Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Повышение уровня секреции внеклеточного полисахарида и выхода биомассы облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei в присутствии экзогенных жирных кислот и их сложных эфиров

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Повышение уровня секреции внеклеточного полисахарида и выхода биомассы облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei в присутствии экзогенных жирных кислот и их сложных эфиров"

На правах рукописи

005020511

Отман Садек Ахмед Мукред

Повышение уровня секреции внеклеточного полисахарида и выхода биомассы облигатной метилотрофной бактерии МеШу1орМ1и$ quaylei в присутствии экзогенных жирных кислот и их сложных эфиров

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

5 ДПР 2012

Москва 2012

005020511

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

кандидат химических наук, доцент

Пшеничникова Анна Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева

Градова Нина Борисовна

кандидат химических наук, ассистент кафедры химии и технологии биологически активных соединений имени H.A. Преображенского МИТХТ им. М.В. Ломоносова

Гроза Наталья Викторовна

Ведущая организация:

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Защита состоится «23» апреля 2012 г. в 15 ч 00 мин на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) по адресу: 119571, г.Москва, пр. Вернадского, д. 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, д. 86, МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат представлен на сайте www.mitht.ru.

Автореферат диссертации разослан _» марта 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Поиск компонентов питательных сред, ускоряющих рост бактерий - продуцентов биомассы и внеклеточных метаболитов - актуальная задача биотехнологии. Перспективными для управления метаболическими процессами у бактерий являются ауторегуляторные вещества, относящиеся по химической природе к свободным жирным кислотам (ЖК) и выполняющие регуляторную функцию по поддержанию жидкостности клеточных мембран (Светличный В.А. и др., 1983; Бабусенко Е.С. и др., 1991). ЖК с длиной цепи от Си до С20 представляют собой уникальные природные вещества, которые в составе липидов являются структурными компонентами клеточных мембран, выполняют энергетические и регуляторные функции. Кроме этого, свободные ЖК обладают разнообразной биологической активностью и прежде всего - антимикробной (активны против вирусов, бактерий, грибов, водорослей, простейших) и цитотоксической (Nieman С. 1954, Desbois А.Р. et al., 2010).

Благодаря своей бактерицидной активности свободные ЖК являются компонентами врожденного неспецифического иммунитета и присутствуют на коже, в грудном молоке и кровотоке человека и животных (Nicolaides N., 1974), где выполняют защитные функции. В концентрациях, не вызывающих цитотоксического действия, ЖК, например олеиновая, разрушают клеточные стенки и приводят к гибели таких патогенов, как стрептококки и стафилококки (Chen С.Н. et al., 2011). Использование ЖК рассматривают в качестве элемента новой антимикробной стратегии как альтернативу традиционным антибиотикам, применение которых часто приводит к формированию лекарственной устойчивости у патогенных бактерий (Huang С.М. et al., 2011).

Наличие свободных жирных кислот в составе модельных мембран, состоящих из 1,2-диэлаидоил-5п-глицеро-3-фосфоэтаноламина и ЖК, способствуют образованию участков небислойной обращенной гексагональной структуры наряду с ламеллярной в широком интервале температур. Молекула жирной кислоты встраивается в мембрану, образует водородные связи с молекулами воды и соседними аминогруппами молекул фосфатидилэтаноламина и влияет на свойства бислоя (Cordomi A. et al., 2010).

Список сокращений: БКЖ - бесклеточная культуральная жидкость; ВБ -высушенная биомасса; ДФГ - 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен; ЖК - жирные кислоты; КОЕ - колониеобразующие единицы; МЭЖК - метиловые эфиры жирных кислот; ОК -олеиновая кислота; СЮ - оптическая плотность; СК - стеариновая кислота; ФЛ -фосфолипиды; ЭПС - экзополисахарид.

Способность свободных жирных кислот влиять на структуру биологических мембран используется в новом направлении фармакологии - мембрано-липидной терапии. Так, олеиновая кислота (OK), увеличивая отрицательную кривизну мембраны, активирует ряд важных белков, способных ингибировать клеточную пролиферацию и индуцировать апоптоз: G-белков, протеинкиназы С, белков теплового шока. Возможно, этот механизм объясняет ускорение роста бактерий - лактобацилл, коринебактерий (Corcoran В.М. et al., 2007), а также индукцию реактивации покоящихся форм микобактерий в присутствии олеиновой кислоты (Назарова Е.В. и др., 2011). Однако, несмотря на большой научный интерес к функциям свободных ЖК в последнее время, механизм их биологической активности изучен не достаточно.

Перспективной моделью для такого рода исследований являются метилотрофные бактерии, не использующие ЖК в качестве субстрата. Работа с такими моделями исключает вероятность стимулирования роста за счет возможности метаболизировать ЖК. Многие облигатные метилотрофные бактерии, использующие в качестве единственного источника углерода доступный метанол, характеризуются способностью секретировать внеклеточные полисахариды или экзополисахариды (ЭПС) и являются перспективными продуцентами биомассы и ЭПС (Schräder J. et al., 2009; Троценко Ю.А. и др., 2010). Бактериальные ЭПС - биополимеры, обладающие уникальными реологическими свойствами, эмульгирующей активностью и способностью формировать гели. Сферы применения микробных экзополисахаридов чрезвычайно разнообразны: нефте- и горнодобывающая, текстильная, пищевая, фармацевтическая, химическая промышленности и медицина. Потребность в этих полимерах постоянно растет, однако спрос на них удовлетворяется не полностью.

Цели и задачи работы

Изучение влияния экзогенных жирных кислот на выход биомассы и повышение уровня секреции внеклеточного полисахарида облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei, а также оптимизация условий его получения и выделения.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

- исследование влияния экзогенных ЖК и их метиловых эфиров на рост и продукцию внеклеточного полисахарида М. quaylei;

- фракционирование клеточных липидов из биомассы, полученной в присутствии олеиновой кислоты и стеариновой кислоты (CK), а также определение жирнокислотного состава фракций свободных ЖК и фосфолипидов;

- исследование физико-химических свойств интактных клеток М. quaylei, выращенных в стандартных условиях и в присутствии экзогенной OK - величины С-

потенциала (методом электрофоретического рассеяния) и текучести мембран (по величинам анизотропии флуоресценции с использованием в качестве гидрофобного зонда 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена (ДФГ);

- оптимизация условий биосинтеза, методы выделения и очистки ЭПС, изучение углеводного и фракционного состава ЭПС М. quayle'v,

- изучение реологических и эмульгирующих свойств растворов и эмульсий, содержащих ЭПС.

Научная новизна работы

Обнаружено ускорение роста и увеличение уровня секреции внеклеточного полисахарида облигатной метилотрофной бактерии М. quaylei в присутствии жирных КИСЛОТ С12-С18 и их метиловых эфиров, экзогенно добавленных в питательную среду. Наилучшим ростовым фактором оказался олеат натрия. На основании данных о составе фракции свободных жирных кислот в клетках, величин ^-потенциала и анизотропии флуоресценции целых клеток высказано предположение о включении жирных кислот в наружную мембрану бактерии М. quaylei.

Оптимизирован состав среды культивирования М. quaylei для повышения продукции экзополисахарида (отношение C/N, концентрации фосфатов и хлорида кальция). Отработаны условия выделения, определены углеводный и фракционный состав экзополисахарида М. quaylei. Изучены эмульгирующие и реологические свойства ЭПС в составе косметических композиций.

Практическая значимость работы

В результате проведенных исследований с использованием в качестве ростовых факторов экзогенных жирных кислот и их метиловых эфиров удалось повысить выход биомассы и ЭПС М. quaylei более чем в 2 и 1,5 раза соответственно. Разработаны две альтернативные схемы выделения внеклеточного полисахарида. Было показано, что ЭПС М. quaylei является повышающим вязкость водных растворов компонентом, обладает эмульгирующей активностью и является стабилизатором эмульсий типа «масло/вода» и по реологическим свойствам не уступает ксантану и другим полимерам, использующимся в косметических и фармацевтических композициях.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Ускорение роста и продукции внеклеточного полисахарида М. quaylei в присутствии экзогенных ЖК и их метиловых эфиров. Использование олеата натрия в качестве ростового фактора М. quaylei.

2. Ряд гидрофобных добавок по способности стимулировать рост бактерии М. quaylei: С18:1>С18:о>С1б:о>метилолеат>метилстеарат>без добавок>С14:0>С12:0.

3. Механизм взаимодействия экзогенных ЖК с клетками М. quay lei путем включения их в состав наружной мембраны и изменения физико-химических свойств поверхности клетки, а также свойств липидного бислоя.

5. Углеводный состав ЭПС М. quaylei: остатки D-глюкозы, L-рамнозы и D-галактозы в соотношении 5:2:1, фракционный состав: основная фракция (70%) ЭПС имеет молекулярную массу от 6.8-105 до 7.9-107 г/моль, а высокомолекулярная (13%) - 2.6-108.

6. Внеклеточный полисахарид М. quaylei образует вязкие псевдопластичные растворы с тиксотропными свойствами и обладает эмульгирующей активностью и стабилизирует эмульсии типа «масло/вода».

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы докладывались на IV и VI Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007 и 2011 гг).

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 3 оригинальные статьи, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК, а также 2 тезисов на международных конференциях.

Структура и объем работы Диссертация изложена на /Сё страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждении результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемои литературы, включающего /// источника. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит ^/""рисунков и .^таблиц.

Работа поддержана грантом № 3.1.1/9247 АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность выбранной темы диссертации, научная новизна и практическая значимость, указан личный вклад соискателя. Сформулированы цели и задачи исследования.

Глава 1. Функции свободных жирных кислот у бактерий (обзор литературы)

Обзор литературы посвящен вопросам биосинтеза и функционирования свободных жирных кислот в бактериальной клетке. Рассмотрен метаболизм ЖК у бактерий: биосинтез и р-окисление ЖК, регуляция экспрессии бактериальных десатураз, транспорт ЖК через мембрану бактерий, ингибирующее и ростостимулирующее действие экзогенных жирных кислот и их производных на бактерии.

6

Всесторонне рассмотрены различные литературные источники, описывающие механизм бактерицидной активности жирных кислот. Показано, что основной мишенью является клеточная мембрана и процессы, в ней протекающие - функционирование электронтранспортной цепи, окислительное фосфорилирование, ферментативные процессы, транспорт питательных веществ, перекисное окисление липидов. Было уделено внимание жирным кислотам как ауторегуляторным метаболитам, необходимым для межклеточной коммуникации. Также были рассмотрены адаптационные изменения мембранных липидов бактерий при изменении температуры, давления, концентрации солей, добавлении мембраноактивных веществ.

Глава 2. Методы исследования

В качестве объекта исследования использовали облигатные метилотрофные бактерии Methylophilus quaylei, штамм МТ (ВКМ В-2338т) (Doronina et al., 2005). Культивирование проводили в минеральной среде, содержащей 1.0 % об. метанола (Нево и др., 2004). Бактерии выращивали на шейкере («Labline», США) при 100 об./мин и 28°С. Концентрацию бактерий в КЖ определяли по величине оптической плотности при 600 им и величине КОЕ/мл. Концентрацию ЭПС определяли фенольным методом (Dubois et al., 1983). Уроновые кислоты определяли модифицированным карбазольным методом (Filisetti-Cozzi et al., 1991).

Липиды экстрагировали по методу Блайя-Дайэра (Bligh et al., 1959). Липидные экстракты фракционировали методом колоночной хроматографии на силикагеле. Для выделения фракции фосфолипидов из фракции суммарных липидов использовали низкотемпературное осаждение (Кейтс, 1975). Метиловые эфиры жирных кислот получали реакцией с ацетилхлоридом (6 % об.) в метаноле (Christie, 1993).

Жирнокислотный состав фракций свободных жирных кислот и фосфолипидов (ФЛ) определяли методом хромато-масс-спектрометрии. Хромато-масс спектры были получены на газовом хроматографе 6890N «Agilent Technologies» (США), масс-детекторе 5973N «Agilent Technologies» (США), с колонкой НР-1 (США). Спектры 'Н-ЯМР были получены на импульсном Фурье спектрометре Bruker DPX-300 с рабочей частотой 300 МГц. Измерение ^-потенциала интактных клеток бактерий проводили на анализаторе частиц Delsa™ Nano («Beckman Coulter, Inc.», США) методом элсктрофоретического рассеяния. Текучесть мембран целых клеток М. quaylei оценивали по величинам анизотропии флуоресценции с использованием в качестве гидрофобного зонда 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена. Анизотропию флуоресценции ДФГ-меченных клеток определяли на флуоресцентном спектрофотометре Varían Сагу Eclipse (Walnut Creek, СА, Австралия).

Клетки продуцента отделяли от бесклеточной культуральной жидкости (БКЖ) центрифугированием. ЭПС осаждали а) ацетоном или 2-пропанолом; б) в виде цетавлоновых солей. Выпавшие хлопья полисахаридов (или их цетавлоновых солей) отделяли центрифугированием.

Очистку ЭПС от примесей органической природы проводили непрерывной экстракцией диэтиловым эфиром 48 ч, используя экстрактор Сокслета.

Молекулярную массу ЭПС определяли методом гель-фильтрации па колонке ТОYOPEARL HW-65 (Япония) (600x20 мм) при элюировании 0.15 М хлоридом натрия.

Глава 3. Основные результаты и их обсуждение 3.1. Влияние экзогенных жирных кислот и их сложных эфиров на рост и продукцию

ЭПС М. quaylei

Бактерия Methylophilus quaylei является облигатным метилотрофом и, поэтому -удобной моделью для изучения влияния экзогенных мембраноактивных веществ. Экзогенные ЖК включали в состав питательной среды в концентрациях в интервале от 10" 6 до 10"3 М. Добавки ЖК вводили в питательную среду в виде растворов в метаноле. Для определения скорости роста и построения кинетических кривых находили зависимость концентрации высушенной биомассы (ВБ) от времени. Кривые роста М. quaylei в присутствии экзогенно добавленных жирных кислот и их метиловых эфиров в концентрации 50 мкМ представлены на Рис. 1.

Время, ч Время, ч

Рис. 1. Влияние длины цепи и степени ненасыщенности экзогенных ЖК (а) и их метиловых эфиров (б) на рост М^иауіеі: 1 - С^.-о, 2 - Сию, 3 - Сі ею, 4 - Сів:о, 5 - Сі8:і, 6 -Сі8д, 1 - без добавок, 8 - МЭ Сил, 9 - МЭ Сі8:і. Концентрация ЖК 50 мкМ.

8

В присутствии ЖК С14-С18 наблюдали ускорение роста и сокращение лаг-фазы, причем с увеличением длины цепи способность ЖК стимулировать рост увеличивалась. Наибольший эффект наблюдали в присутствии ОК. При этом наблюдалось наиболее сильное сокращение лаг-фазы. Добавки МЭЖК приводили к стимуляции роста М. диауШ, причем стимулирующее действие метилолеата было сильнее стимулирующего действия метилстеарата. Метилирование карбоксильной группы молекулы ЖК приводило к ослаблению, но не снятию стимулирующего действия добавки по сравнению с действием соответствующей ЖК, что подтверждает важную, но не решающую роль свободной карбоксильной группы.

Увеличение выхода биомассы в присутствии ОК достигало 25%, что позволило ее рассматривать в качестве ростового фактора. Однако для практического использования ОК, имеющая вязкую консистенцию, крайне неудобна, предпочтительнее олеат натрия, хорошо растворяющийся в воде и метаноле. Нами было изучено влияние концентрации олеата натрия на выход биомассы и экзополисахарида М. диауШ (рис. 2). Важно отметить, что олеат натрия дозозависимо ускорял выход биомассы (рис. 2а), однако характер этой зависимости довольно сложный. Сначала наблюдалось резкое ускорение роста, затем через плато - переход к более медленному росту. Тот же характер наблюдался для зависимости выхода ЭПС от концентрации олеата натрия (рис. 26).

Поскольку питательные среды с олеатом натрия в концентрации выше 0.1 мМ до добавления инокулята были мутными, было изучено влияние концентрации олеата натрия на оптическую плотность питательных сред (рис. 3). Кривая 1 (рис. 3) позволяет предположить наличие как минимум двух критических концентраций, соответствующих образованию различных мицеллярных структур. Но самое интересное - это повторение формы кривых, соответствующих изменению выхода биомассы и ЭПС от концентрации олеата натрия в среде (рис. 2). Чисто арифметический вклад мицелл олеата натрия в светорассеяние культуральной жидкости можно исключить ввиду низких значений оптической плотности при Х= 600 нм (рис. 3, кривая 2). Возможно, различные мицеллярные структуры с разной эффективностью взаимодействуют с клетками бактерии. Однако этот вывод требует дополнительного подтверждения.

При включении олеата натрия в питательную среду в концентрации выше 1 мМ использование метода определения концентрации биомассы в КЖ по величине светорассеяния является некорректным. Для оценки влияния содержания олеата натрия в питательной среде выше 1 мМ на рост и выход ЭПС использовали другую методологию. Выход биомассы оценивали по величине КОЕ/мл (на твердой минеральной

метанолсодержащей среде), продукцию ЭПС определяли в БКЖ, подвергнутой диализу против дистиллированной воды при рН 7.0.

б)

О 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Концентрация олеата натрия, мМ

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Концентрация олеата натрия, мМ

Рис. 2. Влияние экзогенного олеата натрия в культуральной жидкости на рост (а) и продукцию ЭПС (б) М.диауШ: Д,оо и концентрация ЭПС при 24 (2, 4) и 48 (/, 5) ч роста соответственно.

Кроме этого, содержание ЭПС подтверждали взвешиванием осадка после выделения ЭПС из БКЖ после осаждения двумя объемами ацетона. Зависимость секреции ЭПС от содержания олеата натрия в КЖ в диапазоне концентраций от 0 до 10 мМ представлена на рис.4. Наибольший выход наблюдали при концентрации олеата натрия 4 мМ.

0 0,05 0,1

Концентрация олеата натрия, мМ

1"

0 2 4 6 8 10

Концентрация олеата натрия, мМ

Рис. 3. Влияние концентрации олеата натрия на оптическую плотность стерильной питательной среды при X =450 нм(1)иХ. = 600нм(2).

Рис. 4. Влияние экзогенного олеата натрия в КЖ на выход ЭПС М. диауШ (содержание ЭПС в опытах с добавкой олеата натрия в концентрациях > 1 мМ определяли после диализа БКЖ против дистиллированной воды, рН 7.0). Взаимодействие ЖК с клетками бактерии М. диауШ может осуществляться на

поверхности или в результате проникновения в наружную мембрану. Нами были

выделены и фракционированы клеточные липиды из биомассы, полученной в присутствии ОК и стеариновой кислоты, а также изучен жирнокислотный состав фракций свободных ЖК и ФЛ методом хромато-масс-спектрометрии (рис. 5). При добавлении в питательную среду ОК и СК доля этих ЖК в составе фракции свободных ЖК существенно увеличивалась, тогда как состав фракции ФЛ изменялся незначительно (табл.1).

2000000!

1800000 1600000 1400000; 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 о

17.65

!"Tf° Й.'

14Тоо «.оо^.га.чг.отлвл^аооьШ?!®0-

Рис. 5. Хромато-масс-спектрометрический анализ фракции свободных жирных кислот М. quaylei МТ, культивированных в стандартных условиях, без добавок ЖК. Газовый хроматограф 6890N «Agilent Technologies» (США), масс-детектор 5973N «Agilent Technologies» (США), колонкой НР-1 (США). Отнесение пиков с временами удерживания, мин: 16.17- метиловый эфир тетрадекановой кислоты; 17.50 - метиловый эфир 9-гексадеценовой кислоты; 17.65 - метиловый эфир гексадекановой кислоты; 19.28 -метиловый эфир 9-октадеценовой кислоты; 19.54 - метиловый эфир октадекановой кислоты.

Таблица 1

Влияние экзогенных ОК и СК на жирнокислотный состав фракций липидов М. quaylei

Добавки Фракция С 14:0 Cl6:0 Cl6:l С 18:0 Cl8:l

Без добавок Свободные ЖК 2.0 42.3 45.1 7.4 3.2

ФЛ - 33.5 66.5 - -

ОК, 50 мкмоль/л Свободные ЖК - 26.3 17.7 - 56.0

ФЛ - 46.8 53.2 - -

СК, 50 мкмоль/л Свободные ЖК - 14.4 6.9 78.7 -

ФЛ - 40.8 40.8 18.4 -

При включении ЖК в состав наружной мембраны, вероятно, должно происходить уменьшение заряда поверхности при нейтральных значениях рН благодаря наличию карбоксильных групп. Действительно, величина ^-потенциала бактерий, выращенных в

присутствии экзогенной ОК, ниже, чем в стандартных условиях (табл. 2). Промывка клеток буфером, содержащим 1% БСА, связывающего не включившиеся в мембрану ЖК, привела лишь к незначительному повышению ^-потенциала.

Таблица 2

Влияние экзогенной ОК на физико-химические свойства клеток М. диауіеі

Параметр Условия культивирования

стандартные в присутствии ОК, 50 мкМ

после промывки трис буфером, рН 7.5 после промывки буфером, содержащим 1% БСА после промывки трис буфером, рН 7.5 после промывки буфером, содержащим 1% БСА

¡¡-потенциал целых клеток бактерий, мВ -40.77 -40.09 -43.06 -43.01

анизотропия флуоресценции целых клеток* 0.0111 - 0.0087 -

* - флуоресцентный зонд 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен

Была проведена оценка текучести мембран целых клеток М. диауЫ по величинам анизотропии флуоресценции с использованием в качестве гидрофобного зонда ДФГ. Значение анизотропии клеток, выращенных в присутствии ОК, было ниже, чем в стандартных условиях, что коррелирует с повышением текучести мембран в присутствии ОК (табл. 2). Таким образом, эффект ускорения роста метилотрофной бактерии М. диауШ экзогенными ЖК достигался за счет включения их в состав наружной мембраны и изменения физико-химических свойств поверхности клетки, а также свойств липидного бислоя.

3.2. Получение, очистка и изучение углеводного и фракционного состава ЭПС

М. циауШ

Оптимизацию условий культивирования проводили с применением метода математического планирования эксперимента (Дерффель К., 1994). Варьируемые параметры выбирали из условия наибольшей чувствительности культуры к их изменению. Интервалы варьирования параметров выбирали таким образом, чтобы значения параметров были как меньше, так и больше значений, оптимальных для роста бактерии. В качестве факторов варьирования взяли: соотношение концентраций источников углерода и азота - метанола и нитрата натрия С/И (X]), концентрацию хлорида кальция (Х2), концентрацию гидро- и дигидрофосфатов калия (Хз), (табл. 3), содержание остальных компонентов ферментационной среды зафиксировали (полный факторный эксперимент третьего порядка ПФЭ 23).

Выбирали время культивирования, соответствующее стационарной фазе роста - 48 ч. В качестве откликов использовали: а) У] - оценку концентрации биомассы по оптической плотности культуры, при длине волны 600 нм; б) У2 - оценку концентрации экзополисахарида, определяемой фенольным методом - по оптической плотности при длине волны 490 нм. Ошибку эксперимента рассчитывали для каждой серии и использовали полученное значение для оценки значимости коэффициентов регрессионных уравнений (Дерффель К., 1994).

Таблица 3.

Интервалы варьирования параметров культивирования М. циауШ

Соотношение C/N Xi СаС12 х2 Фосфаты х3

+ 4:1 2 % СН3ОН, 0.5 % NaN03 0.03 г/л 4.5 г/л 3 г/л К2НР04, 1.5г/лКН2Р04

- 1:1 0.5 % СН3ОН, 0.5 %NaN03 0.01г/ л 1.5 г/л 1 г/л К2НР04, 0.5 г/л КН2Р04

Были получены следующие регрессионные уравнения:

а) для высушенной биомассы: СВб=14.59+0.34-Х1+0.15-Х2-0.45-Хз+0.02-ХгХ2 +0.15 • X, • Х3 -0.72 • Х2- Хз-0.58 • Xi • Х2 Х3;

б) для ЭПС: СЭпс=1 -72-0.12 • Xi+0.04 • Х2+0.02 • Х3-0.05 • X, • Х2 +0.03 ■ Xi • Х3 +0.125 • Х2 • Хз+0.04 • X, • Х2 Х3.

Была проведена проверка значимости коэффициентов регрессии. Значимыми коэффициентами в регрессионном уравнении для ЭПС, в связи с условием |Ь,|> 0.074,

являются Ь)Э= - 0.12 и Ь2зэ = 0.125. Проверка показала, что уравнения адекватны. Анализ полученного регрессионного уравнения позволяет сделать следующий вывод: наибольшее влияние на конечную концентрацию экзополисахарида оказывает соотношение CIN и совместное влияние хлорида кальция и фосфатов. На основании полученного регрессионного уравнения проводили оптимизацию питательной среды по направлению градиента для биосинтеза ЭПС. Для этого проводили крутое восхождение, изменяя значения коэффициентов Ь2 и Ьз, предполагая линейную зависимость отклика от факторов Х2 и Хз. Оптимальными для биосинтеза ЭПС (2.88 г ЭПС/л) концентрациями хлорида кальция и суммарных фосфатов (К2НР04 и КН2РО4 в соотношении 2:1) оказались 0.0287 и 4.31 г/л соответственно.

Для получения ЭПС бактерии культивировали в питательной среде, состав которой был определен методом математического планирования эксперимента. Для выделения ЭПС из БКЖ использовали осаждение органическими растворителями или осаждение в виде цетавлоновых солей. Полного осаждения ЭПС достигали при добавлении двух

объемов ацетона или изопропанола к одному объему БКЖ. Выпавшие хлопья ЭПС отделяли центрифугированием, лиофилизовали. Добавление в БКЖ цетавлона в массовых соотношениях ЭПС - цетавлон: 1:10, 1:2, 1:1, 2:1, 3,33:1 соответственно показало, что происходит полное осаждение ЭПС в виде цетавлоновых солей. Это, очевидно, обусловлено кислой природой ЭПС. Цетавлоновые соли ЭПС растворяли в 1М растворе NaCl, цетавлон удаляли диализом против 1М раствора NaCl, получая ЭПС в виде натриевой соли.

Анализ состава полученных препаратов ЭПС обнаружил наличие гидрофобных примесей жирных кислот и липидов, присутствующих, как было ранее показано (Терехова Е.А. и др., 2010), в культуральной жидкости М. quaylei. Очистку ЭПС от гидрофобных веществ проводили методом непрерывной экстракции диэтиловым эфиром. Последующая обработка ЭПС в условиях дезацилирования (щелочного гидролиза) показала, что он не содержит остатков жирных кислот.

Потенциально полезные для применения свойства ЭПС - реологические свойства, эмульгирующая активность и способность формировать гели - зависят от молекулярной массы полимера и углеводного состава. Углеводный состав ЭПС определяли после его полного кислотного гидролиза в растворе 2М трифторуксусной кислоты при 100°С с последующим восстановлением до полиолов и ацетилированием (Blakeney А.В. et al., 1983). Методом хромато-масс-спектрометрии было показано, что в составе углеводов ЭПС М. quaylei присутствуют остатки D-глюкозы, L-рамнозы и D-галактозы в соотношении 5:2:1 и не содержит остатков уроновых кислот. Это было подтверждено нами модифицированным карбазольным методом (Filisetti-Cozzi Т.М. et aL, 1991). Однако образование нерастворимых цетавлоновых солей ЭПС свидетельствует о присутствии в его структуре кислотных групп. Определение содержания пирувата (Sloneker J.H. et al., 1962) показало, что ЭПС М. quaylei аналогично бактериальному полисахариду ксантану содержит кислотные пирувилиденовые остатки (8,73%).

Молекулярную массу ЭПС М. quaylei определяли методом гель-фильтрации. Продуцируемый бактерией полисахарид выходит с колонки в виде трех фракций: основной (70%), ограниченной значениями молекулярных масс от 6.8-Ю5 до 7.9-107 г/моль, высокомолекулярной (13%) с молекулярной массой 2.6-108 г/моль и низкомолекулярной (17%) с молекулярной массой <40000 г/моль (рис. 6).

3.3. Изучение реологических свойств растворов и эмульсий, содержащих ЭПС

М. quaylei

Перспективы практического использования ЭПС в составе косметических и лекарственных средств определяются реологическими и эмульгирующими свойствами их

14

растворов, способностью ЭПС выполнять функции загустителей и стабилизировать дисперсии и эмульсии.

О 20 40 60 80 Элюируемый объем, мл

Рис. 6. Гель-хроматограмма ЭПС М. quaylei на колонке TOYOPEARL HW-65 (Япония) (600x20 мм) при элюировании 0.15 М хлоридом натрия

■III)

11-00 12.00 13.00 1* 00 15 00 16.00 17 00 1Є.0О 19.00 20.00 21.'

Рис. 7. Хромато-масс-спектрометрический анализ ацетилированного гидролизата ЭПС М. quaylei.

В качестве загустителей применяют полимеры синтетического и природного происхождения. Наряду с ЭПС М. quaylei для сравнительных исследований нами были использованы распространенные в парфюмерно-косметических и фармацевтических композициях полимеры: бактериальный ЭПС ксантан (Keltrol RD «CP Kelco UK Limited», Великобритания), модифицированный растительный полисахарид гидроксипропилгуар (Jaguar HP 60, Rhodia, Франция) и синтетический гидрофобно-модифицированный полиакриловый полимер, INCI-наименование: Acrylates/Vinyl Isodecanoate Crosspolymer (Stabylen 30, «Sigma», США). Реологические измерения проводили на ротационном программируемом вискозиметре «Brookfield RVDVII+», США.

Реологическое поведение полимерных систем характеризовали реологическими кривыми, к которым относятся кривые течения (зависимости скорости сдвига от напряжения сдвига) и кривые эффективной вязкости (зависимости вязкости от напряжения сдвига). Вид реологических кривых течения и вязкости водно-глицериновых растворов ЭПС М. quaylei свидетельствует, что при концентрациях выше 0,1% масс, эти растворы проявляют неньютоновское поведение, причем структурообразование, а, следовательно, прочность системы, усиливается по мере роста концентрации полимера, что сопровождается увеличением вязкости (рис. 8). Характер течения водно-глицериновых растворов ЭПС М. quaylei псевдопластический аналогично другим коммерческим загустителям.

Возможность использования ЭПС М. quaylei в качестве стабилизатора эмульсий типа «Масло/Вода» была показана на примере косметической композиции следующего состава, % масс: глицерин 5.0; полиглицерил-3-метилгликоздистеарат 3.0; цетеариловый

15

спирт 1.0; глицерилстеарат 2.0; вазелиновое масло 8.0; смесь: метилпарабен, этилпарабен, пропилпарабен, бутилпарабен, изобутилпарабен, феноксиэтанол («РЬепошр») 0.7.

Рис. 8. Кривые а) течения; б) вязкости водно-глицериновых растворов ЭПС М. диауШ. Содержание компонентов, % масс: глицерина 3; ЭПС - 0.05 (1); 0.1 (2); 0.15 (3); 0.2 (4); 0.3 (5).

Эмульсию получали механическим перемешиванием компонентов с последующей гомогенизацией предварительно полученной дисперсии. Стабильность эмульсии определяли помощью следующих тестов: 1) колебательный температурный тест - 3 цикла х (5 ч при -18°С, 5 ч при комнатной температуре, 14 ч при 40°С); 2) термостатирование при 40°С 3 месяца; 3) проверка коллоидной стабильности методом центрифугирования (5 мин, 6000 об/мин). Оптимизация состава базовой композиции не привела к стабилизации системы. Только включение полимеров (ЭПС М. диауШ, ксантан, гидроксипропилгуар, полиакрилат) до 0,1%масс. стабилизировало эмульсию, придавая ей устойчивость не только к циклам замораживания-оттаивания, но и в течение срока хранения как при комнатной, так и при повышенной температуре. Способность полимеров к связыванию воды и загущению эмульсии предотвращает сепарацию на фазы.

При введении ЭПС М. диауШ в состав эмульсии происходит формирование структурной гелевой сетки, о чем свидетельствует наличие зон гистерезиса при прямом и обратном ходе и максимумов на кривых течения при увеличении напряжения сдвига (Рис. 9). Т.е. эмульсии, содержащие ЭПС М. диауШ, также как и друтие исследованные полисахариды, показывают псевдопластическое течение с тиксотропией - реологические свойства, обязательные для загустителей и стабилизаторов эмульсий.

Градиент сдвига, 1 |с

Рис. 9. Кривые течения косметических эмульсий, содержащих ЭПС М. quaylei: 1 - контроль (без ЭПС); 2 - 0.02% масс; 3 - 0.1% масс.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что ЖК и их метиловые эфиры ускоряют рост и продукцию ЭПС М. quaylei. По способности стимулировать рост бактерии М. quaylei гидрофобные добавки в концентрации 50 мМ располагаются в ряду С1В:1>С18:0>С1б:0>метилолеат>метилстеарат>без добавок>С14:0>С12:о.

2. По данным о составе фракции свободных жирных кислот в клетках, величин ¡J-потенциала и анизотропии флуоресценции целых клеток установлено, что эффект ускорения роста метилотрофной бактерии М. quaylei экзогенными ЖК обусловлен включением их в состав наружной мембраны и изменением физико-химических свойств поверхности клетки, а также свойств липидного бислоя.

3. Оптимизированы условия получения (концентрация экзогенного олеата натрия, отношение источников углерода и азота C/N, концентрации фосфатов и хлорида кальция), выделения и очистки ЭПС М. quaylei.

4. Определен углеводный состав ЭПС М. quaylei: остатки D-глюкозы, L-рамнозы и D-галактозы в соотношении 5:2:1, а также фракционный состав: основная фракция (70%) ЭПС имеет молекулярную массу от 6.8-105 до 7.9-107 г/моль, а высокомолекулярная (13%) - 2,6-108. ЭПС М. quaylei аналогично бактериальному полисахариду ксантану содержит кислотные пирувшшденовые остатки (8,73%).

5. Установлено, что ЭПС М. quaylei образует вязкие псевдопластичные растворы с тиксотропными свойствами и обладает эмульгирующей активностью, стабилизирует эмульсии типа «масло в воде». ЭПС М. quaylei может быть использован для создания

препаратов стабильных косметических и лекарственных эмульсий, а также в составе буровых растворов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Отман С.A.M., Пшеничникова А.Б., Швец В.И. Влияние экзогенных жирных кислот на рост и продукцию экзополисахарида облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei. //Прикл. биохимия и микробиология. 2012. Т.48. №2. С.226-231.

2. Отман С.А.М.. Пшеничникова А.Б., Швец В.И. Экзополисахарид облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei: получение, очистка и изучение углеводного и фракционного состава. // Вестник МИТХТ. 2011. Т.6. №6. С.84-87.

3. Степичева H.A., Качегин С.А., Отман С.А.М.. Пшеничникова А.Б. Швец В.И. Текучесть биологических мембран как фактор адаптации метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei к стрессовым условиям. // Тезисы докладов IV Московского международного Конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 12-16 марта 2007 г. Т.2. С.89.

4. Степичева H.A., Качегин С.А., Отман С.А.М.. Пшеничникова А.Б. Влияние экзогенных жирных кислот на ростовые характеристики облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei в условиях осмотического и окислительного стрессов. // Аспирант и соискатель. 2007. №2. С.114-116.

5. Отман С.А.М.. Пшеничникова А.Б., Швец В.И. Влияние экзогенных жирных кислот на продукцию и состав экзополисахарида облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei. II Тезисы VI Московского Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 21-25 марта 2011 г. Москва. Т.1. С.360-361.

Подписано в печать 20.03.12 Заказ № 53 Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1 Тираж 100 экз. ООО «Генезис» 119571, г. Москва, пр-т Вернадского,86 (495) 936-88-35 (494) 434-83-55

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Отман Садек Ахмед Мукред, Москва

61 12-2/413

Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова

На правах рукописи

Отман Садек Ахмед Мукред

Повышение уровня секреции внеклеточного полисахарида и выхода биомассы облигатной метилотрофной бактерии МеШу1орМ1т (¡иауШ в присутствии экзогенных жирных кислот и их сложных эфиров

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент Пшеничникова Анна Борисовна

Москва - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4

ВВЕДЕНИЕ 5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1.1. Метаболизм жирных кислот у бактерий 9

1.1.1. Биосинтез жирных кислот у Escherichia coli 9

1.1.2. Деградация жирных кислот 12

1.1.3. Регуляция экспрессии бактериальных десатураз 13

1.2. Изменения состава мембранных липидов в процессе адаптации бактерий

к стрессовым условиям 16

1.2.1. Влияние температуры на состав мембранных липидов 16

1.2.2. Влияние осмотического стресса на состав мембранных липидов 17

1.2.3. Влияние давления на состав мембранных липидов 18

1.2.4. Влияние добавления спиртов 18

1.3. Влияние экзогенных свободных жирных кислот и их производных

на рост и жизнедеятельность бактерий 20

1.3.1. Ингибирование роста в присутствии свободных жирных кислот 20

1.3.2. Ингибирование роста бактерий в присутствии экзогенных производных жирных кислот 23

1.3.3. Усиление роста бактерий в присутствии свободных жирных кислот 23

1.4. Транспорт жирных кислот через мембрану грамотрицательных бактерий 24

1.4.1. Транспорт жирных кислот через мембрану без участия белков 25

1.4.2. Транспорт жирных кислот через мембрану с участием белков 26

1.4.3. Энергетика процесса транспорта жирных кислот через мембрану 28 1.5. Регуляция липидного состава путем введения экзогенных ЖК 29

1.6. Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования 30

1.6.1 .Хемиосмотическая гипотеза Митчелла 3 0

1.6.2. Окислительное фосфорилирование у бактерий 32

1.6.3. Разобщители биоэнергетической работы 33

1.6.4. Жирные кислоты как разобщители окислительного

фосфорилирования 34

1.7. Жирные кислоты как ауторегуляторные метаболиты, необходимые

для межклеточной коммуникации 38

1.7.1. Восприятие кворума («Quorum sensing») 3 8

1.7.2. Жирные кислоты как ауторегуляторные метаболиты 39

1.8. Морфогенетические изменения бактерий под действием экзогенных

жирных кислот 43

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 45

2.1. Влияние экзогенных жирных кислот и их сложных эфиров на рост

и продукцию внеклеточного полисахарида Methylophilus quaylei 46

2.1.1. Изучение кинетики ростаМ quaylei и секреции внеклеточного полисахарида в присутствии жирных кислот и их метиловых эфиров 46

2.1.2. Влияние олеиновой кислоты на продукцию внеклеточного полисахаридам quaylei 51

2.1.3. Влияние олеата натрия на рост М. quaylei и секрецию полисахарида 52

2.1.4. Фракционирование и анализ липидного состава бактерий М. quaylei методом ТСХ на силикагеле 54

2.1.5. Анализ жирнокислотного состава фракций липидов методом хромато-масс-спектрометрии 57

2.1.6. Влияние экзогенного метилстеарата на жирнокислотный состав

М quaylei 61

2.1.7. Изучение физико-химических свойств поверхности клеток

М. quaylei и свойств липидного бислоя 63

2.2. Получение, очистка и изучение углеводного и фракционного состава полисахарида М. quaylei 65

2.2.1. Оптимизация состава питательной среды методом

математического планирования эксперимента 65

2.2.2. Разработка методов выделения внеклеточных полисахаридов

М. quaylei 68

2.2.3. Анализ состава внеклеточного полисахаридам quaylei 70

2.2.4. Исследование фракционного состава внеклеточного полисахарида

М quaylei методом гель-хроматографии 72

2.3. Изучение эмульгирующих и реологических свойств растворов,

содержащих внеклеточные полисахариды М quaylei 74

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 82 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94 ВЫВОДЫ 106

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОБ - алкилоксибензолы

АСР - ацилпереносящий белок

БКЖ - бесклеточная культуральная жидкость

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВБ - высушенная биомасса

СоА - кофермент А

ДЦЖК - длинноцепочечные жирные кислоты

ДФГ - 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен

ЖК - жирные кислоты;

КОЕ - колониеобразующие единицы

КЖ - культуральная жидкость

ККМ - критическая концентрация мицеллообразования

МЭЖК - метиловые эфиры жирных кислот

НЛ - нейтральные липиды

ОК - олеиновая кислота

ОБ - оптическая плотность

СК - стеариновая кислота

ТСХ - тонкослойная хроматография

ТФУ - трифторуксусная кислота

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ФГ - фосфатидилглицерин

ФК - фосфатидная кислота

ФЛ - фосфолипиды

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭ - фосфатидилэтаноламин

ЦТАБ - цетилтриметиламмоний бромид

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПС - экзополисахарид

ВВЕДЕНИЕ

Поиск компонентов питательных сред, ускоряющих рост бактерий - продуцентов биомассы и внеклеточных метаболитов - актуальная задача биотехнологии. Перспективными для управления метаболическими процессами у бактерий являются ауторегуляторные вещества, относящиеся по химической природе к свободным жирным кислотам (СЖК) [1-3]. Участие этих соединений в биохимических процессах в клетке отражается на свойствах мембраны, играющей ключевую роль, как в структурной организации, так и в функционировании клеток. Жирные кислоты (ЖК) с длиной цепи от С и до С20 представляют собой уникальные природные вещества, которые в виде производных - липидов - являются структурными компонентами клеточных мембран, выполняют энергетические и регуляторные функции. Кроме этого свободные жирные кислоты обладают разнообразной биологической активностью и прежде всего -антимикробной (активны против вирусов, бактерий, грибов, водорослей, простейших) и цитотоксической [4,5]. Бактерицидное действие свободных жирных кислот наблюдали по отношению как к грамположительным бактериям (родов Streptococcus [6-8], Staphylococcus [9-12], Bacillus [12-15], Lactobacillus [16], Mycobacterium [17,18] и других [4,19]), так и грамотрицательным (родов Escherichia [12,14,20], Pseudomonas [15], Neisseria [15], Salmonella [14,15], Helicobacter [21,22] и других [4,19]).

Несмотря на большой научный интерес к биологическим функциям свободных жирных кислот, механизм их бактерицидной активности изучен не достаточно. Известно, что основной мишенью является клеточная мембрана и процессы в ней протекающие -функционирование электронтранспортной цепи, окислительное фосфорилирование, ферментативные процессы, транспорт питательных веществ, перекисное окисление липидов [5].

Свободные жирные кислоты являются компонентами врожденного иммунитета и присутствуют на коже, в грудном молоке и кровотоке человека и животных [23], где выполняют защитные функции. Наиболее детально изучена активность жирных кислот, особенно олеиновой, по отношению к бактериям родов Staphylococcus и Streptococcus -наиболее распространенных возбудителей инфекций кожи и других органов человека [611]. В концентрациях, не вызывающих цитотоксического действия, олеиновая кислота разрушает клеточные стенки и приводит к гибели популяции Staphylococcus aureus [10]. По мнению авторов [10-11] в качестве антимикробных веществ жирные кислоты являются альтернативой традиционным антибиотикам, применение которых часто приводит к формированию лекарственной устойчивости у патогенных бактерий. Использование жирных кислот предлагается авторами [10-11] в качестве элемента новой антимикробной

стратегии, основанной на свойствах врожденного неспецифического иммунитета. Бактерицидная активность олеиновой кислоты против S. aureus возрастает в составе липосом [11].

Экзогенно добавленные в среду культивирования бактерий жирные кислоты в определенных концентрациях ускоряют рост, повышают выживаемость некоторых бактерий в неблагоприятных условиях, например лактобацилл [1,24,25]. Более того, жирные кислоты являются необходимыми ростовыми факторами для таких бактерий, как бактерии родов Lactobacillus, Corynebacterium, Clostridium [26,27].

Бактерицидный или ростостимулирующий эффект жирных кислот определяется их строением (особенно важно количество, а иногда и положение двойных связей), видом бактерии, концентрацией жирной кислоты и условиями культивирования [4,26]. Недавно было показано, что наличие свободных жирных кислот в составе модельных мембран способствует образованию участков небислойной обращенной гексагональной структуры наряду с ламеллярной в широком интервале температур. Молекула жирной кислоты встраивается в мембрану, образует водородные связи с молекулами воды и соседними аминогруппами молекул фосфатидилэтаноламина и влияет на свойства бислоя [28]. Способность свободных жирных кислот влиять на структуру биологических мембран используется в новом направлении фармакологии - мембрано-липидной терапии [29]. Так, олеиновая кислота (ОК), увеличивая отрицательную кривизну мембраны, активирует ряд важных белков, способных ингибировать клеточную пролиферацию и индуцировать апоптоз: G-белков, протеинкиназы С, белков теплового шока. Возможно, этот механизм объясняет ускорение роста бактерий - лактобацилл, коринебактерий [24-26], а также индукцию реактивации покоящихся форм микобактерий в присутствии олеиновой кислоты [30]. Однако, несмотря на большой научный интерес к функциям свободных ЖК в последнее время, механизм их биологической активности изучен не достаточно.

Перспективной моделью для такого рода исследований являются метилотрофные бактерии, не использующие ЖК в качестве субстрата. Работа с такими моделями исключает вероятность стимулирования роста за счет возможности метаболизировать ЖК. Многие облигатные метилотрофные бактерии, использующие в качестве единственного источника углерода доступный метанол, характеризуются способностью секретировать внеклеточные полисахариды или экзополисахариды (ЭПС) и являются перспективными продуцентами биомассы и ЭПС [31,32]. Бактериальные ЭПС - биополимеры, обладающие уникальными реологическими свойствами, эмульгирующей активностью и способностью формировать гели. Сферы применения микробных экзополисахаридов чрезвычайно разнообразны: нефте- и горнодобывающая, текстильная, пищевая, фармацевтическая,

химическая промышленности и медицина. Потребность в этих полимерах постоянно растет, однако спрос на них удовлетворяется не полностью.

Цели и задачи исследования:

Целью настоящей работы явилось изучение влияния экзогенных жирных кислот на выход биомассы и повышение уровня секреции внеклеточного полисахарида облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei, а также оптимизация условий его получения и выделения.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

- исследование влияния экзогенных ЖК и их метиловых эфиров на рост и продукцию внеклеточного полисахарида М. quaylei;

- фракционирование клеточных липидов из биомассы, полученной в присутствии олеиновой кислоты и стеариновой кислоты (СК), а также определение жирнокислотного состава фракций свободных ЖК и фосфолипидов;

- исследование физико-химических свойств интактных клеток М. quaylei, выращенных в стандартных условиях и в присутствии экзогенной ОК - величины С,-потенциала (методом электрофоретического рассеяния) и текучести мембран (по величинам анизотропии флуоресценции с использованием в качестве гидрофобного зонда 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена (ДФГ);

- оптимизация условий биосинтеза, методы выделения и очистки ЭПС, изучение углеводного и фракционного состава ЭПС М. quaylei;

- изучение реологических и эмульгирующих свойств растворов, содержащих ЭПС.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Метаболизм жирных кислот у бактерий

Синтез ЖК является жизненно важным аспектом клеточного метаболизма. В природе существуют 2 основных типа синтаз ЖК. Прототипы ЖК-синтазной системы I обнаружены в клетках млекопитающих и состоят из одиночного гена, производящего полипептид, содержащий все реакционные центры, необходимые для биосинтеза ЖК. В клетках низших эукариотов есть 2 гена, и их полипептидные продукты образуют многофункциональный комплекс. ЖК-синтазная система типа II обнаружена у бактерий и растений. Она является диссоциированной системой, в которой каждый компонент кодируется отдельным геном, который производит уникальный белок, катализирующий одну стадию процесса синтеза ЖК [33].

Двумя важными кофакторами в синтезе ЖК являются СоА и АСР, которые участвуют в переносе растущей ацильной цепи от одного фермента к другому и обеспечивают предшественников для реакции конденсации [34].

Метаболизм ЖК может рассматриваться как 4-стадийный процесс [35]:

- синтез насыщенных ЖК, преимущественно пальмитиновой кислоты, из ацетил-СоА;

- модификация (удлинение цепи, введение двойных связей или гидроксилирование);

- введение в липиды;

- катаболизм до ацетил-СоА ф-окисление).

1.1.1. Биосинтез жирных кислот у Escherichia coli

Модельной системой для изучения биохимии ЖК-синтазной системы типа II является E.coli. Помимо многих преимуществ использования этой бактерии в качестве модели, важно, что в липидах мембраны содержатся только три основных ЖК (пальмитиновая, пальмитолеиновая и цис-вакценовая), и три вида ФЛ (ФС, ФЭ и ФХ) [34].

Предшественники для реакции конденсации (ацетил-СоА и малонил-СоА) образуются из ацетил-СоА пула. Малонил-СоА требуется для всех стадий удлинения цепи и образуется на первой ступени биосинтеза ЖК. Ацетил-СоА карбоксилаза состоит из четырех отдельных белков: биотин-карбоксилазы, биотин-карбоксил-переносящего белка и двух субъединиц, необходимых для ступени переноса карбоксила (рис.1). Малонил-СоА становится доступным для ферментов биосинтеза ЖК путем превращения его в малонил-АСР с помощью малонил-СоА:АСР трансацилазы.

CARBOXYLTRANSFERASE

MALONYL CoA ACETYL CoA

Рис. 1. Реакции, катализируемые ацетил-Co А карбоксилазой [34].

Существуют 3 возможных механизма для инициации биосинтеза ЖК у E.coli (рис.2) [34]. Первый состоит в том, что ß-кетоацил-АСР синтаза III катализирует конденсацию ацетил-Co А с малонил-АСР с получением ацетоацетил-АСР.

Согласно второму механизму ацетат переносится от ацетил-СоА к ацетил-АСР либо ацетил-СоА:АСР трансацилазой, либо конденсирующим ферментом III. Затем ацетил-АСР конденсируется малонил-АСР конденсирующим ферментом I (или альтернативно конденсирующим ферментом И). По третьему механизму малонил-АСР декарбоксилируется синтазой I с формированием ацетил-АСР с последующей конденсацией малонил-АСР (рис.2).

Реакции удлинения цепи представлены на рис. 3. Первый шаг - конденсация малонил-АСР с растущей ацильной цепью с помощью ß-кетоацил-АСР синтазы. Это -единственная необратимая стадия цикла удлинения. Получающийся кетоэфир восстанавливается NADPH-зависимой редуктазой, за чем следует удаление воды ß-гидроксиацил-АСР дегидратазой. Конечное восстановление катализируется еноил-АСР-редуктазой с образованием ацил-АСР, которая в свою очередь, служит субстратом для следующего цикла удлинения.

Специфичный дегидразный фермент ß-гидроксидеканоил-АСР дегидраза (продукт fabA-гена) катализирует ключевую реакцию, на основе которой происходит биосинтез ненасыщенных ЖК из насыщенных ЖК. Эта дегидраза катализирует реакцию дегидратации (рис. 3), однако также способна изомеризовать транс-2-деценоил-АСР до цис-З-деценоил-АСР.

о

СНз-С-БСоА

Л ^ 1 Л АТА, КАв III

Рис.2. Пути инициации биосинтеза ЖК [34].

Таким образом, БаЬА дегидраза необходима для синтеза ненасыщенных ЖК. Однако, этот белок - не единственный генный продукт, необходимый для синтеза ненасыщенных ЖК. Мутанты по |3-кетоацил-АСР синтазе I (1аЬВ) показывают, что продукт fabB гена также требуется для производства ненасыщенных ЖК.

Конечная стадия пути биосинтеза ЖК заключается в переносе ацильных цепей ацил-АСР конечных продуктов в мембранные фосфолипиды глицерофосфатной

ацилтрансферазной системой. Первый фермент переносит ЖК в 1-положение бп-глицерол-3-фосфата, а второй этерифицирует 2 положение глицерольного остова. Как и большинство фосфолипидов в природе, бактериальные фосфолипиды имеют ассиметричное распределение ЖК между 1 и 2 положениями глицерофосфатного остова, что контролируется частично специфичностью ацильных цепей к двум ацилтрансферазам. Глицерофосфатная ацилтрансферазная система не является частью системы биосинтеза ЖК, однако ее активность по отношению к скорости биосинтеза ЖК действительно влияет на структуру ЖК, обнаруженных в мембранных фосфолипидах [34].

1.1.2. Деградация жирных кислот

ЖК могут деградироваться путем р-окисления. Р-окисление - это циклический четырехступенчатый процесс, при котором происходит постепенное уменьшение длины молекулы ЖК на два углеродных атома с карбоксильного конца [36,37]. Первым этапом распада ЖК является их активирование, катализирующееся ацил-СоА-синтетазой. Для процесса активации необходима энергия в форме АТФ. Первой стадией является окисление ацил-СоА путем отщепления двух атомов водорода от а и (3-углеродных атомов ацила коферментом соответствующей дегидрогеназы, далее происходит присоединение молекул воды таки�