и 2Н-лрепаратов МДГ.

Изотопный эффект иэд

1Н-фермент 2Н-фермент

субстрат 1,37±0,05 1,38±0,01

растворитель 0,80±0,02 0,60±0,01

субстрат + растворитель 1,06±0,04 0,77±0,04

Изучение изотопного эффекта растворителя на реакцию, катализируемую МДГ

Несмотря на отмеченное выше большое внимание исследователей к свойствам и механизму действия МДГ, изотопный эффект растворителя на скорость окисления метанола этим ферментом прежде не был описан. В данной серии экспериментов мы впервые наблюдали обратный изотопный эффект растворителя для реакции, катализируемой как 1Н-, так и 2Н-МДГ (табл. 7). Мы полагаем, что наблюдаемый эффект является следствием замещения молекулы воды в процессе связывания метанола с активным центром МДГ при

формировании комплекса Михаэлиса, подобно механизму, действия алкогольдегидрогеназы дрожжей (КФ 1.1.1.1) (Welsh et al., 1980) и механизму ингибирования пепсина (КФ 3.4.23.1) пепстатином (Cho et al., 1994). Однако, поскольку активность МДГ была определена нами в бесклеточных экстрактах, а не прямым методом для очищенного фермента, можно также предположить и другие механизмы возникновения обратного изотопного эффекта растворителя.

4. Влияние дейтерирования ростовой среды на биосинтез ЭПС

Влияние питательных сред с разными уровнями содержания дейтерия на биосинтез ЭПС

Метилотрофные бактерии в большинстве способны к образованию значительных количеств ЭПС, и, соответственно, (при условии их адаптация к росту в дейтерированной среде) представляет собой потенциальные источники дейтерированных углеводов. Поскольку нами было обнаружено, что бактерии Methylophilus sp. В-7741 также продуцируют ЭПС, далее мы исследовали влияние изотопного состава питательных сред с разными уровнями содержания дейтерия на биосинтез этого полимера. Как представлено в табл. 8, накопление ЭПС уменьшалось при увеличении концентрации 2H20 в ростовой среде. При максимальной концентрации 2НгО, уровень накопления ЭПС составил около 32% от контрольного. Выход ЭПС (расчетный параметр) также уменьшался при увеличении концентрации 2НгО в ростовой среде (рис. 6). Однако, учитывая сильное влияние условий культивирования на биосинтез ЭПС, окончательный вывод о продуктивности Methylophilus sp. В-7741 по дейтерированным ЭПС можно будет сделать после более детальной оптимизации условий культивирования.

Во всех случаях, при увеличении концентрации метанола (или дейтерометанола) с 0.5% до 1%, происходило повышение выхода ЭПС. Полученные результаты согласуются с данными о том что избыток источника углерода в среде оказывает стимулирующий эффект на биосинтез ЭПС.

Следует подчеркнуть, что по сравнению с Methylobacillus flagellatum KT MFK5-3, которая была изучена в аналогичных условиях (Мишина с соавт., 2002), Methylophilus sp В-7741 синтезирует в 7.5 и 2.6 раза больше ЭПС или 2Н-ЭПС соответственно в обычной протонированной (НгО / 1%СН3ОН) и максимальной дейтерированной (99.7%гНгО / 1%С2Н302Н) среде.

Таблица 8. Накопление ЭПС в 'Н- и 2Н-средах у МеШуЬрМив эр. В-7741.

Конечная концентрация ЭПС, г/л

Изотопный состав 0.5% СН3ОН или 1% СНзОН или

среды С2Н302Н С2Н302Н

Н20/СН3ОН 0.21 0.60

75%'Н20/ С^НзО^Н 0.13 0.35

95%'!Н20/ С2Н302Н 0.08 0.24

99.7%2Н20/ С'НзО^Н 0.06 0.19

С]эпс,

гЭПС/гАСБ а

12 3 4

Изотопный состав среды

Рис. 6. Влияние концентрации метанола на выход* ЭПС у МеМу/орМив эр. В-7741 в средах с разным содержанием дейтерия.

1 - Н20 / СНзОН; 2 - 75%2Н20 / С2Н302Н;

3 - 95%2Н20 / С2Н302Н; 4 - 99.7%2Н20 / С2Н302Н

а - 0,5% СНзОН или С2Н302Н; б - 1 % СНзОН или С2Н302Н

|* Выход ЭПС (дэпс) = [(конечная концентрация ЭПС, г/л) / (конечная концентрация биомассы, г/л)1

Влияние температуры и рН на биосинтез ЭПС в 1Н- и 2Н-среде

Влияние температуры культивирования Мв#)у1орШ№ эр. В-7741 на биосинтез ЭПС исследовали в диапазоне от 6° до 30°С (Табл. 9). Обнаружена обратная зависимость конечной концентрации ЭПС от температуры: чем меньше температура, тем большим было накопление ЭПС как в 1Н-среде, так и в 2Н-среде.

Также установлена зависимость накопления ЭПС от исходного значения рН среды при рН от 5 до 10 (рис. 7). Оптимальное значение рН для биосинтеза

ЭПС было сходно с оптимальным значением рН для скорости роста в обеих средах. Изменение значений рН выше или ниже оптимума ведет к снижению количества ЭПС в культуральной жидкости как в 1Н-среде, так и в 2Н-среде.

Таким образом, следует отметать, что для процесса получения немеченых или дейтерированных ЭПС созданием определенных условий культивирования можно достичь высоких показателей биосинтетической продуктивности.

В целом, полученные данные позволили сделать вывод о том что, метилотрофные бактерии МеШу1орЫ1из Бр. В-7741 представляются перспективными для биотехнологического получения дейтерированных БАС.

Таблица 9. Влияние температуры на накопление ЭПС у Ме^у/орЫ/иБ ер. В-7741 в 1Н-и 2Н-средах.

Температура,"С Конечная концентрация ЭПС, г/л

Н20/СН30Н 75%"Н20 / С'НзО'Н

6 0.32 0.26

17 0.30 0.20

23 0.23 0.16

30 0.20 0.13

ЭПС,г/л

рН

Рис. 7 . Влияние рН на накопление ЭПС у Ме№у1орШ1иБ эр. В-7741 в Н- и 2Н-среде.

1 -Н20/СН30Н; 2-75%2Н20/С2Н302Н.

5. Исследование углеводного состава ЭПС Methylophilus sp. В-7741 и определение степени включения дейтерия в этот биополимер при максимальном дейтерировании ростовой среды

Изучение углеводного состава ЭПС

Способность клеток метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741 синтезировать ЭПС на дейтерированных средах подтолкнуло к изучению химического и изотопного состава этих ценных БАС. Выделение и очистку ЭПС Methylophilus sp. В-7741 осуществляли в соответствии со схемой, представленной на рис, 8. После получения бесклеточной КЖ ЭПС осаждали двумя объемами растворителя, в качестве которого использовали ацетон, этанол, метанол, 2-пропанол. Именно 2-пропанол был выбран нами для осаждения, поскольку только полученный с использованием 2-пропанола ЭПС обладал способностью набухать и растворяться в воде. Обезвоживание ЭПС проводили в два этапа. На первом этапе сырой ЭПС 3-4 раза промывали 2-пропанолом (ресуспендировапи в 2-пропаноле, затем отделяли центрифугированием), отжимали фильтровальной бумагой, 2-пропанол удаляли под вакуумом в эксикаторе. На последнем этапе ЭПС подвергали лиофильной сушке для удаления воды. Нативный ЭПС исследовали методом 13С-ЯМР.

В 13С-ЯМР спектр нативного ЭПС, отсутствие сигналов при 50-55 м.д. и 170-200 м.д. свидетельствует об отсутствии следующих групп: -0-СН3; >N-Ac; -О-Ас и -СООН. Однако, из-за плохой растворимости ЭПС в воде и невозможности получить растворы необходимой концентрации корректная интерпретация этого спектра оказалась невозможной. Плохая растворимость ЭПС в воде не позволила также исследовать его гомогенность и провести фракционирование нативного ЭПС.

Далее проводили полный и частичный гидролиз ЭПС и гидролизаты исследовали методами ТСХ, БХ, ВЭЖХ, 1Н- и 13С-ЯМР спектроскопии. В составе гидролизатов, были обнаружены рамноза, глюкоза и галактоза. Известно, что глюкоза и галактоза в составе ЭПС метилотрофных бактерий являются D-, а рамноза L-конформерами, поэтому можно предположить что в составе ЭПС Methylophilus sp. В-7741 присутствуют L-рамноза, D-глюкоза и D-галактоза.

Частичный гидролиз проводили нагреванием ЭПС при 100°С в растворе 0.1 н ТФУ в воде. После отделения растворимой фракции (первый гидролизат) к ЭПС добавляли свежий раствор 0.1 н ТФУ и гидролиз повторяли и получали вторую растворимую фракцию (второй гидролизат). Далее к ЭПС еще добавляли

Рис. 8. Схема выделения и анализа ЭПС из культуральной жидкости.

свежий раствор 0.1 н ТФУ, гидролиз продолжали и получали третью растворимую фракцию (третий гидролизат). За ходом гидролиза следили методом ВЭЖХ (колонка БЕРАРОЫ БСХ-ЫНг, З.ЗХЗООмм, ацетонитрил-вода 85/15(об/об); 0,5 мл/мин). В первом гидролизате преобладала рамноза, во втором - рамноза и смесь глюкозы и галактозы практически в равных количествах, а в третьем гидролизате фракция глюкозы и галактозы была основной (рис 9). Полученные результаты могут быть связаны либо с меньшей прочностью гликозидных связей между КЬа и другими углеводными остатками, либо с локализацией Р^а в боковых цепях.

а <

б

в

г

13

Рис. 9. Профиль элюции гидролизатов ВЭЖХ (полученных при 0.1 н ТФУ): а) 1 фракция; б) 2 фракция; в) 3 фракция; г) стандартная смесь (1 - рамноза, 2 - манноза, 3 - глюкоза, 4 - галактоза).

г

По данным ,3С-ЯМР спектроскопии (рис. 10) в гидролизате ЭПС, полученном в 0.1 н ТФУ, присутствуют НИар, аср, Эа!р о чем свидетельствуют характерные резонансные сигналы при 16 0 м.д. (С6 а,(3 ЯИар),

60.7м д (С6 а,р Glcp),61,3м д.(С6 а,р Galp), 92.7 м д ,(С1 а Glcp), 93.8 м д. ,(С1 а Galp), 94.8 м д.(С1 а Rhap), 96.8 м д.(С1 (3 Gicp).

Сигналы при 79.2, 80.9. и 81.8 м.д. соответствуют атомам С4 остатков Galp, Glcp, RhaP, соединенных Р(1-»4) гликозидными связями. Смещение в слабое поле на -10 м д. для С4-атомов остатков Gal указывает на наличие (3(1—>4)-связи. Некоторые отличия в химических сдвигах по сравнению с сигналами у моносахаридов связано с эффектом гликозилирования.

Сигналы при 101.6, 102.99 и 103.7 м.д. могут быть обусловлены С1-атомами соответственно Rhap, Glcp и Galp, образующими р(1-»4) гликозидные связи.

81 Ш 11 II i gSSSSSSS

III SI II II I ЧЫ I.......

i _............. ,V '

tu ' til ник Ъ ~ я ' i ¡^Ú Й I

i

je

" Sí 1 ■» ' * * '

Рис. 10. "С-ЯМР спектр частичного ждролизата ЭПС (полученного при 0.1 н ТФУ).

13С-ЯМР спектр полного гидролизата ЭПС, полученного нагреванием в

2 н ТФУ, представлен на рис.11. Отсутствие сигналов в области 79-82 м.д. и 101-104 м д. свидетельствует об отсутствии гликозидных связей и следовательно, подтверждает полноту гидролиза. Присутствие характерных сигналов атомов С1 при 91.7, 93.1 и 95.5 м.д. подтверждает наличие в ЭПС углеводных остатков С1ср, ва!р и КЬар.

Рис. 11.13С-ЯМР спектр полного гидролизата ЭПС (полученного при 2 н ТФУ).

Определение степени включения дейтерия в ЭПС при максимальном дейтерировании ростовой среды

ЭПС Ме№)у1орЫ1из эр. В-7741, выращенные в высокодейтерированной среде были выделены, очищены и гидролизованы в соответствии со схемой, представленной на рис. 8. Для определения степени включения дейтерия в 2Н-ЭПС методом спектроскопии *Н-ЯМР, его гидролизат был ацетилирован, а также были синтезированы пентаацетаты глюкозы, содержащих в гидролизате. Протоны ацетильных групп были использованы в качестве внутреннего стандарта для определения количества остаточных протонов в области химических сдвигов углеводных протонов. В 1Н-ЯМР спектре ацетилированного гидролизата 2Н-ЭПС, в области, соответствующей углеводным протонам (б 3.6 - 6 м.д.), резонансные сигналы регистрировались в следовых количествах (рис. 12). С учетом точности метода ЯМР спектроскопии можно утверждать, что включение дейтерия составило не менее 95 ат.% дейтерия, то есть полученные препараты ЭПС тотально дейтерированы.

m s-* aTÎ ^ _L_Lb n • Ш îi ! '.M Ir1 If 1 JIlJ k s г i U,,

M

si и ir ÎÏ и ïî б il „ JJJ!..^> J 3 S V' \ и

Рис. 12. 'Н-ЯМР спектры а) пентаацетата-р-глкжопиранозы; 6) ацетилированного полного гидролиза та (полученного при 2 н ТФУ) 2Н-ЭПС.

ВЫВОДЫ

1 - Изучено влияние дейтерометанола и оксида дейтерия на ростовые характеристики новых облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741. Показано, что эти дейтерированные субстраты снижают константы [imax, К„ и К,.

2 - Проведена адаптация Methylophilus sp. В-7741 к росту в высокодейтерированной среде. Показано, что в результате адаптации продолжительность лаг-фазы удалось сократить в три раза, a /w и У^ повысить в б и 3 раза, соответственно.

3 - Обнаружена способность к перекрестной адаптации Methylophilus sp. В-7741 к 2НгО и к другим стрессам - осмотическому и окислительному, а также участие

экзометаболитов-адаптогенов в этом процессе. На основании этих данных предложен подход к упрощению метода получения культур метилотрофных бактерий, адаптированных к высокодейтерированным средам.

4 - В бесклеточных экстрактах изучено влияние дейтерия метанола, воды и дейтерия в самом белке на активность ключевого фермента ассимиляции метанола МДГ. Показано, что активность МДГ Methylophilus sp. В-7741 снижается при полном дейтерировании этого белка. Впервые обнаружен стимулирующий эффект 2Н20 как растворителя на реакцию, катализируемой МДГ.

5 - Установлено, что культура Methylophilus sp. В-7741 способна синтезировать значительные количества внеклеточных полисахаридов. Изучено влияние ростовых факторов и условий культивирования на биосинтез ЭПС. Показано, что снижение температуры приводит к увеличению накопления ЭПС как в 1Н- так и в 2Н-среде.

6 - Изучен химический состав ЭПС, секретируемых Methylophilus sp. В-7741. Обнаружено присутствие углеводных остатков Galp, Glcp, Rhap.

7 - При использовании максимально дейтерированной ростовой среды получены препараты ЭПС, в которых включение дейтерия составляет не менее 95 ат.% дейтерия. Таким образом, культуру Methylophilus sp. В-7741 можно рассматривать как перспективную для использования в качестве продуцента тотально дейтерированных БАС.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1. Пшеничникова А Б., Нево А.Н.С., Волкова Е.В., Складнее Д.А., Швец В.И. Влияние дейтерирования на активность метанолдегидрогеназы Methylophilus sp. В-7741. // Прикладная биохимия и микробиология. - 2003. - Т, 39. - № 6. - С. 1-4.

2. Гордеева Т.Л., Нево А.Н.С., Пшеничникова А.Б., Складнее Д.А., Швец В.И. Рост смешанной культуры бактерий на дейтерированных метанолсодержащих средах. // Тезисы докладов 1-го Международного конгресса "Биотехнология". - 12-16 Октября 2002. - Москва. - С. 64.

3. Пшеничникова А.Б., Исаева H.A., Нево А.Н.С., Рогожкина Е.А., Складнее Д.А., Швец В.И. Закономерности биосинтеза и общая характеристика экзополисахаридов новой метилотрофной бактерии Methylophilus sp. Тезисы

докладов 2-го международного конгресса "Биотехнология". - 10-14 ноября 2003. - Москва.

4. Нево А.Н.С., Пшеничникова А.Б., Складнев Д.А., Швец В.И. Влияние дейтерометанола и оксида дейтерия на ростовые характеристики и биосинтез экзополисахарида облигатными метилотрофными бактериями Methylophilus sp. В-7741. // Биотехнология. - 2003. - № 6 (в печати).

5. Нево А.Н.С., Пшеничникова А.Б., Складнев Д.А., Швец В.И. Оксид дейтерия как стрессовый фактор у метилотрофных бактерий Methylophilus зр. В-7741. // Микробиология. - 2003 (в печати).

Подписано в печать'™.'.... •.. Чюрмат 60x84/16 Бумага писчая. Отпечатано на ризографе Уч изд листов 1,6. Тираж 100 экз Заказ

^ ягд

Лицензия на издательскую деятельность ИД № 03507 от 1612 2000

Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М В Ломоносова.

Издательско-полиграфический центр. 119571 Москва, пр. Вернадского 86.

'7 7?¿ »§'177 9 8

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Нево Суфо Ален Нарсис

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

КЛЮЧЕВЫЕСЛОВА.

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Применение дейтерированных соединений и методы их получения.

1.1.1. Применение дейтерированных соединений.

1.1.2. Методы получения дейтерированных БАС.

1.2.Влияние оксида дейтерия на рост, биохимию и физиологию микроорганизмов.

1.2.1. Сравнительный анализ физико-химических свойств 'НгО и 2НгО.

1.2.2. Влияние НгО на рост и морфологию микроорганизмов, феномен клеточной адаптации к 2НгО.

1.2.3. Влияние НгО на скорость ферментативных реакций и метаболизм углерода.

1.2.4. Влияние 2НгО на метаболизм нуклеиновых кислот, экспрессию генов и генетический контроль.

1.2.5. Влияние Н2О на физиологию микроорганизмов.

1.3. Связь клеточного ответа на Н2О и другие стрессовые факторы.

1.3.1. Перекрестная адаптация к стрессам у микроорганизмов.

1.3.2. Участие экзометаболитов (внеклеточных факторов) в адаптации клетки к стрессам.

1.4. Метилотрофные бактерии как объекты изотопной биотехнологии.

1.4.1 Основные свойства метилотрофных бактерий.

1.4.1.1. Особенности метилотрофных бактерий.

1.4.1.2. Характеристика первого и ключевого фермента ассимиляции метанола у метилотрофных бактерии - метанолдегидрогеназы.

1.4.2. Биотехнологический потенциал метилотрофных бактерий.

1.4.2.1. Экзополисахариды метилотрофных бактерий.

1.4.4.2. Генетическое исследование метилотрофных бактерий.

1.4.3. Получение дейтерированных БАС с использованием метилотрофных бактерий.,

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Влияние дейтерометанола и оксида дейтерия на кинетику роста облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741.

2.1.1. Определение кинетических параметров роста Methylophilus sp. В

РЬ в средах различного изотопного состава.

2.1.2. Влияние содержания дейтерометанола в субстрате на рост Methylophilus sp. В-7741.

2.1.3. Влияние ступенчатой адаптации бактерий Methylophilus sp. В-7741 к 2Н20-содержащим средам на продолжительность лаг-фазы, цтах и Y^.

2.1.4. Определение оптимальных условий - температуры и рН (р2Н) - для роста бактерий Methylophilus sp. В-7741 в дейтерированных средах.

2.2. Оксид дейтерия как стрессовый фактор у Methylophilus sp. В-7741.

2.2.1. Влияние условий выращивания посевного материала на параметры роста в

W^ дейтерированной среде.

2.2.2. Определение активности каталазы в клетках, выращенных в обычной и дейтерированной среде.50.

2.2.3. Изучение биологического действия дейтерированной бесклеточной жидкости на рост Methylophilus sp. В-7741 в дейтерированной среде.

2.3. Влияние дейтерирования на активность МДГ Methylophilus sp. В-7741.

2.3.1. Активность МДГ в экстракте 'Н и 2Н-биомассы Methylophilus sp. В-7741.

2.3.2. Изучение изотопного эффекта субстрата в реакции, катализируемой

МДГ Methylophilus sp. В-7741.

2.3.3. Изучение изотопного эффекта растворителя в реакции, катализируемой

МДГ Methylophilus sp. В-7741.

2.3.4. Изучение влияния рН на активность МДГ в экстракте Н и Н-биомассы Methylophilus sp. В-7741.

2.4. Влияние дейтерия на биосинтез ЭПС у Methylophilus sp. В-7741.

2.4.1. Влияние питательных сред с разными уровнями содержания дейтерия на биосинтез ЭПС.

2.4.2. Влияние температуры и рН на биосинтез ЭПС в 'Н- и 2Н-среде.64.

2.5. Исследование углеводного состава ЭПС и определение степени включения дейтерия в ЭПС.

2.5.1. Выделение и очистка ЭПС Methylophilus sp. В-7741.

2.5.2. Гидролиз ЭПС Methylophilus sp. В-7741 и определение углеводного состава гидролизата хроматографическими методами.

2.5.3. Изучение углеводного состава гидролизата ЭПС

Methylophilus sp. В-7741 методом 'Н и 13С-ЯМР спектроскопии.

2.5.4. Определение степени включения дейтерия в ЭПС при выращивании Methylophilus sp. В-7741 в максимально дейтерированной среде.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Материалы.

3.1.1. Микробиологический объект.

3.1.2. Реагенты.

3.1.3. Приборы.

3.1.4. Питательные среды для культивирования Methylophilus sp. В-7741.

3.2. Методы.

3.2.1. Культивирование бактерий Methylophilus sp. В-7741.

3.2.2. Ступенчатая адаптация бактерий Methylophilus sp. В-7741 к средам, приготовленным на основе 2Н20.

3.2.3. Приготовление посевного материала, адаптированного к осмотическому и окислительному стрессу.

3.2.4. Определение ростовых параметров.

3.2.5. Получение бесклеточных КЖ.

3.2.6. Определение концентрации экзополисахарида.

3.2.7. Приготовление клеточного экстракта из Н- и Н-биомассы.

3.2.8. Определение содержания белка в клеточных экстрактах по методу

Лоури.

3.2.9. Определение активности каталазы.

3.2.10. Определение активности МДГ.

3.2.11. Частичный гидролиз в 0,1 н ТФУ.

3.2.12. Полный гидролиз в 2 н ТФУ.

3.2.13. Получение 1,2,3 Дб-пента-О-ацетил-р-Б-глюкопиранозы.

3.2.14. Ацетилирование гидролизата дейтерированного ЭПС.

3.2.14. Анализ состава гидролизатов методом ТСХ, БХ, и ВЭЖХ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Новая облигатная метилотрофная бактерия Methylophilus sp. В-7741 как продуцент дейтрированной биомассы и экзополисахарида"

Широкое применение биологически активных соединений (БАС), меченных стабильными изотопами, в частности дейтерием, в структурных и фармакокинетических исследованиях обусловило необходимость поиска новых подходов к их получению. В последние годы особое внимание уделяется разработке методов биосинтетического получения стабильномеченых БАС.

Метилотрофные бактерии являются перспективным источником различных классов стабильномеченых БАС. Перспективность метилотрофов как продуцентов дейтерированной биомассы, аминокислот, жирных кислот, экзополисахаридов и других соединений обусловлена тем, что в качестве единственного источника углерода такие бактерии способны использовать Сi-соединения, например, метанол. Это делает процесс культивирования более технологичным и позволяет получить необходимые БАС с высокой степенью включения дейтерия.

Важной проблемой биосинтеза дейтерированных соединений является токсичность дейтерированной воды как одного из основных источников дейтерия. Целый ряд вопросов, которые касаются практического использования различных штаммов-продуцентов БАС для роста и биосинтеза целевых продуктов в высокодейтерированных средах, остаются до конца невыясненными из-за сложности их адаптации к оксиду дейтерия. Решение этой проблемы позволит резко увеличить возможности биосинтетического метода получения дейтерированных БАС.

Механизм и закономерности процесса адаптации и роста бактерий, в том числе метилотрофных, в высокодейтерированных средах (средах с высокими концентрациями оксида дейтерия и дейтерометанолом) не вполне понятны, хотя биологические эффекты дейтерия подробно изучались. В связи с этим, изучение биохимических и физиологических особенностей роста и биосинтеза в тяжелой воде у микроорганизмов продолжает быть актуальной задачей как для получения различных дейтерированных соединений, так и в плане изучения биологически важного феномена адаптации к оксиду дейтерия.

Многие метилотрофные бактерии характеризуются способностью секретировать внеклеточные полисахариды (ЭПС). Дейтерированные ЭПС, полученные при культивировании этих микроорганизмов в высокодейтерированной среде, являются источниками дейтерированных углеводов, используемых в настоящее время как в качестве источника углерода для выращивания гетеротрофных микроорганизмовпродуцентов дейтерированных БАС, так и прямо в различных биомедицинских исследованиях.

Цель работы

Целью настоящей работы было изучение особенностей роста метилотрофных бактерий и биосинтеза ЭПС при замене метанола на дейтерометанол и воды на оксид дейтерия в культуральной среде с использованием в качестве модели новых облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741.

Этапы исследования включали:

1 - Изучение влияния дейтерометанола и оксида дейтерия на ростовые характеристики облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741.

2 - Изучение возможности перекрестной адаптации к дейтерированной среде и другим стрессам - осмотическому и окислительному, а также изучение возможности участия внеклеточных факторов в процессе адаптации к дейтерированной среде.

3 - Изучение влияния дейтерирования на активность МДГ Methylophilus sp. В-7741.

4 - Изучение дейтерирования ростовой среды на биосинтез ЭПС у Methylophilus sp. В-7741.

5 - Выделение и изучение углеводного состава ЭПС; определение степени включения дейтерия в этот биополимер при максимальном дейтерировании ростовой среды.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Нево Суфо Ален Нарсис

ВЫВОДЫ

1 — Изучено влияние дейтерометанола и оксида дейтерия на ростовые характеристики новых облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741. Показано, что эти дейтерированные субстраты снижают константы ртах, Ks, Kt и Y^.

2 — Проведена адаптация Methylophilus sp. В-7741 к росту в высокодейтерированной среде. Показано, что в результате адаптации продолжительность лаг-фазы удалось сократить в три раза, артах и Y^ повысить в 6 и 3 раза, соответственно.

3 — Обнаружена способность к перекрестной адаптации Methylophilus sp. В-7741 к 2Н20 и к другим стрессам - осмотическому и окислительному, а также участие экзометаболитов-адаптогенов в этом процессе. На основании этих данных предложен подход к упрощению метода получения культур метилотрофных бактерий, адаптированных к высокодейтерированным средам.

4 — В бесклеточных экстрактах изучено влияние дейтерия метанола, воды и дейтерия в самом белке на активность ключевого фермента ассимиляции метанола МДГ. Показано, что активность МДГ Methylophilus sp. В-7741 снижается при полном дейтерировании этого белка. Впервые обнаружен стимулирующий эффект 2Н20 как растворителя на реакцию, катализируемой МДГ.

5 — Установлено, что культура Methylophilus sp. В-7741 способна синтезировать значительные количества внеклеточных полисахаридов. Изучено влияние ростовых факторов и условий культивирования на биосинтез ЭПС. Показано, что снижение

I "У температуры приводит к увеличению накопления ЭПС как в Н- так и в Н-среде.

6 — Изучен химический состав ЭПС, секретируемых Methylophilus sp. В-7741. Обнаружено присутствие углеводных остатков Galр, Glcр, Rhap.

7 — При использовании максимально дейтерированной ростовой среды получены препараты ЭПС, в которых включение дейтерия составляет не менее 95 ат.% дейтерия. Таким образом, культуру Methylophilus sp. В-7741 можно рассматривать как перспективную для использования в качестве продуцента тотально дейтерированных БАС.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Нево Суфо Ален Нарсис, Москва

1. Schwarcz Н.Р. Use of stable isotopes to determine compliance. // Control. Clin. Trials. 1984. V.5. №.4 Suppl. P.573-575.

2. Jiang G., Tang G., Wang S., Wang C., Zheng L. Studies on urinary metabolites of perlolyrine in rats. // Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 2000. V.22. №.2. P.154-158.

3. Toriba A., Chetiyanukornkul Т., Kizu R., Hayakawa K. Quantification of 2-hydroxyfluorene in human urine by column-switching high performance liquid chromatography with fluorescence detection. // Analyst. 2003. V.128. №.6. P. 605-610.

4. Wegmann H., Curtius H.C., Gitzelmann R., Otten A. Nutritive value of N-acetyl-L-tryptophan in man.// Helv. Paediatr. Acta. 1979. V.43. №.5. P.497-508.

5. Wenzel M. Erhohte gehirn-affinitat von 131J-markierten N-(alkyl)-amphetaminen nach deuterierung. // J.Labelled Compd. Radiopharm. 1989. V.27. P. 1143-1155.

6. Baker M.T., Ronnenberg W.C., Jr., Ruzicka J.A., Chiang C.K., and Tinker J.H. Inhibitory effects of deuterium substitution on the metabolism of sevoflurane by the rat. Drug Metab. Dispos. 1993. V.21.P.1170-1171.

7. Foster A.B. Deuterium isotope effects in studies of drug metabolism. TIPS. 1984. V.5. P.524-527.

8. Abrahamsson S., Dinh-Nguyen N., Hellgren L.G., Vincent J.C. Patent SE 42601 IB. 1982.

9. Merck and Co., Inc. US Patent 4028405. 1977.

10. Henderson R. The structure of purple membrane from Halobacterium halobium analysis of the X-ray diffraction patterns. //J. Mol. Biol. 1975. V.93. №2. P.123-132.

11. Michel H., Oesterhelt D. Three-dimentional crystals of membrane proteins: bacteriorhodopsin.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V.77. №. 3. P.1283-1285.

12. Campbell I.D., Sheard B. //Trends Biotechnol. 1987. V.5. P.302-306.

13. Griesinger C., Sorensen O.W., Ernst R.R. Three-dimentional Fourier spectroscopy. Application to high-resolution NMR. // J.Magn.Res. 1989. V.84. P. 14-63.

14. Griesinger C., Sorensen O.W., Ernst R.R. Novel three-dimentional NMR techniques for studies of peptides and biological macromolecules. // J.Am.Chem.Soc. 1987. V.109. P.7227-7228.

15. LeMaster D.M., Richards F.M. NMR Sequential Assignment of Escherichia coli Thioredoxin Utilizing Random Fractional Deuteriation. // Biochemistry. 1988. V.27. P.142-150.

16. Oda Y., Nakamura H., Yamazaki Т., Nagayama K., Yoshida M., Kanaya S., Ikehara M. 1H NMR studies of deuterated ribonuclease HI selectively labeled with protonated amino acids. //Journal of BiomolecularNMR. 1992. V.2. P.137-147.

17. Hsu V.L., Armitage I.M. Solution Structure of Cyclosporin A and a Nonimmunosuppressive Analog Bound to Fully Deuterated Cyclophilin. // Biochemistry. 1992. V.31. P.12778-12784.

18. Gardner K.H., Zhang X., Gehring K., Kay L.E. Solution NMR Studies of a 42 Kda Escherichia coli Maltose Binding Protein/p-CycIodextrin Complex: Chemical Shift Assignments and Analysis. //J. Am. Chem. Soc. 1998. V.120. P.l 1738-11748.

19. Nieba-Axmann S.E., Ottiger M., Wuthrich K., Pluckthun A. Multiple cycles of global unfolding of GroEL-bound cyclophilin A evidenced by NMR. // J.Mol.Biol. 1997. V.271. №.5. P.803-818.

20. Gu S., Pan S., Bradbury E.M., Chen X. Use of deuterium-labeled lysine for efficient protein identification and peptide de novo sequencing. // Anal. Chem. 2002. V.74. №.22. P.5774-5785.

21. Kyle D.J., Gladue R., Vail P. Biodeuteration: a novel method for the production of deuterated lubricants.//J. Soc. Tribologists and Lubrication Engineers 1998. V.45. P.335-359.

22. Toray Industries, Inc. Patent J.P. 7010699. 1995.

23. Mitsui Petrochem. Ind. Co., Ltd. Patent JP. 6128557. 1994.

24. Iwamoto M., Maeda M., Sakoda K., Patent EP 501515. 1992.

25. Barker C.E., Eimerl D., Velsko S.P., Roberts D. Patent U.S. 7981636. 1992.

26. Kitahara Т., Ohnori N. Tomihashi N., Ohmori A. Patent EP 128517. 1984.

27. Mitsubishi Rayon KK. Patent JP 59084203.1984.

28. Пшеничникова А.Б., Карнаухова Е.Н., Звонкова Е.Н., Швец В.И. Методы получения дейтерированных аминокислот. // Биоорганическая химия. 1995. Т.21. №.3. С.163-178.

29. Пшеничникова А.Б., Карнаухова Е.Н., Мицнер Б.И., Дубовский П.В., Швец В.И. Изотопный обмен водорода в ароматических аминокислотах. Журнал Общей Химии. // 1993. Т.63. №.5. С. 1034-1040.

30. Griffiths D., Feeney J., Roberts G., Burgen A.S.V. Preparation of selectivelely deuterated aromatic amino acids for use in 1H NMR studies of proteins.// Biochim. Biophys. Acta. 1976. V.446. P. 479-485.

31. Foster R.T., Lewanczuk R., Caille G., Enhancement of the efficacy of nifedipine by deuteration. 1998, US Patent. №. 5. V.846. P.514.

32. Blomquist A.T., Hiscock B.F., Harpp D.N.// J. Org. Chem. 1966. V.31. №.1. P.338-339.

33. Engelman H., Niclas H., Dauert A. Verfahren zur Herstellunng von Glycin-Ds mit hoher Isotopenanreicherung: Патент ГДР. 1989. №. 263191 // Р.Ж. Химия. 1989. №. 21.210155П.

34. Yamamoto D.M., Upson D.A., Linn D.K., Hruby V.J. // J.Amer. Chem. Soc. 1977. V.99. №. 5. P.1564-1570.

35. Kluender H., Huang Fu-Chih, Fritzberg A., Schnoes H., Sih C.J. // J.Amer. Chem. Soc. 1974. V.96. №. 12. P.4054-4055.

36. Wong C.H., Whitesides G.M. //J.Amer.Chem. Soc. 1983. V.105. №.15. P.5012-5014.

37. Field S.J., Young D.W.// J.Chem.Soc.Chem.Communs. 1979. V.l 163-1165.

38. Lee K.M., Ramalingam K., Son J.K., Woodard R.W. // J.Org.Chem. 1989. V.54. №. 13. P.3195-3198.

39. Mcintosh L.P., Dahlquist F.W., Biosynthetic incorporation of 15N and 13C for assignment and interpretation of nuclear magnetic resonance spectra of proteins. // Quarterly Reviews of Biophysics. 1990. V.23. P. 1-38.

40. Katz J.J., Crespi H.L. // Science. 1966. V.151. P.l 187-1191.

41. Crespi H.L. // Stable Isotopes in the Life Sciences / Ed. Freeman S.M. Vienna: Int. Atomic Energy Agency, 1977. P. 111 -121.

42. Karnaukhova E.N., Reshetova O.S., Semenov S.Y., Skladnev D.A., Tsygankov Yu.D. // Amino Acids. 1994. V.6. №1. P. 165-176.

43. Skavenkova M.I., Satterlee J.D., Erman J.E., Siems W.F., Helms G.L. Expression, Purification, Characterization, and NMR Studies of Highly Deuterated Recombinant Cytochrome С Peroxidase // Biochemistry 2001. V.40. P. 12123-12131.

44. Massou S., Puech V., Talmont F., Demange P., Lindley N.D., Tropis M., Milon A., Heterolougous expression of a deuterated membrane-integrated receptor and partial deuteration in methylotrophic yeasts.// J. Biomol. NMR. 1999. V.14. P.231-239.

45. Sosa-Peinado A., Mustafi D., Makinen M.W. Overexpression and biosynthetic deuterium enrichment of TEM-1 p-Lactamase for structural characterization by magnetic resonance methods // Protein Express. Purif. 2000. V.19. P.235-245.

46. Rosen M.K., Gardner K.H., Willis R.C., Parris W.E., Pawson Т., Kay L.E. Selective methyl group protonation of perdeuterated proteins. // J. Mol. Biol. 1996. V.263. P.627-636.

47. Rajesh S., Nietlispach D., Nakayama H., Takio K., Laue E.D., Shibata Т., Ito Y. A novel method for the biosynthesis of deuterated proteins with selective protonation at the aromatic rings of Phe, Tyr, and Тф. // J. Biomol. NMR. 2003. V.27. №1. P.81-86.

48. Haon S., Auge S., Tropis M., Milon A., Lindley N.D. // J. Label. Сотр. Radiopharm. 1993. V.33. P.1053-1063.

49. Gross R.A., Ulmer H.W., Lenz R.W., Tshudy D.J., Uden P.C., Brandt H., Fuller R.C. Biodeuteration of poly (P-hydroxybutyrate). // Int. J. Biol. Macromol. 1992. V.14. P.33-40.

50. Urey H.C., Brickwedde F.G., Murphy G.A. Hydrogen isotope of mass 2. Phys. Rev., 1932. V.39.P.164.

51. Шатенштейн А.И., Варшавский Я.М., Дыхно H.M., Звягинцева Е.Н., Израилевич Е.А., Калиначенко В.Р., Яковлева Е.А. Изотопный состав воды. 1954. Изд. АН СССР.

52. Homma Y., Murase Y. 1990. Radioactivity in deuterated compounds. J. Radioanalytical Nuclear Chem. 146. №.1. P.205-210.

53. Bigeleisen J., Lee M.W., Mandel F. Equilibrium isotope effects. Annual Rev. Phys. Chem., 1973. V.24. P.407-440.

54. Flaumenhaft E., Bose S., Crespi H.L., Katz J.J. Deuterium isotope effects in cytology. Int. Rev. Cytol. 1965. V.18. P.313-361.

55. Лобышев В.И., Калиниченко Л.П. Изотопные эффекты D20 в биологических системах. М.: Наука. 1978. С.35-42.

56. Unno. К., Busujima H., Shimba S., Narita K., Okada S., Characteristics of growth and deuterium incorporation in Chlorella ellipsoidea grown in deuterium oxide. Chem. Pharm. Bull. 1988. V.36. P.l828-1833.

57. Еремин B.A., Чекулаева JI.H. Харатьян Е.Ф., Островский Д.Н. Выращивание бактерий Micrococcus lysodeikticus на дейтерированной среде. Микробиология. 1978. T.XLVII. №.4. С.629-636.

58. Unno К., Ando I., Hagima N., Yokogaki S., Koike C., Okada S. Growth delay and intracellular changes in Chlorella ellipsoidea C-27 as a result of deuteration. Plant. Cell. Physiol. 1992. V.33. №.7. P.963-969.

59. Moses V., Holm-Hansen O., Calvin M. Response of Chlorella to a deuterium environment. // Biochim. Biophys. Acta. 1958. V.28. P.62-70.

60. Chorney W., Scully N.J., Crepsi H.L., Katz J.J. The growth of algae in deuterium oxide. // Biochim. Biophys. Acta. 1960. V.37. P.280-287.

61. Unno K., Busujima H., Shimba S., Narita K., Okada S. Characteristics of growth and deuterium incorporation in Chlorella ellipsoidea grown in deuterium oxide. // Chem. Pharm. Bull. 1988. V.36., №.5. P.1828-1833.

62. Morgan W.D., Kragt A., Freeney J. Expression of deuterium isotope-labeled in yeast Pichiapastoris for NMR studies // J. Biomol. NMR 2000. V. 17. P.337-347.

63. Hochuli M., Szyperski Т., Wuthrich K. Deuterium isotope effects on the central carbon metabolism of Escherichia coli grown on a D20-containing minimal medium. J. Biomol. NMR. 2000. V.17. P.33-42.

64. Klinman J.P. in: Isotope effects on enzyme-catalyzed reactions (Cleland, W.W.et al. Eds). 1977. P. 176-208. University Park Press, Baltimore.

65. Klinman J.P. Adv. Enzymol. 1977. V.46. P.415-494.

66. Schowen B.K., Schowen R.L. //Methods. Enzymol. 1982. V.87. P.551-606.

67. Rebholz K.L., Northrop D.B. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V.176. P.65-69.

68. Whittaker M.M., Ballou D.P., Whittaker J.W. Kinetic isotope effects as probes of the mechanism of galactose oxidase. // Biochemistry. 1998. V.37. P.8426-8436.

69. Alvarez F.J., Ermer J., Hubner G., Schellenberger A., Schowen R.L. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V.117. P.1678-1683.

70. Parsons J.F., Armstrong R.N. //J. Am. Chem. Soc. 1996. V.l 18. P.2295-2296.

71. Henseling J., Rohm K.H. Unusual solvent isotope effects on the amino acylase-catalyzed hydrolysis of acetylamino acids. // FEBS Letters. 1997. V.219. №.1. P.27-30.

72. Shimba S., Unno K., Okada S. Differential cellular isotope effect of deuterium on photosynthetic metabolism of carbon in Cholorella ellipsoidae. Plant Cell Physiol. 1990. V.31. №.1. P.159-162.

73. Shimba S., Unno K., Okada S. Characteristics of the photosynthetic metabolism of carbon in deuterated Chlorella ellipsoidea C-27. Plant Cell Physiol. 1993. V.34. N.2. P.255-262.

74. Rittenberg S.M., Borek E. A study of a completely deuteriated enzyme. Proc. N. A. S. 1961. V.47. P.l772-1775.

75. Rokop S., Gajda L., Parmerter S., Crespi H.L., Katz J.J. Purification and characterization of fully deuterated enzymes. Biochim. Biophys. Acta. 1969. V.l 91. P.707-715.

76. Strain H.H., Thomas M.R., Crespi H.L., Blanke M.I., Katz J.J. Chloroplast pigment and photosyntesis in deuterated green algae. Ann. N.Y.Acad.Sci. 1960. V.84. P.617-633.

77. Bose S., Crespi H.L., Blanke M.I., Katz J.J. Comparative studies of photosynthetic processes in ordinary and fully deuterated algae. Plant Cell Physiol. 1967. V.8. P.545-555.

78. Craig F.N., Trelease S.F. Photosynthesis of Chlorella in heavy water. Amer. J. Bot. 1937. V.24. №.4. P.232-242.

79. Dicken C., Henderson T.R., Dinning J.S. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1962. V.l 10. P.208.

80. Henderson T.R., Dinning J.S. Fed. Proc. 1962. V.21. P.267.

81. Henderson T.R., Dinning J.S. Nature. 1962. V.l94. P.498.

82. Gross P.R., Harding C.V. Science. 1961. V.l33. P.l 133.

83. Wilson J., Dinning J.S. Biochim. Biophys. Acta. 1961. V.53. P.223

84. Ambrose A.P., Czajka D.M. Exp.Cell.Res. 1962. V.26. P.43.

85. Hughes A.M., Bennett E.L., Calvin M. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 1959. V.45. P.581.

86. Henderson T.R. Differential inhibition of p-galactosidase induction and synthesis by deuterium oxide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1962. V.9. №.3. P.240-245.

87. Henderson T.R., Dacus J.M. Deuterium isotope effects on p-galactosidase formation by Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys. 1967. V.l20. P.316-321.

88. De Giovanni R., Zamenhof S. Rec. Genet. Soc. Amer. 1959. V.28. P.65.

89. De Giovanni R. Ann. N.Y.Acad. Sci. 1960. V.84. №.16. P.644.

90. De Giovanni R. Z. VererbLehre 1961. V.92. P.389.

91. Butler L. O., Grist R. W. The effect of D20 on the growth and transforming activities of Streptococcus pneumoniae. J. Gen. Microbiol. 1984. V.130. P.483-494.

92. Laser H., Slater E.C. Effect of heavy water on respiratory-chain enzymes. Nature, 1960. V.187. P.l 115-1117.

93. Mann L.R.B., Moses V. Properties of Escherichia coli grown in deuterated media. Folia Microbiol (Praha). 1971. V. 16. N.4. P.267-284.

94. Kotyk A., Dvorakova M., Koryta J. Deuterons cannot replace protons in active transport processes in yeast. FEBS Letters. 1990. V.264. №.2. P.203-205.

95. Unno K. Okada S. Deuteration causes the decreased induction of heat-shock proteins and1. PiartCill?kus-,ol.increased sensitivity to heat denaturation of proteins in Chlorella. 1994. V.35. N.2. P. 197202.

96. Rastogi R.P., Skukla P.C., Yadava B. Membrane permeability of heavy water // Biochim. et Biophys. Acta. 1971. V.249. №.2. P.454-461.

97. Andjus P.R., Vucelic D. D20-induced cell exitation // J.Membrane Biol. 1990. V.115. P.123-127.

98. Brooks S.C. Osmotic effects of deuterium oxide (heavy water) on living cells // Science. 1937. V.86. №.2239. P.497-498.

99. Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Глуховченко M.H., Октябрьский О.Н. Перекись водорода модулирует внутриклеточные уровни тиолов и калия в клетках Escherichia coli И Микробиология. 1998. Т.67. №.5. С.594-600.

100. Ткаченко А.Г., Пшеничнов М.Р., Салахетдинова О .Я., Нестерова Л.Ю. Роль путресцина и энергетического состояния Escherichia coli в регуляции топологии ДНК при адаптации к окислительному стрессу // Микробиология. 1999. Т.68. №1. С.27-32.

101. Meury J., Robin A. Glutathione-gate K+ channels of Escherichia coli carry out K+ efflux controlled by the redox state of the cell // Arch. Microbiol. 1990. V.154. P.475-482.

102. Butler L.O., Grist R.W. The effect of D20 on the growth and transforming activities of Streptococcus pneumoniae Л J. Gen. Microbiol. 1984. V.130. P.483-494.

103. Матыс В.Ю., Барышникова JI.M., Головлев E.JL. Адаптации к стрессовым условиям у представителей родов Rhodococcus и Gordona. II Микробиология. 1998. Т.67. №.6. С.743-747.

104. Н.Николаев Ю.А. Участие экзометаболитов в адаптации Escherichia coli к срессам // Микробиология. 1997. Т.66. №.1. С.38-41.

105. Flahaut S., Laplace J.M., Frere J., Auffray Y. The oxidative stress response in Enterococcus faecalis: relationship between H2O2 tolerance and H2O2 stress proteins. // Letters in Applied Microbiology. 1998. V.26. P.259-264.

106. Leblanc L., Leboeuf C., Leroi F., Hartke A., Auffray Y. Comparison betwen NaCl tolerance response and acclimation to cold temperature in Shewanella putrefaciens. II Curr. Microbiol. 2003. V.46. №.3. P.157-162.

107. Koga Т., Katagiri Т., Hori H., Takumi K. Alkaline adaptation induces cross-protection against some environmental stresses and morphological change in Vibrio parahaemolyticus. II Microbiol. Res. 2002. V.157. №.4. P.249-255.

108. Николаев Ю.А. Обнаружение двух новых внеклеточных адаптогенных факторов у Escherichia coli К-12. // Микробиология. 1997. Т.66. №.6. С.785-789.

109. Николаев Ю.А. Сравнительное изучение свойств двух внеклеточных протекторов, выделяемых Escherichia coli при повышенной температуре // Микробиология. 1997. Т.66. №.6. С.790-795.

110. Николаев Ю.А., Воронина Н.А., Перекрестное действие внеклеточных факторов адаптации к стрессу у микроорганизмов. // Микробиология. 1999. Т.68. №.1. С.45-50.

111. Rowbury R.J., Goodson М. An extracellular acid stress-sensing protein needed for acid tolerance induction in Escherichia coli. IIFEMS Microbiol. 1999. V.174. №.1. P.49-55.1.

112. Rowbury R.J., Goodson М. Extracellular sensing and signaling pheromones swith-on thermotolerance and other stress responses in Escherichia coli. // Sci. Prog. 2001. V.84. P.205-233.

113. Rowbury R.J. Extracellular sensing components and extracellular induction component alarmones give early warning against stress in Escherichia coli. II Adv. Microb. Physiol. 2001. V.44. P.215-257.

114. Large P.J., Peel D., Quayle J.R. Biochem. J. 1962. V.81. P.470-480.

115. Kemp M.B., Quayle J.R., Biochem. J. 1967. V.102. P.94-102.

116. Anthony C. The biochemistry of methylotrophs. Acad. Press. London. 1982. P.167-187.

117. Zheng Y., Xia Z., Chen Z., Mathews F.S., Bruice T.C. Catalytic mechanism of quinoprotein methanol dehydrogenase: A theoretical and X-ray crystallographic investigation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V.98. № 2. P.432-434.

118. Mincey Т., Bell J.A., Mildvan A.S., Abeles R.H. Mechanism of action of methoxatin-dependent alcohol dehydrogenase. // Biochemistry. 1981. V.20. №.26. P.7502-7509.131. Троценко Ю.А. // 1989.

119. Davis E.N., Wallen L.L. Viscous product from activated sludge by methanol fermentation //Appl. environ, microbiol.1976. V.32. №.2. P.303-305.

120. Kanamru K., Mainuru Y., Micami Y. 2-O-Methyl-D-ramnosa in an extracellular polysaccharide from Hyphomicrobium sp.// Agr. Biol. Chem. 1982. V.46. №.10. P.2419-2424.

121. Southgate G., Goodwin P.M. The regulation of exopolysaccharide production and of enzymes involved in Ci assimilation in Methylophilus methylotrophus. II Journal of General Microbiology. 1989. №.135. P.2859-2867.

122. Osman S.F., Fett W.F., Irwin P., Cescutti P., Brouillette J.N., Oconnor J.V. The structure of the exopolysaccharide of Pseudomonas fluoresceins strain H13. Carbohydrate Research. 1997. V.300. P.323-327.

123. Гринберг Т.А., Косенко JI.B., Малашенко К. Р. ОбразавЗние экзополисахаридов метилотрофными микроорганизмами//Микробиол. Журн. 1984. Т.46. №.3. С.22-26.

124. Цыганков Ю.Д., Чистосердов А.Ю., Казакова С.М. Молекул. Генетика. 1985. №.2.

125. С3"14' Pfot.rair.Aead.9ii.asA.

126. DeMaeyer Е., SkupD., Prasad K.S.etal.-' . 1982. V.79. Р.4256.1. Nature*.

127. Hennam J.F., Cunningham A.F., Sharpe G.S., Atherton K.T. 1982. V.297. P.80.

128. Чистосердов А.Ю., Емерашвили M. Р.,Машко С.В., Лапидус А.Л., Скворцова

129. М.А., Стеркин В.Э., Стронгин А.Я., Цыганков Ю.Д. Экспрессия гена человеческогоинтерферона aF в облигатном метилотрофе Methylobacillus flagellatum КТ и№

130. Pseudomonasputida. Мол. Генет. Микробиол. Вирол.^Т.8. С.36-42.

131. Мосин О.В., Карнаухова Е.Н., Складнев Д.А., Акимова О.Л., Цыганков Ю.Д. Штамм Brevibacterium methylicum — продуцент униформно меченной дейтерием аминокислоты L-фенилаланина. Заявка РФ. N.93055824 от 15.12.1993.

132. Мосин О.В., Карнаухова Е.Н., Пшеничникова А.Б., Складнев Д.А., Акимова О.Л. Биосинтетическое получение дейтерий-меченного L-фенилаланина, секретируемого метилотрофным мутантом Brevibacterium methylicum. Биотехнология. 1993. №.9. Р.16-20.

133. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Юркевич A.M., Швец В.И. Исследование биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum на средах, содержащих тяжелую воду. Биотехнология. 1996. №.3. С.3-12.

134. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.I. Biosynthesis of D-labeled phenylalanine by a new mutant of RuMP facultative methylotroph Brevibacterium methylicum. Bioscience, biotechnology and bioengeneering. 1998. V.62. №.2. P.225-229.

135. Складнев Д.А., Мосин O.B., Егорова T.A., Еремин С.В., Швец В.И. Метилотрофные бактерии источники изотопно-меченных D- и 13С-аминокислот. Биотехнология. 1996. №.4. С.25-34.

136. Мосин О.В., Казаринова Л.А., Преображенская Е.С., Складнее Д.А., Юркевич A.M., Швец В.И. Рост бактерии Bacillus subtilis и биосинтез инозина на высокодейтерированной среде. Биотехнология. 1996. №.4. С. 19-26.

137. Мосин О.В., Складнее Д.А., Швец В.И. Биосинтез D-меченого инозина. Известия РАН, серия Биология, 1999. N.4. С.403-413. Англ. Вариант 1999. Т.26. №.4. С 331-340.

138. Мишина И.М., Пшеничникова А.Б., Швец В.И., Складнев Д.А., Цыганков Ю.Д. Использование метилотрофных бактерий Methylophilus sp В-7741 для получения дейтерированных экзогенных углеводов. // Прикл. Биохим. Микробиол. 2002. Т.38. №.4. С.393-400.

139. Складнев Д.А., Рогожкина Е.А., Кондакова Е.В., Швец В.И., Свищева Н.В., Якименко З.А., Шенкарев З.О., Овчинникова Т.В., Раап Я. Получение изотопно модифицированного ,3C+15N пептидного антибиотика зервамицина ИВ. // Биотехнология. 2002. №.5. С.32-40.

140. Складнев Д.А. Метилотрофные бактерии как основа биотехнологического получения стабильно меченых биологически активных соединений. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. Типогр. МИТХТ. Москва 2000.

141. Гордеева Т.Л., Нево А.Н.С., Пшеничникова А.Б., Складнев Д.А., Швец В.И. Материалы 1-ого Международного Конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития»: Тез. Докл. 14-18 октября 2002 г., Москва, 2002. С. 194.

142. Vanatalu К., Paalme Т., Vilu R., Burkhardt N., Junemann R., May R., Ruhl M., Wadzack J., Nierhaus H. K. // Eur. J. Biochem. 1993. V.216. P.315-321.

143. Moore P.B., Engelman D.M. //Brookhaven Symp. Biol. 1976. V.27. P.12-23.

144. Karnaukhova E.N., Reshetova O.S., Semenov S.Y., Skladnev D.A., Tsygankov Yu.D. // Biosynthesis and MS monitoring. Amino Acids, 1994, V.6. №.1. 165-176.

145. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: практический курс. М.: Фаир-Пресс. 1999. С.568-575.

146. Northrop D.B. In isotope effects on enzyme-catalysed reactions (Cleland W.W., O'Leary M.H., and Northrop D.B., eds.). University Park Press, Baltimore. 1977. P.l22-152.

147. Baev M.V., Kuznetsov E.V., Skladnev D.A., Govorukhina N.I., Sterkin V.E., Tsygankov Y.D. Growth and enzymological characteristics of a pink-pigmented facultative methylotroph Methylobacterium sp. MB1. //Folia Microbiol. 1992. V.37. №.2. P.93-101.

148. Chen B.J., Hirt W., Lim H.C., Tsao G.T. Growth characteristics of a new methylomonad // Appl. Environm. Microbiol. 1977. V.33. №.2. P.269-274.

149. Harrison D.E.F. Studies on the affinity of methanol and methane-utilizing bacteria for their carbon substrates. //J. Appl. Bacteriol. 1973. V.36. P.301-308.

150. Linton J.D., Buckee J.C. Interactions in a methane-utilizing mixed bacterial culture in a chemostat. // J. Gen. Microbiol. 1977. V.l01. P.219-225

151. Thomson J.F. Fumarase activity in D20 // Arch. Biochem. Biophys. 1960. V.90. P.l-6.

152. Natarajan S.K., Sierks M.R. Identification of enzyme-substrate and enzyme-product complexes in the catalytic mechanism of glucoamylase from Aspergillus awamori. // Biochemistry. 1996. V.35.№.48. P. 15269-15279.

153. Thomas H.G., Silverman D.N. Oxidation in H20 and D20 of 6-ethyl-5H-dibenz(c,e)azepine and 1-methylnicotinamide by aldehyde oxidase from rabbit liver.// Arch. Biochem. Biophys. 1985. V. 241. №.2. P.649-655.

154. Urbauer J.L., Dorgan L.J., Schuster S.M. Effects of deuterium on the kinetics of beef heart mitochondrial ATPase. //Arch. Biochem. Biophys. 1984. V. 231. №.2. P.498-502.

155. Мосин O.B., Складнев Д.А., Швец В.И. Исследование физиологической адаптаций бактерий к тяжелой воде.//Биотехнология. 1999. №.4. С.21-31.

156. Smirnova G.V., Muzyka N.G., Oktyabrsky O.N. The role of antioxidant enzymes in response of Escherichia coli to osmotic upshift // FEMS Microbiol. Lett. 2000. V.186. P.209-213.

157. Laser H., Slater E.C. Effect of heavy water on respiratory-chain enzymes // Nature. 1960. V.187. №.4743. P.l 115-1117.

158. Калиниченко Л.П., Христова М.Л., Шноль. Влияние D2O, глицерина, алифатических спиртов и возможная роль гидрофобных взаимодействий в транспорте электронов в митохондриях Л 967. Т. 12. С.824-828.

159. Siegel B.Z., Galston A.W. Biosynthesis of deuterated isoperoxidases in rye plants grown in D20 // Biochemistry. 1966. V.56. P. 1040-1042.

160. Anthony C. Methanol dehydrogenase, a PQQ-containing quinoprotein dehydrogenase // Subcell Biochem. 2000. V.35. P.73-117.

161. Unno K., Kishido Т., Morioka M., Okada S., Oku N. Increased expression of Hsp70 for resistance to deuterium oxide in a yeast mutant cell line. // Biol. Pharm. Bull. 2003. V.26. №.6. P.799-802.

162. Lindquist S., Craig E.A. The heat-shock proteins. // Annu. Rev. Genet. 1988. V.22. P.631-677.

163. Delaney J.M. Requirement of Escherichia coli dnaK gene for thermotolerance and protection against H202. // J.Gen. Microbiol. 1990. V.136. P.2113-2118.

164. Eom C.Y., Park S.T., Kim E., Ro Y.T., Kim S.W., Kim Y.M. Cloning, molecular characterization, and transcriptional analysis of DnaK operon in a methylotrophic bacterium Methylovorus sp. strain SSI DSM 11726. // Mol. Cells. 2002. V.14. №.2. P.245-254.

165. Ильинская O.H., Колпаков А.И., Шмидт M.A., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия // Микробиология. 2002. Т.71. №.1. С.23-29.

166. Лойко Н.Г., Козлова А.Н., Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.Н. Низкомолекулярные ауторегуляторы развития бактерий Thialkalivibrio versutus и Thioalkalimicrobium aerophilum II Микробиология. 2002. Т.71. №.3. С.308-315.

167. Tomita K., Rich A. The effect of deuteration on the geometry of the a-helix // J. Mol. Biol. 1962. V.4. P.83-92.

168. Scheraga H. A. Helix-Random Coil Transformations in deuterated macromolecules // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1960. V.84. P.608-616.

169. Goodwin M.G., Anthony C. Characterization of a novel methanol dehydrogenase containing a Ba2+ ion at the active site // Biochem. J. 1996. V.318. P.673-679.

170. Parkes C., Abeles R. H. Studies on the mechanism of action of action of methoxatin-requiring methanol dehydrogenase reaction of enzyme with electron-acceptor dye // Biochemistry 1984. V.23. P.6355-6363.

171. Mejillano M.R., Shivanna B.D., Himes R.H. Studies on the nocodazole-induced GTPase activity of Tubulin//Arch. Biochem. Biophys. 1996. V.336. P.130-138.

172. Scheuring J., Schramm V.L. Pertussis toxin: transition state analysis for ADP-Ribosylation of G-protein peptide cci3C20 // Biochemistry 1997. V.36. P.8215-8223.

173. Long F.A. Acid-Base Studies with deuterium oxide // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1960. V.84. P.598-602.

174. Welsh K.M., Creighton D.J., Klinman J.P. Transition-state structure in yeast alcohol dehydrogenase reaction: The magnitude of solvent and a-secondary hydrogen isotope effect //Biochemistry. 1980. V. 19. №.10. P.2005-2016.

175. Cho Y., Rebholz K. L., Northrop D. B. Solvent isotope effects on the onset of inhibition of porcine pepsin by pepstatin // Biochemistry. 1994. V.33. P.9637-9642.

176. Xia Z., He Y., Dai W., White S. A., Boyd G. D., Mathews F. S. Detailed active site configuration of a new crystal form of methanol dehydrogenase from methylophilus W3A1 at 1,9 A Resolution//Biochemistry 1999. V.38. P.1214-1220.

177. Sutherland I.W. Biosynthesis of microbial exopolysaccharides. // Adv. Microbiol. Physiol. 1982. V.23. P.79-150.

178. Petry S., Furlan S., Crepeau M.J., Cerning J., Desmazeaud M. Factors affecting exocellular polysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus grown in a chemically defined medium. //Appl. Environ. Microbiol. 2000. P.3427-3431.

179. Cerning J., Bouillanne C., Landon M., Desmazeaud M. Isolation and characterization of exopolysaccharides from slime-forming mesophilic lactic acid bacteria. J. Dairy Sci. 1992. V.75. P.692-699.

180. Cerning J. 1990. Exocellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 1990. V.87. P. 113-130.

181. Kojic M.M., Vujcic M., Banina A., Cocconcelli P., Cerning J., Topisirovic L. Analysis of exopolysaccharide production by Lactobacillus casei CG11, isolated from cheese. Appl. Environ. Microbiol. 1992. V.58. P.4086-4088.

182. Troy F.A., Frerman F.E., Heath E.C. The biosynthesis of capsular polysaccharide in Aerobacter aerogenes. //J. Biol. Chem. 1970. V.246. P. 118-133.

183. Jansson P.E., Kenne L., Widmalm G. Computer-assisted structural analysis of polysaccharides with an extended version of casper using *H- and 13C-N.M.R. Data. // Carbohydrate Research. 1989. V.188. P.169-191.

184. Lipkind G.M., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Kochetkov N.K. A computer-assisted structural analysis of regular polysaccharides on the basis of 13C-N.M.R. // Carbohydrate Research. 1988. V.175. P.59-75.

185. Roe J.H. The determination of sugar in blood and spinal fluid with anthrone reagent // J. Biol. Chem. 1955. V.212.№.1 P.335-337.

186. Beers I.F., Sizer W.I. A spectrophotometric assay for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase // J. Biol. Chem. 1952. V.196. P. 133-140.

187. Anthony C., Zatman L.J. // Biochem. J. 1967. V.104. №.3. P.953-959.