Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных в кремнийорганические золь-гель матрицы микроорганизмов

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованных в кремнийорганические золь-гель матрицы микроорганизмов"

На правах рукописи

КАМАНИНА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В КРЕМНИЙОРГАНИЧЕСКИЕ ЗОЛЬ-ГЕЛЬ МАТРИЦЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

6 НОЯ 2014

Москва-2014

005554330

005554330

Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета

Научный руководитель: доктор химических наук, доцент, заведующий кафедрой биотехнологии ПОНАМОРЕВА Ольга Николаевна (ФГБОУ ВПО Тульский государственный университет)

Официальные оппоненты: доктор химически наук, профессор, заведующий кафедрой технологии химико-фармацевтических и косметических средств АВРАМЕНБО Григорий Владимирович (ФГБОУ ВПО Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева)

доктор биологических наук, старший научный

сотрудник лаборатории выживаемости

микроорганизмов

МУЛЮКИН Андрей Львович

(ФГБУН Институт микробиологии

им. С.Н. Виноградского РАН)

Ведущая организация: ФГБУН Ипститут химии растворов

им. Г.А. Крестова РАН

Защита диссертации состоится «22» декабря 2014 года в 15:00 на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова» по адресу 119571, Москва, пр-т Вернадского, д. 86, аудитория М-119.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова» и на интернет-сайте МИТХТ им. М Б. Ломоносова http://www.mitht.ru. С авторефератом можно ознакомиться на интернет-сайтах ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru и МИТХТ им. М.В. Ломоносова http://wvvw.mitht.ru

Автореферат разослан «22» октября 2014 г. Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 212.120.01, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник /! /> А.И. Лютик

п /¿А,—

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования-

В процессе эволюции природных систем живые организмы развивают различные минерализованные структуры, которые представляют собой сложные иерархические архитектуры на основе композитных биоматериалов. Важнейшая функция таких систем — защита организмов и генетического материала своего вида от неблагоприятных условий. Примерами одноклеточных организмов с минеральной оболочкой являются диатомные водоросли и радиолярии. Эти организмы эволюционировали таким образом, что стали способны формировать силикатные капсулы на своей поверхности, образуя экзо-скелет для обеспечения механической защиты. При этом силикатная капсула не препятствует поступлению питательных веществ в клетку. Такие одноклеточные системы вдохновили исследователей на создание биоматериалов на основе живых клеток, инкапсулированных в неорганические полимерные капсулы.

Особый интерес представляет инкапсулирование биоматериала в кремнийорганические золь-гель матрицы, которые обеспечивают сохранение биологической активности, эффективную защиту от механического, теплового и биологического воздействия. Золь-гель метод позволяет получать материалы с различным размером пор, не требует энергоемкого, дорогого оборудования, является экономичным и экологически чистым. К достоинствам метода можно отнести простоту и экспрессность получения нетоксичной матрицы, сохраняющей постоянный объем независимо от состава среды. Важно отметить, что в подавляющем большинстве случаев золь-гель технологии используют для иммобилизации ферментов. Использование кремнийорганических матриц на основе модифицированных силикагелей для иммобилизации целых клеток является относительно новой задачей. Исследования в этом направлении представляют значительный интерес для разработки эффективных гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных микроорганизмов в биотехнологии, в том числе при разработке биосенсоров.

К недостаткам золь-гель метода относится выделение метанола или этанола, так как спирты токсичны для клеток многих микроорганизмов. Метилотрофные дрожжи и уксуснокислые бактерии характеризуются эффективной ферментативной системой окисления спиртов, поэтому их иммобилизация в золь-гель матрицы не должна приводить к потере активности клеток под действием образующегося в процессе конденсации спирта. Следует отметить, что микробные сенсоры на основе метилотрофных дрожжей и уксуснокислых бактерий находят применение в биотехнологии и пищевой промышленности для мониторинга ферментационных процессов и контроля стоков производств.

Таким образом, разработка стабильных гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных в кремнийорганические золь-гель матрицы ферментов и

1 Работа выполнена при поддержке грантов ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы», соглашение № 14.574.21.0062 и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы», соглашение № I4.B37.21.1231, а так же Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере по программе «Участник молодежного научно-инновационного конкурса», 2013 г. (г. Липецк), госконтракт № 2244ГУ1/2013.

целых клеток микроорганизмов, которые можно использовать, в том числе, как биораспознающие элементы биосенсора, является актуальной задачей для экологии, биотехнологии и биоаналитической химии.

Цель работы:

Выявление закономерностей формирования ЗО-архитектуры

биокремнийорганической золь-гель матрицы под влиянием клеток микроорганизмов для разработки гетерогенных биокатализаторов.

Задачи работы:

• Выявить динамику золь-гель процессов, протекающих в системе силановых прекурсоров метилтриэтоксисилана (МТЭС) и тетраэтоксисилана (ТЭОС) и порообразователя полиэтиленгликоля (ПЭГ) в условиях основного катализа методом ИК-спектроскопии.

• Исследовать структуру гибридных биоматериалов, полученных путем иммобилизации уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydons и метилотрофных дрожжей Pichia angusta в кремнийорганические матрицы, с использованием методов ИК-спектроскопии, сканирующей электронной микроскопии и оптической микроскопии. Выявить влияние соотношения кремнийорганических прекурсоров (ТЭОС и МТЭС) и порообразователя (ПЭГ 3000) на 3D структуру образующихся материалов, их морфологию и степень инкапсулирования микроорганизмов.

• Изучить динамику инкапсулирования клеток микроорганизмов в выбранных условиях.

• Определить влияние соотношения силановых прекурсоров и стрессовых факторов (ионов тяжелых металлов и УФ излучения) на дыхательную активность микроорганизмов, иммобилизованных в золь-гель матрицы, в биораспознающем элементе сенсора.

• Исследовать возможность применения разработанных гетерогенных биокатализаторов для очистки и контроля метанолсодержащих стоков и мониторинга содержания этанола в процессе брожения.

Научная новизна

Впервые установлено, что метилотрофные дрожжи Pichia angusta и уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans участвуют в самоорганизованном формировании архитектуры гибридной биокремнийорганической матрицы, причем архитектура зависит от типа микроорганизма.

Впервые установлена возможность инкапсулирования метилотрофных дрожжей Pichia angusta в бимодальные кремнийорганические матрицы с использованием золь-гель технологий как способа получения стабильных гетерогенных биокатализаторов. Показано, что выделяющийся в ходе золь-гель процессов спирт не оказывает токсического действия на эти микроорганизмы.

Изучена динамика образования капсулы вокруг каждой дрожжевой клетки методом оптической микроскопии. Показано, что в условиях основного катализа фторидом натрия капсулы вокруг клеток дрожжей формируются в течение пяти часов. Результаты исследования вносят вклад в развитие методов получения «искусственных спор» на основе инкапсулированных клеток.

Впервые показано, что 3D архитектура гибридных биоматериалов определяется соотношением кремниевых прекурсоров МТЭС и ТЭОС, это находит отражение в свойствах биокатализатора.

Практическая значимость

Работа вносит практический вклад в разработку гетерогенных биокатализаторов. Предложенный метод иммобилизации прост в исполнении и позволяет получать стабильные, высокочувствительные гетерогенные биокатализаторы, не требует энергоемкого, дорогостоящего оборудования и позволяет получать материалы сложного химического состава и структуры.

Разработана методика инкапсулирования метилотрофных дрожжей с помощью золь-гель технологии для получения стабильных биочувствительных гетерогенных биокатализаторов, которые можно использовать для тиражирования стандартных биораспознающих элементов сенсоров, гетерогенных биокатализаторов как компонентов биофильтров для очистки стоков химических и биотехнологических производств.

Выявлено, что кремнийорганическая капсула, которая формируется вокруг живых клеток метилотрофных дрожжей Pichia angusta, обеспечивает защиту иммобилизованных микроорганизмов в стрессовых условиях (присутствие ионов тяжелых металлов, облучение УФ), что можно использовать для периодической стерилизации биосенсорной системы. Это позволит избежать микробной контаминации и дополнительно увеличит воспроизводимость анализа, основанного на изменении дыхательной активности микроорганизмов.

Разработаны и апробированы макеты биосенсора для определения содержания этилового спирта в образцах бродильной массы и утилизации метилового спирта в метанолсодержащих стоках химических производств. Методика анализа с использованием разработанных макетов биосенсора характеризуется быстротой, высокой чувствительностью, низкой стоимостью.

Разрабатываемый гетерогенный биокатализатор на основе метилотрофных дрожжей, иммобилизованных в кремнийорганическую матрицу, использован при разработке модельных биофильтров, которые перспективны для утилизации метанола в стоках промышленных производств.

Апробация работы и публикации

Результаты работы докладывались на VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 19-22 марта 2013 г.) (диплом победителя и медаль конкурса)-, Всероссийских конференциях с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология» (Тула, 2010, 2011, 2012, 2013 гг. (диплом победителя конкурса); 17-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 21-26 апреля 2013 года) (сертификат участника немецко-русского форума); II Тульском инновационном конвенте (диплом финалиста)', Европейской выставке научно технического творчества молодёжи EXPO-SCIENCES EUROPE 2012 (диплом победителя), а так же на Третьей международной конференции стран СНГ Золь-гель синтез и исследование неорганических соединений, гибридных функциональных материалов и дисперсных систем «Золь-гель-2014». По теме диссертации опубликовано 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК, 11 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций, получен 1 патент.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Метилотрофные дрожжи Pichia angusta и уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans участвуют в самоорганизованном формировании архитектуры гибридной

биокремнийорганической матрицы, причем архитектура зависит от типа микроорганизма.

2. Поведение разных дрожжей при инкапсулировании в кремнийорганические матрицы одинаково. Инкапсулирование не зависит от типа дрожжей, а зависит только от соотношения силановых прекурсоров.

3. Клетки микроорганизмов являются центрами формирования кремнийорганических капсул, и в условиях основного катализа процесс инкапсулирования заканчивается через 5 часов.

4. Кремнийорганическая капсула, которая формируется вокруг клеток метилотрофных дрожжей Pichia angusta, обеспечивает защиту иммобилизованных микроорганизмов в стрессовых условиях (присутствие ионов тяжелых металлов, облучение УФ).

5. Разрабатываемый гетерогенный биокатализатор на основе метилотрофных дрожжей, иммобилизованных в кремнийорганическую матрицу, использован при разработке модельных биофильтров, которые перспективны для утилизации метанола в стоках промышленных производств.

Место проведения работы2. Экспериментальная часть работы выполнялась на кафедре Химии ЕНФ ФГБОУ ВПО Тульский государственный университет.

Структура и объем работы

Работа состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Результатов и их обсуждения, Выводов и Списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена на 106 страницах, содержит 46 рисунок и 15 таблиц. Список литературы включает 99 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложены актуальность темы, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи исследования.

Глава 1. В первой главе приводится анализ научно-технической литературы, посвященной исследованиям по разработке гетерогенных биокатализаторов на основе кремнийсодержащих золь-гель матриц, изучению их структуры и свойств.

Глава 2. Во второй главе дано описание методов исследования. В работе использованы: штаммы дрожжей Pichia angusta ВКМ Y-2559, Cruptococcus curvatus ВКМ Y-3288, бактериальный штамм Gluconobacter oxydons subsp. industrius ВКМ B-1280 (Всероссийская коллекция микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН).

Иммобилизация биоматериала и формирование электрода

К раствору ПЭГ 3000 в фосфатном буферном растворе прибавляли суспензию клеток ((1,3±0,1)-109 КОЕ/см3) в фосфатном буферном растворе и перемешивали в течение 3 минут (Elmi СМ-70М07, Польша), добавляли смесь ТЭОС и МТЭС и вновь перемешивали в течение 3 минут. В работе использовали смеси с содержанием гидрофобной добавки МТЭС: 0, 10, 33, 50, 67, 80, 83, 85, 90 и 100 % об. по отношению к общему объему силановых прекурсоров. Затем добавляли раствор катализатора NaF, перемешивали 15 минут. Через 24 часа наносили 0,005 см3 полученного гетерогенного биокатализатора на пористый стекловолоконный фильтр

2 данные по сканирующей электронной микроскопии и оптической микроскопии получены в

лаборатории цитологии микроорганизмов ИБФМ РАН им. Г.К. Скрябина в сотрудничестве с

к.б.н. Мачулиным A.B. и к.б.н. Сузиной Н.Е.

(Whatman GF/A, Sigma) и подсушивали 15 минут. Полученный биорецепторный элемент наносили на поверхность кислородного электрода (ООО Кронас, Россия), перед использованием промывали фосфатным буферным раствором в течение 5 минут.

Биосенсорные тмерення

Исследования проводили на электрохимической установке, основными элементами которой являются кислородный электрод и потенциостат IPC 2000 (ООО НТФ Вольта, Россия). Между полупроницаемой мембраной кислородного электрода Кларка и защитным колпачком помещали рецепторный элемент на основе иммобилизованных микроорганизмов. Измерения проводили при рабочем потенциале -700 мВ в кювете объемом 4 см3 с использованием натрий-калиевого фосфатного буферного раствора. Измеряемым параметром (ответом биосенсора) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала потенциостата после добавления определяемого вещества в измерительную кювету (нА/мин).

Для изучения влияния ионов тяжелых металлов на дыхательную активность иммобилизованных микроорганизмов, перед внесением в измерительную кювету субстрата, к фоновому раствору добавляли соли тяжелых металлов до необходимого их содержания в конечном растворе. Ответ биосенсора в присутствии метанола определяли, как описано выше. При оценке влияния УФ на дыхательную активность иммобилизованных микроорганизмов полученные гетерогенные биокатализаторы облучали УФ (254 нм). Интенсивность облучения составляла 680 мкВт/см2. После облучения фрагмент стекловолоконного фильтра с иммобилизованными клетками (3x3 мм) помещали на поверхность кислородного электрода Кларка и фиксировали с помощью нейлоновой сетки, перед использованием промывали фосфатным буферным раствором в течение 5 минут.

Хроматографнческие измерения

Определение содержания этилового спирта в образцах проводили газохроматографическим методом, на хроматографе «Кристал-5000.2» (Хроматэк, Россия) с использованием пламенно-ионизационного детектора и капиллярной колонки DB-FFAP (50мх0,32ммх0,50мкм) (Agilent, США). Условия анализа: температура термостата колонки - 70°С, температура испарителя - 200 СС, температура детектора - 250 °С, скорость потока газа-носителя (гелия) - 0,10 дм3/час.

ИК-спектроскопия

ИК-спектры растворов прекурсоров и золь-гель систем регистрировали с помощью инфракрасного Фурье-спектрометра ФМС 1201 (ООО «Мониторинг», Россия), используя приставку МНПВО (многократно нарушенного полного внутреннего отражения) горизонтального типа с призмой из селенида цинка (разрешение 4 см'1). При изучении кинетики формирования золь-гель матрицы ИК-спектры исследуемых образцов фиксировали в течение 65 минут с интервалом в 5 мин.

Оптическая микроскопия

Для регистрации процесса инкапсуляции дрожжевых клеток в кремнийорганическую золь-гель матрицу был использован оптический световой микроскоп Nikon Eclipse Ci (Nikon, Япония) оборудованный камерой ProgRes SpeedXT core5 (Jenoptik, Германия). Наблюдение проводили в фазовом контрасте.

Изучение структуры получившейся матрицы методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)

Электронно-микроскопический анализ образцов проводили с помощью сканирующего электронного микроскопа JSM-6510 LV ("JEOL", Япония) в режиме низкого вакуума (30 Па) при регистрации обратно-отраженных электронов (BSE) а также в режиме высокого вакуума при регистрации вторичных электронов (SE). Образцы кремнийорганической золь-гель матрицы и клеточную суспензию наносили на поверхность токопроводящего скотча, который закрепляли на металлическом диске - объектодержателе. Затем на поверхность образца напыляли тонкий слой платиново-углеродной смеси. Напыление осуществляли в вакуумно-напылительной установке JEE-4X ("JEOL", Япония). Для приготовления образцов клеток клеточную суспензию (108 КОЕ/см3) наносили на поверхность токопроводящего скотча, после 5 минут инкубации каплю удаляли с помощью фильтровальной бумаги, поверхность промывали несколько раз водой, для удаления не связанных с поверхностью клеток.

Моделирование процесса спиртового брожения

Образец пшеничной муки суспендировали в тёплой дистиллированной воде и нагревали до 90°С. В полученную массу добавляли ферментный препарат Termamyl ("Novozymes A/S", Дания) и термостатировали 2 часа при перемешивании. После чего отбирали первую пробу, реакционную массу охлаждали до 60°С и добавляли ферментный препарат SAN Super 360L ("Novozymes A/S", Дания), помещали в термостат и перемешивали 2 часа. После этого охлаждали колбу до 30°С, добавляли дрожжевой препарат SuperStart (Россия) и термостатировали 120 часов для брожения.

Статический режим деградации метанола

В 10 мл 1%-ого раствора метанола, погружали стекловолоконный фильтр GF в нанесенными на него иммобилизованными микроорганизмами в золь-гель матрицу с содержанием МТЭС 85% об. Площадь рабочей поверхности фильтра составляет 2,058-Ю'3 м2. Смесь выдерживали при постоянном перемешивании, периодически отбирая пробы для анализа. Определение содержания метилового спирта в образцах проводили газохроматографическим методом, на хроматографе «Кристал-5000.2» (Хроматэк, Россия) с использованием пламенно-ионизационного детектора и капиллярной колонки DB-FFAP (50мх0,32ммх0,50мкм) (Agilent, США). Условия анализа: температура термостата колонки - 70°С, температура испарителя - 200°С, температура детектора - 250°С, скорость потока газа-носителя (гелия) - 0,10 дм3/час.

Динамический режим деградации метанола

Для набивки колонны использовали стеклянные шарики диаметром 3,3 ±0,3мм. Для активации поверхности шариков перед использованием их на сутки оставляли в 0,1М растворе HCl. Для нанесения на поверхность шариков иммобилизованного биоматериала в бюкс с готовой смесью засыпали 80 шариков с общей площадью поверхности 2,573-10"3м2. После этого набивали шариками хроматографическую колонну и промывали буферным раствором (рН=7,6) до полного очищения от этанола. Между измерениями колонну оставляли заполненной буферным раствором.

Глава 3. В третьей главе приведены основные результаты работы и их обсуждение.

Динамика формирования кремнийорганических золь-гель структур

Формирование золь-гель матриц проводили в условиях основного катализа фторидом натрия при использовании силановых прекурсоров ТЭОС И МТЭС. Для создания бимодальной золь-гель структуры с микро- и нанопорами дополнительно вносят органические полимеры, которые выполняют роль порообразователей. В качестве порообразователя использовали полиэтиленгликоль, который позволяет

избежать чрезмерного уменьшения пор при старении геля. Процессы формирования структур гибридных золь-гель матриц изучали методом ИК-спектроскопии.

0,6

О *

с V с s 0.5

Ü S с В 0,4 Е 0.3

1 & S Я 1о-2

Ф к 1 Э- 9 0,1 со

М 0,0

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 50 Волновое число, см"1

— МТЭС, ТЭОС, rar.NaF МТЭС. ТЭОС ПЭГ - МТЭС.ТЭОС, NaF

; 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Время формирования матрицы, мин

Рис. 1. ИК-спектры золь-гель матрицы (50% об. МТЭС, 50% об. ТЭОС, ПЭГ 3000, катализатор ЫаР) полученные в течение 65 минут с интервалом в 5 минут

Рис.2 Кинетические кривые

формирования золь-гель матриц на основе МТЭС, ТЭОС в условиях основного катализа (содержание 50% об.

МТЭС и 50% об. ТЭОС)

В ИК-спектрах МТЭС содержится интенсивная полоса поглощения 1270 см"1,

которая соответствует деформационным колебаниям Si-СНз-групп, не

подвергающихся гидролизу. Это позволяет нормировать интенсивности

деформационных полос поглощения воды по полосе 1270 см"1 (Ii64</Ii27o) (Рис- !)■ По

нормированным интенсивностям деформационных полос поглощения воды можно

судить о степени конденсации в золь-гель матрицах. На рисунке 2 представлены

кинетические кривые формирования золь-гель матрицы при использовании 50 % об.

МТЭС и 50 % об. ТЭОС. Кинетические зависимости процессов, протекающих при

других соотношениях силановых прекурсоров аналогичны зависимостям,

представленным на рисунке 2. Максимальной скоростью характеризуются процессы

поликонденсации при наличии в системе ПЭГ и катализатора, в этом случае они

завершаются в течение 15 минут (кривая 3, рис. 2), что необходимо учитывать при

иммобилизации микроорганизмов. Поскольку количество ОН-групп в соединениях

(Н20 и ROH), выделившихся в ходе поликонденсации, прямо пропорционально

количеству образовавшихся связей Si-O-Si, число последних можно оценить при

помощи следующих соотношений (1-3): л 2,5 -

0,0

[ОЯ]

А™ [Si-CH,]

А 270

[ОЯ] = количество [Я-О-&']

(1) (2) (3)

ю

20 30 40 50 60 70 80 90 100 Содержание МТЭС, % об.

Рис. 3 Зависимость количества связей 81-0-81 от содержания гидрофобной добавки МТЭС

Максимальное количество образовавшихся связей 81—О—наблюдается в структуре, полученной при использовании 50% об. МТЭС (рис. 3), поскольку в этом случае количество наиболее активных нуклеофилов (81((Ж)3СН3) и наиболее активных субстратов (ЗКОЬВД равно.

Изучение структуры получаемых матриц

К недостаткам золь-гель метода относится выделение низших спиртов, которые токсичны для клеток многих микроорганизмов. Метилотрофные дрожжи и уксуснокислые бактерии характеризуются эффективной ферментативной системой окисления спиртов, поэтому их иммобилизация в золь-гель матрицы не должна приводить к потере активности клеток под действием образующегося в процессах гидролиза и конденсации спирта. Поэтому гетерогенные биокатализаторы на основе уксуснокислых бактерий ЫисопоЬаиег охус1ап8 и метилотрофных дрожжей РгсЫа ап^1а, иммобилизованных в золь-гель матрицу могут найти широкое применение в биотехнологии.

Получение гетерогенных биокатализаторов на основе О/исопоЬа&ег охуйап^

Изучение структуры получаемых матриц проводили методом СЭМ. Так, при использовании соотношения силановых прекурсоров (МТЭС и ТЭОС) 10%:90% в составе матрицы происходит образование сфер размером до 50 мкм (рис. 4а). Однако наблюдается большое количество пластин, представляющих собой плотный сформированный гель. При использовании соотношения 85%: 15% в составе матрицы наблюдается образование сфер размером до 50 мкм (рис. 4в). Большинство сфер втянуты внутрь, что свидетельствует о высокой эластичности получаемой матрицы.

При использовании 50% об. МТЭС в составе матрицы наблюдается образование аналогичных сфер, на поверхности которых находятся клетки &исопоЬас1ег охуйапя (рис. 46). При разрушении сфер видно, что они полые внутри. Толщина стенки сферы 300-500 нм (рис. 4г).

Рис.4 Изображение золь-гель матрицы с иммобилизо ванными бактериями

Gluconobacter oxydans, полученное с помощью СЭМ с различным содержанием МТЭС а - 10об.% б - 50об.% (рамками 1, 2 и 3 отмечены

иммобилизованные бактерии Gluconobacter oxydans), в - 85об.%

Получение гетерогенных биокатализаторов на основе Pichia angusla

В структуре кремнийорганической золь-гель матрицы в отсутствии биоматериала наблюдаются сферические частицы размерами 1-5 мкм. Поскольку метилотрофные дрожжи Pichia augusta ВКМ Y-2559 имеют сферическую форму и размер 2-3 мкм, это затрудняет интерпретацию результатов иммобилизации метилотрофных дрожжей. Для визуализации получаемых структур использовали дрожжевые клетки Cryptococcus curvatus ВКМ Y-3288, которые имеют палочковидную форму и больше по размеру — 5-8 мкм.

При соотношении силановых прекурсоров (МТЭС и ТЭОС) 10%:90% формируется структура, в которой твердые участки матрицы контактируют с остекленевшими клетками (рис. 5а). В структуре геля, полученного из прекурсоров в соотношении 50%:50%, инкапсулированные клетки дрожжей находятся в массе золь-гель полимерной сети (рис. 56). Следует отметить, что размеры сферических частиц, формирующих полимерную сеть, значительно превышают размеры сферических частиц, образующих капсулу вокруг клеток. Вероятно, у поверхности микроорганизмов сконцентрированы центры инициации золь-гель реакций, что приводит к образованию большого числа малых частиц золя. Наибольший интерес представляет архитектура гибридного биоматериала, полученного из МТЭС и ТЭОС в соотношении 85%: 15%. Вокруг каждой клетки формируется капсула, при этом инкапсулированные клетки образуют единую структуру (рис. 5в). Увеличение содержания МТЭС до 90% приводит к неэффективному инкапсулированию дрожжей (рис. 5г).

Рис. 5. Изображение золь-гель матриц с инкапсулированным и дрожжами

СгурЮсоссив сип/аШ ВКМ У-3288 (СЭМ)

Подобные ЗЭ-структуры биоматрикса были получены также в результате золь-гель реакций, протекающих в присутствии метилотрофных дрожжей /\arcgMJta. Таким образом, поведение разных дрожжей при инкапсулировании в кремнийорганические матрицы одинаково. Каждая клетка является центром формирования гибридной биокремнийорганической структуры, и архитектура формирующегося биоматериала зависит только от соотношения силановых прекурсоров. Методом оптической микроскопии показано, что процесс

формирования ЗО гибридной архитектуры продолжается несколько часов и заканчивается образованием капсулы вокруг каждой клетки, (рис. 6).

Рис. 6 Динамика образования капсулы вокруг Сгур1ососс№ ситШш. Оптическая микроскопия, фазовый контраст. Бар-метка 10 мкм

Так, через 1 час после начала реакций у поверхности клеток появляются единичные сферические частицы диаметром около 0,3 мкм, которые образуют золь (рис 6, 0ч). Спустя 3 часа увеличивается количество частиц золя, эти частицы формируют отдельные цепочки вокруг каждой клетки в ходе процесса гелеобразования (рис. 6, Зч). Через 5 часов все клетки дрожжей упакованы в капсулы (рис. 6, 5ч). Сформировавшаяся биокремнийорганическая матрица сохраняет свою структуру во времени (рис. 6, 24ч).

Сравнительный анализ данных электронно-микроскопических исследований, полученных в динамике формирования золь-гель матрицы, указывает на то, что в предложенных нами условиях основного катализа клетки микроорганизмов являются центрами инициации формирования образующейся структуры золь-гель матрицы, что отмечено впервые.

Разработка биосенсора на основе иммобилизованных микроорганизмов в бимодальные кремнийорганические золь-гель матрицы

Характеристики рецепторных элементов, полученных на основе иммобилизованных метилотрофных дрожжей и уксуснокислых бактерий в золь-гель матрицы различного состава представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Чувствительность различных рецепторных элементов с иммобилизованными в кремнийорганические матрицы различного состава уксуснокислыми бактериями аисопоЬаМег охус1ап5 ВКМ В-1280 (субстрат этанол)

Содержание МТЭС,% Чувствительность, нА-дм3/минммоль Нижняя граница определяемых концентраций, мкмоль/дм3 Предел обнаружения, мкмоль/дм3 Операционная стабильность, % Долговременная стабильность, сутки

0 43±4 22 7 1 9

10 67±4 16 6 1 6

33 104±2 13 4 1 7

50 118±3 12 3 0,5 6

67 74±1 17 6 1 7

85 52±1 24 7 1 6

100 33 ±1 37 10 1 9

Таблица 2. Чувствительность различных рецепторных элементов с иммобилизованными в кремнийорганические матрицы различного состава метилотрофными дрожжами ПсЫа ап%и51а ВКМ У-2559 (субстрат метанол и этанол)

Содержание МТЭС,% Субстрат метанол Субстрат этанол

Чувствительность, нА-дм3/мин-ммоль Нижняя граница определяемых концентраций, мкмоль/дм3 Предел обнаружения, мкмоль/дм3 Операционная стабильность, % Долговременная стабильность, сутки Чувств ите льно сть, нА ■ дм3/мин • ммо ль Нижняя граница определяемых концентраций, мкмоль/дм3 Предел обнаружения, мкмоль/дм3 Операционная стабильность, % Долговременная стабильность, сутки

0 87±5 9 3 1,1 9 67±5 13 3 1 9

10 96±4 7 2,2 1 8 67±3 8 2 1 8

33 100±5 6 2 1 18 66±4 9 2 1 18

50 107±4 5 1,5 1 26 61±9 6 2 0,9 23

67 110±8 3 1,5 1 23 99±7 5 1 1 26

80 171±5 5 1 2 16

83 140±10 3 1 1,1 17 182±6 5 1 1,1 17

85 198±5 2 0,7 1 15 185±6 5 1 1 15

90 99±7 3 1 1 10 87±10 5 2 3 10

100 90±5 4 1,5 1,5 8 86±6 8 3 1,2 8

Наибольшей чувствительностью обладает биосенсор на основе уксуснокислых бактерий, иммобилизованных в матрицу с содержанием гидрофобной добавки МТЭС 50% об. от общего количества силановых прекурсоров. Это обусловлено структурой

биоматрицы, в которой содержание связей 81-0-81 наибольшее (рис.3). Биосенсор на основе рецепторного элемента с иммобилизованными метилотрофными дрожжами в золь-гель матрицу с содержанием МТЭС 85% об. обладает наибольшей чувствительностью, что обусловлено формированием единой структуры инкапсулированных клеток дрожжей (рис. 5).

Уксуснокислые бактерии ОЫсопоЬааег оху(1апз вЬвр. \ndustrius В-1280, иммобилизованные в пленку из ПВС, модифицированного Ы-винилпирролидоном, ранее были использованы в качестве рецепторного элемента биосенсора (Асулян Л. Д. и др., 2013). При этом коэффициент чувствительности в 5 раз меньше, а нижняя граница в 2 раза выше, чем при использовании разрабатываемого гетерогенного биокатализатора при окислении этанола. Дрожжи Р. иммобилизованные в

слое ДЭАЭ-декстрана, использовали ранее в качестве рецепторных элементов биосенсора, при этом коэффициент чувствительности в б раз меньше, чем при использовании разработанного рецепторного элемента, а нижняя граница определяемых концентраций в 10 раз выше (Китова А.Е. и др., 2004).

Таким образом, иммобилизация уксуснокислых бактерий и метилотрофных дрожжей в кремнийорганические золь-гель матрицы позволила получить рецепторные элементы биосенсоров, характеризующиеся повышенной чувствительностью по сравнению с другими методами иммобилизации.

Зависимость от рН среды

В работе исследован характер изменения откликов биосенсора при изменении рН от 5,4 до 8,0; нижней и верхней границами возможных рН буферной системы КН2Р04/Ма2НР04.

Иммобилизация на GF Иммобилизация в золь-гель матрицу

Рис. 7. Зависимость ответа сенсора от рН среды при иммобилизации а — Gluconobacter oxydans, б — Pichia angusta

Максимальный ответ биосенсора при использовании в качестве метода иммобилизации уксуснокислых бактерий адсорбции на стекловолоконном фильтре и в золь-гель матрицу наблюдается при рН 6,0 (рис. 7а), а при иммобилизации метилотрофных дрожжей — 7,6 (рис. 76), что связано с наилучшими условиями функционирования бактерий Gluconobacter oxydans и дрожжей Pichia angusta.

Преимущества золь-гель инкапсулирования для защиты клеток от вредных воздействий

Ранее было показано, что синтетические оболочки вокруг клеток эффективно защищают их от воздействия осмотического давления, механического сдвига, теплоты и литических ферментов (Monte F.M., 2002). Эти исследования положили начало новому направлению в биотехнологии — получение «искусственных спор». Полученные структуры с инкапсулированными клетками можно рассматривать как один из вариантов «искусственных спор». Защитное действие кремнийорганической капсулы оценивали по способности снижать токсическое действие ионов тяжелых металлов на дыхательную активность микроорганизмов и защищать микроорганизмы от УФ излучения.

Защита от токсического действия ионов тяжелых металлов Для этого определяли способность инкапсулированных метилотрофных дрожжей, иммобилизованных уксуснокислых бактерий и адсорбированных микроорганизмов окислять метанол (для дрожжей) и этанол (для бактерий) в присутствии ионов тяжелых металлов.

Рис. 8. Влияние ионов тяжелых металлов на окислительную активность дрожжей а -иммобилизация в золь-гель матрицу

(соотношение МТЭС:ТЭОС 50%:50%), б — иммобилизация адсорбцией *3начения ПДК использованы в соответствии с нормативно закрепленный

50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 документом (ГН

Ответ сенсора, нА/мин 2.1.5.1315-03, Россия).

Как показано на рис. 8а, величины ответов биосенсора на основе инкапсулированных метилотрофных дрожжей практически не зависят от присутствия всех ионов металлов, за исключением Cu2+, Cd2+ вследствие их высокой токсичности по отношению к микроорганизмам. При превышении ПДК в 100 раз снижение ответов составляет не более 20%, в то время как активность дрожжей, не покрытых силикатной капсулой, снижается более чем в 4 раза (рис. 86). Однако, при использовании в качестве биоматериала уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans при превышении ПДК в 100 раз для всех исследуемых ионов тяжелых металлов, снижение ответов составляет более 50%. Это связано с тем, что микроорганизмы находятся на поверхности кремнийорганических сфер (рис. 9).

Рис. 9. Влияние ионов тяжелых металлов на окислительную активность бактерий а -иммобилизация в золь-гель матрицу

(соотношение МТЭС:ТЭОС 85%:15%)„ б иммобилизация адсорбцией.

*3начения ПДК

использованы в

соответствии с

нормативно закрепленным документом (ГН

2.1.5.1315-03, Россия).

о защитной функции кремнийорганической капсулы вокруг клеток метилотрофных дрожжей.

Защита от УФ-облучения

Известно, что силикатные материалы, в частности стекла, непроницаемы для коротковолнового и средневолнового диапазона УФ излучения. УФ излучение часто используют в микробиологии, биотехнологии, медицине для стерилизации оборудования, поэтому важно понимать насколько эффективно кремнийорганические капсулы защищают живые клетки при облучении. Для выяснения этого вопроса инкапсулированные клетки дрожжей облучали УФ в коротковолновой области (А, = 254 нм), после чего их использовали в биосенсоре. Оказалось, что аналитические и метрологические характеристики биочувствительного элемента на основе дрожжей практически не изменились по сравнению с характеристиками необлученного биочувствительного элемента. Однако при использовании уксуснокислых бактерий происходит гибель биоматериала при облучении и происходит снижение коэффициента чувствительности в 10 раз и увеличение предела обнаружения в 8 раз.

Эти результаты указывают на беспрецедентные защитные функции кремнийорганического матрикса, который образуется вокруг метилотрофных дрожжей, что следует учитывать при разработке различных биотехнологий. Так, при использовании инкапсулированных дрожжей в биосенсорном анализе УФ-облучение можно использовать для периодической стерилизации биосенсорной системы, что позволит избежать микробной контаминации и дополнительно увеличит воспроизводимость анализа, основанного на изменении дыхательной активности микроорганизмов.

Апробация полученного гетерогенного биокатализатора на основе инкапсулированных в золь-гель матрицу метилотрофных дрожжей

С целью апробации и коррелятивной калибровки разработанного нами рецепторного элемента биосенсора определяли содержание этанола в модельных образцах бродильных масс (табл.3).

0ГЩК* и 10 ПДК □ 25 ПДК в50 ПДК ■ 100 ПДК

12 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 10 12

Ответ сенсора, нА/мин

Эти результаты убедительно свидетельствуют

Таблица 3. Содержание этанола в модельных образцах брожения при получении этилового спирта__

Время брожения, ч Способ измерения концентрации этанола, моль/дм"

С помощью биосенсора Газовая хроматоргафия

2 0,02±0,01 0,020±0,003

24 0,05±0,01 0,043±0,001

48 0,17±0,01 0,168±0,001

72 0,21±0,02 0,205±0,003

Статистический анализ результатов определения этанола показал, что выборки, полученные двумя методами, неоднородны по воспроизводимости, при этом значения концентрации этанола, определяемые с помощью биосенсора на основе выбранного гетерогенного биокатализатора и с помощью референтного метода (ГХ), незначимо отличаются между собой, поэтому биосенсор с разработанным биокатализатором может быть использован для мониторинга этанола в бродильных средах.

Разработанный гетерогенный биокатализатор на основе инкапсулированных клеток микроорганизмов применили для создания биофильтра, которые возможно применять для очистки сточных вод, в динамическом и статическом режимах.

В статическом режиме для анализа состава исследуемой смеси проводили отбор проб и их анализ хроматографическим методом. По полученным данным была построена кривая, представленная на рисунке 10.

1,0

144 192 240 288 336 384 432 480 статическом

Рис.10 Зависимость

концентрации метанола в растворе от времени при режиме

Время, ч

деградации

Вид кривой свидетельствует о постепенной переработке метанола микроорганизмами. По истечении 19 суток концентрация метанола снизилась до 0,0026 моль/дм3 метанола, что соответствует 84% от исходного количества.

Динамический режим, напротив, может найти свое применение именно в этой области. Варьируя параметры колонны можно добиться таких условий, при которых метанол будет расщепляться полностью в течение длительного периода времени. Поскольку себестоимость гетерогенного биокатализатора невысока, по мере отработки его можно обновлять. Используемые в качестве наполнителя колонны

стеклянные шарики предварительно подвергали активированию в кислой среде. При этом на поверхности шариков образуются свободные ОН-группы, что увеличивает адсорбционную способность поверхности за счет образования связей -81-0-81-.

При пропускании раствора метанола через хроматографическую колонну в режиме 3-х разных скоростей были получены кривые, представленные на рисунке 11.

5 10 15 20 Объем, см*

Рисунок 1 1 . Зависимость концентрации метанола в растворе от времени в динамическом режиме при

скоростях пропускания:

а)1 см3/мин;

б) 0,5 см3/мин;

в) 0,1см3/мин.

Для каждой из скоростей были рассчитаны динамическая емкость до проскока (позволяет судить о степени использования катализатора в динамических условиях), полная динамическая емкость (характеризует количество переработанного субстрата, до прекращения работы колонны), время защитного действия (время работы до явления проскока). Рассчитанные параметры представлены в таблице 4.

Самые высокие значения наблюдаются при скорости пропускания 0,1см3/мин. Это связано с тем, что в этом случае время контакта подвижной фазы с неподвижной обеспечивает эффективную диффузию субстрата к микроорганизмам и продуктов реакции во внешнюю среду.

Сравнение характеристик статического и динамического режима переработки метанола представлено в таблице 4.

Таблица 4. Параметры переработки метанола в статическом и динамическом режиме

Условия переработки метанола Динамический режим Статический режим

Скорость пропускания

1 см3/мин 0,5 см /мин 0,1 см3/мин

Время эксперимента, мин 20 40 200 19 суток

Доля переработанного метанола, % 11 40 51 84

Полная динамическая емкость, ммоль/КОЕ (1,6±0,1)10"9 (4,9±0,3)-10 9 (5,9±0,2) -9 •10 —

Производительность, ммоль/КОЕмин -10 (0,80±0,06)-10 (1,20±0,09)Т0 10 (2.9±0,1) -10 •10 -10 4,2-10

В статических условиях деградация метанола протекает наиболее эффективно (субстрат переработан на 98%). Однако эти условия сложно применить на практике для очищения природных объектов.

Динамические условия удобно применять на практике, но степень переработки метанола в них существенно ниже. Наибольшая степень переработки метанола (50%) наблюдается при минимальной скорости пропускания раствора через колонну. Улучшить показатели данного вида колонны возможно с помощью изменения ее параметров — длины, ширины, количества неподвижной фазы.

При пропускании через хроматографическую колонну реального образца стока воды со скоростью 0,1 см3/мин и последующем хроматографическом определении метанола было получена кривая, по результатам измерений получены параметры, представленные в таблице 5.

_Таблица 5. Параметры переработки метанола в реальном образце сточных вод3

Параметр Значение

Скорость, см3/мин 0,1

Время защитного действия, мин 50

Динамическая емкость до проскока, моль/КОЕ (1,3±0,1)-10'4

Полная динамическая емкость, моль/КОЕ (1,83±0,02)10"6

Производительность, моль/КОЕ -мин (0,015±0,004) 10"*

Количество переработанного метанола, % 57

Биологическая очистка сточных вод промышленных предприятий применяется для удаления растворенных органических загрязнений. Органические загрязнения, входящие в состав промышленных сточных вод, весьма разнообразны. В сточных водах химических производств присутствуют вещества, являющимися продуктами органического синтеза. Множество данных веществ находят широкое применение в технологиях промышленного производства и, в конечном итоге, в определенных количествах присутствуют в сточных водах. Одним из таких компонентов является метанол. Максимальная концентрация метанола, допустимая при биологической очистке - 10 ммоль/дм3, эффективность удаления на сооружениях биологической очистки - 95% (ВРД 39-1.13-010-2000). Однако при такой высокой эффективности до биологической очистки сточные воды, содержащие метанол, необходимо очищать до 10 ммоль/дм3. При использовании разработанного гетерогенного биокатализатора для утилизации метанолсодержащих стоков максимально допустимая концентрация метанола составляет 40 ммоль/дм3.

Таким образом, выбранный способ утилизации метанолсодержащего стока может быть использован для очищения сточных вод. Однако, улучшение показателей по утилизации метанолсодержащих стоков возможно с помощью изменения параметров используемой колонны - длины, ширины, количества неподвижной фазы.

3 технологические воды ОХК Щекиноазот до очистки.

Выводы:

Проведенные исследования вносят теоретический и практический вклад в разработку гетерогенных биокатализаторов, на основе иммобилизованных в кремнийорганические золь-гель матрицы микроорганизмов.

1. Исследована динамика образования бимодальных кремнийорганических матриц на основе силановых прекурсоров МТЭС и ТЭОС и порообразователя ПЭГ в условиях основного катализа. Показано, что процессы гидролиза и поликонденсации протекают за 15 минут.

2. Впервые метилотрофные дрожжи Pichia angusta и уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydons были иммобилизованы в кремнийорганические золь-гель матрицы. Выявлена зависимость между количеством гидрофобной добавки МТЭС и структуры гибридных биоматриц.

3. Впервые показано, что в условиях основного катализа микроорганизмы являются центрами формирования архитектуры биоматрицы, причем в зависимости от типа микроорганизмов формируются специфические структуры: клетки дрожжей Pichia angusta и Cryptococcus curvatus инкапсулированы, а бактерии Gluconobacter oxydans участвуют в образовании сферических структур геля.

4. Разработаны макеты биосенсоров для определения содержания низших спиртов и получены их аналитические и метрологические характеристики. Показано, что иммобилизация в кремнийорганические матрицы метилотрофных дрожжей увеличивает чувствительность и стабильность биосенсора в стрессовых условиях, что обусловлено инкапсулирования микроорганизмов.

5. Гетерогенный биокатализатор на основе инкапсулированных метилотрофных дрожжей использован при разработке модельных биосенсоров и биофильтров, которые перспективны для определения и утилизации метанола в стоках промышленных производств и определения содержания этанола в бродильных средах.

Благодарности

Автор благодарен коллективам кафедр химии и биотехнологии Тульского государственного университета и сотрудникам лаборатории цитологии микроорганизмов ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино за неоценимую помощь в проведении исследований и интерпретации результатов. Особую признательность автор выражает к.х.н., доц. Роговой Татьяне Валентиновне за помощь в постановке эксперимента по получению кремнийорганических полимеров золь-гель методом и изучению их свойств, к.б.н. Сузиной Наталье Егоровне и к.б.н. Мачулину Андрею Валерьевичу за неоценимый вклад в проведении экспериментов по исследованию структуры биоматриц методами сканирующей электронной микроскопии и оптической микроскопии.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. О.А.Каманина, О.А.Соколова, Т.В.Рогова. Гетерогенные биокатализаторы на основе глюкозооксидазы, иммобилизованной в золь-гель матрицу, как биораспознающие элементы биосенсоров // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2013. Вып. 1. С. 215-222

2. О.А. Каманина, Д.Г.Федосеева, Т.В. Рогова, О.Н. Понаморева, И.В. Блохин, А.В. Мачулин, В.АТАлферов Синтез кремнийорганических золь-гель матриц и получение на их основе гетерогенных биокатализаторов // Журнал прикладной химии —2014 —Т. 87. № 6. С. 753-759

3. O.N. Ponamoreva, О.А. Kamanina, A.V. Machulin, T.V. Rogova, V.A. Arlyapov, S.V.Alferov, N.E. Suzina, E.P. Ivanova Yeast-based self-organized hybrid bio-silica sol-gels for biosensors design // Biosensors and Bioelectronics — In Press — http://dx.doi.Org/10.1016/i.bios.2014.08.045

4. Патент Российской Федерации № 2492236, МПК C12N11/02, C12Q1/02. Композиция для получения кремнийорганической золь-гель матрицы для иммобилизации микроорганизмов в биосенсорных анализаторах / Рогова Т.В., Арляпов В.А., Алферов С.В., Каманина О.А., Понаморева О.Н., Алферов В.А.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Тульский государственный университет" (ТулГУ) — № 2012123164; заявл. 05.06.2012; опубл. 10.09.2013

5. Каманина О.А., Рогова Т.В. Определение ВПК реальных образцов с помощью биосенсора на основе дрожжевых клеток Pichia angusta инкпсулированных в бимодальную золь-гель матрицу. Материалы I Всероссийского конгресса молодых ученых- 10-13 апреля - Санкт-Петербург, 2012 - С.206

6. Каманина О.А., Соколова О.А., Арляпов В.А., Рогова Т.В. Биосенсор на основе уксуснокислых бактерий, иммобилизованных в кремнийорганические золь-гель матрицы.Материалы Всероссийской молодежной конференции «Актуальные проблемы химии и биологии» — Пущино — 30 июля - 3 августа— 2012 — С. 72-73

7. Каманина О.А., Сытникова Н.В., Рогова Т.В. Определение этанола в коммерческих образцах с помощью амперометрического биосенсора. Материалы Международной конференции «Биология-наука XXI века» — г. Москва —24 мая 2012г. — С. 338-340

8. Каманина О.А., Соколова О.А., Рогова Т.В. Иммобилизованные в золь-гель матрицы микроорганизмы как основа биорецепторных элементов биосенсоров. Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2012» Тула - 12 сентября, 15 октября — 2012 - С. 11

9. Каманина О.А., Соколова О.А., Рогова Т.В. Селективный биосенсор для определения глюкозы. Материалы II-ая Международная научно-практическая конференция «Биотехнология — перспективы развития» — Уфа — 12-13 ноября 2012 —С. 30-32

Ю.Каманина О.А., Федосеева Д.Г., Соколова О.А, Рогова Т.В. Иммобилизация биоматериала в бимодальные кремнийорганические золь-гель матрицы для создания рецепторных элементов биосенсоров определения этанола.

Материалы III Международной научной интернет-конференции "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий" — 19-22 ноября 2012 г. — С. 149151

П.Каманина O.A., Федосеева Д.Г., Рогова Т.В., Понаморева О.Н. Золь-гель полимерные материалы для иммобилизации целых клеток метилотрофных дрожжей как основа для получения гетерогенных биокатализаторов. Материалы VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» — Москва — 19-22 марта 2013 г. — С.156-157

12. Каманина O.A., Рогова Т.В., Арляпов В.А., Понаморева О.Н. Стабильные гетерогенные биокатализаторы на основе метилотрофных дрожжей Pichia angusta, иммобилизованных в золь-гель матрицу. Материалы 17 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология — наука 21 века» — Пущино — 21-26 апреля 2013 г. — С.337-338 П.Каманина O.A., Бурмистрова Т.В., Рогова Т.В. Метилотрофные дрожжи Pichia angusta, иммобилизованные в золь-гель матрицы, как основа стабильных гетерогенных биокатализаторов. Материалы IX Международной научно-практической конференции «AKTUALNE PROBLEMY NOWOCZESNYCH NAUK - 2013» — 7-15 czerwca (июль) — Польша, 2013 - Vol. 26 Nauk biologicznych — С. 69-71 14-Соколова O.A., Бурмистрова Т.В., Каманина O.A. Иммобилизация метилотрофных дрожжей в гибридную кремнийорганическую золь-гель матрицу как основа биосенсора. Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2013» Тула — 12 сентября, 15 октября — 2012 - С. 57 15.Каманина O.A., Рогова Т.В., Понаморева О.Н. Иммобилизованные в гибридную кремнийорганическую золь-гель матрицу метилотрофные дрожжи как основа биосенсора. Материалы Третьей международной конференции стран СНГ Золь-гель синтез и исследование неорганических соединений, гибридных функциональных материалов и дисперсных систем «Золь-гель-2014» —Суздаль —8-12 сентября 2014— С. 88-89

Подписано в печать:

21.10.2014

Заказ № 10316 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru