Флуоресцентные маркеры для молекулярной и клеточной биологии: флуоресцентные таймеры, постоянно флуоресцирующие и фотоактивируемые белки

Верхуша, Владислав Витальевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Флуоресцентные маркеры для молекулярной и клеточной биологии: флуоресцентные таймеры, постоянно флуоресцирующие и фотоактивируемые белки
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Флуоресцентные маркеры для молекулярной и клеточной биологии: флуоресцентные таймеры, постоянно флуоресцирующие и фотоактивируемые белки"

На правах рукописи

ВЕРХУША Владислав Витальевич

ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МАРКЕРЫ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ: ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ТАЙМЕРЫ, ПОСТОЯННО ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ И ФОТОАКТИВИРУЕМЫЕ БЕЛКИ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

4847139

1 9 май 2011

Санкт-Петербург 2011

4847139

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН и в Медицинском колледже им. А. Эйнштейна в Нью-Йорке

Научный консультант: доктор физико-математических наук, профессор

Туроверов Константин Константинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Левицкий Дмитрий Иванович

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

доктор биологических наук, профессор Пермяков Евгений Анатольевич

Учреждение Российской академии наук Институт биологического приборостроения РАН

доктор физико-математических наук Тимковский Андрей Леонидович Учреждение Российской академии наук Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт

биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится МЮЯЯ 2011 года в часов на заседании

Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, д. 4

Сайт института: www.cytspb.rssi.ru

Адрес электронной почты института: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru Факс института: (812) 297-03-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институте цитологии РАН Автореферат разослан «04 » 2011 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, .

кандидат биологических наук (у^шЛЕ. В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Прижизненная визуализация процессов, происходящих в клетках и организмах, с высоким пространственным разрешением в реальном масштабе времени с использованием в качестве флуоресцентных маркеров зеленого флуоресцентного белка (GFP), его вариантов и гомологов, составляющих семейство GFP-подобных белков, стала в последнее десятилетие одним из наиболее востребованных методов исследования в биологии и медицине. В отличие от других природных пигментов, GFP-подобные белки формируют хромофор без участия внешних ферментных систем или кофакторов, кроме молекулярного кислорода. Таким образом, образование хромофора и возникновение свечения происходит непосредственно в живых организмах, тканях или клетках. Концевые фрагменты флуоресцентных белков доступны для связывания с другими белками, что позволяет осуществлять сшивку флуоресцентных белков (FP) с белками-мишенями. Это свойство делает FP уникальными генетически кодируемыми флуоресцентными маркерами - незаменимым инструментом для изучения взаимодействия белков, их локализации, внутриклеточного транспорта и создания молекулярных биосенсоров на различные внутриклеточные метаболиты.

В настоящее время FP широко используются для флуоресцентного мечения белков, органелл, клеток и целых организмов как прокариот, так и эукариот. Возможность одновременного использования нескольких FP с разными спектральными характеристиками привела к развитию новых методов оптической микроскопии, позволяющих изучать многофакторные процессы в живой клетке и многоклеточном организме. Последующие исследования постгрансляционных изменений, структуры и свойств GFP-подобных белков позволили разработать подходы для целенаправленного создания новых FP с улучшенными и даже заданными свойствами, которые нашли свое применение в биологии и биотехнологии.

Все красные FP дикого типа, так же как и первые улучшенные версии на их основе, обладали рядом существенных недостатков, таких как неполное и медленное образование хромофора, склонность к агрегации и олигомеризации, примесь зеленой флуоресцентной формы хромофора. Любой из перечисленных недостатков значительно ограничивает применение FP. Получение улучшенных вариантов FP остается важной задачей, решение которой значительно расширяет возможности применения FP в молекулярной и клеточной биологии. В настоящее время наиболее эффективным методом получения улучшенных версий красных FP является сочетание случайного и сайт-направленного мутагенеза с высоко эффективной техникой сортировки и отбора клеток.

Практическая значимость красных FP особенно велика для микроскопии тканей и целых организмов, поскольку свет с большей длиной волны лучше проникает в биологические образцы. Более того, использование красных FP повышает чувствительность детекции флуоресценции, так как автофлуоресценция клеток и светорассеивание в тканях уменьшаются с увеличением длины волны света.

Ввиду уникальных биохимических свойств белков семейства GFP, большой практической значимости FP для молекулярной и клеточной биологии, а также биомедицинских исследований, изучение механизмов, лежащих в основе спектральных, фотохимических и биохимических свойств FP, и создание новых FP является актуальной задачей.

Цель и задачи работы. Целью данной работы являлось создание новых постоянно флуоресцирующих FP, фотоактивируемых флуоресцентных белков (PAFP) и белков, флуоресценция которых изменяется со временем (т.н. флуоресцентных белков-таймеров (FT)), позволяющих производить флуоресцентное мечение в живых клетках и тканях. В ходе исследования решались следующие задачи:

1. Создание мономерных вариантов FP, PAFP и FT с различными спектральными характеристиками и паспортизация их фотохимических и биохимических свойств.

2. Определение пространственной структуры вновь созданных FP, PAFP и FT белков, изучение структуры их хромофоров, а также аутокаталитических и фотоиндуцированных механизмов их формирования.

3. Изучение свойств новых FP, PAFP и FT в связи с перспективами их использования в качестве маркеров в различных современных методах микроскопии и цитофлуорометрии.

4. Применение улучшенных вариантов FP, PAFP и FT, созданных в ходе выполнения работы, в конструкциях слияния с клеточными белками для решения ряда конкретных задач клеточной биологии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Формирование Tyr-содержащих хромофоров красных FP, PAFP и FT происходит через стадию образования синего интермедиата, хромофор которого состоит из имидазольного кольца и Л'-ацилиминовой группы, не объединенных в систему сопряженных л-связей с фенольным кольцом тирозина 64.

2. Автокаталитическая трансформация синего интермедиата в красный хромофор может быть замедлена, полностью остановлена или преобразована в фотоиндуцированный процесс методом сайт-направленного мутагенеза. Тем самым был показан путь целенаправленного превращения мономерных FP в PAFP и FT.

3. Предложен рациональный молекулярный подход, направленный на получение вариантов FP с большим стоксовым сдвигом флуоресценции посредством формирования в них цепей водородных связей для переноса протона в возбуждённом состоянии хромофора.

4. Созданные в работе FP, PAFP и FT являются оптимизированными маркерами для стандартных методов флуоресцентной микроскопии, микроскопии сверхвысокого разрешения и для флуоресцентной визуализации процессов в тканях животных.

5. Полученные в работе FP, PAFP и FT с улучшенными спектральными, биохимическими и фотохимическими свойствами позволяют решать ряд новых биологических задач на живых клетках и тканях млекопитающих.

использовании методов стандартной флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуорометрии. Вновь созданные варианты FP были применены в качестве маркеров при апробации новых методов оптической микроскопии, таких как регистрация резонансного безызлучателыюго переноса энергии (Förster resonance energy transfer, FRET), двухфотонное (two-photon, 2Р) возбуждение флуоресценции, регистрация изображений сверхвысокого разрешения единичных молекул PALM (photoactivated localization microscopy) и микроскопия сверхвысокого разрешения ансамбля молекул STED (stimulated emission depletion). Созданные FP, PAFP и FT были использованы для решения задач молекулярной клеточной биологии, включая мечение структур в живых клетках, детекцию внутриклеточных взаимодействий и детекцию колокализации белков-мишеней, определение внутриклеточного возраста белков.

Практическое значение полученных результатов. Практическая ценность работы заключается в получении новых мономерных FP, которые можно применять для многоцветового мечения белков, органелл, клеток и организмов различных видов прокариот и эукариот. Разработана стратегия рационального дизайна красных фотоактивируемых FP и FP с большим стоксовым сдвигом, которая может быть использована для получения других подобных маркеров с заданными спектральными характеристиками. Разработано несколько фотоактивируемых красных FP, что открывает новые возможности для прицельного введения и последующего слежения за перемещением одновременно двух флуоресцентно-меченых белков в живых тканях, клетках и органеллах. Становится доступным двухцветовая PALM микроскопия, основанная на использовании двух спектрально различающихся фотоактивируемых FP. Получен мономерный FP, флуоресцирующий в дальне-красной области спектра.

Апробация полученных результатов. Результаты диссертационной работы были представлены в качестве приглашённых докладов на следующих международных симпозиумах и конференциях: "Novel Approaches to Bioimaging II" (Эшберн, США, 2010), 50th Annual Meeting of American Society for Cell Biology (Филаделфия, США, 2010), "Light in Life Sciences" (Мельбурн, Австралия, 2009), "Fluorescent Proteins and Biological Sensors II" (Эшберн, США, 2009), 238th American Chemical Society National Meeting (Вашингтон, США, 2009), Annual USA-Russian Flow Cytometry Workshop (Москва, 2009), 48th Annual Meeting of American Society for Cell Biology (Сан-Франциско, США, 2008), "Fluorescent Proteins and Biological Sensors" (Эшберн, США, 2007), The MetroFlow Fall Meeting (Нью-Йорк, США, 2007), 4th Symposium on Biological Imaging "Innovations in Fluorescence Probes for Live-Cell Imaging" (Медисон, США, 2007), NIH Chesapeake Cytometry Consortium meeting (Бетезда, США, 2007), "Frontiers in Microscopy" (Бар Харбор, США, 2006), 57th Pittsburg Conference on Analytical Chemistry and Applied Spectroscopy (Орландо, США, 2006), а также на приглашенных семинарах и лекциях в Колумбийском университете (США, 2011), Гарвардском университете (США, 2001, 2007, 2011), Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2010), Йельском университете (США, 2009), Институте молекулярной биологии и генетики (Киев, Украина, 2006, 2009), Институте медицинских исследований Бурке (США, 2007), Университете Флориды (США, 2005), Университете Центральной Флориды (США, 2005), Питгсбургском университете (США, 2004), Центре фотомедицины Велмана Массачусетского госпиталя (США, 2004), Институте биоорганической химии РАН (2000, 2003), университете Колорадо (США, 2003), факультете биоинженерии и биоинформатики и

факультете химии Московского государственного университета (1999, 2002), Вюрцбургском университете (Германия, 2001), Киотском университете (Япония, 2001), университете Томаса Джефферсона (США, 2001), университете Орегона (США, 2001).

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Национальных Институтов Здоровья США (гранты DA019980, GM070358 и GM073913), NATO Collaborative Linkage Grant CBP.NR.NRCLG 981752 (Россия-США), федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" (контракт 02.740.11.5141) и программы РАН "Молекулярная и клеточная биология".

Публикации но теме работы. По материалам диссертации опубликованы 52 рецензированные печатные работы (44 оригинальные статьи, 6 обзоров и 2 главы в книгах) за период с 1999 по 2010 год.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследований, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций. Все результаты, обсуждаемые в работе, были получены либо лично автором, либо руководимыми им сотрудниками и аспирантами. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад автора заключался в непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов, в обсуждении и литературном оформлении результатов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит страницы печатного текста,_рисунков,_таблиц и_ссылки.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Основным направлением работы стала оптимизация свойств FP и, в частности, получение FP, спектры поглощения (возбуждения флуоресценции) и флуоресценции которых перекрывали бы по возможности больший спектральный диапазон. В задачу работы входило: 1) создание синего FP с улучшенными характеристиками и красных флуоресцентных FP по возможности с большими длинами волн возбуждения флуоресценции и флуоресценции; 2) получение вариантов белков с максимально возможной молекулярной яркостью, т.е. с максимально возможным коэффициентом молекулярной экстинкции и максимально большим квантовым выходом флуоресценции; 3) получение вариантов белков с максимально возможной фотостабильностыо; 4) получение мономерных форм FP, не склонных к димеризации и агрегации.

1. Мономерный синий флуоресцентный белок mTagBFP.

К моменту начала работы над диссертацией (1999 г.) уже были получены оптимизированные варианты зеленых и желтых белков, отличающихся высокой молекулярной яркостью (произведение квантового выхода флуоресценции и коэффициента молярной экстинкции) и высокой фотостабильностью, такие как EGFP и EYFP (Tsien, 1998). Все имеющиеся к этому времени синие FP (BFP) не отвечали этим требованиям. Мы предположили, что создать такие BFP можно путем замены

His66 на Тугбб. Однако ранние попытки разработать варианты BFP с Тугбб в протежированном состоянии на основе GFP путём блокирования переноса протона в возбуждённом состоянии (Ormo et al., 1996) не имели успеха. Мы обратили внимание на то, что образование красного хромофора проходит через стадию образования синего протежированного хромофора (Verkhusha et al., 2004) и что у красных флуоресцентных белков (RFPs) перенос протона в возбужденном состоянии не наблюдается (Hosoi et al., 2006; Remington, 2006). Поэтому было решено создать BFPs на основе пяти красных белков различного генетического происхождения: TagRFP (Merzlyak et al., 2007), mCherry (Shaner et al., 2004), mKeima (Kogure et al., 2006), HcRedl (Fradkov et al., 2002) и M355NA (Bulina et al., 2003). Сайт-специфический и случайный мутагенез привёл к тому, что все RFPs были конвертированы в BFP варианты. Эти BFPs содержали ограниченное число

100 мин 150 мин

О 50 100 150 200 250 п

n U МИМ

Время, мин

После разрезенин

До разрезания

400 450 500 550 600

Длина волны, нм

Время, мин

Время, с

ш 30

Флуоресценция

FRET

Рис. 1. Свойства mTagBFP. (А) Спектры поглощения, возбуждения и эмиссии mTagBFP. (Б) Кинетика созревания mTagBFP и контрольного EBFP2. (В) pH-зависимость для mTagBFP и EBFP2. (Г) Кривые фотовыцветания для mTagBFP (сплошная линия) и контрольных EBFP2 (коротко-штриховая линия) и Azurite (штриховая линия), полученные при облучении в эпифлуоресцентном режиме. (Д) Кривые фотовыцветания mTagBFP (сплошная линия), EBFP2 (коротко-штриховая линия) и контрольного Azurite (штриховая линия), полученные при сканировании лазером с длиной волны 405 нм. (Е) Спектры флуоресценции очищенной FRET конструкции mTagBFP-mTagGFP до и после протеолитического разрезания. (Ж) FRET mTagBFP-mTagGFP в клетках HeLa, обработанных стауроспорином на панели 3. (3) На верхних снимках показаны изображения клеток после обработки стауроспорином. На нижних снимках с помощью псевдоЦветов показаны корректированные сигналы FRET.

консервативных мутаций по одним и тем же положениям полипептидной цепи 65L,H, 69К, 84F,W,L, 148F,I, 165A,I,N, 181 A,I и 203F,Y (если не указано иное, нумерация здесь и ниже приведена по выравниванию аминокислотной последовательности со стандартным GFP). Дальнейшая селекция мутантов привела к созданию синего мономерного белка mTagBFP, отличающегося от TagRFP восемью аминокислотными заменами: N23D, R69K, Р131Т, М151Т, G175S, С179А, D213N и K214N, спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции которого имеют максимумы соответственно при 399 и 456 нм (Рис. 1А).

1.1. Физико-химические характеристики очищенного mTagBFP.

По сравнению с EBFP2, который являлся наилучшим мономерным BFP (Ai et al., 2007), mTagBFP имеет в 1,6 раза больший молярный коэффициент экстинкции (52000 М~'см-1) и в 1,2 раза больший квантовый выход (0,63). Таким образом, молекулярная яркость mTagBFP почти в 2 раза выше, чем у EBFP2, и сравнима с молекулярной яркостью широко используемого EGFP. Более структурированный и узкий спектр флуоресценции mTagBFP по сравнению с EBFP2 (полуширина спектра флуоресценции mTagBFP составляет 59 нм, в то время как у EBFP2 эта величина составляет 70 нм) обеспечивает большее спектральное разделение с другими FPs, что делает mTagBFP весьма перспективным маркером для многоцветового мечения.

При 37°С mTagBFP время созревания в два раза короче, а интервал рН-стабильности - в два раза шире (р/^а ниже 3,0) по сравнению с EBFP2 (Рис. 1Б и 1В). Фотостабильность mTagBFP при облучении в эпифлуоресцентном режиме сравнима с фотостабильностью Azurite (Mena et al., 2006), но ниже на 40% по сравнению с EBFP2 (Рис. 1Г). При использовании сканирующего конфокального облучения фотостабильность mTagBFP была в 2,1 и 3,3 раза выше, чем фотостабильность EBFP2 и Azurite, соответственно (Рис. 1Д).

1.2. Использование mTagBFP в качестве донора FRET.

Поскольку спектр флуоресценции mTagBFP и спектры поглощения GFPs имеют значительное перекрывание, mTagBFP может быть хорошим донором в сочетании с GFP (акцептором) при безызлучательном резонансном переносе энергии (FRET). Среди доступных GFP в качестве возможного акцептора был выбран TagGFP из-за его слабого поглощения в спектральной области ниже 400 нм, где возбуждается mTagBFP. Конструкция FRET-маркеров требует, чтобы донор и акцептор были мономерными. После введения известной мономеризующей мутации А206К и дополнительного мутагенеза для сохранения яркости белка был получен яркий мутант TagGFP с заменами L99Q, M153R, V163A и А203К. Эта мутантная форма mTagGFP имеет спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции с максимумами при 483 и 506 нм, соответственно.

Расчет показал, что для пары mTagBFP и mTagGFP радиус Фёрстера 7?о=5,25 нм, т.е. больше, чем для пары EBFP2-mTagGFP и стандартных пар ECFP-EYFP (Patterson et al., 2000) и mCyPet-mYPet (Nguyen et al., 2005; Ohashi et al., 2007). Экспериментальная оценка эффективности переноса энергии была выполнена при помощи протеолитического расщепления сконструированного белка слияния, состоящего из тандема mTagBFP-mTagGFP, соединённого аминокислотной последовательностью -DEVD-, котрая может быть расщеплена каспазой-3 (Рис. 1Е) Эффективность FRET, £, составила соответственно: £=0,57 для mTagBFP-mTagGFP, £=0,38 для EBFP2-mTagGFP, £=0,42 для ECFP-EYFP и £=0,51 для mCyPet-mYPet

пар. Это означает, что пара mTagBFP-mTagGFP является лучшей среди имеющихся FRET-nap мономерных флуоресцентных белков.

Эта пара была использована в качестве биосенсора на апоптоз в клетках линии HeLa. Об эффективности переноса судили на основании интенсивности сигнала FRET (Gordon et al., 1998). Начальная эффективность FRET для тандемых пар mTagBFP-mTagGFP и ECFP-EYFP составляла 51,5% и 48%. При инкубации в течение 150 мин с 1 мкМ стауроспорина эффективность FRET снижалась от 51,5% до нуля (Рис. 1Ж, 3). Большая эффективность FRET для пары mTagBFP-mTagGFP позволила обнаружить даже слабую протеолитическую активность на начальных стадиях апоптоза. В контрольных экспериментах по соэкспрессии белков в клетках, пара mTagBFP-mTagGFP имела в 6 раз более низкий уровень базового сигнала FRET, по сравнению с парой ECFP-EYFP. Это обусловлено тем, что mTagBFP и mTagGFP, полученные из различных морских организмов, не склонны образовывать гетеродимеры, в отличие от слабо димеризующихся ECFP и EYFP из одного того же природного источника.

1.3. Структура хромофоров mTagBFP и его предшественника TagRFP.

Основываясь на том, что несколько генетически существенно различных RFP удалось превратить в BFP варианты при помощи близких мутаций, а также на наших ранних наблюдениях о том, что хромофор DsRed (Matz et al., 1999) и других RFP при созревании проходит стадию синего протонированного интермедиата (Verkhusha et а!., 2004), мы предположили, что механизм образования красного хромофора через синий интермедиат должен быть консервативным. Прямое сравнение хромофоров и их окружения в близко родственных синем и красном флуоресцентных белках должно было пролить свет на этот вопрос. Поэтому мы закристаллизовали и определили пространственную структуру TagRFP и его производного mTagBFP с разрешениями 2,2 Â.

Было установлено, что TagRFP имеет практически пленарный анионный DsRed-подобный хромофор (Yabrough et al., 2001) с двойной связью Са-Ср в боковой цепи Туг64, но в трале-конфигурации. Хромофор mTagBFP содержит N-ацилимин и одинарную связь Са-Ср в боковой цепи Туг64, что исключает фенольное кольцо Tyr64 mTagBFP из системы сопряженных я-связей. При денатурации mTagBFP в щёлочи или кислоте возникают спектры поглощения, которые не характерны для GFP-подобного или DsRed-подобного хромофоров, содержащих двойную связь Са-Ср в боковой цепи Туг хромофора.

Было установлено, что точечные аминокислотные замены в окружении N-ацилимина влияют на образование или на фотостабильность синей флуоресценции. Кроме того, введение алифатических остатков в позицию 64 mTagBFP почти не влияет на спектры поглощения и флуоресценции. Это подтверждает, что двойной связи Са-Ср в боковой цепи Туг64 не существует. Масс-спектрометрия хромофор-содержащего пептида mTagBFP показала, что при формировании хромофора масса фрагмента уменьшается на 20 Да, причём с помощью тандем-масс-спектрометрии мы обнаружили, что связь Ca-N в Leu63 окислена.

Эти данные указывают на то, что mTagBFP содержит новый тип хромофора -Л'-[(5-гидрокси-1//-имидазол-2-ил)метилиден]ацетамид, вовлеченный, как и хромофоры TagRFP и mTagBFP, во множество взаимодействий с окружающими их аминокислотами внутри р-бочонка.

1.4. Трансформация тирозин содержащих хромофоров.

На основании химических структур хромофоров, данных мутагенеза и имеющихся литературных данных в работе была предложена общая схема химических превращений трипептида, образующего хромофор, согласно которой Бэкес^подобный хромофор, такой как в Та£ЯРР, образуется через шТа§ВРР-подобный интермедиат (Рис. 2). После синтеза происходит сворачивание полипептидной цепи ИР, которое сопровождается циклизацией трипептида с отщеплением молекулы воды (Рис. 2, А->Б). Образующаяся имидазолон-содержащая форма имеет спектр поглощения с максимумом около 350 нм.

Рис. 2. Пути образования хромофоров тТа§ВРР и TagRFP. (А) Нециклизованный хромофорный трипептид. (Б) Циклизованный, но не окисленный предшественник хромофора пП^ВРР. (В) Синий mTagBFP хромофор. (Г) Красный TagRFP хромофор ОвКеё-подобного типа. (Д) Зелёный вРР-подобный хромофор. (Е) Протонированная форма ОРР-подобного хромофора. (Ж) Протонированная форма ОэКесРподобного хромофора.

Образование этой формы имеет место как для фотоактивируемых РАТа£ЯРР (8иЬасИ й а1., 2010), так и для перманентно флуоресцирующих мутантов вРР (Вагопёеаи Й а1., 2007). Дальнейшее окисление этой формы кислородом может протекать либо по связи Са-Ср в боковой цепи Туг трипептида с образованием анионного ОРР-подобного хромофора с максимумом спектра поглощения при ~490 нм (Рис. 2, Б->Д), либо по Са-Ы связи первого остатка трипептида с образованием тТа§ВРР-подобного хромофора с максимумом спектра поглощения при ~400 нм (Рис. 2, Б->В), найденного у mTagBFP, синих форм РТ белков (8иЬасЬ е1 а1., 2009) и в «ОРР» состоянии РАРР семейства РАтСИеггу. Образование анионного ОзЯеё-подобного хромофора с максимумом спектра поглощения при -580 нм требует окисления тТа§ВРР-подобного хромофора по связи Са-Ср в боковой цепи Туг трипептида (Рис. 2, В->Г). Окисление может протекать как автокаталитически (как, например, у Та£11РР и тСЬегту), так и в результате облучения фиолетовым светом, как в случае белков РАтСИеггу и PATagRFP (БиБасЬ й а1., 2010). В РТ автокаталитический переход В->Г замедлен в различной степени (8иЬасЬ е! а1., 2009). В случае РАТа§ЯРР в результате облучения фиолетовым светом также может происходить переход Б->В. Практически любая химическая трансформация хромофора на Рис. 2 может быть замедлена или даже заблокирована мутагенезом и может происходить либо автокаталитически, либо быть фотоиндуцированной.

Как GFP- так и DsRed-подобные хромофоры способны к флуоресценции в анионной (депротонированной) форме (Рис. 2Д, Г). Введение дополнительных карбоксильных групп около этих хромофоров приводит к протонированию гидроксильной группы фенольного кольца Туг хромофора и образованию нефлуоресцентных нейтральных (протонированных) хромофоров с максимумами спектра поглощения при ~400 и -460 нм (Рис. 2Е, Ж). При облучении этих нейтральных форм светом в максимумах поглощения они переходят в возбужденное состояние, в котором может происходить процесс переноса протона от гидроксильной группы Тугбб с образованием короткоживущих анионных состояний. В этих состояниях GFP- или DsRed-подобные хромофоры испускают зеленый или красный фотоны, соответственно, со значительно более низкой энергией, чем энергия поглощенного фотона. Процесс переноса протона в возбужденном состоянии ответствен за так называемый большой стоксов сдвиг, наблюдаемый у некоторых зеленых (Zapata-Hommer et al., 2003; Ai et al., 2008) и красных (Henderson et al., 2009; Piatkevich et al., 2010) флуоресцентных белков.

2. Серия мономерных флуоресцентных белков-таймеров.

Для визуализации хронологических и пространственных молекулярных событий на клеточном уровне большой интерес представляет создание флуоресцентных таймеров (FT) - белков, у которых положение спектра флуоресценции изменяется во времени. Единственным доступным к моменту начала работы над диссертацией FT был DsRed-FT, известный также как DsRed-E5 (Terskikh et al., 2000). Однако склонность этого белка к образованию тетрамера препятствовала его использованию в белках слияния. Достигнутое нами понимание механизма формирования хромофоров в FP (Рис. 2) позволило определить путь создания FT, изменяющих флуоресценцию с синей на красную. В качестве исходного материала для направленного мутагенеза был выбран ген красного FP mCherry - мономерного варианта DsRed. Анализ структуры mCherry, а также экспериментальные данные об аминокислотных заменах, влияющих на скорость созревания мутантных вариантов DsRed, позволили выбрать для мутагенеза позиции 42, 44, 65, 69, 106, 148, 203 и 224. Скрининг бактериальных библиотек мутантов методом проточной цитофлуориметрии и последующий анализ отобранных колоний на чашках Петри выявил два мутанта mCheny/K69R/A224S с быстрым и mCherry/K69R с медленным превращением синего света в красный, которые, однако, имеют низкую яркость флуоресценции. Эти мутанты были подвергнуты случайному мутагенезу. Были выбраны три мутанта mCherry: 1) H17Y, M18V, Е34К, K69R, L84W, S112T, S149T, S149T, D178N, N202D, S209T и A224S, 2) M18L, T43S, K69R, L84W, M152I, H176D, Q194L, L205M, Y221C и R227H, и 3) M18V, G24D, E32V, K69R, L84W, D178N, A179V, Q110H и I120V, которые мы назвали соответственно FastFT, MediumFT и SlowFT.

2.1. Основные свойства очищенных рекомбинантных быстрого (FastFT), среднего (MediumFT) и медленного (SlowFT) таймеров.

Синие формы FastFT, MediumFT и SlowFT имеют спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции с максимумами при 403/466, 401/464 и 402/465 нм, соответственно (Рис. ЗА, Б для FastFT). Соответствующие красные формы имеют спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции с максимумами при 583/606,

579/600 и 583/604 нм. Спектры поглощения обеих форм совпадают с соответствующими спектрами возбуждения флуоресценции. Все ИТ, как и исходный гпСЬегту, не склонны к димеризации.

В процессе созревания РТ максимальное накопление синих форм наблюдается через 0,25, 1,2 и 9,8 ч после синтеза РаБ1РТ, МесйитРТ и 81оу/РТ при 37°С (Рис. ЗВ). После этого доля синих форм РТ снижается до нуля, а доля красных форм увеличивается до максимального значения. Скорость этих процессов зависит от температуры (Рис. ЗГ, Д, Е). Для каждого РТ отношение интенсивностей красной и синей флуоресценции представляет собой параболическую зависимость от времени, которая однозначно связана с возрастом определенного РТ.

Молярные коэффициенты экстинкции и квантовые выходы флуоресценции

рН рН рН

Рис. 3. Свойства флуоресцентных белков-таймеров. (А) Изменения во времени спектра возбуждения флуоресценции для синей (пик на 403 нм) и красной (пик на 583 нм) форм Раз1РТ при 37°С. (Б) Изменения во времени спектра эмиссии флуоресценции для синей (пик на 466 нм) и красной (пик на 606 нм) форм Раз1РТ при 37°С. (В) Кинетика созревания синей (чёрным) и красной (серым) форм Раз1РТ (треугольники), МеёштРТ (квадраты) и 51о\уРТ (круги) при 37°С. (Г-Е) Изменение во времени отношения красной к синей флуоресценции для Рав1РТ (Г), МесНшпРТ (Д) и 51ошРТ (Е) при разных температурах. (Ж-И) рН зависимость интенсивности флуоресценции для синей (Ж) и красной (3) форм и отношение между красной и синей формами (И) для Раз1РТ (треугольники). МесМшпРТ (квадраты), 51о\уРТ (круги) и контрольных ЕВРР2 (Ж) и шСИеггу (3) (ромбы).

синих форм FT составляют соответственно 33400-49700 М"'см"' и 0,30-0,41. Флуоресценция синих форм отличается высокой рН стабильностью со значением рЛ'а около 3,0 (Рис. ЗЖ). Для сравнения, широко используемый синий белок EBFP2 характеризуется более низкой рН стабильностью со значением рА'а около 4,5. Коэффициенты экстинкции красных форм FT выше, чем у синих форм, и варьируют от 73100 до 84200 М"'см"'. Квантовые выходы флуоресценции красных форм FT составляют 0,05-0,09. рН стабильность флуоресценции красных форм близка к исходному mCherry со значениями рА"а 4,1-4,7 (Рис. 33). Для всех FT отношение интенсивности флуоресценции красной и синией форм меняется в пределах физиологических значений рН от 5,4- до 7,4 менее чем на 8%.

2.2. Использование флуоресцентных таймеров для изучения внутриклеточных процессов.

Для того, чтобы охарактеризовать поведение FT в системах, отличных от бактерий, FT были экспрессированы в стабильных клонах клеточной линии S2 дрозофилы под контролем промотора, индуцируемого металлотионеином. После краткой индукции в течение 0,5, 1 и 2 ч экспрессии FastFT, MediumFT и SlowFT сульфатом меди наблюдали изменение интенсивности синей и красной флуоресценции клеток S2 на протяжении 15 дней, используя метод проточной цитофлуориметрии (Рис. 4А-В). Для изучения свойств FT в клетках млекопитающих была выбрана линия клеток HeLa/Tet-Off. Транскрипцию FT останавливали через несколько часов доксициклином, после чего флуоресценцию клеток анализировали, используя проточный цитофлуориметр (Рис. 4Г-Е).

Следует отметить, что рост флуоресценции синей и красной форм и уменьшение флуоресценции синих форм для всех FT в клетках S2 и HeLa/Tet-Off происходили медленнее, чем изменение сооответствующих параметров для очищенных FT (Рис. 4). Эти данные свидетельствуют о том, что трансляция FT продолжается еще некоторое время после ингибирования экспрессии. Кроме того, FT in vivo подвержены внутриклеточной деградации, о чем свидетельствует медленное уменьшение интенсивности красной флуоресценции после достижения максимума.

Свойства FT были использованы при изучении внутриклеточного транспорта лизосомного рецептора LAMP-2A шаперон-опосредованной аутофагии (chaperone-mediated autophagy, СМА) (Eskelinen et al., 2002). По данным проведенных ранее исследований транспорта LAMP биохимическими и иммунофлуоресцентными методами, оставалось не ясным, каким из двух внутриклеточных путей LAMP попадает в лизосомы: прямым - из аппарата Гольджи в поздние эндосомы и лизосомы, или непрямым - из аппарата Гольджи на плазматическую мембрану секреторным путем, а затем в лизосомы посредством эндоцитоза. Поскольку белок слияния LAMP-2A-MediumFT можно было наблюдать в нескольких клеточных компартментах одновременно, именно эту конструкцию слияния применили для изучения транспорта в клетках линии HeLa/Tet-Off.

Исходя из количества синей и красных форм, наблюдаемых для LAMP-2A-MediumFT в разных компартментах, а также из их соотношения, было определено, что LAMP-2A появляется на плазматической мембране не в результате слияния уже существующих лизосомных компартментов, а доставляется из аппарата Гольджи непосредственно после синтеза. Мы определили время нахождения LAMP-2A-MediumFT в различных клеточных компартментах при непрямом транспорте: аппарат Гольджи (1,3-1,4 ч) —> плазматическая мембрана (3,0 ч) —> ранние и рециклирующие

О 10 20 30 40 50 60 70 Время, ч

синяя форма

красная форма

наложение

эндосомы (3,0-7,0 ч) —> поздние эндосомы и лизосомы (после 7,5 ч). Через 12 ч после экспрессии более 90% ЬАМР-2А находится в поздних эндосомах и лизосомах (Рис. 4Ж).

Инт. синей фл., отн. ед.

Время, ч

0 50 100 150 200 250 300 350 Время, ч

3 юо

О 50 100 150 200 250 300 350 Время, ч

0 50 100 150 200 250 300 350 Время, ч

1ч 6 ч 12 ч 21ч 36 ч 63 ч

Рис. 4. Поведение ФТ в клетках Э2 дрозофилы и НеЬа млекопитающих после импульсного включения экспрессии. (А-В) Изменения во времени флуоресценции синей (чёрные символы) и красной (пустые символы) форм, определенные с помощью проточной цитофлуориметрии в клетках 82 для Раз1РТ (А), МесНитРТ (Б) и 51о\уРТ (В) при 25°С. (Г-Д) Изменения во времени флуоресценции синей (синие символы) и красной (красные символы) форм в клетках НеЬа/ТеМЖдля МесМитРТ (Г) и 81о\\ТТ (Д), экспрессируемых в цитоплазме при 37°С. (Е) Точечные гистограммы, полученные на проточной цитофлуориметрии с клетками НеЬа/ТеЬСОТ, экспрессирующими Б^иТТ в цитоплазме при 37°С, для выбранных значений времени: 1,5 (зеленый), 7 (светло зеленый), 17 (желтый), 41 (оранжевый) и 56 (красный) часов после добавления доксициклина. (Ж) Внутриклеточная локализация белка слияния ЬАМР-2А-Мес1штРТ в клетках НеЬа/Тй-СЖ в различные периоды времени после прекращения транскрипции доксициклином. Синяя и красная формы ЬАМР-2А-Мес1штРТ показаны соответственно зеленым и красным псевдоцветами.

Таким образом, мономерные FT позволяют определять обмен между компартментами, следить за молекулами до и после отдельного клеточного события и определять времена внутриклеточных пост-трансляционных изменений. Наличие трёх FT с различными временами созревания хромофора будет востребовано при исследовании клеточных процессов с существенно отличающимися временными параметрами. Кроме того, синий и красный цвета флуоресценции позволяют использовать FT вместе с GFP вариантами для многоцветного мечения клеточных структур. Мономерное состояние FT позволяет применять их в FRET методах с GFP в качестве FRET партнера. В отличие от тетрамерного таймера DsRed-E5 мономерные FT могут также использоваться для определения хронологии внутриклеточных белок-белковых взаимодействий.

2.3. Структуры хромофоров FastFT и его синего мутанта В1ие102.

Для выяснения молекулярного механизма изменения спектра FT от синего к красному мы определили пространственную структуру белков FastFT (с хромофором M66-Y67-G68) и его мутанта В1ие102 (с хромофором L66-Y67-G68), который не изменяет цвет на красный, а всё время остаётся синим. Показано, что переход состояния с синей флуоресценцией в состояние с красной флуоресценцией происходит в соответствии со схемой, представленной на Рис. 2, и связан с замедлением окисления связи Ca-Cß в боковой цепи Туг67 хромофора. Ключевую роль в этом процессе играют остатки Arg70 и Туг83, так как мутации R70K или W83L существенно ускоряют образование красного, но не оказывают большого влияния на скорость образования синего хромофора. Замены S217A и S217C в FastFT, наоборот, существенно замедляют образование промежуточного синего хромофора, но не влияют на переход из синего в красный, тогда как хромофор FastFT имеет цис-конфигурацию, стабилизированую водородной связью между кислородом фенолята Туг67 и гидроксилыюй группой боковой цепи Serl46. В В1ие102 объемная боковая цепь Ile 146 ингибирует г/г/оконформацию хромофора, тем самым блокируя переход из состояния с синей флуоресценцией в состояние с красной флуоресценцией.

3. Серия фотоактивируемых флуоресцентных белков PAmCherrv.

Фотоактивируемые флуоресцентные белки (PAFP) - исходно не флуоресцирующие, становятся флуоресцентными после краткого облучения фиолетовым светом. PAFP пригодны для практически мгновенного мечения молекулярных субпопуляций и визуализации их последующей динамики внутри клеток. PAFP также являются зондами, необходимыми для новых оптических технологий с высоким разрешением, таких как фотоактивируемая локализационная микроскопия PALM. Особый интерес для развития PALM представляет создание мономерных красных PAFP.

На основании анализа механизма формирования хромофоров (Рис. 2) для создания PAFP мы предложили сделать переход хромофорной структуры из состояния В в состояние Г фотоиндуцированным и при этом модифицировать саму структуру В или её ближайшее окружение таким образом, чтобы в состоянии В структура не флуоресцировала. В качестве исходного материала для направленного мутагенеза был выбран ген mCherry. Насыщенный мутагенез по позициям 148, 165, 167 и 203, расположенным в непосредственной близости к хромофору, и последующий случайный мутагенез позволили выявить три фотоактивируемых

-- РАтСьшу1

---РА|-пС|1«гу2

......РАшелелуЗ

- - - ■ гпСЬеггу

О 20 40 60 80 100

Время созревания, мин

В .

О X аз о я

X ™ ли ? О ой !

, * —шк скорости

£ 20 ! —о— »фсрйктивностъ

5 га

-РАтО|вну1

- - - РАтСИеггу2

......РАташггуЗ

............ИЕ«РР

8 10 16 20 Время активации, с

И'

50 100 150

Время, с

0 50 100 150

Время, с

РА(пС11е(гу1 .........геСЬепу

О 25 50 75

Время выжигания, с

в: .юо^

« о

! ® 8° I

8 £ ео! о о

| -40 я#2

Xх о

Г20!

ВО 100 160 200

Время, с

- гйСГкягуКеч

Рис. 5. Свойства белков РАшСЬеггу. (А) Спектры поглощения, возбуждения и флуоресценции для РАшСЬеггу 1 до и после фотоактивации на длине волны 399 нм. Спектры поглощения и флуоресценции РАшСЬеггу2 и РАшСЬеггуЗ сходны. (Б) Кинетика созревания при 37°С для РАшСЬеггу 1, РАтСЬеггу2, РАшСЬеггуЗ и шСЬегту. (В) рН-зависимость интенсивности флуоресценции для РАшСЬеггу 1, РАшСЬепу2, РАшСЬеггуЗ и 1с1Ео5рР. (Г) Относительные скорость и эффективность фотоактивации РАшСЬеггу 1 при различных значениях рН. Значения скорости и эффективности для РАшСЬепу2 и РАшСЬеггуЗ сходны. Кинетика фотоактивации (Д) и фотообесцвечивания (Е) для РАшСЬеггу 1, РАшСЬеггу2, РАшСЬеггуЗ и 1(1ЕозРР. (Ж-И) Цикличное освещение РАшСЬеггу 1, геСЬепу и гзСЬепуЯеу через фильтр 570/30 в течение 12 с и один из следующих фильтров: 390/40 нм в течение 0,6 с (Ж), 436/20 в течение 0,5 с (3), или 480/40 в течение 0,4 с (И). Максимумы сигналов на (Ж-И) нормированы на относительную яркость каждого белка.

варианта с улучшенными характеристиками: РАшСЬеггу 1 - Е26У, А58Т, К69Ы, Е84Е, Ы99К, 8148Ь, 1165V, (3167Р, Ы69У и 120311; РАгпСЬеггу2 - М18Ь, К69М, Ь84Р, А147Т, 81481,, 1165Ь, 0167А, Е169Т, А179Т, 120311 и 1Ш6Ц и РАшСЬеггуЗ - М18Ц А58Т, К69Ы, Е84Р, М1371, Е146Б, 8148Ь, Г165Ь, (3167А, Б178Е и 1203Я.

3.1. Свойства очищенных белков РАтСИеггу.

До фотоактивации РАшСЬеггу 1, РАшСЬеггу2 и РАшСЬеггуЗ имеют спектры поглощения с максимумами при 404-406 нм и не флуоресцируют. В

фотоактивированном состоянии белки PAmCherry флуоресцируют в красной области спектра. Они имеют спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции с максимумами на 564/595, 570/596 и 570/596 нм, квантовые выходы флуоресценции в пределах 0,24-0,53 и молярные коэффициенты экстинкции 18000-24000 М"'см"' (Рис. 5А). Времена созревания вариантов PAmCherry (18-25 мин при 37°С) превышают в 1,2-1,7 раза время созревания исходного mCherry (Рис. 5Б). Все варианты PAmCherry, как и mCherry, являются мономерами.

По сравнению с tdEosFP, PAFP с исходно зеленой флуоресценцией (Wiedenmann et al., 2004), все варианты PAmCherry имеют более высокую рН-стабильность со значениями рА^а 6,2-6,3 (Рис. 5В). Эффективность и скорость фотоактивации PAmCherry (см. Рис. 5Г для PAmCherry 1) уменьшаются при переходе в кислую область pH. Белок PAmCherry 1 имеет скорость фотоактивации, более чем в 2 раза превышающую этот параметр для двух других вариантов PAmCherry ив 1,6 раза - для tdEosFP (Рис. 5Д). Скорость обесцвечивания фотоактивированных вариантов PAmCherry в 1,8-3,5 раза ниже, по сравнению с красной формой tdEosFP (Рис. 5Е). При фотоактивации интенсивность красной флуоресценции возрастает для PAmCherry в 3000-5000 раз, тогда как красная флуоресценция очищенного tdEosFP увеличивается не более чем в 200 раз.

На примере PAmCherry 1 нами была проверена способность вновь созданных PAFP к обратимому фотопереключению, способность к которому была показана для ранее созданных мутантов mCherry, названных rsCherry и rsCherryRev (Stiel et al., 2008). При периодическом облучении с использованием светофильтров 390/40 (или 436/20) и 570/30 образец PAmCherry 1 последовательно фотоактивировали фиолетовым светом, а затем фотообесцвечивали желтым светом (Рис. 5Ж, 3). Было показано, что фотоактивация PAmCherry 1 необратима. Белок обесцвечивается уже после 15 циклов фотопереключения (Рис. 5И).

3.2. Использование PAmCherryl в микроскопии сверхвысокого разрешения PALM.

Для оценки возможности применения PAmCherry в PALM приложениях были созданы белки слияния PAmCherry с двумя белками плазматической мембраных трансферриновым рецептором (transferrin receptor, TfR) и белком ts045 вируса G везикулярного стоматита (vesicular stomatitis virus G protein ts045, VSVG). Локализацию этих белков можно было выявить с помощью микроскопии полного внутреннего отражения TIRF (total internal reflection fluorescence). Белки слияния TfR-PAmCherry и VSVG-PAmCherry при экспрессии в клетках линии COS-7 сохраняли нормальную локализацию.

Сравнение характеристик PAmCherryl и tdEosFP в конструкциях с VSVG и TfR при использовании их в микроскопии высокого разрешения PALM показало, что эти PAFP дают сравнимое пространственное разрешение (Рис. 6А-Е).

Конструкция PAmCherryl-TfR была использована в двухцветовой PALM микроскопии совместно с химерной конструкцией зелёного PAFP, PAGFP (Patterson et al., 2002), с легкой цепью клатрина (clathrin light chain, CLC). Известно, что TfR интернализуется через клатрин-окаймленные везикулы, размер которых совпадает с размером кластеров TfR. Мы изучили колокализацию кластеров TfR и клатрин-окаймленных везикул. Для TfR-PAmCherry 1 (Рис. 6Ж-И) и PAGFP-CLC (Рис. 6К-Л) характерны кластеры, расположенные повсюду на плазматической мембране. TfR-PAmCherryl формировал крупные структуры протяженностью несколько мкм (Рис.

Рис. 6. PALM микроскопия PAmCherryl в фиксированых COS-7 клетках. (А) Гистограммы количества фотонов, собранных от молекул, показаны для TfR-PAmCherryl (красные столбцы; среднее значение=724) и TfR-tdEosFP (черные столбцы; среднее значение=940). (Б) Гистограммы неопределенностей молекулярной локализации (а) для TfR-PAmCherry 1 (красные столбцы; среднее значение=15,18) и TfR-tdEosFP (черные столбцы; среднее значение= 16,75). (В) Гистограммы продолжительности молекулярной флуоресценции (0,1 с кадры) для TfR-PAmCherryl (красные

столбцы) и TfR-tdEosFP (черные столбцы). (Г) Гистограммы количества фотонов, собраных от молекул VSVG-PAmCherry 1 (красные столбцы; среднее значение=657) и VSVG-tdEosFP (черные столбцы; среднее значение=1057). (Д) Гистограммы ст для V S VG-P AmCherry 1 (красные столбцы; среднее значение=20,96) и VSVG-tdEosFP (черные столбцы; среднее значение=19,91). (Е) Гистограммы продолжительности молекулярной флуоресценции (0,1 с кадры) для VSVG-PAmCherry 1 (красные столбцы) и VSVG-tdEosFP (черные столбцы). (Ж-Т) Изображения клеток, со-экспрессирующих (Ж-И) TfR-PAmCherry 1 и (К-М) PAGFP-CLC, в режиме TIRF (Ж, К, И) или PALM (3, И, Л, М, О, П) (Н-П) Наложение изображений

показывает относительные

распределения TfR-PAmCherryl (красный) и PAGFP-CLC (зеленый). (Р) Парный корелляционный анализ (вверху) и нормализованные результаты (внизу) на наличие и размер молекулярных кластеров.

Кластерный анализ молекул на изображениях на О (С) и П (Т).

А Б В

0 14 I TfR-tdEosFP 8 щ, 0 60 12 I > TfR-PAmCherry1 ' jl ^ 5°

1 i |! 1 |:l-_ ¿ il I"

°0 1000 2000 °0 10 20 30 40 50 0 1 2 3 4 5 S 7

Фотоны о, нм Кадры

1 1 ■ VSVG-tdEosFP ^ 6 ,13 VSVG-PAmCtierry1 5 14 1 s-3 L у i I 8U LI L

0 1000 2000 £ 1 10 20 30 40 50 2345678910

Фотоны a, hm Кадры

TIRF PALM PALM

6Ж, 3), которые, возможно, представляют собой складки плазматической мембраны. Наблюдалась частичная колокализация TfR-PAmCherry 1 с PAGFP-CLC как на TIRF-снимках (Рис. 6Н), так и на PALM изображениях с разрешением в 25 нм (Рис. бО, П). Парный корреляционный анализ подтвердил сходные молекулярные распределения и характерный размер кластеров -200 нм для обоих

типов молекул TfR-PAmCherryl и PAGFP-CLC, с более высокой степенью кластеризации для CLC (Рис. 6Р). С помощью кластерного анализа мы определили, что молекулы TfR-PAmCherryl и PAGFP-CLC находятся в трёх различных состояниях: кластеризованы и колокализованы, кластеризованы и не колокализованы и полностью не кластеризованы (Рис. 6С, Т).

Наблюдаемые нами с помощью PALM форма и размер кластеров совпадали с клатрин-окаймленными везикулами, наблюдаемыми ранее с использованием электронной микроскопии (Heuser et al., 1989). Различная колокализация TfR и CLC может представлять разные стадии формирования клатрин-окаймленных везикул (Kirchhausen, 2000). Так, кластеры PAGFP-CLC, в которых отсутствует TfR-PAmCherryl, могут соответствовать зрелым клатрин-окаймленным везикулам, кластеры TfR-PAmCherryl без PAGFP-CLC, возможно, представляют зрелые эндосомы, близкие к плазматической мембране, а колокализованные кластеры являются ранними клатрин-окаймленными везикулами, захватившими TfR-PAmCherryl.

Таким образом, отсутствие флуоресценции любого другого цвета в белках PAmCherry, кроме как красного, расширяет диапазон возможностей многоцветовой стандартной микроскопии и многоцветовой микроскопии сверхвысокого разрешения. Меньший размер мономерной формы PAmCherry, по сравнению с tdEosFP, вносит меньше искажений в функциональные характеристики белков слияния.

3.3. Хромофор PAmCherryl в тёмном и флуоресцентном состояниях.

Для выяснения молекулярного механизма фотоиндуцированного изменения спектров PAFP мы закристаллизовали белок PAmCherryl до и после фотоактивации. Хромофор в темном состоянии имеет неплоскую конформацию и содержит, аналогично хромофору mTagBFP, неокисленную связь Ca-Cß в боковой цепи Туг67. Белок PAmCherry 1 в фотоактивированном состоянии содержит неплоский анионный DsRed-подобный хромофор в транс- конфигурации, при этом наблюдается уменьшение электронной плотности карбоксильной группы Glu215. Данные масс-спектрометрии подтвердили, что в OFF состоянии окислена только Ca-N связь в Met66, а в ON состоянии, кроме того, окислена связь Ca-Cß в боковой цепи Туг67.

Основываясь на этих данных, мы предложили механизм фотоактивации PAmCherryl, согласно которому хромофор PAmCherryl в возбужденном состоянии выступает в роли акцептора электрона от карбоксильной группы Glu215, в результате чего высвобождается молекула С02 по механизму радикальной реакции Кольбе (van Thor et al., 2002). Декарбоксилирование Glu215 приводит к окислению связи Ca-Cß в боковой цепи Туг67, в результате чего образуется хромофор, флуоресцирующий в красной области спектра.

4. Фотоактнвнруемый красный флуоресцентный белок PATagRFP.

Микроскопия сверхвысокого разрешения траекторий единичных частиц (sptPALM) создает перспективу получения информации о пространственной и временной гетерогенности внутриклеточного движения индивидуальных белковых молекул. Особый интерес могут представлять эксперименты по двухцветовой sptPALM для слежения за траекторией перемещения в клетке двух белков. Для реализации возможности sptPALM требуется создание соответствующих PAFP. Существенным недостатком PAFP PAmCherry (описание свойств которых дано в

предыдущем разделе) для реализации микроскопии сверхвысокого разрешения sptPALM является низкая фотостабильность этих белков. Поэтому был разработан вариант мономерного перманентно флуоресцирующего красного белка TagRFP, содержащий 12 аминокислотных замен: R69S, F84W, Q139K, А147Р, N148S, М151К, Y153K, S165V, H203R, R207I, V218W и C229S, названный PATagRFP.

4.1. Физико-химические характеристики PATagRFP.

До фотоактивации PATagRFP не флуоресцирует в видимом диапазоне. Облучение PATagRFP светом с длиной волны 405 нм приводит к необратимой фотоактивации белка в состояние, флуоресцирующее в красной области спектра с максимумом при 595 нм. Спектр возбуждения флуоресценции имеет максимум при 562 нм и совпадает со спектром поглощения (Рис. 7А). Молярный коэффициент поглощения и квантовый выход флуоресценции PATagRFP равен соответственно 66000 М"'см"' и 0,38, что свидетельствует о большей в 3 раза яркости, по сравнению с PAmCherryl. Фотоактивационный контраст для очищенного PATagRFP составлял -540. Флуоресценция PATagRFP имела более высокую pH-стабильность, по сравнению с PAmCheriyl, со значением рК3 равным 5,3 (Рис. 7Б). Высокая рН-

s § ,

I ь I 3 J <oJ

is:

■St

-Aös OFF

......AbsON

-----Ex ON

---Em ON .

300 400 500 600 700

Длина волны, нм

к"

5 s

0) S

0.3- 12

ш я

С S

££ го 2 0

I PATagRFP PAmCherryl PAGFP

Инт. света при активации, мВт/см2

Время выжигания, с

Инт. света при выжигании, мВт/см2

Рис. 7. Свойства очищенного PATagRFP. (А) Спектр поглощения до фотоактивации (сплошная линия) и спектры поглощения (линия из точек), возбуждения флуоресценции (линия из тире-точек) и эмиссии (штриховая линия) после. (Б) рН-зависимость для флуоресценции PATagRFP (кружки), контрольного РАшСЬеггу1 (треугольники) и TagRFP предшественника (ромбы). (В) Кинетика фотоактивации для РАТа§КРР (сплошная линия), РАшСИеггу! (штриховая линия) и РАвРР (линия из точек). (Г) Полувремена фотоактивации для PATagRFP (сплошные колонки), РАтСЬеггу1 (заштрихованные колонки) и РАОРР (незакрашенные колонки) при различных интенсивностях света. (Д) Кинетика фотовыцветания для PATagRFP (сплошная линия), РАтСЬеггу1 (пунктирная линия) и Та§ЯРР (линия из точек). (Е) Полувремена фотовыцветания для PATagRFP (сплошные колонки), РАтС)1егту1 (заштрихованные колонки) и TagRFP (незакрашенные колонки) при различных интенсивностях света.

стабильность делает РАТа§КРР полезным для использования в компартментах клетки с низким рН.

Было показано, что как скорость фотоактивации, так и скорость фотовыцветания флуоресцентной формы PATagRFP зависит от интенсивности облучающего света. При высоких интенсивностях облучения РАТа§ЯРР имел более медленную кинетику фотоактивации и фотовыцветания по сравнению с контрольными белками (рис. 7В-Е). При уменьшении интенстивности света эта разница нивелировалась.

Максимальные значения эффективности фотоактивации для РАТа§ЯРР, РАшСЬеггу1 и РАйРР наблюдаются при длинах волн соответственно 400-420±10 нм, 400±10 нм и 380-400±10 нм (Рис. 8А), т.е. при длинах волн, отвечающих максимуму спектра поглощения (405 нм) для РАтСЬегту1 в темном состоянии и максимуму спектра поглощения (412 нм), приписываемому промежуточному соединению, возникающему в процессе фотоактивации РАТаёЯРР (Рис. 8Б). Эффективность

Рис. 8. Характеристики фотоактивации PATagRFP при 25°С. (А) Максимальная флуоресценция РАЧ^ИРР (сплошные колонки), и контрольных РАтСЬеггу1 (заштрихованные колонки) и РАОРР (незакрашенные колонки), достигаемая при различных длинах волн света активации. (Б) Изменения поглощения PATagRFP в течение фотоактивации с помощью 405/15 нм. Вставка показывает поглощение образца PATagRFP (27 мг/мл) в начале (сплошная линия) и после 60 мин (пунктирная линия) фотоактивации. (В) Спектральная зависимость максимальной флуоресценции (сплошные колонки) по сравнению с максимальной скоростью фотоактивации (заштрихованные колонки) для PATagRFP. (Г) Временная зависимость синей (пунктирная линия) и красной (сплошная линия) форм PATagRFP во время фотоактивации с помощью света либо 350/50 нм, либо 390/40 нм. (Д) Временная зависимость синей (пунктирная линия) и красной (сплошная линия) форм PATagRFP, которая была предактивирована в течение 1 мин светом 350/50 нм, в темноте. Вставка показывает временную зависимость форм сходно предактивированного PATagRFP, но во время его облучения с помощью света 390/40 нм. (Е) Зависимость максимальной скорости фотоактивации от мощности света 350/50 нм.

фотоактивации PATagRFP, PAmCherryl и PAGFP значительно уменьшается с увеличением длины света фотоактивации, превышающей 420 нм (Рис. 8А). Например, эффективность фотоактивации PATagRFP голубым светом с длиной волны 480±10 нм в 3,5 раза меньше по сравнению с PAmCherryl, что может быть использовано для двухцветовой фотоактивации PATagRFP совместно с PAGFP, флуоресценция которого возбуждается в фотоактивированом состоянии на 488 нм.

Установлено, что PATagRFP имеет сложную кинетику фотоактивации, которая сопровождается образованием на начальных этапах темного состояния с максимумом спектра поглощения при длине волны 351 нм и последующим формированием интермедиата с максимумом спектра поглощения при длине волны 412 нм, который затем переходит в флуоресцентное состояние с максимуом спектров поглощения/флуоресценции при 562/592 нм. Динамика этих процессов зависит от длины волны света, используемого для фотоактивации. Так, образование интермедиата с максимумом спектра поглощения при 412 нм в 5 раз эффективнее при облучении светом с длиной волны 350/50 нм, в то же время образование красной флуоресцентной формы из этого промежуточного состояния происходит быстрее при облучении светом с длиной волны 390/40 нм (рис. 8).

Мы заключили, что фотоактивация PATagRFP является двухстадийным процессом, включающим однофотонное поглощение двумя различными формами хромофора.

4.2. Использование PATagRFP в микроскопии траекторий единичных частиц sptPALM.

Перспективы использования PATagRFP для изучения траекторий движения отдельных белков изучали с использованием химерных конструкций PATagRFP с белком VSVG и эпидермальным фактором роста (EGF). Живые клетки линии COS-7, экспрессирующие химеры, фотографировали в режиме PALM при низких уровнях возбуждения (561 нм) и фотоактивации (405 нм). Молекулы PATagRFP при сравнимом пространственном разрешении с контрольными химерными конструкциями PAmCherry 1 имели большую в 1,3 раза фотостабильность, большую длительность флуоресценции и в 1,5 раза больший квантовый выход (Рис. 7Е).

В двухцветных экспериментах sptPALM использовали белки слияния PATagRFP-EGFR (рецептор EGF) и VSVGts045-PAGFP. PALM изображения живых клеток показали точечное распределение обеих конструкций на плазматической мембране (Рис. 9А, Г). Совмещение изображений свидетельствует о частичной колокализации молекул VSVG и EGFR в пределах одних и тех же точечных областей (Рис. 9Ж), но основная часть кластеров содержала лишь одну химерную конструкцию. Анализ траекторий белков слияния PATagRFP-EGFR (Рис. 9Д, Е) и VSVGts045-PAGFP (Рис. 9Б, В) показал, что даже в областях кажущейся колокализации молекул их траектории не перекрывались во времени (Рис 93, И). Мы заключили, что EGFR и VSVG локализуются и движутся в пределах разных мембранных доменов.

Белок PATagRFP найдёт широкое применение в таких sptPALM приложениях, как слежение за перемещением двух различных типов молекул в клетке, мониторинг единичных молекул дикого типа и мутантных молекул или слежение за молекулами в различных доменах клетки.

5. Обратимо фотонереключаемый флуоресцентный белок rsTagRFP.

X ось, мкм х ось, мкм

Рис. 9. Двухцветовая sptPALM микроскопия в живых клетках COS-7 при 37°С. Изображения (А-В) VSVG-PAGFP и (Г-Е) EGFR-PATagRFP в режиме TIRF получены со скоростью 9,4 кадров/с. PALM изображения (A) VSVG-PAGFP (зеленые) и (Г) EGFR-PATagRFP (красные) наложены друг на друга (Ж). Стрелки показывают области колокализации между молекулами VSVG и EGFR. Масштабный отрезок равен 2 мкм. Изображены траектории молекул (Б) VSVG-PAGFP и (Д) EGFR-PATagRFP с продолжительностью более, чем 0,7 с, причем каждая траектория предсталена различным цветом. Коэффициенты диффузии изображены для молекул VSVG-PAGFP (В) и EGFR-PATagRFP (Е) в начале траекторий и цвет закодирован согласно цветовым картам справа. (3) VSVG-PAGFP (зеленые) и EGFR-PATagRFP (красные) траектории наложены друг на друга. (И) Увеличенная область, отмеченная квадратом на 3.

Новым эффективным подходом изучения взаимодействия двух белков в клетке является фотохромный безызлучательно-резонансный перенос энергии pcFRET. В этом методе флуресценция донора модулируется обратимыми изменениями спектра поглощения фотохромного акцептора. Преимущество pcFRET над другими способами измерения FRET заключается в том, что он обеспечивает точное и

VSVG-PAGFP

5 25 х 5

S 20

о о

>Ч 15

10 15 20 25 30

X ось, мкм

EGFR-PATagRFP

10 15 20 25 30

X ось, мкм

10 15 20 25 30

х ось, мкм

' ■ » «

19 .j , '

повторяемое определение FRET эффективности для одной и той же пары донор-акцептор в одной и той же клетке. Из-за отсутствия мономерного обратимо переключаемого FP с разными спектрами поглощения в ON и OFF состояниях, который мог бы выступать в качестве акцептора, pcFRET был реализован только при использовании в качестве акцептора фотопереключаемых химических красителей (Мао et al., 2008). Мы провели один раунд направленного и несколько раундов случайного мутагенеза TagRFP, чтобы создать обратимо переключаемый красный FP, названный rsTagRFP, содержащий следующие мутации в исходной последовательности TagRFP: F84W, 1125L, N148A, S165G, F181L, K189N и Y200F.

5.1. Физико-химические свойства очищенного rsTagRFP.

Облучение rsTagRFP светом с длиной волны -445 нм переключает белок в ОК состояние, в котором его спектры поглощения и флуоресценции имеют максимум при длинах волн 567 и 585 нм, интенсивность красной флуоресценции возрастает при этом в 20 раз (Рис. 10А). Молярный коэффициент экстинкции rsTagRFP в ON состоянии в максимуме спектра поглощения (567 нм), измеренный при рН 7,5, равен 36800 М"'см"', а квантовый выход флуоресценции составляет 0,11. Облучение светом с длиной волны -570 нм переключает rsTagRFP в ОРР состояние со спектром поглощения, имеющим максимум при 440 нм. Большая часть вновь синтезированных

0.0 0.5 1.0 1.5 2.34 2.40 2.46

Время, с

0 2 0 4 0 6 0 8 1 0 1 2

Мощность, мВт/см2

0.1 02 03 0.4

Мощность, мВт/см2

Рис. 10. Свойства rsTagRFP. (А) Спектр поглощения после облучения светом 570/30 нм (ОРР состояние; сплошная линия), спектры возбуждения (пунктирная линия) и эмиссии (линия из точек) после облучения светом 445/25 нм (01^1 состояние). (Б) Начальные скорости переключения в ОЫ и ОРР состояния, достигаемые при различных длинах волн. (В) Кинетика релаксации из ОРР и ON состояний в темноте. Белок после очистки (в начальном состоянии) был переключен в ОБР состояние светом 570/30 нм. После того, как белок достиг основного состояния в темноте, он был переключен в ОЫ состояние светом 445/25 нм. Поглощение в ОК состоянии нормировано на 100%. (Г) Временная зависимость флуоресценции во время переключения в ОРР и ОК состояния светом 570/5 (4,9 мВт/см2) и 440/5 нм (0,3 мВт/см2). Зависимость начальных скоростей переключения в ОРР (Д) и ON (Е) состояния от интенсивности света соответственно 570/30 и 436/20 нм.

молекул rsTagRFP (~97%) находится в ON состоянии (Рис. 10В). После одного OFF-ON цикла переключения устанавливается равновесие, в котором около одной трети молекул rsTagRFP находится в ON состоянии при комнатной температуре. Скорость фотопереключения rsTagRFP в OFF и ON состояние зависит от используемой длины волн (Рис. 10Б, Г).

Время созревания rsTagRFP составляло 43 мин при 37°С, что в 1,5 раза меньше времени созревания TagRFP. Форма спектра поглощения rsTagRFP зависит от рН среды: при физиологических рН (7,0-8,0) наблюдается полоса поглощения с максимумом при 567 нм, а при рН 4,0-5,0 доминирует полоса поглощения с максимумом при 440 нм. Вероятно, эти полосы поглощения соответствуют анионной (567 нм) и нейтральной (440 нм) формам фенольной гидроксильной группы красного хромофора (Yampolsky et al., 2008). Флуоресцентный контраст фотопереключения rsTagRFP уменьшался при закислении. Этот эффект может быть использован для измерения внутриклеточного рН.

5.2. Свойства rsTagRFP в фотохромном FRET.

Мы изучили свойства rsTagRFP в качестве акцептора pcFRET в химерной конструкции rsTagRFP-EYFP. EYFP был выбран в качестве донора из-за значительного перекрывания между эмиссией EYFP и поглощением rsTagRFP в ON состоянии и незначительного воздействия света возбуждения EYFP на rsTagRFP. Как и предполагалось, при переключении rsTagRFP в ON и OFF состояние светом с длиной волны 436/20 нм и 570/30 нм создаются и нарушаются условия для FRET между EYFP и rsTagRFP, при этом наблюдаются многократные циклы модуляции флуоресценции EYFP. Обратимое тушение флуоресценции EYFP составляло около 20%. Протеазное расщепление химерного белка EYFP-rsTagRFP сопровождалось исчезновением модуляции флуоресценции EYFP при фотопереключении rsTagRFP, что подтверждает обусловленность эффекта модуляции флуоресценции EYFP существованием pcFRET.

5.3. Применение rsTagRFP в pcFRET в живых клетках.

Мы использовали донорно-акцепторную пару rsTagRFP и EYFP при изучении с использованием pcFRET взаимодействия между EGFR и адапторным белком Grb2, которое индуцируется в клетках млекопитающих EGF и происходит на плазматической мембране и в эндосомах (Sorkin et al., 2000; Yamazaki et al., 2002).

Мы экспрессировали белки слияния EGFR-EYFP и Grb2-rsTagRFP в клетках линии HeLa. Внутриклеточное распределение химерных конструкций в покоящихся клетках было различным. Как и ожидалось, молекулы EGFR-EYFP были в основном локализованы на плазматической мембране, тогда как молекулы Grb2-rsTagRFP были равномерно распределены по всей клетке с несколько более высоким уровнем локализации в ядрах (Рис. 11 А). Введение в среду EGF (100 нг/мл) приводило к быстрому накоплению Grb2-rsTagRFP на плазматической мембране с последующей аккумуляцией и колокализацией обеих конструкций в эндосомах. Как и ожидалось, фотопереключение Grb2-rsTagRFP не влияло на эмиссию EGFR-EYFP в отсутствие EGF (Рис. 11Б-Г). Это подтверждает предположение об отсутствии взаимодействия между EGFR и Grb2 в нестимулированных EGF клетках. После введения EGF фотопереключение Grb2-rsTagRFP приводило к значительной и обратимой модуляции интенсивности флуоресценции EGFR-EYFP (на -20%) как на плазматической мембране, так и в эндосомах, что свидетельствует о взаимодействи

Евт и ОгЬ2 в этих компартментах клетки (Рис. 11 Б). Существование колокализации ЕОРЯ и вгЬ2 в клетках НеЬа после их стимуляции ЕйР было подтверждено нами с помощью РЫМ микроскопии.

Белок гзТа§ЯРР, по сравнению с геСИеггуНеу, имеет существенно более высокую яркость и более высокий контраст, который не зависит от числа циклов

О. Ш

EGFR-EYFP Grb2-rsTagRFP

лЛ Ф

<л ЛйГ- щw— 1 ■р

V 1Щ* « а* - . Ч » Шш

+ EGF -2 мин I 2 мин

к то

X X

ГО

С1 S

га 5 о. о X

1201

h 100

ф а.

S LL. X >-

® ш

ф "6"

+ EGF

■ EGFR-EYFP

Grb2-rsTagRFP

2 4 6 8 10 12

Циклы переключения

+ EGF

-5 О

4 мин 10 мин

5 10 15 20 25 30 35

Время, мин 15 мин 30 мин

On . \ n X \ т.- v

к2я ..J

Off 1 /J га

ея

1500

Рис. 11. Взаимодействие между EGFR-EYFP и Grb2-rsTagRFP в живых клетках HeLa, визуализированное с помощью pcFRET. (А) Изображения клеток в наборе фильтров YFP (слева) и ТХ2 (справа) в одном и том же поле зрения до и, в различные моменты времени, после добавления EGF. (Б) Модуляция суммарных красных (красная линия) и желтых (оранжевая линия) интенсивностей флуоресценции в клетках во время ON-OFF циклов переключения Grb2-rsTagRFP акцептора. (В, Г) Изменения флуоресценции EGFR-EYFP в ответ на переключение Grb2-rsTagRFP. (В) График показывает относительное увеличение флуоресценции EGFR-EYFP при переключении Grb2-rsTagRFP в OFF состояние в различные моменты времени до и после стимуляции EGF. (Г) Изображения флуоресценции EGFR-EYFP в псевдоцвете (верхний ряд: Grb2-rsTagRFP - ON; нижний ряд: Grb2-rsTagRFP -OFF) в различные моменты времени до и после стимуляции EGF.

переключения. Более того, фотоконверсия rsTagRFP сопровождается резкими и значительными изменениями спектра поглощения, которые позволяют использовать его в pcFRET. Пара rsTagRFP-EYFP имеет большие перспективы использования в pcFRET микроскопии для изучения внутриклеточных белковых взаимодействий. Красный фотопереключаемый белок rsTagRFP может также применяться для слежения за транспортом меченых белков между различными органеллами в одной клетке при возбуждении светом низкой интенсивности. Более того, совместное использование rsTagRFP и зелёного обратимо переключаемого белка Dronpa (Ando et al., 2004), позволит изучать транспорт одновременно двух белков в одной клетке.

6. Мономерный дальне-красный флуоресцентный белок TagRFP657.

Существует несколько причин, которые определяют необходимость создания дальне-красных FP со спектром возбуждения, имеющим максимум при длине волны больше 600 нм, и спектром флуоресценции с максимумом при длине волны больше 650 нм. Такие белки необходимы для получения изображений живых тканей в спектральной области, где поглощение гемоглобина и меланина незначительно, для использования совместно с ближне-красными или оранжевыми FP в многоцветовой микроскопии, а также в связи с тем, что современные проточные цитофлуориметры и лазерные конфокальные микроскопы укомплектованы стандартными красными

А Б

ti 100 Ех 611 нм Л /\Ет 657нм Ч 100

а) / \ 0

X 75 \ I 75

о \ 0

- 50 \ г 50

Ц \ Ц

-8- 25 \ 25

г 0 " I --- 0

— TagRFP657 .... mKale2

500 600 700 800

Длина волны, нм

и 1200

X 900

о 600

с 300

■е-

к 150

S 0

I— □ TagRFP657

Я- ¡® mKate2

| |

5 6 14 5 47 1

Мощность света, мВт/см2

100 200 300

Время созревания, мин

480 500 520 540 560

Длина волны, нм

Рис. 12. Свойства TagRFP657. (А) Спектры возбуждения (линия из точек) и эмиссии (сплошная линия). (Б) рН зависимость для флуоресценции TagRFP657 (квадраты) и тК.а1е2 (треугольники). (В) Кинетика фотовыцветания для TagRFP657 (сплошная линия) и тКа1е2 (линия из точек). (Г) Полувремена фотовыцветания для TagRFP657 (незакрашенные колонки) и тКа1е2 (сплошные колонки) при различных интенсивностях света. (Д) Кинетика созревания TagRFP657 (сплошная линия) и тКа1е2 (линия из точек). (Е) Остаточная зелёная флуоресценция TagRFP657 (сплошная линия), шКа!е2 (линия из точек) и шИерШие (штриховая линия).

лазерами с длинои волны излучения 633-640 нм. В коммерческом оптическом микроскопе сверхвысокого разрешения ансамбля молекул БТЕО, позволяющем получать изображения с разрешением в 70 нм, используется лазер с длиной волны 635-640 нм.

К моменту начала работы над диссертацией в литературе существовало описание

мономерных дальне-красных РР с максимумами спектров возбуждения и флуоресценции при длинах волн, меньших соответственно 600 и 650 нм, и дальне-красных РР со спектрами возбуждения и флуоресценции, с максимумами при длинах волн, несколько больших, чем соответственно 600 и 650 нм, которые являются либо димерами, либо тетрамерами и поэтому непригодны для создания белков слияния. Мы

использовали направленный и случайный мутагенез гена мономерного РР тКа1е (ЗЬсЬегЬо ег а1., 2007), имеющего максимумы спектров возбуждения и флуоресценции соответственно при 588 и 635 нм, для создания мономерного дальне-красного белка,

названного Та£ЯРР657. Этот белок имеет 10

аминокислотных замен по сравнению с исходным тКа1е: К9Т, М44С>, К69Н, Р84\У, 8148Н, 8165Т, 0166А, М167Ц Ы 81Р и Я203У.

6.1. Физико-химические

характеристики очищенного Та£ЯРР657.

Очищенный Та£НРР657

Юмкм

0 по1 юг ю3 ю4 TurboRFP-mito (зеленый) Ех. 638 нм Em. 660/20 нм H2B-TagRFP657

В Confocal^. I р STED

1 МКМ [J

FWHM = 228 нм

Расстояние, мкм

00 0-2 04 Об оа 1 i

Расстояние, мкм

Рис. 13. PagRFP657 в клетках HeLa. (А) Разделение суспензии клеток, экспрессирующих TagRFP657, mKate или TagRFP, на проточном цитофлуориметре. (Б) Со-экспрессия белков слияния TagRFP657 с гистоном Н2В (H2B-TagRFP657) и Turbo RFP с митохондриальным сигналом (TurboRFP-mito). Цвета на А и Б являются псевдоцветами. Изображения ЕВЗ-TagRFP657, получены с использованием конфокальной (В) или STED (Г) микроскопии. (Д, Е) Увеличенная область, отмеченная квадратами на В и Г. Белыми стрелками указаны детали, разрешимые на STPD. Профили интенсивностей (Ж, 3) получены для участков на Д и Е. Полуширина профилей отмечена красными стрелками.

имеет существенно сдвинутые в дальне-красную область спектры по сравнению с mKate: спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции имеют максимумы при соответственно 611 и 657 им (Рис. 12А). Молярный коэффициент экстинкции в максимуме спектра поглощения равен 34000 М"'см"', квантовый выход - 0,10. Мы сравнили свойства TagRFP657 с улучшенным вариантом mKate2 (Shcherbo et al., 2009), сведения о созданини которого появились во время работы по созданию TagRFP657. Белок TagRFP657 имеет по сравнению с mKate2 более высокую pH стабильность (Рис. 12Б) и примерно в 2 раза большую фотостабильность (Рис. 12В, Г). Созревание хромофора TagRFP657 (125 мин) происходит медленнее по сравнению с mKate2 (Рис. 12Д). При этом, однако, формирование хромофора TagRFP657 было более полным, по сравнению с mKate2 и его мутантой формой, получившей название mNeptune (Lin et al., 2009): в случае TagRFP657 практически отсутствует остаточная зелёная флуоресценция (Рис. 12Е). Показано, что TagRFP657 в растворе и в составе белков слияния в клетках млекопитающих является мономером.

6.2. TagRFP657 в многоцветовых цитофлуорометрии и микроскопии.

Дальнее-красное положение спектров возбуждения флуоресценции и флуоресценции TagRFP657 не позволяет регистрировать флуоресценцию этого белка с использованием стандартых наборов фильтров для красных FP. Для оценки возможности практического использования FP TagRFP657 мы регистрировали флуоресценцию при длинах волн больше 650 им и возбуждении при 633 нм с использованием стандартного гелий-неонового лазера. Даже при возбуждении светом с длиной волны 633 нм, при которой оптическая плотность составляет 50% от оптической плотности в максимуме спектра, интенсивность флуоресценции TagRFP657 была в 7 раз больше, чем у mKate, и 2,5 раза больше по сравнению с mKate2.

Нами было показано, что дальне-красный TagRFP можно использовать совместно с красными или ближнее-красными FP как в проточной цитофлуориметрии, так и в флуоресцентной микроскопии с использованием стандартных фильтров (Рис. 13А, Б).

6.3. TagRFP657 в микроскопии сверхвысокого разрешения STED.

Дальне-красный FP TagRFP657 является единственным мономерным FP, который может использоваться при работе с TSC STED микроскопом (Leica), в котором для возбуждения флуоресценции используется лазер с излучением при 638 нм и лазер с излучением при 750 нм для дезактивации возбуждённого состояния. Возможность получения изображений сверхвысокого разрешения с использованием TagRFP657 была продемонстрирована нами для ряда белков слияния, в частности для белка ЕВЗ, связывающегося с микротрубочками. Были получены изображения ЕВЗ-TagRFP657 в клетках линии HeLa в стандартном конфокальном (Рис. 13В, Д) и STED (Рис. 13Г, Е) режимах. STED изображения имели в 3 раза лучшее разрешение (Рис. 133), по сравнению с изображениями, полученными в обычном для конфокального микроскопа режиме (Рис. 13Ж). Размер полученного с использованием TagRFP657 изображения (full width at half of maximum, FWHM) составил 74 нм, что практически соответствует пределу инструментального разрешения данной модели STED микроскопа.

6.4. Неинвазивная визуализация опухоли с помощью TagRFP657.

Использование дальне-красных FP существенно для получения флуоресцентных изображений тканей и организмов. Мы создали три линии клеток аденокарциномы молочной железы крысы МТЬпЗ, стабильно экспрессирующие один из следующих белков: циановый Cerulean (Rizzo et al., 2004), зелёный EGFP или TagRFP657. Смесь полученных флуоресцентных клеток была трансплантирована в молочную железу SCID (severe combined immunodeficency) мышей. Через четыре недели клетки сформировали раковую опухоль размером в несколько миллиметров. Опухоль четко визулизировалась в дальне-красной области спектра, но совершенно не детектировалась в синем и зелёном каналах. Таким образом, TagRFP657 может успешно применяться для неинвазивной визуализация тканей в живых организмах.

7. Белки с большим стоксовым сдвигом LSSmKatel и LSSmKate2.

В настоящее время одним из наиболее перспективных подходов, позволяющих получать высококачественное изображение живых тканей на глубине вплоть до 1 мм, является двухфотонная микроскопия (Zipfel et al., 2003). Суть двухфотонной микроскопии состоит в том, что возбуждение флуоресценции происходит с использованием инфракрасного лазера большой интенсивности, что приводит к поглощению флуорофором двух фотонов с длиной волны, в два раза превышающей длину волны обычного однофотонного возбуждения. Однако красные FP не могут быть эффективно возбуждены коммерчески доступным инфракрасным титан-сапфировым лазером, так как спектры их двухфотонного поглощения сдвинуты в более длинноволновую область относительно рабочего диапазона длин волн излучения титан-сапфирового лазера (Drobizhev et al., 2009). Решением данной проблемы могла бы быть разработка красного FP, спектр возбуждения которого смещен в коротковолновую область, или, другими словами, красного FP с большим стоксовым сдвигом (large Stokes shift, LSS). Одновременное использование такого красного белка с зеленым и синим FP открывает перспективы для параллельного изучения нескольких клеточных процессов методом многоцветовой двухфотонной микроскопии при возбуждении флуоресценции одной длиной волны. Понимание механизма большого стоксового сдвига в GFP-подобных белках может помочь при рациональном дизайне красных FP с большим стоксовым сдвигом на основе существующих стандартных FP.

На основе mKate в результате нескольких раундов молекулярной эволюции были созданы мутантные красные FP с большим стоксовым сдвигом, содержащие замены K69Y, Р131Т, S148G, М167Е, T183S, M196V и K69Y, Р131Т, S148G, M167D, T183S, M196V, которые назвали соответственно LSSmKatel и LSSmKate2.

7.1. Физико-химические характеристики LSSmKatel и LSSmKate2.

Основные характеристики белков LSSmKatel, LSSmKate2 и контрольного mKeima - единственного красного FP с большим стоксовым сдвигом (180 нм) приведены на Рис. 14. В отличие от mKeima, белки LSSmKate не имеют дополнительного спектра возбуждения с максимумом в районе 580 нм (Рис. 14А). Спектры двухфотонного возбуждения для вариантов LSSmKate, ECFP (Tsien, 1998) и EGFP, измеренные в пределах от 760 до 1000 нм, показали существенное перекрывание. Значение эффективности поглощения в максимуме спектра двухфотонного возбуждения а2?в для LSSmKatel было в 1,6 раза ниже, а для

100

Q) 80

н о 60

с 40

-8- 20

X 0

Ч 100

а>

о 60

d 40

■е-

ь 20

Z S 0 I

— LSS-mKata1 . -. LSS-mKat«2 4

400 500 600 700

Длина волны, нм

■fr 20 к

z о S

— LSS-mKale1

— LSS-mKate2 • ■ -mKeima

■9" 20

."->LSS-mKate1 i -A-LSS-mKata2 ■ □•mKeima

0 300 600 900 1200 5

Время созревания, мин

— LSS-mKate1 ™LSS-mKate2

• • • mKeima /

— EGFP /

— ECFP /

) 50 100 150 200

Время выжигания, с

600 850 900 950 1000

Длина волны,нм

tjioo а . 80 X

о 60

q 40

*20 Ь

£ О

—LSS-mKata1 ---LSS-mKata2 • -•mKeima

) 50 100 150 200

Время выжигания, с

Рис. 14. Свойства LSSmKatel (сплошная линия), LSSmKate2 (пунктирная линия) и mKeima (точечная линия). (А) Спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции. (Б) Кривые кинетики созревания. (В) рН зависимость интенсивности флуоресценции. (Г) Кривые фотообесцвечивания для LSS-mKates, mKeima и EGFP (линия точка-тире). (Д) Двухфотонньге спектры возбуждения для LSSmKatel, LSSmKate2, mKeima, EGFP и ECFP (линия две точки-тире). (Е) Кривые фотообесцвечивания при 2Р-возбуждении на 870 нм.

LSSmKate2 в 1,4 раза выше соответствующего значения для mKeima (Рис. 14Д). Величина фотостабильности при двухфотонном возбуждении для LSSmKatel была такой же, как для mKeima, а значение двухфотонной фотостабильности для LSSmKate2 было в 1,4 раза выше, чем для mKeima (Рис. 14Е). Белки LSSmKate, в отличие от белков mKeima, не склонны к димеризации.

7.2. Механизм большого стоксового сдвига в белках LSSmKate.

Большой стоксов сдвиг в белках LSSmKate может быть объяснен переносом протона в возбужденном состоянии. Данное явление было ранее исследованно на вариантах GFP, обладающих большим стоксовым сдвигом. Чтобы доказать данное предположение, а также установить аминокислотные остатки, участвующие в переносе протона, была определена пространственная структура белков LSSmKate в кристаллическом состоянии и исследована зависимость спектральных характеристик этих белков от рН, температуры, H/D изотопного состава растворителя, проведен мутагенез ключевых аминокислотных остатков, вовлеченных в перенос протона.

Рентгеноструктурные данные свидетельствуют о том, что трипептид Met63-Tyr64-Gly65 формирует DsRed-подобный хромофор в i/wc-копфигурации в LSSmKatel и в тиране-конфигурации в LSSmKate2.

Детальный анализ третичных структур белков LSSmKate позволил определить два возможных пути переноса протона. В случае LSSmKatel гидроксильная группа тирозина цис-хромофора формирует водородную связь с карбоксильной группой боковой цепи Glul67, которая в свою очередь образует водородные связи с Serl65 и молекулой воды (Рис. 15А). В структуре LSSmKate2 фенольная группа транс-

хромофора образует

непосредственную водородную связь с Serl65, который связан водородной связью с карбоксильной группой Asp 167 и молекулой воды (Рис. 15Б).

В отличие от других FP с большим стоксовым сдвигом, спектры

поглощения белков

LSSmKate, измеренные при 25°С при значениях рН от 3 до 11, практически не изменялись. При значении рН 11 появлялся новый пик поглощения, смещенный в красную область спектра с максимумом 579 нм, который был обозначен как пик В. Возбуждение пика В приводило к красной флуоресценции с

максимумом при 628 нм, который совпадал для обоих белков LSSmKate. Спектры флуоресценции белков LSSmKate демонстрировали сильную зависимость от температуры и изотопного состава растворителя:

смещение максимумов флуоресценции в

коротковолновую область спектра при низких температурах и увеличение коротковолнового плеча спектра флуоресценции при замещении протонов

дейтронами. Похожие

эффекты при замене водорода на дейтерий были описаны для mKeima и вариантов GFP, в которых реализуется механизм

переноса протона в возбужденном состоянии (Shi et al., 2007; Henderson et

Рис. 15. Структуры хромофоров LSSmKatel (А) и LSSmKate2 (Б) и их микроокружения с наложением на 2Р0-РС электронную плотность хромофоров. Водородные связи указаной в ангстремах. Стрелками указаны торсионные углы х1 и %2. Предлагаемые фотоциклы для LSSmKatel (В) и LSSmKate2 (Г) при нейтральном рН и 25°С. Возбужденное состояние нейтрального хромофора А*, образующееся при облучении светом с длиной волны -460 нм, превращается после ЕвРТ в возбужденное анионное состояние, обозначенное как I*. После эмиссии красной флуоресценции протон переносится от С1и167 ^85тКа1е1) или Авр167 ^88тКа1е2) к хромофору с образованием основного состояния нейтрального А хромофора.

al., 2009).

Замена Serl65 на Ala, Thr или Met приводит к существенному сдвигу максимума флуоресценции LSSmKate2, уменьшению рН-стабильности и квантового выхода LSSmKate2, но практически не влияет на спектральные свойства LSSmKatel. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что остаток Serl 65 вовлечен в цепь переноса протонов в LSSmKate2, но не участвует в реализации переноса протона в LSSmKatel. Ключевые стадии фотофизических и фотохимических процессов, происходящих в LSS-mKatel и LSSmKate2, приведены на рис (Рис. 15В, Г). В основном состоянии хромофора рА"а карбоксила Glu/Aspl67 ниже, чем рЛ"а гидроксильной группы тирозина хромофора, и хромофоры находятся в нейтральной форме, стабилизируемой карбоксил-анионом. В возбужденном состоянии происходит возрастание кислотности гидроксильной группы тирозина хромофора (рА"а может достигать значений 2-3), что позволяет ей выступать в качестве донора протона и протонировать карбоксильные группы Glu/Aspl67 (Wiehler et al., 2003).

7.3. Рациональный дизайн белков с большим стоксовым сдвигом.

Мы полагаем, что формирование путей переноса протона в возбужденном состоянии, аналогичных существующим в белках LSSmKatel, LSSmKate2 и mKeima, можно осуществить и в других оранжевых и красных FP с тирозин-содержащим хромофором путем введения Asp или Glu в микроокружение хромофора. Для проверки данной гипотезы было выбрано пять стандартных FP, таких как mNeptune (Lin et al., 2009), mCherry, mStrawberry, mOrange (Shaner et al., 2004) и mKO (Karasawa et al., 2004).

С использованием сайт-направленного мутагенеза были созданы две серии библиотек кДНК генов для каждого FP. В первом случае в 165 позицию были введены Asp или Glu, а позиция 167 подвергалась случайному мутагенезу. В другом случае замены позиции 165 были случайными, а в 167 позицию были введены Asp или Glu. В результате скрининга были найдены клоны, обладающие оранжевой или красной флуоресценцией при возбуждении в области длин волн 440-460 нм, т. е. обладающие большим стоксовым сдвигом. Гены, которые кодировали соответствующие белки, содержали одну или две аминокислотные замены в позициях 165 и (или) 167. Характер спектров возбуждения флуоресценции свидетельствует о том, у большинства мутантных белков хромофор был протонирован даже при нейтральных рН.

7.4. Использование белков LSSmKatel и LSSmKate2 для визуализации процессов, происходящих в живых клетках.

Для того, чтобы оценить перспективность использования белков LSSmKatel и LSSmKate2 для визуализации процессов, происходящих в живых клетках, были созданы белки слияния вариантов LSSmKate с р-актином, а-актинином, паксиллином, кератином, а-тубулином, гистоном Н2В и цитохром С оксидазой. Эти конструкции слияния хорошо встраивались в соответствующие эндогенные клеточные структуры. Это свидетельствует о том, что белки LSSmKate в клетках остаются мономерами, в отличие от mKeima, склонного к димеризации.

Яркость и фотостабильность белков LSSmKate позволяет проводить эксперименты по визуализации внутриклеточной динамики в течение длительных промежутков времени. Наблюдение митохондрий, меченных белками LSSmKate, в течение 40 мин с использованием эпифлуоресцентного микроскопа показало

Рис. 16. (А) Изображение клеток МТЬпЗ со стабильной экспрессией белков слияния сигнала ядерной локализации с Ь88тКа1е1 (красный), Р-1,4-галактозилтрансферазы с ЕСЕР (синий) и флуоресцеин-декстраном (кровеносные сосуды, зеленый) показывает пары ядро-аппарат Гольджи (желтые стрелки) выстроившиеся в линию по соседству с кровеносным сосудом опухоли. (Б) Диаграмма, демонстрирующая метод расчета угла оси ядро-комплекс Гольджи относительно оси, направленной перпендикулярно к кровеносному сосуду. Расстояния ядро-сосуд рассчитывали по линейным сегментам (пример показан на (А), линии обозначенные желтыми точками отмечены как 1, 2 и 3). (В) Анализ углов ориентации ядро-аппарат Гольджи-сосуд. Горизонтальная ось показывает расстояния от сосуда к ядру, вертикальная ось показывает количество пар ядро-аппарат Гольджи, характеризующихся малым (<90°, черные столбцы) или большим углом (>90°, серые столбцы), рассчитанным относительно ближайшего сегмента сосуда. Столбцы (Г) показывают отношение количества пар с малым углом (<90°) к количеству пар с большим углом (>90°) в пределах 0-40 мкм для 21 различных сегментов сосуда.

g в ядро

» комплекс Гольджи

клеточная мембрана

со 4"

кровеносный сосуд

■ <90 градусов >90 градусов

кш

40 80 120160200240280320360400 Расстояние до сосуда, мкм

Отношение: 0-90 градусов/90-180 градусов

III lll.llll.lllllll

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Сегмент сосуда

отсутствие заметного фотообесвечивания. Фотостабильность Ь88-тКа1е1 и Ь88-шКа1е2 в живых клетках линии НеЬа при высокой мощности возбуждающего света была в 3,6 и в 2 раза выше по сравнению с ЕСРР.

Для проверки возможности применения белков Ь88тКа1е в качестве дополнительного красного маркера вместе с существующими красными РР со стандартным стоксовым сдвигом конструкции белков слияния Ь88тКа1е и тКеша были одновременно экспрессированы вместе с конструкциями тСЬеггу, Та£ЯРР и тКЖе. Два набора фильтров позволили визуализировать оба белка Ь88шКа1е с белками тСЬеггу, Та§ЯРР или шКа1е без перекрывания сигналов между каналами. С другой стороны, использование света с длиной волны 570/30 для возбуждения красных РР со стандартным стоксовым сдвигом приводило также к возникновению заметной флуоресценции шКеша.

Клетки аденокарциномы молочной железы человека МОА-МВ-231 и крысы МТЬпЗ, стабильно экспрессирующие белки Ь88шКа1е, локализованные в цитоплазме либо в ядрах клеток, имели нормальную скорость пролиферации и подвижность в культуре. Это свидетельствует о низкой цитотоксичности РР. Уровень флуоресценции Ь88шКа1е в стабильных клеточных линиях не претерпевал заметных изменений в течение как минимум нескольких клеточных делений.

7.5. Многоцветовая двухфотонная микроскопия в живых мышах.

В клетках MTLn3 были со-экспрессироваиы 3 химерные конструкции с разными FP: LSSmKatel и LSSmKate2 - в ядрах, ECFP - в комплексе Гольджи и EGFP - в цитоплазме. Смесь полученных флуоресцентных клеток была трансплантирована в молочную железу SCID мышей. Кожа возле выросшей опухоли была заменена на оптическое стекло, что позволяло проводить двухфотонную микроскопию раковых клеток живой мыши в течение двух недель.

Анализ изображений показал, что LSSmKate белки локализованы в ядрах и присутствуют практически во всех клетках опухоли. Яркость LSSmKate2 in vivo оказалась в два раза выше яркости LSSmKatel, что соответствует соотношению яркостей данных белков in vitro. По мере проникновения вглубь ткани яркость ECFP и EGFP уменьшалась сильнее, чем яркость белков LSSmKate. На глубине 100 мкм флуоресценция ECFP и EGFP практически не детектировалась. Разрешение снимков опухоли позволяло определить положение каждой клетки и расположение в ней ядра, комплекса Гольджи и цитоплазмы. Это преимущество высокого разрешения было использовано для изучения движения индивидуальных раковых клеток и исследования взаимного расположения органелл клеток in vivo.

Имеются данные о том, что комплекс Гольджи находится впереди ядра во время миграции клеток, вызванной искусственным повреждением тканей (ранением) (Nobes et al., 1999). Было также установлено, что поляризация раковых клеток происходит в непосредственной близости к кровеносным сосудам (Wyckoff et al., 2000). Поэтому мы проанализировали взаимное расположение клеток относительно ближайшего кровеносного сосуда как функцию угла между вектором, соединяющим ядро и комплекс Гольджи, и вектором, направленным перпендикулярно кровеносному сосуду (Рис. 16А, Б). Результаты свидетельствуют о преимущественной поляризации MTLn3 клеток относительно кровеносного сосуда на расстоянии менее 40 мкм до него (рис. 16В, Г).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе разработаны новые мономерные флуоресцентные белки трёх различных групп: перманентно флуоресцентные белки, флуоресцентные белки-таймеры и фотоактивируемые флуоресцентные белки (Таблица 1).

Каждый белок был охарактеризован спектроскопически, фотохимически и биохимически. Основные представители групп белков были закристаллизованы, определены хиические структуры их хромофоров и предложены молекулярные механизмы поведения этих белков. Все созданные белки были исследованы в клетках млекопитающих, экспресированные свободно в цитоплазме и в качестве белков слияния. Основные представители групп были использованы для решения актуальных задач клеточной биологии. Более того, полученные белки были применены в новых методах оптической микроскопии, таких как FRET, pcFRET, 2Р, PALM и STED, многогоцветовой проточной цитофлуорометрии и флуоресцентной визуализации в животных.

фотохимические механизмы формирования и функционирования хромофоров позволят разработать стратегии дизайна следующего поколения генетически-кодируемых флуоресцентных зондов.

Таблица 1. Свойства флуоресцентных белков, созданных в данной работе.

Белок Ехша/, нм ЕттаД нм М'см"1 <ЗУГ Яркость" Дополнительный параметр

Перманентно флуоресцентные белки Время полусозревания,ч

тТайВРР 399 456 52 000 0,63 32 2,7 0,22

Ь88шКа1е1 463 624 31 200 0,08 2,5 3,2 1,7

Ь88тКа1е2 460 605 26 000 0,17 4,5 2,7 2,5

ТаеЯРР657 611 657 34 000 0,10 3.4 5,0 2,0

Флуоресцентные белки-таймеры Время перехода с, ч

ЭктП" 402 465 33 400 0,35 12 2,6 9,8

583 604 84 200 0,05 4 4,6 28

Ме<ЛитРТ 401 464 44 800 0,41 18 2,7 1.2

579 600 73 100 0,08 6 4,7 3,9

Раз1РТ 403 466 49 700 0,30 15 2,8 0,25

583 606 75 300 0,09 7 4,1 7.1

Фотоактивируемые флуоресцентные белки Свет переключения

РАтСЬеггу 1 564 595 18 000 0,46 8 6,3 фиолетовый

РАтСЬеггу2 570 596 24 000 0,53 13 6,2 фиолетовый

РАтСЬеггуЗ 570 596 21 000 0,24 5 6.2 фиолетовый

PATagRFP 562 595 66 000 0,38 25 5,3 фиолетовый

rsTagRFP 440 585 15 300 10"3 0,02 - оранжевый

567 585 36 800 0,11 4 6.6 синий

аМаксимум возбуждения флуоресценции; "Максимум эмиссии флуоресценции; "Коэффициент молярной экстинкции; 'Квантовый выход; лМолекулярная яркость флуоресцентного белка, определяемая как произведение квантового выхода на коэффициент молярной экстинкции, делённая на 1000; °Время достижения максимальной флуоресценции для синих форм и время, соответствующее формированию половины от максимальной флуоресценции, для красных форм.

выводы

1. Разработаны методы направленной молекулярной эволюции, которые в сочетании с высокоэффективным скринингом с использованием проточной цитофлуорометрии позволили создать мономерные флуоресцентные белки с улучшенными и принципиально новыми фотохимическими и фотофизическими свойствами на основе перманентно флуоресцирующих белков: фотоактивируемые флуоресцентные белки, флуоресцентные белки-таймеры и дальне-красные флуоресцентные белки.

2. Разработан рациональный молекулярный подход формирования путей переноса протона в возбужденном состоянии, позволяющий получать флуоресцентные белки, обладающие заданными спектральными характеристиками и большим стоксовым сдвигом.

3. Создан мономерный синий флуоресцентный белок mTagBFP, который обладает наибольшей яркостью в синем спектральном диапазоне по сравнению с существующими аналогами, и содержит хромофор, образованный имдазольным кольцом и N-ацилиминовой группой. Показано, что исключение фенольного кольца тирозинового остатка 64 из системы сопряженных л-связей приводит к формированию хромофора, флуоресцирующего в синей области спектра.

4. Установлено, что формирование DsRed-подобного хромофора в красных перманентно флуоресцирующих и фотоактивируемых белках осуществляется через стадию образования mTagBFP-подобного хромофора, флуоресцирующего в синей области спектра.

5. Созданы мономерные флуоресцентные белки-таймеры, позволяющие изучать пространственно-временные характеристики внутриклеточных процессов и возраст внутриклеточных белковых молекул.

6. Создан красный фотопереключаемый флуоресцентный белок, фотоконверсия которого сопровождается существенным, но обратимым изменением формы спектра поглощения. Показана возможность использования этого белка в качестве акцептора в новом методе фотохромного безызлучателыю-резонансного переноса энергии для изучения межбелковых взаимодействий в живых клетках.

7. Созданы мономерные фотоактивируемые красные флуоресцентные белки, являющиеся исключительно перспективными маркерами для селективного внутриклеточного мечения молекул в микроскопии сверхвысокого разрешения PALM.

8. Создан мономерный дальне-красный флуоресцентный белок, оптимизированный для использования со стандартными красными лазерными источниками света, применяемыми в проточной цитофлуорометрии, для неинвазивной визуализации клеток в живых организмах и в микроскопии сверхвысокого разрешения STED.

9. Созданы мономерные красные флуоресцентные белки с большим стоксовым сдвигом, позволяющие осуществлять визуализацию процессов в живых тканях с субклеточным разрешением в режиме реального времени.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Обзоры:

1. Петкевич К.Д., Ефременко Е.Н., Верхуша В.В. и Варфоломеев С.Д. Красные флуоресцентные белки и их свойства. Успехи химии 2010, 79: 273-290.

2. Piatkevich K.D. and Verkhusha V.V. Advances in engineering of fluorescent proteins and photoactivatable proteins with red emission. Curr. Opin. Chem. Biol. 2010, 14: 23-29.

3. Stepanenko O.V., Verkhusha V.V., Kuznetsova I.M., Uversky V.N. and Turoverov K.K. Fluorescent proteins as biomarkers and biosensors: throwing color lights on molecular and cellular processes. Curr. Protein Pept. Sci. 2008, 9: 338-369.

4. Степаненко O.B., Верхуша B.B., Кузнецова И.М. и Туроверов К.К. Флуоресцентные белки: физико-химические свойства и использование в клеточной биологии. Цитология 2007, 49: 395-420.

5. Lukyanov К.А., Chudakov D.M., Lukyanov S. and Verkhusha V.V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005, 6: 885-891.

6. Verkhusha V.V. and Lukyanov K.A. The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. Nat. Biotechnol. 2004, 22: 289296.

Главы в книгах:

7. Lyagin I., Gudkov D., Verkhusha V. and Efremenko E. Genetic construct encoding the biosynthesis of N-His6-e-pHluorins-OPH in E.coli cells. In book: Chemical and Biochemical Physics, Kinetics and Thermodynamics: New Perspectives. (Scott P.E., Zaikov G.E., and Kablov V.F., Eds.), 2008, 83-90. Nova Science Publishers, NY, ISBN 1-60456-024-X.

8. Verkhusha V.V., Matz M.V., Sakurai T. and Lukyanov K.A. GFP-like fluorescent proteins and chromoproteins of the class Anthozoa. In book: Protein Structures: Kaleidoscope of Structural Properties and Functions. (Uversky V.N., Ed.). 2003, 405439. Research Signpost Publishers, ISBN 81-7736-1775.

Статьи:

9. Piatkevich K.D., Malashkevich V.N., Almo S.C. and Verkhusha V.V. Engineering ESPT pathways based on structural analysis of LSSmKate red fluorescent proteins with large Stokes shift. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132: 10762-10770.

10. Morozova K.S., Piatkevich K.D., Gould T.G., Zhang J., Bewersdorf J. and Verkhusha V.V. Far-red fluorescent protein excitable with red lasers for flow cytometry and super-resolution STED nanoscopy. Biophys. J. 2010, 99: L13-L15.

11. Subach F.V., Zhang L„ Gadella T.W.J., Gurskaya N.G., Lukyanov K.A. and Verkhusha V.V. Red fluorescent protein with reversibly photoswitchable absorbance for photochromic FRET. Chem. Biol. 2010, 17: 745-755.

12. Subach F.M., Patterson G.H., Renz M., Lippincott-Schwartz J. and Verkhusha V.V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color superresolution sptPALM of live cells. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132: 6481-6491.

13. Subach O.M., Malashkevich V.N., Zencheck W.D., Morozova K.S., Piatkevich K.D., Almo S.C. and Verkhusha V.V. Structural characterization of acylimine-containing blue and red chromophores in mTagBFP and TagRFP fluorescent proteins. Chem. Biol. 2010, 17: 333-341.

14. Pletnev S., Subach F.V., Dauter Z., Wlodawer A. and Verkhusha V.V. Understanding blue-to-red conversion in monomeric fluorescent timers and hydrolytic degradation of their chromophores. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132: 2243-2253.

15. Piatkevich K.D., Hulit J., Subach O.M., Wu B., Abdulla A., Segall J.E. and Verkhusha V.V. Monomeric red fluorescent proteins with a large Stokes shift. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010, 107: 5369-5374.

16. Subach F.V., Malashkevich V.N., Zencheck W.D., Xiao H., Filonov G.S., Almo S.C. and Verkhusha V.V. Photoactivation mechanism of PAmCherry based on crystal structures of the protein in the dark and fluorescent states. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009, 106:21097-21102.

17. Pletnev S., Morozova K.S., Verkhusha V.V. and Dauter Z. Rotational order-disorder structure of fluorescent protein FP4B0. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2009, 65:906-912.

18. He J., Vora M., Haney R.M., Filonov G.S., Musselman C.A., Burd C.G., Kutateladze A.G., Verkhusha V.V., Stahelin R.V. and Kutateladze T.G. Membrane insertion of the FYVE domain is modulated by pH. Proteins 2009, 76: 852-860.

19. Bogdanov A., Mishin A., Yampolsky I., Belousov V., Chudakov D., Subach F., Verkhusha V.V., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. Green fluorescent proteins are light-induced electron donors. Nat. Chem. Biol. 2009, 5: 459-461.

20. Shcherbo D., Murphy C.S., Chepurnykh T.V., Shcheglov A.S., Verkhusha V.V., Pletnev V.Z., Hazelwood K.L., Lukyanov S., Davidson M.W. and Chudakov D.M. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem. J. 2009, 418: 567-574.

21. Telford W.G., Subach F.V. and Verkhusha V.V. Super-continuum white light lasers for flow cytometry. Cytometry 2009, 75A: 450-459.

22. Gould T.J., Verkhusha V.V. and Hess S.T. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nat. Protocols 2009, 4: 291308.

23. Subach F.V., Patterson G.H., Manley S., Gillette J.M., Lippincott-Schwartz J. and Verkhusha V.V. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat. Methods 2009, 6: 153-159.

24. Subach F.V., Subach O.M., Gundorov I.S., Morozova K.S., Piatkevich K.D., Cuervo A.M. and Verkhusha V.V. Monomeric fluorescent timers that change color from blue to red report on cellular trafficking. Nat. Chem. Biol. 2009, 5:118-126.

25. Gould T.J., Gunewardene M.S., Gudheti M.V., Verkhusha V.V., Yin S.R., Gosse J. A. and Hess S.T. Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropies. Nat. Methods 2008, 5: 1027-1030.

26. Kedrin D., Gligorijevic B., Wyckoff J., Verkhusha V.V., Condeelis J., Segall J.E. and van Rheenen J. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods 2008, 5: 1019-1021.

27. Subach O.M., Gundorov I.S., Yoshimura M., Subach F.V., Zhang J., Griienwald G., Souslova E.A., Chudakov D.M. and Verkhusha V.V. Conversion of red fluorescent protein into a bright blue probe. Chem. Biol. 2008, 15: 1116-1124.

28. Stepanenko O.V., Verkhusha V.V., Shavlovsky M.M., Kuznetsova I.M., Uversky V.N. and Turoverov K.K. Understanding the role of Arg96 in structure and stability of green fluorescent protein. Proteins 2008, 73: 539-551.

29. Pena P.V., Horn R.A., Hung Т., Lin H„ Kuo A.J., Wong R.P.C., Subach O.M., Champagne K.S., Zhao R., Verkhusha V.V., Li G., Gozani O. and Kutateladze T.G. Histone H3K4me3 binding is required for the DNA repair and apoptotic activities of ING1 tumor suppressor. J. Mol. Biol. 2008,380: 303-312.

30. Kapoor V., Karpov V., Linton C„ Subach F.V., Verkhusha V.V. and Telford W.G. Solid state yellow and orange lasers for flow cytometry. Cytometry 2008, 73A: 570577.

31. Mishin A.S., Subach F.V., Yampolsky I.V., King W., Lukyanov K.A. and Verkhusha V.V. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry 2008; 47: 4666-4673.

32. Horn R.A, Vora M., Regner M., Subach O.M., Cho W., Verkhusha V.V., Stahelin R.V. and Kutateladze T.G. pH-dependent binding of the epsin ENTH domain and the API80 ANTH domain to PI(4,5)P2-containing bilayers. J. Mol. Biol 2007, 373: 412423.

33. Kapoor V., Subach F.V., Kozlov V.G., Grudinin A., Verkhusha V.V. and Telford W.G. New lasers for flow cytometry: filling the gaps. Nat. Methods 2007, 4: 678-679.

34. Невзглядова O.B., Артемов A.B., Зенин B.B., Верхуша В.В., Шавловский М.М., Поварова О.И., Степаненко О.В., Кузнецова И.М. и Туроверов К.К. Экспрессия рекомбинантного актина 5С из дрозофилы в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris. Цитология 2007,49: 300-310.

35. Gurskaya N.G., Verkhusha V.V., Shcheglov A.S., Staroverov D.B., Chepurnykh T.V., Fradkov A.F., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 2006, 24: 461-465.

36. Lee S.A., Eyeson R., Cheever M.L., Geng J., Verkhusha V.V., Burd C., Overduin M. and Kutateladze T.G. Targeting of the FYVE domain to endosomal membranes is regulated by a histidine switch. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005, 102: 13052-13057.

37. Verkhusha V.V. and Sorkin A. Conversion of the monomeric red fluorescent protein into a photoactivatable probe. Chem. Biol. 2005, 12: 279-285.

38. Stepanenko O.V., Verkhusha V.V., Kazakov V.I., Shavlovsky M.M., Kuznetsova I.M., Uversky V.N. and Turoverov K.K. Comparative studies on the structure and stability of fluorescent proteins EGFP, zFP506, mRFPl, dimer2 and DsRed. Biochemistry 2004,43: 14913-14923.

39. Galperin E., Verkhusha V.V. and Sorkin A. Three-chromophore FRET microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells. Nat. Methods 2004, 1: 209-217.

40. Chudakov D.M., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. Photoswitchable fluorescent label for protein tracking. Nat. Biotechnol. 2004, 22: 1435-1439.

41. Verkhusha V.V., Chudakov D.M., Gurskaya N.G., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. Common pathway for the red chromophore formation in the fluorescent proteins and chromoproteins. Chem. Biol. 2004,11: 845-854.

42. Verkhusha V.V., Pozhitkov A.E., Smirnov S.A., Borst J.W., van Hoek A., Klyachko N.L., Levashov A.V. and Visser A.J. Effect of high pressure and reversed micelles on the fluorescent proteins. Biochim. Biophys. Acta 2003, 1622: 192-195.

43. Verkhusha V.V., Kuznetsova I.M., Stepanenko O.V., Zaraisky A.G., Shavlovsky M.M., Turoverov K.K. and Uversky V.N. High stability of Discosoma DsRed as compared to Aequorea EGFP. Biochemistry 2003,42: 7879-7884.

44. Bulina M.E., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Chudakov D.M. and Lukyanov K.A. Heterooligomeric tagging diminishes non-specific aggregation of target proteins fused with Anthozoa fluorescent proteins. Biochem. J. 2003, 371: 109-114.

45. Verkhusha V.V., Shavlovsky M.M., Nevzglyadova O.V., Gaivoronsky A.A., Artemov A.V., Stepanenko O.V., Kuznetsova I.M. and Turoverov K.K. Expression of recombinant GFP-actin fusion protein in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Yeast Res. 2003, 3: 105-111.

46. Fradkov A.F., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Bulina M.E., Yanushevich Y.G., Martynov V.I., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. Far-red fluorescent tag for protein labelling. Biochem. J. 2002, 368: 17-21.

47. Верхуша B.B., Аковбян H.A., Ефременко E.H., Варфоломеев С.Д. и Вржещ П.В. Кинетический анализ созревания и денатурации красного флуоресцентного белка DsRed. Биохимия 2001, 66: 1659-1670.

48. Verkhusha V.V., Otsuna H., Awasaki T., Oda H., Tsukita S. and Ito К. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation. J. Biol. Chem. 2001, 276: 29621-29624.

49. Vrzheshch P.V., Abovikyan N.A., Varfolomeyev S.D. and Verkhusha V.V. Denaturation and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions. FEBS Letters 2000,487: 203-208.

50. Варфоломеев С.Д., Ефременко E.H., Верхуша B.B. и Вржещ П.В. Синтетические аналоги аминокислот в клетках и белках. Вестн. Моск. Ун-та 2000,41:352-354.

51. Verkhusha V.V., Tsukita S. and Oda H. Analysis of cytoskeleton dynamics and cell migration in Drosophila ovaries using GFP-actin and E-cadherin-GFP fusion molecules. Proc. SPIE 1999, 3604: 130-139.

52. Verkhusha V.V., Tsukita S. and Oda H. Actin dynamics in lamellipodia of migrating border cells in the Drosophila ovaries revealed by a GFP-actin fusion protein. FEBS Letters 1999,445:395-401.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Ai H.W., Shaner N.C., et al. (2007) Biochemistry 46: 5904-5910.

Ai H.W., Hazelwood K.L., et al. (2008) Nat. Methods 5: 401-403.

Ando R., Mizuno H., Miyawaki A. (2004) Science 306: 1370-1373.

Barondeau D.P., Kassmann C.J., et al. (2007) J. Am. Chem. Soc. 129: 3118-3126.

Drobizhev M„ Tillo S„ Makarov N.S, et al. (2009) J. Phys. Chem. В 113: 855-859.

Eskelinen E. et al. (2002) Mol. Biol. Cell 13: 3355-3368.

Gordon G.W., Berry G„ Liang X.H., et al. (1998) Biophys. J. 74: 2702-2713.

Henderson J.N., Osborn M.F., et al. (2009) J. Am. Chem. Soc. 131: 13212-13213.

HeuserJ.E., Anderson R.G. (1989) J. Cell Biol. 108: 389-400.

Hosoi H„ Mizuno H„ et al. (2006) J. Phys. Chem. В 110: 22853-22860.

Karasawa S„ Araki Т., Nagai Т., et al. (2004) Biochem. J. 381: 307-312.

Kirchhausen T. (2000) Annu. Rev. Biochem. 69: 699-727.

Kogure Т., Karasawa S., Araki Т., et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24: 577-581.

Lin M.Z., MeKeown M.R., Ng H.-L., et al. (2009) Chem. Biol. 16: 1169-1179.

Mao S., Benninger R.K., Yan Y., et al. (2008) Biophys. J. 94: 4515-4524.

Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., et al. Nat. Biotechnol. (1999) 17: 969-973.

Mena M.A., Treynor T.P., et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24: 1569-1571.

Merzlyak E.M., Goedhart J., Shcherbo D„ et al. (2007) Nat. Methods 4: 555-557.

Nguyen A.W., Daugherty P.S. (2005) Nat. Biotechnol. 23: 355-360.

Nobes C.D., Hall A. (1999) J. Cell Biol. 144: 1235-1244.

Ohashi Т., Galiасу S.D., et al. (2007) Protein Sci. 16: 1429-1438.

Ormo M„ Cubitt A.B., Kallio K„ et al. (1996) Science 273: 1392-1395.

Patterson G.H., Piston D.W., Barisas B.G. (2000) Anal. Biochem. 284: 438-440.

Patterson G.H., Lippincott-Schwartz J. (2002) Science 297: 1873-1877.

Remington S.J. (2006) Curr. Opin. Struct. Biol. 16: 714-721.

Rizzo M.A., Springer G.H., et al. (2004) Nat. Biotechnol. 22: 446-449.

Shaner N.C., Campbell R.E.; et al. (2004) Nat. Biotechnol. 22: 1567-1572.

Shcherbo D., Merzlyak E.M., et al. (2007) Nat. Methods 4: 741-746.

Shi X., Abbyad P., Shu X., et al. (2007) Biochemistry 46: 12014-12025.

Sorkin A., McCIure M„ Huang F., Carter R. (2000) Curr. Biol. 10: 1395-1398.

Stiel A.C., Andresen M„ Bock H„ et al. (2008) Biophys. J. 95: 2989-2997.

Terskikh A., Fradkov A., Ermakova G„ et al. (2000) Science 290: 1585-1588.

Tsien R.Y. (1998)Лишл Rev. Biochem. 67: 509-544.

van Thor J.J., Gensch Т., et al. (2002) Nat. Struct. Biol. 9: 37-41.

Wiedenmann J., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 15905-15910.

Wiehler J., Jung G., Seebacher C., et al. (2003) ChemBioChem. 4: 1164-1171.

Wyckoff J.B., Jones J.G., et al. (2000) Cancer Res. 60: 2504-2511.

Yamazaki Т., Zaal K„ Hailey D„ et al. (2002) J. Cell Sci. 115: 1791-1802.

Yampolsky I.V., Kislukhin A.A., et al. (2008) Bioorg. Chem. 36: 96-104.

Yarbrough D., Wachter R.M., et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 462-461.

Zapata-Hommer O., Griesbeck O. (2003) BMC Biotechnol. 3: 5.

Zipfel W.R., Williams R.M, Webb W.W. (2003) Nat. Biotechnol. 21: 1369-1377.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 25.03.2011. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 2,0. Уч.-изд. л. 2,0. Тираж 100. Заказ 7370Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Верхуша, Владислав Витальевич

Список часто используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 1.1. Физико-химические свойства ОБР-подобных белков.

1.1.1. Источники флуоресцентных белков и хромопротеинов.

1.1.2. Агрегация.

1.1.3. Олигомеризация.

1.1.4. Созревание: фолдинг белка и образование хромофора.

1.1.5. Фотостабильность.

1.1.6. рН устойчивость флуоресценции.

1.2. Улучшенные мономерные красные флуоресцентные белки.

1.2.1. Оранжевые и красные флуоресцентные белки. 1.2.2. Дальне-красные флуоресцентные белки.

1.2.3. Тетрамерный флуоресцентный таймер.

1.3. Фотоактивируемые красные флуоресцентные белки.

1.3.1. Необратимо фотоактивируемые ультрафиолетовым светом.

1.3.2. Необратимо фотоактивируемые видимым светом.

1.3.3. Обратимо переключаемые флуоресцентные белки.

1.4. Структура флуоресцентных белков.

1.4.1. Кристаллическая структура флуоресцентных белков.

1.4.2. Структура и образование хромофора.

1.4.3. Окружение хромофора.

1.4.4. Образования ацилиминой связи в хромофоре.

1.4.5. Планарность хромофора.

1.5. Фотоконверсия в красных флуоресцентных белках.

1.5.1. Необратимое фотопереключение.

1.5.2. Цис-транс изомеризация хромофора.

1.5.3. Фотоконверсии перманентных красных флуоресцентных белков

1.6. Перенос протона в возбужденном состоянии хромофора.

1.6.1. Заряд хромофора и сеть водородных связей.

1.6.2. Фотоцикл в GFP белке дикого типа.

1.6.3. Зависимость переноса протона от окружения хромофора.

1.7. Основные направления применения красных флуоресцентных

1 белков.

1.7.1. Преимущества применения в клеточной биологии.

1.7.2. Флуоресцентные белки как репортерные гены. 1.7.3. Флуоресцентные белки как маркеры.

1.7.4. Методы, основанные на FRET.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы молекулярной биологии.

2.3. Выделение и характеризация рекомбинантных белков.

2.4. Структурный анализ белков.

2.5. Методы клеточной биологии.

2.6. Флуоресцентная микроскопия клеток в культуре.

2.7. Двухфотонная микроскопия и визуализация в мышах.

2.8. Общая схема создания новых флуоресцентных белов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Мономерный синий флуоресцентный белок mTagBFP.

3.1.1. Физико-химические характеристики очищенного mTagBFP.

3.1.2. Использование mTagBFP в качестве донора FRET.

3.1.3. Структуры хромофоров mTagBFP и его предшественника TagRFP

3.1.4. Трансформация тирозин содержащих хромофоров.

3.2. Серия мономерных флуоресцентных белков-таймеров.

3.2.1. Основные свойства очищенных рекомбинантных быстрого

FastFT), среднего (MediumFT) и медленного (SlowFT) таймеров

3.2.2. Использование флуоресцентных таймеров для изучения внутриклеточных процессов.

3.2.3. Структуры хромофоров FastFT и его синего мутанта В1ие102.

3.3. Серия фотоактивируемых флуоресцентных белков PAmCherry.

3.3.1. Свойства очищенных белков PAmCherry.

3.3.2. Использование PAmCherryl в микроскопии сверхвысокого разрешения PALM.

1 3.3.3. Хромофор PAmCherryl в тёмном и флуоресцентном состояниях.

3.4. Фотоактивируемый красный флуоресцентный белок PATagRFP.

3.4.1. Физико-химические характеристики PATagRFP.

3.4.2. Использование PATagRFP в микроскопии траекторий единичных частиц sptPALM.

3.5. Обратимо фотопереключаемый красный флуоресцентный белок rsTagRFP.

3.5.1. Физико-химические свойства очищенного rsTagRFP.

3.5.2. Свойства rsTagRFP в фотохромном FRET.

3.5.3. Применение rsTagRFP в pcFRET в живых клетках.

3.6. Мономерный дальне-красный флуоресцентный белок TagRFP

3.6.1. Физико-химические характеристики очищенного TagRFP657.

3.6.2. TagRFP657 в многоцветовых цитофлуорометрии и микроскопии.

3.6.3. TagRFP657 в микроскопии сверхвысокого разрешения STED.

3.6.4. Неинвазивная визуализация раковой опухоли с помощью

TagRFP

3.7. Белки с большим стоксовым сдвигом LSSmKatel и LSSmKate2.

3.7.1. Физико-химические характеристики LSSmKatel и LSSmKate2.

3.7.2. Механизм большого стоксового сдвига в белках LSSmKate.

3.7.3. Рациональный дизайн белков с большим стоксовым сдвигом.

3.7.4. Использование белков LSSmKatel и LSSmKate2 для визуализации процессов, происходящих в живых клетках.

3.7.5. Многоцветная двухфотонная микроскопия в живых мышах.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Флуоресцентные маркеры для молекулярной и клеточной биологии: флуоресцентные таймеры, постоянно флуоресцирующие и фотоактивируемые белки"

Актуальность проблемы. Прижизненная визуализация процессов, происходящих в клетках и организмах, с высоким пространственным разрешением в реальном масштабе времени с использованием в качестве флуоресцентных маркеров зеленого флуоресцентного белка (ОБР), его вариантов и гомологов, составляющих семейство СБР-подобных белков, стала в последнее десятилетие одним из наиболее востребованных методов исследования в биологии и медицине. В отличие от других природных пигментов, ОБР-подобные белки формируют хромофор без участия внешних ферментных систем или кофакторов, кроме молекулярного кислорода. Таким образом, образование хромофора и возникновение свечения происходит непосредственно в живых организмах, тканях или клетках. Концевые фрагменты флуоресцентных белков доступны для связывания с другими белками, что позволяет осуществлять сшивку флуоресцентных белков (ТР) с белками-мишенями. Это свойство делает БР уникальными генетически кодируемыми флуоресцентными маркерами -незаменимым инструментом для изучения взаимодействия белков, их локализации, внутриклеточного транспорта и создания молекулярных биосенсоров на различные внутриклеточные метаболиты.

В настоящее время БР широко используются для флуоресцентного мечения белков, органелл, клеток и целых организмов как прокариот, так и эукариот. Возможность одновременного использования нескольких БР с разными спектральными характеристиками привела к развитию новых методов оптической микроскопии, позволяющих изучать многофакторные процессы в живой клетке и многоклеточном организме. Последующие исследования посттрансляционных изменений, структуры и свойств СРР-подобных белков позволили разработать подходы для целенаправленного создания новых БР с улучшенными и даже заданными свойствами, которые нашли свое применение в биологии и биотехнологии.

Все красные БР дикого типа, так же как и первые улучшенные версии на их основе, обладали рядом существенных недостатков, таких как неполное и медленное образование хромофора, склонность к агрегации и олигомеризации, примесь зеленой флуоресцентной формы хромофора. Любой из перечисленных недостатков значительно ограничивает применение РР. Получение улучшенных вариантов БР остается важной задачей, решение которой значительно расширяет возможности применения РР в молекулярной и клеточной биологии. В настоящее время наиболее эффективным методом получения улучшенных версий красных РР является сочетание случайного и сайт-направленного мутагенеза с высоко эффективной техникой сортировки и отбора клеток.

Практическая значимость красных РР особенно велика для микроскопии тканей и целых организмов, поскольку свет с большей длиной волны лучше проникает в биологические образцы. Более того, использование красных БР повышает чувствительность детекции флуоресценции, так как автофлуоресценция клеток и светорассеивание в тканях уменьшаются с увеличением длины волны света.

Ввиду уникальных биохимических свойств белков семейства ОРР, большой практической значимости РР для молекулярной и клеточной биологии, а также биомедицинских исследований, изучение механизмов, лежащих в основе спектральных, фотохимических и биохимических свойств FP, и создание новых FP является актуальной задачей.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Формирование Tyr-содержащих хромофоров красных FP, PAFP и FT происходит через стадию образования синего интермедиата, хромофор которого состоит из имидазольиого кольца и N-ацилиминовой группы, не объединенных в систему сопряженных л-связей с фенольным кольцом тирозина 64.

3. Предложен рациональный молекулярный подход, направленный на получение вариантов FP с большим* стоксовым сдвигом флуоресценции посредством формирования в них цепей водородных связей для переноса протона в возбуждённом состоянии хромофора.

Научная новизна работы. Созданы двенадцать новых мономерных FP, PAFP и FT, обладающих либо совершенно новыми, либо существенно улучшеными, по сравнению с существующими аналогами, физико-химическими свойствами при экспрессии в качестве белков слияния в клетках. Часть созданных белков не имеет аналогов. Получены кристаллы и определена методом рентгеноструктурного анализа простраственная структура семи белков. На основании этих данных и результатов масс-спектрометрического анализа определены химические структуры хромофоров этих белков, предложены молекулярные механизмы их спектрального, фотохимического и биохимического поведения. Предложена общая схема формирования тирозин-содержащих хромофоров в FP. Показано, что новые FP, PAFP и FT расширяют возможности многоцветового внутриклеточного мечения при использовании методов стандартной флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуорометрии. Вновь созданные варианты FP были применены в качестве маркеров при апробации новых методов оптической микроскопии, таких как регистрация резонансного безызлучательного переноса энергии (Förster resonance energy transfer, FRET), двухфотонное (two-photon, 2Р) возбуждение флуоресценции, регистрация изображений сверхвысокого разрешения единичных молекул PALM (photoactivated localization microscopy) и микроскопия сверхвысокого разрешения ансамбля молекул STED (stimulated emission depletion). Созданные FP, PAFP и FT были использованы для решения задач молекулярной клеточной биологии, включая мечение структур в живых клетках, детекцию внутриклеточных взаимодействий и детекцию ^локализации белков-мишеней, определение внутриклеточного возраста белков.

Практическое значение полученных результатов. Практическая ценность работы заключается в получении новых мономерных FP, которые можно применять для многоцветового мечения белков, органелл, клеток и организмов различных видов прокариот и эукариот. Разработана стратегия рационального дизайна красных фотоактивируемых FP и FP с большим стоксовым сдвигом, которая может быть использована для получения других подобных маркеров с заданными спектральными характеристиками. Разработано несколько фотоактивируемых красных FP, что открывает новые возможности для прицельного введения и последующего слежения за перемещением одновременно I двух флуоресцентно-меченых белков в живых тканях, клетках и органеллах. Становится доступным двухцветовая PALM микроскопия, основанная на использовании двух спектрально различающихся фотоактивируемых FP. Получен мономерный FP, флуоресцирующий в дальне-красной области спектра.

Йельском университете (США, 2009), Институте молекулярной биологии и генетики (Киев, Украина, 2006, 2009), Институте медицинских исследований Бурке (США, 2007), Университете Флориды (США, 2005), Университете Центральной Флориды (США, 2005), Питтсбургском университете (США, 2004), Центре фотомедицины Велмана Массачусетского госпиталя (США, 2004), Институте биоорганической химии РАН (2000, 2003), университете Колорадо (США, 2003), факультете биоинженерии и биоинформатики и факультете химии Московского государственного университета (1999, 2002), Вюрцбургском университете (Германия, 2001), Киотском университете (Япония, 2001), университете Томаса Джефферсона (США, 2001), университете Орегона (США, 2001).

Публикации по теме работы. По материалам диссертации опубликованы 52 рецензированные печатные работы (44 оригинальные статьи, 6 обзоров и 2 главы в книгах) за период с 1999 по 2010 год.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследований, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций. Все результаты, обсуждаемые в работе, были получены либо лично автором, либо руководимыми им сотрудниками и аспирантами. В Работах, выполненных в соавторстве, личный ВИад автора заключался в непосредственном участии в планировании „ проведении экспериментов, в обсуждении и литературном оформлении результатов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обычно предполагается, что все цветовое разнообразие живых организмов обусловленно хромопротеинами или низкомолекулярными пигментами. Как правило, хромопротенины содержат небольшую молекулу небелковой природы или ион металла, которые отвечают за хромогенные свойства белка. Однако, флуоресценция зеленого флуоресцентного белка (GFP), открытого в 1961 году группой исследователей во главе с Осаму Шимомурой [1] при изучении ими биолюминесценции медузы Aequorea victoria из класса Hydrozoa, обусловлена взаимодействим внутренних аминокилотных остатков белка и не требует участия вспомогательных кофакторов, ферментов или каких-либо субстратов. Многие годы GFP изучался очень небольшой группой исследователей как белок, являющийся частью биолюминесцентной системы [2]. После клонирования гена GFP интерес к нему чрезвычайно возрос, и в настоящее время GFP и его улучшенные мутанты являются наиболее широко используемыми генетическими маркерами [3-5]. В 2008 году Нобелевской премии по химии, самой престижной научной награды, удостоились Осаму Шимомура, Мартин Чалфи и Роджер Тсиен за разработку и получение различных форм зеленого флуоресцентного белка [6]. Очередным толчком к развитию этого направления в биотехнологии послужило клонирование генов GFP-подобных белков, флуоресцирующих в желтой, оранжевой, красной и дальне-красной областях спектра [7]. На момент начала работы над диссертацией были известны флуоресцентные белки всей цветовой гаммы от голубого до дальне-красного, которые покрывают спектр от 424 нм до 655 нм.

Красные флуоресцентные белки (RFPs) имеют максимумы эмиссии флуоресценции превышающие 560 нм. Все RFPs могут быть разделены на две оольшие группы: перманентно красные флуоресцентные белки и красные флуоресцентные белки, которые требуют УФ или видимого синего света для образования красного хромофора. Также следует упомянуть такие GFP-подобные белки как хромопротеины (CPs), которые способны эффективно поглощать свет, однако при этом не флуоресцируют. CPs имеют один максимум абсорбции на 560610 нм, длина волны максимума поглощения определяет цвет СР. Часто при созревании RFPs проходят через голубое или зеленое флуоресцентное состояние. Это свойство RFPs было использовано для создания флуоресцентных таймеров, которые на ранних стадиях созревания флуоресцируют в голубой или зеленой области спектра, а в полностью созревшем состоянии — в красной.

1.1. Физико-химические свойства GFP-подобных белков

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Верхуша, Владислав Витальевич

выводы

3. Создан мономерный синий флуоресцентный белок mTagBFP, который обладает наибольшей яркостью в синем спектральном диапазоне по сравнению с существующими аналогами, и содержит хромофор, образованный имдазольным кольцом и КГ-ацилиминовой группой. Показано, что исключение фенольного кольца тирозинового остатка 64 из системы сопряженных я-связей приводит к формированию хромофора, флуоресцирующего в синей области спектра.

4. Установлено, что формирование БвРеё-подобного хромофора в красных перманентно флуоресцирующих и фотоактивируемых белках осуществляется через стадию образования пП^ВРР-подобного хромофора, флуоресцирующего в синей области спектра.

5. Созданы мономерные флуоресцентные белки-таймеры, позволяющие изучать, пространственно-временные характеристики внутриклеточных процессов и: возраст внутриклеточных белковых молекул.

6. Создан красный фотопереключаемый флуоресцентный белок, фотоконверсия: которого сопровождается существенным, но обратимым изменением формы спектра поглощения. Показана возможность использования этого белка в качестве акцептора в новом методе фотохромного безызлучательно— резонансного переноса энергии для изучения межбелковых взаимодействий в живых клетках.

9. Созданы мономерные красные флуоресцентные белки с большим стоксовымс сдвигом, позволяющие осуществлять визуализацию процессов в живых тканях с субклеточным разрешением в режиме реального времени.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Созданные FP, PAFP и FT существенно расширяют возможности современных методов получения флуоресцентных изображений в молекулярной и клеточной биологии и биомедицинских исследованиях. Новые белки можно применять для многоцветового мечения молекул, органелл, клеток и организмов в широком диапазоне видов прокариот и эукариот. Предложенные автокаталитические и фотохимические механизмы формирования и функционирования хромофоров позволят разработать стратегии дизайна следующего поколения генетически-кодируемых флуоресцентных зондов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Верхуша, Владислав Витальевич, Санкт-Петербург

1. Shimomura 0., F.H.Johnson, Y.Saiga. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol., 59, 223-239 (1962).

2. Morise H., O.Shimomura, F.H.Johnson, J.Winant. Intermolecular Energy Transfer in Bioluminescent systems of aequorea. Biochemistry, 13, 2656-2662 (1974).

3. Prasher D.C., V.KEckenrode, W.W.Ward, F.G.Prendergast, M.J.Cormier. Primary structure of the Aequorea victorea green fluorescent protein. Gene, 111, 229-233 (1992).

4. Chalfie M., Y.Tu, G.Euskirchen, W.W.Ward, D.C.Prasher. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science, 263, 802-805 (1994).

5. Day R.N., M.W.Davidson. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem. Soc. Rev., 38, 2887-2921 (2009).

6. Miyawaki A. Green fluorescent protein glows gold. Cell, 135, 987-990 (2008).

7. Matz M.V., A.F.Fradkov, Y.A.Labas, A.P.Savitsky, A.G.Zaraisky, M.L.Markelov, S.A.Lukyanov. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat. Biotechnol, 17, 969-73 (1999).

8. Labas Y.A., N.G.Gurskaya, Y.G.Yanushevich, A.F.Fradkov, K.A.Lukyanov, S.A.Lukyanov, M.V.Matz. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 4256-61 (2002).

9. Wiedenmann J., C.Elke, K.D.Spindler, W , ^-^unke. Cracks in the 3-can: fluorescentproteins from Anemonia sulcata. Proc. ,

10. Acad. Set USA. 97, 14091-140962000).

11. Gurskaya N.G., A.F.Fradkov, A.Terskilcb

12. M.V.Matz, Y.A.Labas, V.l.Marlynov, Y.G.Yanushevich, K.A.Lukyanov, S.A T пъ-,-ulcyanov. GFP-like chromoproteins <source of far-red fluorescent proteins. FEFZ*? т1. Zeti-> 507, 16-20 (2001).

13. Yanushevich Y.G., D.B.Staroverov, A «г ,

14. У' A.F.Fradkov, N.G.Gurskaya,

15. M.E.Bulina, K.A.Lukyanov, S.A.Lukyanc-»^ a

16. A strate§y for the generation of non-aggregating mutants of Anthozoa fluore^n«.fproteins. FEBS Lett., 511, Ц-142002).

17. Shkrob M.A., Y.G.Yanushevich, D.IvT г^т, ^ ,-Chudakov, N.G.Gurskaya, Y.A.Labas,

18. S.Y.Poponov, N.N.Mudrik, S.Lukyanox^ ^ * т ,

19. K-A.Lukyanov. Far-red fluorescentproteins evolved from a blue chromoprotc- ;^ -p л .ein from Actmia equina. Bio chem. J„ 392649.654 (2005).

20. Wiedenmann J., A.Schenk, C.Rocker, A л т^ ^ ^ .

21. K.D.Spindler, G.U.Nienhaus. A farred fluorescent protein with fast maturatir^r№on and reduced oligomerization tendencyfrom Entacmaea quadricolor (Anthozoa a • ч ^

22. V a, Retinaría). Proc. Natl Acad. Sci. USA, 99,11646-11651 (2002).

23. Merzlyak E.M., J.Goedhart, D.Shcherbo Лугсг».

24. M.E.Bulina, A.S.Shcheglov, A.F.Fradkov,

25. A.Gaintzeva, K.A.Lukyanov, S.Lukyariov

26. V' T-W.Gadella, D.M.Chudakov. Brightmonomeric red fluorescent protein with . , , „an extended fluorescence lifetime. Nat.

27. Methods, 4, 555-557 (2007).

28. Shcherbo D., E.M.Merzlyak, T.V.Chepurnykh, A.F.Fradkov, G.V.Ermakova, E.A.Solovieva, K.A.Lukyanov, E.A.Bogdanova, A.G.Zaraisky, S.Lukyanov, D.M.Chudakov. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat. Methods, 4, 741-746 (2007).

29. Karasawa S., T.Araki, T.Nagai, H.Mizuno, A.Miyawaki. Cyan-emitting and orange- emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer. Biochem. J., 381, 307-312 (2004).

30. Bulina M.E., D.M.Chudakov, O.V.Britanova, Y.G.Yanushevich, D.B.Staroverov, T.V.Chepurnykh, E.M.Merzlyak, M.A.Shkrob, S.Lukyanov, K.A.Lukyanov. A genetically encoded photosensitizer. Nat. Biotechnol., 24, 95-99 (2006).

31. Mishin A.S., F.V.Subach, I.V.Yampolsky, W.King, K.A.Lukyanov, V.V.Verkhusha. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry, 47, 4666-4673 (2008).

32. Shaner N.C., R.E.Campbell, P.A.Steinbach, B.N.Giepmans, A.E.Palmer, R.Y.Tsien. Improved monomelic red, orange and yellow fluorescent proteinsderived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol, 22, 15671572 (2004).

33. Strack R.L., D.Bhattacharyya, B.S.Glick, RJ.Keenan. Noncytotoxic orange and red/green derivatives of DsRed-Express2 for whole-cell labeling. BMC Biotechnol., 9, 32 (2009).

34. Tsutsui H., S.Karasawa, Y.Okamura, A.Miyawaki. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat. Methods, 5, 683-685 (2008).

35. Shaner N.C., M.Z.Lin, M.R.McKeown, P.A.Steinbach, K.L.Hazelwood, M.W.Davidson, R.Y.Tsien. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat. Methods, 5, 545-551 (2008).

36. Campbell R.E., O.Tour, A.E.Palmer, P.A.Steinbach, G.S.Baird, D.A. Zacharias, R.Y.Tsien. A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 7877-7882 (2002).

37. Bevis B.J., B.S.Glick. Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRed). Nat. Biotechnol., 20, 83-87 (2002).

38. Strack R.L., D.E.Strongin, D.Bhattacharyya, W.Tao, A.Berman, H.E.Broxmeyer, R.J.Keenan, B.S.Glick. A noncytotoxic DsRed variant for whole-cell labeling. Nat. Methods, 5, 955-957 (2008).

39. Strongin D.E., B.Bevis, N.Khuong, M.E.Downing, R.L.Strack, K.Sundaram, B.S.Glick, R.J.Keenan. Structural rearrangements near the chromophore influence the maturation speed and brightness of DsRed variants. Protein Eng. Des. Sel., 20, 525-534 (2007).

40. Fischer M., I.Haase, E.Simmeth, G.Gerisch, A.Muller-Taubenbcrger. A brilliant monomeric red fluorescent protein to visualize cytoskeleton dynamics in Dictyostelium. FEBSLett., 577, 227-232 (2004).

41. Fischer M., I.Haase, S.Wiesner, A.Mullcr-Taubenberger. Visualizing cytoskeleton dynamics in mammalian cells using a humanized variant of monomeric red fluorescent protein. FEBS Lett., 580,2495-2502 (2006).

42. Kredel S., F.Oswald, K.Nienhaus, K.Deuschle, C.Rocker, R.Heilker, G.U. Nienhaus, J.Wiedenmann. mRuby, a bright monomeric red fluorescent protein for labeling of subcellular structures. PLoS ONE, 4, e4391 (2009)

43. Kogure T., S.Karasawa, T.Araki, K.Saito, M.Kinjo, A.Miyawaki. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color singlelaser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat. Biotechnol., 24, 577-581 (2006).

44. Wang L., W.CJackson, P.A.Steinbach, R.Y.Tsien. Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 1674516749 (2004).

45. Fradkov A.F., V.V.Verkhusha, D.B.Staroverov, M.E.Bulina, Y.G.Yanushevich, V.I. Martynov, S.Lukyanov, K.A.Lukyanov. Far-red fluorescent tag for protein labelling. Biochem. J., 368,17-21 (2002).

46. Terskikh A.V., A.F.Fradkov, A.G.Zaraisky, A.V.Kajava, B.Angres. Analysis of DsRed Mutants. Space around the fluorophore accelerates fluorescence development. J. Biol. Chem., 277, 7633-7636 (2002).

47. Baird G.S., D.A.Zacharias, R.Y.Tsien. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,11984-11989 (2000).

48. Vrzheshch P.V., N.A.Akovbian, S.D.Varfolomeyev, V.V.Verkhusha. Denaturation and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions. FEBSLett., 487, 203-208 (2000).

49. Heikal A.A., S.T.Hess, G.S.Baird, R.Y.Tsien, W.W.Webb. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,11996-12001 (2000).

50. Wiedenmann J., B.Vallone, F.Renzi, K.Nienhaus, S.Ivanchenko, C.Rocker, G.U.Nienhaus. Red fluorescent protein eqFP611 and its genetically engineered dimeric variants. J. Biomed. Opt., 10,14003 (2005).

51. Kogure T., H.Kawano, Y.Abe, A.Miyawaki. Fluorescence imaging using a fluorescent protein with a large Stokes shift. Methods, 45, 223-226 (2008).

52. Mizuno H., A.Sawano, P.Eli, H.Hama, A.Miyawaki. Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and partner for fluorescence energy transfer. Biochemistry, 40, 2502-2510 (2001).

53. Terskikh A., A.Fradkov, G.Ermakova, A.Zaraisky, P.Tan, A.V.Kajava, X.Zhao, S.Lukyanov, M.Matz, S.Kim, I.Weissman, P.Siebert. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science, 290, 1585-1588 (2000).

54. Bulina M.E., D.M.Chudakov, N.N.Mudrik, K.A.Lukyanov. Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. BMC Biochem., 3, 7 (2002).

55. Kredel S., K.Nienhaus, F.Oswald, M.Wolff, S.Ivanchenko, F.Cymer, A.Jeromin, F.J.Michel, K.D.Spindler, R.Heilker, G.U.Nienhaus, J.Wiedenmann. Optimized and far-red-emitting variants of fluorescent protein eqFP611. Chem Biol., 15, 224-233 (2008).

56. Shaner N.C., P.A.Steinbach, R.Y.Tsien. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods, 2, 905-909 (2005).

57. Gross L.A., G.S.Baird, R.C.Hoffman, K.K.Baldridge, R.Y.Tsien. The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,11990-11995 (2000).

58. Petersen J., P.G.Wilmann, T.Beddoe, AJ.Oakley, RJ.Devenish, M.Prescott, J.Rossjohn. The 2.0-Â crystal structure of eqFPôll, a far red fluorescent protein from the sea anemone Entacmaea quadricolor. J. Biol. Chem., 278, 44626-44631 (2003).

59. Kawano H., T.Kogure, Y.Abe, H.Mizuno, A.Miyawaki. Two-photon dual-color imaging using fluorescent proteins. Nat. Methods, 5, 373-374 (2008).

60. Shu X., A.Royant, M.Z.Lin, T.A.Aguilera, V.Lev-Ram, P.A.Steinbach, R.Y.Tsien. Mammalian Expression of Infrared Fluorescent Proteins Engineered from a Bacterial Phytochrome. Science, 324, 804-807 (2009).

61. Shu X., L.Wang, L.Colip, K.Kallio, S.J.Remington. Unique interactions between the chromophore and glutamate 16 lead to far-red emission in a red fluorescent protein. Protein Sci., 18, 460-466 (2009).

62. Ando R., H.Hama, M.Yamamoto-Hino, H.Mizuno, A.Miyawaki. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 12651-12656 (2002).

63. Wiedenmann J., S.Ivanchenko, F.Oswald, F.Schmitt, C.Rôcker, A.Salih, K.D.Spindler, G.U.Nienhaus. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 15905-15910 (2004).

64. McKinney S.A., C.S.Murphy, K.L.Hazelwood, M.W.Davidson, L.L.Looger. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods, 6, 131133 (2009).

65. Tsutsui H., S.Karasawa, H.Shimizu, N.Nukina, A.Vliyawaki. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter EMBO Rep 6,233-238 (2005).

66. Habuchi S., H.Tsutsui, A.B.Kochaniak, A.Miyawaki, A.TVT.van Oijen. mKikGR a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS OT\TJ£, 3? e3944 (2008)

67. Gurskaya N.G., V.V.Verkhusha, A.S.Shcheglov, D.B.Staroverov, T.V.Chepurnykh A.F.Fradkov, S.Lukyanov, K.A.Lukyanov. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol 24 461-465 (2006).

68. Chudakov D.M., A.V.Feofanov, N.N.Mudrik, S.Lukyanov, K.A.Lukyanov Chromophore environment provides clue to kindling fluorescent protein riddle J. Biol. Chem., 278, 7215-7219 (2003).

69. Chudakov D.M., V.V.Belousov, A.G.Zaraisky, V.V.Novoselov, D.B.Staroverov D.B.Zorov, S.Lukyanov, K.A.Lukyanov. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nat. Biotechnol, 21,191-194 (2003).

70. Stiel A.C., M.Andresen, H.Bock, M.Hilbert, J.Schilde, A.Schônle, CEggeling Egner A., S.W.Hell, S.Jakobs. Generation of monomeric reversibly switchable red fluorescent proteins for far-field fluorescence nanoscopy. Biophys J., 95, 2989-2997 (2008).

71. Wall M.A., M.Socolich, R.Ranganathan. The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed. Nat. Struct. Biol., 7, 1133-1138 (2000).

72. Yarbrough D., R.M.Wachter, K.Kallio, M.V.Matz, S.J.Remington. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. Proc Natl. Acad. Sci. USA, 98, 462-467 (2001).

73. He X., A.F.Bell, P.J.Tonge. Synthesis and spectroscopic studies of model red fluorescent protein chromophores. Org. Lett., 4,1523-1526 (2002).

74. Mizuno H., T.K.Mal, KJ.Tong, R.Ando, T.Furuta, M.Ikura, A.Miyawaki. Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red' conversion of a fluorescent protein. Mol. Cell, 12,1051-1058 (2003).

75. Remington S.J., R.M.Wachter, D.K.Yarbrough, B.Branchaud, D.C.Anderson, K.Kallio, K.A.Lukyanov. zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore. Biochemistry, 44, 202-212 (2005).

76. Quillin M.L., D.M.Anstrom, X.Shu, S.OLeary, KKallio, D.M.Chudakov, S.J.Remington. Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution. Biochemistry, 44, 5774-5787 (2005).

77. Yampolsky I.V., S.J.Remington, V.I.Martynov, V.K.Potapov, S.Lukyanov, K.A.Lukyanov. Synthesis and properties of the chromophore of the asFP595 chromoprotein from Anemonia sulcata. Biochemistry, 44, 5788-5793 (2005).

78. Shu X., N.C.Shaner, C.A.Yarbrough, R.Y.Tsien, S.J.Remington. Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. Biochemistry, 45, 96399647 (2006).

79. Kikuchi A., E.Fukumura, S.Karasawa, H.Mizuno, A.Miyawaki, Y.Shiro. Structural characterization of a thiazoline-containing chromophore in an orange fluorescent protein, monomeric Kusabira Orange. Biochemistry, 47,11573-11580 (2008).

80. Wood T.I., D.P.Barondeau, C.Hitomi, C.J.Kassmann, J.A.Tainer, E.D.Getzoff. Defining the role of arginine 96 in green fluorescent protein fluorophore biosynthesis. Biochemistry, 44,16211-16220 (2005).

81. Sniegowski J.A., J.W.Lappe, H.N.Patel, H.A.Huffman, R.M.Wachter. Base catalysis of chromophore formation in Arg96 and Glu222 variants of green fluorescent protein. J. Biol. Chem., 280, 26248-26255 (2005).

82. Barondeau D.P., J.A.Tainer, E.D.Getzoff. Structural evidence for an enolate intermediate in GFP fluorophore biosynthesis. J. Am. Chem. Soc., 128, 3166-3168 (2006).

83. Ugalde J.A., B.S.Chang, M.V.Matz. Evolution of coral pigments recreated. Science, 305,1433 (2004).

84. Verkhusha V.V., D.M.Chudakov, N.G.Gurskaya, S.Lukyanov, K.A.Lukyanov. Common pathway for the red chromophore formation in the fluorescent proteins and chromoproteins. Chem. Biol., 11, 845-854 (2004).

85. Wiehler J., J.von Hummel, B.Steipe. Mutants of Discosoma red fluorescent protein with a GFP-like chromophore. FEBSLett., 487,384-389 (2001).

86. Pakhomov A.A., V.I.Martynov. Chromophore aspartate oxidation-decarboxylation in the green-to-red conversion of a fluorescent protein from Zoanthus sp. 2. Biochemistry, 46,11528-11535 (2007).

87. Chan M.C., S.Karasawa, H.Mizuno, I.Bosanac, D.Ho, G.G.Prive, A.Miyawaki, M.Ikura. Structural characterization of a blue chromoprotein and its yellow mutant from the sea anemone Cnidopus japonicus. J. Biol. Chem., 281, 37813-37819 (2006).

88. Martynov V.I., B.I.Maksimov, N.Y.Martynova, A.A.Pakhomov, N.G.Gurskaya, S.A.Lukyanov. A purple-blue chromoprotein from Goniopora tenuidens belongs to the DsRed subfamily of GFP-like proteins. J. Biol. Chem., 278, 46288-46292 (2003).

89. Pakhomov A.A., N.V.Pletneva, T.A.Balashova, V.I.Martynov. Structure and reactivity of the chromophore of a GFP-like chromoprotein from Condylactis gigantea. Biochemistry, 45, 7256-72564 (2006).

90. Shu X., P.Leiderman, R.Gepshtein, N.R.Smith, K.Kallio, D.Huppert, S.J.Remington. An alternative excited-state proton transfer pathway in green fluorescent protein variant S205V. Protein Sci., 16, 2703-2710 (2007).

91. Hayashi I., H.Mizuno, K.I.Tong, T.Furuta, F.Tanaka, M.Yoshimura, A.Miyawaki, M.Ikura. Crystallographic evidence for water-assisted photo-induced peptide cleavage in the stony coral fluorescent protein Kaede. Mol. Biol, 372, 918-926 (2007).

92. Nienhaus K., G.U.Nienhaus, J.Wiedenmann, H.Nar. Structural basis for photo-induced protein cleavage and green-to-red conversion of fluorescent protein EosFP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 9156-9159 (2005).

93. Henderson J.N., S.J.Remington. Crystal structures and mutational analysis of amFP486, a cyan fluorescent protein from Anemonia majano. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102,12712-12717 (2005).

94. Loos D.C., S.Habuchi, C.Flors, J.Hotta, J.Wiedenmann, G.U.Nienhaus, J.Hofkens. Photoconversion in the red fluorescent protein from the sea anemone Entacmaea quadricolor: is cis-trans isomerization involved? J. Am. Chem. Soc., 128, 6270-6271 (2006).

95. Nienhaus K., H.Nar, R.Heilker, J.Wiedenmann, G.U.Nienhaus. Trans-cis isomerization is responsible for the red-shifted fluorescence in variants of the red fluorescent protein eqFPôll. J. Am. Chem. Soc., 130, 12578-12579 (2008).

96. Kremers G.J., K.L.Hazelwood, C.S.Murphy, M.W.Davidson, D.W.Piston. Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nat. Methods, 6, 355-358 (2009).

97. Goedhart J., J.E.Vermeer, M.J.Adjobo-Hermans, L.van Weeren, T.W.Gadella. Sensitive detection of p65 homodimers using red-shifted and fluorescent protein-based FRET couples. PLoS ONE, 2, elOll (2007).

98. Henderson J.N., Osborn M.F., Koon N., Gepshtein R., Huppert D., Remington S.J. Excited state proton transfer in the red fluorescent protein mKeima. J. Am. Chem. Soc., 131,13212-13213 (2009).

99. Violot S., Carpentier P., Blanchoin L., Bourgeois D. Reverse pH-dependence of chromophore protonation explains the large Stokes shift of the red fluorescent protein mKeima. J. Am. Chem. Soc., 131, 10356-10357 (2009).

100. Wiehler J., Jung G., Seebacher C., Zumbusch A., Steipe B. Mutagenic stabilization of the photocycle intermediate of green fluorescent protein (GFP). Chembiochem, 4, 1164-1171 (2003).

101. Brejc K., Sixma T.K., Kitts P.A., Kain S.R., Tsien R.Y., Ormo M., Remington S J. Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 2306-2311 (1997).

102. Palm GJ, Zdanov A, Gaitanaris GA, Stauber R, Pavlakis GN, Wlodawer A. The structural basis for spectral variations in green fluorescent protein. Nat. Struct. Biol, 4, 361-365 (1997).

103. Shu X, Kallio K, Shi X, Abbyad P, Kanchanawong P, Childs W, Boxer SG, Remington SJ. Ultrafast excited-state dynamics in the green fluorescent protein variant S65T/H148D. 1. Mutagenesis and structural studies. Biochemistiy, 46, 12005-12013 (2007).

104. McAnaney TB, Shi X, Abbyad P, Jung H, Remington SJ, Boxer SG. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 3. Temperature dependence of proton transfer. Biochemistry, 44, 8701-8711 (2005).

105. Stoner-Ma D, Jaye AA, Ronayne KL, Nappa J, Tonge PJ, Meech SR. Ultrafast electronic and vibrational dynamics of stabilized A state mutants of the green fluorescent protein (GFP): snipping the proton wire. Chem. Phys., 350, 193-200 (2008).

106. Nienhaus K, Renzi F, Vallone B, Wiedenmann J, Nienhaus GU. Chromophore-protein interactions in the anthozoan green fluorescent protein asFP499. Biophys. J., 91,4210-4220 (2006).

107. Hoffman R.M. Recent advances on in vivo imaging with fluorescent proteins. Methods Cell Biol., 85, 485-495 (2008)

108. Zipfel W.R., R.M.Williams, W.W.Webb. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat. BiotechnoL, 21,1369-1377 (2003).

109. Girkin J.M., S.Poland, A.J.Wright. Adaptive optics for deeper imaging of biological samples. Curr. Opin. Biotechnol., 20,106-110 (2009)

110. Patterson G, Davidson M, Manley S, Lippincott-Schwartz J. Superresolution imaging using single-molecule localization. Annu. Rev. Phys. Chem., 61, 345-367 (2010).

111. Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol. Rev., 90, 1103-1163 (2010).

112. Chudakov D.M., K.A.Lukyanov. Use of green fluorescent protein (GFP) and its homologs for in vivo protein motility studies. Biochemistry (Mosc.), 68, 952-957 (2003).

113. Kedrin D., B.Gligorijevic, J.Wyckoff, V.V.Verkhusha, J.Condeelis, J.E.Segall, J.van Rheenen. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods, 5,1019-1021 (2008).

114. Chudakov D.M., S.Lukyanov, K.A.Lukyanov. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques, 42, 553-557 (2007).

115. Chudakov D.M., S.Lukyanov, K.A.Lukyanov. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat. Protoc., 2, 2024-2032 (2007).

116. Anderson K.I., J.Sanderson, S.Gerwig, J.Peychl. A new configuration of the Zeiss LSM 510 for simultaneous optical separation of green and red fluorescent protein pairs. Cytometry A, 69, 920-929 (2006).

117. Peter M., S.M.Ameer-Beg, M.K.Hughes, M.D.Keppler, S.Prag, M.Marsh, B.Vojnovic, T.Ng. Multiphoton-FLIM Quantification of the EGFP-mRFPl FRET Pair for Localization of Membrane Receptor-Kinase Interactions. Biophys. J., 88, 1224-1237 (2005).

118. Tramier M., M.Zahid, J.C.Mevel, M.J.Masse, M.Coppey-Moisan. Sensitivity of CFP/YFP and GFP/mCherry pairs to donor photobleaching on FRET determinationby fluorescence lifetime imaging microscopy in living cells. Microsc. Res. Tech., 69, 933-939 (2006).

119. Piston D.W., G.J.Kremers. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem. Sei., 32, 407-414 (2007).

120. Shcherbo D., E.A.Souslova, J.Goedhart, T.V.Chepurnykh, A.Gaintzeva, I.I.Shemyakina, T.W.Gadella, S.Lukyanov, D.M.Chudakov. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnol., 9, 24 (2009)

121. Mutoh H., A.Perron, D.Dimitrov, Y.Iwamoto, W.Akemann, D.M.Chudakov, T.Knöpfel. Spectrally-resolved response properties of the three most advanced FRET based fluorescent protein voltage probes. PLoS ONE, 4, e4555 (2009).

122. Neylon C. Chemical and biochemical strategies for the randomization of protein encoding DNA sequences: library construction methods for directed evolution. Nucleic Acids Res., 32,1448-1459 (2004).

123. Ho S.N., H.D. Hunt, R.M. Horton. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene, 77, 51-59 (1989).

124. Laemmli U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685 (1970).

125. Born M., E. Wolf. Principles of optics: electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. New York: Cambridge University Press. (1997).

126. Hillesheim L.N., Chen Y., Müller J.D. Dual-color photon counting histogram analysis of mRFPl and EGFP in living cells. Biophys. J., 91, 4273-4284 (2006).

127. Nagy A., Wu J., Berland K.M. Observation volumes and {gamma}-factors in two-photon fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophys. J., 89, 2077-2090 (2005).

128. Otwinowski Z., Minor W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol., 276, 307-326 (1997).

129. Storoni L.C., McCoy A.J., Read R.J. Likelihood-enhanced fast rotation functions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., 60, 432-438 (2004).

130. Collaborative Computational Project, Number 4. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., 50, 760-763 (1994).

131. Emsley P., Cowtan K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr DBiol Crystallogr., 60, 2126-3132 (2004).

132. Hooft R.W., Vriend G., Sander C., Abola E.E. Errors in protein structures. Nature, 381, 272 (1996).

133. Laskowski R.A., M. W. MacArthur, D. S. Moss and J. M. Thornton PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures J. Appl. Cry St., 26, 283-291 (1993).

134. Krissinel E, Henrick K. Secondary-structure matching (SSM), a new tool for fast protein structure alignment in three dimensions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., 60, 2256-2268 (2004).

135. Hernandez L, Smirnova T, Kedrin D, Wyckoff J, Zhu L, Stanley ER, Cox D, Muller WJ, Pollard JW, Van Rooijen N, Segall JE. The EGF/CSF-1 paracrine invasion loop can be triggered by heregulin betal and CXCL12. Cancer Res., 69, 3221-3227 (2009).

136. Rasband WS ImageJ. National Institutes of Health, Bethesda, MD, http://rsb.info.nih.gov/ij/ (1997-2006).

137. Wyckoff J, Wang W, Lin EY, Wang Y, Pixley F, Stanley ER, Graf T, Pollard JW, Segall J, Condeelis J. A paracrine loop between tumor cells and macrophages is required for tumor cell migration in mammary tumors. Cancer Res., 64, 7022-7029 (2004).

138. Tsien R.Y. Green fluorescent protein. Annn. Rev. Biochem., 67, 509-544 (1998).

139. Ormo M., Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., Remington S.J. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science, 273, 13921395 (1996).

140. Hosoi H., Mizuno H., Miyawaki A., Tahara T. Competition between energy and proton transfer in ultrafast excited-state dynamics of an oligomeric fluorescent protein red Kaede. J. Phys. Chem. B, 110, 22853-22860 (2006).

141. Remington S.J. Fluorescent proteins: maturation, photochemistry and photophysics. Curr. Opin. Struct. Biol., 16, 714-721 (2006).

142. Bulina M.E., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Chudakov D.M., and Lukyanov K.A. Heterooligomeric tagging diminishes non-specific aggregation of target proteins fused with Anthozoa fluorescent proteins. Biochem. J., 371, 109-114 (2003).

143. Ai H.W., Shaner N.C., Cheng Z., Tsien R.Y., Campbell R.E. Exploration of new. chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins. Biochemistry, 46, 5904-5910 (2007).

144. Mena M.A., Treynor T.P., Mayo S.L., Daugherty P.S. Enhanced blue fluorescent proteins isolated from computationally targeted libraries. Nat. Biotechnol., 24, 1569-1571 (2006).

145. Patterson G.H., Piston D.W., Barisas B.G. Förster distances between green fluorescent protein pairs. Anal. Biochem., 284, 438-440 (2000).

146. Nguyen A.W., Daugherty P.S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nat. Biotechnol., 23, 355-360 (2005).

147. Ohashi T., Galiacy S.D., Briscoe G., Erickson H.P. An experimental study of GFP-based FRET, with application to intrinsically unstructured proteins. Protein Sei., 16, 1429-1438 (2007).

148. Gordon G.W., Berry G., Liang X.H., Levine B., Herman B. Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys. J., 74, 2702-2713 (1998).

149. Subach F.M., Patterson G.H., Renz M., Lippincott-Schwartz J., and Verkhusha V.V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J. Am. Chem. Soc., 132, 6481-6491 (2010).

150. Barondeau D.P., Kassmann C.J., Tainer J.A., Getzoff E.D. The case of the missing ring: radical cleavage of a carbon-carbon bond and implications for GFP chromophore biosynthesis. J. Am. Chem. Soc., 129, 3118-3126 (2007).

151. Subach F.V., Subach O.M., Gundorov I.S., Morozova K.S., Piatkevich K.D., Cuervo A.M., and Verkhusha V.V. Monomeric fluorescent timers that change color from blue to red report on cellular trafficking. Nat. Chem. Biol., 5,118-126 (2009).

152. Zapata-Hommer O., Griesbeck O. Efficiently folding and circularly permuted variants of the Sapphire mutant of GFP. BMC Biotechnol., 3, 5 (2003).

153. Ai H.W., Hazelwood K.L., Davidson M.W., Campbell R.E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods, 5, 401-403 (2008).

154. Piatkevich K.D., Malashkevich V.N., Almo S.C., and Verkhusha V.V. Engineering ESPT pathways based on structural analysis of LSSmKate red fluorescent proteins with large Stokes shift. J. Am. Chem. Soc., 132,10762-10770 (2010).

155. Eskelinen EL, Illert AL, Tanaka Y, Schwarzmann G, Blanz J, Von Figura K, Saftig P. Role of LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Mol. Biol. Cell, 13, 3355-3368 (2002).

156. Patterson G.H., Lippincott-Schwartz J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science, 297, 1873-1877 (2002).

157. Heuser J.E., Anderson R.G. Hypertonic media inhibit receptor-mediated endocytosis by blocking clathrin-coated pit formation. J. Cell Biol., 108, 389-400 (1989).

158. Mao S., Benninger R.K., Yan Y., Petchprayoon C., Jackson D., Easley C.J., Piston D.W., Marriott G. Optical lock-in detection of FRET using synthetic and genetically encoded optical switches. Biophys. J., 94, 4515-4524 (2008).

159. Sorkin A., McClure M., Huang F., Carter R. Interaction of EGF receptor and grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Curr. Biol., 10, 1395-1398 (2000).

160. Yamazaki T., Zaal K., Hailey D., Presley J., Lippincott-Schwartz J., Samelson L.E. Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization. J. Cell Sci., 115, 1791-1802 (2002).

161. Ando R., Mizuno H., Miyawaki A. Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting. Science, 306, 1370-1373 (2004).

162. Rizzo M.A., Springer G.H., Granada B., Piston D.W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat. Biotechnol., 22, 446-449 (2004).

163. Drobizhev M., Tillo S., Makarov N.S., Hughes T.E., Rebane A. Absolute two-photon absorption spectra and two-photon brightness of orange and red fluorescent proteins. J. Phys. Chem. B, 113, 855-859 (2009).

164. Nobes C.D., Hall A. Rho GTPases control polarity, protrusion, and adhesion during cell movement. J. Cell Biol., 144, 1235-1244(1999).

165. Wyckoff J.B., Jones J.G., Condeelis J.S., Segall J.E. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res., 60, 2504-2511 (2000).

Информация о работе

Верхуша, Владислав Витальевич
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Флуоресцентные маркеры для молекулярной и клеточной биологии: флуоресцентные таймеры, постоянно флуоресцирующие и фотоактивируемые белки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы