Моделирование структуры и мембранной топологии цитохрома b5

Смолинская, Юлия Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Моделирование структуры и мембранной топологии цитохрома b5
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Моделирование структуры и мембранной топологии цитохрома b5"

На правах рукописи

Смолинская Юлия Юрьевна

Моделирование структуры и мембранной топологии цитохрома Ь5

03.00.04 «биохимия»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Иванов Алексей Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Соколов Николай Николаевич

кандидат химических наук Палюлин Владимир Александрович

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится " /б" !Л4рИЛ 2005 г. в (3 часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН по адресу: 119121, Москва, ул.Погодинская, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН.

Автореферат разослан 2005 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета кандидат биологических наук

В.С. Былинкина

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Введение. Актуальность темы

Микросомальный цитохром Ь5 (Ь5) является мембранным белком, который находится в эндоплазматическом ритикулуме. Основной его физиологической функцией является латеральный и межмембранный перенос электронов, включая восстановление цитохромов Р450 (Archakov, 1974), реакции десатурации жирных кислот (Strittmatter, 1974), биосинтез холестерола (Clarke, 2004) и реакции гидроксилирования (Vergeres G, 1995).

Цитохром Ь5 представляет собой двухдоменный мембранный белок, "заякоренный" С-концом в мембране. С помощью трипсина он может быть разделен на водорастворимый гемсодержащий глобулярный домен, сохраняющий физико-химические и окислительно-восстановительные свойства Ь5, и мембранный гидрофобный домен (Tajima, 1978). Пространственная структура водорастворимого фрагмента была решена с помощью рентгеноструктурного анализа (Mathews, 1972а; Mathews, 19726) и доступна в белковом банке PDB (Berman, 2000). Пространственная структура мембраносвязанного домена до сих пор остается неизвестной. Различные авторы предполагают 2 возможные мембранные топологии этого домена. Согласно одной из них мембранный участок Ь5 имеет форму петли - С-конец белка выходит из мембраны с той же стороны, где расположен белок (Ozols, 1989; Tajima, 1980). По другой гипотезе - мембранный домен Ь5 является трансмембранным и пересекает мембрану насквозь (Vergeres, 1995).

Анализ пространственной структуры белков базируется на комбинации методов молекулярной биологии, биохимии, ЯМР и кристаллографии (McPherson, 2002; Drenth, 1994). Однако, такие подходы пригодны в основном для водорастворимых белков, поэтому определены пока только единичные структуры мембранных белков. Это обусловлено существующими проблемами их экспрессии и кристаллизации. Дефицит данных о молекулярном строении мембранных белков стимулирует применение методов молекулярного моделирования (Chang, 1996).

Поскольку конформация мембраносвязанных частей белков обусловлена взаимодействием с липидным бислоем, то для корректного моделирования мембранных белков необходимо использовать адекватную среду в виде модели липидного бислоя с двумя водными фазами с обеих сторон. В последние годы моделированию таких белков в мембранном окружении было посвящено много работ (Saiz, 2002; Forrest, 2000; Tieleman, 1997). Однако, до сих пор существует проблема создания адекватной модели липидного бислоя, хорошо отражающей свойства биологической мембраны.

параметры, как объем и площадь поверхности бислоя, приходящиеся на одну молекулу фосфолипида; распределение различных групп атомов вдоль нормали к бислою; ориентация отдельных метиленовых фрагментов алифатической цепи (параметр порядка) (МсСаЬе, 1994).

Для проверки пригодности модели бислоя для моделирования структуры и топологии мембранных белков необходимо также выполнение контрольного моделирования с использованием похожего по структуре мембранной части периферического белка с известной структурой и мембранной топологией. В белковом банке РБВ (Вегшап, 2000) имеется всего 88 структур мембраносвязанных белков (http://blanco.biomol.uci.edu/Membra ne_Proteins_xtal.html), большинство которых является большими интегральными белками (1Лт$сЬпе1с1ег, 2001). Поэтому в качестве контрольного мембраносвязанного периферического белка нами был выбран фермент моноаминооксидаза А (МАО А). Его структура и мембранная топология недавно были решены методами белковой кристаллографии (Ма, 2004).

Цель работы

Моделирование пространственной структуры цитохрома Ь5 в мембранном окружении и анализ возможных вариантов топологии мембраносвязанного домена этого белка.

Основные задачи:

1. Создать равновесную модель фосфолипидного бислоя из молекул дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) в водном окружении.

2. Проверить пригодность модели фосфолипидного бислоя для моделирования периферических мембранных белков на примере моноаминоксидазы А (МАО А).

3. Выполнить моделирование структуры и мембранной топологии цитохрома Ь5 в мембранном окружении в виде полноатомной модели липидного бислоя и двух водных фаз.

4. Выполнить анализ возможных вариантов мембранной топологии цитохрома Ь5 и сравнить их с известными экспериментальными данными.

1.2. Научная новизна и практическая значимость работы

Построена модель липидного бислоя, которая хорошо согласуется с известными экспериментальными данными (объем и площадь, занимаемые одной молекулой ДПФХ, толщина бислоя, порядок ацильных цепей, профили плотности атомов). На примере мембранного белка МАО А было показано, что модель бислоя может быть использована для моделирования различных мембранных белков.

вариантов, что предполагает существование Ь5 в двух топологиях и

объясняет противоречивые экспериментальные данные.

Впервые показано, что конформация участка, соединяющего водорастворимый и мембраносвязанный домены может играть важную функциональную роль в регуляции взаимодействия цитохрома Ь5 с редокс-партнерами.

Полученные модели полноразмерного цитохрома Ь5 могут быть использованы для изучения взаимодействия цитохрома Ь5 с редокс-партнерами.

1.3. Апробация работы

Основные положения диссертации были доложены на следующих конференциях:

1. 2th International conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine" (Moscow-Pies-Moscow, 2004);

2. XII Российский Национальный Конгресс "Человек и лекарство" (Москва, 2005);

3. 4-ая Национальная конференция "Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины" (Москва, 2005);

4. 4-ая Всероссийская конференция "Молекулярное моделирование" (Москва, 2005);

5. 14th International Conference on Cytochromes P450: Biochemistry, Biophysics and Bioinformatics (Dallas, USA, 2005).

Апробация диссертации состоялась 5 мая 2005 года на межлабораторном семинаре ГУ НИИ биомедицинской химии им В.Н. Ореховича РАМН.

По теме диссертации опубликовано 6 работ.

1.4. Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, объекты и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 53 рисунками; библиографический указатель включает 153 публикации.

1.5. Положения, выносимые на защиту

1. Построена модель липидного бислоя из ДПФХ, которая хорошо согласуется с экспериментальными данными. На примере мембранного белка МАО А, структура которого известна, показано, что модель бислоя может быть успешно использована для моделирования и изучения топологии мембранных белков.

2. Построены модели цитохрома Ь5 в мембранном окружении в трансмемб-

ранной и петлевой топологиях. Моделирование молекулярной динамики показало стабильность обоих вариантов, что предполагает существование Ь5 в двух топологиях и объясняет противоречивые экспериментальные данные.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Конструирование липидного бислоя и систем белок/бислой проводили с использованием молекулярно-графического пакета Sybyl (Sybyl 6.3-6.9) фирмы Tripos на сервере Silicon Graphics 0rigin350 (8xR16000-700) под управлением операционной системы IRIX 6.5. Вычислительная часть работы выполнялась с использованием программы Gromacs 3.2 (Berendsen, 1995) на кластере из 16 2-х процессорных узлов на базе AMD MP 2400+ МГц, соединенных сетью Fast Ethernet под ОС Red Hat Linux 7.3. Для предсказания вторичной структуры мебраносвязанного домена цитохрома Ь5 были использованы программы ALB (Ptitsyn, 1983), PHD (Rost, 1993), PROF (Rost, 1994). Анализ полученных результатов проводился на персональных компьютерах Pentium под управлением операционной системы Windows 2000.

В работе были использованы пространственная структура водорастворимого домена цитохрома Ь5 из микросом печени быка (индекс PDB 1CYO) (Durley, 1996), структура моноаминоксидазы А (индекс PDB 105W) (Ma, 2004), депонированные в белковой базе данных Protein Data Bank (PDB) (Berman, 2000). Из Кембриджской базы данных CSD (Allen, 2002) были взяты структуры холина (индекс АССНОВ11) и глицерофосфата (индекс DAHJAX).

Конструирование молекулы ДПФХ Модель трехмерной структуры дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) была построена с помощью модуля Biopolymer (Sybyl 6.9) на основе известных структур холина и глицерофосфата, а также остатков пальмитиновой кислоты. Расчет парциальных зарядов липидов проводили полуэмпирическим квантовомеханическим методом AMI (Sybyl 6.9).

Конструирование липидного бислоя из ДПФХ. Молекула ДПФХ была размножена с использованием макроса программы Sybyl 6.9 и из полученных копий построена первичная модель бислоя. Каждый монослой состоял из 169 молекул ДПФХ, а бислой соответственно содержал 338 молекул. С применением модуля "editconf" (Gromacs 3.2) была выполнена процедура масштабирования, с помощью которой задавался объем ячейки. Используя модуль "genbox" (Gromacs 3.2) ячейку заполняли молекулами воды. С каждой стороны бислоя было добавлено около 15000 молекул воды. Оптимизация бислоя из ДПФХ. Для оптимизации структуры бислоя и моделирования МД были использованы параметры силовых полей GROMOS и Lipid (Berger, 1997), а также модель SPC (Berendsen, 1984) для воды. Моделирование МД было выполнено при периодических граничных условиях, постоянном давлении (1бар) (Berendsen, 1984) и температуре

(323°K) (Nose, 1984; Hoover, 1985). Для уменьшения объема расчетов при оценке дальнодействующих невалентных взаимодействий применяли функцию двухдиапазонной "отсечки" (Berger, 1997; Lindahl, 2000) с параметрами 1,0 нм/1,8 нм: взаимодействия на расстояниях до 1,0 нм рассчитывали на каждом шаге моделирования МД, а на расстояниях 1,0-1,8 нм - через каждые 10 шагов.

Верификация модели мембраны. Для верификации модели бислоя были рассчитаны объем, занимаемый одной молекулой липида, площадь проекции "головки" одной молекулы липида, параметр порядка (SrD), профили распределения плотности атомов в ячейке поперек плоскости мембраны, которые сравнивались с экспериментальными данными. По этим данным полученный бислой находится в хорошем соответствии с параметрами жидко-кристаллического состояния.

Подтверждение пригодности модели бислоя из ДПФХ для моделирования мембранных белков. В качестве контрольного объекта для подтверждения пригодности модели бислоя как среды моделирования структуры и топологии мембранных белков была использована пространственная структура моноаминоксидазы А (МАО А) (код PDB 105W) (Ma, 2004). Встраивание белка в оптимизированную модель бислоя из ДПФХ осуществлялось вручную с помощью средств программного комплекса Sybyl 6.9. Моделирование МД с МАО А показало устойчивость последней. Конструирование цитохрома Ь5 в петлевой и трансмембранной топологиях. В связи с тем, что топология мембраносвязанного домена цитохрома Ь5 и его ориентация относительно водорастворимого домена неизвестна, были проанализированы все конформационные возможности и выбраны крайние возможные конформации этого участка. Таким образом, были получены две модели Ь5 в трансмембранной топологии и две модели в петлевой топологии. Все четыре модели были оптимизированы с помощью процедуры минимизации энергии программы Sybyl для уменьшения конфликтов, возникших при конструировании моделей вручную. Оптимизация модели бислоя для моделирования цитохрома Ь5 в транасмембранной и петлевой топологиях. Для моделирования цитохрома Ь5 в Т-топологии была подготовлена модель бислоя со сквозным отверстием для встраивания трансмембранного домена цитохрома Ь5. Для этого было выполнено непродолжительное моделирование МД бислоя с белком, который был вставлен перпендикулярно поверхности бислоя. В связи с тем, что моделирование МД проводилось при переменном объеме, молекулы липидов разошлись, образуя отверстие для мембраносвязанного домена белка.

Для моделирования цитохрома Ь5 в П-топологии модель бислоя была модифицирована другим образом. Из одного монослоя были удалены 23 молекулы ДПФХ для освобождения места под цитохром Ь5 в П-топологии. В результате в монослое образовалась полость и он содержал соответственно всего 146 молекул ДПФХ.

Оптимизация цитохрома Ь5. Среднеквадратичное отклонение аминокислотных остатков (RMS) в процессе моделирования МД определялось как отклонение координат остатков от их начального положения в течение времени. Для верификации было проведено сравнение RMS моделей и оценочных значений RMS, вычисленных из кристаллической структуры на основе B-фактора (Storch, 1995).

Доступная липидам площадь поверхности белка (Бдпфх) вычислялась как разность площади поверхности белка в водном окружении и доступной для воды площади поверхности белка, находящегося в бислое.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Построение и оптимизация модели липидного бислоя из ДПФХ

Модель структуры дипальмитоилфосфатидилхолина была построена с использованием известных пространственных структур холина и глицерофосфата (коды АССНОВ11 и DAHJAX, соответственно) из Кембриджской базы данных CSD (Allen et all., 2002) и моделей пальмитиновой кислоты (рис. 1).

Молекула ДПФХ была размножена и из полученных копий построена первичная модель бислоя (рис. 1). Каждый монослой состоял из 169 молекул ДПФХ, а бислой, соответственно, содержал 338 молекул. Далее была выполнена процедура масштабирования, с помощью которой задавался первоначальный объем ячейки. Он определялся как объем, занимаемый одной молекулой ДПФХ, определенный экспериментально, + 8% для обеспечения свободной динамики молекул липида при оптимизации, умноженный на количество молекул липида. Таким образом, сконструированная ячейка имела следующие линейные размеры: L, х Ц х Ц= 9,2 х9,2 х 5,2 нм, соответственно. С каждой стороны бислоя было добавлено примерно 15000 молекул воды, что увеличило высоту ячейки (Lz) до 15,6 нм (рис. 1). Этот размер ячейки был использован при моделировании взаимодействий белка с бислоем.

Моделирование молекулярной динамит бислоя из ДПФХ. При

моделировании молекулярной динамики (МД) бислоя в первые 10 пс наблюдали ряд переходных процессов, визуально выражавшихся в значительном (до 1,0 нм) расхождении листков бислоя (рис. 2). В следующие 20 пс происходило восстановление и стабилизация системы - листки бислоя сходились и он принимал нормальный вид. Подобные переходные процессы с расхождением листков бислоя были отмечены ранее (Heller et all., 1993). Это обусловлено, по-видимому, большим количеством стерических конфликтов в первоначальной структуре бислоя, сконструированной вручную. Дальнейшее длительное моделирование МД в течение 3,5 не показало высокую стабильность мембраны.

Дипальмитоилфосфатндилхолин СДПФХ)

Холик

Глицерофосфат

Пальмитиновые жирные кислоты

Рисунок 1. Схема конструирования первоначальной модели бислоя (слева) и химическая структура ДПФХ с нумерацией всех тяжелых атомов (справа). Построение модели ДПФХ (а), построение модели бислоя (б), создание водных фаз с двух сторон бислоя (в).

Время 0 пс

10 пс

Рисунок 2. Изменение структуры бислоя из ДПФХ при моделировании МД. Структура бислоя показана на разных этапах моделирования МД в интервале от 0 до 30 пс. Атомы углерода показаны зеленым цветом, кислорода - красным, водорода - белым, азота - голубым, фосфора -фиолетовым, фон - синим.

Время 20 пс

30 пс

Анализ результатов моделирования МД бислоя из ДПФХ. Равновесие системы было достигнуто после 1,3 не моделирования МД. Для анализа свойств бислоя были использованы данные на участке равновесной траектории 2,5 - 3,5 не. Средние значения макроскопических параметров i бислоя приведены в таблице 1. Полученные данные хорошо согласуются с экспериментальными значениями (Nagle, 1993; Nagle et all., 1988). Значения объема и площади, занимаемые одной молекулой липида, вычисленные из * модели сравнивались с экспериментальными значениями, полученными в разных состояниях липидного бислоя - жидко-кристаллическом и состоянии геля. По этим данным полученный нами бислой находится в жидкокристаллическом состоянии. Также о жидко-криталлическом состоянии свидетельствует самоориентация ацильных цепей липидов. Наша модель бислоя имеет значения объема и площади, занимаемые одной молекулой липида, 0,6 нм2 и 1,2 нм3 соответственно, эти значения входят в диапозон полученных ранее на других бислоях из ДПФХ: объем от 0,53 до 0,65 нм2 (Takaoka, 2000), площадь от 1,18 до 1,22 нм3 (Hofsass, 2003; Takaoka, 2000).

Профили распределения плотности атомов и групп атомов в ячейке вдоль нормали Z к мембране показаны на рис. 3. Видно, что распределение атомов хорошо согласуется как с известными экспериментальными данными (Nagle, 1996), так и более ранними моделями (Такаока, 2000). Уменьшение плотности атомов примерно в два раза в середине бислоя (Z = 7,5 нм) также согласуется с экспериментальными данными (Franks, 1977). Вода заходит в область полярных головок липидов, в результате чего гидрофобная часть бислоя, не содержащая воду, составляет примерно 2,0 - 2,5 нм, что также согласуется с известными экспериментальными данными (Egberts et all., 1994).

Параметр порядка (SrD) вдоль жирнокислотных остатков липидов представлен на рис. 4. Видно, что кривая изменения SCD, рассчитанная для системы после 3,5 не моделирования МД, также согласуется с экспериментальными данными (Seelig, Seelig, 1974) - имеется плато в центральной области цепей (углеродные атомы с номера 17 по 23) и снижение SCd в концевой части (углеродные атомы с номера 24 по 30) (Lafleur et all., 1990; Seelig et all., 1977). В середине мембраны ScD ~ 0,1, что свидетельствует о наибольшей подвижности концевых групп.

Для оценки пригодности построенной модели мембраны для моделирования мембранных белков нами был выполнен контрольный эксперимент по моделированию мембраносвязанного белка с известной структурой и мембранной топологией. Для этого была использована пространственная структура моноаминоксидазы А (МАО А).

Мембраносвязанный домен МАО А состоит из короткого неупорядоченного фрагмента и a-спирали. Моделирование МД в системе

Таблица 1. Сравнение полученных расчетных и известных экспериментальных значений макроскопических параметров бислоя из ДПФХ.

Параметр Модель Эксперимент Ссылка

Гель Жидкий кристалл

S (липида), нм2 0,6 0,52 (25°С) 0,71 (50°С) Lis et. al., 1982

0,50 (21°С) 0,68 (50°С) Janiak, 1979

0,49 (25°С) Tardieu, 1973

0,49 (25°С) 0,68 (50°С) Rand, Parsegian, 1989

0,48 (20°С) Sun, 1994

0,63 (50°С) Nagle, 1996

0,57 (50°С) Buldt, 1979

0,67 (44°С) Lewis, Englman, 1983

V (липида), нм3 1,2 1,14 (20°С) 1,23 (50°С) Wiener, 1988

1,14 (20°С) Blazyk, 1979

1,14 (20°С) 1,23 (50°С) Nagle, 1978

1,14 (20°С) 1,23 (50°С) Laggner, 1976

1,23 (50°С) Schmidt, Knoll, 1985

Lz, нм 5,9 6,2 Nagle, 1993

Углерод 19-углерод 19*, нм 2,3 2,4 Buldt, 1979

Углерод 29-углерод 29 , нм 0,7 0,7 Buldt, 1979

Примечание' Б (липида) - площадь проекции "головки" одной молекулы липида, V (липида) -объем, занимаемый одной молекулой липида, I, - толщина бислоя,' - расстояния между соответствующими атомами из разных листков бислоя.

вода/белок/бислой было выполнено в 2 этапа. На первом этапе мембраносвязанный домен МАО А встроили в равновесную модель бислоя. Моделирование МД системы выполняли в течение 2,0 не. Стабильное состояние было достигнуто через 0,5 не. Сравнение мембраносвязанного домена МАО А после моделирования МД и кристаллической структуры показало незначительные изменения в топологии неупорядоченного домена, в то время как структура а-спирали не изменилась. Структурное выравнивание основной цепи этого домена и соответствующего участка из кристаллической структуры МАО А показало хорошее соответствие (RMS = 2,22 А).

60 яг I 140 л А /А ' ...... J \ í V ..........

л i20 ■ I Í

& 0 . к А

3.0 6.0 9.0 Z(HM) 12.0

30 40

г-ажЫ (А)

Рисунок 3. Профили плотности атомов в ячейке вдоль нормали Ъ к поверхности мембраны (а) и соответствующие значения из эксперимента (б) (рисунок взят из Такаока, 2000).

-бислой из ДПФХ,

-вода,

-система ДПФХ/вода,

-группы Р04,

группы N(CH3)3.

0,30

0,20

■о

о (О

0,10

0,00

b-f-f

18 20 22 24 26 Номер углеродного атома

Рисунок 4. Параметр порядка (SCD) атомов жирнокислотных остатков липидов после моделирования МД (черный цвет) и экспериментальные значения (красный цвет) (Seelig, Seelig, 1974).

На втором этапе водорастворимый домен МАО А был присоединен к оптимизированному мембраносвязанному домену. Моделирование МД МАО А в бислое было выполнено в течение 2,0 не. Система вода/бислой/белок

достигла равновесия через 0,4 не. Пространственное совмещение основных цепей МАО А после моделирования МД и кристаллической структуры также показало хорошее соответствие (RMS = 2,45 А) (рис. 5а).

Для оценки роли бислоя в поддержании нативной конформации мембранной части белка был выполнен контрольный эксперимент по моделированию МД МАО А в воде (без бислоя) в течение 1,0 не. Уже после первых 30 пс моделирования МД топология мембраносвязанного участка белка нарушается (в основном а-спираль). Система достигла равновесия только когда а-спираль мембраносвязанного участка приблизилась к глобулярной части белка (рис. 56). Такое поведение мембраного белка в воде согласуется с ранее описанными аналогичными результатами (Dubovskii et all., 2000).

Таким образом, нами была построена модель липидного бислоя, которая хорошо согласуется с известными экспериментальными данными и на примере мембранного белка МАО А была показана ее пригодность для корректного моделирования структуры и топологии периферических мембранных белков.

а б

Рисунок 5. Пространственное совмещение основных цепей кристаллической структуры МАО А (светлый цвет) и модели (темный цвет) после моделирования МД в течение 2,0 не в мембранном окружении (а), после моделирования МД в течение 1,0 не в воде (б).

3.2 Моделирование цитохрома Ь5 в мембранном окружении

Пространственная структура водорастворимого фрагмента микросомального цитохрома Ь5 из печени быка была решена методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 1,5 А (индекс PDB 1CYO) (Durley et all., 1996) и доступна в белковом банке PDB (Berman et all., 2000). В тоже время пространственная структура мембраносвязанного домена до сих пор остается неизвестной.

Существуют два предположения о структуре мембраносвязанного домена Ь5. Согласно первому мембранный участок Ь5 имеет форму петли (П-топология) - С-конец белка выходит из мембраны с той же стороны, где расположен белок (Ozols, 1989; Tajima, 1980) (рис. 6а). По другой гипотезе -мембранный домен Ь5 является трансмембранным и пересекает мембрану насквозь (Т-топология) (Vergeres, 1995) (рис. 66).

Современные компьютерные технологии пока не могут адекватно моделировать процесс встраивания белка в бислой. В связи с этим нами было выполнено моделирование микросомального цитохрома Ь5 в двух альтернативных конформациях мембранного якоря, встроенного в оптимизированный бислой. Для этого была использована пространственная структура водорастворимого домена цитохрома Ь5 из печени быка (аминокислотные остатки 5-88) и модель мембранного домена (аминокислотные остатки 89-133), построенная вручную в разных конформациях.

Ранее в работе (Ozols, 1989) в экспериментах по обработке карбоксипептидазой Y однослойных липосом со встроенным Ь5 было показано, что 6 аминокислотных остатков (128-133) мембраносвязанного домена цитохрома Ь5 оказываются внутри липосомы. Другими авторами показано, что после действия протеаз фрагмент 103-127 остается в мембране (Tajima, 1980). В работе (Vergeres, 1995) был выделен гидрофобный фрагмент, содержащий 22 незаряженных аминокислотных остатка (104-126). На основе этих экспериментальных данных мембраносвязанный домен был условно разделен на три участка: соединительный участок (Ser89-Aspl03), мембраносвязанный участок (Serl04-Tyrl26) и С-концевой (Hisl27-Asnl33) (рис. 7).

На первом этапе конструирования мембраносвязанного домена была предсказана его вторичная структура. Мембраносвязанный участок Ь5 был определен всеми программами как а-спираль, С-концевой и соединительный - неупорядоченные участки.

Топология соединительного участка относительно водорастворимого домена неизвестна, но считается, что он является очень подвижным участком в белке (Clarke, 2004). Анализ области соединения водорастворимого и трансмембранного домена показал, что возможно множество конформаций соединительного участка. Для моделирования нами были выбраны две крайние возможные конформации этого участка.

Рисунок 6. Две возможные топологии мембранного якоря: петлевая (а), трансмембранная (б).

CYTB5 BOVIN

90 100 110 120

ISKITKPSESIITTIDSNPSWWTNWLIPAISAL -%--

130

FVALIYHLYTSEN

t <t i Ii in

Рисунок 7. Аминокислотная последовательность цитохрома Ь5 из микросом печени быка. Водорастворимый домен выделен серым, три участка мембраносвязанного домена:

I - соединительный участок, II - мембраносвязанный участок, III - С-кон-цевой участок.

Все четыре модели белка (рис. 8) были первоначально оптимизированы процедурой минимизации энергии в вакууме для решения стерических конфликтов, возникающих вследствие конструирования моделей вручную. Полученные структуры были использованы для дальнейшего моделирования МД.

Модель TI

МодельТ2

Модель П1

Модель П2

Рисунок 8. Предварительные модели пространственной структуры цитохрома Ь5 в Т-топологии (модели Т1 и Т2) и П-топологии (модели П1 и

Светлым показаны водо-растворимые домены, темным - мембраносвязанные домены.

Моделирование МД цитохрома Ь5 в трансмембранной топологии. Моделирование цитохрома Ь5 в Т-топологии происходило в два этапа. На первом этапе была получена модель бислоя со сквозным отверстием для размещения трансмембранного домена цитохрома Ь5. На втором этапе в оптимизированный для Т-топологии липидный бислой вставляли предварительно сконструированные модели цитохрома Ь5. Ранее было показано, что триптофановые остатки 108, 109 и 112 находятся в области углеродов 21-24 ацильных цепей липидов (нумерация атомов на рис. 1) (Markello, 1984). В трансмембранной топологии водорастворимый домен располагался таким образом, что он не участвовал во взаимодействии с головками бислоя. После добавления воды полученные системы использовали для дальнейшего моделирования.

Моделирование МД с обеими моделями цитохрома Ь5 в Т-топологии проводилось в течение 3,0 не. Для модели Т1 равновесие по энергии было достигнуто через 0,2 не моделирования МД, среднее значение потенциальной энергии составило -1,31х10б кДж/моль. Однако стационарного состояния по величине RMS система достигла только через 1 не (рис. 9). Для модели Т2 равновесие по энергии было достигнуто через 0,3 не моделирования МД (среднее значение потенциальной энергии составляло -1,28х106 кДж/моль), а по величине RMS через 1,5 не (рис. 9).

П2).

0.3

Рисунок 9. Изменение

ее. 0.1

а а>

2 0.2 х

величин RMS основных цепей модели Т1 (черный) и Т2 (серый).

0.0

1.0

2.0

3.0

Время модолировнания МД (не)

Гем в стартовых моделях располагался приблизительно под углом 90° к плоскости поверхности бислоя. После моделирования МД в течение 1,3 не системы с моделью Т1, гем занял положение под углом приблизительно 45° к поверхности бислоя и данное положение оставалось постоянным до конца моделирования. Тот же угол 45° между плоскостями гема и мембраны был получен после 0,9 не моделирования МД в системе, с моделью Т2. Ранее было показано, что угол 45° является оптимальным для передачи электронов от цитохрома Ь5 к его редокс-партнерам (Yeung, 1999).

В течение всего моделирования МД конформация водорастворимого домена оставалась стабильной в обеих системах (рис. 10), а мембраносвязанный домен был перпендикулярным к поверхности бислоя. Таким образом, в течение моделирования изменялась конформация соединительного участка, что обуславливало изменение угла наклона водорастворимого домена в плоскости, параллельной тему. Наиболее стабильной была модель T1 (RMS равнялось 1,3 и 1,9 А для моделей Т1 и Т2, соответственно). Основные изменения в конформации мембраносвязанного домена в обеих моделях наблюдались в первые 1,0 не моделирования МД и в г дальнейшем обе системы оставались стабильными.

В начале динамики в обеих моделях происходило нарушение структуры а-спирали в центре (Тгр109 - Ьеи113). Основные различия в поведении мембраносвязывающего участка в двух анализируемых моделях наблюдались в области а-спирали, расположенной ближе к водорастворимому домену. Если в модели Т1 неупорядоченный участок составил 3 аминокислотных остатка, то в модели Т2 неупорядоченный участок был более протяженным и составил 8 аминокислотных остатков.

Рисунок 10. Пространственное совмещение основных цепей начальной структуры в Т-топологии (светлый цвет) и после моделирования МД системы бислой/белок/вода в течение 3,0 не (темный цвет). Совмещено по мембра-носвязанному домену, а-модель Т1, б - модель Т2.

Сопоставление среднеквадратичного отклонения аминокислотных остатков в процессе моделирования МД с вычисленным го В-фактора кристаллической структуры цитохрома Ь5 показано на рис. 11а. RMS из моделирования МД хорошо согласуется с RMS кристаллической структуры цитохрома Ь5. В обеих моделях наиболее подвижными участками являются N- и С-концы белка. Кроме того, в области водорастворимого домена наблюдаются два пика: остатки 40-46, 62-70 (рис. 11). Считается, что повышенная подвижность этих участков белка имеет физиологическое значение и связана со значительными структурными перестройками в глобулярной части цитохрома Ь5 при взаимодействии с партнерами и передаче электронов (Mathews, 1972).

В модели Т1 наблюдался дополнительный пик RMS в области остатков 19-25, который также виден и в кристаллической структуре. Отсутствие пика на графике для модели Т2 обусловлено тем, что в ней эта область стабилизирована взаимодействием с соединительным участком Ser89-Aspl03. Поскольку кристаллическая структура содержит только водорастворимый домен, то область остатков 19-25 у него является подвижной.

Номер аминокислотного остатка б в

Рисунок 11. Среднеквадратичное отклонение аминокислотных остатков (RMS), рассчитанное из кристаллической структуры (черный цвет) и моделей Т1 (синий цвет) и Т2 (зеленый цвет) в моделировании МД в промежутке 1,02,5 не (а) и наиболее подвижные области в водорастворимом домене в Т1 (б) и в Т2 (в): Leu40 - Gly46 (красный), Phe62 - Asp70 (желтый) и Hisl9 - Thr25 (оранжевый).

I - водорастворимый домен, II - соединительный участок, III -мембраносвязанный участок, IV - С-концевой участок.

На рис. 12 показана площадь поверхности аминокислотных остатков цитохрома Ь5, доступной для липидов. Видно, что точка действия трипсина, разделяющего Ь5 на водорастворимый и мембраносвязанный домены (Aspl03) (Tajima, 1980; Ozols, 1989), доступна для воды в обеих моделях.

Для оценки стабильности мембраносвязанного домена в трансмембранной топологии был выполнен контрольный эксперимент по моделированию МД модели Т1 вне бислоя (в водном окружении) в течение >

1,0 не. Уже после 0,3 не моделирования МД топология мембраносвязанного участка белка нарушилась - произошел излом мембраносвязанного участка в области Рго115. Такое поведение мембранного участка цитохрома Ь5 согласуется поведением в аналогичном эксперименте МАО А, белка с известной трансмембранной топологией мембранного якоря, а

о so toe

Номер аминокислотного остатка

Рисунок 12. Доступная для липидов площадь поверхности моделей Т1(а) и Т2(б) после моделирования МД в течение 2,5 не.

Моделирование МД цитохрома Ь5 в петлевой топологии. Моделирование цитохрома Ь5 в петлевой топологии, как и в трансмембранной, происходило в два этапа. На первом этапе была модифицирована модель бислоя, в котором из одного монослоя были удалены 23 молекулы ДПФХ для освобождения места под цитохром Ь5 в петлевой топологии. В результате этот монослой содержал 146 молекул ДПФХ. На втором этапе в подготовленный липидный бислой вставляли предварительно сконструированные модели цитохрома Ь5 в П-топологии.

Степень погружения в бислой моделей в П-топологии соответствовала экспериментальным данным по флуоресценции триптофановых остатков и области действия протеаз (Markello, 1985; Ozols, 1989; Tajima, 1980). После добавления воды полученные системы использовали для дальнейшего моделирования.

Моделирование МД цитохрома Ь5 в П-топологии проводилось в течение 3,0 не. Модель П1 достигла стационарного состояния по энергии через 0,25 не моделирования МД, среднее значение потенциальной энергии составило -1,20х106 кДж/моль. Для модели П2 стационарное состояние было достигнуто еще быстрее (через 0,2 не) и среднее значение потенциальной энергии было немного ниже (-1,22х106 кДж/моль). Однако стационарного состояния по величине RMS для модели П1 в течение 3,0 не моделирования МД достигнуто не было, в то время как для модели П2 стационарное состояние было достигнуто через 1,5 не (рис. 13).

В течение всего моделирования конформация водорастворимого домена в обеих моделях оставалась стабильной. Модели отличались тем, что в модели П2 наблюдалось сближение мембраноевзязанного и водорастворимого доменов, в то время как у модели П1 возникал дефект бислоя в области взаимодействия с белком.

Время моделирования МД. не

Рисунок 13. Изменение величин RMS основных цепей моделей П1 (черный) и П2 (серый).

В начальных конформациях гем располагался под углом 60° к плоскости мембраны. При моделированиии МД происходило медленное изменение положения гема в разных направлениях. В результате угол между плоскостью гема и плоскостью мембраны составил примерно 90° для модели П1 и 45° для модели П2.

Модель П2 оказалась более стабильной (RMS = 1,5 А) по сравнению с П1 (RMS = 2,5 А). Основные изменения в конформации мембраносвязанного домена в обеих моделях наблюдались в первые 0,3 не моделирования МД. При этом изменения вторичной структуры мембраносвязанного домена не наблюдались (рис. 14).

Среднеквадратичное отклонение аминокислотных остатков цитохрома Ь5 в П-топологии при моделировании МД представлено на рис. 15. Наиболее подвижными участками в обеих моделях являются N и С-концы. В водорастворимом домене модели П2 наблюдались два небольших пика (остатки 40-46, 63-68) в той же области, что и в моделях Т-топологии.

На рис. 16 показано распределение доступной для липидов площади поверхности моделей в бислое. Видно, что известные из литературы области действия протеаз (аминокислотные остатки 103 и 127) (Tajima, 1980; Ozols, 1989), доступны для воды в обеих моделях. В модели П2 наблюдалось существенное взаимодействие водорастворимого домена белка с бислоем (аминокислотные остатки 9-24, 48-56, 84-88).

Рисунок 14. Пространственное совмещение основных цепей стартовой (светло-серый) и после моделирования МД в течение 3,0 не (темно-серый) моделей П1 и П2. Совмещение выполнено по водорастворимому домену.

Номер аминокислотного остатка

Рисунок 15. Среднеквадратичное отклонение аминокислотных остатков (RMS), рассчитанные из кристаллической структуры (черный) и моделей П1 (зеленый) и П2 (синий) при моделировании МД в промежутке 1,0-2,5 не. I - водорастворимый домен, II - соединительный участок, III - мембра-носвязанный участок, IV - С-концевой участок.

а б

Рисунок 16. Доступная для липидов площадь поверхности моделей П1 (синий) и П2 (зеленый) цитохрома Ь5 после моделирования МД в течение 2,5 не (а) и участки водорастворимого домена в модели П2, взаимодействующие с бислоем (голубым цветом) (б). Водорастворимый домен показан темным, мембраносвязанный - светлым цветом.

Сопоставление характеристик моделей П1 и П2 цитохрома Ь5 позволяет сделать заключение, что структура белка в модели П2 более взаимносогласована и, по-видимому, более точно отражает структуру цитохрома Ь5 в П-топологии.

4. ОБСУЖДЕНИЕ

Основные характеристики исследованных моделей полноразмерного цитохрома Ь5 в мембранном окружении представлены в таблице 2| Сопоставление параметров моделей П1 и П2 показывает, что модель П2 обладает лучшими характеристиками по сравнению с П1. Этот вывод подтверждается также тем, что в процессе моделирования МД в модели П2 происходит сближение водорастворимого и мембраносвязанного доменов, в результате чего практически исчезает пустое пространство между доменами и ряд аминокислотных остатков водорастворимого домена контактирует с полярными головками липидов. Подобный эффект сближения водорастворимого и мембраносвязанного доменов наблюдался ранее при моделировании цитохрома Ь5 в П-топологии в системе бензол/вода (Иванов, 2000). Модель П2 является также более стабильной, чем модель П1 исходя из значений потенциальной энергии и RMS. Негативным фактором является влияние положения мембраносвязанного домена в модели П1 (С-концевая область) на подвижность участков в водорастворимом домене (Leu40 - Gly46, Phe62 - Asp70, Hisl9 - Thr25), важных для формирования комплексов с редокс-партнерами и переноса электронов. Все эти данные указывают на то, что модель П2 лучше соответствует структуре цитохрома Ь5 в петлевой конформации мембранного домена.

Сопоставление расчетных параметров моделей Т1 и Т2 показывает, что модель Т1 более устойчива. Это выражается в меньших величинах потенциальной энергии системы и RMS белка при моделировании МД, а также в более быстром достижении стационарного состояния по RMS. Кроме того, в модели Т1 мембраносвязанный участок остается более структурированным, чем в модели Т2. Таким образом, эти данные указывают, что модель Т1 более точно отражает структуру цитохрома Ь5 в бислое в трансмембранной топологии.

Изучение процесса встраивания цитохрома Ь5 в клеточные мембраны показало, что этот процесс происходит посттрансляционно (Vergeres, 1995), не связан с SRP-частицами (Vergeres, Waskell, 1995) и не является АТФ-зависимым (High, Abell, 2004). Исследования с использованием специфических антител и цитохрома Ь5, связанного с тагом гликозилирования (глик-Ь5), показали, что в мембране этот белок присутствует в основном в трансмембранной конформации (Honsho, 1998; Hanlon, 2000). В одной из работ было показано, что при введении глик-Ь5 в клетку, обнаруживались оба варианта топологии белка: часть белка находилась в Т-топологии, часть белка в П-топологии. Через некоторое

Таблица 2. Основные характеристики моделей цитохрома Ь5.

Параметр Модель П1 Модель П2 Модель Т1 Модель Т2

Средняя потенциальная энергия, кДж/моль, х106 -1,20 -1,22 -1,31 -1,28

Угол между гемом и бислоем,град. 60 0=0 не) 90 0=3,0 не) 60 (1=0 не) 45 0=3,0 не) 90 0=0 не) 45 0=3,0 не) 90 (1=0 не) 45 0=3,0 не)

Пространственное выравнивание основных цепей стартовой модели и модели после 3,0 не моделирования МД (ЯМБ), А 2,5 1,5 1,3 1,9

Области подвижных остатков водорастовримого домена нет Ьеи40-ау46, аи63-8ег68 Ьеи40-СТу46, РЬе62-Авр70, Шв19 -ТЬг25 Ьеи40 - ау46, РЬе62 - Авр70

Изменения структуры мембраносвязанного домена и бислоя Дефект бислоя Структуры согласованы 2 а-спирали, разрыв - 3 остатка 2 а-спирали, разрыв -8 остатков.

Взаимодействие участка №в19 -ТЬг25 с бислоем или белком с С-концом бежа с бислоем — с соединительным участком белка

Расстояние между Са-атомами 8ег22 и А1а54, нм 0,95 1,22 1,13 1,02

Доступность протеазам (Дер 103, Н1б127) есть есть есть есть

Взаимодействие водорастворимого домена с бислоем — Ьув9 - Бег24, С1и48-01у56, №в84 - Агя88 — Н1в84, Авр86

время практически весь белок переходил в Т-топологию, при этом авторы не зарегистрировали перехода цитохрома Ь5 из Т- в П-топологию (НопвЬо, 1998). Эти экспериментальные данные указывают на то, что Т-топология мембранного участка цитохрома Ь5, по видимому, является физиологической формой этого белка в клеточных мембранах, а конформация белка в П-топологии может присутствовать только как временная форма в процессе встраивания цитохрома Ь5 в мембрану. Противоречивые данные о топологии мембраносвязанного домена могут быть обусловлены также разными

временами регистрации. В равновесной системе цитохром Ь5 находился в Т-топологии, тогда как в короткие времена после введения белка, регистрировался цитохром Ь5 в П-топологии. В наших контрольных исследованиях при моделировании цитохрома Ь5 в Т-топологии в воде происходил излом мембранного якоря в районе Pro 115, что свидетельствует о том, что цитохром Ь5 может находиться в топологии, близкой к петлевой при встраивании в бислой из водной фазы.

Переход топологии мембраносвязанного домена из петлевой в трансмембранную возможен при переходе амидной связи Ие114 - Рго115 из цис- в транс- положение. Энергетически невыгодно нахождение пролинового остатка в цис-положении (Richardson, 1981; Abeles, 1992; Vergeres, Waskell, 1995).

В Т-топологии наиболее стабильной является модель Т1, основное различие моделей Т1 и Т2 заключается в разной конформации соединительного участка (Ser89 - Aspl03). В модели Т2 он взаимодействует с петлей His 19 - Thr 25, тогда как в модели Т1 этот участок расположен свободно. Таким образом, конформация соединительного участка относительно водорастворимого домена может оказывать влияние как на структуру и стабильность мембраносвязанного участка, так и на функцию белка.

Для оценки роли связывающего участка были проанализированы изменения в водорастворимом домене в обеих моделях, а также проанализированы районы потенциального взаимодействия Ь5 с редокс-партнерами. В настоящее время считается, что перенос электронов возможен по двум путям (рис. 17) (Storch, Daggett, 1995; Horn, 2ООО). Согласно первому из них, при переносе электронов гемы цитохрома Ь5 и редокс-партнеров располагаются в одной плоскости, и во взаимодействие вовлекаются аминокислотные остатки спиралей аЗ, а4 и петли между ними (Glu44, Glu48, Asp 60) (Rodgers, 1988) (рис. 17a). Согласно второму варианту пути переноса электронов, гемы редокс партнеров и цитохрома Ь5 располагаются перпендикулярно друг другу, при этом функционально важное значение имеет петля al-ß2 (аминокислотные остатки His 19 - Thr 25), которая, изменяя конформацию, регулирует доступ к гему (Нош, 2000; Storch, Daggett, 1995) (рис. 176). В настоящее время есть экспериментальные данные, подтверждающие возможность существования обоих путей передачи электронов (Storch, Daggett, 1995; Horn, 2000). Анализ подвижности аминокислотных остатков в ходе моделирования МД показал, что наблюдается повышенная подвижность участков, связанных с обоими путями переноса электронов (в модели Т1 Leu 40 - Gly 46, Phe 62 - Asp 70, His 19 -Thr 25).

Рисунок 17. Возможные варианты ориетации гемов цитохрома Ь5 и его редокс-партнеров.

а - положением гемов редокс-партнеров в одной плоскости, б - положением гемов редокс-партнеров перпендикулярно друг другу.

В работе других авторов по моделированию взаимодействия цитохрома Ь5 с цитохромом С (Нот et all., 2000) методом ручного докинга с последующей МД было показано, что стабильные комплексы могут сформироваться для обоих путей передачи электронов. Комплекс между цитохромами Ь5 и С с расположением гемов в одной плоскости характеризовался небольшой площадью контакта, но близким расположением атомов железа гемов (15-17 А). В комплексе цитохром Ь5-цитохром С для переноса электронов при перпендикулярном положении гемов расстояние между атомами железа гемов было большим (21 А), но площадь контакта белков была больше, что предполагает формирование более долгоживущего комплекса. В наших модельных экспериментах на f возможность формирования комплекса цитохрома Ь5 со своими редокс-

партнерами указывает анализ липофильного потенциала поверхности моделей цитохрома Ь5 (рис. 18). Видно, что в модели Т1 имеются две ( выраженных гидрофобных области. Первая область имеет небольшой размер

и образована частичным открыванием петли al-P2, вторая область сформирована гидрофобными остатками водорастворимого домена и соединительного участка мембраносвязывающего домена. Обе эти области располагаются в районах образования комплекса цитохрома Ь5 с его редокс-партнерами. В модели Т2 такие области отсутствует.

Рисунок 18. Поверхности моделей Т1, Т2 и кристаллической структуры водорастворимого домена цитохрома Ь5, раскрашенные по величине липофильного потенциала (ЬР). Максимальные значения ЬР - коричневый цвет, минимальное - синий. Выделены остатки, которые являются важными для передачи электронов, желтым выделены гидрофобные области, а - путь переноса электронов с перпендикулярным положением гемов редокс партнеров,

б - путь переноса электронов с положением гемов редокс партнеров в одной плоскости.

Вышеперечисленные данные указывают на то, что в реальных условиях соединительный домен может выполнять регуляторную роль, участвуя в образовании контакта между цитохромом Ь5 и его редокс партнерами. На наличие у цитохрома Ь5 двух мест связывания с другими белками также указывают экспериментальные данные, полученные при титровании цитохрома Ь5 цитохромом С (Нот, 2000). Наблюдалось

стехиометрия цитохром Ь5 : цитохром с = 1 : 2. Так же было зарегистрировано образование тройного комплекса флавопротеин - цитохром Р450 2В4 - цитохром Ь5 (Kuznetsov, 2004).

ВЫВОДЫ

1. Построена компьютерная модель среды для моделирования периферических мембранных белков, состоящая из липидного бислоя и двух водных фаз. На примере мембранного белка моноаминоксидазы А с известной пространственной структурой и мембранной топологией показано, что данная среда может быть использована для моделирования мембранных белков.

2. Построены модели цитохрома Ь5 в трансмембранной и петлевой топологиях. Моделирование молекулярной динамики показало стабильность обоих вариантов, что предполагает возможное существование Ь5 в двух топологиях и объясняет существующие противоречивые экспериментальные данные.

3. Анализ построенных моделей цитохрома Ь5 показал, что конформация участка Ser89-Aspl03, соединяющего водорастворимый и мембраносвязанный домены, может играть важную роль в регуляции взаимодействия цитохрома Ь5 с его редокс-партнерами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. A.S. Ivanov, V. Skvortsov, A. Sechenykh, Y. Smolinskaya, A. Archakov. Trends and new perspectives in 3D modeling of cytochrome P450. // 2th International conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine", Moscow-Pies-Moscow, 2004, 3.2.

2. Ю.Ю. Смолинская, A.B. Веселовский, A.C. Иванов. Моделирование структуры моноаминоксидазы А в мембранном окружении. // Тезисы XII Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство", Москва, 2005,

3. Ю.Ю. Смолинская, A.B. Веселовский, A.C. Иванов Полноатомная компьютерная модель бислойной мембраны из дипаль-митоилфосфатидилхолина. // Тезисы 4-ой Национальной конференции "Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины", Москва, 2005.

4. A.C. Иванов, B.C. Скворцов, A.A. Сеченых, Ю.Ю. Смолинская, А.И. Арчаков. Проблемы и перспективы моделирования трехмерных структур цитохромов Р450. // Тезисы 4-ой Всероссийской конференции "Молекулярное моделирование", Москва, 2005, 29.

5. A.S. Ivanov, Y.Y. Smolinskaya, АЛ. Archakov Computer simulation of full-length cytochrome b5 in explicit lipid bilayer. // 14th International Conference on Cytochromes P450: Biochemistry, Biophysics and Bioinformatics, Dallas, USA, 2005.

6. Ю.Ю. Смолинская, A.B. Веселовский, A.C. Иванов Полноатомная компьютерная модель бислойной мембраны с МАО А. // Биомедицинская химия, 2004, 50,451-459.

РЫБ Русский фонд

2007-4 6699

0 9 КС:: 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смолинская, Юлия Юрьевна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Моделирование липидных бислоев

2.1.1. Необходимость моделирования бислоев

2.1.2. Типы моделей мембран

2.1.3. Методы моделирования

2.1.4. Моделирование молекулярной динамики бислоя

2.1.5. Верификация моделей мембран

2.2. Моделирование мембранных белков и пептидов

2.2.1. Моделирование мембранных пептидов

2.2.2. Моделирование белков в липидном бислое

2.2.3. МАО А

2.3. Функции и свойства цитохрома Ь

2.3.1. Функции, структура и свойства цитохрома Ь

2.3.2. Моделирование мембраносвязанного домена цитохрома Ь

3. Объекты и методы

3.1. Аппаратная и программная база работы

3.2. Объекты

3.3. Конструирование молекулы ДПФХ

3.4. Конструирование липидного бислоя из ДПФХ

3.5. Оптимизация бислоя из ДПФХ

3.6. Верификация модели мембраны

3.7. Подтверждение пригодности модели бислоя из ДПФХ для моделирования мембранных белков

3.8. Конструирование цитохрома Ь5 в петлевой и трансмембранной топологии

3.9. Оптимизация модели бислоя для моделирования цитохрома Ь5 в трансмембранной и петлевой топологиях

3.10. Оптимизация цитохрома Ь

4. Результаты

4.1. Построение и оптимизация модели липидного бислоя из ДПФХ

4.1.1. Моделирование МД бислоя из ДПФХ

4.1.2. Анализ результатов моделирования МД бислоя из ДПФХ 51 4.2 Моделирование цитохрома Ь5 в мембранном окружении

4.2.1. Моделирование МД цитохрома Ь5 в трансмембранной топологии

5. Обсуждение

6. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Моделирование структуры и мембранной топологии цитохрома b5"

Цитохром Ь5 является мембранным белком, который присутствует в различных клеточных мембранах. Основная физиологическая функция Ь5 - латеральный и межмембранный перенос электронов, включая восстановление цитохромов Р450 (Archakov et al., 1974), реакции десатурации жирных кислот (Strittmatter et al., 1974), биосинтез холестерола (Clarke et al., 2004) и реакции гидроксилирования (Vergeres et al., 1995).

Микросомальный цитохром Ь5 представляет собой двухдоменный мембранный белок, "заякоренный" С-концом в мембране. С помощью трипсина он может быть разделен на водорастворимый гем-содержащий глобулярный домен, сохраняющий физико-химические и окислительно-восстановительные свойства Ь5, и мембранный гидрофобный домен (Tajima et al., 1978). Пространственная структура водорастворимого домена была решена с помощью рентгеноструктурного анализа (Mathews et al., 1972а; Mathews et al., 19726) и доступна в белковом банке PDB (Berman et al., 2000). Пространственная структура мембраносвязанного домена до сих пор остается неизвестной. Предполагают 2 возможные мембранные топологии этого домена. Согласно одной из них мембранный участок Ь5 имеет форму шпильки - С-конец белка выходит из мембраны с той же стороны, где расположен белок (Ozols, 1989; Tajima et al., 1980). По другой гипотезе - мембранный домен Ь5 является трансмембранным и пересекает мембрану насквозь (Vergeres et al., 1995).

Анализ пространственной структуры белков базируется на комбинации методов молекулярной биологии, биохимии, ЯМР и кристаллографии (McPherson, 2002; Drenth, 1994). Однако такие подходы пригодны в основном для водорастворимых белков и поэтому пока определены только единичные структуры мембранных белков. Это обусловлено существующими проблемами их экспрессии и кристаллизации. Дефицит данных о молекулярном строении мембранных белков стимулирует применение методов молекулярного моделирования (Chang et al., 1996).

Поскольку конформация мембраносвязанных частей белков обусловлена взаимодействием с липидным бислоем, то для корректного моделирования мембранных белков необходимо использовать адекватную среду в виде модели липидного бислоя с двумя водными фазами с обеих сторон. В последние годы моделированию таких белков в мембранном окружении было посвящено много работ (Saiz et al., 2002; Forrest et al., 2000; Tieleman et al., 1997). Однако, до сих пор проблема создания адекватной модели липидного бислоя, хорошо отражающей свойства биологической мембраны, остается.

Оценку достоверности построенной модели бислоя и ее пригодности для моделирования мембранных белков необходимо проводить на основе расчетных и экспериментальных данных (Ивков и др., 1981; Ивков и др., 1982). Для верификации модели бислоя могут быть использованы такие расчетные параметры, как объем и площадь поверхности бислоя, приходящиеся на одну молекулу фосфолипида; распределение различных групп атомов вдоль нормали к бислою; ориентация отдельных метиленовых фрагментов алифатической цепи (параметр порядка) (McCabe et а]., 1994). Для проверки пригодности модели бислоя для моделирования его структуры необходимо выполнение контрольного моделирования с использованием периферического белка, структура и топология которого известны. В белковом банке PDB (Вегшап et al., 2000) имеется всего 88 структур мембраносвязанных белков (http://blanco.biomol.uci.edu /MembraneProteinsxtal.html), большинство из которых являются большими интегральными белками (Ulmschneider et al., 2001). Поэтому в качестве контрольного мембраносвязанного периферического белка была выбрана моноаминооксидаза А (МАО А). Ее структура и мембранная топология недавно были решены методами белковой кристаллографии (Ma et al., 2004).

Целью данной работы было моделирование пространственной структуры цитохрома Ь5 в мембранном окружении и анализ возможных вариантов топологии мембраносвязанного домена этого белка.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

3. Выполнить моделирование структуры и мембранной топологии цитохрома Ь5 в мембранном окружении.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые выполнено моделирование молекулярной динамики полноразмерного цитохрома Ь5 в мембранном окружении в трансмембранной и петлевой топологиях. Моделирование показало стабильность обоих вариантов, что предполагает существование Ь5 в двух топологиях и объясняет противоречивые экспериментальные данные.

Полученные модели полноразмерного цитохрома Ь5 могут быть использованы для изучения взаимодействия цитохрома Ь5 с редокс-партнерами в плоскости мембраны.

Апробация работы

Основные положения диссертации были доложены на следующих конференциях:

1. 2th International conference "Genomics, Proteomics and Bioinformatics for Medicine" (Moscow-Pies-Moscow, 2004);

2. XII Российский Национальный Конгресс "Человек и лекарство" (Москва, 2005);

3. 4-я Национальная конференция "Информационно-вычислительные технологии в решении фундаментальных научных проблем и прикладных задач химии, биологии, фармацевтики, медицины" (Москва, 2005);

4. 4-я Всероссийская конференция "Молекулярное моделирование" (Москва, 2005);

5. 14th International Conference on Cytochromes P450: Biochemistry, Biophysics and Bioinformatics (Dallas, USA, 2005).

По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Положения, выносимые на защиту

2. Построены модели цитохрома Ь5 в мембранном окружении в трансмембранной и петлевой топологиях. Моделирование молекулярной динамики показало стабильность обоих вариантов, что предполагает существование Ь5 в двух топологиях и объясняет противоречивые экспериментальные данные.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Смолинская, Юлия Юрьевна

6. ВЫВОДЫ

2. Построены модели цитохрома Ь5 в трансмембранной и петлевой топологиях. Моделирование молекулярной динамики показало стабильность обоих вариантов, что предполагает возможное существование Ь5 в двух топологиях и объясняет различные экспериментальные данные.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смолинская, Юлия Юрьевна, Москва

1. Abeles I., Frey P., Jencks W. Biochemistry. Jones and Bartlett. Boston. 1992. 218.

2. Allen F.H. The Cambridge Structural Database: a quarter of a million crystal structures and rising.// Acta Cryst. 2002. B58. 380-388. (http://www.ccdc.cam.ac.uk)

3. Allen T.W., Bastug Т., Kuyucak S., Chung S.H. Gramicidin A channel as a test ground for molecular dynamics force fields.// Biophys. J. 2003. 84. 4. 2159-68.

4. Archakov A.I., Karyakin A.V., Skulachev V.P. Intermembrane electron transfer in mitochondrial and microsomal systems.// FEBS Lett. 1974. 39. 239-242.

5. Areas E.P., Pascutti P.G., Schreier S., Mundin K.C., Bisch P.M. Molecular dynamics at a cytoplasm/membrane interface of a signal sequence from an E. coli maltoporin.// Braz. J. Med. Biol. Res. 1994. 27. 527-33.

6. Bachar, M., Becker, O.M. Protein-induced membrane disorder: a molecular dynamics study of melittin in a dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer.// Biophys. J. 2000. 78. 13591375.

7. Balali-Mood K, Harroun ТА, Bradshaw JP. Molecular dynamics simulations of a mixed DOPC/DOPG bilayer.// Eur Phys J E Soft Matter. 2003. 1.135-40.

8. Banci L., Bertini I., Branchini B.R., Hajieva P., Spyroulias G.A., Turano P. Dimethyl propionate ester heme-containing cytochrome b5: structure and stability. //J.Biol.Inorg.Chem. 2001. 6. 490-503.

9. Bechinger B. Structure and functions of channel-forming peptides: magainins, cecropins, melittin and alamethicin.//J. Mem. Biol. 1997.156.197-211.

10. Ben-Tal N., A. Ben-Shaul A. Nicholls and B. Honig. Free-energy determinants of alpha-helix insertion into lipid bilayers.// Biophys. J. 1996. 70.1803-1812.

11. Berendsen H.J.C., D. van der Spoel, van Drunen R. GROMACS:A message-passing parallel molecular dynamics implementation.// Сотр. Phys. Comm. 1995. 95. 43-56.

12. Berendsen H.J.C., J.P.M. Postma, W. F. Van Gunsteren, A. DiNola, J.R. Haak. Molecular dynamics with coupling to an external bath.// J. Chem. Phys. 1984. 81. 3684-3690.

13. Berger O., Edholm O., Jahnig F. Molecular dynamics simulations of a fluid bilayer of dipalmitoylphosphatidylcholine at full hydration, constant pressure, and constant temperature.// Biophys. J. 1997. 72. 2002-2013.

14. Berman H.M., Westbrrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank.// Nucleic Acids Res. 2000. 28. 235-242. (http://www.rcsb.org/pdb/)

15. Berneche S., Nina M., Roux B. Molecular dynamics simulation of melittin in a dimyristoylphosphatidylcholine bilayer membrane.// Biophys. J. 1998. 75.1603-1618.

16. Biggin P.C., Sansom M.S. Interactions of alpha-helices with lipid bilayers: a review of simulation studies.// Biophys Chem. 1999.76.3.161-183.

17. Biggin P.C., Sansom M.S.P. Simulation of voltage-dependent interactions of c-helical peptides with lipid bilayers.// Biophys. Chem. 1996. 60. 99-110.

18. Blazyk J.F., Melchoir D.L., Steim J.M. An automated differential scanning dilatometer.// Anal Biochem. 1975. 68.2.586-599.

19. Brooks B.R., Bruccoleri R.E., Olafson B.D., States D.J., Swaminathan S., Karplus M. CHARMM: A program for macromolecular energy, minimization, and dynamics calculations.//J. Сотр. Chem. 1983. 4. 187-217.

20. Buldt G., Gaily H.U., Seelig J., Zaccai G. Neutron diffraction studies on phosphatidylcholine model membranes. I. Head group conformation.// J Mol. Biol. 1979. 134.4. 673-691.

21. Buldt G., Gaily H.U., Seeling J., Zaccai G. Neutron diffraction studies on phosphatidylcholine model membranes. I. Head group conformation. //J. Mol. Biol. 1979. 134. 673-691.

22. Burkhart B.M., Li N., Langs D.A., Pangborn W.A., Duax W.L. The conducting form of gramicidin A is a right-handed double-stranded double helix.// Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1998. 95. 22.12950-12955.

23. Capener C.E., Sansom M.S.P. MD Simulations of а К channel model-sensitivity to changes in ions, waters and membrane environment.// J. Phys. Chem. В 2002.106. 4543-4551.

24. Chang Y.T., Stiffelman O.B., Loew G.H. Computer modeling of 3D structures of cytochrome P450.//Biochimie. 1996. 78. 771-779.

25. Clarke T.A., Im S.C., Bidwai A., Waskell L. The role of the length and sequence of the linker domain of cytochrome b5 in stimulating cytochrome P450 2B4 catalysis.// J. Biol. Chem. 2004. 279. 35.36809-36818.

26. Darden Т., York D., Pedersen L. Particle mesh ewald: An N log (N) method for ewald sums in large systems.// J. Chem. Phys. 98.1993.10089-10092.

27. Deber C.M., Li S.C. Peptides in membranes: helicity and hydrophobicity.// Biopolymers. 1995.37. 295-318

28. Douliez J.-P., Leonard A., Dufourc EJ. Restatement of order parameters in biomembranes: calculation of C-C bond order parameters from C-D quadrupolar splittings.// Biophys. J. 1995. 68.1727-1739.

29. Drenth J. Principles of Protein X-ray Crystallography.// Springer Verlag, New York. 1994. 341.30

Информация о работе

Смолинская, Юлия Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Моделирование структуры и мембранной топологии цитохрома b5 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно