Физико-химические свойства красных флуоресцентных белков и их использование для создания сенсоров, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии

Горященко, Александр Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физико-химические свойства красных флуоресцентных белков и их использование для создания сенсоров, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические свойства красных флуоресцентных белков и их использование для создания сенсоров, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии"

>,5 ^ - На правах рукописи

Горященко Александр Сергеевич

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КРАСНЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ СОЗДАНИЯ СЕНСОРОВ, ОСНОВАННЫХ НА ИНДУКТИВНО-РЕЗОНАНСНОМ ПЕРЕНОСЕ ЭНЕРГИИ

Специальность 03.01.06 - «биотехнология (в том числе бионанотехнологии)»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

13 ПЕК 2012

МОСКВА 2012

005047471

Работа выполнена в лаборатории физической биохимии Федерального государственного бюджетного учреэдения науки Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

доктор химических наук, профессор, зав. лабораторией физиологически активных биополимеров Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института элементоорганических соединений им. В.Н. Несмеянова РАН Игорь Александрович Ямсков

доктор биологических наук, зав. лабораторией биофотоники Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Константин Анатольевич Лукьянов

Защита состоится «25» декабря 2012 г. в «15» часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В, Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «23»ноября 2012 г.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Александр Павлович Савицкий

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учрехедение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

И.К. Сакодынская

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Развитие методов геномики и протеомики позволило определить первичную структуру и пост-трансляционную модификацию большого числа белков и ферментов. В настоящее время актуальной задачей является изучение функционирования белков и ферментов непосредственно в живых клетках и организмах, поскольку это позволило бы понять, под действием каких факторов и на какой стадии того или иного биологического процесса происходит активация или ингибирование исследуемого фермента. Проведение подобных исследований на живых системах стало возможным в результате развития методов биоимиджинга. Одними из наиболее широко применяемых маркеров для биоимиджинга являются цветные флуоресцентные белки, поскольку они представляют собой генетически кодируемые флуоресцентные метки, которые экспрессируются самими клетками и не требуют изучения фармакокинетики их введения в исследуемые системы. Кроме того, в большинстве случаев цветные флуоресцентные белки не являются токсичными, устойчивы к действию протеаз, а палитра полученных на данный момент цветных белков покрывает практически весь диапазон видимого света

Одним из ключевых клеточных процессов, контролируемых группой протеолитических ферментов - каспаз, является апоптоз, или программируемая клеточная гибель. Нарушение регуляции апоптоза приводит к развитию целого ряда тяжелых заболеваний - аутоиммунных, нейродегеративных, патологии системы крови и злокачественным опухолям. Изучение процесса апоптоза позволит понять патогенез этих заболеваний, а в дальнейшем, возможно, разработать новые лекарственные средства. Центральным ферментом апоптоза является так называемая эффекторная каспаза-3, так как на ней сходятся два пути активации апоптоза - митохондриальный и рецепторный, и кроме того она является основным эффекторным ферментом апоптоза.

Ранее нами был создан биосенсор на каспазу-3, названный TagRFP-23-KFP, который основан на явлении индуктивно-резонансного переноса энергии - FRET. Данный FRET-сенсор обладает флуоресценцией в красной области спектра, что позволяет снизить уровень фоновой флуоресценции, а также увеличивает глубину проникновения возбуждающего света внутрь тканей. Применение практически не флуоресцирующего белка KFP в качестве акцептора позволило решить проблему перекрывания спектров флуоресценции донора и акцептора, кроме того, данный сенсор позволяет детектировать активность каспазы-3 по изменению времени жизни флуоресценции донора, что в отличие от регистрации изменения интенсивности флуоресценции является концентрационно-независимым методом.

Поскольку оптические свойства различных клеточных линий могут существенно различаться, актуальной задачей является оценка возможности детекции активности

каспазы-3 с помощью разработанного сенсора ТадРРР-23-КРР в различных опухолевых моделях, в частности, имеющих сильную пигментацию.

Важным вопросом также является применимость данного сенсора для детекции ферментативной активности в различных клеточных органеллах. Поскольку значение рН в клеточных органеллах существенно варьируется - от 4,5 в лизосомах до 8,5 в аппарате Гольджи, актуальной задачей является изучение зависимости флуоресцентных свойств компонент разработанного сенсора от значения рН среды.

При использовании КРР в качестве тушителя в сенсоре ТадРРР-23-КРР недостатком является способность КРР к разгоранию, то есть существенному увеличению квантового выхода под действием интенсивного зеленого света, что может привести к зависимости флуоресцентных свойств сенсора от мощности возбуждающего излучения. Согласно литературным данным, замена глицина в 148 положении на аспарагин в белке КРР позволяет получить нефлуоресцирующий и не разгорающийся под действием интенсивного зеленого света мутантный белок КРР-в148М. Однако, свойства указанного мутантного белка изучены лишь качественно, поэтому актуальной задачей является количественная характеристика флуоресцентных свойств белка КРР-С148Ы и его способности к разгоранию под действием интенсивного зеленого света, а также изучение его физико-химических свойств.

Наконец, новаторским подходом является применение сразу нескольких сенсоров и одновременная детекция активности нескольких ферментов или слежение за какими-либо параметрами клетки. Для этого актуальным является создание и изучение физико-химических и спектральных свойств биосенсора на основе пары дальнекрасных флуоресцентных белков, сигнал которого можно было бы детектировать одновременно с сигналом разработанного сенсора ТадРРР-23-КРР.

Цели и задачи работы. Целями настоящей работы было изучение физико-химических и спектральных свойств красных флуоресцентных белков и создание на их основе РКЕТ-сенсоров для детекции активности каспазы-3.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. продемонстрировать возможность детекции активности каспазы-3 с помощью сенсора ТадКРР-23-КРР в клетках опухолевой линии В16, обладающих сильной пигментацией;

2. изучить зависимость флуоресцентных свойств белка КРР от значения рН;

3. изучить спектральные и физико-химические свойства белка КРР с заменой С148М;

4. изучить спектральные и физико-химические свойства РРЕТ-сенсора на основе дальнекрасных белков РиэюпРес! и Оес^БИка;

5. продемонстрировать расщепление сенсора на основе белков РизюпЯес! и Сес^Ика под действием каспазы-3;

Научная новизна. Была продемонстрирована возможность детекции активности каспазы-3 с помощью сенсора TagRFP-23-KFP в клетках меланомы мыши В16, обладающих сильной пигментацией; по изменению времени жизни флуоресценции TagRFP.

Было показано появление в кислой области pH новых спектральных форм KFP; первая из них характеризуется поглощением на 450 нм и может быть идентифицирована как фракция с нейтральной формой хромофора, вторая флуоресцирует на 530 нм и ее появление может быть объяснено образованием катионной формы хромофора в результате переноса протона в возбужденном состоянии.

Проведена количественная характеристика флуоресцентных свойств белка KFP с заменой G148N и его способности к разгоранию под действием интенсивного зеленого света, а также показано, что замена G148N приводит к изменению олигомерного состояния KFP с тетрамера на димер. Впервые получен и охарактеризован FRET-сенсор на каспазу-3 на основе дальнекрасных белков FusionRed и Dedushka. Эффективное расщепление субстрата на основе белков FusionRed и Dedushka каспазой-3 in vitro показано по изменению параметров флуоресценции и электрофоретическим методом.

Практическая значимость. Установленная зависимость спектральных свойств KFP от pH позволяет оценить возможность его использования для создания сенсоров, имеющих локализацию в различных клеточных компартментах. Замена G148N в белке KFP позволяет уменьшить его олигомеризацию, что дает возможность уменьшить олигомеризацию биосенсоров на основе красных флуоресцирующих белков. Созданные генно-инженерные конструкции на основе двух красных и двух дальнекрасных флуоресцирующих белков дают возможность регистрации ферментативной активности каспазы-3, а в перспективе - использовать пару разработанных биосенсоров для одновременного мониторинга активности двух различных каспаз.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (202 ссылки). Диссертация содержит 134 страницы печатного текста, включает 68 рисунков и 3 таблицы.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных и российских конференциях: Школа-конференция «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины» (Москва, 2010,), третья международная научно-практическая конференция «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине (Санкт-Петербург, 2012), Programmed Cell Death in Biology and Medicine» (Москва, 2012), IV Съезд биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), 20th International Conference on Advanced Laser Technologies ALT'12 (Thun, Switzerland, 2012), Russian-Chinese Workshop on Biophotonics and Biomedical Optics (Saratov, Russia, 2012).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Характеристика клеточной линии B16-TR23K

Ранее созданный в нашей лаборатории FRET-биосенсор на каспазу-3 TagRFP-23-KFP был успешно опробован на модели клеток аденокарциномы легкого человека и позволил детектировать активность каспазы-3 по изменению времени жизни флуоресценции донора.

Однако, оптические свойства различных клеточных линий могут существенно различаться. В частности, в линиях, имеющих сильную пигментацию, детекция сигнала сенсора по изменению интенсивности флуоресценции сильно затруднена или вообще невозможна, поэтому возможность применения сенсора TagRFP-23-KFP и метода детекции по изменению времени жизни флуоресценции донора решено было опробовать на модели опухолевой линии меланомы мыши В16, имеющих сильную пигментацию.

Линия клеток B16-TR23K, экспрессирующая сенсор TagRFP-23-KFP, была получена путем трансфекции клеток В16 плазмидной ДНК pTR23K методом липосомальной трансфекции.

Флуоресценция клеток клеточной линии B16-TR23K in vitro была подтверждена при помощи флуоресцентной микроскопии. На Рис. 1 приведены микрофотографии опухолевых клеток исходной меланомы В16(А) и флуоресцирующей меланомы В16-TR23K (Б).

Рисунок 1. Получение трансфицированных клеток В16-ТР23К. А - меланома В16, Б-меланома В16-ТР23К (Мкоп-ТЕ2000и, х 20, экспозиция 1с).

Полученное методом РЫМ распределение времени жизни флуоресценции клеток В16-ТР23К, обработанных цисплатином, продемонстрировало бимодальное распределение средних времен жизни флуоресценции с максимумами 2 и 2,4 не соотвественно (Рис. 2).

Рисунок 2. Изображение клеток В16-ТК23К, обработанных цисплатином, полученное методом РИМ. Внизу приведено распределение средних времен жизни флуоресценции по всему кадру.

Полученное изображение наглядно демонстрирует, что два разных времени жизни флуоресценции возникают из-за наличия двух субпопуляций клеток, обладающих различными временами жизни флуоресценции. В одной субпопуляции (среднее время жизни флуоресценции 1,9-2 не) клеток время жизни флуоресценции соответствует полученному нами ранее времени жизни флуоресценции нерасщепленного субстрата ТадЯРР-гЗ-КРР (Рис. 3).

Рисунок 3. Распределение времени жизни флуоресценции клетки В16-ТК23К, не содержащей активной каспазы-3 (клетка 1 на Рис. 2).

Другая субпопуляция имеет заметно большее среднее время жизни флуоресценции (2,4 не). Это время жизни флуоресценции соответствует индивидуальному белку ТадЯРР, то есть клетки этой субпопуляции подверглись апоптозу и содержат расщепленный субстрат ТадРРР-23-КРР (Рис. 4) и таким образом эти клетки содержат активную каспазу-

ЕЯ

¡"«1

_Время, не__

Рисунок 4. Распределение времени жизни флуоресценции клетки В16-ТР23К, содержащей активную каспазу-3 (клетка 2 на Рис. 2).

Таким образом, нами продемонстрирована возможность детекции активности каспазы-3 в живых клетках пигментированной меланомы мыши В16, экспрессирующей РРЕТ-сенсор на каспазу-3 ТадРРР-23-КРР, методом РЫМ.

2. Свойства КРР в кислой области рН 2.1. Спектрально-флуоресцентные свойства КРР в кислой области рН

Зависимость начальной флуоресценции КРР от рН имеет характерную куполообразную форму. При низких значениях рН флуоресценция белка падает, что говорит о его денатурации. По мере увеличения рН начальная флуоресценция КРР возрастает, достигая максимума при рН 4,3, после чего вновь падает, причем при рН 7,3 она практически нулевая, что соответствует переходу белка в нефлуоресцирующее состояние (Рис. 5), тогда как при рН выше 9, как было показано ранее, наблюдается существенное увеличение интенсивности флуоресценции, причем данное явление является полностью обратимым как при щелочных, так и при кислых значениях рН.

220 л

200

180

160

140

О Ф

с; 120 -в-

л 100 §

х ш

80 60 40 20 0

рн

Рисунок 5. Зависимость интенсивности флуоресценции КРР в начальный момент времени от рН в буфере 0.1 М СН3СООЫа, 0.2 М СН3СООМН4. Возбуждение флуоресценции на 530 нм, детекция - на 590 нм.

Спектр поглощения КРР в кислой области рН демонстрирует падение поглощения на 560 нм с течением времени, в то время как на 450 нм появляется новая полоса поглощения (Рис.6).

О минут

Длина волны,нм

Рисунок 6. Временная зависимость спектра поглощения КРР в буфере 0.1М СНзСООЫа, 0.2 М СН3СООМН,, рН 4,5.

Спектр возбуждения флуоресценции КРР также показывает увеличение интенсивности флуоресценции белка с течение времени, причем помимо основного пика возбуждения на 560 нм появляется новый, ранее неизвестный пик - на 450 нм. (Рис. 7),

■ел

Длина волны, нм

Рисунок 7. Временная зависимость спектра возбуждения флуоресценции КРР в буфере 0.1 М СН3СОО№, 0.2 М СН3СООМН4, рН 4,5. Детекция на 590 нм.

Что касается спектров флуоресценции, то при возбуждении флуоресценции на 530 нм наблюдается один максимум на 590 нм (Рис. 8), тогда как при возбуждении флуоресценции на 455 нм помимо основного максимума (590 нм) появляется еще один -на 530 нм, ранее не описанный (Рис. 9).

Длина волны,нм

Рисунок 8. Временная зависимость спектра эмиссии КРР при возбуждении флуоресценции на 530 нм в буфере 0.1М СН3СООМа, 0.2 М СН3СООЫН4, рН 4,5.

-0 минут

-10 минут

-20 минут

120 минут-^-ч -30 минут

40 минут

Л/^Ой -50 минут

500

550

600

650

700

Длина волны, нм

Рисунок 9. Временная зависимость спектра эмиссии КРР при возбуждении флуоресценции на 455 нм в буфере 0.1М СН3СООМа, 0.2 М СН3СООМН4, рН 4,5.

Таким образом, в кислой среде наблюдается увеличение флуоресценции КРР. При этом в спектре поглощения появляется новая полоса - 450 нм, которая согласно результатам квантово-химических расчетов соответствует форме КРР с нейтральным хромофором. При этом в спектре флуоресценции при возбуждении на 455нм наблюдаются 2 пика — 530 и 590 нм. Пик на 590 нм соответствует анионной форме хромофора. Максимум на 530 нм вероятнее всего соответствует форме КРР с катионным хромофором, образующимся в результате процесса переноса протона на атом азота имидазолинонового кольца хромофора в возбужденном состоянии (Рис. 10).

Ои215 I

Н|з197

НО

I*-NN

Агд92

Рисунок 10. Перенос протона на хромофор КРР в возбужденном состоянии.

Такой перенос протона становится возможным благодаря существенному изменению значения рКа атома азота имидазолинонового кольца хромофора в возбужденном состоянии - с кислого (рКа 3,7, основное состояние) на основное ( рКа 8,9, возбужденное состояние), что делает его акцептором протона.

Гипотеза о появлении в кислой области рН формы белка, содержащей протонированный хромофор и флуоресцирующей на 530 нм была проверена измерением кинетического изотопного эффекта.

Были получены кинетики затухания флуоресценции КРР при рН 3,94 в Н20 и 020 и регистрации на 590 нм (соответствует флуоресценции анионной формы хромофора) и

520 нм (предположительно соответствует флуоресценции катионной формы хромофора) (Рис. 11).

Рисунок 11. Начальные участки кривых затухания флуоресценции КРР в Н20 и 020, рН 3,94. Возбуждение флуоресценции на 405 нм.

Анализ кривых затухания флуоресценции КРР в Н20 и 020 показал, что при регистрации на 590 нм кривые затухания совпадают, тогда как регистрация на 520 нм демонстрирует некоторую задержку кинетики затухания образца КРР 020 по сравнению с образцом в Н20.

Различие скорости переноса и Н* от молекулы растворителя на хромофор КРР является причиной различия кинетик затухания флуоресценции в Н20 и Р20. Этот результат говорит о наличии кинетического изотопного эффекта, который подтверждает гипотезу о переносе протона в возбужденном состоянии и появлении в возбужденном состоянии протонированной формы хромофора КРР в кислой области рН.

2.2. Изучение кинетического изотопного эффекта

-НгО, детекция на 520 нм

-Н20, детекция на 590 нм

-О О, детекция на 520 нм

Время, не

2.3. Кинетики разгорания и тушения флуоресценции КРР

Нами было изучено изменение флуоресцентных свойств КРР под действием лазерного излучения с длиной волны 532 нм в кислой области рН. На рис. 12 приведены результаты для рН 4,02.

■ Разгорание флуоресценции » Повтор через 10 минут

1400 -,

В 400 -

X 200 -

0-1-.-1---,-.-,-.-,-.-,-,

О 20 40 ео ВО 100

Время (сек)

Рис. 12. Кинетики разгорания флуоресценции КРР при рН 4,02. Возбуждение флуоресценции на 532 нм, регистрация - на 590 нм.

В кислой области рН КРР изначально имеет высокий квантовый выход флуоресценции, и облучение зеленым светом приводит к росту флуоресценции примерно на 10%. Таким образом, при кислых значениях рН образуются интенсивно флуоресцирующие конформации белка, не требующие при этом накачки светом в отличие от классического фотоиндуцируемого разгорания.

Была также исследована кинетика тушения флуоресценции при рН 4,02 флуоресцирующей формы КРР лазером с длиной волны возбуждения 405 нм.

В начальный момент времени белок облучали зеленым лазером, после чего включали синий лазер при работающем зеленом. Облучение зеленым светом с последующим включением синего (длина волны 405 нм) лазера не приводит к тушению флуоресценции КРР (Рис. 13).

- Разгорание флуоресценции Повтор через 10 минут_|

Время (сек)

Рисунок 13. Флуоресценция КРР при облучении зеленым лазером (532 нм) с последующим включением синего (405 нм) при рН 4,02. Момент включения синего лазера выражен скачком сигнала. Регистрация флуоресценции на 590 нм.

При облучении образца КРР при рН 4,02 только синим лазером (405 нм) уровень флуоресценции возрастал пропорционально мощности и сохранялся в течение всего эксперимента, причем варьирование мощности облучения не приводило к тушению флуоресценции при регистрации как на 519 нм (Рис.14), так и на 590 нм (Рис. 15).

- Мощность лазера 90 мВ Мощность лазера 30 МВ

- Мощность лазера 9,7 мВ

"**—ТГ""*' *1 ■ И |н 1|_п*)41 »ГЦ П Г1Ц Ц|_

Время (сек)

Рисунок 14. Зависимость флуоресценции КРР от мощности облучения синим лазером (405 нм) при рН 4,02. Регистрация флуоресценции на 519 нм.

■ Мощность лазера 90 мВ —• Мощность лазера 30 мВ —Мощность лазера 9,7 мВ

=Г 250 -

!Т • • * •

во

100

Время (сек)

Рисунок 15. Зависимость флуоресценции КРР от мощности облучения синим лазером (405 нм) при рН 4,02. Регистрация флуоресценции на 590 нм.

Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют о том, что: 1) при кислых значениях рН интенсивность флуоресценции КРР как на 520 нм, так и на 590 нм существенно возрастает по сравнению с нейтральным рН; 2) К росту флуоресценции на 520 нм приводит появление формы КРР с катионным хромофором, доля которой при нейтральных рН незначительна; 3) Главным отличием эффекта разгорания КРР при кислых значениях рН от эффекта разгорания КРР в щелочной области рН является отсутствие флуоресцирующих конформеров, восприимчивых к действию синего света.

Использование в качестве акцептора во РРЕТ-паре нефлуоресцирующих хромобелков решает проблему перекрывания спектров флуоресценции донора и акцептора. Согласно литературным данным, введение мутации в148Ы в КРР позволяет сделать белок не флуоресцирующим и неразгорающимся, что позволяет путем минимальных изменений в структуре разработанного в нашей лаборатории РИЕТ-сенсора на каспазу-3 ТадРРР-23-КРР наделить его указанным преимуществом.

Размер белка КРР-С148Ы определяли с помощью гель-фильтрационной хроматографии (Рис. 16) и методом динамического светорассеяния (Рис. 17).

Целевой белок собирали по поглощению на 560 нм. На хроматограмме присутствует один пик, который соответствует, молекулярной массе около 63 кДа.

3. Свойства белка КРР с заменой С148М

3.1. Определение размеров хромопротеина КРР-Ы48Ы

200

150

14,3 мл, 63,4 кДа

-280 пт -560 пт

3 О с

100-

0 5 10 15

Объем, мл

Рисунок 16. Гель-фильтрация КРР-С1481\1 на носителе 5ирегс1ех 200 10/300 вЬ. Регистрация поглощения выполнялась на двух длинах волн - 280 и 560 нм.

В результате экспериментов по динамическому рассеянию было вычислено, что гидродинамический радиус белка КРР-в148М равен 3,5 нм, что в приближении сферической модели соответствует молекулярной массе, равной 61 кДа (рис. 17).

О 30

и га 2 *

0,01 0,10 1,00 10,00 100,00 1.0Е+3 1,0Е+4

Радиус, нм

Рисунок 17. Размер частиц КРР-С148Ы по результатам экспериментов по динамическому светорассеянию.

Таким образом, поскольку рассчитанная молекулярная масса КРР-0148М составляет 25,9 кДа, выделенный образец хромопротеина представляет собой димер.

По данным ПААГ-электрофореза в элюате наблюдаются две основные полосы - 19 и 9 кДа, в то время как в районе 26 кДа присутствует только следовое количество белка (Рис. 18). Поскольку при созревании КРР-С148№ в полипептидной цепи образуется разрыв, при проведении денатурирующего электрофореза должны наблюдаться две полосы. Первая соответствует 170 аминокислотам с С-конца КРР-вШЫ (17 кДа), а вторая - 66 аминокислотам с М-конца КРР-в148М (молекулярная масса данного фрагмента около 9 кДа). Таким образом, данные денатурирующего электрофореза и анализ денситограммы показали, что выделенный образец содержит 85% созревшей формы КРР-С148Ы и в элюате находится чистый образец КРР-С148Ы.

о^-Л

26 \а г

19 9

Расстояние (пиксели)

Рисунок 18. Справа - ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия фракции КРР-С148Ы после гель-фильтрации. Слева - денситограмма линейного участка, обозначенного желтой линией.

Результаты экспериментов по гель-фильтрации и динамическому светорассеянию КРР-в148М оказались неожиданными, поскольку в литературе такой замене приписывали только потерю свойства разгорания белка.

Тетрамер КРР представляет собой димер димеров, в которых мономеры ориентированы антипараллельно друг относительно друга. Каждый мономер взаимодействует с двумя другими мономерами в тетрамере, образуя два разных интерфейса - для связи мономеров в димер и связи димеров между собой. Поскольку замена С148Ы приводит к разрушению тетрамерной структуры при сохранении димерной, логично предположить, что эта мутация нарушает взаимодействия между димерами белка. Анализ кристаллической структуры тетрамера КРР показал, что аминокислота в 148 положении действительно попадает в область интерфейса димеров (Рис.19). 01у148 при формировании тетрамера взаимодействует с остатками Р11е198, РИе200 и Ме151 (Рис. 20). Вероятно, существенно больший размер аспарагина по сравнению с глицином приводит к стерическим затруднениям во взаимодействии димеров, что препятствует формированию тетрамера.

Рисунок 19. Структура тетрамера КРР. Синим цветом выделен остаток глицина-148.

Рисунок 20. Интерфейс тетрамеризации КРР. Зеленым цветом выделен глицин-148, остатки Р1пе198, РЬе200 и Ме151 представлены в виде поверхности, доступной растворителю.

3.2. Кинетики разгорания и тушения флуоресценции КРР-Ы48Ы

Нами были получены кинетики разгорания под действием лазерного излучения с длиной волны 532 нм при рН 8,8. В качестве образца сравнения использовали КРР той же концентрации в том же буфере. Сравнение полученных результатов (Рис. 21) показывает, что замена глицина в 148 положении на аспарагин действительно делает КРР неразгорающимся.

—Разгорание флуоресценции КРР

—•— Разгорание флуоресценции КРР, повтор через 10 минут * Разгорание флуоресценции КРР-0148М

V Разгорание флуоресценции КРР-Р148И. повтор через 10 минут

10 20 30 40 50 60 70

Время (сек)

Рисунок 21. Сравнение кинетик разгорания KFP и мутантного белка KFP-G148N в буфере 20 mM Tris-HCI, 150 тМ NaCI, рН 8,8. Возбуждение флуоресценции на 532 нм, регистрация - на 590 нм.

3.3. Спектральные свойства белка КРР-в148Ы

Нами были получены спектры образцов КРР и мутантного белка КРР-С148Ы, имеющих одинаковую оптическую плотность в максимуме поглощения (Рис. 22).

Рисунок 22. Спектры поглощения KFP и мутантного белка KFP-G148N в буфере 20 mM Tris, 150 тМ NaCI, 500 тМ имидазол, рН 7,6.

Максимум поглощения мутантного белка KFP-G148N и исходного белка совпадают, однако спектр поглощения мутантного белка отличается от спектра KFP более выраженным плечом на 520 нм.

В спектрах флуоресценции наблюдается смещение максимума флуоресценции с 598 нм в случае KFP до 591 нм для мутантного белка, а также в 2,2 раза большая интенсивность флуоресценции последнего (Рис. 23).

Длина волны, нм

Рисунок 23. Спектры флуоресценции KFP и мутантного белка KFP-G148N в буфере 20 mM Tris, 150 тМ NaCI, 500 тМ имидазол, рН 7,6. Возбуждение флуоресценции на 530 нм.

При этом в отличие от исходного белка КРР спектры возбуждения и флуоресценции КРР-в148Ы демонстрируют наличие форм белка с нейтральным и катионным хромофором уже при нейтральных значениях рН (Рис. 24,25)

крр-смви

Длина волны,нм

Рисунок 24. Нормированные спектры возбуждения флуоресценции КРР и мутантного белка КРР-в148Ы в буфере 0.1М СН3СОО№, 0.2 М СН3СООМН4, рН 7,0. Регистрация флуоресценции на 620 нм.

-КРР, возбуждение флуоресценции на 455 нм

КРР~3143Ы, возбуждение флуоресценции на 455 нм КРР, возбуждение флуоресценции на 530 им _КРР-6148М, возбуждение флуоресценции на 530 нм

Длина волны, нм

Рисунок 25. Нормированные спектры флуоресценции КРР и мутантного белка КРР-в148Ы в буфере 0.1 М СН3СОО№, 0.2 М СН3СООИН4, рН 7,0.

Что касается зависимости флуоресцентных свойств КРР-в148Ы от рН, то как и в случае КРР наблюдается рост флуоресценции белка при смещении как в кислую, так и в щелочную область рН, но при этом в отличие от исходного белка положения максимумов

возбуждения и флуоресценции мутантного белка КРР-С148М изменяются в пределах 5 нм (Рис. 26).

• Положение максимума возбуждения флуоресценции

Рисунок 26. Зависимость флуоресцентных свойств белка KFP-G148N от pH.

4. Свойства сенсора FusionRed-Linkerl-Dedushka

Для обеспечения возможности одновременной детекции активности сразу двух ферментов нами был разработан сенсор на основе FRET-пары дальнекрасных белков Fusion Red и Dedushka. Для изучения свойств данного сенсора в качестве линкера была использована последовательность LKDEVDGDEVDGAS, также распознаваемая каспазой-3, но отличающаяся наличием двух повторов DEVD, что должно способствовать увеличению эффективности расщепления сенсора ферментом.

Экспрессия слитых генов флуоресцирующих белков FusionRed и Dedushka в клетках Е. coli приводит к синтезу полноразмерного продукта с молекулярной массой 53,6 кДа.

4.1. Определение размеров сенсора FusionRed-Linkerl-Dedushka

Определение размера полученной конструкции проводили с помощью гель-фильтрации и методом динамического светорассеяния. Результаты гель-фильтрации говорят о том, что субстрат FusionRed-Linkerl-Dedushka в основном выходит в виде фракции, молекулярная масса которой составляет около 437 кДа, следовательно, так как масса цельной конструкции составляет 53,6 кДа, белок выходит в форме октамера (Рис. 27).

Рисунок 27. Гель-фильтрация окрашенной фракции , полученной из лизата клеток осаждением сульфатом аммония и отдиализованной в течение ночи к буферу 20 мМ ТрисхНС1, 150 мМ NaCI, рН 8,8. Регистрацию поглощения вели на 280 нм (синяя линия) и 560 нм (красная линия). Пунктирной линией обозначен момент введения образца.

Ре-хроматография фракции, соответствующей молекулярной массе 437 кДа, демонстрирует, что образец выходит в виде фракции, молекулярная масса которой составляет около 463 кДа, то есть преобладающим олигомерным состоянием FusionRed-Linkerl-Dedushka действительно является октамер (Рис. 28).

Объем, мл

Рисунок 28. Ре-хроматография фракции FusionRed-Linkerl-Dedushka, соответствующей молекулярной массе 437 кДа. Элюирующий буфер - ТрисхНС1, 150 мМ NaCI, pH 8,8. Регистрацию поглощения вели на 280 нм (синяя линия) и 560 нм (красная линия). Пунктирной линией обозначен момент введения образца.

В результате экспериментов по динамическому светорассеянию было вычислено, что гидродинамический радиус белка FusionRed-Linkerl-Dedushka равен 6,2 нм, что в приближении сферической модели соответствует молекулярной массе, равной 244 кДа, соответствующей тетрамерной форме белка (Рис. 29).

6,2 нм, 244 кДа

0,01 0,10 1.00 10,00 100,00

Радиус, НМ

Рисунок 29. Размер частиц РиэюпКесШпкеМ-ОеаизЬка по результатам экспериментов по динамическому светорассеянию.

Таким образом, белок слияния РивюпКей-ипкеМ-ОеЬизЬка представляет собой тетрамер, имеющий тенденцию к октамеризации при повышении концентрации (как в случае гель-фильтрации).

По данным ПААГ-электрофореза в элюате находится достаточно чистый образец РиэюпВесШпкеИ-ОесШвЬка. При этом наблюдаются две основные полосы - 55 и 46 кДа, в то время как в районе 26 кДа белковых фракций практически нет (Рис. 30). Поскольку при созревании РиэюпКес! в полипептидной цепи образуется разрыв, наблюдаемые полосы можно сопоставить соответственно форме субстрата с несозревшим Ячвю^ес) (53,6 кДа) и с зрелым РиБЮлЯес!, содержащим разрыв полипептидной цепи (46,3 кДа).

116 66.2 45

25 18.4 14.4

55 46

О 200 ш

£ 150

(

__ 55 46

100 150 200

Расстояние (пиксели)

Рисунок 30. - ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия фракции Рив'гапНесШпкеМ-ОеЬизЬка после гель-фильтрации. Левая дорожка - маркеры молекулярной массы белка, кДа. Справа приведена денситограмма линейного участка, обозначенного желтой линией.

Таким образом, анализ денситограммы показал, что выделенный образец содержит 54% несозревшей и 46% созревшей формы РивюпКесШпкегЧ-ОейизЬка, то есть РиэюпКесМ-ткеМ-ОесШвЬка экспрессируется в виде смеси созревшего и несозревшего белка, в котором отсутствует разрыв полипептидной цепи.

4.2. Определение эффективности переноса энергии РиБ/олЯей в конструкции Ри5шпИе<1-ипкег1-Ое<1и5Ька

Для оценки отношения квантовых выходов свободного РизюпИес! и РиэюпКес! в конструкции РизюпРес1-ипкег1-Оес^зИка было рассчитано относительное поглощение Ривюп1Чес) в конструкции. В первую очередь было проведено разложение спектра поглощения РизюпР!ес1 на два пика с помощью распределения Гаусса (Рис. 31).

0,16

-0,02 -,-,-,-,---,-,-,-,-,-,-,-,-,

450 500 550 600 650 700 750 SOO

Длина волны, нм

Рисунок 31. Разложение спектра поглощения FusionRed на Гауссовы полосы. Были определены положения и полуширины пиков и в дальнейшем данные значения были использованы при разложении спектра поглощения конструкции (Рис. 32). Спектр поглощения FusionRed-Linkerl-Dedushka был разложен с помощью четырёх гауссианов. При этом две компоненты относятся к FusionRed, а другие две - к Dedushka.

Длина волны, нм

Рисунок 32. Разложение спектра поглощения конструкции Ри5юпРей-ипкег1-Dedushka на Гауссовы полосы.

Далее проводилось вычисление вклада FusionRed в суммарную оптическую плотность конструкции FusionRed-Linkerl-Dedushka на длине волны возбуждения флуоресценции. Для этого суммировались оптические плотности кахедой из двух компонент FusionRed на длине волны 530 нм (DFuSionRed53o)- Вычислив площадь под спектром эмиссии флуоресценции FusionRed-Linkerl-Dedushka (Sem) при возбуждении светом 530 нм, можно найти отношение Sem/DFusionRed530. Вычисляя такое же отношение для индивидуального FusionRed (S/D), было найдено отношение квантовых выходов FusionRed в составе конструкции и в виде индивидуального белка: п =

(Sem/DFusionRed53oV(S/D) = 76%, т.е. в ПОЛуЧвННОЙ КОНСТРУКЦИИ ПРОИСХОДИТ ИНДуКТИВНО-

резонансный перенос энергии, эффективность которого составляет Е = 100% - 76% = 24%.

4.3. Спектральные свойства выделенной конструкции

Снижение интенсивности флуоресценции полученного белка слияния FusionRed-Linkerl-Dedushka на длине волны эмиссии FusionRed по сравнению с индивидуальным FusionRed на 22% свидетельствует о наличии переноса энергии между донором и акцептором и хорошо соотносится с рассчитанным значением эффективности переноса энергии, равным 24% (Рис. 33).

Рисунок 33. Спектры флуоресценции индивидуального FusionRed (черная линия) и белка слияния FusionRed-Linkeг1-Dedushka (красная линия). Возбуждение флуоресценции на 530 нм.

Нормированные спектры флуоресценции индивидуального Fus¡onRed и белка слияния FusionRed-L¡nker1-Dedushka демонстрируют сдвиг максимума последнего в сторону больших длин волн, что также свидетельствует о наличии переноса энергии в конструкции (Рис. 34).

Длина волны, нм

Рисунок 34. Нормированные спектры флуоресценции индивидуального РиэюпКес! (черная линия) и белка слияния РиБЮпКесШпкеМ-ОеЬиБЬка (красная линия). Возбуждение флуоресценции на 530 нм.

4.4. Определение эффективности расщепления конструкции Риа10пЯес/-Цпкег1-ОеЬизЬка под действием каспазы-3

Для оценки эффективности расщепления конструкции под действием каспазы-3 было проведено измерение спектров флуоресценции до добавления фермента и после инкубации с ним. Белок слияния инкубировался с каспазой-3 в течение 24 часов при температуре 15°С. В результате инкубации с каспазой-3 наблюдается увеличение интенсивности флуоресценции образца сенсора Ри5юпР?ес1-ипкег1-0ес1и5Ька на 30%, что хорошо согласуется с данными об эффективности переноса энергии в конструкции (Рис. 35).

Длина волны, нм

Рисунок 35. Спектр флуоресценции конструкции FusionRed-Linkerl-Dedushka до (чёрная линия) и после (синяя линия) обработки каспазой-3. Возбуждение флуоресценции на 530 нм. Буфер 50 mM HEPES, рН 7.4, 100 тМ NaCI, 0.1% CHAPS, 10 тМ DTT, 0.1 тМ ЭДТА, 10% глицерин.

Для подтверждения эффективного расщепления линкера под действием каспазы-3 был также проведён электрофорез исходных образцов FusionRed-Linkerl-Dedushka и после обработки каспазой-3 (рис. 36).

116

66,2 57

47,5

30 28

45 35

1 2 3

Рисунок 36. ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия, 4-15% полиакриламидный гель. Перед нанесением образцы прогревались в течение 5 мин. на кипящей водяной бане. 1 - маркеры молекулярной массы белка, кДа; 2 - исходный белок, 3 - конструкция, обработанная каспазой-3.

|В исходной конструкции наблюдаются две основные полосы - 57 и 47,5 кДа. Первая соответствует конструкции Ри5юпКес1-ипкег1-Оес1и5Ька с несозревшей формой РизюпРес!, а вторая зрелой конструкции. После инкубации с каспазой-3 полоса 47,5 кДа исчезает,' но появляется полоса в районе 28 кДа (0ейиз1пка с участком линкера) и 20 кДа (фрагмент РиэгапЯей), что говорит об эффективном расщеплении линкера (см. Таблицу 1)-

Масса, кДа

Фрагменты субстрата с учетом разрыва ПП цепи Фрагменты после расщепления

1-й ОЕУО 2-й ОЕУО Оба ОЕУЭ

46,3 7,2 26,3 20 7,2 26,8 19,5 7,2 26,3 19,5 7,2 0,5

Таблица 1. Рассчитанные массы компонентов субстрата Ри$юпР?ес1-ипкег1-Dedushka до и после расщепления линкера.

Таким образом, конструкция РизюпЯесМ-ткеМ-ОеЬивЬка эффективно расщепляется под действием каспазы-3.

5. ВЫВОДЫ

1. Продемонстрирована возможность детекции активности каспазы-3 с помощью сенсора TagRFP-23-KFP в клетках меланомы мыши В16, обладающих сильной пигментацией; по изменению времени жизни флуоресценции TagRFP.

2. Обнаружено появление в кислой области рН новых спектральных форм KFP; первая из них характеризуется поглощением на 450 нм и может быть идентифицирована как фракция с нейтральной формой хромофора, вторая флуоресцирует на 530 нм и ее появление на основании данных по кинетическому изотопному эффекту в дейтерированной воде может быть объяснено образованием катионной формы хромофора в результате переноса протона в возбужденном состоянии.

3. Продемонстрировано, что при нейтральном значении рН мутантный белок KFP-G148N обладает в 2,2 раза более яркой флуоресценцией, чем исходный белок; в отличие от KFP спектры флуоресценции мутантного белка KFP-G148N демонстрируют наличие фракций с нейтральным и катионным хромофором при нейтральных значениях рН.

4. Показано, что замена G148N приводит к изменению олигомерного состояния KFP с тетрамера на димер.

5. На основании изучения свойств сенсора каспазы-3 на основе белков FusionRed и Dedushka: показано, что он представляет собой тетрамер, в котором эффективность индуктивно-резонансного переноса энергии от FusionRed к Dedushka составляет 24%. Показано расщепление субстрата на основе белков FusionRed и Dedushka каспазой-3 in vitro по изменению параметров флуоресценции и электрофоретическим методом.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Rusanov A.L., Mironov V.A., Goryashenko A.S., Grigorenko B.L., Nemukhin A.V., Savitsky A.P. «Conformational partitioning in pH-induced fluorescence of the kindling fluorescent proteip (KFP)» // J Phys Chem B. (2011);115(29):9195-201.

2. Rusanov A.L., Ivashina T.V., Vinokurov L.M., Goryashenko A.S., Zherdeva V.V., Savitsky A.P., «FRET-sensor for imaging with lifetime resolution» // Laser Applications in Life Sciences, edited by Matti Kinnunen; Risto Myllyla. Proceedings of the SPIE, Volume 7376, pp. 737611-1-6(2010).

3. Лапшин Г.Д., Горященко A.C., Хренова М.Г, Русанов A.J1, Ивашина Т.В, Жердева В В., Савицкий А.П. «Оптимизация длины линкера в генетически кодируемых сенсорах каспазы-3» // Современные проблемы науки и образования (2011),-№6, (приложение "Биологические науки"), стр. 18

Тезисы

1. А.С. Горященко, А.П. Савицкий «Создание генетически кодируемого субстрата для in vivo определения активности каспазы-3» // Школа-конференция «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины» 16-17 сентября 2010, Москва.

2. Горященко А.С., Жердева В.В., Щербо Д.С., Чудаков Д.М., Савицкий А.П. «Генетически-кодируемый FRET-субстрат каспазы-3 на основе дальнекрасных флуоресцирующих белков» // Сборник статей третьей международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» 26-28 апреля 2012, Санкт-Петербург.

3. Goryashchenko A.S., Zherdeva V.V., Shcherbo D.S., Chudakov D.M., Savitsky A.P. «Far-red fret-sensor for determination of caspase-3 activity» // Материалы конференции «Programmed Cell Death in Biology and Medicine» 21-22 июня 2012,Москва.

4. Горященко A.C., Хренова М.Г., Ивашина T.B., Савицкий А.П. «Физико-химические и ■флуоресцентные свойства белка KFP с заменой G148N» // Материалы IV Съезда биофизиков России, Симпозиум Ш«Физика - медицине и экологии», 20 - 26 августа 2012 года г. Нижний Новгород, стр.55.

5. Goryashchenko A,S., Rusanov A.L., Mironov V.A., Nemukhin A.V., Savitsky A.P. «Fluorescent properties of the kindling fluorescent protein (KFP) at acidic pH values» // 20th International Conference on Advanced Laser Technologies ALT'12, 2-6 September 2012, Thun, Switzerland, pp. 369-370.

6. Alexander P. Savitsky, V.V. Zherdeva, I.G. Meerovich.M.G. Khrenova, A.S. Goryashchenko,«Fluorescence molecular bioimaging in drug design and screening» // Russian-Chinese Workshop on Biophotonics and Biomedical Optics, September 26-28, 2012, Saratov, Russia, p. 17.

Принято к исполнению 22 ноября 2012 г.

Исполнено 23 ноября 2012 г.

Объем 1,5 п.л.

Тираж 120 экз.

Заказ №31230

Оттиражировано на ризографе в 000«К0ПИМАСТЕР»

ИНН/КПП 7718871342\771801001

Адрес: 107076, г. Москва, Колодезный пер, д 144, оф.636

www.copyma5ter.bi2

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Горященко, Александр Сергеевич

Используемые сокращения.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Структура цветных флуоресцентных белков.

2.2. Фотоактивируемые флуоресцентные белки.

2.3. Влияние рН на спектральные свойства флуоресцентных белков.

2.4. Влияние окружения хромофора на разгорание фотоактивируемых флуоресцентных белков.

2.5. Олигомеризация цветных флуоресцентных белков.

2.6. Флуоресцентный резонансный перенос энергии.

2.7. Выбор FRET-пары.

2.8. Определение эффективности FRET.

2.8.1. Спектральные методы.

2.8.2. Методы, основанные на измерении времени жизни флуоресценции.

2.9. Биосенсоры на основе флуоресцентных белков.

2.9.1. Используемые FRET-пары.

2.9.2. Применение FRET-биосенсоров на основе флуоресцентных белков.

2.10. Постановка цели работы.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Оборудование.

3.2. Реактивы.

3.3. Использованные методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Анализ специфичности гидролиза сенсора TagRFP-23-KFP.

4.2. Определение эффективности гидролиза сенсора TagRFP-23-KFP под действием каспазы-3.

4.3. Характеристика клеточной линии В16-ТБ123К.

4.4. Свойства КРР в кислой области рН.

4.4.1. Спектрально-флуоремцентные свойства КРР в кислой области рН.

4.4.2. Изучение кинетического изотопного эффекта.

4.4.3. Кинетики разгоранил и тушения флуоресценции КРР.

4.5. Свойства белка КРР с заменой G148N.

4.5.1. Определение размеров хромопротеина КРР~а48М.

4.5.2. Кинетики разгоранил и тушения флуоресценции КРР-вШМ.

4.5.3. Спектральные свойства белка КРР-С148М.

4.6. Изучение экспрессии сенсора ТЫ-23-С.

4.7. Свойства сенсора Еи8ЮпИе(1-1лпкег1-Ое(1и811ка.

4.7.1. Определение размеров сенсора Р1топИей.-Ыпкег1-БейизНка.

4.7.2. Определение эффективности переноса энергии Р1топ11е(1 в сенсоре РтюпКеЛ-Ыпке^-Вейткка.

4.7.3. Спектральные свойства выделенной конструкции.

4.7.4. Определение эффективности расщепления сенсора FusionRed-Linkerl-Dedushka под действием каспазы-3.

5. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физико-химические свойства красных флуоресцентных белков и их использование для создания сенсоров, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии"

Флуоресцирующие белки широко применяются для визуализации процессов клеточной биологии на различных уровнях, от отдельных молекул до целых организмов [1]. Они являются удобными генетически кодируемыми маркерами, имеющими компактные размеры, низкую токсичность и стабильную структуру. Кроме того, реакция образования хромофора в таких белках является автокаталитической, поэтому они могут быть экспрессированы практически в любых живых организмах. Первый представитель этого класса белков, зеленый флуоресцирующий белок, был впервые выделен в 1962 году из медузы Aequorea Victoria. В настоящее время создано множество GFP-подобных протеинов, покрывающих практически весь видимый спектр [2].

Методы визуализации, основанные на явлении флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) позволяют изучать взаимодействие целевых белков или органелл между собой. С помощью FRET-биосенсоров на основе флуоресцентных белков возможно детектировать изменение параметров клетки, таких, как рН и мембранный потенциал, определять концентрации различных веществ - перекиси водорода, ионов Са , СГ. Использование FRET-сенсоров как субстратов различных киназ и протеаз позволяет проводить прямой мониторинг ферментативной активности. Так, FRET-сенсоры на каспазу-3 - один из центральных ферментов апоптоза, на котором сходятся митохондриальный и рецепторный пути активации протеолитического каскада, можно использовать для оценки агрессивности патологических процессов и эффективности действия противоопухолевых лекарственных средств, направленных на активацию апоптоза.

Открытие фотоактивируемых флуоресцентных белков, существенно увеличивающих квантовый выход при облучении светом определенной длины волны, позволило проводить селективную фотоактивацию меченных такими белками биологических структур и определять скорость их перемещения. Фотоактивируемые флуоресцентные белки также нашли б применение в методах сверхразрешающей флуоресцентной микроскопии, таких как RESOLFT и PALM. При низких же интенсивностях возбуждающего излучения подобные белки могут использоваться как тушители во FRET-сенсорах, что приводит к увеличению динамического диапазона измерений.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Горященко, Александр Сергеевич

5.ВЫВОДЫ

4. Показано, что замена G148N приводит к изменению олигомерного состояния KFP с тетрамера на димер.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сенсор Та§11РР-23-КРР позволяет проводить определение активности каспазы-3 в живых клетках. При этом даже наличие сильной пигментации клеточной линии не является препятствием для проведения измерений. Однако зависимость флуоресцентных свойств КБР от рН и от мощности возбуждающего излучения ограничивает применение разработанного сенсора в различных клеточных органеллах и приборную базу исследований. Введение в КЕТ мутации 0148М приводит к мутантному белку, флуоресценция которого не зависит от интенсивности возбуждающего света. Кроме того, данный белок является димером, что позволяет повысить доступность линкера для каспазы-3. Наконец, разработанный сенсор на основе дальнекрасных белков РизюпЯес! и ВеёшИка, в данной работе также использованный для определения активности каспазы-3, путем изменения линкера в дальнейшем может быть использован вместе с сенсором Та§Б?РР-23-КРР для одновременной детекции активности двух ферментов, например двух различных каспаз.

7. СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Rusanov A.L., Mironov V.A., Goryashenko A.S., Grigorenko B.L., Nemukhin A.V., Savitsky A.P. «Conformational partitioning in pH-induced fluorescence of the kindling fluorescent protein (KFP)» // J Phys Chem B. (2011); 115(29):9195-201.

3. Лапшин Т.Д., Горященко A.C., Хренова М.Г, Русанов А.Л, Ивашина Т.В, Жердева В.В., Савицкий А.П. «Оптимизация длины линкера в генетически кодируемых сенсорах каспазы-3» // Современные проблемы науки и образования (2011),-№6, (приложение "Биологические науки"), стр. 18

Тезисы

4. Горященко А.С., Хренова М.Г., Ивашина Т.В., Савицкий А.П. «Физико-химические и флуоресцентные свойства белка KFP с заменой G148N» // Материалы IV Съезда биофизиков России, Симпозиум Ш«Физика -медицине и экологии», 20 - 26 августа 2012 года г. Нижний Новгород, стр.55.

6. Alexander P. Savitsky, V.V. Zherdeva, I.G. Meerovich,M.G. Khrenova, A.S. Goryashchenko,«Fluorescence molecular bioimaging in drug design and screening» // Russian-Chinese Workshop on Biophotonics and Biomedical Optics, September 26-28, 2012, Saratov, Russia, p. 17.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Горященко, Александр Сергеевич, Москва

1. Giepmans B.N.G., Adams S.R., Ellisman M.H., Tsien R.Y. The fluorescenttoolbox for assessing protein location and function. // Science 2006, 312, 217-24.

2. Day R.N., Davidson M.W. The fluorescent protein palette: tools for cellularimaging. // Chem Soc Rev 2009, 38, 2887-921.

3. Shimomura O., Johnson F. H., Saiga Y. Extraction, purification and properties ofaequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. // J Cell Comp Physiol 1962, 59, 223-39.

4. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W., Prendergast F.G., Cormier M.J.

5. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. // Gene 1992, 111,229-33.

6. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W., Prasher D. Green fluorescent proteinas a marker for gene expression. // Science 1994, 263, 802-805.

7. Heim R., Prasher D.C., Tsien R.Y. Wavelength mutations and posttranslationalautoxidation of green fluorescent protein. // Proc Nail Acad Sci USA 1994, 91, 12501^4.

8. Zimmer M. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and relatedphotophysical behavior. // Chem Rev 2002, 102, 759-81.

9. Remington S.J. Fluorescent proteins: maturation, photochemistry and photophysics.

10. Chit Opin Struct Biol 2006, 16, 714-21.

11. Tsien R.Y. The green fluorescent protein. // Annu Rev Biochem 1998, 67, 509-44.

12. Зубова H.H., Булавина А.Ю. Савицкий А.П. Спектральные и физико-химические свойства зеленого (GFP) и красного (drFP583) флуоресцирующих белков. // Успехи биологической химии 2003, 43, 163-224.

13. Chudakov D.M., Verkhusha V. V, Staroverov D.B., Souslova E.A., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. // Nat Biotechnol 2004, 22, 1435-9.

14. Ando R., Hama H., Yamamoto-Hino M., Mizuno H., Miyawaki A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. // Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99, 12651-6.

15. Mizuno H., Mal T.K., Tong K.I., Ando R., Furuta T., Ikura M., Miyawaki A. Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein. // Mol Cell 2003, 12, 1051-8.

16. Ivanchenko S., Rocker C., Oswald F., Wiedenmann J., Nienhaus G.U. Targeted Green-Red Photoconversion of EosFP, a Fluorescent Marker Protein. IIJ Biol Phys 2005,31,249-259.

17. McKinney S.A., Murphy C.S., Hazelwood K.L., Davidson M.W., Looger L.L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. // Nat Methods 2009, 6, 131-3.

18. Tsutsui H., Karasawa S., Shimizu H., Nukina N., Miyawaki A. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. // EMBO reports 2005, 6, 233-8.

19. Chudakov D.M., Feofanov A. V, Mudrik N.N., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Chromophore environment provides clue to "kindling fluorescent protein" riddle. // J Biol Chem 2003, 278, 7215-9.

20. Chudakov D.M., Belousov V. V, Zaraisky A.G., Novoselov V. V, Staroverov D.B., Zorov D.B., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. H Nat Biotechnol 2003, 21, 191^1.

21. Lippincott-Schwartz J., Patterson G.H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. II Science 2003, 300, 87-91.

22. Habuchi S., Ando R., Dedecker P., Verheijen W., Mizuno H., Miyawaki A., Hofkens J. Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa. // Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102, 9511-6.

23. Quillin M.L., Anstrom D.M., Shu X., O'Leary S., Kallio K., Chudakov D.M., Remington S J. Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution. II Biochemistry 2005, 44, 5774-87.

24. Bravaya K.B., Bochenkova A. V, Granovsky A.A., Savitsky A.P., Nemukhin A. V Modeling photoabsorption of the asFP595 chromophore. Il J Phys Chem A 2008, 112, 8804-10.

25. Battad J.M., Wilmann P.G., Olsen S., Byres E., Smith S.C., Dove S.G., Turcic K.N., Devenish R.J., Rossjohn J., Prescott M. A structural basis for the pH-dependent increase in fluorescence efficiency of chromoproteins. // J Mol Biol 2007,368, 998-1010.

26. Nemukhin A.V., Topol I.A., Grigorenko B.L., Savitsky A.P., Collins J.R. Conformation dependence of pKa's of the chromophores from the purple asFP595 and yellow zFP538 fluorescent proteins. // Theochem 2008, 863, 39-43.

27. Grigorenko B., Savitsky A., Topol I., Burt S., Nemukhin A. Ground-state structures and vertical excitations for the kindling fluorescent protein asFP595. // J Phys Chem B 2006, 110, 18635-40.

28. Schäfer L. V, Groenhof G., Klingen A.R., Ulimann G.M., Boggio-Pasqua M., Robb M.A., Grubmüller H. Photoswitching of the fluorescent protein asFP595: mechanism, proton pathways, and absorption spectra. // Angew Chem Int 2007, 46, 530-6.

29. Schäfer L. V, Groenhof G., Boggio-Pasqua M., Robb M.A., Grubmüller H. Chromophore protonation state controls photoswitching of the fluoroprotein asFP595. // PLoS Comput Biol 2008, 4, el000034.

30. Grigorenko B.L., Nemukhin A.V. Modeling trans-cis chromophore isomerization for the asFP595 kindling protein. Proc SPIE; 2007; 6449, p. 644900-644900-5.

31. Schüttrigkeit T.A., Feilitzsch T. , Kompa C.K., Lukyanov K.A., Savitsky A.P., Voityuk A.A., Michel-Beyerle M.E. Femtosecond study of light-induced fluorescence increase of the dark chromoprotein asFP595. // Chem Phys 2006, 323, 149-160.

32. Elsliger M.A., Wächter R.M., Hanson G.T., Kallio K., Remington S.J. Structural and spectral response of green fluorescent protein variants to changes in pH. // Biochemistry 1999, 38, 5296-301.

33. Rusanov A.L., Mironov V. A, Goryashenko A.S., Grigorenko B.L., Nemukhin A. V, Savitsky A.P. Conformational partitioning in pH-induced fluorescence of the kindling fluorescent protein (KFP). f/JPhys Chem B 2011, 115, 9195-201.

34. Rusanov A.L., Zubova N., Savitsky A.P. Role of pH in the appearance of the fluorescent state of chromo protein asCP595 and its mutant KFP. Proc SPIE; 2007, 6449, 644917—644917—7.

35. Schwille P., Kummer S., Heikal A., Moerner W., Webb W., Fluorescence correlation spectroscopy reveals fast optical excitation-driven intramolecular dynamics of yellow fluorescent proteins. II Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97, 151156.

36. Wiedenmann J., Elke C., Spindler K.D., Funke W. Cracks in the beta-can: fluorescent proteins from Anemonia sulcata (Anthozoa, Actinaria). // Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97, 14091-6.

37. Kennis J.T.M., Larsen D.S., van Stokkum I.H.M., Vengris M., van Thor J.J., van Grondelle R. Uncovering the hidden ground state of green fluorescent protein. // Proc Natl Acad Sci USA 2004, 101, 17988-93.

38. Ormô M., Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., Remington S.J. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. // Science 1996, 273, 1392-5.

39. Seifert M.H.J., Georgescu J., Ksiazek D., Smialowski P., Rehm T., Steipe B., Holak T.A. Backbone dynamics of green fluorescent protein and the effect of histidine 148 substitution. II Biochemistry 2003, 42, 2500-12.

40. Bosisio C., Quercioli V., Chirico G., D'Alfonso L., Bettati S., Raboni S., Campanini B., Collini M. Effect of the point mutation H148G on GFPmut2

41. Heim R., Prasher D.C. Tsien R.Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. // Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91, 12501-12504.

42. Heim R., Tsien R.Y. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. // Curr Biol 1996, 6, 178-182.

43. Kremers G.-J., Goedhart J., van den Heuvel D.J., Gerritsen H.C., Gadella T.W.J. Improved green and blue fluorescent proteins for expression in bacteria and mammalian cells. // Biochemistry 2007, 46, 3775-83.

44. Rizzo M.A., Springer G.H., Granada B., Piston D.W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. // Nat Biotechnol 2004, 22, 445-9.

45. Cormack B.P., Valdivia R.H., Falkow S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). // Gene 1996, 173, 33-8.

46. Heim R., Cubitt A.B., Tsien R.Y. Improved green fluorescence. // Nature 1995, 373, 663-4.

47. Yang T.T., Cheng L., Kain S.R. Optimized codon usage and chromophore mutations provide enhanced sensitivity with the green fluorescent protein. // Nucl Acids Res 1996, 24, 4592-3.

48. Matz M. V, Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. // Nat Biotechnol 1999, 17, 969-73.

49. Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y., Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral // Proc Nat. Acad Sci USA 2000, 97,11984-11989.

50. Vrzheshch P.V., Akovbian N.A., Varfolomeyev S.D., Verkhusha V.V., Denaturation and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions // FEBS lett. 2000, 487, 203-208.

51. Jakobs S., Subramaniam V., Schônle A., Jovin T.M., Hell S.W., EFGP and DsRed expressing cultures of Escherichia coli imaged by confocal, two-photon and fluorescence lifetime microscopy II FEBS Lett. 2000, 479(3), 131-135.

52. Wall M.A., Socolich M., Ranganathan R. The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed. // Nat Struct Biol 2000, 7, 1133-8.

53. Petersen J., Wilmann P.G., Beddoe T., Oakley A.J., Devenish R.J., Prescott M., Rossjohn J. The 2.0-A crystal structure of eqFP611, a far red fluorescent protein from the sea anemone Entacmaea quadricolor. // J Biol Chem 2003, 278, 4462631.

54. Prescott M., Ling M., Beddoe Т., Oakley A.J., Dove S., Hoegh-Guldberg O., Devenish R.J., Rossjohn J. The 2.2 Ä Crystal Structure of a Pocilloporin Pigment Reveals a Nonplanar Chromophore Conformation. // Structure 2003, 11, 275-284.

55. Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A., Tsien R.Y., A monomeric red fluorescent protein // Proc Natl Acad Sei USA 2002, 12,7877-7882.

56. Арсланбаева Jl.P., Жердева B.B., Ивашина T.B., Винокуров Л.М., Русанов А.Л., Савицкий А.П. Генетически кодируемая FRET-napa на основе тербийсвязывающего пептида и красного флуоресцентного белка И Прикл Биохгш Микробиол 2010, 46, № 2, 166-171

57. Vinkenborg J.L., Evers Т.Н., Reulen S.W.A., Meijer E.W., Merkx M. Enhanced sensitivity of FRET-based protease sensors by redesign of the GFP dimerization interface. // Chembiochem 2007, 8, 1119-21.

58. Savitsky A.P., Rusanov A.L., Zherdeva V. V, Gorodnicheva Т. V, Khrenova M.G., Nemukhin A. V FLIM-FRET Imaging of Caspase-3 Activity in Live Cells Using Pair of Red Fluorescent Proteins. // Theranostics 2012, 2, 215-26.

59. Rusanov A.L., Ivashina Т. V., Vinokurov L.M., Goryashenko A.S., Zherdeva V. V., Savitsky A.P. // Proc. SPIE 2010, 737611-737611-6.

60. Wang Y., Shyy J.Y.-J., Chien S. Fluorescence proteins, live-cell imaging, and mechanobiology: seeing is believing. // Annu Rev Biomed Eng 2008, 10, 1-38.

61. Lakowicz, J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy // Springer 3rd edition 2006, 954 стр

62. Patterson G.H., Piston D.W., Barisas B.G. Förster distances between green fluorescent protein pairs. II Anal Biochem 2000, 284, 438^-0.

63. Piston D.W., Kremers G.-J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. // Trends Biochem. Sei, 2007, 32, 9, 407-414.

64. Roda A., Guardigli M., Michelini E., Mirasoli M. Nanobioanalytical luminescence: Förster-type energy transfer methods. II Anal Bioanal Chem 2009, 393, 109-123.

65. Rusanov A.L., Ivashina T. V, Vinokurov L.M., Fiks I.I., Orlova A.G., Turchin I.V, Meerovich I.G., Zherdeva V.V, Savitsky A.P. Lifetime imaging of FRET between red fluorescent proteins. IIJBiophotonics 2010, 3, 774-83.

66. Kremers G.J., Goedhart J., Visible fluorescent proteins for FRET II Laboratory Techniques in Biochemistiy and Molecular Biology. FRET and FLIM Techniques 2008, 33, 171-224

67. Olwin B.B., Keller C.H., Storm D.R. Interaction of a fluorescent N-dansylaziridine derivative of troponin I with calmodulin in the absence and presence of calcium. // Biochemistry 1982, 21, 5669-5675.

68. Chapman E.R., Alexander K., Vorherr T., Carafoli E., Storm D.R. Fluorescence energy transfer analysis of calmodulin-peptide complexes. // Biochemistry 1992, 31, 12819-12825.

69. Gordon G.W., Berry G., Liang X. H., Levine В., Herman В., Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. II Biophys. J. 1998, 74, 2702-2713.

70. Youvan D.C., Silva C.M., Bylina E.J., Coleman W.J., Dilworth M.R., Yang M.M. Calibration of fluorescence resonance energy transfer in microscopy using genetically engineered GFP derivatives on nickel chelating beads. // Biotechnology 1997,3, 1-18.

71. Shotten D.M. Confocal scanning optical microscopy and its applications for biological specimens. II J. Cell Sci. 1989, 94, 175-206.

72. Wallrabe PI., Periasamy A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. // Curr Opin Biotechnol 2005, 16, 19-27.

73. Berney C., Danuser G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. // Biophysical J 2003, 84, 3992-4010.

74. Van Munster E.B., Gadella T.W. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). // Adv Biochem Eng Biotechnol 2005, 95, 143-175.

75. Wallrabe H., Periasamy A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy // Curr Opin Biotechnol 2005, 16, 19-27.

76. Borst J.W., Visser A.J.W.G. Fluorescence lifetime imaging microscopy in life sciences. // Meas Sci Technol 2010, 21, 102002.

77. Levitt J.A., Matthews D.R., Ameer-Beg S.M., Suhling K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. // Curr Opin Biotechnol 2009, 20, 1, 28-36.

78. Gautier I., Tramier M., Durieux C., Coppey J., Pansu R. B., Nicolas J. C., Kemnitz K., Coppey-Moisan M. Homo-FRET microscopy in living cells to measure monomer-dimer transition of GFP-tagged proteins. // Biophys J 2001, 80, 30003008.

79. Runnels L.W., Scarlata S.F. Theory and application of fluorescence homotransfer to melittin oligomerization. // Biophys J1995, 69, 1569-1583.

80. Tramier M, Coppey-Moisan M. Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells. II Methods Cell Biol 2008, 85, 395-414.

81. Rizzo M.A., Piston D.W. High-contrast imaging of fluorescent protein FRET by fluorescence polarization microscopy. II Biophys J 2005, 88, L14-L16.

82. Heim R., Tsien R.Y. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. // Curr Biol 1996, 6, 178-82.

83. Pollok B.A., Heim R. Using GFP in FRET-based applications. // Trends Cell Biol 1999, 9, 57-60.

84. Goedhart J., van Weeren L., Hink M.A., Vischer N.O.E., Jalink K., Gadella T.W.J. Bright cyan fluorescent protein variants identified by fluorescence lifetime screening. II Nat Methods 2010, 7, 137-9.

85. Nguyen A.W., Daugherty P.S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. // Nat Biotechnol 2005, 23, 355-60.

86. Griesbeck O., Baird G.S., Campbell R.E., Zacharias D.A., Tsien R.Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. H J Biol Chem 2001, 276, 29188-94.

87. Nagai T., Ibata K., Park E.S., Kubota M., Mikoshiba K., Miyawaki A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. // Nat Biotechnol 2002, 20, 87-90.

88. Ai H., Hazelwood K.L., Davidson M.W., Campbell R.E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. // Nat Methods 2008, 5, 401-3.

89. Niino Y., Hotta K., Oka K. Simultaneous live cell imaging using dual FRET sensors with a single excitation light. // PloS one 2009, 4, e6036.

90. Shcherbo D., Souslova E.A., Goedhart J., Chepurnykh T. V, Gaintzeva A., Shemiakina I.I., Gadella T.W.J., Lukyanov S., Chudakov D.M. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. // BMC biotechnol 2009, 9, 24.

91. Piljic A., Schultz C. Simultaneous recording of multiple cellular events by FRET. II ACS Chem Biol 2008, 3, 156-60.

92. Selvin P.R. Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes. // Ann Rev Biophys Biomol Struct 2002, 31, 275-302.

93. Rajapakse H.E., Gahlaut N., Mohandessi S., Yu D., Turner J.R., Miller L.W. Time-resolved luminescence resonance energy transfer imaging of protein-protein interactions in living cells. // Proc Natl Acad Sci USA 2010, 107, 13582-7.

94. Miyawaki A., Llopis J., Heim R., McCaffery J.M., Adams J.A., Ikura M., Tsien R.Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. // Nature 1997, 388, 882-7.

95. Palmer A.E., Qin Y., Park J.G., McCombs J.E. Design and application of genetically encoded biosensors. // Trends Biotechnol 2011, 29, 144-52.

96. Bellomo E.A., Meur G., Rutter G.A. Glucose regulates free cytosolic Zn~ concentration, Slc39 (ZiP), and metallothionein gene expression in primary pancreatic islet p-cells. IIJ Biol Chem 2011, 286, 25778-89.

97. Dittmer P.J., Miranda J.G., Gorski J.A., Palmer A.E. Genetically encoded sensors to elucidate spatial distribution of cellular zinc. // J Biol Chem 2009, 284, 16289-97.

98. Vinkenborg J.L., Nicolson T.J., Bellomo E.A., Koay M.S., Rutter G.A., Merkx M. Genetically encoded FRET sensors to monitor intracellular Zn2+ homeostasis. // Nat Methods 2009, 6, 737-40.

99. DiPilato L.M., Cheng X., Zhang J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. // Proc Natl Acad Sci USA 2004, 101, 16513-8.

100. DiPilato L.M., Zhang J. The role of membrane microdomains in shaping beta2-adrenergic receptor-mediated cAMP dynamics. // Mol Biosyst 2009, 5, 832-7.

101. Klarenbeek J.B., Goedhart J., Hink M.A., Gadella T.W.J., Jalink K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. // PloS one 2011, 6, el9170.

102. Violin J.D., DiPilato L.M., Yildirim N., Elston T.C., Zhang J., Lefkowitz R.J. beta2-adrenergic receptor signaling and desensitization elucidated by quantitative modeling of real time cAMP dynamics. IIJ Biol Chem 2008, 283, 2949-61.

103. Honda A., Sawyer C.L., Cawley S.M., Dostmann W.R.G. Cygnets: in vivo characterization of novel cGMP indicators and in vivo imaging of intracellular cGMP. // Methods Mol Biol 2005, 307, 27^3.

104. Niino Y., Hotta K., Oka K. Blue fluorescent cGMP sensor for multiparameter fluorescence imaging. // PloS one 2010, 5, e9164.

105. Nikolaev V.O., Gambaryan S., Lohse M.J. Fluorescent sensors for rapid monitoring of intracellular cGMP. I I Nat Methods 2006, 3, 23-5.

106. Russwurm M., Mullershausen F., Friebe A., Jàger R., Russwurm C., Koesling D. Design of fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based cGMP indicators: a systematic approach. II Biochem /2007, 407, 69-77.

107. Cicchetti G., Biernacki M., Farquharson J., Allen P.G. A ratiometric expressible FRET sensor for phosphoinositides displays a signal change in highly dynamic membrane structures in fibroblasts. II Biochemistry 2004, 43, 1939-49.

108. Nishioka T., Aoki K., Hikake K., Yoshizaki IT, Kiyokawa E., Matsuda M. Rapid turnover rate of phosphoinositides at the front of migrating MDCK cells. // Mol Biol Cell 2008, 19, 4213-23.

109. Sato M., Ueda Y., Takagi T., Umezawa Y. Production of PtdInsP3 at endomembranes is triggered by receptor endocytosis. // Nat Cell Biol 2003, 5, 1016-22.

110. Yoshizaki H., Aoki K., Nakamura T., Matsuda M. Regulation of RalA GTPase by phosphatidylinositol 3-kinase as visualized by FRET probes. // Biochem Soc Trans 2006, 34, 851-4.

111. Matsu-ura T., Michikawa T., Inoue T., Miyawaki A., Yoshida M., Mikoshiba K. Cytosolic inositol 1,4,5-trisphosphate dynamics during intracellular calcium oscillations in living cells. IIJ Cell Biol 2006, 173, 755-65.

112. Remus T.P., Zima A. V, Bossuyt J., Bare D.J., Martin J.L., Blatter L.A., Bers D.M., Mignery G.A. Biosensors to measure inositol 1,4,5-trisphosphate concentration in living cells with spatiotemporal resolution. // J Biol Chem 2006, 281,608-16.

113. Tanimura A., Nezu A., Morita T., Turner R.J., Tojyo Y. Fluorescent biosensor for quantitative real-time measurements of inositol 1,4,5-trisphosphate in single living cells. IIJ Biol Chem 2004, 279, 38095-8.

114. Sato M., Ueda Y., Umezawa Y. Imaging diacylglycerol dynamics at organelle membranes. // Nat Methods 2006, 3, 797-9.

115. Violin J.D., Zhang J., Tsien R.Y., Newton A.C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase C. // J Cell Biol 2003, 161,899-909.

116. Okumoto S., Jones A., Frommer W.B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. II Annu Rev Plant Biol 2012, 63, 663-706.

117. Fehr M., Frommer W.B., Lalonde S. Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors. // Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99, 984651.

118. Deuschle K., Chaudhuri B., Okumoto S., Lager I., Lalonde S., Frommer W.B. Rapid metabolism of glucose detected with FRET glucose nanosensors in epidermal cells and intact roots of Arabidopsis RNA-silencing mutants. // Plant Cell 2006, 18, 2314-25.

119. Fehr M., Lalonde S., Lager I., Wolff M.W., Frommer W.B. In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors. IIJ Biol Chem 2003, 278, 19127-33.

120. Takanaga H., Chaudhuri B., Frommer W.B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. // Biochim Biophys Acta 2008, 1778, 1091-9.

121. Lager I., Felir M., Frommer W.B., Lalonde S. Development of a fluorescent nanosensor for ribose. // FEBS Lett 2003, 553, 85-9.

122. Lager I., Looger L.L., ITilpert M., Lalonde S., Frommer W.B. Conversion of a putative Agrobacterium sugar-binding protein into a FRET sensor with high selectivity for sucrose. IIJ Biol Chem 2006, 281, 30875-83.

123. Hires S.A., Zhu Y., Tsien R.Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. // Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105, 4411-6.

124. Okumoto S., Looger L.L., Micheva K.D., Reimer R.J., Smith S.J., Frommer W.B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. 11 Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102, 8740-5.

125. Bogner M., Ludewig U. Visualization of arginine influx into plant cells using a specific FRET-sensor. IIJFluoresc 2007, 17, 350-60.

126. Yang H., Bogner M., Stierhof Y.-D., Ludewig U. H-independent glutamine transport in plant root tips. // PloS one 2010, 5, e8917.

127. Okada S., Ota K., Ito T. Circular permutation of ligand-binding module improves dynamic range of genetically encoded FRET-based nanosensor. // Protein Sci 2009, 18, 2518-27.

128. Ewald J.C., Reich S., Baumann S., Frommer W.B., Zamboni N. Engineering genetically encoded nanosensors for real-time in vivo measurements of citrate concentrations. // PloS one 2011, 6, e28245.

129. Bermejo C., Ewald J.C., Lanquar V., Jones A.M., Frommer W.B. In vivo biochemistry: quantifying ion and metabolite levels in individual cells or cultures of yeast. UBiochemJ 2011, 438, 1-10.

130. Bermejo C., Haerizadeh F., Takanaga H., Chermak D., Frommer W.B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. // Biochem J2010, 432, 39<M06.

131. Bermejo C., Haerizadeh F., Takanaga H., Chermak D., Frommer W.B. Optical sensors for measuring dynamic changes of cytosolic metabolite levels in yeast. // Nat Protoc 2011, 6, 1806-17.

132. Chaudhuri B., Hormann F., Frommer W.B. Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants. H J Exp Bot 2011, 62, 2411-7.

133. Kramer J.M., Yi L., Shen F., Maitra A., Jiao X., Jin T., Gaffen S.L. Evidence for ligand-independent multimerization of the IL-17 receptor. // J Immunol 2006, 176,711-5.

134. Azpiazu I., Gautam N. A fluorescence resonance energy transfer-based sensor indicates that receptor access to a G protein is unrestricted in a living mammalian cell. H J Biol Chem 2004, 279, 27709-18.

135. Camuzeaux B., Spriet C., Heliot L., Coll J., Duterque-Coquillaud M. Imaging Erg and Jun transcription factor interaction in living cells using fluorescence resonance energy transfer analyses. // Biochem Biophys Res Commun 2005, 332, 1107-14.

136. Latif R., Graves P., Davies T.F. Ligand-dependent inhibition of oligomerization at the human thyrotropin receptor. IIJ Biol Chem 2002, 277, 45059-67.

137. Majoul I., Straub M., Hell S.W., Duden R., Soling H.D. KDEL-cargo regulates interactions between proteins involved in COPI vesicle traffic: measurements in living cells using FRET. II Dev Cell 2001, 1, 139-53.

138. Wurch T., Matsumoto A., Pauwels P.J. Agonist-independent and -dependent oligomerization of dopamine D-2 receptors by fusion to fluorescent proteins IIFEBS Lett 2001,507, 109 (2001).

139. Tengholm A., Meyer T. A PI3-kinase signaling code for insulin-triggered insertion of glucose transporters into the plasma membrane. // Curr Biol 2002, 12, 1871-6.

140. Tengholm A., Teruel M.N., Meyer T. Single cell imaging of PI3K activity and glucose transporter insertion into the plasma membrane by dual color evanescent wave microscopy. // Sci STKE 2003, 2003, PL4.

141. Wong W., Scott J.D. AKAP signalling complexes: focal points in space and time. // Nat Rev Mol Cell Biol 2004, 5, 959-70.

142. Houslay M.D. Underpinning compartmentalised cAMP signalling through targeted cAMP breakdown. // Trends Biochem Sci 2010, 35, 91-100.

143. Allen M.D., Zhang J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. // Biochem Biophys Res Commun 2006, 348, 716-21.

144. Depry C., Allen M.D., Zhang J. Visualization of PKA activity in plasma membrane microdomains. II Mol Biosyst 2011, 7, 52-8.

145. De S., Macara I.G., Lannigan D.A. Novel biosensors for the detection of estrogen receptor ligands. // The J Steroid Biochem Mol Biol 2005, 96, 235-44.

146. Wang Z., Gerstein M., Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. II Nat Rev Genet 2009, 10, 57-63.

147. Awaji T., Hirasawa A., Shirakawa H., Tsujimoto G., Miyazaki S. Novel green fluorescent protein-based ratiometric indicators for monitoring pH in defined intracellular microdomains. // Biochem Biophys Res Commun 2001, 289, 457-62.

148. Sakai R., Repunte-Canonigo V., Raj C.D., Knopfel T. Design and characterization of a DNA-encoded, voltage-sensitive fluorescent protein. // Eur J Neurosci 2001, 13,2314-8.

149. Ai H., Hazelwood K.L., Davidson M.W., Campbell R.E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. // Nat Methods 2008, 5, 401-3.

150. Subach O.M., Gundorov I.S., Yoshimura M., Subach F. V, Zhang J., Griienwald D., Souslova E.A., Chudakov D.M., Verkhusha V. V Conversion of red fluorescent protein into a bright blue probe. // Chem Biol 2008, 15, 1116-24.

151. Shcherbo D., Souslova E.A., Goedhart J., Chepurnykh T. V, Gaintzeva A., Shemiakina I.I., Gadella T.W.J., Lukyanov S., Chudakov D.M. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. // BMC Biotechnol 2009, 9, 24.

152. Arslanbaeva L.R., Zherdeva V. V, Ivashina T. V, Vinokurov L.M., Rusanov A.L., Savitskii A.P. Genetically encoded FRET-pair on the basis of terbium-binding peptide and red fluorescent protein. // Prikl Biokhim Mib'obiol 46, 166-71.

153. Hwang Y.-C., Chen W., Yates M. V Use of fluorescence resonance energy transfer for rapid detection of enteroviral infection in vivo. // Appl Environ Microbiol 2006, 72, 3710-5.

154. Luo K.Q., Yu V.C., Pu Y., Chang D.C. Measuring dynamics of caspase-8 activation in a single living HeLa cell during TNFalpha-induced apoptosis. // Biochem Biophys Res Commun 2003, 304, 217-22.

155. Chiang J.J.-H., Truong K. Using co-cultures expressing fluorescence resonance energy transfer based protein biosensors to simultaneously image caspase-3 and Ca2+ signaling. II Biotechnol Lett 2005, 27, 1219-27.

156. Hwang Y.-C., Chu J.J.-H., Yang P.L, Chen W., Yates M. V Rapid identification of inhibitors that interfere with poliovirus replication using a cell-based assay. II Antiviral Res 2008, 77, 232-6.

157. Jones J., Heim R., Hare E., Stack J., Pollok B.A. Development and application of a GFP-FRET intracellular caspase assay for drug screening. // J Biomol Screen 2000,5,307-18.

158. Evers T.H., van Dongen E.M.W.M., Faesen A.C., Meijer E.W., Merkx M. Quantitative understanding of the energy transfer between fluorescent proteins connected via flexible peptide linkers. // BiochemisUy 2006, 45, 13183-92.

159. Graham D.L., Lowe P.N., Chalk P.A. A method to measure the interaction of Rac/Cdc42 with their binding partners using fluorescence resonance energy transfer between mutants of green fluorescent protein. // Anal Biochem 2001, 296, 208-17.

160. Sambrook J., Fritisch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual // 2nd Ed. N. Y. : Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989.

161. Yanisch-Perron C., Vieira .J, Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. // Gene 1985,33, 1, 103-119.

162. Topol I., Collins J., Mironov V., Savitsky A., Nemukhin A. Modeling absorption of the kindling fluorescent protein with the neutral form of the chromophore. // Int J Quant Chem 2012, 112, 2947-2951.

163. Scharnagl C., Raupp-Kossmann R.A. Solution p K a Values of the Green Fluorescent Protein Chromophore from Hybrid Quantum-Classical Calculations. // J Phys Chem B 2004, 108, 477-489.

Информация о работе

Горященко, Александр Сергеевич
кандидата химических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Физико-химические свойства красных флуоресцентных белков и их использование для создания сенсоров, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы