Молекулярное моделирование пептидов в мембранах

Полянский, Антон Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярное моделирование пептидов в мембранах
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное моделирование пептидов в мембранах"

На правах рукописи

Полянский Антон Александрович

МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПЕПТИДОВ В МЕМБРАНАХ: ОТ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ СВЯЗЫВАНИЯ С БИСЛОЕМ К НАПРАВЛЕННОМУ ИЗМЕНЕНИЮ АКТИВНОСТИ

Специальность 03.00.02 — Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

МОСКВА - 2006

Работа выполнена на кафедре биоинженерии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в Лаборатории структурной биологии Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научный руководитель:

Доктор физико-математических наук,

доцент Р.Г. Ефремов

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук,

профессор Г.Ю. Ризниченко

Доктор химических наук, чл.-корр. РАН Ю.А. Чизмаджев

Ведущая организация:

Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится 23 ноября 2006 г. в 15:30 на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра Биофизики, «Новая» аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан « %}> » О2006 г.

•'■••.г.^-ь-

Биол (I

-фа.'/у л;

ч^оЧ«.'».

Ученый секретарь Диссертационного совет^/^ доктор биологических наук, профессор ¡Фш м,л ^'оа1'/^'(^.ЕДК'ренделева

f-.il Ш / государст ; IП, , ^ ЧЖ ____

Актуальность проблемы

Мембрано-активные пептиды (МАП) представляют класс соединений, выделенных из природных источников или синтезированных de novo, которые обладают широким спектром биологической активности, часто связанной с изменением физико-химических параметров клеточной мембраны. Действие таких агентов модулируется набором многих факторов (конформация пептида, мода связывания, рН, фазовое состояние и липидный состав мембраны, и др.). Понимание структурных предпосылок, определяющих различные функциональные особенности МАП — одна из важнейших фундаментальных задач в изучении белок-мембранных взаимодействий. Помимо фундаментального значения, исследования в данной области важны для оптимизации и разработки новых соединений, имеющих практическое применение в современной биотехнологии и фармацевтической промышленности (направленная доставка лекарств, генная терапия, антимикробные и противоопухолевые препараты).

Наряду с экспериментальными методиками, в последние годы стало возможным изучать поведение МАП в мембранных системах с помощью техники компьютерного моделирования. Для решения подобных задач могут эффективно применяться методы молекулярной динамики (МД) явно заданных гидратйро-ванных мембран (Forrest & Sansom, 2000), которые позволяют исследовать картину взаимодействий на атомном уровне. Тем не менее, во многих современных работах, посвященных моделированию МАП в мембранном окружении, ряд важных аспектов пептид-мембранных взаимодействий часто остается за рамками проводимых исследований. Например, роль различных а.к. остатков в дестабилизации бислоя, специфическое влияние пептидов на структурно-динамические свойства мембраны («мембранный ответ»), гетерогенность поверхностных свойств границ раздела (интерфейсов) водно-липидных систем и др. Одним из возможных объяснений этому является сложность моделируемых объектов и отсутствие общих системных подходов к проблеме белок-мембранных взаимодействий.

Цели настоящей работы:

- Разработка новых подходов в моделировании МАП, позволяющих детально описывать картину взаимодействия пептидов с водно-липидными системами;

- Применение полученных результатов в теоретическом изучении мембранного связывания ряда объектов, обладающих важной биологической активностью (фузионные, антимикробные пептиды и др.), и de novo дизайн МАП с направленно измененным функциональным действием.

На защиту выносятся следующие основные положения и результаты:

1. Разработаны и оптимизированы методики исследования поведения пептидов в явно заданных модельных мембранах, основанные на расчетах МД. Реализованные новые подходы в анализе МД-данных с использованием процедур картирования различных структурно-динамических свойств поверхности мембран позволяют получать детальную картину мембранного ответа, вызванного встраиванием пептидов.

2. Характер связывания фузионного пептида Е5, пептидного переносчика пе-нетратина и антимикробного пептида Ыс2а является следствием их адаптации к различному мембранному окружению. Основными факторами служат: а) кон-формационная подвижность пептида; б) заряд, динамическое состояние и кривизна поверхности мембраны; в) гидрофобная организация водно-липидного интерфейса.

3. Дестабилизация мембран в процессе связывания ряда биологически активных пептидов происходит в результате образования специфических контактов аминокислотных остатков с полярными головками липидных молекул, а). Взаимодействие остатков глутаминовой кислоты фузионного пептида Е5 с фосфати-дилхолиновыми (ФХ) группами приводит к вытеснению липидов из плоскости мембраны, б). Формирование комплексов ароматических и катионных остатков пенетратина с молекулами фосфатидилсерина (ФС) способствует возникновению «гидрофобных дефектов» на поверхности мембраны.

4. Применение разработанных методик молекулярного моделирования позволило предсказать аминокислотные замены (Не701п, РЬеЮЬуБ) для антимикробного пептида 1Лс2а, направленные на уменьшение его гемолитической активности. Экспериментальные данные биологического тестирования для синтезированных аналогов Ыс2а продемонстрировали высокую эффективность предложенных мутаций.

Научное значение и новизна работы.

Все представленные выше результаты получены впервые. Показано, что встраивание вглубь интерфейса сопровождается реорганизацией пространственной структуры пептида в соответствии с аминокислотным составом и поверхностным распределением его гидрофобных и гидрофильных свойств. Дополнительное влияние на структуру пептида оказывают невалентные взаимодействия аминокислотных остатков внутри молекулы и с мембранным окружением. Эти данные расширяют традиционные представления о процессе сворачивания полипептидной цепи на границе полярной и неполярной фаз, основанные исключительно на амфифильных свойствах последовательностей. Установлено, что мембранный ответ на действие МАП имеет локальный характер: изменение структурно-динамических параметров наблюдается только в области контакта пептида с бислоем, не влияя на интегральные характеристики мембраны. Для разных МАП действие на мембрану характеризуется наличием как общих черт (уменьшение подвижности липидов в области контактов, нарушение характера их упаковки и др.), так и особенностей, связанных с функциональной активностью пептида. При этом в дестабилизации мембраны ключевую роль часто играют специфические контакты остатков пептидов с липидными молекулами. Указанные эффекты зависят от аминокислотного состава пептидов и химического строения полярных головок липидов. Это позволяет выявлять молекулярные основы селективности МАП к различным типам клеточных мембран. .

В целом, широкое рассмотрение проблемы мембранного ответа на действие биологически активных пептидов и сравнительное изучение, разных мембранных систем, проведенное в рамках настоящей работы, позволило сделать существенный шаг в понимании функционирования липидной составляющей

клеточной мембраны, а также расширить представления о механизмах белок-мембранных взаимодействий.

Практическое значение работы.

Полученные результаты могут стать необходимой теоретической базой для направленного дизайна пептидов, обладающих разной биологической активностью (антимикробные, противораковые, переносчики и пр.), которые являются перспективными объектами для разработки новых лекарственных препаратов. В частности, на основании данных молекулярного моделирования были получены первые результаты по направленному изменению активности антимикробного пептида Ыс2а из яда паука Ьаскезапа 1агаЪае\и

В настоящей работе представлен и подробно описан ряд новых методик анализа данных МД, позволяющих рассматривать различные аспекты белок-мембранных взаимодействий. Кроме того, на основании систематизации полученных результатов создана технология, оптимизирующая задачу моделирования периферически связывающихся МАП в явно заданных мембрано-имитирующих системах. Это позволяет существенно расширить применение т зШсо подхода в современной биотехнологии и молекулярной медицине.

Публикации и апробация.

Основные результаты работы изложены в 5 статьях, опубликованных в международных научных журналах. Материалы диссертации докладывались на 4-й и 5-й международных конференциях «Биоинформатика регуляции и структуры генома» (Новосибирск, 2004, 2006), международной конференции «Взаимодействие пептид-мембрана» (Намюр, 2004), 18-м Франко-бельгийском конгрессе по фармацевтической химии (Люксембург, 2004), 5-м международном симпозиуме аспирантов, проводимом Европейской молекулярно-биологической лабораторией (Гейдельберг, 2004), Симпозиуме «Взаимодействие белков и пептидов с поверхностью мембран» в рамках 231-го конгресса Американского химического общества (Атланта, 2006).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа имеет следующую структуру: Во Введении (Глава I) сформулированы основные цели и задачи и их взаимосвязь с общими тенденциями в изучении МАП. Глава II представляет собой обзор литературы, посвященный современным методам моделирования мембранных систем и их взаимодействий с МАП. Полученные результаты и их обсуждение приведены в Главе III, состоящей из шести разделов. В разделе Ш.1 описана разработка и оптимизация процедур и протоколов для расчета и анализа МД явно заданных гидрати-рованных заряженных и нейтральных мембранных систем. В разделах 1П.2-Ш.5 приводятся примеры применения полученных наработок в исследовании поведения различных МАП в модельных мембранах. В разделе Ш.6. содержится краткое описание разработанной технологии моделирования МАП. Содержание Главы IV (Заключение) составляет перечень основных результатов работы, обсуждение их научно-практического значения и дальнейших перспектив исследований в данной области. Описание методов, использованных в работе, дано в

Главе V. Завершает диссертацию Список литературы. Диссертация изложена на /^fe страницах машинописного текста, проиллюстрирована ^УО рисунками и ЯР таблицами. Список литературы включает YS&источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. ВВЕДЕНИЕ

В первой главе обосновывается необходимость применения методов молекулярного моделирования для изучения поведения МАП в мембранах, сформулированы направления и цели исследования.

II. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ

В данной главе описаны современные методы моделирования поведения МАП в явно заданных гидратированных мембранных системах.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

///./. Разработка моделей явно заданных гидратированных заряженных и нейтральных мембранных систем.

В данном разделе приведено описание процедуры оптимизации методов моделирования явно заданных мембранных систем и создания базы данных (БД) липидных бислоев и мицелл разного липидного состава. Процедура отработки и тестирования методик проиллюстрирована на примере сравнительного моделирования заряженного (диолеилфосфатидилсерин — ДОФС) и цвиттерионного (диолеилфосфатидилхолин — ДОФХ) ненасыщенных бислоев (раздел 111.1.1).

III. 1.1 Роль заряда полярной головки в структурной организации модельной мембраны. Сравнительное моделирование заряженного и цвиттерионного бислоев.

В результате проведенных расчетов МД получена модель заряженной мембраны ДОФС, для которой показано хорошее согласие с имеющимися экспериментальными данными (табл.1). При этом установлено, что поведение системы существенно зависит от используемого алгоритма учета электростатических взаимодействий. Применение функций сферических отсечек приводит к ряду артефактов — моделируемый бислой оказывается менее упорядоченным по сравнению с экспериментальными данными, имеет «размытый» водно-липидный интерфейс, наблюдаются серьезные флуктуации толщины бислоя. При использовании модифицированных алгоритмов суммирования по Эвальду (PME1) структурные характеристики полученного бислоя хорошо согласуются с соответствующими экспериментальными значениями. Для бислоя ДОФХ показано отсутствие каких-либо расчетных артефактов при использовании функций отсечек, что позволяет применять данную схему учета электростатических взаимодействий в МД-расчетах цвиттерионных липидных систем. Сравнение результатов МД для модельных бислоев ДОФХ и ДОФС позволяет сделать вывод о том, что, в отличие от заряженной мембраны, цвиттерионная мембрана ДОФХ обладает

1 PME - Particle-Mesh Ewald (англ.)

менее структурированным интерфейсом. Это влияет на ряд ее интегральных характеристик (характер упаковки липидов (Al, Dp_p, Scd), глубина проникновения воды и пр.).

Таблица 1. Равновесные макроскопические средние для бислоев ДОФС и ДОФХ: расчеты МД и экспериментальные данные._

Параметр* ДОФС ДОФХ

Отсечки РМЕ Эксперимент** Отсечки РМЕ Эксперимент

AL, А2 63.33±0.07 63.31±0.08 64 70.23±0.18 70.55±0.12 72.5

<DP.P>, А 37.7±0.6 39.0±0.2 39 36.2±0.2 35.8±0.2 36.9

DHH..A 44 39 39 36.8 35.9 36.9

<Scd> 0.10±0.03 0.14±0.05 0.15# 0.11±0.04 0.10±0.04 0.14"

* Описание параметров: Аь — средняя площадь на липидную молекулу; <Ор.р> — средняя толщина бис-лоя (расстояние между плоскостями атомов фосфора в разных монослоях); Е)нн — расстояние между пиками электронной плотности для атомов фосфора; <8са> - средний параметр порядка ацильных цепей липидов;

** РйгасЬе й а1., 2004.

* Данные взяты для степени гидратации — 40 молекул воды на молекулу липида.

III. 1.2. Создание БД модельных водно-липидных систем и изучение их структурно-динамических свойств.

В данном разделе описано создание БД равновесных моделей гидратиро-ванных бислоев и мицелл различного состава. При этом: 1) разработаны заново и/или оптимизированы топологические справочники для молекул липидов и детергентов в силовых полях Сгошоз87/96; 2) оптимизированы вычислительные протоколы для моделирования МД явно заданных липидных бислоев на высокопроизводительных платформах с параллельной архитектурой - с использованием программного пакета СШЭМАСЗ (ЫпёаЫ е1 а1., 2001). Характерный размер систем: —100-200 молекул липидов / -5-7 х 103 молекул воды / ~100-200 ионов Иа+ (в случае анионных липидов). Температуру в ячейке при расчете бислойных систем задавали с учетом данных о температуре фазового перехода гель-жидкий кристалл для моделируемого липида, чтобы мембрана находилась в жидкокристаллическом состоянии. Число молекул детергента в ячейке (для мицелл) задавали, исходя из экспериментальных данных о критической концентрации мицел-лообразования.

Таблица 2. Структурные параметры бислоев и мицелл.

Бислой Т,°С* Al, (А2)** D„.d,(A) Sed D„ (А)

Димиристоилфосфатидилсерин (ДМФС)^ 42(36) 47.1 41.23 0.326 12.80

Димиристоилфосфатидилхолин (ДМФХ)п8 52 (24) 59.7 35.24 0.184 12.45

Д ипал ьмито ил фосфатид илхол ин (ДПФХ)( 28 52(41.5) 59.0 39.01 0.187 12.77

Пальмитоилолеилфосфатидилглицерол (ПОФГ)288 42 (-4) 56.5 39.43 0.185/0.176* 13.10

Пальмитоилолеилфосфатидилэтаноламин (ПОФЭ)128 42 (26) 57.0 39.97 0.197/0.185 10.93

Пальмитоилолеилфосфатидилхолин (ПОФХ)|28 27 (-3) 63.7 37.35 0.183/0.149 13.25

Пальмитоилолеилфосфатидилсерин (ПОФС)^ 27(14) 57.2 41.07 0.185/0.178 11.42

Диолеилфосфатидилхолин (ДОФХ)128 27 (-22) 70.5 35.80 0.104 12.00

Диолеилфосфатидилсерин (ДОФС)^« 27 (-11) 63.3 39.03 0.138 11.16

Мицелла Т,°С AL, (Äz) R., (Ä) а Sed D„ (A)

Додецилфосфохолин (ДФХ)бо 27 91.5 20.90 0.106 0.064 5.30

Додецилсульфат натрия (ДСН)бо 50 77.2 19.20 0.146 0.091 5.56

Лизомиристоилфосфатидилглицерол (ЛМФГ)72 42 100.6 24.01 0.060 0.101 5.19

Лизопальмитоилфосфатидилглицерол (ЛПФГ)72 42 105.3 24.56 0.070 0.070 4.76

Лизопапьмитоилфосфатидилглицерол (ЛПФГ)]25 42 86.7 29.37 0.072 0.086 6.21

* Температура моделирования, в скобках дана температура фазового перехода гель-жидкий кристалл ** Описание параметров: Ai — площадь, приходящаяся на липидную молекулу; Dp.p— толщина бислоя (расстояние между пиками электронной плотности по фосфору); Sed — параметр порядка ацильных цепей липидов; Di — ширина интерфейса; Rs — радиус мицеллы; а - анизотропия мицеллы

* Значения Sd даны для насыщенной и ненасыщенной ацильных цепей

В результате серии расчетов МД длительностью —20 не был получен набор траекторий для бислоев, состоящих из основных природных липидов, и мицелл, наиболее широко используемых в экспериментальных исследованиях белок-мембранных взаимодействий (табл. 2). На протяжении МД все исследуемые системы сохраняют бислойную (или мицеллярную) структуру, а полученные на равновесных участках траекторий МД (обычно последние 5 не) макроскопические средние значения (табл. 2) хорошо согласуются с имеющимися экспериментальными данными.

Картирование поверхностных свойств модельных мембран позволяет детально описывать мембранный ответ, вызванный встраиванием пептида, и исследовать механизмы дестабилизации мембран. В основе подхода лежит расчет различных усредненных параметров на равновесных участках МД траекторий для каждой липидной молекулы и картирование полученных значений в плоскости мембраны или на ее поверхности, доступной растворителю (ПДР).

Для анализа локального изменения толщины мембраны (отклонения от среднего значения Dp.p) использовали процедуру получения разностных двумерных карт рельефа поверхности. На первом этапе рассчитывали ПДР для обоих монослоев мембраны, далее производили интерполяцию и сглаживание рельефов, а также их последующее вычитание. «Разностную» поверхность затем представляли в виде двумерной (2D) карты (рис. 1 А).

Оценку динамической структуры интерфейса модельных мембран, а также влияние МАП на подвижность липидных молекул осуществляли с помощью расчета эффективных значений флуктуации полярных головок относительно их равновесных положений (RMSF™0'). Для сравнительного анализа распределения динамических фракций липидов в бислоях разного состава использовали относительную величину ARMSFтЫ, определяемую по формуле: ARAíSf""1 = RMSF""1-max(RMSF¡£), где max(RMSF^) - максимум распределения значений RMSF1"0' липидов в модельном бислое (в случае моделирования МАП — в «чистом», то есть без пептида). Для построения 20-карт использовали координаты атомов фосфора полярных головок. Процедуру проводили независимо для обоих монослоев (рис. 1В).

-и.^ и.и

АКМБрмо^ А

Рнс.1. Структурно-динамические свойства поверхности модельных мембран. А. Схема построения разностных карт рельефа поверхности модельных мембран на примере бислоя ДМФХ. Б. Ориентация полярных головок в бислое ДОФС (двумерная карта угла 0 для монослоя). В. Поверхностное распределение динамических фракций липидов в бислое ДОФХ. Распределение эффективных значений флук-туаций полярных головок — данные для бислоя (слева). Двумерная карта относительных подвижностей для монослоя (справа). Г. Гидрофобные и гидрофильные участки на поверхности бислоя ПОФГ. Поверхность раскрашена в соответствии со значениями МГП, рассчитанными в каждой ее точке. Светлым показаны гидрофильные области, темным — гидрофобные.

Ориентацию липидных головок оценивали по углу 6 между нормалью к плоскости бислоя и вектором, образованным центральным атомом глицерола и Са атомом в серине (для ФС) или аналогичными атомами в ФЭ, ФХ, ФГ (рис. 1Б). При этом для каждой молекулы липида на равновесном участке МД определяли среднее значение угла 9. Для построения 2Э-карт использовали координаты атомов фосфора полярных головок. Процедуру проводили независимо для обоих монослоев. 2Б-карты для углов 0 позволяют выявить локализацию дефектов в упаковке липидных головок, вызванную, в частности, взаимодействиями с МАП.

Структура водно-липидного интерфейса в различных мембранных системах характеризуется гетерогенной организацией. В частности, нами было показано, что поверхность бислоев и мицелл не является полностью гидрофильной, а содержит гидрофобные участки (рис. 1Г). Одной из причин этого является достаточно «рыхлая» структура мембранных интерфейсов. Для картирования гидрофобных и гидрофильных свойств ПДР в модельных бислоях и мицеллах использовали метод молекулярного гидрофобного потенциала (МГП). Ранее этот метод успешно применялся для анализа гидрофобных свойств белков и ряда МАП (ЕАгетоу & Уе^о1еп, 1995). Картирование осуществляется на основании расчета МГП в каждой точке ПДР. Под «нейтральными» понимаются значения

МГП 0.00±0.02, большие и меньшие значения рассматриваются как «гидрофобные» и «гидрофильные», соответственно. Анализ гидрофобных свойств на равновесных участках МД для модельных бислоев и мицелл показал, что соотношения доли гидрофобной / нейтральной / гидрофильной поверхностей являются характеристическими параметрами модельных мембранных систем.

III. 1.3. Создание смешанных бислоев. имитирующих клеточные мембраны.

Создание смешанных липидных бислоев, имитирующих по составу различные клеточные мембраны, является следующим шагом в повышении реалистичности моделирования МАП. В соответствии с данными о липидном составе и физико-химических свойствах мембран грам отрицательных (Грам-) бактерий и клеток млекопитающих (эритроциты) были созданы следующие бислойные липидные системы:

■ «Эритроциты» - ПОФХП4: ПОФЭп^ХОЛ2^ (80% ПОФХ+ПОФЭ, 20% ХОД в соответствии с липидным составом мембран эритроцитов человека);

■ «Грам-» - ПОФЭ20о:ПОФГ88 (70% ПОФЭ, 30% ПОФГ - в соответствии с липидным составом мембраны Е. соЩ\

Для получения равновесных структур разработанных модельных систем проведены расчеты МД с длиной траектории ~15 не. Уточнение параметров смешанных модельных мембран было проведено на основании сравнения характера упаковки липидов в смеси и в однокомпонентных бислоях.

III.2. Определение структуры МАП в модельных мицеллах, сравнение с экспериментом. Влияние гидрофобной организации водно-липидного интерфейса на конформацию пептида в связанном состоянии.

Сопоставление результатов моделирования и эксперимента необходимо для оценки корректности вычислительного подхода, который в дальнейшем был использован для изучения поведения ряда МАП в сложных модельных мембранных системах. Определение структуры антимикробного пептида (АМП) ис2а3 (см. также раздел Ш.5) в мицелле ДСН было проведено методом 'Н-ЯМР спектроскопии в Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН (ОиЬоуэки е1 а1, 2006). Параллельно были выполнены расчеты МД пептида в мицелле ДСН6о (20 не), которые позволяют получить дополнительную информацию о структурной организации пептида и характере его взаимодействий с мицеллой. Для сравнительного анализа были использованы траектория МД (равновесный участок) и 20 ЯМР-конформаций пептида (РЭВ код 2в9Р).

2 ХОЛ - холестерол

3 1Лс2а: СЬРСКЫККГСЯКА13УА\Л<КАКСКН

G LFGKLÏ К К FGRKAIS YAVKKARG К H

12 16 20 N остатка

Рис.2. A. Структура пептида Ltc2a в мицелле ДСН — данные МД (вверху) и ЯМР. Спиральные участки представлены цилиндрами. Пептид: белый цвет — гидрофобные остатки, серый- полярные, черный — остатки Arg и Lys. Б. Положение пептида на поверхности модельной мицеллы: темные области - полярные головки детергента, светлые — ацильные цепи. В. Энергии ван-дер-ваальсовых (вверху) и электростатических взаимодействий остатков пептида с молекулами ДСН.

На рис. 2А показан общий вид пространственной структуры пептида, полученной по результатам 'Н-ЯМР и МД. В обоих случаях сохраняется характерный тип укладки — два спиральных участка, расположенных под углом друг к другу. При этом в каждом случае гидрофобные остатки спиралей ориентированы навстречу друг другу. Отметим, что метод 'Н-ЯМР спектроскопии, использованный для получения структуры Ыс2а, не позволяет изучать детальную картину взаимодействии с мицеллой, в то время как данная информация может быть получена на основании анализа МД пептида. Из рис. 2Б видно, что, взаимодействуя с пептидом, мицелла сохраняет свою сферическую форму. Для мицелл ДСН характерна высокая доля гидрофобной поверхности (-60%, см. также раздел III. 1.2), что определяет моду связывания 1Лс2а. Пептид ориентируется таким образом, чтобы наибольшее число гидрофобных остатков находилось в выгодных контактах с гидрофобными участками поверхности мицеллы (области экспонированных ацильных цепей), а заряженные — с полярными головками молекул детергента. Наблюдаемое взаимное соответствие пространственных распределений гидрофобных / гидофильных свойств для пептида и мицеллы приводит к существенному выигрышу в энергии ван-дер-ваальсовых и электростатических взаимодействий (рис. 2Б). Это стабилизирует данную конформацию Ыс2а на интерфейсе. Интересно, что 1Ч-концевая спираль пептида, благодаря своим выраженным амфифильным свойствам (см. раздел Ш.5.1), обладает более низкой энергией взаимодействия с амфипатической поверхностью мицеллы ДСН, чем остальная часть пептида.

Подведем итог. Структура Ыс2а, полученная на основании расчетов МД в мицелле, хорошо согласуется с экспериментальными данными 1Н-ЯМР. Это говорит об адекватности созданных моделей и эффективности используемых вычислительных протоколов. Пептид в области интерфейса стремится принять конформацию, для которой наблюдается наилучшее взаимное соответствие собственных гидрофобных / гидофильных свойств с гидрофобной организацией поверхности мицеллы.

III. 3. Влияние динамического состояния мембраны на характер встраивания МАП (на примере фузионного пептида Е5).

Оболочечные вирусы «заякориваются» на поверхности клетки с помощью консервативных фрагментов (~20 а.к.), называемых фузионными пептидами (ФП) и представляющих подсемейство МАП. ФП встраиваются в мембрану клеток хозяина, приводя к образованию контакта между липидными бислоями вируса и клетки. Изучение молекулярных механизмов слияния имеет не только фундаментальное значение, но также важно для разработки биомедицинских препаратов, направленных на предотвращение проникновения вируса в клетки. Данный раздел посвящен сравнительному моделированию пептида Е5, синтетического аналога ФП из гемагглютинина вируса гриппа А, в мембранах, состоящих из ДМФХ и ДПФХ. Отличие в длине ацильных цепей (две СН2 группы) данных липидов определяет различные физико-химические параметры бислоев (толщина мембраны, коэффициенты латеральной диффузии липидов и пр.). Использование таких систем позволило оценить влияние динамического состояния мембраны («рыхлая» - ДМФХ, «плотная» - ДПФХ) на характер встраивания пептида Е5. Суммарные сведения о проведенных расчетах МД даны в табл.3.

Конформация пептида в связанном состоянии

Анализ данных МД показывает, что присутствие водно-липидного интерфейса стабилизирует а-спиральную конформацию в И-концевой области пептида (остатки 2-10), что хорошо согласуется с данными, полученными на основании анализа набора ЯМР-структур в мицеллах ДФХ (ВиЬоувкн е1 а1., 2000). В соответствии с данными ЯМР и МД, С-концевая область пептида обладает большей конформационной подвижностью. Конформация участка 12-20 зависит от типа мембраны — более структурированная в бислое ДМФХ (остатки 12-17 -50% времени пребывают в а-спиральной конформации) и отсутствие какой-либо выраженной вторичной структуры в ДПФХ.

Таблица. 3. Расчеты МД для Е5.

Система* ■р Размер ячейки (А3) Время МД (не)

Е5/вода704з/Ыа+5 32 60.0x60.0x60.0 15

ДМФХ,28/вода7219/Е5/Ыа+5 52 (24) 61.8x61.8x95.0 30

ДПФХ 128/вод а5188/Е5/Ыа+5 52 (41.5) 61.3x61.8x83.1 20

*Е5 —СЬРЕА1АЕР1ЕСОШЕСЫЕС; для расчетов были взяты равновесные структуры бислоев (см. раздел III. 1.2); ♦'"Температура в МД расчетах, в скобках даны значения температуры фазового перехода гель-жидкий кристалл.

Характер встраивания Е5

При взаимодействии пептида с обоими бислоями наблюдается заглубление К-концевой спирали, тогда как С-концевой фрагмент остается связанным на поверхности мембраны (рис. ЗА). В течение МД угол между осью >1-концевой спирали и плоскостью мембраны ДМФХ изменяется от —0° (стартовая ориентация) до -40° (10-14 не) и впоследствии приобретает значение ~20° (после 17 не). Таким образом, в процессе связывания пептид «выбирает» оптимальную геометрию встраивания, которая стабилизируется на интерфейсе. В бислое ДПФХ >1-концевая спираль оказывается менее заглубленной и лежит практически парал-

лельно плоскости мембраны. При этом характер связывания определятся гидрофобной организацией пептида и поверхности мембраны в области контакта (см. также разделы III. 1.2, Ш.2). Для расчета пространственных гидрофобных / гидрофильных свойств был использован метод МГП. Поверхность пептида была картирована в соответствии со значениями МГП, созданными атомами Е5 (МГППептид) и соседними атомами липидов (МГПбИслой)- Для Е5 в бислое ДПФХ поверхностное распределение МГПпепТид характеризуется наличием двух выраженных гидрофобных паттернов: в М-концевой спирали и на С-концевом участке. В бислое ДМФХ оба гидрофобных участка образуют на поверхности пептида непрерывный паттерн. Кроме того, в мембране ДМФХ наблюдается более высокая корреляция между пространственными распределениями гидрофобных и гидрофильных СВОЙСТВ ДЛЯ МГПпептид и МГПбислой, чем в ДПФХ (рис. ЗБ). В результате пептид эффективно взаимодействует с «рыхлой» мембраной и глубоко встраивается в бислой, что приводит к вытеснению некоторых липидных молекул в водную фазу (рис. ЗА). Эти липиды находятся в выгодных контактах с карбоксильными группами остатков глутаминовой кислоты 11, 15, 19, 20. В процессе встраивания пептида бислой ДПФХ сохраняет свою целостность. При этом боковые цепи остатков С1и лежат на поверхности мембраны, что делает их менее доступными для липидов.

А ДМФХ Б МГП (пептид)

Рис.3. А. Геометрия связывания пептида Е5 в бислоях ДМФХ (вверху) и ДПФХ. Пептид показан в виде ленты с выделенными остатками глутаминовой кислоты. Водно-липидный интерфейс схематически представлен плоскостью. Показаны соседние молекулы липидов, их положительно заряженные холи-новые группы даны в виде связей и сфер. Б. Гидрофобная организация поверхности пептида и мембран в системах Е5/ДМФХ (слева) и Е5/ДПФХ. Поверхность пептида раскрашена в соответствии со значениями МГП в каждой точке, полученными либо для атомов пептида (вверху), либо для соседних липидов. Гидрофобные и гидрофильные области показаны темным и светлым цветами, соответственно.

Мембранный ответ, вызванный ФП.

Мембранный ответ, вызванный встраиванием Е5, как и в случае ряда других МАП (см. разделы Ш.4, Ш.5), имеет локальный характер, т.е. существенных изменений интегральных параметров мембраны (Аь, Ор_р и пр.) не установлено. В то же время в системе Е5/ДМФХ наблюдается «размывание» профиля плотности (смещение в водную фазу) фосфорных групп липидов контактного монослоя,

по сравнению с «чистой» мембраной (рис. 4А). В бислое ДПФХ наблюдается обратная тенденция - смещение профиля плотности для фосфорных групп происходит к центру бислоя, поскольку в данном случае пептид «продавливает» часть липидов внутрь мембраны. В зависимости от состава бислоя, важные отличия наблюдаются в распределении плотности воды вдоль нормали к мембране (р*(г)). Разностная кривая Др^) = pw(z)E5/дпФx - Р«(г)дПФх (рис. 4Б) при ¿>0 имеет два отрицательных (г= 16, 22А) и один положительный пик (г=ПА). Проникновение координированных пептидом молекул воды в процессе его встраивания в мембрану приводит к появлению отрицательного пика при г=22А. Пики Др\у(г) в области 11 и 16 А связаны с заглублением полярных головок липидов вместе с молекулами воды внутрь гидрофобного ядра. Для мембраны ДМФХ функция Ар„(г) в области контактного интерфейса имеет только один отрицательный пик (2=18А), соответствующий молекулам воды, привнесенным вместе с пептидом. При этом полярные головки липидов ДМФХ не погружаются в область ациль-ных цепей при встраивании Е5 (рис. 4А), а, напротив, формируют «встречный поток». В результате для воды практически не наблюдается изменений характера распределения вдоль нормали к мембране, что приводит к отсутствию дополнительных пиков на графике Др№(г).

Встраивание Е5 сопровождается локальным уменьшением толщины мембраны «в тени» пептида (рис. 4Б), составляющим 6 и 4 А для бислоев ДМФХ и ДПФХ, соответственно. Сходный эффект был ранее обнаружен в МД исследовании взаимодействия ФП гемагглютинина вируса гриппа НЗ с бислоем ПОФХ (Уассаго & а1., 2005).

200

'И 00

Рис.4. А-Б. Изменения организации водно-липидного интерфейса, вызванные встраиванием пептида. А. Распределения плотности фосфорных групп липидов и атомов пептида (штрих линии) вдоль нормали к контактным монослоям ДМФХ (черный), ДПФХ (серый). Пунктиром показаны данные для «чистых» бислоев; сплошной линией - в системах с пептидом. Б. Изменения в характере распределения плотности воды вдоль нормали к мембране (pw(z)). На графике представлены разностные кривые Äp„<z) = pw(z)n5/6HCflo» - Р»(г)бислой Для систем Е5/ДМФХ (черный) и Е5/ДПФХ (серый). В. Двумерные карты локальных изменений толщины мембраны ДМФХ (слева) и ДПФХ. Окраска произведена в соответствии со шкалой, приведенной на рисунке. Подробнее см. раздел III. 1.2

Подведем итог. Результаты моделирования ФП Е5 в бислоях ДМФХ и ДПФХ показывают, что в обоих случаях наблюдается ряд сходных черт в поведении пептида: стабилизация а-спиральной конформации И-концевой области пептида в мембране, локальный характер мембранного ответа. Ряд важных аспектов взаимодействия пептида с мембраной, зависит от ее состава. 1). Пептид глубже встраивается в более «рыхлый» бислой ДМФХ, чем в относительно более плотный ДПФХ. При этом мембрана ДПФХ сохраняет свою целостность, тогда как в ДМФХ некоторые липидные молекулы в области связывания пептида оказываются вытесненными из плоскости бислоя в водную фазу вследствие образования выгодных контактов с остатками глутаминовой кислоты. 3). Динамическое состояние мембраны влияет на геометрию встраивания пептида: угол наклона Ы-концевой а-спиралиг к плоскости бислоя ДМФХ составляет ~ 20° в отличие от параллельной ориентации в мембране ДПФХ. В первом случае результаты МД воспроизводят экспериментально установленную моду связывания ФП (Нап е1 а!., 2001), вторая мода связывания характерна для их неактивных аналогов (Уассаго е1 а!., 2005).

Ш.4. Роль специфических контактов пептид-липиды в дестабилизации заряженных и нейтральных мембран.

Неспецифические пептидные переносчики представляют особый класс МАП, которые способны доставлять в клетки различные ковалентно пришитые гидрофильные молекулы (ДНК, пептиды, лекарства) без нарушения целостности плазматической мембраны, что делает их перспективными объектами современной биотехнологии. Механизм интернализации таких пептидов до сих пор не установлен. Пенетратин (рАп1р)4, 16-членный фрагмент гомеодоменного белка Ан-теннопедии из О. melanogaster является типичным представителем пептидных переносчиков. В данном разделе описаны результаты МД (длительностью ~20 не) рАМр в заряженных и цвиттерионных мембранах (ДОФХ и ДОФС, см. раздел III. 1.1), а также в водном окружении. Особое внимание уделено влиянию различных стартовых ориентации пептида относительно мембраны на характер его встраивания.

Особенности структурной организации рАп1р

Распределение заряженных и гидрофобных остатков в структуре рАп1р не позволяет ему формировать выраженно амфифильную спираль на границе раздела гидрофобной / гидрофильной фаз и придает подвижность структуре пептида при взаимодействии с мембранами. Это определяет невысокую долю а-спиральной конформации (<50%) для структуры рАп1р в цвиттерионном модельном бислое, вне зависимости от стартовой ориентации. При взаимодействии с заряженным бислоем структура пептида определяется его исходной ориентацией (рис. 5А) и характеризуется либо утратой спиральной конформации и появлением элементов Р-структуры — в первом случае, либо формированием нестабильной спирали - во втором. Такая конформационная динамика рАШр в заряженной мембране хорошо согласуется с экспериментальными данными и опре-

4 рАпф: Кд1К1\№<ЗШ.1ШК\>/КК

деляется характером его взаимодействия липидами. В первом случае (исходная ориентация — запуск 1) ароматические и заряженные остатки в середине молекулы были обращены в противоположную сторону от поверхности бислоя (рис. 5А), поэтому в процессе встраивания важную роль во взаимодействии с липидами играют N-концевой остаток Argl и С-концевые Lys. Во втором случае (исходная ориентация — запуск 2) заряженные и ароматические остатки центрального фрагмента pAntp (Тгрб, Argl0, Argil) вносят основной вклад во взаимодействие с мембраной, а также участвуют в образовании долгоживущих комплексов с ФС-липидами (см. далее). При этом наблюдается стабилизация спиральной структуры пептида.

мембрана

Рис.5. А. Стартовые ориентации pAntp, исходная конформация пептида — ЯМР-структура в смеси ТФЭ/вода (Czalik et al, 2002; PDB код: 1KZ0). Структура пептида показана в виде ленты, заряженные и ароматические остатки выделены темным цветом. Б. Положение пептида относительно плоскости (г=0А), образованной атомами фосфора липидных головок в бислоях ДОФС (слева) и ДОФХ. Результаты МД для стартовых ориентации запуск 1 (сплошная линия) и запуск 2 (пунктир).

Стэкинг-взаимодействия ароматических остатков с аргинином.

Результаты МД показывают, что в воде исходная спиральная конформация пептида сохраняется, что в целом согласуется с экспериментальными наблюдениями (Czalic et al., 2002). Отчасти это объясняется наличием долгоживущих стэ-кинг-взаимодействий между остатками Arg и ароматическими кольцами Тгр и Phe. Стэкинг-пары Тгрб-Argl0 и Phe7-Argil с параллельной ориентацией гуани-диновой группировки относительно плоскости ароматического кольца сформированы остатками i,i+4. При связывании с мембранами стэкинг-взаимодействия позволяют понижать энергию для экспонированных в водную и гидрофобную фазу ароматических и заряженных остатков, соответственно. Это повышает сродство pAntp к водно-липидному интерфейсу, а также позволяет стабилизировать различные моды связывания пептида (рис. 5Б) с заряженной мембраной.

Argf * *> iLys Arg^fj^" -Ьтгр

■■ 2 НИИ

10 20 время, не

Рис.6. Механизм дестабилизации мембраны ДОФС (на примере МД расчетов для стартовой ориентации pAntp — запуск 2). А. Примеры долгоживущих комплексов ФС с остатками пептида. Для каждого комплекса приведены диаграммы со временем жизни. Б. Мембранный ответ (см. подробнее раздел III. 1.2). Слева: Поверхностное распределение динамических фракций липидов. Окраска поверхности проведена в соответствии со шкалой для ЛRMSFТемным цветом показаны «замороженные» области (для которых происходит наиболее существенное уменьшение подвижности полярных головок липидов в результате связывания пептида). Справа: Поверхностное распределение для углов 0 полярных головок липидов относительно нормали к бислою. Окраска поверхности проведена в соответствии со шкалой для угла 0. Положение атомов основной цепи пенетратина показано крестиками. Положение липидов, участвующих в долгоживущих комплексах с остатками пептида (см. панель А), обозначено цифрами. В. Временная зависимость доли гиброфобной (пунктир) и гидрофильной (сплошная линия) поверхности в области контакта пептида с мембраной. Г. Структура «дефекта» в области контакта пептида с мембраной. Основная цепь пептида показана лентой. Атомы фосфора полярных головок представлены сферами, ацильные цепи липидов показаны связями.

Специфические комплексы с липидами и механизм дестабилизации модельной мембраны.

Помимо стэкинг-взаимодействий, еще одной важной особенностью Arg и Тгр, входящих в состав молекулы pAntp, является их способность к формированию долгоживущих комплексов с липидами ФС (рис. 6А). Интересно, что при одновременной координации полярной головки липида гуанидиновой группой Arg и индольным кольцом Тгр время жизни комплексов возрастает. Показанное сродство pAntp к липидам ФС отражается на характере мембранного ответа, вызванного встраиванием пептида в модельные мембраны (рис. 6Б). Изменение динамики липидных головок («замораживание» в области контакта пептида с мембраной) и нарушение их упаковки (изменение ориентации по отношению к нормали бислоя) более выражено для бислоя ДОФС, чем для ДОФХ. Кроме того, отсутствие специфических контактов остатков пептида с ФХ-липидами объясняет одинаковые моды связывания pAntp в цвиттерионной мембране в случае различных стартовых ориентаций (рис. 5Б). Изменение динамики липидных головок определяется числом долгоживущих контактов остатков пептида с молекулами липидов. В то же время нарушение характера упаковки ФС-липидов в об-

ласти интерфейса, в первую очередь, связано с формированием долгоживущих комплексов. Важно, что молекулы ФС, участвующие в комплексах с остатками pAntp, одновременно обладают пониженной подвижностью и измененной ориентацией полярной головки относительно нормали к плоскости мембраны, что приводит к образованию дефекта в упаковке липидов на поверхности мембраны (рис. 6Г).

При взаимодействии pAntp с мембранами важную роль играют гидрофобные / гидрофильные соответствия для контактных поверхностей пептида и мембраны (см. также раздел III.3). Данный эффект наиболее выражен в бислое ДОФС. В первом случае (исходная ориентация — запуск I) пептид попадает в область с повышенной долей гидрофобной ПДР (~35%) по отношению к среднему значению, что обусловливает его глубокое встраивание (рис. 5Б). Во втором случае исходная доля гидрофобной ПДР в области контакта соответствует ее среднему значению для бислоя ДОФС, однако в процессе встраивания пептида внутрь интерфейса доля гидрофобной поверхности возрастает (рис. 6В) вследствие изменения структурно-динамических параметров липидов, находящихся в контакте с пептидными остатками (см. выше). Таким образом, для pAntp наблюдается способность адаптироваться к гетерогенным свойствам водно-липидного интерфейса в процессе встраивания в мембрану.

Подведем итог. Полученные нами результаты, в совокупности с большим набором экспериментальных данных, позволяют предположить гипотетический механизм прямого переноса pAntp через мембраны, состоящий из нескольких этапов. На первом этапе адсорбировавшиеся на поверхности молекулы пептида нарушают структуру липидного бислоя, что может быть связано с локальным увеличением концентрации заряженных липидов (для мембран эукариотических клеток - в основном ФС) и/или с формированием «гидрофобных дефектов» (рис. 6В-Г). При увеличении концентрации пептидов на поверхности мембраны количество дефектов возрастает, поэтому вновь связавшиеся пептиды способны глубоко встраиваться в мембрану. Это приводит к существенному изменению локальных электрических свойств мембраны, что при наличии трансмембранного потенциала позволяет отдельным молекулам pAntp преодолевать гидрофобную фазу бислоя. При этом липиды, находящиеся в комплексах с остатками пептида, могут экранировать заряженные группы pAntp от невыгодных взаимодействий с гидрофобным ядром. Основным условием возможности трансмембранного переноса по предложенному механизму является концентрационная зависимость, т.е. существование определенного порогового значения, при достижении которого возможно проникновение пептидов в клетку или липидные везикулы. Концентрационная зависимость для интернализации pAntp показана в ряде экспериментальных работ.

III.5. Особенности аминокислотной организации МАП, обусловливающие различные механизмы связывания с мембраной (на примере антимикробных пептидов).

В данном разделе описаны результаты сравнительного моделирования пептидов Ltc2a и Ltd, которые относятся к семейству латарцинов — линейных АМП, недавно выделенных в ИБХ РАН из яда паука Lachesana tarabaevi (Kozlov

et al., 2006). Экспериментально обнаружено, что антимикробная активность выше для Ltc2a, однако данный пептид также обладает выраженными гемолитическими свойствами (литическое действие на эритроциты млекопитающих). Механизмы действия этих пептидов отличаются. Для Ltc2a показано, что он разрушает мембраны по «ковровому механизму» (Dubovskii et al., 2006). Для Ltcl вопрос о механизме остается открытым. Предположительно, его мембранная активность связана с образованием потенциал-зависимых проводящих структур (белок-липидных пор). Таким образом, основной задачей являлось определение молекулярных предпосылок функционального отличия этих достаточно близких по аминокислотной последовательности пептидов. Кроме того, важной практической составляющей данного этапа стала направленная оптимизация функции Ltc2a (в первую очередь, уменьшение гемолитической активности), проведенная в результате использования методов моделирования, для предсказания необходимых точечных мутаций.

III.5.1 Основные результаты моделировнание Ltc2a и Ltcl в мембранах «Эритроциты» и «Грам-»

Структура пептидов. Оба пептида в процессе МД встраиваются в интерфейсы модельных мембран, сохраняя при этом а-спиральную конформацию на протяжении всей молекулы, за исключением N- и С-концевых областей (в среднем доля спиральной конформации на равновесном участке для данных АМП составляет ~70%, см. табл. 4). В разделе III.2 описана структура Ltc2a в мицеллах ДСН, которая состоит из двух спиральных участков, соединенных гибким линкером и расположенных практически перпендикулярно друг другу. В мембранах пептид находится в вытянутой спиральной конформации без выраженных изломов в центре молекулы. Таким образом, характер кривизны поверхности модельных водно-липидных систем влияет на конформацию связанного пептида: переход от сферической мицеллы к плоской мембране приводит к серьезным структурным перестройкам в молекуле Ltc2a.

Табл.4 Траектории МД для Ltc2a и Ltcl* в модельных бислоях.

Траектории МД Время МД, не Доля спиральной конформации пептида %

Ltc2a/ «Эритроциты»** 20 80

Ltcl / «Эритроциты» 20 73

Ltc2a / «Грам-» 30 73

Ltcl / «Грам-» 30 78

*А.к. последовательности пептидов (ароматические остатки выделены жирным шрифтом, гидрофобные подчеркнуты):

Ltcl S^SGMWRRKLKKLRNALKKKLKGEK Ltc2a GLFGKLIKKFGRKAISYAVKKARGKH ** Подробнее см. раздел III. 1.3

Взаимодействие с липидами. В процессе взаимодействия с модельными мембранами оба пептида образуют специфические комплексы с липидами. Для Ltcl характерно формирование таких комплексов с липидами ПОФЭ и ПОФГ только в мембране «Грам-» (рис. 7А). Ltc2a образует серию комплексов с ПОФХ в мембране «Эритроциты», а также с ПОФЭ и ПОФГ - в «Грам-». На формирование комплексов с липидами существенное влияние оказывает распределение

остатков в а-спирали пептида. Из рис. 7А видно, что Ltd формирует амфифиль-ную спираль, при этом все комплексы с липидами образованы остатками, находящимися на «гидрофильной стороне». Спираль Ltc2a в целом не обладает ам-фифильными свойствами. Комплексы с липидами формируют остатки, входящие как в гидрофобные, так и в гидрофильные паттерны. Таким образом, пространственная организация пептидов содержит предпосылки для взаимодействия с липидами разных типов, а также определяет их характер связывания с мембранами.

A Ltd Ltc2a Б

180 360

Угол поворота, град.

"Эритроциты"

"Грам-"

4 8 12 16 20 Номер остатка

0 180 360

Угол поворота, град.

Рис.7. А. Двумерные карты распределения гидрофобных свойств на поверхности пептидов. Остатки, образующие специфические комплексы с липидами в мембранах «Эритроциты» (ЭР) и «Грам-» (Г-), обозначены черными точками. Карты построены с использованием метода МГП для расчета значений потенциала в каждой точке ПДР в проекции на цилиндрическую поверхность спиралей пептидов (a, Z) (а - угол поворота относительно оси спирали, Z- смещение вдоль оси спирали). Контурные линии соединяют точки с одинаковым значением МГП. Б. Положение пептидов относительно плоскости, образованной атомами фосфора липидных головок в мембранах «Эритроциты» и «Грам-»: Ltd (черный) и Ltc2a (серый). Толстой линией показана граница мембраны, рассчитанная по среднему положению атомов фосфора липидного монослоя, пунктиром обозначены оси спиралей.

Характер связывания. В процессе МД пептиды Ltcl и Ltc2a по-разному связываются с модельными мембранами — для Ltc2a характерна периферическая ориентация, Ltcl обладает способностью встраиваться под углом к плоскости мембраны, с сильно заглубленной N-концевой областью (рис. 7Б). Эти отличия обусловлены различием в а.к. составе пептидов и гидрофобными свойствами их спиралей (амфифильная для Ltcl и без выраженных свойств, за исключением амфифильного N-концевого участка — для Ltc2a, рис. 7А). Способность Ltcl встраиваться внутрь интерфейса зависит от типа мембраны. В случае цвитери-онной мембраны «Эритроциты», содержащей ФХ-липиды, заглубление пептида затруднено вследствие недостаточно эффективного взаимодействия с полярными головками. Наличие равномерно распределенных ароматических остатков, обладающих повышенным сродством к мембранному интерфейсу (F3, FIO, Y17), по-видимому, влияет на параллельную ориентацию Ltc2a. В Ltcl присутствие остатков Trp (W3,W7) в N-концевой области пептида способствуют его встраиванию под углом к плоскости мембраны.

Динамические свойства липидов в области интерфейса. Ltc2a, вследствие эффективного взаимодействия с липидами ПОФХ в мембране «Эритроциты», сильнее влияет на их динамику (образует выраженные фракции липидов с пониженной подвижностью), чем Ltcl. В «Грам-» за счет параллельной ориентации пептида также наблюдается заметное изменение динамических характеристик липидов в области контакта (см. подробнее разделы III. 1.2, III.4). Для Ltcl, сильно заглубленного в мембрану, этот эффект выражен слабее.

Подведем итог. Для Ltc2a характерно существенное воздействие на структурно-динамические свойства мембран вблизи интерфейса, поэтому можно предположить, что механизм действия данного пептида связан с поверхностной дестабилизацией бислоя. Дестабилизация, видимо, «накапливается» при увеличении концентрации пептида, достигая определенного уровня, при котором наблюдается разрушение бислоя. Такое поведение говорит в пользу коврового механизма. Мембранный ответ на действие пептида Ltcl выражен слабее. Видимо, для реализации его механизма действия необходима трансмембранная (или сильно заглубленная) ориентация пептида, что позволяет предположить для него способность к формированию белок-липидных пор. Результаты моделирования хорошо согласуются с экспериментальными данными (вытекание красителей из ФЭ/ФГ липосом, Р31-ЯМР), полученными в Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН.

III.5.2. Разработка аналогов Ltc2a с измененной активностью.

Номер остатка Угол поворота, град Угол поворота, град Угол поворота, град

Рис.8. А. Энергии ван-дер-ваальсовых взаимодействий 1Лс2а с мембраной «Эритроциты». Б. Направленное изменение гидрофобных паттернов на поверхности пептида 1Лс2а. Приведены двумерные карты распределения гидрофобных свойств на поверхности пептида дикого типа и его мутантов. Области мутаций выделены овалами. Остальные детали — как в подписи к рис. 7А

По результатам МД цвиттерионная мембрана «Эритроциты» обладает более гидрофобной поверхностью, по сравнению с заряженной «Грам-». Это позволяет предположить, что уменьшение площади гидрофобной поверхности Ltc2a приводит к понижению эффективности взаимодействия с цвиттерионными мембранами и, следовательно, — к уменьшению гемолитической активности пептида. Сравнение двумерной карты распределения гидрофобности на поверхности пептида и профиля энергии ван-дер-ваальсовых взаимодействий остатков Ltc2a с мембраной «Эритроциты» (рис. 8) позволяет выявить наиболее перспективные остатки для последующих мутаций — 11е7, РЬеЮ. Для них одновременно характерны низкая энергия взаимодействия с мембраной и локализация внутри обширных гидрофобных паттернов на карте МГП. Поэтому для уменьшения гемо-

литической активности Ыс2а были предложены мутации 11е7->С1п, РИе10->Ьуз (рис. 8Б). Данный этап работы проводили в тесном сотрудничестве с Лабораторией пептидного синтеза и группой оптической спектроскопии Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН. Предложенные мутанты Ыс2а были синтезированы, и для них проведена серия биологических тестов на гемолитическую и антимикробную активности (табл. 5). Видно, что изменение всего лишь одного а.к. остатка позволяет существенно уменьшить гемолитическую активность пептидов, сохраняя при этом антибактериальную активность на уровне пептида дикого типа.

Табл. 5. Активности пептида Ис2а и его аналогов.

Минимальная иигибирующая концентрация, мкМ ЭК50*, мкМ

Пептид Последовательность Е. соИ С-600 В. яиЫШх В-501 ВКМ Эритроциты человека

1Лс2а СЬРСКЫККРСГ1КА1 SYAVK.KAR.GKH 3.0 0.7 9.2

г Ь{с2а_17СГ " ' СЬРСКЬ0ККРСШСА13УАУККАКСКН " оУ"-*

Ыс2а_Р 10К СЬЕСКЫККРСККАТБУАУККАЯСКН 5.0 1.3 -

* Эффективная концентрация, вызывающая 50%-ный лизис.

** Активность отсутствует (0% лизис) при концентрациях до 45 мкМ.

111.6. Краткое описание разработанной технологии моделирования МАП.

В данном разделе приводится описание технологии, оптимизирующей задачу моделирования МД периферически связывающихся МАП в явно заданных мембрано-имитирующих системах. Технология была разработана на основании систематизации результатов предыдущих этапов работы. Она включает две составные части — технологию создание моделей мембрано-имитирующих сред и технологию моделирования пептидов в присутствии таких систем.

IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В этой главе суммированы проведенные в работе исследования, полученные новые результаты и выводы.

1. Для учета различных эффектов при моделировании МАП была создана БД однокомпонентных липидных бислоев (~200 липидов) и мицелл (—100 молекул детергента) с разной химической структурой полярной головки и ацильных цепей. Проведена оптимизация процедур МД явно заданных гидратированных заряженных и нейтральных мембранных систем с применением высокопроизводительных многопроцессорных вычислительных платформ. Показано хорошее согласие теоретических моделей мембранных систем с имеющимися экспериментальными данными. Созданы модели смешанных бислоев, близких по составу к реальным биологическим мембранам (эритроцитов человека, грам- бактерий). Разработаны новые методики картирования свойств поверхностей модельных мембран (распределения гидрофобных/гидрофильных свойств, подвижность полярных головок липидов, характер упаковки липидов, рельеф поверхности).

2. Проведено тестирование методов моделирования МАП на основании сравнения структур АМП 1Лс2а, независимо полученных по данным МД и 'Н-ЯМР спектроскопии в мицеллах ДСН. Результаты: а) Данные МД о структуре 1Лс2а в

мицелле хорошо согласуются с экспериментальными данными 'Н-ЯМР, что говорит об адекватности созданных моделей и эффективности используемых вычислительных протоколов, б) Структура пептида состоит из двух спиралей, соединенных линкерным участком и ориентированных практически перпендикулярно друг другу своими гидрофобными остатками.

3. Изучен характер взаимодействия фузионного пептида Е5, синтетического гомолога пептида слияния из гемагглютинина вируса гриппа, с бислоями, состоящими из липидов с разной длиной ацильных цепей (ДМФХ и ДПФХ). Результаты: а). В процессе МД пептид глубже встраивается в интерфейс более «рыхлой» мембраны ДМФХ, по сравнению с мембраной ДПФХ. Мембранный ответ также более выражен в случае бислоя ДМФХ. б). Встраивание Е5 в бислой ДМФХ приводит к вытеснению части липидов из плоскости мембраны в водную фазу за счет эффективного взаимодействия с остатками глутаминовой кислоты пептида.

4. Проведено моделирование взаимодействия неспецифического переносчика пенетратина с заряженным (ДОФС) и цвиттерионным (ДОФХ) бислоями. Результаты: а). Конформационная динамика пенетратина отличается от поведения амфифильных МАП. В водном окружении структура пептида частично стабилизирована стэкинг-взаимодействиями остатков Arg и Тгр; в незаряженном бислое ДОФХ сохраняется исходная а-спиральная конформация; в ДОФС, в зависимости от стартовой ориентации, наблюдаются как а-спиральная, так и ß-структурная конформации. Полученные результаты хорошо согласуются с экспериментальными данными, б). Дестабилизация локальной структуры бислоя и изменение его динамических свойств связаны с образованием специфических долгоживущих комплексов пептид-липиды. Пенетратин проявляет способность к формированию сложных центров захвата молекул ФС, тогда как для ФХ этот эффект практически отсутствует.

5. Изучено поведение АМП Ltd и Ltc2a в модельных бислоях, имитирующих мембраны эритроцитов и грам отрицательных бактерий. Результатьг а). Характер взаимодействия с ФХ-липидами отличается в случае двух пептидов, что, возможно, определяет их различные гемолитические свойства, б). Отличия в характере связывания с модельными мембранами и мембранном ответе на действие пептидов позволяют сделать предположение о разных механизмах дестабилизации клеточных мембран («ковровый» — для Ltc2a; с образование белок-липидных пор - для Ltcl). Полученные результаты в целом согласуются с экспериментальными данными, в). Для Ltc2a предложен ряд мутаций, направленных на уменьшение гемолитической активности пептида. С помощью экспериментальных методов была показана эффективность предсказанных аминокислотных замен.

V. выводы

2. Характер связывания фузионного пептида Е5, пептидного переносчика пе-нетратина и антимикробного пептида Ltc2a является следствием их адаптации к различному мембранному окружению. Основными факторами служат: а) кон-формационная подвижность пептида; б) заряд, динамическое состояние и кривизна поверхности мембраны; в) гидрофобная организация водно-липидного интерфейса.

3. Дестабилизация мембран в процессе связывания ряда биологически активных пептидов происходит в результате образования специфических контактов аминокислотных остатков с полярными головками липидных молекул, а). Взаимодействие остатков глутаминовой кислоты фузионного пептида Е5 с ФХ приводит к вытеснению липидов из плоскости мембраны, б). Формирование комплексов ароматических и катионных остатков пентератина с ФС способствует возникновению «гидрофобных дефектов» на поверхности мембраны.

4. Особенности аминокислотной организации АМП Ltd и Ltc2a обусловливают различный характер их связывания с моделями бактериальных и эукарио-тических мембран. В частности, распределение ароматических остатков в молекулах пептидов и гидрофобная организация их спиралей определяют периферическую моду связывания для Ltc2a и заглубленную — для Ltcl.

5. На основании молекулярного моделирования предсказаны полярные аминокислотные замены в гидрофобных областях антимикробного пептида Ltc2a (Ile7Gln, PhelOLys), направленные на уменьшение его гемолитической активности. Данные биологического тестирования для полученных аналогов (Ltc2a_I7Q, Ltc2a_F10K) показали эффективность предложенных мутаций.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Polvansky A.A.. Volynsky P.E., Nolde D.E., Arseniev A.S., Efremov R.G. Role of lipid charge in organization of water/lipid bilayer interface: insights via computer simulations. (2005). J. Phys. Chem. B, 109, 15052-15059.

2. Volynsky P.E., Polvansky A.A.. Simakov N.A., Arseniev A.S., Efremov R.G. Effect of lipid composition on the "membrane response" induced by a fusion peptide. (2005). Biochemistry, 44, 14626-14637.

3. Dubovskii P.V., Volynsky P.E., Polvansky A.A.. Chupin V.V., Efremov R.G., Arseniev A.S. Spatial structure and activity mechanism of a novel spider antimicrobial peptide. (2006). Biochemistry, 45, 10759-10767.

4. Polvansky A.A.. Volynsky P.E., Arseniev A.S., Efremov R.G. Computer simulations of anionic unsaturated lipid bilayer — a suitable model to study membrane interactions with a cell-penetrating peptide In: Bioinformatics of Genome Regulation and Structure II. (Eds. N.Kolchanov and R. Hofestaedt) Springer Science+Business Media, Inc. 2005, 235-246.

5. Полянский A.A.. Косинский Ю.А, Ефремов Р.Г. Локальные температурные изменения подвижности в молекулах тиоредоксинов влияют на их термостабильные свойства. (2004) // Биоорганическая химия. Т. 30, № 5, 470-480

6. Efremov R.G., Nolde D.E., Volynsky P.E., Vereshaga Y.A., Simakov N.A., Polvansky A.A. Molecular modeling of membrane peptides and proteins. Fundamental & Clinical Pharmacology 2004 18, 594

7. Polvansky A.A.. Volynsky P.E., Efremov R.G. Computer simulations of anionic unsaturated lipid bilayer: a base system to study peptide-membrane interactions. Proceedings of the Fourth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure, Novosibirsk, Russia (2004), 1,333-334.

8. Polvansky A.A.. Volynsky P.E., Efremov R.G. Unsaturated phosphatidylserine bilayer: a perspective model system to study peptide-membrane interactions via computer simulations. Proceedings of International symposium "Peptide-Membrane Interactions" Namur, Belgium (2004), P3.

9. Polvansky A.A.. Volynsky P.E., Efremov R.G. Computer simulations of interaction of Trojan peptides with lipid bilayers. Handbook of 5th EMBL PhD Student International Symposium, "Design of Life - Learning from Nature", Heidelberg, Germany (2004), 80.

10. Efremov R.G., Volynsky P.E., Polvansky A.A.. Aliper E.T., Dubovskii P.V., Arseniev A.S. Binding of membrane-active peptides to lipid bilayers: From modeling of structure and dynamics — to understanding of function. Proceedings of Symposium "Interactions of Peptides and Proteins with Membrane Surfaces", the 231st ACS National Meeting, Atlanta, USA (2006), PHYS-105

{http://oasys2. confex. com/acs/23 lnm/techprogram/P912258. htm)

11. Polvansky A.A.. Aliper E.T., Volynsky P.E., Efremov R.G. Action of membrane-active peptides on explicit lipid bilayers. Role of specific peptide-lipid interactions in membrane destabilization. Proceedings of the Fifth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure, Novosibirsk, Russia (2006), 1, 302305.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Czajlik A., Mesko Е., Репке В., Perczel A. J. Pept. Sei. 2002, 8,151 Dubovskii P.V., Li H., Takahashi S., Arseniev A.S., Akasaka K. Protein Sei. 2000, 9, 786.

Efremov R.G., Vergüten G. J. Phys. Chem. 1995, 15, 63.

Forrest L.R., Sansom M.S. Curr Opin Struct Biol. 2000, 10,174.

Han X., Bushweiler J.H., Cafiso D.S., Tamm L.K. Nat Struct Biol. 2001, 8, 715.

Kozlov S.A., Vassilevski A.A., Feofanov A.V., Surovoy A.Y., Karpunin D.V., Grishin

E.V. J. Biol. Chem. 2006,281, 20983.

Lindahl E., Hess В., van der Spoel. D. J. Mol. Mod. 2001, 7, 306.

Petrache H.I., Tristram-Nagle S., Gawrisch K., Harries D., Parsegian V.A., Nagle J.F.

Biophys. J. 2004, 86, 1574.

Vaccaro L., Cross K.J., Kleinjung J., Straus S.K., Thomas D.J., Wharton S.A., Skehel J.J., Fraternali F. Biophys. J. 2005, 88, 25.

Заказ № 126/10/06 Подписано в печать 13.10.2006 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ее5))

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 ¿) www.cfr.ru ; е-тай:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Полянский, Антон Александрович

СОДЕРЖАНИЕ.

Глава I. ВВЕДЕНИЕ.

Глава 11. Моделирование поведения МАП в явно заданных гидратированных мембранных системах (обзор литературы).

11.1. МД расчеты водно-липидных систем.

11.1.1. Цвиттерионные мембранные системы.

11.1.2. Заряженные бислои и мицеллы.

II. 1.3. Многокомпонентные мембраны.

11.2. МД расчеты пептидов в мембранах.

И.З. Резюме.

Глава III. Результаты и обсуждение.

III. 1. Разработка моделей явно заданных гидратированных заряженных и нейтральных мембранных систем.

III.1.1 Роль заряда полярной головки в структурной организации модельной мембраны. Сравнительное моделирование заряженного и цвиттерионного бислоев.

III. 1.2. Создание базы данных (БД) модельных водно-липидных систем и изучение их структурно-динамических свойств.

III. 1.3. Создание смешанных бислоев, имитирующих реальные клеточные мембраны.

111.2. Определение структуры МАП в модельных мицеллах, сравнение с экспериментом. Влияние гидрофобной организации водно-липидного интерфейса на конформацию пептида в связанном состоянии.

111.3. Влияние динамического состояния мембраны на характер встраивания МАП (на примере фузионного пептида Е5).

111.3.1. Конформация пептида в связанном состоянии.

111.3.2. Мода встраивания в липидные бислои.

111.3.3. Связывание пептида на поверхности мембраны. Роль гидрофобных соответствий.

111.3.4. Мембранный ответ, вызванный встраиванием ФП.

111.3.5. Резюме.

111.4. Роль специфических контактов остатков пептида с полярными головками липидов в дестабилизации заряженных и нейтральных мембран.

111.4.1. Расчеты МД пенетратина и его аналогов.

111.4.2. Взаимодействие pAntp с цвиттерионными (ДОФХ) и заряженными (ДОФС) бислоями.

111.4.3. Мембранный ответ, вызываемый пептидом.

111.4.4. Взаимодействие аналогов пенетратина с бислоем ДОФС.

111.4.5. Влияние гидрофобной организации поверхности мембраны на характер связывания пептида.

111.4.6. Резюме.

111.5. Особенности аминокислотной организации МАП, обусловливающие различные механизмы связывания с мембраной (на примере антимикробных пептидов).

III. 5.1 Основные результаты моделирования Ltc2a и Ltcl в мембранах

Эритроциты» и «Грам-».

111.5.2. Разработка аналогов Ltc2a с измененной активностью.

111.6. Краткое описание разработанной технологии моделирования МАП.

Этап I. Создание и оптимизация теоретических моделей полноатомных гидратированных мембран-имитирующих систем.

Этап II. Моделирование периферически связывающихся пептидов в присутствии полноатомных гидратированных мембранных систем.

Глава IV. Заключение.

IV. 1. Обзор проведенных исследований и полученных результатов.

IV.2. Научно-практическое значение работы.

IV.3. Перспективы.

V. Методы.

V.I. Используемые теоретические подходы.

V. 1.1.Метод молекулярного гидрофобного потенциала (МГП).

V.I.2.Meтoд молекулярной динамики (МД) явно заданных гидратированных мембранных систем.

V.2. Используемые МАП.

V.3. Вычислительные протоколы.

V.3.I. Получение равновесных структур бислоев и мицелл.

V.3.2. МД Ltc2a с мицеллой ДСН60.

V.3.3. МД Е5 с бислоями ДМФХ и ДПФХ.

V.3.4. МД pAntp в воде и с бислоями ДОФХ / ДОФС.

V.3.5. МД Ltcl и Ltc2a с бислоями «Эритроциты» / «Грам-».

V.4. Анализ данных МД.

V.4.I. Картирование структурно-динамических свойств на поверхности модельных мембран.

V.4.2. Расчет основных параметров для пептидов и мембран.

V.4.3. Визуализация молекулярных структур.

VI. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярное моделирование пептидов в мембранах"

Мембранные процессы чрезвычайно важны для функционирования живой клетки.При этом огромную роль выполняет липидный бислой, который является сложной гетерогенной структурой, гибко реагирующей на внешние воздействия и тем самым влияюший на работу мембранных и мембрано-активных белков и пептидов. Мембраноактивные пептиды (МАП) представляют класс соединений, выделенных из природныхисточников или синтезированных de novo, которые обладают широким спектром биологической активности, часто связанной с изменением физико-химических параметров клеточной мембраны. Действие таких агентов модулируется набором многих факторов(конформация пептида, мода связывания, рП, фазовое состояние и липидный составмембраны, и др.). Понимание структурных предпосылок, определяющих различныефункциональные особенности МАП - одна из важнейших фундаментальных задач в изучении белок-мембранных взаимодействий. Помимо фундаментального значения для современной структурной биологии (установление основных принципов функционирования белков в мембранах, их фолдинг в неполярном окружении и др.), исследования вданной области важны для оптимизации и разработки новых соединений, имеющихпрактическое применение в современной биотехнологии и фармацевтической промышленности - направленная доставка лекарств через клеточную мембрану, создание МАП сзаданной активностью, генная терапия и борьба с различными заболеваниями, в частности, инфекционными и онкологическими.Изучение свойств природных белок-липидых систем экспериментальными методами сильно затруднено ввиду их сложности. Поэтому широкое распространение получили модельные мембранные системы (мицеллы, везикулы, бицеллы), имитирующие реальные мембраны. Па данный момент эти системы хорошо изучены с помощью различных экспериментальных методик (электронная микроскопия, нейтронное рассеяние,рентгеноструктурный анализ, ЯМР, ЭПР) (Chapman, 1988; Auger, 2000). Однако частоэкспериментальные данные являются противоречивыми и при этом отражают лишь общую (усредненную) картину организации мембранных систем (геометрия системы, параметры упаковки и подвижность липидов). Паряду с экспериментальными работами, впоследние годы стало возможным исследовать модельные мембранные системы с помощью техники компьютерного моделирования, основанного на применении высокопроизводительных многопроцессорных вычислительных платформ. Наиболее информативными из них являются расчеты молекулярной динамики (МД) явно заданных воднолипидных систем и метод Монте-Карло (МК), которые позволяют детально описыватьструктурные и динамические параметры исследуемых объектов. В настоящее время спомощью указанных методик исследован целый ряд модельных бислоев и мицелл (Ash etal, 2004; Saiz & Klein, 2002; Chiu et al, 1999; Tieleman et al., 1997). При этом подавляющеечисло работ посвящено изучению «чистых» цвиттерионных насыщенных и ненасыщенных бислоев и нейтральных мицелл. В то же время существуют лишь несколько примеров успешного моделирования систем, которые наиболее приближены к реальным биологическим мембранам - заряженных бислоев и мембран, содержащих смеси липидов(Pandit & Berkowitz, 2002; Polyansky et al., 2005; Murzyn et al., 2005). Это объясняется целым рядом технических трудностей, возникающих при изучении заряженных систем.Еще более сложным является моделирование взаимодействий модельных бислоев и мицелл с МАП. Для решения подобных задач могут эффективно применяться методы МД иМК (Wong & Kamath, 2002; Bond & Sansom, 2003), которые позволяют исследовать картину взаимодействий на атомном уровне. Тем не менее, во многих современных работах,посвященных моделированию МАП в мембранном окружении, ряд важных аспектовпептид-мембранных взаимодействий остается за рамками проводимых исследований.Например, роль различных аминокислотных остатков в дестабилизации бислоя, специфическое влияние пептидов на структурно-динамические свойства мембраны («мембранный ответ»), гетерогенность поверхностных свойств границ раздела (интерфейсов)водно-липидных систем и др. Одним из возможных объяснений этому является сложность моделируемых объектов и отсутствие общих системных подходов к проблеме белок-мембранных взаимодействий.Таким образом, основной целью настоящей работы стало создание новых подходов в моделировании МАП, позволяющих детально описывать картину взаимодействияпептидов с водно-липидными системами, и их применение в теоретическом изучениимембранного связывания ряда объектов, обладающих важной биологической активностью (фузионные и антимикробные пептиды (ФП, АМП), неспецифические пептидныепереносчики через клеточные мембраны (ППК)).При этом были созданы новые методики анализа данных МД, дающих важнуюинформацию о характере мембранного ответа, вызванного встраиванием пептидов, гетерогенной структурно-динамической организации интерфейсов водно-липидных систем,распределении поверхностных гидрофобных свойств модельных мембран, специфических взаимодействиях различных аминокислотных остатков пептидов с молекулами ли8пидов и детергентов, а также их роли в дестабилизации мембраны. Особое внимание было уделено разработке и апробации теоретических моделей разных мембранных систем,отличающихся по своим физико-химическим свойствам и липидному составу. Среди нихбыли рассмотрены заряженные и нейтральные бислои и мицеллы с разной химическойструктурой полярной головки и ацильных цепей (ДМФХ, ДПФХ, ПОФХ, ПОФЭ, ДОФХ,ДМФС, ПОФС, ПОФГ, ДОФС, ДФС, ДСН). Подобные системы часто используют в экспериментальных исследованиях с помощью методов ЯМР, ЭПР, рентгеноструктурногоанализа (Nagle «& Tristram-Nagle, 2000), поэтому сопоставление результатов моделирования и имеющихся экспериментальных данных позволило произвести оптимизацию вычислительных алгоритмов для получения наилучшего согласия между ними. Также былапроведена разработка смешанных бислойных систем, по своим физико-химическимсвойствам (поверхностный заряд, ненасыщенность и пр.) и липидному составу приближенных к реальным биологическим мембранам (эукариотические, бактериальные). Моделирование МАП в различных мембранных системах позволило учесть влияние рядафакторов на процесс их взаимодействия (химическая стурктура и заряд полярной головки, насыщенность ацильных цепей, динамическое состояние мембраны и др.). При этомбыла создана база данных (БД) бислоев и мицелл различного липидного состава, разработано новое программное обеспечение (ПО) на основании стандартного пакета МДGROMACS (Lindahl et al., 2002), позволяющее в полуавтоматическом режиме создаватьявно заданные гидратированные пептид-мембранные системы и проводить анализ данных МД. На основании полученных результатов была создана технология, оптимизирующая задачу моделирования периферически связывающихся пептидов в явно заданных мембрано-имитирующих системах (см. далее).Рассмотрение МАП, обладающих различной биологической и функциональнойактивностью, позволило выявить ряд интересных и важных аспектов их взаимодействияс мембранами. Встраивание вглубь интерфейса сопровождается реорганизацией пространственной структуры пептида в соответствии с аминокислотным составом и поверхностным распределением гидрофобных и гидрофильных свойств. Дополнительное влияние на структуру пептида оказывают невалентные взаимодействия аминокислотных остатков внутри молекулы и с мембранным окружением. Это придает определенную конформационную подвижность МАП, которая может быть связана с его биологической активностью. Полученные данные расширяют традиционные представления о процессесворачивания полипептидной цепи на границе полярной и неполярной фаз, основанныеисключительно на амфифильных свойствах последовательностей. Установлено, что мембранный ответ на действие МАП имеет локальный характер, то есть изменение структурно-динамических параметров наблюдается только в области контакта пептида с бислоем, зачастую, не влияя на интегральные характеристики мембраны. Для разных МАПдействие на мембрану характеризуется наличием как общих черт (уменьшение подвижности липидов в области контактов, нарушение характера их упаковки и др.), так и особенностей, связанных с функциональной активностью пептида. При этом в дестабилизации мембраны ключевую роль часто играют специфические контакты остатков пептидовс липидными молекулами. Указанные эффекты зависят от аминокислотного состава пептидов и химического строения полярных головок липидов. Это позволяет выявлять молекулярные основы селективности МАП к различным типам клеточных мембран.В целом, широкое рассмотрение проблемы мембранного ответа на действие биологически-активных пептидов и сравнительное изучение разных мембранных систем,проведенное в рамках настоящей работы, позволило сделать существенный шаг в понимании функционирования липидной составляющей клеточной мембраны, а также расширить представления о механизмах белок-мембранных взаимодействий. Полученныерезультаты могут стать необходимой теоретической базой для направленного дизайнапептидов, обладающих разной биологической активностью (АМП, противораковые, переносчики и пр.), которые могут быть использованы в медицинской биоинженерии новых лекарственных препаратов. В частности первые результаты по направленному изменению активности АМП на основании данных молекулярного моделирования были по

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Полянский, Антон Александрович

VI. выводы

2. Характер связывания фузионного пептида Е5, пептидного переносчика пенетратина и антимикробного пептида Ltc2a является следствием их адаптации к различному мембранному окружению. Основными факторами служат: а) конформа-ционная подвижность пептида; б) заряд, динамическое состояние и кривизна поверхности мембраны; в) гидрофобная организация водно-липидного интерфейса.

3. Дестабилизация мембран в процессе связывания ряда биологически активных пептидов происходит в результате образования специфических контактов аминокислотных остатков с полярными головками липидных молекул, а). Взаимодействие остатков глутаминовой кислоты фузионного пептида Е5 с ФХ приводит к вытеснению липидов из плоскости мембраны, б). Формирование комплексов ароматических и катионных остатков пентератина с ФС способствует возникновению «гидрофобных дефектов» на поверхности мембраны.

4. Особенности аминокислотной организации АМП Ltcl и Ltc2a обусловливают различный характер их связывания с моделями бактериальных и эукариотических мембран. В частности, распределение ароматических остатков в молекулах пептидов и гидрофобная организация их спиралей определяют периферическую моду связывания для Ltc2a и заглубленную - для Ltcl.

5. На основании молекулярного моделирования предсказаны полярные аминокислотные замены в гидрофобных областях антимикробного пептида Ltc2a (Ile7Gln, PhelOLys), направленные на уменьшение его гемолитической активности. Данные биологического тестирования для полученных аналогов (Ltc2aI7Q, Ltc2aF10K) показали высокую эффективность предложенных мутаций.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Полянский, Антон Александрович, Москва

1. Aliste М.Р., MacCallum J.L., Tieleman D P. Molecular dynamics simulations of pentapeptides at interfaces: salt bridge and cation-pi interactions. Biochemistry (2003) 42, 8976-8987.

2. Andree H.A, Reutelingsperger C.P., Hauptmann R., Hemker H.C., Hermens W. Т., Willems G.M. Binding of vascular anticoagulant alpha (VAC alpha) to planar phospholipid bilayers J Biol Chem (1990)265,4923-4928.

3. Anezo C., de Vries A.H., Holtje H.D., Tieleman D. P., Marrink S.J. Methodological issues in lipid bilayer simulations. J Phys Chem В (2003)107,9424-9433.

4. Appelt C., Eisenmenger F., Kuhne R., Schmieder P., Soderhall J.A. Interaction of the antimicrobial peptide cyclo(RRWWRF) with membranes by molecular dynamics simulations. Bio-phys J (2005) 89, 2296-306.

5. Ash W.L., Zlomislic M.R., Oloo E.O., Tieleman D.P. Computer simulations of membrane proteins. Biochim BiophysActa. (2004) 1666, 158-189.

6. Auger M. Biological membrane structure by solid-state NMR. Curr. Issues Mol Biol. (2000) 2, 119-124.

7. Balali-Mood K., Harroun T.A., Bradshaw J.P. Molecular dynamics simulations of a mixed DOPC/DOPG bilayer. Eur. Phys. J. (2003) 12, 136-140.

8. Binder H, Lindblom G. A molecular view on the interaction of the trojan peptide penetratin with the polar interface of lipid bilayers. Biophys J. (2004) 87, 332-343.

9. Binder H, Lindblom G. Charge-dependent translocation of the Trojan peptide penetratin across lipid membranes. Biophys. J. (2003) 85, 982-995.

10. Bjorklund J., Biverstahl H., Graslund A., Maler L., Brzezinski P. Real-time transmembrane translocation of penetratin driven by light-generated proton pumping. Biophys. J. (2006) 91, L29-3I.

11. Bockmann R.A., Нас A., Heimburg Т., Grubmuller H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophys J. (2003)85, 1647-1655

12. Bond P.J., Sansom M.S. Membrane protein dynamics versus environment: simulations of OmpA in a micelle and in a bilayer. J. Mol. Biol. (2003) 329,1035-1053.

13. Brogden K.A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev. Microbiol. (2005)3, 238-250.

14. Brooks III C.L., Bruccoleri R.E., Olafson B.D., States D.J., Swamiathan S., Karplus M. CHARMM: a program for macromolecular energy minimization and dynamics calculations. J. Comput Chem. (1983)4,187-217.

15. Bruce C.D., Berkowitz M.L., Perera L., Forbes M D.E. Molecular Dynamics Simulation of Sodium Dodecyl Sulfate Micelle in Water: Micellar Structural Characteristics and Counterion Distribution. J Phys Chem В (2002) 106,3788-3793.

16. Bruckheimer E.M., Schroit A.J. Membrane phospholipid asymmetry: host response to the ex-ternalization of phosphatidylserine. JLeukoc Biol. (1996) 59, 784-788.

17. Caesar C.E., Esbjorner E.K., Lincoln P., Norden B. Membrane interactions of cell-penetrating peptides probed by tryptophan fluorescence and dichroism techniques: correlations of structure to cellular uptake. Biochemistry (2006) 45, 7682-7692.

18. Chapman D. Biomembrane structure and function: recent studies and new techniques. Parasitology (1988) 96 Suppl: SI 1-23.

19. Chiu S.W., Jakobsson E., Subramaniam S., Scott H.L. Combined monte carlo and molecular dynamics simulation of fully hydrated dioleyl and palmitoyl-oleyl phosphatidylcholine lipid bilayers. Biophys J. (1999) 77,2462-2469.

20. Chiu S.W., Jakobsson E., Scott H.L. Combined Monte Carlo and molecular dynamics simulation of hydrated lipid-cholesterol lipid bilayers at low cholesterol concentration. Biophys J. (2001)80,1104-1114.

21. Chiu S.W., Jakobsson E., Mashl J., Scott H.L. Cholesterol-Induced Modifications in Lipid Bilayers: A Simulation Study. Biophys J. (2002) 83, 1842-1853.

22. Christiaens В., Grooten J., Reusens M., Joliot A., Goethals M., Vandekerckhove J., Prochiantz A., Rosseneu M. Membrane interaction and cellular internalization of penetratin peptides. Eur. J. Biochem (2004) 271,1187-1197.

23. Clayton A.H., Atcliffe B.W., Howlett G.J., Sawyer W.H. Conformation and orientation of penetratin in phospholipid membranes. J. Pept. Sci (2006) 12,233-238.

24. Cocca B.A., Seal S.N., D'Agnillo P., Mueller Y.M., Katsikis P.D., Rauch J., Weigert M., Radic M.Z. Structural basis for autoantibody recognition of phosphatidylserine-beta 2 glycoprotein I and apoptotic cells. Proc Natl Acad Sci USA (2001)98, 13826.

25. Connolly M.L. Solvent-accessible surfaces of proteins and nucleic acids. Science (1983) 221, 709-713.

26. Czajlik A., Mesko E., Репке В., Perczel A. Investigation of penetratin peptides. Part 1. The environment dependent conformational properties of penetratin and two of its derivatives. J Pept Sci (2002)8,151-171.

27. Dennison S.R., Wallace J., Harris F., Phoenix D.A. Amphiphilic alpha-helical antimicrobial peptides and their structure/function relationships. Protein Pept Lett. (2005) 12, 31-39.

28. Derossi D., Joliot A.H., Chassaing G., Prochiantz A. The third helix of the Antennapedia ho-meodomain translocates through biological membranes. J. Biol Chem. (1994) 269, 1044410450.

29. Derossi D., Calvet S., Trembleau A., Brunissen A., Chassaing G., Prochiantz A. Cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptor-independent, J Biol. Chem (1996)271, 18188-18193.

30. Derossi D., Chassaing G. Prochiantz A. Trojan peptides: the penetratin system for intracellular delivery. Orends Cell Biol (1998) 8, 84-87.

31. Deshayes S, Morris M.C., Divita G., Heitz F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cell Mol Life Sci. (2005) 62, 1839-1849.

32. Drin G., Mazel M., Clair P., Mathieu D., Kaczoreck M., Temsamani J. Physico-chemical requirements for cellular uptake of pAntp peptide. Role of lipid-binding affinity. Eur. J. Biochem (2001)268,1304-1314.

33. Dubovskii P.V., Volynsky P.E., Polyansky A.A., Chupin V.V., Efremov R.G., Arseniev A.S. Spatial structure and activity mechanism of a novel spider antimicrobial peptide. Biochemistry (2006)45,10759-10767.

34. Dubovskii P.V., Li H., Takahashi S., Arseniev A.S., Akasaka K. Structure of an analog of fusion peptide from hemagglutinin. Protein Sci. (2000) 9, 786-798.

35. Efremov R.G., Gulyaev D.I., Vergoten G., Modyanov N.N. Application of 3D molecular hy-drophobicity potential to the analysis of spatial organization of membrane domains in proteins.

36. Hydrophobic properties of transmembrane segments of Na,K-ATPase. J Prot. Chem (1992)1., 665-675.

37. Efremov R.G., Vergoten G. Hydrophobic organization of alpha-helix membrane bundle in bac-teriorhodopsin. J. Protein Chem (1996) 15, 63-76.

38. Efremov R.G., Nolde D.E., Konshina A.G., Syrtcev N.P., Arseniev A.S. Peptides and proteins in membranes: what can we learn via computer simulations? Curr. Med Chem. (2004) 11, 2421-2442.

39. Epand, R.M. Fusion peptides and the mechanism of viral fusion. Biochim. Biophys Acta (2003)1614,116-121.

40. Epand R.M., Epand R.F., Martin I., Ruysschaert J.M. Membrane interactions of mutated forms of the influenza fusion peptide. Biochemistry (2001) 40, 8800-8807.

41. Essex J.W., Hann M.M., Richards W.G. Molecular dynamics simulation of a hydrated phospholipid bilayer. Phil. Trans. R Soc. Lond В (1994) 344, 239-260.

42. Essmann U., Регега L., Berkowitz M.L., Darden Т., Lee H., Pedersen L.G. A smooth particle mesh Ewald method. JChem Phys. (1995) 103, 8577-8593.

43. Fauchare J.L., Quarendon P., Kaetterer L. Estimating and representing hydrophobicity potential. J Mol Graphics (1988) 6, 203-206.

44. Forrest L. R., Sansom M.S. Membrane simulations: bigger and better? Curr Opin Struct Biol2000)10,174-181.

45. Furet P., Sele A., Cohen N.C. 3D molecular lipophilicity potential profiles: a new tool in molecular modeling. J. Mol Graphics (1988) 6, 182-200.

46. Giangaspero, A., Sandri, L., and Tossi, A. Amphipathic alpha helical antimicrobial peptides. Eur.J Biochem (2001)268,5589-5600.

47. Giesen P.L., Willems G.M., Hemker H.C., Hermens W.T. Membrane-mediated assembly of the prothrombinase complex. JBiolChem (1991)266, 18720-18725.

48. Golden Software, Inc. (1999). SURFER User Manual, version 7.0.

49. Goldmann, W. H., Isenberg, G. Actin-related protein (Arp2) inserts into artificial lipid membranes. Cell. Biol Int. (2002) 26, 1073.

50. Gray C., Tamm L.K. pH-induced conformational changes of membrane-bound influenza hemagglutinin and its effect on target lipid bilayers. Protein Sci. (1998) 7,2359-2373.

51. Han X., Bushweller J.H., Cafiso D.S., Tamm L.K. Membrane structure and fusion-triggering conformational change of the fusion domain from influenza hemagglutinin. Nat Struct Biol.2001)8,715-720.

52. Hancock R.E.W., Lehrer R. Cationic peptides: a new source of antibiotics. Trends Biotechnol. (1998) 16, 82-88.

53. Huang Q., Chen Ch.-L., Herrmann A. Bilayer conformation of fusion peptide of influenza virus hamgglutinin: a molecular dynamics study. Biophys J (2004)87, 14-22.

54. Huber T, Botelho A.V., Beyer K., Brown M.F. Membrane Model for the G-Protein-Coupled Receptor Rhodopsin: Hydrophobic Interface and Dynamical Structure. Biophys J. (2004) 86, 2078-2100

55. Hubner W., Blume A. Interactions at the lipid-water interface. Chem. Phys Lipids (1998) 96, 99-123.

56. Humphrey W., Dalke A., Shulten K. (1996) VMD Visual molecular dynamics. J. Mol. Graph., 14.1, 33-38

57. Jiang F.Y., Bouret Y., Kindt J.T. Molecular Dynamics Simulations of the Lipid Bilayer Edge Biophys J. (2004) 87,182-192.

58. Jorgensen W.L., Tirado-Rives J. The OPLS potential functions for proteins. Energy minimizations for crystals of cyclic peptides and crambin. J. Amer. Chem Soc (1988) 110,1657-1666.

59. Kabsch W., Sander C. Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features. Biopolymers (1983) 22,2577-2637.

60. Kamath S., Wong T.C. Membrane structure of the human immunodeficiency virus gp41 fusion domain by molecular dynamics simulation. BiophysJ. (2002) 83,135-143.

61. Kandasamy S.K, Larson R.G. Binding and insertion of alpha-helical anti-microbial peptides in POPC bi layers studied by molecular dynamics simulations. Chem. Phys Lipids (2004) 132, 113-132.

62. Khandelia H., Kaznessis Y.N. Molecular dynamics simulations of helical antimicrobial peptides in SDS micelles: what do point mutations achieve? Peptides (2005a) 26, 2037-2049.

63. Khandelia H., Kaznessis Y.N. Molecular dynamics simulations of the helical antimicrobial peptide ovispirin-1 in a zwitterionic dodecylphosphocholine micelle: insights into host-cell toxicity. J Phys Chem В (2005b) 109,12990- 2996.

64. Korte Т., Epand R.F., Epand R.M., Blumenthal R. Role of the Glu residues of the influenza hemagglutinin fusion peptide in the pH dependence of fusion activity. Virology (2001) 289, 353-361.

65. Magzoub M., Eriksson L.E., Graslund A. Conformational states of the cell-penetrating peptide penetratin when interacting with phospholipid vesicles: effects of surface charge and peptide concentration. Biochim Biophys Acta (2002) 1563, 53-63.

66. Magzoub M., Pramanik A., Graslund A. Modeling the endosomal escape of cell-penetrating peptides: transmembrane pH gradient driven translocation across phospholipid bilayers. Biochemistry (2005) 44,14890-14897.

67. Magzoub M., Grasslund A. Cell-penetrating peptides: from inception to application, Q ReV. Biophys (2004)37, 147-195.

68. Magzoub M., Kirk K., Eriksson L.E.G., Langel U., Grasslund. A. Interaction and structure induction of cell-penetrating peptides in the presence of phospholipid vesicles. Biochim Biophys Acta, Biomembr. (2001) 1512, 77-89.

69. Marrink S.J., Mark A.E. Molecular Dynamics Simulations of Mixed Micelles Modeling Human Bile. Biochemistry (2002) 41, 5375-5382.

70. Marrink Siewert J. and Alan E. Mark The Mechanism of Vesicle Fusion as Revealed by Molecular Dynamics Simulations J Am Chem. Soc. (2003) 125, 11144-11145

71. Marrink S.J., Mark A.E. Molecular View of Hexagonal Phase Formation in Phospholipid Membranes. Biophys J (2004) 87, 3894-3900.

72. Marrink S.J., Tieleman D.P. Molecular Dynamics Simulation of Spontaneous Membrane Fusion during a Cubic-Hexagonal Phase Transition. Biophys. J. (2002) 83, 2386-2392.

73. Marrink S.J., Lindahl E., Edholm O., Mark A.E. Simulation of the Spontaneous Aggregation of Phospholipids into Bilayers. J. Am. Chem Soc. (2001) 123, 8638- 8639.

74. Mashl R.J., Scott H.L., Subramaniam S., Jakobsson E. Molecular simulation of dioleoylphos-phatidylcholine lipid bilayers at differing levels of hydration. Biophys J. (2001) 81, 3005-3015.

75. Morris K.F., Gao X., Wong T.C. The interactions of the HIV gp41 fusion peptides with zwit-terionic membrane mimics determined by NMR spectroscopy. Biochim. Biophys Acta (2004) 1667, 67-81.

76. Mukhopadhyay P., Monticelli L., Tieleman D.P. Molecular dynamics simulation of a palmi-toyl-oleoyl phosphatidylserine bilayer with Na+ counterions and NaCl. Biophys. J. (2004) 86, 1601-1609.

77. Murzyn K., Rog Т., Pasenkiewicz-Gierula M. Phosphatidylethanolamine-phosphatidylglycerol bilayer as a model of the inner bacterial membrane. Biophys J. (2005) 88, 1091-1103.

78. Murzyn K., Rog Т., Jezierski G., Takaoka Y., Pasenkiewicz-Gierula M. Effects of Phospholipid Unsaturation on the Membrane/Water Interfaced Molecular Simulation Study Biophys. J. (2001)81, 170-183.

79. Nagle J. F., Tristram-Nagle S. Structure of lipid bilayers. Biochim Biophys. Acta (2000) 1469, 159-195.

80. Рак С.С., Fidler I.J. Molecular mechanisms for activated macrophage recognition of tumor cells. Semin Cancer Biol. (1991) 2,189-195.

81. Palm C., Netzereab S., Hallbrink M. Quantitatively determined uptake of cell-penetrating peptides in non-mammalian cells with an evaluation of degradation and antimicrobial effects. Peptides (2006)27, 1710-1716.

82. Pandit S.A., Berkowitz M.L. Molecular dynamics simulation of dipalmitoylphosphatidylserine bilayer with Na+ counterions. BiophysJ. (2002) 82,1818-1827.

83. Pandit S. A., Bostick D., Berkowitz M. L. Mixed bilayer containing dipalmitoylphosphatidyl-choline and dipalmitoylphosphatidylserine: lipid complexation, ion binding, and electrostatics. Biophys J. (2003) 85,3120-31.

84. Pandit S.A., Jakobsson E., Scott H.L. Simulation of the Early Stages of Nano-Domain Formation in Mixed Bilayers of Sphingomyelin, Cholesterol, and Dioleylphosphatidylcholine Biophys J. (2004a) 87, 3312-3322

85. Pandit S. A., Bostick D., Berkowitz M. L. Complexation of Phosphatidylcholine Lipids with Cholesterol Biophys J. (2004b) 87,1345-1356.

86. Patra M., Karttunen M., Hyvonen M.T., Falck E., Lindqvist P., Vattulainen I. Molecular dynamics simulations of lipid bilayers: major artifacts due to truncating electrostatic interactions. Biophys J. (2003) 84, 3636-3645.

87. Persson D., Thoren, P.E.G., Norden B. Penetratin-induced aggregation and subsequent dissociation of negatively charged phospholipid vesicles. FEBSLett. (2001) 505,307-312.

88. Petrache H. I., Tristram-Nagle S., Gawrisch K., Harries D., Parsegian V. A., Nagle J.F. Structure and fluctuations of charged phosphatidylserine bilayers in the absence of salt. Biophys J. (2004) 86, 1574-1586.

89. Pinheiro T. J., Cheng H., Seeholzer S. H., Roder H. Direct evidence for the cooperative unfolding of cytochrome с in lipid membranes from H-(2)H exchange kinetics. J. Mol Biol. (2000) 303, 617-626.

90. Polyansky A.A., Volynsky P.E., Nolde D.E., Arseniev A S. Efremov R.G. Role of Lipid Charge in Organization of Water/Lipid Bilayer Interface: Insights via Computer Simulations. J. Phys. Chem. В (2005) 109, 15052-15059

91. Powers J.P., Hancock R.E. The relationship between peptide structure and antibacterial activity. Peptides (2003)24, 1681-1691.

92. Robinson A.J., Richards W.G., Thomas P.J., Hann M.M. Head group and chain behavior in biological membranes: a molecular dynamics computer simulation. Biophys J. (1994) 67, 23452354.

93. Rog Т., Pasenkiewicz-Gierula M. Effects of epicholesterol on the phosphatidylcholine bilayer: a molecular simulation study. Biophys J. (2003) 84, 1818-1826.

94. Rog Т., Murzyn K., Pasenkiewicz-Gierula M. Molecular dynamics simulations of charged and neutral lipid bilayers: treatment of electrostatic interactions. Acta Biochim Pol. (2003) 50, 789.

95. Rog Т., Murzyn K., Gurbiel R., Takaoka Y., Kusumi A., Pasenkiewicz-Gierula M. Structural Properties of a Highly Polyunsaturated Lipid Bilayer from Molecular Dynamics Simulations. J Lipid Res. (2004) 45,326-336.

96. Sachs J.N., Nanda H., Petrache H.I., Woolf T.B. Changes in Phosphatidylcholine Headgroup Tilt and Water Order Induced by Monovalent Salts: Molecular Dynamics Simulations Biophys. J (2004) 86 3772-3782.

97. Saiz L., Klein M.L. Computer simulation studies of model biological membranes. Acc Chem Res (2002)35,482-489.

98. Saiz L., Klein M.L. Structural Properties of a Highly Polyunsaturated Lipid Bilayer from Molecular Dynamics Simulations Biophys J (2001) 81,204-216.

99. Sankararamakrishnan R.H. Weinstein H. Molecular dynamics simulations predict a tilted orientation for the helical region of dynorphin A(l—17) in dimyristoylphosphatidylcholine bilayers. Biophys. J (2000) 79,2331- 2344.

100. Sanner M.F, Spehner J.C. Olson A .J. Reduced surface: an efficient way to compute molecular surfaces, Biopolymers (1996) 38 305-320.

101. Schamberger J., Clarke R. J. Hydrophobic ion hydration and the magnitude of the dipole potential. Biophys J. (2002) 82, 3081-3088.

102. Shepherd C.M, Vogel H J, Tieleman D P. Interactions of the designed antimicrobial peptide MB21 and truncateddermaseptin S3 with lipid bilayers: molecular-dynamics simulations. Biochem J. (2003)370, 233-243.

103. Stouch T.R. Lipid membrane structure and dynamics studied by all-atom molecular dynamics simulations of hydrated phospholipid bilayers. Mol. Simulation (1993) 10,335-362.

104. Tamm L.K., Crane J., Kiessling V. Membrane fusion: a structural perspective on the interplay of lipids and proteins. Curr. Opp m Struct Biol (2003) 13, 453-466.

105. Tarek M. Membrane Electroporation: A Molecular Dynamics Simulation. Biophys. J. (2005) 88,4045-4053.

106. Terrone D., Sang S.L., Roudaia L., Silvius J.R. Penetratin and related cell-penetrating cationic peptides can translocate across lipid bilayers in the presence of a transbilayer potential. Biochemistry (2№) 42, 13787-13799.

107. Tieleman D.P. The molecular basis of electroporation BMC Biochemistry (2004), 5, 10

108. Tieleman D.P., Berendsen H.J.C. Molecular dynamics simulations of a fully hydrated dipalmi-toylphosphatidylcholine bilayer with different macroscopic boundary conditions and parameters. J. Chem Phys. (1996) 105, 4871-4880.

109. Tieleman D.P., Marrink S.J., Berendsen H.J.C. A computer perspective of membranes: molecular dynamics studies of lipid bilayer systems. Biochim. Biophys Acta (1997) 1331,235-270.

110. Tristram-Nagle S., Petrache H.I., Nagle J.F. Structure and interactions of fully hydrated diole-oylphosphatidylcholine bilayers Biophys J. (1998) 75, 917-925.

111. Tsou L.K., Tatko C.D., Waters M.L. Simple cation-pi interaction between a phenyl ring and a protonated amine stabilizes an alpha-helix in water. J. Am Chem. Soc. (2002) 1124, 1491714921.

112. Vaccaro L., Cross K.J., Kleinjung J., Straus S.K.,. Thomas D.J, Wharton S.A., Skehel J.J., Frat-emali F. Plasticity of influenza haemagglutinin fusion peptides and their interaction with lipid bilayers. Biophys J.( 2005) 88,25-36.

113. Van der Spoel D., van Buuren A.R., Apol A., MeulenhoffPJ., Tieleman P., Sijbers A.L.T.M., van Drunen R., Berendsen H.J.C. (1996).CROMACS User Manual, ver. 2.0, University of Groningen.

114. Van Gunsteren, W. F., Berendsen, H. J. C. 1987, Gromos-87 manual. Biomos BV. Nijenborgh 4, 9747 AG Groningen, the Netherlands.

115. Vanderkooi G. Computation of mixed phosphatidylcholine-cholesterol bilayer structures by energy minimization. BiophysJ (1994) 66, 1457-1468.

116. Vergoten G. Molecular Dynamics Simulations of Biomembrane Models. Biospectroscopy (1998) 4, S41-S46.

117. Vogel H.J., Schibli D.J., Jing W., Lohmeier-Vogel E.M., Epand R.F., Epand R.M. Towards a structure-function analysis of bovine lactoferricin and related tryptophan- and arginine-containing peptides. Biochem Cell Biol (2002) 80, 667-677.

118. Volynsky P.E., Polyansky A.A., Simakov N.A., Arseniev A.S., Efremov R.G. Effect of lipid composition on the "membrane response" induced by a fusion peptide. Biochemistry (2005) 44, 14626-14637.

119. Walsh C. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature. (2000) 406, 775-781

120. Wang S.X., Cai G.P., Sui S.F. The insertion of human apolipoprotein H into phospholipid membranes: a monolayer study. Biochem J. (1998), 335,225-232.

121. Webb R.J., East J.M., Sharma R.P, Lee A.G. Hydrophobic mismatch and the incorporation of peptides into lipid bilayers: a possible mechanism for retention in the Golgi. Biochemistry (1998)37, 673-679.

122. Weiner S.J., Kollman P.A., Case D.A., Singh U.C., Ghio C., Alagona G., Profeta S., Weiner P. A new force field for molecular mechanical simulation of nucleic acids and proteins. J Amer. Chem Soc. (1984) 106, 765-784.

123. White S.H., Wimley W.C. Peptides in lipid bilayers: structural and thermodynamic basis for partitioning and folding. Curr. Op. Struct Biol (1993) 4, 79-86.

124. White S.H., Wimley W.C. Hydrophobic interactions of peptides with membrane interfaces. Biochim Biophys Acta (1998) 1376,339-352.

125. Wilson M. A., Pohorille A Molecular dynamics of a water-lipid bilayer interface. J Am. Chem Soc. (1994) 116, 1490-1501.

126. Wymore Т., Wong T.C. The structure and dynamics of ACTH (1-10) on the surface of a sodium dodecylsulfate (SDS) micelle: a molecular dynamics simulation study. J Biomol Struct Dyn (2000)18,461-476

127. Yarrow F., Vlugt T.J.H., van der Eerden J.P.J.M., Snel M.M.E. Melting of a DPPC lipid bilayer observed with Atomic Force Miscroscopy and computer simulation. J. Crystal Growth, (2005) 275, el417-el421.

128. Zhang W. Smith S.O. Mechanism of Penetration of Antp(43-58) into Membrane Bilayers. Biochemistry (2005)44,10110-10118.

129. Выражаю особую благодарность сотрудникам Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН Дубовскому П. В. и Феофанову А. В., результаты экспериментальных исследований которых позволили существенно усилить научную составляющую данной работы.

130. За дружескую и творческую атмосферу в лаборатории хочу поблагодарить весь коллектив Группы молекулярного моделирования Лаборатории структурной биологии ИБХ РАН.

131. Я глубоко признателен моей семье за постоянную заботу и поддержку, без чего данная работа была бы невозможна.

Информация о работе

Полянский, Антон Александрович
кандидата физико-математических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.02

Диссертация

Молекулярное моделирование пептидов в мембранах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы