Спектрально-флуоресцентные свойства KFP и использование этого белка для создания сенсоров, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии

Русанов, Александр Леонидович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Спектрально-флуоресцентные свойства KFP и использование этого белка для создания сенсоров, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Спектрально-флуоресцентные свойства KFP и использование этого белка для создания сенсоров, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии"

На правах рукописи

484ало/

Русанов Александр Леонидович

СПЕКТРАЛЬНО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ СВОЙСТВА КРР И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭТОГО БЕЛКА ДЛЯ СОЗДАНИЯ СЕНСОРОВ, ОСНОВАННЫХ НА ИНДУКТИВНО-РЕЗОНАНСНОМ ПЕРЕНОСЕ ЭНЕРГИИ

Специальность 03.01.04 - «биохимия»

2 7 ЯНЗ 2й11

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА 2010

4843237

Работа выполнена в лаборатории физической биохимии Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского Государственного Университета им. МБ. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор химических наук,

профессор

А.П. Савицкий

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор, чл.-корр. РАН А.Г. Габибов

доктор биологических наук,

профессор

A.A. Красновский

Ведущая организация: Биологический факультет

Московского Государственного

Университета

им. М.В.Ломоносова

Защита состоится «Ю» ■рефрены 2011 г. в часов на заседании

диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.33, строение 1. Автореферат разослан «'#» сгиедъгы 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических

наук

А.Ф. Орловский

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Флуоресценция используется для визуализации процессов клеточной биологии на различных уровнях, от отдельных молекул до целых организмов. Традиционные методы, основанные на флуоресцентных красителях, часто требуют дополнительной очистки меченых соединений и их инвазивного введения внутрь клетки. Эти ограничения можно преодолеть благодаря использованию зеленого флуоресцирующего белка GFP и его гомологов. При этом присоединение их к интересующим белкам, благодаря их относительно небольшой и компактной структуре, слабо или совершенно не влияет на исходные свойства изучаемых белков. Использование флуоресцирующих белков позволяет вести неинвазивное наблюдение экспрессии репортерных генов, внутриклеточного перемещения белков и динамики биохимических сигналов в живых клетках и организмах. Открытие фотопереключаемых белков существенно расширило возможности применения флуоресцирующих белков в молекулярной и клеточной биологии и явилось основой для разработки микроскопии сверхвысокого разрешения. Одним из фотопереключаемых белков является красный белок asCP (использованный, в частности, для метода RESOLFT, достигающего разрешения 50-100 нм), который обладает способностью обратимого фотопереключения между флуоресцирующей и нефлуоресцирующей формами. Однако механизм фотопереключения (разгорания флуоресценции) asCP и его мутантной формы KFP (kindling fluorescent protein, asCP A143G) с оптимизированными свойствами разгорания всё ещё остаётся невыясненным.

Использование методов, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии (FRET) между двумя флуоресцирующими белками позволило существенно увеличить возможности применения этих белков в качестве маркеров в живых клетках для наблюдения за биологическими механизмами и физиологическими функциями клетки. FRET-биосенсоры на основе флуоресцирующих белков имеют ряд преимуществ по сравнению с другими методами, в которых используется конъюгация с синтетическими красителями. Во-первых, они могут быть сконструированы путем генетических манипуляций и доставлены в клетки с помощью трансфекции и последующей экспрессии; во-вторых, им можно придать сигналы внутриклеточной или тканевой локализации, что позволяет вести наблюдение как за органеллами и отдельными клетками, так и за целыми организмами.

Одним из подходов для скрининга противоопухолевых препаратов in vivo является детекция апоптоза в клетках мишенях. Для визуализации процессов in vivo на уровне одной клетки перспективным объектом является семейство каспаз, а именно, каспаза-3, как один из ключевых ферментов, участвующих в развитии процесса апоптоза в клетке. Белковые сенсоры, в основу которых положен принцип индуктивно-резонансного переноса энергии между двумя красными белками, одним из которых является KFP,

наиболее отвечают задачам увеличения эффективности детекции активности каспазы-3 in vitro и от vivo. Измерение кинетик затухания флуоресценции позволяет решить проблему калибровки сенсора, а использование нефлуоресцирующего акцептора избавляет от спектральной контаминации, т.е. попадания эмиссии донора в канал регистрации акцептора, характерную для стандартной методики измерения по интенсивности флуоресценции. Применение красных флуоресцирующих белков позволяет уменьшить автофлуоресценцию тканей и увеличить проницаемость света вглубь тканей.

Таким образом, изучение и характеристика спектрально-флуоресцентных свойств белка KFP является актуальной задачей при разработке новых методов субдифракционной флуоресцентной микроскопии и создании новых сенсоров для детекции ферментативной активности в живых клетках и организмах.

Цели и задачи работы. Целями настоящей работы было изучение спектральных и физико-химических свойств KFP, а также создание и характеристика FRET-сенсора на его основе для детекции активации каспазы-3 in vivo.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. изучить рН-зависимость флуоресценции и положения максимумов эмиссии, возбуждения и поглощения KFP;

2. определить влияние рН на эффективность разгорания и тушения KFP;

3. изучить спектральные свойства и оценить эффективность переноса энергии во FRET-сенсоре на основе двух красных белков;

4. определить эффективность расщепления конструкции под действием каспазы-3;

Научная новизна. Впервые было показано, что флуоресцентные свойства KFP обусловлены набором конформеров, равновесие между которыми определяется значением рН. Исследована зависимость свойства разгорания и тушения флуоресценции KFP в зависимости от рН. Установлено существование в щелочной области рН двух флуоресцирующих конформеров по-разному реагирующих на действие синего света.

Разработана модель для детекции ферментативной активности каспазы-3 in vitro методом флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением. Предлагаемый подход основан на применении красного флуоресцирующего белка TagRFP в качестве донора и хромопротеина KFP в качестве акцептора, в результате чего затухание флуоресценции такой конструкции происходит гораздо быстрее, чем для индивидуального донора. Эффективность переноса энергии в созданной генно-инженерной конструкции составила 51.1%. Методом планарного имиджинга с временным разрешением показана возможность детекции активации апоптоза у животных in vivo. Данная методика позволяет различать флуоресцентные метки с близкими максимумами эмиссии, такие как DsRed2 и TagRFP, что невозможно при использовании обычного метода регистрации по интенсивности.

Практическая значимость. Установленные зависимости разгорания и тушения флуоресценции KFP позволяют расширить применение данного белка в качестве маркера в клеточной и молекулярной биологии, а также в микроскопии сверхвысокого разрешения. Созданная генно-инженерная конструкция на основе двух красных флуоресцирующих белков даёт возможность регистрации ферментативной активности каспазы-3 на клеточном уровне методом флуоресцентной микроскопии с временным разрешением.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (201 ссылка). Диссертация содержит 123 страницы печатного текста, включает 53 рисунка и 5 таблиц.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных и российских конференциях: V Съезд Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008,), XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009), II International symposium Topical problems of biophotonics - 2009 (Nizhny Novgorod - Samara - Nizhny Novgorod, 2009), Школа-конференция Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины 2010 (Москва, 2010), XII International Conference on Laser Applications in Life Sciences 2010 (Oulu, Finland, 2010).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Спектрально-флуоресцентные свойства KFP 1.1. Анализ рН-зависимостей asCP и его мутантов

Применение цветных белков зависит от высокого квантового выхода флуоресценции или от его регулирования внешними параметрами. Нами было показано, что увеличения интенсивности флуоресценции можно добиться не только путем накачки белка интенсивным светом, но также и при изменении рН. Белок asCP и его мутанты практически не флуоресцируют при нейтральных значениях рН, но при титровании в щелочную область рН наблюдается значительное возрастание флуоресценции. Для белка дикого типа заметный рост наблюдается при рН больше 7, для мутанта asCP A143S после достижения рН равного 8, а для KFP при рН более 9.

При этом такое увеличение флуоресценции KFP полностью обратимо: увеличение рН приводит к появлению флуоресценции, в то время как обратное титрование от рН 10. до 7 возвращает белок в нефлуоресцирующее состояние.

Изменение рН приводит также к изменению положения максимума в спектрах флуоресценции белка. В нейтральной области рН синхронно происходит сдвиг в положении максимумов эмиссии и возбуждения флуоресценции КРР, который говорит о том, что в белке происходят конформационные изменения, затрагивающие область хромофора. При этом скачок в положении максимумов наблюдается при более низких значениях рН, чем заметное изменение интенсивности флуоресценции (рис. 1А).

Значительное изменение положения максимума поглощения КРР также наблюдается при варьировании рН. При нейтральных значениях рН максимумы поглощения (рис. 1Б) и возбуждения (рис. 1А) совпадают (565 нм), в то время как по достижению рН равного 8.5 максимум возбуждения резко сдвигается до 571 нм (рис. 1А) и остаётся неизменным при дальнейшем увеличении рН. Данное наблюдение может быть объяснено появлением другой конформации белка с отличающимися флуоресцентными свойствами. При движении в щелочную область рН происходит постепенное уменьшение максимума длины волны поглощения, что может быть интерпретировано, как появление новой мажорной нефлуоресцирующей конформацт, максимум поглощения которой смещён в коротковолновую область.

Сдвиг в положениях максимумов эмиссии и возбуждения происходит при рН 8.5, в то время как заметное увеличение интенсивности флуоресценции наблюдается при рН больше 9. Это факт может быть объяснён следующим образом. При нейтральных рН (ниже 8) в растворе доминирует специфическая белковая конформация с низким квантовым выходом флуоресценции. В щелочной области рН между 8 и 9 возникает другая конформация, для которой максимумы эмиссии и возбуждения заметно отличаются, по сравнению с предыдущей конформацией. Однако доля этой вновь возникшей конформации очень мала и белок в целом флуоресцирует слабо. При рН в районе 10 концентрация этого конформера значительно увеличивается и белок становится флуоресцирующим, что сопровождается возрастанием интенсивности и квантового выхода флуоресценции. Однако доля флуоресцирующего конформера всё ещё слишком мала, чтобы оказывать влияние на сдвиг положения максимума поглощения или её можно было зарегистрировать по изменению спектров поглощения. В процессе титрования в щелочную область рН оптическая плотность образцов уменьшается (рис. 1Б). Эти данные указывают на сложность в идентификации появления новой, рН-индуцированной, флуоресцентной конформации белка при наблюдении за спектрами поглощения.

Таким образом, изменение рН сопровождается сдвигом равновесия между различными конформациями белка, представляющими собой набор флуоресцирующих и нефлуоресцирующих форм.

(А)

Г I

О 5

03 о 5 О X

со

I Ц

со 0

аз

X Ц

сг

605600595590585580575570565560555550-

* а

(Б)

сц ^

0) Э" о с;

о с

568-

566-

564-

562-

У 560-го

558-

* эмиссия <! возбуждение А интенсивность

_—*

РН

— ■ — максимум поглощения оптическая плотность

-400

-300 ф

-200 ®

•100

•1.0

•0,9

КЗ,8

•0,7

6 7 8 9

рН

Рис. 1. (А) Зависимость интенсивности флуоресценции и положения максимумов эмиссии и возбуждения КЯР от рН. (Б) Влияние рН на значение оптической плотности и положение максимума поглощения КРР.

— — — — __ — ------- __

1.2. Кинетики разгорания и тушения КРР

Нами были изучены кинетики разгорания КЯР под действием лазерного излучения с длиной волны 532 нм при различных рН. На рис. 2 приведены результаты для рН 6.42; 8.77 и 10.6. Интенсивность флуоресценции увеличивается и достигает максимального значения через ~ 100 секунд.

ш гг

о а> а

о >

-е-

1200

юоо

800

600

400

200

рН = 10.6 рН = 8.77

рН = 6.42

60 90 120 150 180 210 240 время, сек

Рис. 2. Кинетики разгорания КРР при различных значениях рН.

Наблюдается увеличение максимальной интенсивности флуоресценции при движении в щелочную область, что соответствует данным, полученным при облучении светом низкой интенсивности. При этом в области щелочных рН коэффициент усиления к, высчитываемый как отношение интенсивностей флуоресценции после и до облучения белка светом, практически не меняется при облучении интенсивным зеленым светом. Таким образом, интенсивно флуоресцирующие конформации белка образуются при высоких значениях рН, не требуя при этом накачки светом, в отличие от классического фотоиндуцируемого разгорания.

Была также исследована кинетика тушения флуоресценции при облучении «разгоревшегося состояния» лазером с длиной волны возбуждения 473 нм (рис. 3). При этом было исследовано влияние последовательности включение лазеров, чтобы

выяснить влияет ли синий цвет на разгоревшуюся форму белка или препятствует появлению новой флуоресцирующей формы.

^ 1200

з:

=г

Щ 1000

о (Ц

о.

о >>

с; -9-

.о

800-

600-

о о

т 400

си н х £

200 4

зелёный лазер (532 нм) —•— зелёный (532 нм) + синий (473 нм) лазеры .....л отсутствие облучения

.....т одновременное включение зелёного (532 нм) и

синего (473 нм) лазеров

Уош»

100 200

300

400

500

время, сек

Рис. 3. Кинетика разгорания и тушения КРР при рН = 9.41.

В начальный момент времени белок облучали зеленым лазером, после чего включали синий лазер при работающем зеленом, т.к. разгоревшаяся форма КЯР может быть затушена с помощью синего света. Интенсивность флуоресценции мгновенно падала до некоторого постоянного значения, не изменяющегося с течением времени. Затем белок в течение - 250 секунд не подвергался облучению. Далее одновременно включали синий и зеленый лазеры. При этом было показано, что интенсивность конечного сигнала не зависит от того, какая форма белка (флуоресцирующая или темная) подвергается воздействию излучения.

Исследование рН-зависимостей свидетельствует о том, что увеличение рН приводит к росту остаточной флуоресценции после включения синего лазера (рис. 4), что говорит о накоплении новой флуоресцирующей формы, невосприимчивой к облучению светом с длиной волны 473 нм. В диапазоне рН от 7.81 до 9.80 интенсивность флуоресценции резко увеличивается под действием облучения зелёным светом и достигает максимума за ~ 100 секунд. Синий свет практически полностью тушит индуцированную флуоресценцию. В то же время в области более щелочных рН (10.14) белок уже находится во флуоресцирующем состоянии, не требующем облучения

зелёным светом, а воздействие синего света не приводит к полному тушению флуоресценции.

облучение зелёным включение синего лазера (473 нм)

время, сек

Рис. 4. Кинетики разгорания флуоресценции №Р при облучении зелёным светом (532 нм) и тушения синим светом (473 нм) при различных значениях рН.

Таким образом, набор конформаций белка, возникающий в области щелочных значений рН, может быть разделён на две популяции: первая из них не гасится синим светом и её доля возрастает с увеличением рН, а вторая чувствительна к облучению синим светом и её доля снижается по мере движения в щелочную область рН.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что: 1) интенсивность флуоресценции КРР может быть значительно увеличена в области высоких значений рН; 2) природа увеличения флуоресценции заключается в появлении в щелочной области рН новых белковых конформаций со смещёнными положениями максимумов поглощения, возбуждения и эмиссии, доля которых при кислых и нейтральных рН незначительна; 3) рН-индуцированное разгорание ведёт к увеличению доли флуоресцирующих конформеров, не восприимчивых к действию синего света.

Результаты этих экспериментов могут быть обобщены в виде схемы, представленной на рис. 5.

q- 0.001 q = 0.001 q — 0.02

~~7 8 9 15 рН

Рис. 5. Схема обратимых переходов между тёмными и флуоресцирующими формами №Р. q - квантовый выход, к - коэффициент усиления флуоресценции. Я -флуоресцирующая форма, Я' - тёмная форма белка. Я* и Р?'* - возбуждённые состояния. К - константы равновесия между тёмными и флуоресцирующими конформациями белка.

При низких рН существует равновесие между флуоресцирующей (возбуждение 566 нм, эмиссия 585 нм) и тёмной К'(1) (максимум поглощения 566 нм) формами белка, и доля нефлуоресцирующей фракции существенно больше. Квантовый выход флуоресценции в этом диапазоне рН невысок (д = 0.001 на рис. 5). Облучение интенсивным зелёным светом приводит к увеличению интенсивности флуоресценции более чем в 20 раз (к = 20-30).

При движении в область щелочных рН образуется флуоресцирующая форма Я(2), которая также поглощает на длине волны 584 нм, а флуоресцирует на 600 нм. Образованию этой формы соответствует скачок в положении максимумов эмиссии и возбуждения.

Данная конформация находится в равновесии с соответствующей темной формой Н'{2), поглощающей на 566 нм. Квантовый выход флуоресценции в этом диапазоне также составляет 0.001. Однако при дальнейшем движении в область щелочных рН тёмная

форма Р?'(2) переходит в тёмную форму К'(3) с максимумом поглощения на 554 нм. Р'(3) находится в равновесии с флуоресцирующей формой Я(2), но при этом равновесие сдвигается в сторону флуоресцирующей формы. Происходит резкое увеличение концентрации Р.(2), а, соответственно, возрастает интенсивность и квантовый выход флуоресценции.

Набор новых конформаций белка, возникающий в области щелочных значений рН, также может быть разделён на две популяции: первая из них Р(2)„ не гасится синим светом и её доля возрастает с увеличением рН, а вторая Р(2)Ьч чувствительна к облучению синим светом и её доля снижается по мере движения в щелочную область рН (рис. 6).

Облучение

470 н ?vi

ьш> am

600 ш«

R(2)fl

Рис. 6. Равновесие между двумя флуоресцирующими формами КРР, одна из которых чувствительна к действию синего света (К(2)Ьч), а другая - нет (Н(2)я).

2. FRET-napa на основе двух красных белков 2.1. Обоснование выбора FRET-пары

В качестве донора и акцептора для конструкций на основе индуктивно-резонансного переноса энергии были выбраны красные флуоресцирующие белки TagRFP (максимум возбуждения 555 нм, максимум эмиссии 584 нм) и KFP (максимум возбуждения 580 нм, максимум эмиссии 600 нм), соответственно. TagRFP представляет собой яркий мономерный белок с высоким квантовым выходом флуоресценции (q = 0.48), в то время как KFP - практически нефлуоресцирующий тетрамерный белок (квантовый выход флуоресценции q < 0.001). При этом оба белка не токсичны для клеток. Максимумы эмиссии TagRFP и возбуждения флуоресценции KFP очень близки, что ведёт к хорошему спектральному перекрыванию.

Фёрстеровский радиус для такой пары белков, в предположении свободной ориентации белков относительно друг друга (к2 = 2/3), равен 47 А. На эффективность переноса энергии влияет расстояние между донором и акцептором и относительная ориентация дипольных моментов эмиссии донора и поглощения акцептора. Поскольку диаметр р-бочонка флуоресцирующего белка равен 24 А, минимально возможное расстояние между центрами двух бочонков (и, соответственно, хромофорами) равно 24 А. Эффективность переноса энергии в этом случае составляет 98.2% (для ориентационного фактора к2= 2/3) или 99.7% (для фиксированной ориентации с к2 = 4). Эффективность переноса для других возможных расстояний между донором и акцептором приведена в таблице 1.

Таблица 1. Зависимость эффективности индуктивно-резонансного переноса энергии от значений расстояний между донором и акцептором и от ориентационного фактора.

к2 2/3 4

Г, А 24 45 65 120 24 45 65 120

Е, % 98.2 56.2 12.4 0.4 99.7 88.3 45.3 2.1

2.2. Конструирование плазмиды

Для изучения индуктивно-резонансного переноса энергии в клетках млекопитающих была сконструирована плазмида, содержащая слитые в единой рамке считывания гены красных флуоресцирующих белков TagRFP и KFP, разделенные линкерной последовательностью из 23 аминокислот с сайтом узнавания каспазы-3 -DEVD. В качестве исходного был использован челночный вектор pKindlingRed-N (Evrogen, Россия).

Важным этапом является выбор линкера, содержащего сайт распознавания каспазой-3. Анализ литературных данных показал, что в большинстве случаев используются аминокислотные последовательности, состоящие из гибких и гидрофильных остатков (случайные последовательности из глицина и серина), поскольку предполагается, что они образуют статистический клубок и не взаимодействуют с белковыми доменами. При этом длина линкера, а также его структура могут оказывать существенное влияние на уровень FRET, а также на эффективность экспрессии конструкций в клетках.

Полученная генетическая конструкция, кодирующая слитые гены красных флуоресцирующих белков, разделённых линкерными последовательностями с сайтом узнавания каспазы-3 (рис. 7), позволяет проводить трансфекцию эукариотических клеток для оптимизации индуктивно-резонансного переноса энергии.

pTRK-23

EcoRI Kpnl

BamHI

Pcmv

TagRFP

-L GTGGSGG.DÄ i J^rir,GSCDVPYAT

KFP

Рис. 7. Схема сконструированной рекомбинантной плазмиды для изучения индуктивно-резонансного переноса энергии в эукариотических клетках.

Для изучения свойств рекомбинантных белков in vitro слитые гены TagRFP и KFP, соединенные линкерной последовательностью, были клонированы также в прокариотическом трансляционном векторе рЕТ22Ь.

2.3. Характеристика размеров TagRFP-23-KFP

Экспрессия слитых генов красных флуоресцирующих белков в клетках Е. coli приводит к синтезу полноразмерного продукта с молекулярной массой 54.6 кДа. Очистка полученной конструкции проводилась с помощью ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Чистота выделенного препарата оценивалась с помощью электрофореза и составляла не менее 95%. Наблюдаются две основные полосы - 37 и 20 кДа, в то время как в районе 55 кДа, белковых фракций нет. Поскольку при созревании KFP, в полипептидной цепи образуется разрыв между Cys62 и Met63, при проведении денатурирующего электрофореза, должны наблюдаться две полосы. Первая соответствует полноразмерному TagRFP с линкером и 66 аминокислотами с N-конца KFP (молекулярная масса данного фрагмента около 35 кДа), а вторая -170 аминокислотам с С-конца KFP (20 кДа). Таким образом, данные денатурирующего электрофореза свидетельствуют о полном созревании KFP, входящего в состав конструкции.

Была проведена оценка размеров выделенной конструкции. По результатам гель-фильтрации на носителе Superdex 200 10/300 GL молекулярная масса TagRFP-23-KFP составляет 250 кДа. В результате экспериментов по динамическому светорассеянию было вычислено, что гидродинамический радиус конструкции TagRFP-23-KFP равен 5,7 нм, чго в приближении сферической модели соответствует молекулярной массе равной 208 кДа.

Таким образом, поскольку суммарная молекулярная масса TagRFP, линкера и KFP составляет 54,6 кДа, выделенная белковая конструкция TagRFP-23-KFP, по-видимому, имеет тетрамерную структуру. Вероятно, сохраняется исходное олигомерное состояние KFP.

2.4. Спектральные свойства выделенной конструкции

Существенное снижение интенсивности флуоресценции полученного белка слияния на длине волны эмиссии ТадЯРР, по сравнению с индивидуальным ТадРРР свидетельствует о наличии переноса энергии между донором и акцептором. Максимум спектра поглощения выделенной конструкции ТадРРР-23-КЯР находится между максимумами поглощения индивидуальных ТадРРР и КРР (рис. 8). В то же время он практически идентичен суммарному спектру поглощения ТадРРР и КРР, который был получен сложением коэффициентов экстинкции двух этих белков на соответствующих длинах волн. Таким образом, можно говорить, что соотношение концентраций ТадРРР и КРР в выделенном образце близко к 1:1.

Рис. 8. Спектры поглощения индивидуального ТадР^Р (светло-серая линия), белка слияния ТадКРР-23-КРР (чёрная линия) и КРР (тёмно-серая линия). Прерывистой линией представлен расчётный суммарный спектр поглощения ТадРЧРР-КРР.

2.5. Определение эффективности переноса энергии ТадЯРР в конструкции ТэдЯРР-23-КРР

Для оценки отношения квантовых выходов свободного ТадРРР и ТадРРР в конструкции Тад[ЧРР-23-КРР, было выяснено относительное поглощение Тад1ЧРР в белке слияния. В первую очередь было проведено разложение спектра поглощения КРР на два пика с помощью распределения Гаусса. Были определены положения и полуширины пиков и в дальнейшем данные значения были использованы при разложении спектра поглощения белка слияния (рис. 9). Спектр поглощения ТадРРР-23-КРР был разложен с

Л Л

ТадЯРР-23-КРР

480 500 520 540 560 580 600 620 длина волны, нм

помощью четырёх гауссианов. При этом две компоненты относятся к КРР, а другие две - к Тад(ЧРР.

450 500 550 600 650 длина волны, нм

Рис. 9. Разложение спектра поглощения конструкции TagRFP-23-KFP.

Далее проводилось вычисление вклада TagRFP в суммарную оптическую плотность конструкции TagRFP-23-KFP на длине волны возбуждения флуоресценции. Для этого суммировались оптические плотности каждой из двух компонент TagRFP на длине волны 532 нм (DTag532). Вычислив площадь под спектром эмиссии флуоресценции TagRFP-23-KFP (S ет) при возбуждении светом 532 нм, можно найти отношение Sern/Djag532. Вычисляя такое же отношение для индивидуального TagRFP (S/D), было найдено отношение квантовых выходов TaRFP в составе конструкции и в виде индивидуального белка: n = (Sem/DTag532)/ (S/D) = 48,9%, т.е. в полученной конструкции квантовый выход флуоресценции TagRFP снижается более чем в два раза, по сравнению с квантовым выходом свободного TagRFP. Это свидетельствует о наличии индуктивно-резонансного переноса энергии в полученной конструкции, эффективность которого составляет Е = 100% - 48.9% = 51.1%. Для такой эффективности переноса энергии, среднее расстояние между хромофорами должно быть в пределах от 45 до 65 Ä, в зависимости от значения ориентационного фактора (см. Табл. 1).

2.5. Измерение времён жизни флуоресценции ТадЙРР-23-КРР

Следующим шагом по изучению свойств полученной конструкции было сравнение времён жизни флуоресценции индивидуального белка TagRFP и белка

слияния ТадЯРР-23-КРР (рис. 10). Кинетики затухания флуоресценции белков

5 10 15 20 25

время, не

Рис. 10. Кинетики затухания флуоресценции индивидуального ТадЯРР (серая линия) и белка слияния ТадРРР-23-КРР (чёрная линия).

Затухание флуоресценции ТадР^Р описывается с помощью одной экспоненты и временем жизни т, = 2,42 не. В то же время для конструкции Тад1ЧРР-23-КРР появляется ещё одна компонента т2 = 1,24 не, что также говорит о наличии индуктивно-резонансного переноса энергии, поскольку время жизни флуоресценции в этом случае должно уменьшаться. При этом в случае белка слияния предэкспоненциальный множитель короткоживущей компоненты, отображающий относительное содержание в образце, в 3 раза больше множителя для долгоживущей фракции (табл. 2). Наличие долгоживущей компоненты ТадР!РР-23-КРР может быть приписано фракции белка, в которой отсутствует перенос энергии.

Таблица 2. Времена жизни и предэкспоненциальные множители для ТадЯРР и ТадЯРР-

23-КРР.

т. А, а2

ТадЯРР 2.42 - 2760 -

ТадРРР-23-КРР 2.45 1.24 686 2012

Таким образом, наличие индуктивно-резонансного переноса энергии в белке слияния Тад!ЧРР-23-КРР, было подтверждено двумя различными методами.

3. Определение эффективности расщепления конструкции ТадКРР-23-КРР под действием каспазы-3

3.1. Стационарная флуоресцентная спектроскопия

Для оценки эффективности расщепления конструкции под действием каспазы-3 было проведено измерение спектров флуоресценции до добавления фермента и после инкубации с ним. Белок слияния инкубировался с каспазой-3 в течение 24 часов при температуре 37°С. Интенсивность флуоресценции возрастает приблизительно в два раза (рис. 11), что говорит об эффективном расщеплении линкера под действием протеиназы.

^ 30-

|_Н-.-,-,-,-,-1-,-,-.-1-.-1-.-,-.-1

540 560 580 600 620 640 660 680 700

длина волны,нм

Рис. 11. Спектр флуоресценции конструкции Тад1ЧРР-23-КРР до (чёрная линия) и после (серая линия) обработки каспазой-3.

3.2. флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением

Инкубирование ТадРРР-23-КРР с каспазой-3 также оказывает существенное влияние на времена жизни флуоресценции. Кинетики затухания флуоресценции конструкции до и после инкубирования с ферментом приведены на рис. 12. Расщепление линкера протеиназой ведёт к изменению расстояния между донором и акцептором и, таким образом, влияет на эффективность переноса энергии.

время, не

Рис. 12. Кинетики затухания флуоресценции Тад(^РР-23-КРР до и после инкубирования с каспазой-3.

Затухание флуоресценции для нерасщеплённой конструкции ТадКРР-23-КРР описывается с помощью функции двух экспонент с временами жизни т, = 1.2 не и т2 = 2.4 не. Инкубирование белка слияния с ферментом приводит к увеличению среднего времени жизни флуоресценции. Кинетика затухания становится моноэкспоненциальной со временем жизни т = 2.4 не, таким же, как и для индивидуального белка ТадР^Р (табл. 3). Таким образом, наблюдение за расщеплением ТадРРР-23-КРР под действием каспазы-3 возможно вести в режиме флуоресцентных измерений с временным разрешением.

Таблица 3. Времена жизни флуоресценции TagRFP-23-KFP до и после обработки каспазой-3.

ТадР!РР-23-КРР ТадКРР-23-КРР + каспаза-3

Времена Предэкспоненциальные Времена Предэкспоненциальные

жизни, не множители жизни, НС множители

2.45 686 (25.4%) 2.46 100%

1.24 2012(74.6%)

3.3. Электрофорез и иммуноблоттинг

Для подтверждения эффективного расщепления линкера под действием каспазы-3 был также проведён электрофорез образцов ТадЯРР-23-КРР до и после обработки протеиназой.

В исходной конструкции наблюдаются две основные полосы - 37 и 20 кДа. Первая соответствует полноразмерному ТадРРР с линкером и 66 аминокислотами с М-конца КРР (молекулярная масса данного фрагмента около 37 кДа), а вторая - 170 аминокислотам с С-конца КРР (20 кДа). После инкубации с каспазой-3 полоса 37 кДа исчезает, но появляется полоса в районе 27 кДа (ТадР^Р с участком линкера), что говорит об эффективном расщеплении линкера.

Для идентификации данных полос был проведён вестерн-блоттинг (рис. 13). В качестве первичных антител были выбраны антитела к ТадИРР (Еугодеп, Россия).

□ и и □ □ Рис. 13. 1 - индивидуальный

55-Ш1| TagRFP; 2 - индивидуальный КРР;

/ 3 - маркеры молекулярной массы

белка, кДа; 4 - исходный белок

34 V TagRFP-23-KFP; 5 - конструкция,

обработанная каспазой-3. Чёрной

26+- ■ • стрелкой отмечена полоса 37 кДа, соответствующая нерасщеплёиной конструкции TagRFP-23-KFP.

17* Серой стрелкой - фрагмент

конструкции после расщепления

(TagRFP с участком линкера).

Результаты блоттинга показывают, что данные антитела не связываются с KFP (вторая дорожка). При этом полосы индивидуального TagRFP, конструкции TagRFP-23-KFP и фрагмента расщеплённой конструкции хорошо видны. Исходная конструкция проявляется в виде интенсивной полосы в районе 37 кДа и слабоинтенсивной полосы в области 27 кДа (по-видимому, эта полоса соответствует небольшому количеству TagRFP, появляющемуся в результате неспецифического расщепления белка слияния протеазами клеток E.Coli, от которого не удаётся избавиться в процессе очистки белка). После инкубирования с каспазой-3 проявляется лишь одна полоса 27 «Да.

Таким образом, конструкция TagRFP-23-KFP эффективно расщепляется под действием каспазы-3. Полученный белок может быть использован для исследования свойств белка слияния in vitro методами флуоресцентной микроскопии с временным разрешением.

4. Верификация полученной молекулярной модели на эукариотических клеточных линиях и животных

4.1. Трансфекция эукариотических клеток

В ходе выполнения работы была проведена транзиторная кальциевая трансфекция клеточной линии млекопитающих НЕК293 Phoenix гуманизированной плазмидной ДНК, содержащей ген полученной конструкции TagRFP-23-KFP. Экспрессия белковой конструкции была подтверждена с помощью флуоресцентной микроскопии. Трансфецированные клетки обладали достаточно яркой флуоресценцией.

Была получена клеточная линия млекопитающих А549, трансфецированная плазмидой, кодирующей ген TagRFP-23-KFP. Показана стабильная и эффективная экспрессия и созревание белка слияния. При этом кинетика затухания флуоресценции клеток, несущих ген TagRFP-23-KFP, при 580 нм (узкополосный фильтр 580/14-25 нм, Semrock, США) характеризуется более быстрыми временами, чем кинетика для клеток экспрессирующих TagRFP. Времена жизни флуоресценции белков, экспрессированных в клетках, согласуются с результатами, полученными в экспериментах с очищенными белками. Результаты измерений для флуоресцирующей линии клеток А549 в режиме временного разрешения представлены в таблице 4.

Таблица 4. Времена жизни флуоресценции клеток линии А549, экспрессирующих TagRFP и TagRFP-23-KFP.

A549_TagRFP-23-KFP A549_TagRFP

Времена жизни, не Амплитуды Время жизни, не Амплитуда

2.32 15172(62.6%)

2.42 100%

1.26 9075 (37.4%)

4.2. Изучение активации каспазы-3 в клетках Ме1Ког под действием индукторов апоптоза

Активация каспазы-3 в клетках Ме1Ког, трансфецированных плазмидой рТРК-23 детектировалась с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа с временным разрешением МюгоТ1те 200 (Р1ах1иап1, Германия). Наблюдалось изменение времени жизни флуоресценции клеток при добавлении индуктора апоптоза - антибиотика камптотецина.

Воздействие камптотецина приводит к изменению вида зависимости затухания флуоресценции с течением времени, при этом среднее время жизни флуоресценции увеличивается (рис. 14),

л (о о

1 ф

О)

10 15 20 25 время, не

без индуктора +камптотецин

Рис. 14. Кинетики затухания флуоресценции клеток Ме1Ког рТЯК23 до (черная кривая) и после инкубации с камптотецином (серая кривая).

Эти данные свидетельствуют об эффективном расщеплении линкера каспазой-3. Обработка кинетик затухания флуоресценции клеток возможна с помощью трехэкспоненциальной модели, при этом времена жизни равны 1.2, 2.4 и 4.5 не. Инкубация с камптотецином приводит к увеличению доли фракции имеющей время жизни флуоресценции 2.4 не, в то время как доля содержание фракции с временем жизни 1.2 не снижается. Самое долгое время жизни 4.5 не относится, по-видимому, к автофлуоресценции данного типа клеток.

4.3. Верификация полученной молекулярной модели на животных

Для доказательства возможности регистрации расщепления конструкции на животных был проведён модельный эксперимент, в котором были использованы три флуоресцирующих белка с максимумами флуоресценции в красной области спектра -ТадЯРР, ТадНРР-23-КРР и 0з1Чес12. На рис. 15 представлены результаты в режимах измерения по интенсивности и с временным разрешением.

интенсивность флуоресценции i < время жизни, не

Рис. 15. Результаты ex vivo экспериментов по визуализации трёх различных флуорофоров, помещённых в стеклянные капсулы: капсулы с TagRFP и TagRFP-23-KFP были имплантированы под кожу, тогда как DsRed2 был помещён рядом с экспериментальным животным. Серым цветом обозначен контур тела мыши. Система визуализации позволяет вычислять времена жизни флуоресценции. Вверху слева представлено изображение по интенсивности флуоресценции, вверху справа - по временам жизни флуоресценции. Графики внизу демонстрируют обработку кинетик затухания флуоресценции различных флуорофоров.

Эти данные иллюстрируют преимущества метода регистрации с временным разрешением. Максимумы эмиссии TagRFP и DsRed2 практически идентичны (584 и 583 нм, соответственно), поэтому спектральный метод измерения по интенсивности не позволяет различить эти белки в отличие от способа регистрации с временным разрешением. Средние времена жизни трёх используемых белков, определённые в этом эксперименте, составляют 2.13 не для индивидуального TagRFP, 1.6 не для конструкции TagRFP-23-KFP и 3.35 не для DsRed2, что позволяет дискриминировать эти флуорофоры по времени затухания флуоресценции.

Таким образом, показана возможность идентификации TagRFP-23-KFP и детекции индивидуального TagRFP на животных в режиме измерения кинетик затухания флуоресценции, поскольку данный процесс сопровождается изменением времён жизни флуоресценции. Это является основой для создания метода определения ферментативной активности каспазы-3 in vivo.

5. ВЫВОДЫ

1) Показано, что флуоресцентные свойства KFP обусловлены набором конформеров, равновесие между которыми зависит от значения рН. Движение в щелочную область рН приводит к увеличению концентрации флуоресцирующего конформера.

2) При щелочных рН установлено существование двух флуоресцирующих конформеров по-разному реагирующих на действие синего света. Один из них при облучении светом с длиной волны 470 нм возвращается в нефлуоресцирующее состояние, другой не чувствителен к облучению.

3) Получены плазмиды для экспрессии белка слияния TagRFP-23-KFP в прокариотических и эукариотических клетках.

4) Определена эффективность переноса энергии в созданном сенсоре TagRFP-23-KFP, равная 51.1%, что соответствует расстоянию между белками в 45-65 Á.

5) Под воздействием каспазы-3 на полученный сенсор TagRFP-23-KFP, представляющим собой конструкцию на основе двух красных белков TagRFP и KFP, соединённых линкером с сайтом расщепления каспазой-3, уровень переноса энергии снижается с 51.1% до 0%.

6) Инкубация клеток линии MeIKor, эскпрессирующих белок TagRFP-23-KFP, с индуктором апоптоза камптотецином приводит к исчезновению компоненты со временем жизни флуоресценции равным 1.2 не, что характерно для расщепленной конструкции.

7) Показана возможность дискриминации расщеплённой и нерасщеплённой конструкции на животных /л vivo флуоресцентными методами с временным разрешением.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1) A.L. Rusanov, T.V. Ivashina, L.M. Vinokurov, I.I. Fiks, A.G. Orlova, I.V. Turchin, I.G. Meerovlch, V.V. Zherdeva, and A.P. Savitsky. Lifetime imaging of FRET between red fluorescent proteins. J. Biophotonics, 2010, v. 3(12), p. 774-783.

2) A.L. Rusanov, A.P. Savitsky. Fluorescence resonance energy transfer between fluorescent proteins as powerful toolkits for in vivo studies. Las. Phys. Lett., 2011, v. 8(2), p. 91-102.

Тезисы

1) Савицкий А.П., Саркисов О.M, Немухин А.В., Григоренко Б.Л., Бравая К., Шелаев И., Русанов А. Фемтосекундная кинетика первичных фотопроцессов в разгорающемся белке KFP. Материалы V Съезда Российского фотобиологического общества. Международная конференция «Преобразование света при фотосинтезе», Пущино, 8-13 июня 2008 г., с. 184.

2) Русанов А.Л., Ивашина Т.В., Савицкий А.П. Роль 178 положения в формировании хромофора KFP. Материалы V Съезда Российского фотобиологического общества. Международная конференция «Преобразование света при фотосинтезе», Пущино, 8-13 июня 2008 г., с. 202.

3) Русанов A.J1. Создание и изучение свойств FRET-конструкции на основе двух красных флуоресцирующих белков. XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, 14-17 апреля 2009 г.

4) Rusanov A.L., Ivashina T.V., Savitsky A.P. Substrates for lifetime imaging of the caspase-3 activity. II International symposium Topical problems of biophotonics - 2009, Nizhny Novgorod - Samara - Nizhny Novgorod, 19-24 July 2009, p. 110.

5) Русанов А.П., Савицкий А.П. ИРПЭ-конструкции на основе двух красных флуоресцирующих белков для имиджинга с временным разрешением. Школа-конференция Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины 2010, Москва, 1617 сентября 2010 г., с. 71.

6) I. Turchin, I. Fiks, M. Kleshnin, A. Orlova, A. Rusanov, A. Savitsky. Fluorescence tomography of red fluorescent protein expressed tumors in small animals. XII International Conference on Laser Applications in Life Sciences 2010, Oulu, Finland, 9-11 June 2010, p. 121.

Подписано в печать 22 декабря 2010 г. Объем 1,2 п. л. Тираж 120 экз. Заказ № 991 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Русанов, Александр Леонидович

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Структура GFP-подобных белков

2.2. Применение цветных флуоресцирующих белков

2.3. Фотоактивируемые флуоресцирующие белки

2.4. Фотохимическая конверсия

2.5. Процессы протонирования-депротонирования хромофора в GFP

2.6. Роль планарности и цис-транс изомеризации в фотофизических свойствах флуоресцирующих белков

2.7. Влияние белкового окружения хромофора на свойства флуоресцирующих белков

2.8. Квантово-химическое моделирование процесса разгорания KFP

2.9. Индуктивно-резонансный перенос энергии между флуоресцирующими белками

2.10. Выбор флуоресцирующих белков для метода FRET

2.11. Способы измерения FRET

2.11.1. Спектральный метод

2.11.2. Измерение времён жизни флуоресценции

2.12. Генно-инженерные конструкции для FRET

2.13. Межмолекулярный FRET

2.14. Внутримолекулярный FRET

2.15. Структура линкеров

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Используемые реагенты и оборудование

3.2. Выделение, очистка и трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной ДНК

3.3. Экспрессия и выделение белков с 6-гистидиновым тагом

3.4. Электрофорез белков

3.5. Титрование белков *

3.6. Спектральные измерения

3.7. Кинетические измерения

3.7.1. Кинетики разгорания и тушения флуоресценции KFP

3.7.2. Необратимая фотоконверсия KFP

3.8. Метод получения генетической конструкции для оценки эффективности индуктивно-резонансного переноса энергии

3.8.1. Амплификация генов красных флуоресцирующих белков с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР)

3.8.2. Клонирование генов красных флуоресцирующих белков в экспрессирующихся в про- и эукариотических клетках векторах

3.8.3. Встраивание литерных последовательностей, содержащих сайт узнавания каспазы-З между парой красных флуоресцирующих белков

3.8.4. Конструирование плазмиды pET22b/TagRFP-23-KFP для изучения эффективности индуктивно-резонансного переноса энергии между парой красных флуоресцирующих белков in vitro

3.9. Изучение синтеза рекомбинантного белка TagRFP-23-KFP в клетках Е. Coli

3.10. Очистка рекомбинантного белка TagRFP-23-KFP

3.10.1. Осаждение сульфатом аммония

3.10.2. Ионообменная хроматография

3.10.3. Гель-фильтрация

3.11. Динамическое светорассеяние

3.12. Иммуноблоттинг

3.13. Трансфекция эукариотических клеток

3.14. Измерение времён жизни

3.15. Планарный имиджинг 68 3.15. Определение активности каспазы-3 in vitro

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Спектрально-флуоресцентные свойства KFP

4.1.1. Анализ рН-зависимостей asCP и его мутантов

4.1.2. Кинетики разгорания и тушения KFP

4.1.3. Квантово-механическое - молекулярно-механическое моделирование процесса разгорания

4.1.4. Необратимая фотоактивация KFP

4.2. Обоснование выбора FRET-пары

4.3. Получение и характеристика FRET-пары

4.3.1. Конструирование плазмиды

4.3.2. Свойства полученного белка

4.3.2.1. Характеристика размеров TagRFP-23-KFP

4.3.2.2. Спектральные свойства выделенной конструкции

4.4. Определение эффективности переноса энергии

TagRFP в конструкции TagRFP-23-KFP

4.4.1. Разложение спектров флуоресценции с помощью распределения Гаусса

4.4.2. Измерение времён жизни флуоресценции TagRFP-23-KFP

4.5. Определение эффективности расщепления TagRFP-23-KFP под действием каспазы

4.5.1. Стационарная флуоресцентная спектроскопия

4.5.2. Флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением

4.5.3. Электрофорез и иммуноблоттинг

4.6. Верификация полученной молекулярной модели на эукариотических клеточных линиях и животных

4.6.1. Трансфекция эукариотических клеток

4.6.2. Изучение активации каспазы-3 в клетках

MelKor под действием индукторов апоптоза

4.6.3. Верификация полученной молекулярной модели на животных

Введение Диссертация по биологии, на тему "Спектрально-флуоресцентные свойства KFP и использование этого белка для создания сенсоров, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии"

Флуоресценция используется для визуализации процессов клеточной биологии на различных уровнях, от отдельных молекул до целых организмов [1]. Традиционные методы, основанные на флуоресцентных красителях, требуют инвазивного введения внутрь клетки. Эти ограничения можно преодолеть благодаря использованию зеленого флуоресцирующего белка GFP и его гомологов. При этом присоединение их к интересующим белкам, благодаря их относительно небольшой и компактной структуре, слабо или совершенно не влияет на исходные свойства изучаемых белков [2]. Использование флуоресцирующих белков позволяет вести неинвазивное наблюдение экспрессии репортёрных генов, внутриклеточного перемещения белков и динамики биохимических сигналов в живых клетках и организмах [1].

Зелёный флуоресцирующий белок был впервые выделен в 1962 году из медузы Aequorea Victoria, за 30 лет до того, как была расшифрована последовательность кодирующей этот белок кДНК. Хотя были получены мутанты с голубой, синей и желто-зеленой флуоресценцией, ни для одного из них максимум эмиссии не превышал 529 нм [3]. Открытие новых «GFP-подобных» протеинов из кораллов рода Anthozoa значительно расширило набор цветов доступных для использования в биологических приложениях [4, 5].

Знание и понимание функций ключевых ферментов в метаболических процессах в режиме реального времени - это те задачи, которые решаются с помощью современных достижений в области физики, химии и биологии. Одно событие или процесс могут описываться целым каскадом биохимических реакций и молекулярных событий. В этом случае традиционные методы in vitro не применимы или частично применимы для оценки взаимосвязи индивидуальных молекулярных процессов в клеточных метаболических путях. Таким образом, определение ферментативной активности in vivo в реальном времени остается сложной комплексной задачей. На сегодняшний момент решение таких задач стало возможно при использовании методов исследования, позволяющих вести мониторинг молекулярных событий на уровне одной функционирующей клетки.

FRET-биосенсоры на основе флуоресцирующих белков имеют ряд преимуществ по сравнению с другими методами, в которых используется конъюгация с синтетическими красителями. Во-первых, они могут быть сконструированы путем простых генетических манипуляций и доставлены в клетки с помощью трансфекции и последующей экспрессии; во-вторых, им можно придать сигналы внутриклеточной или тканевой локализации, что позволяет вести наблюдение как за органеллами и отдельными клетками, так и за целыми организмами. Это открывает новые возможности для изучения действия лекарственных препаратов непосредственно на живых организмах, а использование методов с высокой разрешающей способностью позволяет вести наблюдение за динамикой молекулярных процессов внутри живых систем. Визуализация процессов в реальном времени, а также количественная оценка эффективности действия лекарственных средств делают такие биосенсоры перспективным инструментом для проведения доклинического скрининга новых препаратов на лабораторных животных.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Структура СРР-подобных белков

Экспрессия генов флуоресцирующих белков возможна в любых живых клетках, при этом посттрансляционная модификация белка не требует введения дополнительных ферментов, кофакторов или каких-либо других вспомогательных веществ, кроме кислорода, поскольку хромофор образуется путем автокаталитической циклизации и окисления трех аминокислот (в случае вРР это 8ег65-Туг66-01у67) [7]. Этому предшествует образование структуры полого цилиндра ((3-бочонка), внешняя сторона которого образована одиннадцатью антипараллельными р-листами. Диаметр такого цилиндра составляет приблизительно 24 А, а высота 42 А. Хромофор находится внутри этой структуры и связан а-спиральными участками, проходящими вдоль оси бочонка. Короткие фрагменты а-спиралей и петли образуют «крышки», закрывающие цилиндр сверху и снизу. Такой плотно сконструированный бочонок служит, по-видимому, для защиты хромофора, обеспечивая стабильность и устойчивость при нагревании и действии денатурирующих агентов. Структура данного типа характерна для всех флуоресцирующих белков [8]. Хромофор всегда образуется из трех аминокислот, при этом первая из них может быть практически любой, а две другие (Туг и в1у) в природе инвариантны. Методами направленного мутагенеза было показано, что Туг может быть заменен на любую другую ароматическую аминокислоту. И только в1у67 сохраняется во всех флуоресцирующих белках [9], так как он является лучшим нуклеофилом в подобных циклизациях, поскольку создает минимальные стерические затруднения [8].

Белки с синей и зеленой флуоресценцией имеют хромофоры химически идентичные хромофору ОБР, в то время как желтые и красные флуоресцирующие варианты подвергаются дополнительной реакции окисления, в результате которой образуется ацилимин. Возможны также дальнейшие химические превращения, приводящие к образованию хромофоров с уникальными свойствами (рис. 1) [9]. флуоресцирующих белков. Хромофоры вРР и ОзЯес! являются промежуточными соединениями для образования других структур. Рисунок взят из работы [9].

Так, в гРР538 остаток лизина хромофора подвергается циклизации, взаимодействуя с собственной а-карбонильной группой, образуя при этом тетрагидропиридиновое кольцо. В т-Огаг^е треонин взаимодействует с карбонильным атомом углерода, образуя дигидроксиоксазольный цикл. В фотоконвертируемом белке Каес1е путем светоиндуцируемой реакции зеленый хромофор Нлэ-Туг-Иу необратимо переходит в красный, что сопряжено с разрывом цепи. Наконец, в фотоактивируемом «разгорающемся флуоресцирующем белке» (КРТ) хромофор подвергается автокаталитическому гидролизу ацилимина, в результате чего образуется кето-форма. Определяющим в цвете флуоресценции является размер системы сопряжения, при этом локальные эффекты среды, такие как положение заряженных групп внутри белка, могут приводить к сдвигу максимума в спектре поглощения и эмиссии до 20 нм любом направлении [3, 9].

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Русанов, Александр Леонидович

6. выводы

2) При щелочных рН установлено существование двух флуоресцирующих конформеров, по-разному реагирующих на действие синего света. Один из них при облучении светом с длиной волны 470 нм возвращается в нефлуоресцирующее состояние, другой не чувствителен к облучению.

3) Получены плазмиды для экспрессии белка слияния TagRFP-23-KFP в прокариотических и эукариотических клетках.

4) Определена эффективность переноса энергии в созданном сенсоре TagRFP-23-KFP, равная 51.1%, что соответствует расстоянию между белками в 4565 Á.

6) Инкубация клеток линии MelKor, эскпрессирующих белок TagRFP-23-KFP, с индуктором апоптоза камптотецином приводит к исчезновению компоненты со временем жизни флуоресценции равным 1.2 не, что характерно для расщепленной конструкции.

7) Показана возможность дискриминации расщеплённой и нерасщеплённой конструкции на животных ш vivo флуоресцентными методами с временным разрешением.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биосенсоры на основе индуктивно-резонансного переноса энергии между цветными флуоресцирующими белками позволяют наблюдать за широким диапазоном молекулярных событий, такими как белок-белковые взаимодействия, конформационные изменения молекул, каталитические функции ферментов и изменение концентрации биомолекул в живых клетках. Они являются важным инструментом современной клеточной и молекулярной биологии, поскольку обладают уникальными преимуществами, среди которых генетически кодируемая флуоресценция, простота генетических манипуляций и доставки внутрь клетки, возможность легко пометить изучаемые органеллы и ткани.

Однако на данный момент все известные FRJET-пары обладают некоторыми недостатками, что снижает динамический диапазон измерений. Одно из направлений по улучшению FRET-биосенсоров заключается в измерении FRET по временам жизни и в получении новых FRET-nap с модифицированными свойствами за счет изменения ориентационного и дистанционного факторов.

Сенсоры на основе FRET могут быть использованы для наблюдения за сложными и комплексными молекулярными процессами, такими как передача сигналов или изучение метаболических путей внутри трансгенных животных. Возможность in vivo имиджинга в реальном времени позволяет заглянуть вглубь биологических механизмов и физиологических функций клетки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Русанов, Александр Леонидович, Москва

1. В. Giepmans, S. Adams, М. Ellisman, R. Tsien, Science 312, 217 (2006).

2. W. Du, Y. Wang, Q. Luo, B.-F. Liu, Anal. Bioanal. Chem. 386, 444 (2006).

3. R. Tsien, Annu. Rev. Biochem. 67, 509 (1998).

4. M. Matz, A. Fradkov, Y. Labas, A. Savitsky, A. Zaraisky, M. Markelov, and S. Lukyanov, Nat. Biotechnol. 17, 969 (1999).

5. A. Miyawaki, Neuron 48, 189 (2005).

6. K. Truong and M. Ikura,Cur. Opin. in Struct. Biol. 11, 573 (2001).

7. R. Heim, D. Prasher and R. Tsien, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 12501 (1994).

8. H. Зубова, А. Булавина, А.Савицкий, Успехи биологической химии 43, 163 (2003).

9. J. Remington, Curr. Opinion in Struct. Biol. 16, 714 (2006).

10. N. Shaner, P. Steinbach, and R. Tsien, Nat. Meth. 2, 905 (2005).

11. N. Zubova, V. Korolenko, A. Astafyev, A. Petrukhin, L. Vinokurov, O. Sarkisov and A. Savitsky, Biochem. 44, 3982 (2005).

12. Y. Yanushevich, D. Staroverov, A. Savitsky, A. Fradkov, N. Gurskaya, M. Bulina, K. Lukyanov, and S. Lukyanov, FEBS Lett. 511, 11 (2002).

13. R. Campbell, O. Tour, A. Palmer, P. Steinbach, G. Baird, D. Zacharias, and R. Tsien, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99, 7877 (2002).

14. J. Wiedenmann, В. Vallone, F. Renzi, К. Nienhaus, S. Ivanchenko, С. Röcker, and G. Nienhaus, J. Biomed. Opt. 10, 14003 (2003).

15. J. Wiedenmann, S. Ivanchenko, F. Oswald, F. Schmitt, C. Röcker, A. Salih, K.-D. Spindler, and G. Nienhaus, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101, 15905 (2004).

16. T. Kogure, S. Karasawa, T. Araki, K. Saito, M. Kinjo, and A. Miyawaki, Nat. Biotechnol. 24, 577 (2006).

17. E. Galperin, V. Verkhusha, and A. Sorkin, Nat. Meth. 1, 209 (2004).

18. M. Bulina, K. Lukyanov, O. Britanova, D. Onichtchoulc, S. Lukyanov, and D. Chudakov, Nat. Protocols 1, 947 (2006).

19. M. Zimmer, Chem. Rev. 102, 759 (2002).112

20. Н. Зубова, А.Савицкий, Успехи биологической химии 45, 391 (2005).

21. R. Tsien, Annu. Rev. Biochem. 67, 509 (1998).

22. C.-W. Lin, C. Jao, and A. Ting, J. Am. Chem. Soc. 126, 5982 (2004).

23. T. Evers, M. Appelhof, P. de Graaf-Heuvelmans, E. Meijer, and M. Merkx, J. Mol. Biol. 374,411 (2007).

24. A. Terskikh, A. Fradkov, G. Ermakova, A. Zaraisky, P. Tan, A. Kajava, X. Zhao, S. Lukyanov, M. Matz, S. Kim, I. Weissman, and P. Siebert, Science 290, 1585 (2000).

25. V. Belousov, A. Fradkov, K. Lukyanov, D. Staroverov, K. Shakhbazov, A. Terskikh, and S. Lukyanov, Nat. Methods 3, 281 (2006).

26. K. Piatkevich, E. Efremenko, V. Verkhusha, and S. Varfolomeev, Russ. Chem. Rev. 79, 243 (2010).

27. K. Lukyanov, D. Chudakov, S. Lukyanov, and V. Verkhusha, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 885 (2005).

28. S. J. Remington, Curr. Opin. in Struct. Biol. 16, 714 (2006).

29. А.А. Красновский мл., Биохимия, 72, 1311 (2007).

30. A. Jiménez-Banzo, S. Nonell, J. Hofkens, and C. Flors, Biophys. J. 94, 168-172 (2008).

31. J. van Thor, T. Gensch, K. Hellingwerf, and L. Johnson, Nat. Struct. Biol. 9, 37 (2002).

32. D. Chudakov, V. Verkhusha, D. Staroverov, E. Suslova, S. Lukyanov, and K. Lukyanov, Nat. Biotechnol. 22, 1435 (2004).

33. R. Ando, H. Hama, M. Yamamoto-Hino, H. Mizuno, and A. Miyawaki, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 12651 (2002).

34. H. Mizuno, T. Mal, K. Tong, R. Ando, Т. Furuta, M. Ikura, and A. Miyawaki, Mol. Cell 12, 1051 (2003).

35. S. Ivanchenko, C. Rocker, F. Oswald, J. Wiedenmann and G. Nienhaus, J. Biol. Phys. 31, 249 (2005).

36. S. Mckinney, C. Murphy, K. Hazelwood, M. Davidson, and L. Looger, Nat. Methods 6, 131 (2009).

37. H. Tsutsui, S. Karasawa, H. Shimizu, N. Nukina, and A. Miyawaki, EMBO reports 6, 233 (2005).

38. S. Habuchi, H. Tsutsui, A. Kochaniak, A. Miyawaki, and A. van Oijen, PLoS ONE 3: e3944 (2008).

39. N. Gurskaya, V. Verkhusha, A. Shcheglov, D. Staroverov, T. Chepurnykh, A. Fradkov, S. Lukyanov, and K. Lukyanov, Nat. Biotechnol. 24, 461 (2006).

40. K. Lukyanov, A. Fradkov, N. Gurskaya, M. Matz, Y. Labas, A. Savitsky, M. Markelov, A. Zaraisky, X. Zhao, Y. Fang, W. Tan, and S. Lukyanov, J. Biol. Chem. 275, 25879 (2000).

41. D. Chudakov, A. Feofanov, N. Mudrik, S. Lukyanov, and K. Lukyanov, J. Biol. Chem. 278, 7215 (2003).

42. D. Chudakov, V. Belousov, A. Zaraisky, V. Novoselov, D. Staroverov, D. Zorov, S. Lukyanov, and K. Lukyanov, Nat. Biotechnol. 21, 191 (2003).

43. J. Lippincott-Schwartz and G. Patterson, Science 300, 87 (2003).

44. S. Habuchi, R. Ando, P. Dedecker, W. Verheijen, H. Mizuno, A. Miyawaki, and J. Hofkens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 9511 (2005).

45. M. Quillin, D. Anstrom, X. Shu, S. O'Leary, K. Kallio, D. Chudakov, and J. Remington, Biochemistry 44, 5774 (2005).

46. P. Wilmann, J. Petersen, R. Devenish, M. Prescott, and J. Rossjohn, J. Biol. Chem. 280, 2401 (2005).

47. P. Schwille, S. Kummer, A. Heikal, W. Moerner, and W. Webb, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 151 (2000).

48. M. Chen, C. Lambert, J. Urgitis, and M. Zimmer, Chem. Phys. 270, 157 (2001).

49. M. Cotlet, J. Hofkens, M. Maus, T. Gensch, M. Van der Auweraer, J. Michiels, G. Dirix, M. Van Guyse, J. Vanderleyden, A. Visser, and F. De Schryver, J. Phys. Chem. B 105, 4999 (2001).

50. J. Wiedenmann, C. Elke, K.-D. Spindler, and W. Funke, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 14091 (2000).

51. V. Martynov, A. Savitsky, N. Martynova, P. Savitsky, K. Lukyanov, and S. Lukyanov, J. Biol. Chem. 276, 21012 (2001).114

52. V. Zagranichny, N. Rudenko, A. Gorokhovatsky, M. Zakharov, T. Balashova, and A. Arseniev. Biochemistry 43, 13598 (2004).

53. J. Kennis, D. Larsen, I. van Stokkum, M. Vengris, J. van Thor and R. van Grondelle, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101, 17988 (2004).

54. A. Bell, D. Stoner-Ma, R. Wächter, and P. Tonge, J. Am. Chem. Soc. 125, 6919 (2003).

55. S. Habuchi, M. Cotlet, T. Gensch, T. Bednarz, S. Haber-Pohlmeier, J. Rozenski, G. Dirix, J. Michiels, J. Vanderleyden, J. Heberle, F. De Schryver, and J. Hofkens, J. Am. Chem. Soc. 127, 8977 (2005).

56. M. Chattoraj, B. King, G. Bublitz, and S. Boxer, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, 8362 (1996).

57. H. Lossau, A.Kummer, R.Heinecke, F. Pollinger-Dammer, C. Kompa, G. Bieser, T. Jonsson, C. Silva, M. Yang, D. Youvan, M. Michel-Beyerle, Chem. Phys. 213, 1 (1996).

58. J. Petersen, P. Wilmann, T. Beddoe, A. Oakley, R. Devenish, M. Prescott, and J. Rossjohn, J. Biol. Chem. 278, 44626 (2003) .

59. K. Nienhaus, B. Vallone, F. Renzi, J. Wiedenmann, and G. Nienhaus, Acta Crystallogr. D59, 1253 (2003).

60. M. Prescott, M. Ling, T. Beddoe, A. Oakley, S. Dove, O. Hoegh-Guldberg, R. Devenish, and J. Rossjohn, Structure 11, 275 (2003).

61. P. Wilmann, J. Petersen, A. Pettikiriarachchi, A. Buckle, S. Smith, S. Olsen, M. Perugini, R. Devenish, M. Prescott, and J. Rossjohn, J. Mol. Biol. 349, 223 (2005).

62. S. Olsen and S. Smith, J. Am. Chem. Soc. 129, 2054 (2007).

63. X. He, A. Bell, P. Tonge, FEBS Letters 549, 35 (2003).

64. T. Schüttrigkeit, T. von Feilitzsch, C. Kompa, K. Lukyanov, A. Savitsky, A.Voityuk, and M.E. Michel-Beyerle, Chem. Phys. 323, 149 (2006).

65. I. Yampolsky, J. Remington, V. Martynov, V. Potapov, S. Lukyanov, and K. Lukyanov, Biochemistry 44, 5788 (2005).

66. X. He, A. Bell, and P. Tonge, Org. Lett. 4, 1525 (2002).

67. D. Yarbrough, R. Wächter, K. Kallio, M. Matz, and J. Remington, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98, 462 (2001),.

68. M. Seifert, J. Georgescu, D. Ksiazek, P. Smialowski, T. Rehm, B. Steipe, and T. Hola, Biochemistry 42, 2500 (2003).

69. A. Terskikh, A. Fradkov, A. Zaraisky, A. Kajava, and B. Angres, J. Biol. Chem. 277, 7633 (2002).

70. M. Andresen, M. Wahl, A. Stiel, F. Gräter, L. Schäfer, S. Trowitzsch, G.Weber, C. Eggeling, H. Grubmüller, S. Hell, and S. Jakobs, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102, 13070 (2005).

71. N. Henderson and J. Remington, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102, 12712 (2005).

72. K. Bravaya, A. Bochenkova, A. Granovsky, A. Savitsky, A. Nemukhin, J. Phys. Chem. A, 112, 8804 (2008).

73. J. Battad, P. Wilmann, S. Olsen, E. Byres, S. Smith, S. Dove, K. Turcic, R. Devenish, J. Rossjohn, M. Prescott, J. Mol. Biol. 368, 998 (2007).

74. A. Nemukhin, I. Topol, B. Grigorenko, A. Savitsky, J. Collins, J. Mol. Struct. (THEOCHEM), 863, 39 (2008).

75. R. Bizzarri, R. Nifosi, S.Abbruzzetti, W. Rocchia, S. Guidi, D. Arosio, G. Garau, B. Campanini, E. Grandi, F. Ricci, C. Viappiani, F.Beltram, Biochemistry, 46, 5494 (2007).

76. B. Grigorenko, A. Savitsky, I. Topol, S. Burt, A.Nemukhin. J. Phys. Chem. B, 110, 18635 (2006).

77. L. Schäfer, G. Groenhof, A. Klingen, G. Ullmann, M. Boggio-Pasqua, M. Robb, andH. Grabmüller, Angew. Chemie Int. Ed. 2007,119, 530-536.

78. L. Schäfer, G. Groenhof, M. Boggio-Pasqua, M. Robb, and H. Grubmüller, PLoS Comput. Biol. 2008, 4, el000034.

79. M. Martin, F. Negri, and M. Olivucci, J. Am. Chem. Soc. 126, 5452 (2004).

80. B. Grigorenko and A. Nemukhin, Proceedings of SPIE 6449, 6449001 (2007).

81. B. Grigorenko, A. Savitsky, I. Topol, S. Burt, A. Nemukhin. Chem. Phys. Lett. 424, 184 (2006).

82. Li, E. Pham, and K. Truong, J. Biotechnol. Lett. 28, 1971 (2006).116

83. Joseph R. Lakowicz. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Second Edition, 1999, Kluwer Academic/ Plenum Publishers, New York, 367-373.

84. G. Patterson, D. Piston, and B. Barisas, Anal. Biochem. 284, 438 (2000).

85. K. Jensen, L. Martini, and T. Schwartz, Biochem. 40, 938 (2001).

86. J. Vinkenborg, T. Evers, S. Reulen, E. Meijer, and M. Merkx, ChemBioChem 8, 119(2007).

87. S. Shimozono, H. Hosoi, H. Mizuno, T. Fukano, T. Tahara, and A. Miyawaki, Biochem. 45, 6267 (2006).

88. T. Evers, E. van Dongen, A. Faesen, E. Meijer, and M. Merkx, Biochem. 45, 13183 (2006).

89. A. Livesey and J.-C.Brochon, Biophys. J. 52, 693 (1987).

90. J.-C. Brochon, Methods Enzymol. 240, 262 (1994).

91. A. Visser , S. Laptenok, N. Visser, A. van Hoek, D. Birch, J.-C. Brochon5 and J. Borst, Europ. Biophys. J. 39, 241 (2010).

92. M. Matz, A. Fradkov, Y. Labas, A. Savitsky, A. Zaraisky, M. Markelov, and S. Lukyanov, Nat. Biotechnol. 17, 969 (1999).

93. A. Sinicropi, T. Andruniow, N. Ferre, R. Basosi, M. Olivucci, J. Am. Chem. Soc. 127, 11534(2005).

94. A. Nemukhin, B. Grigorenko, A. Savitsky, Acta Naturae, 2, 33 (2009).

95. B. Pollok and R. Heim, Trends in Cell Biol. 9, 57 (1999).

96. Fluorescent Proteins, Methods in Cell Biology, Second Edition, edited by Kevin F. Sullivan, 2008, Academic Press, 382-393.

97. M.Rizzo, G. Springer, B. Granada, and D. Piston , Nat. Biotechnol. 22, 445 (2004).

98. G.-J. Kremers, J. Goedhart, E. van Munster, and T. Gadella, Biochem. 45, 6570 (2006).

99. M. Lelimousin, M. Noirclerc-Savoye, C. Lazareno-Saez, B. Paetzold, S. Le Vot, R. Chazal, P. Macheboeuf, M. Field, D. Bourgeois, A. Royant, Biochem. 48, 10038 (2009).

100. A. Müller-Taubenberger and K. Anderson. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 77, 1 (2007).

101. H. Mizuno, A. Sawano, P. Eli, H. Hama, and A. Miyawaki, Biochem. 40, 2502 (2001).

102. N. Gurskaya, A. Fradkov, A. Terskikh, M. Matz, Y. Labas, V. Martynov, Y. Yanushevich, K. Lukyanov, S. Lukyanov, FEBS Lett. 507, 16 (2001).

103. R. Steinmeyer, A. Noskov, C. Krasel, I. Weber, C. Dees, and G. Harms, J. Fluor. 15, 707 (2005).

104. R. Strack, B. Hein, D. Bhattacharyya, S. Hell, R. Keenan, and B. Glick, Biochem. 48, 8279 (2009).

105. A. Doerr, Nature Methods, 6, 482 (2009).

106. J. Goedhart, J. Vermeer, M. Adjobo-Hermans, L. van Weeren, T. Gadella Jr., PLoS ONE, 2, elOl 1 (2007).

107. O. Zapata-Hommer, O. Griesbeck, BMC Biotechnol. 3, 5 (2003).

108. T. Nagai, A. Sawano, E. Park, and A. Miyawaki, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98, 3197(2001).

109. M. Mank, D. Reiff, N. Heim, M. Friedrich, A. Borst, and O. Griesbeck, Biophys. J. 90, 1790 (2006).

110. Y. Huang, and C. Bystroff, Biochem. 48, 929 (2009).

111. J. Lippincott-Schwartz and G. Patterson, Science 300, 87 (2003). 112.1. Majoul, Int. J. Med. Microbiol. 293, 1 (2004).

112. Y. Yan and G. Marriott, J. Cur. Opinion in Chem. Biol. 7, 635 (2003).

113. A. Harpur, F. Wouters, and P. Bastiaens, Nat. Biotechnol. 19, 167 (2001).

114. M. Pedersen, M. Carmosino, and B. Forbush, J. Biol. Chem. 283, 2663 (2007).

115. E. Zelazny, J. Borst, M. Muylaert, H. Batoko, M. Hemminga, and F. Chaumont, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 104, 12359 (2007).

116. S. Scolari, S. Engel, N. Krebs, A. Pia Plazzo, R. De Almeida, M. Prieto, M. Veit, and A. Herrmann, J. Biol. Chem. 284, 15708 (2009).

117. S. Ganesan, S. Ameer-beg, T. Ng, B. Vojnovic, and F. Wouters, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 103, 4089 (2006).

118. R. Cummings, H. McGovern, S. Zheng, Y. Park, and J. Hermes, Anal. Biochem. 269, 79 (1999).

119. E. Heyduk and I. Heyduk, Anal. Biochem. 248, 216 (1997).

120. P.R. Selvin, Annu. Rev. Biophys. Biomembr. 31, 275 (2002).

121. P.R. Selvin, Nature Struct. Biol. 7, 730 (2000).

122. K. Lundin, K. Blomberg, T. Nordstrom, and C. Lindqvist, Anal. Biochem. 299, 92 (2001).

123. K. Stenroos, P. Hurskainen, S. Eriksson, I. Hemmila, K. Blomberg, and C. Lindqvist, Cytokine 10, 495 (1998).

124. K. Blomberg, P. Hurskainen, and I. Hemmila, Clin. Chem. 45, 855 (1999).

125. S. Kane, C. Fleener, Y. Zhang, L. Davis, A. Musselman, and P. Huang, Anal. Biochem. 278, 29 (2000).

126. E. Lopez-Crapez, H. Bazin, E. Andre, J. Noletti, J. Greinier, and G. Mathis, Nucleic Acid Res. 29, 1 (2001).

127. L. Arslanbaeva, V. Zherdeva, T. Ivashina, L. Vinokurov, A. Rusanov, and A. Savitsky, App. Biochem. and Microbiol. 46, 154 (2010).

128. L. Martin, B. Sculimbrene, M. Nitz, and B. Imperiali, QSAR Comb. Sci. 24, 1149(2005).

129. I. Clark, I. Hill, M. Sikorska-Walker, J. MacManus, and A. Szabo, FEBS Lett. 333,96 (1993). •

130. Maliwal, B.P., Gryczynski, Z., and Lakowicz, J.R., Anal. Chem. 73, 4277 (2001).

131. H. Rajapakse, N. Gahlaut, S. Mohandessi, D. Yu, J. Turner, and L. Miller, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 107, 13582 (2010).

132. J. Kramer, L. Yi, F. Shen, A. Maitra, X. Jiao, T. Jin, and S. Gaffen, J. Immunol. 176,711 (2006).1341. Azpiazu and N. Gautam, J. Biol. Chem. 279, 27709 (2004).

133. T. Weiss, C. Chamberlain, T. Takeda, P. Lin, K. Hahn, and M. Farquhar, Proc.

134. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14961 (2001).

135. B. Camuzeaux, C. Spriet, L. Heliot, J. Coll, and M. Duterque-Coquillaud, Biochem. Biophys. Res. Commun. 332, 1107 (2005).

136. R. Latif, P. Graves, and T. Davies, J. Biol. Chem. 276, 45217 (2001).1381. Majoul, M. Straub, R. Duden, S. Hell, and H.-D. Soling, Dev. Cell 1, 1 (2001).

137. T. Wurch, A. Matsumoto, and P.J. Pauwels, FEBS Lett. 507, 109 (2001).

138. V. Lissandron, A. Terrin, M. Collini, L D'alfonso, G. Chirico, S. Pantano, and M. Zaccolo, J. Mol. Biol. 354, 546 (2005).

139. M. Zaccolo, T. Cesetti, G. Di Benedetto, M. Mongillo, V. Lissandron, A. Terrin, and I. Zamparo, Biochem. Soc. Trans. 33, 1323 (2005).

140. E. Yeow and A. Clayton, Biophys. J. 92, 3098 (2007).

141. I. Gautier, M. Tramier, C. Durieux, J. Coppey, R. B. Pansu, J-C. Nicolas, K. Kemnitz, and M. Coppey-Moisan, Biophys. J. 80, 3000 (2001).

142. K. Yoshitake, S. Waki, and H. Ueda, Biosens. Bioelectr. 23, 1266 (2008).

143. T. Endoh, M. Mie, and E. Kobatake, J. Biotechnol. 133, 413 (2008).

144. A. Rodriguez, J. Condeelis, R. Singer, J. Dictenberg, Semin. Cell. Dev. Biol. 18, 202 (2007).

145. M. Rehm, H. Dussmann, R. Janicke, J. Tavare, D. Kogel, and J. Prehn, J. Biol. Chem. 277, 24506 (2002).

146. K. Luo, V. Yu, Y. Pu, and D. Chang, Biochem.Biophys. Res. Commun. 304, 217 (2003).

147. J. Chiang and K. Truong, Biotechnol. Lett. 27, 1219 (2005).

148. T. Awaji, A. Hirasawa, H. Shirakawa, G. Tsujimoto, and S. Miyazaki, Biochem. Biophys. Res. Comm. 289, 457 (2001).

149. T. Remus, A. Zima, J. Bossuyt, D. Bare, J. Martin, L. Blatter, D. Bers, and G. Mignery, J. Biol. Chem. 281, 608 (2006).

150. A. Tanimura, A. Nezu, T. Morita, R.Turner, and Y. Tojyo, J. Biol. Chem. 279, 38095 (2004).

151. S. De, I. Macara, D. Lannigan, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 96, 235 (2005).

152. T. Endoh, H. Funabashi, M. Mie, and E. Kobatake, Anal. Chem. 77, 4308 (2005).

153. M. Fehr, S. Lalonde, I. Lager, M. Wolff, and W. Frommer, J. Biol. Chem. 278, 19127 (2003).

154. M. Fehr, S. Lalonde, D. Ehrhardt, and W. Frommer, J. Fluor. 14, 603 (2004).

155. M. Fehr, W. Frommer, and S. Lalonde, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 99, 9846 (2002).

156. S. Okumoto, L. Looger, K. Micheva, R. Reimer, S. Smith, and W. Frommer, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 102, 8740 (2005).

157. H. Takanaga, B. Chaudhuri, and W. Frommer, Biochim. Biophys. Acta 1778, 1091 (2007)

158. P. Dittmer, J. Miranda, J. Gorski, and A. Palmer, J Biol Chem. 284, 16289 (2009).

159. A. Tanimura, T. Morita, A. Nezu, A. Shitara, N. Hashimoto, and Y. Tojyo, J. Biol. Chem. 284, 8910 (2009).

160. H. Imamura, K. Nhat, H. Togawa, K. Saito, R. lino, Y. Kato-Yamada,T. Nagai, and H. Noji, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 106, 15651 (2009).

161. A. Yamada, K. Hirose, A. Hashimoto, and M. lino, Biochem. J. 385, 589 (2005).

162. D. Braun, S. Garfield, and P. Blumberg, J. Biol. Chem. 280, 8164 (2005).

163. M. Sato, T. Ozawa, K. Inukai, T. Asano, and Y. Umezawa, Nat. Biotechnol. 20, 287 (2002).

164. A. Ting, K. Kain, R. IClemke, and R. Tsien, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98, 15003 (2001).

165. Y. Wang, E. Botvinick, Y. Zhao, M. Berns, S. Usami, R. Tsien, and S. Chien, Nature 434, 1040 (2005).

166. B. Hall, M. McLean, K. Davis, J. Casanova, S. Sligar, and M. Schwartz, Anal. Biochem. 374, 243 (2007).

167. R. Itoh, K. Kurokawa, Y. Ohba, H. Yoshizaki, N. Mochizuki, and M. Matsuda, Mol. and Cell. Biol. 22, 6582 (2002).

168. A. Collinson, S.Bligh, D. Graham, H. Mott, P. Chalk, N. Korniotis, and P. Lowe, ASSAY and Drug Dev.Technol. 2, 659 (2004).

169. A. Seth, T. Otomo, H. Yin, and M. Rosen, Biochem. 42, 3997 (2003).121

170. C.-W. Lin, C. Jao, and A. Ting, J. Am. Chem. Soc. 126, 5982 (2004).

171. K. Osibow, R. Malli, G. Kostner, and W. Graier, J. Biol. Chem. 281, 5017 (2006).

172. A. Miyawaki, J. Llopis, R. Heim, J. McCaffery, J. Adams, M. Ikura, and R. Tsien, Nature 388, 882 (1997).

173. A.Miyawaki, O. Griesbeck, R. Heim, and R. Tsien, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96,2135 (1999).

174. R. Rudolf, M. Mongillo, P. Magalhaes, and T. Pozzan, J. Cell Biol. 166, 527 (2004).

175. R. Cornea, F. Nitu, S. Graber, K. ICohler, M. Satzer, D. Thomas, B. Fruen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 6128 (2009).

176. S. Diegelmann, A. Fiala, C. Leibold, T. Spall, and E. Buchner, Genesis 34, 95 (2002).

177. M. Hara, V. Bindokas, J. Lopez, K. Kaihara, L. Landa Jr., M. Harbeck, and M. Roe, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, 932 (2004).

178. N. Tsujino, A. Yamanaka, K. Ichiki, Y. Muraki, T. Kilduff, K. Yagami, S. Takahashi, K. Goto, and T. Sakurai, J. Neurosci. 25, 7459 (2005).

179. R. Kerr, V. Lev-Ram, G. Baird, P. Vincent, R. Tsien, and W. Schafer, Neuron 26, 583 (2000).

180. K. Gromova, M. Friedrich, A. Noskov, G. Harms, Biochim. Biophys. Acta 1773, 1759 (2007).

181. M. Bogner and U. Ludewig, J. Fluoresc. 17, 350 (2007).

182. R. Sakai, V. Repunte-Canonigo, C. Raj, and T. Knopfel, Europ. J. of Neurosci. 13, 2314(2001).

183. R. Mitra, C. Silva, D. Youvan, Gene 173, 13 (1996).

184. B. Zhang, Biochem. Biophys. Res. Comm. 323, 674 (2004).

185. A. Gorokhovatsky, V. Marchenkov, N. Rudenko, T. Ivashina, V. Ksenzenko, N. Burkhardt, G. Semisotnov, L. Vinokurov, and Y. Alakhov, Biochem. Biophys. Res. Comm. 320, 703 (2004).

186. B. Schüler, E. Lipman, P. Steinbach, M. Kumke, and W. Eaton, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 102, 2754 (2005).

187. R. Best, K. Merchant, I. Gopich, B. Schüler, A. Bax, and W. Eaton, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 104, 18964 (2007).

188. D. Graham, P. Lowe, and P. Chalk, Anal. Biochem. 296, 208 (2001).

189. F. Chan, R. Siegel, D. Zacharias, R. Swofford, K. Holmes, R. Tsien, and M. Lenardo, Cytometry 44, 361 (2001).

190. T. Ohashi, S. Galiacy, G. Briscoe, and H. Erickson, Prot. Sei. 16, 1429 (2007).

191. M. Schwentker, H. Bock, M. Hofmann, S. Jakobs, J. Bewersdorf, C. Eggeling, S. Hell, Microsc. Res. Tech., 70,269 (2007).

192. E. Merzlyak, J. Goedhart, D. Shcherbo, M. Bulina, A. Shcheglov, A. Fradkov, A. Gaintzeva, K. Lukyanov, S. Lukyanov, T. Gadella, and D. Chudakov, Nature Methods 4, 555 (2007).

193. G. Jekely, Neural Notes 4, 2 (1998).

194. C.-Z. Ni, C. Li, J. Wu, A. Spada, and K. Ely, J. Mol. Recognit. 16, 121 (2003).

195. J. Rotonda, D. Nicholson, K. Fazil, M. Gallant, Y. Gareau, M. Labelle, E. Peterson, D. Rasper, R. Ruel, J. Vaillancourt, N. Thornberry, and J. Becker, Nat. Struct. Mol. Biol. 3, 619 (1996).

196. A. Porter and R. JaEnicke, Cell Death Diff. 6, 99 (1999).

197. N. Thornberry, T. Rano, E. Peterson, D. Rasper, T. Timkey, M. Garcia-Calvo, V. Houtzager, P. Nordstrom, S. Roy, J. Vaillancourt, K. Chapman, and D. Nicholson, J Biol Chem. 272, 17907 (1997).

198. G. Cohen, Biochem. J. 326, 1 (1997).

199. N. Thornberry, Chem. Biol. 5, 97 (1998).

Информация о работе

Русанов, Александр Леонидович
кандидата химических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Спектрально-флуоресцентные свойства KFP и использование этого белка для создания сенсоров, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы