Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Красные и дальне-красные флуоресцентные белки, оптимизированные для мечения белков слияния

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Красные и дальне-красные флуоресцентные белки, оптимизированные для мечения белков слияния"

На правах рукописи

Шемякина Ирина Игоревна

Красные и дальне-красные флуоресцентные белки, оптимизированные для мечения белков слияния

Специальность- 03.01.03- молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

27МАЙ 2015

Москва, 2015 год

005569263

Работа выполнена в лаборатории геномики адаптивного иммунитета Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Чудаков Дмитрий Михайлович

Официальные оппоненты:

Соболев Александр Сергеевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной генетики внутриклеточного транспорта Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук.

Шеваль Евгений Валерьевич, доктор биологических наук, старший научный сотрудник отдела электронной микроскопии Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук.

Защита состоится «17» июня 2015 г. в 10:00 на заседании диссертационного совета Д002.019.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: 117997, ГСП-7, Москва, В-437, Миклухо-Маклая, д. 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук и на сайте Института www.ibch.ru

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клонирование гена зеленого флуоресцентного белка GFP (Green Fluorescent protein) медузы Aeqitorea victoria в 1992 году открыло широкие перспективы для фундаментальных и прикладных исследований в области молекулярной и клеточной биологии. Так как флуоресцентные белки (ФБ) являются генетически-кодируемыми флуоресцентными метками, они могут быть встроены и экспрессированы в одной рамке считывания с интересующим белком, что позволяет наблюдать за его локализацией в живых системах. Однако, необходимой характеристикой ФБ для успешного мечения исследуемых белков при максимальном сохранении их нативной функции и локализации является мономерность. Первый клонированный флуоресцентный белок, avGFP, оказался естественным мономером. По данной причине, avGFP и его производные варианты с флуоресценцией в циановой, зеленой и желтой (максимумы эмиссии от 470 до 530 нм) областях спектра сегодня широко применяются в составе белков слияния. В то же время, все известные природные красные флуоресцентные белки характеризуются димерной либо тетрамерной природой. Усилиями различных научных коллективов и нашей лабораторией был получен ряд мономерных красных и дальне-красных ФБ. Однако опыт многих исследований свидетельствует о том, что существующие мономерные красные белки, такие как mCherry, TagRFP и mKate2, уступают зеленым мономерным белкам при работе в химерных конструкциях с белками слияния. Таким образом, оставалась нерешенной задача разработки оптимального красного ФБ для мечения исследуемых белков в живых клетках, которой и была посвящена данная работа. Цели и задачи работы. Целью диссертационной работы являлось получение красных мономерных флуоресцентных белков, качество работы которых в составе белков слияния не уступало бы лучшим зеленым флуоресцентным белкам. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Получить и охарактеризовать красный флуоресцентный белок, который будет сохранять мономерные свойства даже при высоких концентрациях (более 1 мг/мл) и будет обладать низкой циитотоксичностью.

2. На его основе получить мономерные фотоактивируемые красные флуоресцентные белки.

3. Получить мономерный флуоресцентный белок, характеризующийся батохромным сдвигом максимума эмиссии флуоресценции в дальне-красную область видимой части спеетра.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате диссертационной работы были получены и охарактеризованы четыре флуоресцентных белка, обладающих эмиссией флуоресценции в красной и дальне-красной областях видимой части спектра. Подтверждено влияние некоторых аминокислотных замен в окружении хромофора на мономерные свойства белков. Полученные белки охарактеризованы и vivo. Показана их применимость для мечения белков слияния. Полученные белки используются в научных исследованиях в различных лабораториях России и мира.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 101 странице. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка цитируемой литературы, который содержит 124 ссылки. Диссертация содержит 18 рисунков и 2 таблицы.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции «Физиология 2010» (Манчестер, 2010), на третьем международный симпозиуме «Актуальные проблемы биофотоники» (Санкт-Петербург - Нижний Новгород 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять статей в рецензируемых журналах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Красный мономерный флуоресцентный белок.

Многие белки слияния и большинство биосенсоров на основе ФБ чрезвычайно чувствительны к олигомеризации и неспецифической внутриклеточной локализации. За последнее десятилетие ряд красных димерных и тетрамерных белков подвергался искусственной мономеризации, которая в большинстве случаев приводила к потере яркости, уменьшению скорости созревания и снижению стабильности флуоресценции. Лучшие образцы красных мономерных белков уступают природным зеленым

мономерным белкам в составе белков слияния. Эта проблема объясняется остаточной слабой димеризацней красных флуоресцентных белков.

В настоящей работе нас мотивировала задача получения красного флуоресцентного белка, качество работы которого в составе белков слияния не уступало бы лучшим зеленым белкам, таким как тЕтегаШ или тЕОРР.

1.1 Получение белка р!ШопНе(1

На основании таких характеристик как высокая яркость флуоресцентного сигнала, высокая скорость созревания хромофора, и низкая токсичность, белок шКа!е2 был выбран нами в качестве основы для разработки красного мономерного белка, для которого не будет характерна проблема слабой димеризации.

На основании анализа трехмерной структуры белка шКа!е мы выбрали ряд положений аминокислотных остатков, которые способны влиять на олигомерные свойства белка тКа1е2. С помощью сайт-специфичного ПЦР-мутагенеза мы внесли следующие замены в микроокружение хромофора: 8132А, 64Л, К182Е, У200М. Кроме того, мы заменили гидрофобный С-концевой участок, стабилизирующий формирование димера, на О1у-богатый участок, что может повлиять на поведение тКа!е в составе белков слияния.

Полученный на этом этапе белок был назван тКа1е2.5. Его мономерность при концентрации до 10 мг/мл была подтверждена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии НРЬС. Однако, следствием введения мономеризующих замен стало ухудшение ряда характеристик белка. В частности, недостатками тКа(е2.5 являются относительно невысокая яркость флуоресценции, а также низкая рН-стабильность (кажущееся значение рКа = 7.0, тогда как для исходного белка шКа1е2 рКа=5.0). Наша дальнейшая работа была направлена на оптимизацию свойств белка тКа(е2.5, которая, однако, не должна была произойти за счет изменения его мономерных свойств.

Основываясь на нашем предыдущем опыте работы с белками этого семейства (потомками белка дикого типа ерРР578), а также на данных о трехмерной структуре белка шКа!е, мы предположили, что аминокислотные замены в окружении хромофора, такие как К69К, 8148М, С165Т, IЛ 81Р и Я203Н приведут к созданию флуоресцентного

белка, подобного TagRFP, который обладает высокой pH-стабильностью. Используя специально дизайнированные праймеры, мы провели несколько раундов сайт-специфичного мутагенеза. Были получены библиотеки, содержащие различные комбинации аминокислотных замен в выбранных нами положениях. Яркость полученных вариантов анализировали с помощью флуоресцентного бинокуляра SZX-12 (Olympus), спектрофотометра SMS2VIS и программы smsCalc для измерения спектров флуоресценции с отдельных колоний и штрихов. Самые яркие варианты были объединены и подверглись нескольким раундам случайного мутагенеза. На каждом раунде случайного мутагенеза отбиралось 20-40 вариантов. После секвенирования отобранных вариантов мы объединяли накопленные недимеризующие замены (согласно результатам секвенирования и анализа трехмерной структуры белка mKate) в различных комбинациях с использованием метода вырожденного сайт-направленного мутагенеза, и полученный набор вариантов подвергали следующему раунду случайного мутагенеза. Такой цикл повторяли в общей сложности 7 раз. Ряд замен, найденных в ходе случайного мутагенеза, такие как пара T75P+Q76P, значительно увеличили скорость и эффективность созревания белка. Этот дуплет пролинов находится между а-спиралью, несущей хромофор, и четвертым ß-слоем, и по всей вероятности обеспечивает необходимый угол поворота при переходе между этими структурными элементами.

Окончательный вариант, названный FusionRed (от fusion- белок слияния), имеет яркость при экспрессии в бактериях сопоставимую с яркость белка-предшественника mKate2.

1.2 Характеристика и сравнение FusionRed с аналогами in vitro

Анализ олигомерного статуса белков mKate2, mKate2.5 и FusionRed проводился с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии HPLC на носителе Superdex 200, при концентрации 10 мг/мл (рис. 1 а).

Было показано, что белки mKate2.5 и FusionRed сохраняют мономерную природу (молекулярная масса около 22 kDa) даже при этой высокой концентрации, сопоставимой с максимально достижимой в физиологических условиях. В то же время, белок mKate2 был представлен на HPLC двумя перекрывающимися пиками, что свидетельствует о наличии димерной составляющей при концентрации 10 мг/мл.

Были измерены спектры возбуждения флуоресценции и эмиссии белка FusionRed в интервале длин волн от 400 до 850 нм. Спектры имеют узкую и четкую форму пиков. Максимум возбуждения флуоресценции составил 580 нм, максимум эмиссии - 608 нм. Наблюдается сдвиг максимума эмиссии в более коротковолновую часть спектра относительно белка mKate2 (Я.ет=633 нм). Отсутствие промежуточных форм существования хромофора подтверждается наличием единственного узкого пика на спектре поглощения (рис. 1 б).

С 2

S2 10 БЭ 65 49 3S 3836 23.6»

500 600 700

Хгява во/мы (шм(

Рисунок 1. Характеристики белка Ри$!оп1*е1|.

а. Результаты НРЬС для белков шКа1е2, тКа1е2.5 и РиэюпЯес! при концентрации 10 мг/мл. По оси У отложены нормированные значения поглощения белка (деленные на максимальное значение), по оси X - молекулярная масса в кЭ

б. Нормализованные спектры поглощения (черная сплошная линия), возбуждения (красная пунктирная линия) и эмиссии (красная сплошная линия) флуоресценции белка РизюпЯес!

Было определено, что квантовый выход флуоресценции для белка FusionRed составляет 0.19. Коэффициент молярной экстинкции при 580 нм составляет 94 500 M-I см-1, что делает данный белок потенциально эффективным акцептором для FRET.

Для определения фотостабильности полученного белка FusionRed и сравнение ее с аналогами (TagRFP, mKate2, mCherry) использовались химерные конструкции с гистоном Н2В, синтезируемые в клетках линии HeLa. Фотостабильность исследуемых белков определялась при помощи флуоресцентного микроскопа. Время

полуобесцвечивания белка FusionRed превосходит время полуобесцвечивания белков TagRFP и mKate2 в 3 и 2 раза соответственно.

1.3 Характеристика и сравнение белка FusionRed с аналогами in vivo

Мы получили более 40 белков слияния FusionRed, которые были протестированы при экспрессии в клетках млекопитающих (рис. 2).

в JÉt в •'Л « г

V.5 ° 1У 3 U ' ' • _ и к

л Г Ф ■■ - : ■ - ' V . - ■ ■ §я

Н т . ■•••".' V ■-• - ф •vf 4

Рисунок 2. Белок FusionRed в живых клетках.

Изображения клеток, трансфецированных рекомбинантными генетическими конструкциями, кодирующими следующие слитные белки:

a.FusionRed-P-актин; 6.FusionRed-Rab5a-7 (локализация в эндосомах); b.FusionRed-фибрилларин; г. FusionRed- ламин; д. FusionRed- а -тубулин; е. FusionRed-аннексин- А4; ж.FusionRed-ER (локализация в эндоплазматическом ретикулуме) з. FusionRed-кавеолин; H.FusionRed- c-Ha-Ras (мембранная локализация); к. FusionRed-3nHTon-RhoB-GTPa3bi (локализация в эндосомах); л. FusionRed-naKcmMHH-22; m.FusionRed- лизосомальный-мембранный-гликопротеин (мембранная локализация); h.FusionRed-lifeact (пептид, связывающий филаменты актина); о. FusionRed-PDHAl-10 (pyruvate dehydrogenase; митохондриальная локализация); п. FusionRed-кератин; p.FusionRed- миозин (легкая цепь); c.FusionRed-c-src-N-7; т. FusionRed-PMP (сигнал пероксисомальной лакализации); у. FusionRed-ЕВЗ (белок семейства RP/EB, ассоциированный с микротрубочками); ф. FusionRed-Golgi (45 N-концевой аминокислотный остаток галактозилтрансферазы, локализация в комплексе Гольджи)

Масштабная линейка, 10 мкм. Фотографии сделаны Michael W. Davidson, США.

Все исследованные химерные конструкты проявляли в экспериментах преимущественно ожидаемую внутриклеточную локализацию. Уровень экспрессии флуоресцентного белка (наблюдаемая яркость сигнала) варьировался в различных клетках, что характерно при временной трансфекции эукариотических клеток. Исследованные конструкции Ри5ЮпЯес1 с белками слияния демонстрировали сопоставимую яркость сигнала и процент трансфецированных клеток. В подавляющем большинстве случаев качество работы РивюпЯес! не уступало лучшим мономерным зеленым белкам, таким как тЕОРР или тЕтегаШ (рис. 2).

Формирование белковых агрегатов может быть токсичным для клеток. Для тестирования склонности белка РивюпЯеё к формированию агрегатов мы протестировали его поведение в продолжительной экспрессии в клетках линии НеЬа. Клетки были трансфецированы рекомбинантными плазмидами, содержавшими последовательность нуклеотидов, кодирующую ген белка Ри81опЯес1 под контролем СМУ-промотора. Яркий красный флуоресцентный сигнал появлялся уже через 23-24 часа после трансфекции. При этом мы не наблюдали формирования видимых агрегатов даже через 5 дней после трансфекции. Таким образом, в этом отношении белок Еи8юпЯес1 унаследовал позитивные черты белка-предшественника тКа1е2.

Следующим этапом работы стало сравнение цитотоксичности белков РиэюпЯес!, тКа!е2, шСИеггу и тЯиЬу относительно белка ЕОРР, широко применяемого для мечения белков слияния и характеризующегося низкой токсичностью даже при относительно высоких концентрациях. Для этого был проведен ряд трансфекций клеток линии НеЬа векторами, кодирующими данные флуоресцентные белки. Клетки, экспрессирующие белок ЕОРР, были смешаны с клетками, экспрессирующими один из красных ФБ, в результате чего было получено четыре отдельные клеточные смеси: ЕОРР и тЯиЬу, ЕйРР и РивюпЯеё, ЕОЕР и гпКа!е2, ЕОРР и шСИеггу. Через 48 часов после трансфекций было рассчитано соотношение красных и зеленых клеток с использованием проточной цитометрии. После дополнительной 92-часовой инкубации соотношение красных и зеленых клеток было заново измерено. Поскольку подсчету подвергались только живые клетки, соотношения до и после инкубации можно считать точным отображением токсичности красного белка по сравнению с ЕОРР. В этих экспериментах было показано, что цитотоксичность белка тЯиЬу более чем в 10 раз превышает цитотоксичность белка ЕОРР. Остальные красные белки (Ри5ЮпК.ес1, тКа1е2

и шСЬеггу) обладают низкой цитотоксичностью, сопоставимой с цитотоксичностью ЕОРР в этом эксперименте (рис. 36). Следует отметить, что через четыре дня после трансфекции клеток линии НеЕ.а векторами, кодирующими тСЬеггу и тЯиЬу, мы наблюдали флуоресцентное мечение, напоминающие лизосомапьную локализацию. Для белков тКа!е2 и РивюпКе^) такого явления через четыре дня после трансфекции не наблюдалось (рис. 3 а). Исследования были частично выполнены на оборудовании ЦКП ИБХ.

Рисунок 3 . Сравнение красных мономерных флуоресцентных белков.

а. Клетки линии НеЬа, трансфецированные плазмидами, кодирующими исследуемые красные флуоресцентные белки под контролем СМУ-промотера. 4 дня после трансфекции. Для белков шСЬеггу и тЯиЬу наблюдается лизосомальная локализация. шКа1е2 и РизюпЯес! остаются правильно локализованными в цитоплазме.

б. Цитотоксичность белков в клетках линии НеЬа относительно ЕйРР

Следующим этапом работы стала оценка токсичности полученного мономерного белка Риз10пЯе(1 на лабораторных животных. В качестве модели нами были выбраны Хепорш 1аеУ15 (совместно с Лабораторией молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ

8

РАН). Были проведены микроинъекции плазмид, кодирующих флуоресцентные белки под контролем CMV-промотера, в эмбрионы Xenopus laevis. В предварительных экспериментах мы наблюдали разные степени снижения среднего размера глаз головастиков, в зависимости от экспрессируемых флуоресцентных белков. Учитывая, что данный параметр относительно легко измерить, он был использован для оценки относительной токсичности следующих флуоресцентных белков: EGFP, mCherry, mKate2 и FusionRed (рис. 4 а-е).

д

I

3

Рисунок 4. Токсичность белков EGFP, mCherry. mKate2 и FusionRed in vivo.

Трансгенные эмбрионы Xenopus laevis. экспрессирующие EGFP (a, a'), mCherry (б, б') mKate2 (г, г') и FusionRed (д, д'). Фотографии эмбрионов в белом свете (а', б', в', г') и флуоресцентные изображения (а.б.в.г).

д. Среднее значение размера глаз эмбрионов Xenopus laevis после инъекций плазмид, экспрессирующих различные флуоресцентные белки.

е. Количество выживших эмбрионов через 5 дней после инъекций плазмид.

pEGFP

pmKate2

Белок шСЬеггу оказался наиболее токсичным из всех тестируемых белков. Инъекции тСИеггу снизили средний размер глаз наиболее значительно (рис. 4 б', д, е).

ЕОРР и шКа1е2 обладают умеренной токсичностью (рис. 4 а', в'), а белок РияюпКсс! является наименее токсичным из всех четырех вариантов (рис. 4 г'). Выживаемость Ки^опЯеё-экспрессирующих эмбрионов составила 68%, тогда как этот показатель для контрольных эмбрионов составил 76%. Для ЕОРР, тКа(с2 и тСЬепу - 59%, 51% и 37% соответственно.

Полученные результаты свидетельствуют о низкой токсичности РизюпЯес! и его применимости для мечения белков, клеток и тканей в трансгенных организмах.

2. Красные мономерные обратимо фотоактивируемые белки

Недавно на основе белка Та£ЯРР был получен обратимо фотоактивируемый белок КРР-НС. Данный белок обладает флуоресценцией в красной области спектра. Максимумами возбуждения и эмиссии КРР-НС приходится на 585 и 615 нм, соответственно. Интенсивность флуоресценции КРР-НС падает в 10 раз (за счет уменьшения квантового выхода флуоресценции) под воздействием зеленого света (530560 нм) и затем возвращается к исходному уровню при облучении синим светом (450490 нм) или после инкубации в темноте (время полувосстановления флуоресценции составляет 30 мин). Аминокислотные остатки 69, 148, 165, 179 и 181 (нумерация по ОРР) играют определяющую роль в проявлении свойств фотоактивируемости. 148 и 165 аминокислотные остатки в значительной степени определяют возможность фотоиндуцируемой цис-транс-изомеризации хромофора.

Однако, недостатком белка КРР-НС является низкая яркость флуоресценции. Нас привлекла возможность получения мономерного фотоактивируемого красного флуоресцентного белка на основе мономерного белка Ги$юп[<ес), который высокогомологичен КРР-НС.

2.1 Получение фотоактивируемых белков шКа1еКРР1 и тКа(еКР'Р2

Мы сравнили КРР-НС и РизюпЯес! по позициям 69, 148, 165, 179 и 181. Оба белка содержат цистеин в 165 положении и лейцин в 181. Различия наблюдаются только по 69, 148 и 179 положениям. Следовательно, было решено провести направленный мутагенез Ри5ЮпКе(1 с различным набором мутаций по этим позициям.

Используя специально дизаГишрованные праймеры, мы провели несколько серий сайт-специфичного мутагенеза. Нами были получены следующие варианты: FusionRedS148H; FusionRed R69K, S148H; FusionRed R69K, S148H, С179Л. Отсутствие случайных замен в результирующих вариантах было подтверждено секвенированием. При этом яркость флуоресценции FusionRed R69K, S148H и FusionRed R69K, S148H, С179А была намного выше, чем яркость флуоресценции белков KFP-HC или FusionRedS148H. Варианты белка FusionRed R69K, S148H (далее mKateKFPl) и FusionRed R69K, S148H, С179А (далее mKateKFP2) демонстрировали выраженную способность к обратимому изменению флуоресцентных свойств и было принято решение продолжить работу с вариантами.

2.2 Изучение фотоактивационных свойств белков mKateKFPl и mKateKFP2

Фотоактивационные свойства колонии E.coli, экспрессирующие варианты mKateKFPl и mKateKFP2, изучали как при помощи микроскопа Leitz Laborlux К (объектив 40х) с высокой мощностью (100 Вт ртутная лампа), так и при помощи флуоресцентного бинокуляра SZX-12 (Olympus). Интенсивности флуоресценции обоих вариантов довольно быстро снижалась при облучении зеленым светом (менее чем за одну минуту). Восстановление флуоресценции происходило при облучении синим светом за две минуты или за 10 минут в темноте. Для исходного белка FusionRed в тех же условиях эффекта обратимого фотообесцвечивания не наблюдалось.

Следующим этапом нашей работы стало изучение фотоактивационных свойств иммобилизованных на металлоафииной смоле белков mKateKFPl и mKateKFP2 с помощью флуоресцентного микроскопа DM1 6000 В. В этих условиях достигаются более высокие локальные мощности облучения, которые также могут применяться в реальной микроскопии живых клеток. Были подобраны условия многократной фотоактивации/тушения флуоресценции данных белков. Белки mKateKFPl и mKateKFP2 под действием зеленого света (3 с, -3 Вт/см2) переходят в потушенное состояние и быстро восстанавливают красный флуоресцентный сигнал при облучении синим светом (1.5-3 с, ~3 Вт/см2). Интересно, что наблюдается возрастание интенсивности свечения флуоресцентной формы этих белков на начальных циклах фотопереключения (рис. 5). Для белка mKateKFPl после достижения максимума

наблюдается постепенное выгорание флуоресцентной формы. Необратимое фотообесцвечивание белка тКа1еКРР2 при тех же условиях происходит намного медленнее. Фактически, белок тКа1еКРР2 не обесцвечивается даже после сотен циклов фотоактивации-фотоинактивации при заданных условиях. Контраст между фотоинактивированной и фотоактивированной формами флуоресценции для белка

ёё о X ш

5

ъ £

600 800 вреыя. сек

1200

время, сек

шКа1еКРР1 достигает 30 раз, для тКа1еКРР2- 20 раз.

Рисунок 5. Фотоконверсия иммобилизированных на смоле белков шКа1еКРР1(а) и тКа1еКРР2 (б) синим светом (1.5 с) после облучения зеленым светом (3 с). Нижний ряд точек -потушенная флуоресценция, верхний ряд точек - восстановленная флуоресценция. Интенсивность облучения около 3 Вт/см".

Были измерены спектры поглощения, возбуждения и эмиссии флуоресценции полученных белков. Для активированной формы mK.ateK.FPl максимум возбуждения и эмиссии флуоресценции приходятся на 572 нм и 613 нм, соответственно. Максимум эмиссии после тушения флуоресценции составляет 602 нм (сдвиг на 11 нм). Максимум возбуждения флуоресценции для активированной формы mKateKFP2 приходится на 580 нм, максимум эмиссии - на 605 нм. После тушения флуоресценции максимум эмиссии смещается на 2 нм влево и приходится на 603 нм.

Белки mKateKFPl и mKateKFP2 имеют два максимума поглощения - 405 нм и 565 нм. При облучении зеленым светом, приводящим к падению яркости красного флуоресцентного сигнала, наблюдается падение пика поглощения при 405 нм и рост при 565 нм. Рост поглощения при 565 нм свидетельствует об увеличении коэффициента молярной экстинкции белка. Так как яркость флуоресценции пропорциональна произведению коэффициента молярного поглощения и квантового выхода, тушение флуоресценции данных белков объясняется одновременным и доминирующим уменьшением квантового выхода флуоресценции.

Полученные белки mKateKFPl и mKateKFP2 имеют высокий контраст, быстро тушатся и восстанавливаются. Яркость флуоресценции данных белков выше яркости флуоресценции белка KFP-HC. Данные белки не содержат замен во внешней части бета-бочонка относительно FusionRed. Таким образом mKateKFPl и mKateKFP2 наследуют мономерные свойства белка-предшественника. Это делает их оптимальными фотоактивируемыми вараинтами для использования в составе белков слияния.

3. Дальне-красный мономерный белок

На сегодняшний день цветовая палитра мономерных ФБ охватывает практически весь видимый спектр, от фиолетовой до красной его части. Единственным заметным пробелом остается ближняя инфракрасная область спектра. Недавно был описан дальне-красный мономерный ФБ TagRFP 657 (максимумом эмиссии флуоресценции при 657нм), разработанный на основе белка mKate. Недостатками данного белка являются низкая яркость (14% от яркости белка mKate2) и низкая скорость созревания (время полусозревания при 37°С составляет 125 мин, для белка mKate2 этот показатель составляет 48 мин). Достигнутые нами успехи в разработке красного мономерного белка

FusionRed заставили нас задуматься о получении дальне-красного мономерного белка с батохромным сдвигом максимума поглощения. Такой ФБ должен сохранять мономерные свойства даже при высоких концентрациях (более 1 мг/мл), не должен быть склонным к неспецифичным взаимодействиям в живых клетках, не должен проявлять цитотоксических свойств. Важно также отметить, что белок с максимум возбувдения флуоресценции более 600 нм может быть эффективно возбужден стандартными бЗЗнм или 635нм лазерными линиями.

3.1 Получение дальне-красного мономерного белка

Поиск ключевых аминокислотных остатков для сайт-специфичного мутагенеза был основан на анализе кристаллической структуры белка mKate и аминокислотной последовательности белка TagRFP 657.

Длят сайт-специфического мутагенеза мы выбрали следующие аминокислотные остатки, потенциально способные влиять на спектральные характеристики белка:

1. 44 аминокислотный остаток, который находится в непосредственной близости от хромофора. Следует отметить, что остаток метионина в положении 44 подвергся замене в недавно опубликованных дальне-красных флуоресцентных белках: mNeptune, полученном на основе mKate; E2-Crimson, полученном на основе DsRed-Express2; eqFP650 и eqFP670, полученные в нашей лаборатории на основе белка Katushka 9-5; белок TagRFP 657 также несет замену в 44 положении.

2. 69 и 152 аминокислотные остатки. Исходя из выравнивания аминокислотных последовательностей флуоресцентных белков, боковая цепь аминокислоты в 69 и 152 положениях обращена внутрь белковой глобулы и ориентирована на хромофор.

4. 148, 165, 167 и 203 аминокислотные остатки. Природа этих аминокислотных остатков обуславливает смещение равновесия между анионной и протонированной формами хромофора, его изомеризацию (цис- или транс-) и определяет нековалентные взаимодействия, влияющие на степень поляризации хромофора. Разработанный ранее в нашей лаборатории дальне-красный флуоресцентный белок eqFP670 на основе белка Katushka 9-5 подвергся заменам по 148 и 165 положению. Введение замены 203Y -ароматическое кольцо остатка тирозина в положении 203 способно входить в стэкинг-

ароматическое кольцо остатка тирозина в положении 203 способно входить в стэкинг-взаимодействие с системой сопряжённых связей хромофора и смещать спектр эмиссии белка в длинноволновую область спектра.

5. 181 аминокислотный остаток, который находится в непосредственной близости от хромофорной группы. Мы предположили, что замена L181F может увеличить яркость флуоресценции.

Для получения библиотеки с аминокислотными заменами M44QEC, K69HN, S148HN, L152M, А165Т, M167ML, L181F, R203YF (всего 48 вариантов) мы провели серию сайт-специфичных ПЦР-мутагенезов.

На этом этапе работы нашей основной задачей являлся отбор вариантов, обладающих максимумами эмиссии флуоресценции, сдвинутыми в дальне-красную область видимой части спектра. Отбор вариантов, характеризуемых батохромным сдвигом относительно белка FusionRed, проводили с использованием бинокуляра Olympus SZX-12 с соответствующим набором светофильтров. Спектры эмиссии флуоресценции мутантных вариантов, обладавших наиболее яркой флуоресценцией в дальне-красной области, снимали с помощью спектрофотометра SMS2VIS. Самый яркий вариант содержал следующие аминокислотные замены: M44Q, К69Н, S148H, L152M, А165Т, M167L, L181F, R203Y. Полученный белок характеризуется сильным батохромным сдвигом как спектра возбуждения (пик 610 нм), так и спектра эмиссии флуоресценции (пик 657 нм).

Для оптимизации яркости и скорости созревания полученного варианта, мы решили провести несколько раундов случайного мутагенеза для последующего отбора вариантов с дополнительными заменами в окружении хромофора.

На первом раунде нами было подвергнуто скринингу порядка 10000 индивидуальных клонов. Было отобрано 12 наиболее ярких клонов с максимумами эмиссии флуоресценции в диапазоне от 653нм до ббОим. По результатам секвенирования мы отобрали 4 варианта, не содержащих нежелательных внешних (потенциально димеризующих) замен.

На основе этих четырех вариантов был проведен второй раунд случайного мутагенеза. На этом этапе было отобрано 16 клонов. По результатам секвенирования было отобрано 4 варианта. Для этих клонов были выделены рекомбинантные белки.

Полученные варианты мы сравнили по яркости флуоресценции и скорости созревания. Лучший вариант по этим показателям получил название Ри5юпЯес1-657. Он содержит дополнительные аминокислотные замены 531 С, Е21(Ю, возникшие в ходе случайного мутагенеза.

Мы определили спектральные характеристики белка р1ВЮпКес1-657. Измерили спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции. Спектры имеют узкую форму пиков. Максимум возбуждения флуоресценции составил 609 нм, а максимум эмиссии- 657нм (рис. 6).

г* OJ 0.8 -

ш

о

<ж 0.6 -

са-

аз

в> 0.4 -

о"

0.2 -

о.о -

500 еоо 700

Длина волны (нм)

Рисунок 6. Спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции РизюпКес1-657К (пунктирная и прямая красная линии соответственно).

Для полученного белка были определены коэффициент молярной экстинкции и квантовый выход флуоресценции. По результатам измерений значения коэффициентов молярной экстинкции для белка FusionRed-657R составил 43000 М"1 см"1 . Для расчета квантового выхода флуоресценции данного белка были измерены спектры поглощения и эмиссии флуоресценции при комнатной температуре и соотнесены с белком TagRFP 657, для которого квантовый выход флуоресценции составляет 0.1. Было определено, что квантовый выход флуоресценции для белка FusionRed-657 составляет 0.06.

Следующим этапом нашей работы стало тестирование белка FusionRed-657 in vivo. Для тестирования белка FusionRed-657 в клетках млекопитающих была получена нуклеотидная последовательность данного белка под контролем CMV-промотера. Мы провели ряд трансфекций клеток линии HeLa. При экспрессии в живых клетках

Ри8юпКес1-657 унаследовал низкотоксичные свойства белка-предшественника. Достаточно яркий дальне-красный флуоресцентный сигнал появлялся через 24 часа после трансфекции, что свидетельствует о довольно быстром созревании полученного белка в клетках млекопитающих. Через три дня после трансфекции мы не наблюдали формирование белковых агрегатов (рис. 7).

Для проверки возможности использования полученного дальнекрасного белка для мечения белков слияния мы использовали модель визуализации р-актина. Для этого нами была получена химерная конструкция Ри5тпЯе<1-657-р-актин. После проведения трансфекций клеток линии НеЬа полученной рекомбинантной плазмидой, мы наблюдали специфичное мечение актиновых филаментов (рис. 7). Однако следует признать, что относительная яркость флуоресцентного сигнала была недостаточна для надежного использования РизюпКес1-657 в составе белков слияния, и требуется дальнейшая работа по усовершенствованию этого варианта.

Рисунок 7. Белок Ри.<поп1*е11-657 в живых клетках

а. Клетки линии НеЬа, трансфецированные рекомбинантной плазмидой рРизюпКес1-657, 3 дня после трансфекции б. Клетки линии НеЬа, трансфицированные рекомбинантной плазмидой р Ри8юпКес)-657-р-асПп, 48 часов после трансфекции.

10

20

30

40

50

ауСГР МЗК6ЕЕЬртеУУР1ЬУЕЬПЙОУЫСНКРЗУЗОЕЗЕеОАТУЗКЬТЬКГ1ЙТТС-КЬРУРИРТ

БэКеа MRSSKNVIKEFMRFKVRMEGTVNGHEFEIEGEGEGRPYEGHNTVKLKVTKGGPLPFAWD1

ечЕР578 МЗЕЫКЕЫМНМК1,УМЕ6ТУ™ННРКСТЗЕСЕНКРУЕСТОТМК1КУУЕ6СРЬРЕАЕ01

ТадИЕР МЗЕЪ1КЕШНМКЬУМЕетУгаННГКСТЗЕ<ЗЕеКРУЕвТ0ТМК1К¥УЕОСРЬРЕ,АЕТ>1

тКаСе МЗЕЬ1КЕЫМНМКЬУМЕеТУ™нНЕКСТЗЕСЕйКРУЕЙТдТ[Ж1КУУЕабРЬРЕАЕ01

тр^е2 МУЗЕЫКЕЫМНМКЬ¥МЕСТУШЫННГКСТЗЕОЕ5КРУЕ6Т0ТМК1КАУЕС6РЬРЕАЕО1

шKate2.5 тГЗЕЬ1КЕШНМК1,УМЕ6ТУШННЕКСТЗЕ6ЕЗКРУЕ6Т(2ТМР1К|УЕС0РЬРЕАЕ01

Гиз1опЯе<1 МУЗЕЬ1КЕШРМКЬУМЕ6ТУШННЕКСТЗЕ6ЕеКРУЕ5Т0ТМР1к|уЕССРЬРЕАЕ01

тКа1е№Р2 МУЗЕЬ1КЕШРМКЬУМЕСТУШННЕКСТЗЕеЕ5КРУЕ0ТдТ1Ж1к1уЕС0РЬРЕАЕО1

ЕиэРес1-657 МУЗЕЦКЕЫМРМКЬУМЕбТУШННРКСТСЕбЕбКРУЕеТОТСМКЩУЕбСРЬРЕАЕО!

60 70 80 90 100 110

аувЕР ЬУТТЕЗУОУОСЕЗРУРОНМКОЕШЕЕКЗАМРЕСУУС2ЕКТ1 ЕЕКООСМУКТРАЕУКЕЕСОТ

DsReci ЬЗР0Е0УСЗКУУУКНРАВ1Р—ОУККЬЗЕРЕОРКИЕКУШГЕОСОУУТУТЙВЗЗЬОООС

ечЕР578 1АТЗМУЕЗКТЕ1ШТдС1Р--ВЬЕК(23ЕРЕСЕТИЕК1ТТУЕ06СУ1,ТАТ(20ТЗЬСда0С

ТадКЕР 1АТЗЕМУ63КТЕ1ННТ0С1Р--ОГЕК03ЕРЕШт|Е1У4тХ;ЕВ6СУ|тЯте03;зЙа0вС

mKate ЬАТЗЕМТСЗКТПМНТОИР— ОЕЕКОЗЕРЕСЕТЯЕКУТТУЕООЗУЬТАТООТЗКгОЙС

mKate2 1АТ^«СЗКТРганТОС1Р--ОРРКдЯРЕб|т|Е|у4т|ЕОС6у|т|т|1^з|оОСС

шKate2.5 1АТ8Р1ЖЗВСТРтанРОС1Р--ОРГКОЗРРЕ6РТЙЕ|\ЯтаЕОССу|т^т|о|з|оОСС

Еизл.01Шес! 1АТЗ™УСЭ|ТРХКНРРСХР--ВРРКаЗЕРЕ(ЛтаЕ8УВт|Е06СУ|ТЙт|0®3|(2П6С

ЩКа1еКЕР1 LATSFMYGSKTFIKHPPGIP--DFFKQSFPEGFTWERVTTYEDGGVIíTATQDTSLQDGC

тка1екрр2 ьатзгмусзк'гв'ххнрр;;: р эгь-кизг?кег: нкк¥т: у:::.чнл'ьтд':'2:)кьс:;.;с

РиэРес1-657 ЬАТЗРМУСЗШТИКНРРМР— ОРГКОЗРРЕОЕТНЕНУТТУЕОООУЬТАТООТЗЬОПбС

avGFP

ОБРесЗ

едРР578

ТадРЕР

тр^е

IrlKate2

raKate2.5

Ь'аз хопр.ес!

тКа!еКГР1

mKateKFP2

РизРес1-б57

120 130 140 150 160 170

ЬУт1ЕЬкй1огкЕОбМьснкъЕУыгазшуу1токдкыб1ктагк1РШ1Еоо5Уаь

Е1ХМЙ1аУЫЙРЗПСРУМОКк|м-С#ЕА|тЁКЬУРР--06УШкбЕ|НрА1;КЬКООСНУЬ ИУЫУКГШУЫРРЗКСЗУМОККТЬ-СИЕАЯТЕМЬУРА—ОбСЬРйНЗОМАЬКЪУбСбУЬН ЫУЫУК1Р6™РРЗШРУМ0ККТ1.-С(«ЕАМТЕМЬУРА—ОебЬЕбКЗОМАЬКЬУвСаНЫ ЫУЫУК:МСУ№РЗНСРУМ0ККТ1,-СИЕАЗТЕ№УРА—ВЗСДОВДПЛнвКДОЗвЗНЫ ЫУЫУКГРбУМРРЗ^РУМСЖКТЬ-СУЯЕАЗТЕТЬУРА—РССЪЕСРАОМАЬКЬУббСНЫ

ЫУЫУККеУОТР ЫУНУКЛУЗУОТР

ЮРУМОККШЬ-6^ЕА8ТЕТВУРА--066Р)_™О8А1КЬУ606НЬ1 ЯвР7МОКК#1.-СИЕА§Т§Т|УРА— ССбрЕ^ШЗрг^КЬУБСеНЫ *ЮРУМОККТЬ-С5?ЕАНТЕТИУ РА— 066ЬЕ<зИга4АЬКЬ УСвОНЬ I

II I НИЦ!'! .1'! I (¡1 иГп|'11||1 'I III I ]'И'|Дн1и|*|1|.....ММ

200 210 220* " 230

АОНУ(20ЫТР1СО-СРУЬЬРОЫНУЬЗТОЗАЬЗКОРЫЕКНВНМУЬЬЕЕУТАА21ТНСМОЕЬУК

УЕЕК31УМАККР---У0ЬРСУУУУОЗКЮ1ТЗН-ЫЕОУТ1УЕ0УЕРТЕеКННЬЕЬ

СБГКТТУКЗККРАКЫЬКМРСГНГУОНКЬЕЫКЕ-АОКЕТУУЕОНЕМАУАКУСОЬРЗКЬСНК С№КТТУНЗККРАКЫЬКМРСУУУУВДНЬЕК1КЕ-АОКЕТУУЕ0НЕУАУАРУСОЬРЗКЬСНК СЫЬКТТУЯЗККРАКЫЬКМРСУУУУОМЬЕК1КЕ-АОКЕТУУЕСгНЕУАУДКУСВЬРЗКЬСНК СЫЬКТТУНЗККРАКМЬК>№ОУУУУРКК1.Еа1КЕ-АРКЕТУУЕ0НЕУАУЙКУСРЬРЗК1,6НК СМЬ|ТТУНЗККРАК№КМРСУУ1УРРРЬЕК1КЕ-АРЫЕТУУЕ0НЕУАУАРУ|>ТС0АС066К

СЫЬ|ТТУНЗККРАТЫЬКМРСУУ|УО|КЬЕК1КЕ-аопетууеонеуауаруЬТ66АОО66К

1яЬЕК1КЕ-АРРЕТУУЕ0НЕУАУАРУЕТ60А000еК ШШКЕ-АОПЕТУУЕОНЕУАУАКУрТвОУЗЕКЗСК :(1,ЕК1Ке-АРРЕТУУЕ0НЕУАУАКУрТСОАСОССК

ТТУРЗККРАТЬЛ.КМРСУУр ТТУРЭККРАТЫЪКМРСУУГ ТТУРЗККРАТЫЬКМР6УУ|

Рисунок 8 . Выравнивание аминокислотных последовательностей

Структурно важные регионы отмечены серым цветом. Отмечены следующие замены аминокислотных остатков: голубым выделены мономеризующие замены; замены, увеличивающие скорость созревания белка, показаны желтым; замены микроокружения хромофора показаны зеленым. Нумерация аминокислотных остатков представлена относительно ауОРР.

4. Заключение

В результате данной работы мы получили и охарактеризовали четыре красных и дальне-красных мономерных флуоресцентных белка. Белок Ри5юп11ес1 по результатам НРЬС сохраняет мономерные свойста при высоких концентрациях (10 мг/мл) и обладает низкой цитотоксичностью. Показано, что качество работы Ги8юпКс(1 в составе химерных конструкций с белками слияния не уступало лучшим мономерным зеленым белкам, таким как тЕСБР или тЕтегаЫ.

На основе белка Г1шопке(1 были получены белки с различными спектральными характеристиками.

Обратимо фотоконвертируемые белки тКа(еКРР1 и тКа1еКГР2 способны ко многим сотням циклов фотопереключения без существенного фотообесцвечивания. тКа1еКРР1 является ярким ФБ, обладающим высоким контрастом (до 30 раз), быстро тушится и восстанавливается и может быть использован в качестве обратимо фотоконвертируемой мономерной флуоресцентой метки для локального оптического мечения, а также для микроскопии сверхвысокого разрешения. Белок тКа1еКРР2 немного уступает по яркости и контрасту тКа1еКРР 1.

Сайт-специфический мутагенез М44С, Я69Н, 5148Н, С165Т, М167Ц Ы81Г и [ 1203У в сочетании с найденными в ходе случайного мутагенеза заменами БЗЮ и Е2100 привели к получению дальне-красного белка Ри5ЮпКес1-657. Показана применимость белка Рц5ЮпЯес1-657 для мечения белков слияния.

Во всех трех случаях отсутствуют внешние (потенциально димеризующие) аминокислотные замены относительно белка Ги5юпКес1 (рис. 8), следовательно, мономерные и низкотоксичные свойства белка Р^юпКсс! не должны были измениться.

Полученные флуоресцентные белки могут быть полезны в качестве маркеров для мечения белков в живых клетках, в том числе при многоцветовом мечении и микроскопии сверхвысокого разрешения, а также, мы надеемся, послужат основой для разработки новых улучшенных вариантов ФБ и биосенсоров.

Выводы

1. Получен и охарактеризован красный флуоресцентный белок FusionRed, сохраняющий мономерные свойства даже при высоких концентрациях.

2. Показано, что качество работы белка FusionRed в составе белков слияния не уступает зеленым мономерным белкам. Показано преимущество белка FusionRed по сравнению с другими красными мономерными флуоресцентными белками /и vivo: FusionRed демонстрирует низкую цитотоксичность и низкую склонность к агрегации.

3. Получены обратимо фотоконвертируемые белки на основе FusionRed, изучены их фотоактивационные свойства. Установлено, что замены R69K, S148H и С179А обуславливают эффект обратимой фотоактивации данных белков.

4. Получен и охарактеризован дальне-красный мономерный флуоресцентный белок с батохромным сдвигом максимума поглощения - FusionRed-657.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Shcherbo D., Souslova Е.А., Goedhart J., Chepurnykh T.V., Gaintzeva A., Shemiakina I.I., Gadella T.W., Lukyanov S., Chudakov D.M. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnol. 2009. 9:24.

2. Shcherbo D„ Shemiakina I.I., Ryabova A.V., Luker K.K., Schmidt B.T., Souslova E.A., Gorodnicheva T.V., Strukova L., Shidlovskiy K.M., Britanova O.V., Zaraisky A.G., Lukyanov K.A., Loschenov V.B., Luker G.D., Chudakov D.M. Near-infrared fluorescent proteins. Nat Methods. 2010 7(10):827-9.

3. Pletneva N.V., Pletnev V.Z., Shemiakina I.I., Chudakov D.M., Artemyev I., Wlodawer A., Dauter Z., Pletnev S. Crystaiiographic study of red fluorescent protein eqFP578 and its far-red variant Katushka reveals opposite pH-induced isomerization of chromophore. Protein Sci. 2011 20(7): 126574.

4. Shemiakina I.I., Ermakova G.V., Cranfdl P.J., Baird M.A., Evans R.A., Souslova E.A., Staroverov D.B., Gorokhovatsky A.Y., Putintseva E.V., Gorodnicheva T.V., Chepurnykh T.V., Strukova L., Lukyanov S., Zaraisky A.G., Davidson M.W., Chudakov D.M., Shcherbo D. A monomeric red fluorescent protein with low cytotoxicity. Nat Commun. 2012;3:1204.

5. Горященко A.C., Жердева B.B., Щербо Д.С., Шемякина И.И., Савицкий А.П. Дапънекрасный FRET-сенсор для детекции активации каспазы-3. Современные проблемы науки и образования. 2013, № 4, http: www.science-education.ru/l 10-9774

Тезисы докладов на конференциях

1. Souslova Е.А., Shcherbo D, Shemiakina II, Lukyanov KA, Chudakov DM. Novel far-red and near infra-red fluorescent proteins. Physiology 2010 Meeting. Manchester, UK, 2010.

2. Shcherbo D., Shemyakina I.I., Zaraisky A.G., Davidson M.W., Luker G.D., Chudakov D.M. Near-infrared fluorescent proteins for whole-body imaging. Ill International Symposium "Topical Problems of Biophotonics". St.Petersburg - Nizhny Novgorod, Russia, 2011