Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и применение мономерных красных флуоресцентных белков с большим стоксовым сдвигом
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение мономерных красных флуоресцентных белков с большим стоксовым сдвигом"
московским государственный университет
имени М.В. ЛОМОНОСОВА Химический факультет
4855ДО4
ПЕТКЕВИЧ КИРИЛЛ ДМИТРИЕВИЧ
разработка и применение мономерных красных флуоресцентных белков с большим стоксовым сдвигом
03.01.04 - биохимия 03.01.06 - биотехнология в том числе бионанотехнологии
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
2 4 оез 2311
москва-2011
4855964
Работа выполнена на кафедре химической этимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и на кафедре анатомии и структурной биологии Медицинского колледжа имени А. Эйнштейна, Нью-Йорк
Научные руководители:
член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Варфоломеев Сергей Дмитриевич кандидат химических наук, доцент Верхуша Владислав Витальевич
Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН,
доктор химических наук, профессор Кочетков Сергей Николаевич доктор биологических наук Лукьянов Константин Анатольевич
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук Институт Цитологии РАН
Защита состоится «¿¿.» февраля 2011 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.ВЛомоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Автореферат разослан января 2011 года Учёный секретарь
диссертационного совета, ..
кандидат химических наук С Сакодынская И.К.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В последнее десятилетие одним из наиболее приоритетных методов исследований в биологии и медицине стала визуализация различных процессов, происходящих в живых организмах, тканях или клетках в режиме реального времени с помощью флуоресцентных маркеров. Особое место среди них занимает зеленый флуоресцентный белок (GFP), его варианты и гомологи. Главными особенностями GFP-подобных белков при их использовании являются высокая стабильность и способность к формированию хромофора без участия кофакторов, ферментов или каких-либо субстратов, кроме молекулярного кислорода (Shaner et.al., 2007). Таким образом, образования хромофора и возникновения свечения возможно непосредственно в живых организмах, тканях или клетках. Оказалось, что N- и С-концы флуоресцентных белков (FPs) доступны для создания гибридных белков, что позволяет осуществлять сшивку флуоресцентного белка (FP) с белком-мишенью. При этом FP не оказывает влияния на локализацию и функцию исследуемого белка. Это свойство делает GFP-подобные белки уникальными генетически кодируемыми флуоресцентными маркерами, которые стали незаменимыми инструментами для изучения взаимодействия белков, их локализации и транспорта, а также биосенсоров внутриклеточных метаболитов, позволяющих определять концентрацию Са2+ и цАМФ, pH, мембранный потенциал, активность некоторых ферментов (например, каспаз, киназ и протеаз) в живой клетке (Stepanenko el.al.. 2008).
Клонирование генов GFP-подобных белков, флуоресцирующих в желтой, оранжевой, красной и дальней красной областях спектра, явилось очередным этапом в использовании FPs для проведения исследований в области биологии (Matz et. al., 1999). Одновременное использование нескольких FPs с разными спектральными характеристиками привело к развитию современных методов исследований, позволяющих изучать многофакторные процессы в живой клетке и многоклеточном организме. Последующие научные исследования посттрансляционной химии, структуры и свойств GFP-подобных белков позволили разработать подходы к созданию новых FPs с улучшенными и даже заданными свойствами, которые нашли свое применение в биотехнологии и клеточной биологии (Heim et.al., 1996).
Все красные FPs дикого типа, так же как и первые улучшенные версии на их основе, обладали рядом существенных недостатков, таких как неполное и медленное
образование хромофора, примесь зеленой флуоресцентной формы хромофора, склонность к агрегации и олигомеризации. Любой из перечисленных недостатков значительно ограничивает применение FP. Поэтому получение оптимальных красных FPs является очень актуальной проблемой, решение которой значительно расширяет возможности применения FPs в биологии и биотехнологии. В настоящее время наиболее эффективным методом получения улучшенных версий красных FPs является сочетание случайного и сайт-направленного мутагенеза с высоко эффективными техниками сортировки и отбора клеток. Данная стратегия уже была успешно использована для получения ряда FPs с заранее заданными физико-химическими характеристиками (Subach et.al., 2009а, b).
Практическая значимость красных FPs особенно велика для микроскопии тканей и целых организмов, так как свет с большей длиной волны лучше проникает в биологические образцы. Это объясняется тем, что вода, меланин и гемоглобин, основные вещества, которые поглощают свет в биологических тканях, имеют минимальный коэффициент экстинкции в диапазоне длин волн от 600 до 900 нм. Данный диапазон длин волн называется "оптическим окном" и является оптимальным для микроскопии биологических тканей и целых организмов (Konig, 2000). Более того, использование FPs с максимумом флуоресценции выше 600 нм может повысить чувствительность детекции флуоресценции. Это связано с тем, что автофлуоресценция клеток (прежде всего флуоресценция флавинов, витаминов, NAD(P)H) и светорассеивание в тканях уменьшаются с увеличением длины волны света.
На данный момент одним из лучших методов, позволяющих получать высококачественное трехмерное изображение живых тканей на глубину вплоть до 1 миллиметра, является двухфотонная микроскопия (Zipfel et.al., 2003). Суть двухфотонной микроскопии состоит в том, что возбуждение флуоресценции происходит с помощью инфракрасного лазера большой интенсивности, что приводит к поглощению флюорофором двух фотонов с длиной волны в два раза больше длины волны однофотонного возбуждения. Использование красных FPs в мультифотонной микроскопии может открыть новые возможности для проведения исследований живых тканей и целых организмов с субклеточным разрешением в режиме реального времени. Однако красные FPs не могут быть эффективно возбуждены стандартным коммерчески доступным инфракрасным лазером, так как
спектры их двухфотоллого поглощения лежат в более длинноволновой области относительно рабочего диапазона длин волн данного лазера (Drobizhev et.al., 2009). Возможным подходом к решению данной проблемы может быть разработка красного FP, спектр возбуждения которого смещен в коротковолновую область, или, другими словами, красного FP с большим Стоксовым сдвигом (large Stokes shift, LSS).
В настоящее время существует острая необходимость дальнейшего развития методов визуализации биологических объектов для выяснения фундаментальных основ жизнедеятельности клеток в условиях нормы и патологий различного происхождения. Создание новых вариантов флуоресцентных белков с длиной волны флуоресценции более 600 им и при этом характеризующиеся большим Стоксовым сдвигом является актуальной задачей, которая имеет большое теоретическое и практическое значение. Более того, сочетание подобных белков с зеленым или синим FPs может быть также использовано для многоцветной двухфотонной микроскопии, что позволит наблюдать за нескольким клеточными процессами одновременно. Введение этих белков в практику экспериментальной работы невозможно без выяснения механизмов, лежащих в основе спектральных свойств FP, а также изучения связи между их структурой и оптическими, а также биохимическими характеристиками. Понимание механизма большого Стоксового сдвига в GFP-подобных белках может позволить рациональный дизайн красных FPs с большим Стоксовым сдвигом на основе существующих стандартных FPs.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось создание на основе гена белка mKate (Scherbo et.al., 2007) новых мономерных красных FPs с большим Стоксовым сдвигом, с длиной волны максимума флуоресценции более 600 нм, исследование связи особенностей первичной структуры новых белков с их спектральными свойствами и фотохимическими характеристиками. Оценить возможности практического применения новых красных FPs в белках слияния с различными клеточными белками в живых клетках в качестве флуоресцентного маркера для многоцветной одно- и двухфотонной микроскопии в тканях живых мышей.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. На основе гена мономерного красного FP mKate (длина волны флуоресценции 635 нм) методами молекулярного клонирования и эволюции создать по крайней мере
два новых красных FPs с большим Стоксовым сдвигом, обладающих длиной волны максимума флуоресценции более 600 нм, названные LSS-mKatel и LSS-mKate2.
2. Измерить спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции, спектры двухфотонного поглощения, определить величины фотостабильности, квантового выхода, коэффициента экстинкции, скорости созревания хромофора и рН-стабильности флуоресценции, исследовать олигомерное состояние LSS-rnKate белков. Сравнить полученные характеристики с соответствующими значениями для единственного ранее опубликованного красного FP с большим Стоксовым сдвигом mKeima (Стоксов сдвиг составляет 180 iim) (Kogure et.al., 2006) и другими страндартыми FPs других диапозонов флуоресценции.
3. Определить третичные структуры полученных LSS-rnKate белков методом рентгеноструктурного анализа. Установить аминокислотные замены, ответственные за увеличение Стоксового сдвига флуоресценции, а также влияющие на биохимические характеристики новых LSS-rnKate белков. Установить молекулярный механизм флуоресценции LSS-mKate белков.
4. Проанализировать возможности практического использования белков LSS-mKate в живых клетках путем создания и анализа экспрессии его химерных генетических конструкций с клеточными белками в культивируемых клетках млекопитающих, а также с помощью стандартной флуоресцентной микроскопии показать возможности многоцветного мечения клеток новыми LSS-mKatel и LSS-mKate2 и известными красными FPs.
5. Исследовать возможности практиктического использования белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 для многоцветной двухфотонной микроскопии живых тканей и организмов.
Научная новизна полученных результатов. Созданы два новых мономерных красных FPs, названные LSS-mKatel и LSS-mKate2 и обладающие максимумами возбуждения около 460 нм и максимумами флуоресценции более 600 нм. Оба полученных LSS-mKate белка обладали улучшеными физико-химическими свойствами по сравнению с таковыми для единственного известного красного FP с большим Стоксовым сдвигом mKeima. Определены аминокислотные последовательности полученных белков. Установлены аминокислотные остатки, ответственные за сдвиг максимумов возбуждения в коротковолновую область и биохимические свойства новых белков.
Описаны спектральные и фотохимические свойства ЬЬ^-тКаЫ и Г,88-тКа1е2. Измерены полупериоды формирования хромофора, эффективность созревания хромофора и рН-зависимость интенсивности флуоресценции для Ь88-гнКа1е белков. Установлено, что флуоресценция Ь88-тКа1е1 и Ь88-тКа1е2 является самой рН-стабильной из всех известных красных ИРя. Установлено влияние внесенных мутаций на структурно-функциональные изменения белка тЮие. которые определяют флуоресцентные и биохимические свойства 1,88-тКа1е белков в процессе молекулярной эволюции.
Впервые показано, при сравнении с аналогичными характеристиками уже существующего красного РР тКета с большим Стоксовым сдвигом, ЬЙЦ-тКа1е белки обладают существенными преимуществами для применения в клеточной биологии.
Были решены кристаллические структуры белков Ь88-тКа1е1 и Ь88-тКа1е2 во флуоресцентных состояниях с разрешением 2.0 и 1.5 А. Изучены зависимости спектральных характеристик белков Ь8Я-тКа1е1 и Ь88-тКа1е2 от температуры, рН среды, протонно-дейтериевого состава растворителя. На основании полученных данных были предложены молекулярные механизмы большого Стоксового сдвига для Ь88-тКа1е1 и Ь88-шКа1е2.
Впервые была предложена схема рационального дизайна новых красных РРз с большим Стоксовым сдвигом на основе уже существующих стандартных красных РРэ. Используя данную стратегию, была получена серия флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом, которые обладают максимумами флуоресценции в широком диапазоне длин волн от 560 до 640 нм.
Показано, что новые Ь88-тКа1е белки расширяют возможности многоцветного мечения клеток для двухфотонной микроскопии, добавляя новый красный цвет, и спектрально отличаются от существующих красных РРя при использовании для многоцветной стандартной флуоресцентной микроскопии. Впервые была проведена многоцветовая двухфотонная микроскопия тканей живых мышей с субклеточным разрешением в режиме реального времени. Данный подход был использован для анализа взаимного расположения органелл клеток в раковой опухоли мыши как функции расстояния до ближайшего кровеносного сосуда. Высокая фотостабильность Ь88-тКа1е белков сделала возможным длительное наблюдение за отдельно взятой клеткой при ее миграции в раковой опухоли. Анализ полученных
изображенный показал поляризацию пар комплекс Гольджи-ядро в раковых клетках, расположенных на расстояниях менее 40 мкм до ближайшего кровеносного сосуда.
Практическое значение полученных результатов. Практическое значение результатов диссертационной работы состоит прежде всего в том, что в ходе работы были получены новые белки LSS-mKate, которые могут быть эффективно использованы для многоцветной двухфотонной микроскопии живых тканей. Спектральные характеристики LSS-mKate белков оптимальны для визуализации живых клеток и тканей с субклеточным разрешением в течение длительного времени. Белки LSS-mKate лишены таких серьезных недостатков, как склонность к агрегации в живых клетках, низкая рН-стабилыюсть и остаточная зеленая флуоресценция и, таким образом, имеют большой потенциал применения в биотехнологии. Созданные FPs раскрывают новые возможности многоцветного мечения биологических объектов, поскольку могут быть эффективно спектрально разрешены с другими стандартными флуоресцентными белками. В паре с уже существующими синими FPs, LSS-mKatel и LSS-mKate2 могут использоваться для создания молекулярных биосенсоров, работающих на основе безизлучательного переноса энергии (FRET). Белки LSS-mKate возбуждаются стандартными синими лазерами 407 нм и 457 нм проточных цитофлуориметров, благодаря чему станут полезным инструментом для биомедицинских исследований. Предложенная схема рационального дизайна красных FPs с большим Стоксовым сдвигом может быть использована для получения других подобных FPs с улучшенными и заданными спектральными характеристиками.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлена на: The American Society for Cell Biology 48th Annual Meeting (San Francisco, США, 2008); VII Ежегодная Международная Молодежная Конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая Физика» (Москва, Россия, 2008); XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009» (Москва, Россия, 2009); Intern. Conf. «Biocatalysis-2009: Fundamentals&Applications» (Архангельск, Россия, 2009); III Международная конференция: "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины" (Ростов-на-Дону, Россия, 2009).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 статей и 5 тезисов докладов на международных конференциях и симпозиумах.
Структура Ii объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 120 страницы печатного текста, 29 рисунков, 5 таблиц, 153 ссылки.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Экспериментальная часть Объект исследования. Ген белка mKate, мутантные варианты mKate, белки LSS-mKate, их первичная, вторичная и третичная структуры, спектральные и фотохимические характеристики, химерные конструкции LSS-mKate белков с клеточными белками.
Методы исслдования. В работе использовались следующие штамы бактерий E.coli: DH5a и LMG194. Все генно-инженерные манипуляции проводили согласно описанным методам и протоколам (Маниатис и др., 1984). Олигодезоксирибонуклеотиды были синтезировны в лаборатории фирмы Fisher Oligo (США). Амплификацию генов проводили на приборе MyCycler Thermal Cycler фирмы BioRad (США). Сайт-направленный мутагенез проводили с использованием QuikChange Mutagensis Kit (Stratagene, США). Случайный мутагенез осуществляли с помощью GeneMorph II Random Mutagenesis Kit (Stratagene, США). Выделение плазмидных ДНК и очистку ПЦР-продуктов проводили с использованием специальных наборов для выделения и очистки ДНК «GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit» (Fermentas, Латвия) и «QuickClean PCR Purification Kit» (GenScript, США).
Сортировку бактериальных библиотек проводили на проточном цитофлуориметре MoFlo XDP (Dako, США) или FACSAria (Becton Dickinson, США). Вторичную селекцию бактериальных клонов проводился с помощью флуоресцентного стереомикроскопа Leica MZ16F, оснащенного спектрофотометром QDI-202 (CRAIC, США).
Выделение рекомбинантных белков, синтезированных в клетках E.coli, проводили по стандартной методике с использованием металлоаффинного сорбента Ni-NTA (Qiagen, США) или В-Per реактива, для лизиса бактериальных клеток (Pierce, США). Исследования основных физико-химических характеристик флуоресцентных белков проводили в фосфатно-солевом буфере PBS при pH 7.5 после очистки на металлоаффинном сорбенте Ni-NTA (Qiagen, США). Измерения
двухфотонных спектров возбуждения проводили используя лазерную систему Caméléon Ultra Ti-Sapphire (Coherent, США).
Кристаллы белков LSS-mKatel и LSS-mKate2, обладающие хорошей дифракцией рентгеновских лучей, были получены диффузией паров летучих веществ методом «сидящей капли». Данные дифракции были зарегистрированы на детекторе Quantum 315 CCD (Area Detector Systems Corp., Poway, США) с длиной волны облучения 1.08 Â на Х29А пучке синхротронного излучения (National Synchrotron Light Source, Brookhaven, США). Полученные дифракционные данные были обработаны с помощью программного обеспечения HKL2000, TRUNCATE, PHASER, COOT, REFMAC, WHATCHECK и PROCHEK.
Для исследования возможностей применения новых FPs в клеточной биологии использовали культуры клеток линии HeLa, MTLn3, МТЬпЗ со сверхэкспрессией ErbBl и MDA-MB-231. Микроскопию животных клеток проводили с использованием конфокального микроскопа SP5 AOBS (Leica, США) или инвертированного микроскопа 1X81 (Olympus, США), оборудованном источником света Lumen PRO с металло-галоидной лампой (Prior). Трансплантация раковых клеток в молочные железы ТКИД мышей и хирургическая обработка опухоли были проведены в соответствии с протоколами Института Исследований животных при Медицинском колледже имени А. Эйнштейна (АБСОМ, США). Двухфотонная микроскопия in vivo производилась с использованием микроскопа 1X81 (Olympus, США) с титан-сапфировым лазером (BioRad, США). Микроскопию раковых клеток проводили при длине волны 870 нм. Серии изображений были реконструированы с помощью программы ImageJ и проанализированы с использованием программного обеспечения Region of Interest Tracker (AECOM, США).
Результаты н их обсуждение 1. Создание красных флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом
Среди существующих дальне-красных флуоресцентных белков, следует отметить недавно созданный белок mKate, который существенно ярче, чем его аналоги HcRed (Gurskaya et.al., 2001) или mPlum (Wang et.al, 2004), имеющие сходные спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции. Кроме того, mKate характеризуется мономерным состоянием, высокой скоростью и степенью созревания красного хромофора. Сначала был проведен случайный мутагенез гена белка mKate с применением полимеразой цепной реакции. Затем ПЦР-продукты
la
были лигированы в экспрессионный вектор pBAD/IIis-B и трансформированы в клетки E.coli штамма LMG194. Полученные в результате мутагенеза бактериальные библиотеки размерами до 7х 107 независимых клонов, сортировались на проточном цитофлуориметре. Критерий отбора был таковым: собирались клетки не обладающие зеленой (возбуждение 488 нм, эмиссия 520/40 нм), красной (возбуждение 568 нм, эмиссия 620/30), синей (возбуждение 407 нм, эмиссия 450/65 нм) флуоресценцией, но обладающие красной флуоресценцией при возбуждении лазером с длиной волны 407 нм (возбуждение 407 нм, эмиссия выше 580 нм). Из каждой библиотеки собиралось несколько тысяч клеток с максимальной яркостью нужного фенотипа, которые высевались па чашки Петри для синтеза целевого белка. Вторичная селекция клонов проводилась с использованием флуоресцентного стереомикроскопа. Самые яркие колонии нужного фенотипа переносились на штрихи для измерения их спектров флуоресценции, с использованием присоединённого к стереомикроскопу спектрометра Craie QDI202. После каждого
а100 ■7/ Ч — LSS-mKate1 7\-"LSS-mKate2 б 100-
I 80 •7 ■Д ' Л •••mKeima X 80-
о • \ ' Д о
i60 •7 Л il \\ 1 60
f 40 • V 'г 'Л i 40-
§■ 20 if \\у? \ 1 20-
— LSS-mKate1
— LSS-mKate2 . * -inKeima
400 500 600 700 Длина волны, нм
300 600 900 1200 Время созревания, мин
100
i
' 80
; 60
j- 40
}■ 20
' 0
1 oLSS-mKatel -*-LSS-mKalô2 • □•mKeima
100
Э
i 80
о
| 60
40-
«
о с; 20
— LSS-mKate1
• ■•LSS-mKate2
• •• mKeima -••EGFP
" 200 160 S 120
G
— LSS-mKate1
— LSS-mKate2
— mKeima /
— EGFP / —ECFP /
50 100 150 200 Время фотовыжигания, с
850 900 950 1000 Длина волны, нм
—LSS-mKatel —LSS-mKate2 .. .mKeima
0 50 100 150 200 Время фотовыжигания, с
Рис. 1. Спектральные, биохимические свойства и фотообесцвечивание белков Ь53-тКа(е1 (сплошная линия), 1,88-тКаи:2 (пунктирная линия), и тКета (точечная линия), (а) Спектры возбуждения м эмисси флуоресценции, (б) Кривые кинетики созревания, (в) рН-зависимость интенсивности флуоресценции, (г) Нормированные кривые фотообесцвечивания для капель растворов !.$8-шКа(с5, тКенпа, и Ь'ОП-1 (линия точка-тире) в масле, фотообесцвечивание проводилось с использованием излучения металл-галогеновой лампы, (д) Двухфотонные спектры возбуждения для Ь5й-тКа1е1, Ь83-тКа1с2, тКет1а, НОГ-'Р, и ЕСП1 (линия две точки-тире), (е) Кривые фотообесцвечивания для меченных белками ядер живых клеток линии НеЬа, измеренных при двухфотонной возбуждении с длиной волны 870 нм. Каждая кривая представляет данные, усредненные для 16-20 клеток.
раунда мутагенеза и скрининга, из 25-30 самых ярких клонов с большим Стоксовым сдвигом и минимальной флуоресценцией в других областях спектра, выделялась ДНК, которая секвенировалась. Смесь кДНК отобранных вариантов затем использовали как исходную для следующего раунда мутагенеза. В результате нескольких последовательных раундов молекулярной эволюции белка mKate были найдены мутантные белки mKate/Lys69Tyr/Pro131Thr/Serl48Gly/Metl67GIu/ Thr 183Ser/Metl96Val и mKate/Lys69Tyr/Pro!3 lThr/Serl48Gly/Metl67Asp/Thrl83Ser/ Metl96VaI (нумерация приведена по выравниванию аминокислотной последовательности со стандартным белком GFP), которые назвали LSS-mKatel и LSS-mKate2, соответственно.
2. Основные физико-химические характеристики очищенных рекомбинантных белков LSS-mKatel и LSS-mKate2
На следующем этапе были характеризованы очищенные белки LSS-mKatel и LSS-mKate2 и их свойства сравнивали со свойствами FP mKeima в одинаковых условиях. Основные характеристики белков LSS-mKatel, LSS-mKate2 и mKeima приведены на Рис. 1 и в Таблице 1. Спектры двухфотонного возбуждения для вариантов LSS-mKate, ECFP, and EGFP измеренные в пределах от 760 до 1000 нм показали существенное перекрывание, кроме того значение максимума спектров двухфотонного возбуждения сг2РЕ для LSS-mKatel было в 1.6 раза ниже, а для LSS-mKate2 в 1.4 раза выше соответствующего значения для mKeima (Рис. 1, д). Величина фотостабильности при двухфотонном возбуждении для LSS-mKatel была такой же, как для mKeima, а значение двухфотонной фотостабильности для LSS-mKate2 было в 1.4 раза выше, чем для mKeima (Рис. 1, е).
Таблица 1. Свойства белков LSS-mKatel, LSS-mKate2 и mKeima
Белок Fx a НМ Fm 6 HM г, ivr' см-1 QYr Яркость3 Фото стабиль ность, с Р к. 412 Созревания при 37°С, мин
LSS-mKatel 463 624 31 200 0,08 2,5 60 3,2 100
LSS-mKate2 460 605 26 000 0,17 4.5 44 2,7 150
mKeima 440 584 620 620 13 400 2 500 0,24 0,17 3.4 н.д. 19 н.д. 6,0 н.д 270 н.д.
Здесь и далее: "максимум возбуждения флуоресценции; "максимум эмиссии флуоресценции; "коэффициент молярной экстинкции; "квантовый выход; дяркость флуоресцентного белка определяется как произведение квантового выхода на коэффициент молярной экстинкции, деленный на 1000.
a ser165^
Glu1671
X2 XV j
Мономерпость очищенных рекомбинантных LSS-mKate белков была показана с помощью белкового электрофореза в полунативных полиакриламидных гелях с использование мономерного, димерного и тетрамерного белков в качестве контроля. Белок inKcima, согласно проведенному анализу, имеет тенденцию к димеризации даже при относительно невысокой концентрации 50 мкг/мл. 3. Молекулярный механизм большого Стоксового сдвига в белках LSS-mKate
Большой Стоксов сдвиг в белках LSS-mKate может быть объяснен переносом протона в возбужденном состоянии хромофора (excited-state proton transfer, ESPT). Данное явленение было ранее исследованно на вариантах GFP, также обладающих большим Стоксовым сдвигом. Чтобы доказать данное предположение, а также установить аминокислотные остатки участвующие в переносе протона были решены кристаллические структуры LSS-mKate белков во флуоресцентном состоянии, исследована зависимоть спектральных характеристик от рН, температуры, II/D изотопного состава растворителя, проведен мутагенез ключевых аминокислотных остатков вовлеченных в перенос протона. 3.1. Третичная структура белков LSS-mKatel и LSS-mKate2. С целью исследования молекулярных механизмов красной флуоресценции белков LSS-mKate 1 и LSS-mKate2, были решены их кристаллические структуры во флуоресцентных состояниях с разрешением 2.0 и 1.5 А, соответственно. Наложение структур LSS-mKate белков на структуру их предшетвенника mKate
Asp167
Рис. 2. Молекулярные структуры хромофоров Ь85-тКа1е1 (а) и тКа!е2 (б) и их ближайшего микроокружения с суперналожспием на соответствующую 2/\, - Гс электронную плотность хромофоров (по контуру 1а). Водородные связи представлены зелеными пунктирными линиями с длиной указанной в ангстремах; атомы окрашены по типу атомов (углерод -серый, азот - синий, кислород -красный, сера - желтый); молекулы воды показаны как красные шары. Стрелками указаны торсионные утлы х1 их2.
показало значительное структурное сходство всех соответствующих аминокислотных остатков, за исключением тех, которые были заменены в процессе молекулярной эволюции. Электронные плотности хромофоров, образованных трипептидом Ме1бЗ-Туг64-01у65, согласовались с соответствующими параметрами для ГьиесЬподобного хромофора. В структуре Ь88-тКа1е1 г/г/с-конфигурация фенольного кольца хромофора преобладала у всех четырех молекул ассиметричной единицы. Напротив, в структуре Ь88-тКа1е2, преобладала транс-конфигурация фенольного кольца хромофора, с небольшой популяцией (-10%) г/г*с-изомера, присутствующего в двух из четырех молекул ассиметричной единицы.
Детальный анализ третичных структур Ь38-тКа1е белков позволил определить две различные цепи водородных связей с участием фенольных групп хромофора. В случае Ь88-тКа1е1 гидроксильная группа тирозина 1Д(с-хромофора формирует водородную связь с карбоксильной группой боковой цепи С1и167, которая в свою очередь образует водородные связи с 8ег165 и молекулой воды (Рис. 2, а). В структуре Ь88-тКа1е2 фенольная группа транс-хромофора образует непосредственную водородную связь с 8ег165, который связан водородной связью с карбоксильной группой Азр167 и молекулой воды (Рис. 2, б). Геометрия
Рис. 3. Спектры поглощения и флуоресценции белков Ь58-тКа1е1 (а, б, в) и Ь55-тКа1е2 (г, д, е) при различных значениях рН (а, б, г, д) (смотри также Табл. 1) и в двух разных растворителях при 77 и 298 К (в и г). На панелях б и д, спектры поглощения были измерены при рН 7 после возвращения рН образцов белков с 11 обратно к нейтральному значению рН. На панелях вне длина волны возбуждения составляла 450 им. Спектры нормированы на 100%.
водородных связей между гидроксильной группой остатка тирозина и боковыми цепями Serl65 и Asp 167 оптимальная с точки зрения углов и длин связей. Возможно, что значительное отличие между длинами волн максимумов эмиссии флуоресценции и квантовыми выходами белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 (Таблица 1) обусловлены различными конфигурациями их хромофоров и окружениями их фенольных колец, так же как это наблюдалось в случае мутантных белков eqFPöl 1 (Nienhaus et. al., 2008).
3.2. Зависимость спектральных свойств белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 от pH, температуры и изотопного состава растворителя. Спектры поглощения белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 при значениях pH 3, 5, 7, 9 и 11 были измерены при комнатной температуре (Рис. 3, а и г). В отличие от других FPs с большим Стоксовым сдвигом, спектры поглощения LSS-mKate белков при значениях pH от 3 до 11 практически не изменялись. При значении pH 11 появлялся новый пик поглощения, смещенный в красную область спектра с максимумом 579 им, который был обозначен как пик В. Возбуждение пика В приводило к красной флуоресценции с максимумом при 628 нм, который совпадал для обоих белков LSS-mKate (Рис. 3, б и д). Спектры флуоресценции белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 демонстрировали сильную зависимость от температуры и изотопного состава растворителя: смещение максимумов флуоресценции в коротковолновую область спектра при низких температурах и увеличение коротковолнового плеча спектра флуоресценции при замещении протонов дейтеронами (Рис. 3, в и е). Похожие эффекты при замене протонов на дейтерий были ранее описаны для белка rtiKeima и некоторых вариантов GFP, в которых реализуется механизм ESPT (Shi et.al., 2007; Henderson et.al., 2009).
Таблица 2. Спектральные свойства мутантных белков LSS-mKatel и LSS-mKate2.
Белок Ex,„„, нм Errw, нм QY pK,
LSS-mKatel 463 624 0,08 3,2
LSS-mKate 1/Ser 165 Ala 463 624 0,09 3,5
LSS-mKate2 460 605 0,17 2,7
LSS-mKate2/Serl65Ala 463 624 0,08 3,4
LSS-mKate2/Ser 165Thr 463 627 0,12 3,2
LSS-mKate2/Serl65Met 463 627 0,08 3,6
3.3. Мутагенез ключевых аминокислотных остатков в LSS-mKatel н LSS-
inKate2. Замена Serl65 на Ala, Thr или Met приводит к существенному сдвигу
максимума флуоресценции белка LSS-mKate2, также данные мутации уменьшают рН-стабильность и квантовый выход LSS-mKate2. В случае белка LSS-mKatel замена Ser 165 на гидрофобный Ala не приводит к каким-либо существенным изменениям спектральных характеристик (Таблица 2). Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что остаток Serl65 вовлечен в цепь переноса протонов в белке LSS-mKate2, но не участвует в реализации ESPT в белке LSS-mKatel.
а
S«ms—^ series—^
А
А*
А,
Glu1í7 UvH..í
I* ^о
..А.
Реп ротоиирование 'н i хромофора
N"t '
А
X'
о^о'
о-н-о
7 \._/
>°
о
Л ^ , -
А
Рис. 4. Предполагаемые фотоциклы для Ь5Я-тКа1е1 (а) и Ь85-тКа1е2 (б) при нейтральном рН и комнатной температуре. Возбужденное состояние нейтрального хромофора А*, образующееся при облучении светом с длиной волны -460 нм, превращается после Е8РТ в возбужденное анионное состояние, обозначаемое как I*. После эмиссии красной флуоресценции, протон переносится от 01и167 (Ь88-тКа1е1) или Азр167 (Ь53-тКа(е2) к хромофору с образование основного состояния нейтрального А хромофора.
Полученные данные свидетельствуют о протекании Е8РТ в белках Ь88-шКа1е. Более того по аналогии с ОРР дикого типа (СЬаНога] еЛя/., 1996), был предложен возможный фотоцикл для белков Ь88-тКа1с1 и Е88-т1Са1е2. На Рис. 4 проиллюстрированы ключевые стадии схемы фотофизических и фотохимических
процессов, происходящих в белках 1^8-тКа1е при нейтральных значениях рН при комнатной температуре. В основном состоянии хромофора р/Са карбоксила 01и/А5р167 ниже чем рЛ"а гидроксилыюй группы тирозина хромофора, и хромофоры находятся в нейтральной форме, стабилизируемой карбоксил-анионом. В возбужденном состоянии происходит резкое возрастание кислотности гидроксилыюй группы тирозина хромофора (рКй может достигать значений 2-3), что позволяет ей выступать в качестве донора протона и протонировать карбоксильные группы аи/А8р167 (\Viehler е1а1, 2003).
■ .' С1и167 'н, 5 _ " - еиЛбТ -
<Уо Ч)-о
рн<л.5 э.5<рн<п.» ч рнги.о н/
в
Бвг165—> вес! 65—>
^о н-о р -н о о
у тн о ^ т\хгт4н
Аар167 \/ ♦«* А»р167 \ / +н*
,Н<1.5 ^О ^11,11.1.4 4
Рис. 5. Предполагаемые схемы кислотно-основных равновесий хромофора и его ближайшего аминокислотного окружения для белков Ь88-тКа1е1 (а) и Ь85-тКа1е2 (б) которые объясняют рН-зависимое поведение спектральных свойств данных белков.
Простая модель, включающая три различных состояния хромофора и его ближайшего окружения, адекватно объясняет рН-зависимое поведение белков ЬЭЗ-тКа(е (Рис. 5). При значениях.рН ниже 3,5, и хромофор и карбоксильная группа 01и/А5р 160 протонироваиы, таким образом ЕвРТ не происходит. При значениях рН в пределах от 3,5 до 10, хромофор протонирован, а карбоксильные группы С1и/Л5р160 депротонированы, и эффективный Е8РТ приводит к красной флуоресценции с большим Стоксовым сдвигом. При рН 11 и, возможно, выше образуется флуоресцентная анионная форма хромофора, которая характеризуется максимумами возбуждения и эмиссия флуоресценции 579 нм и 630 нм, соответственно, для обоих 1,88-тКа1е белков. Депротонирование хромофора происходит при достаточно высоких значениях рН. Это может означать, что отрыв протона от нейтрального хромофора является энергетически неблагоприятным процессом, возможно из-за тесной близости двух отрицательно заряженных групп: карбоксильной группы 01ис160/Аьр160 и фенольной группы хромофора. Более того, на спектры поглощения белков Ь88-тКа1е рН влияет обратимо (Рис. 3, б и д). Таким
Рис. 6. Сети водородных связей участвующие в переносе протонов в белках LSS-mKatel (a), LSS-mKate2 (б) и mKeima (в) показаны для хромофора и аминокислотных остатков, вовлеченных в ESPT (водородные связи выделены серым).
образом, мы предполагаем, что пик А в спектре поглощения белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 соответствует нейтральному состоянию хромофора, а пик В — анионному состоянию хромофора.
4. Рациональный подход к созданию флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом
Было предположено, что цепи водородных связей для переноса протона, реализуемые в белках LSS-mKate и mKeima (Рис. 6), могут быть созданы и в других оранжевых и красных FPs с тирозинсодержащим хромофором, путем введения Asp или Glu в микроокружение хромофора. Для проверки данной гипотезы было выбрано пять стандартных FPs, таких как mNeptune (Lin et.al., 2009), mCherry, mStravvberry, mOrange (Shaner et.al., 2004) и mKO (Karasawa et.al. 2004) вместе с белком mKate, для введения сайт-направленных мутаций, которые могут создать условия для протекания ESPT. Предварительный выбор позиций для аминокислотных замен основывался на выравнивании аминокислотных последовательностей белков LSS-mKatel, LSS-mKate2 и mKeima с аминокислотными последовательностями указанных выше белков.
Для превращения выбранных FPs в варианты с большим Стоксовым сдвигом, были созданы две серии библиотек кДНК генов для каждого белка с помощью сайт-направленного мутагенеза. В первом случае в 165 позицию были введены Asp или Glu, а позиция 167 была заменена случайным образом. В другом случае, в 165 позиция была заменена случайно, а в 167 позицию были введены Asp или Glu. В результате последующего скрининга были найдены клоны обладающие оранжевой или красной флуоресценцией при возбуждении циановым светом, то есть обладающие большим Стоксвым сдвигом. В результате секвенирования полученных ДНК были обнаружены гены, которые кодировали соответствующие исходные
белки с одной или двумя аминокислотными заменами в позициях 165 и/или 167 (Табл. 3). Измеренные спектры возбуждения флуоресценции отобранных вариантов показали, что даже при нейтральных значениях рН большинство мутантных белков обладали протежированным хромофором. В дальнейшем улучшение полученных в данной работе оранжевых и дальне-красных вариантов с большим Стоксовым сдвигом приведет к созданию отличных маркеров с двумя спектрально разрешаемыми цветами для молекулярной и клеточной биологии. Данная стратегия может быть использована для получения новых РР.ч с большим Стоксовым сдвигом.
5. Характернзацня белков Ь88-шКа!е1 и Ь88-тКа(е2 в живых клетках
Для характеризации белков Ь88-тКа1е1 и Ь88-тКа1е2 в клетках млекопитающих, сначала проводили временную трансфекцию клеток линии НеЬа плазмидными ДНК, кодирующими белки Ь88-тКа1е без какого-либо сигнала локализации. Были получены изображения флуоресцирующих клеток с помощью флуоресцентного микроскопа с широким полем зрения или конфокального микроскопа. Высокий уровень флуоресценции клеток, экспрессирующих гены ЬББ-тКа(.е белков, можно было наблюдать через 20 часов после трансфекции. Высокий уровень флуоресценции сохранялся как минимум в течение 72 часов после проведения временной трансфекции. Флуоресцентные сигналы Ь88-тКа1е белков были равномерно распределены внутри цитоплазмы и ядра живых клеток линии НеЬа без какой-либо видимой агрегации или неспецифической локализации. Затем были созданы белки слияния вариантов Ь88-тКа1е с (3-актином, а-актином,
Таблица 3. Спектральные свойства оранжевых и красных ИРз с аминокислотными заменами по позициям 165 и 167._
Исходный Введенные Рх
оелок мутации ИМ 11.11
Нет 588 635
тКа!е 167Авр 1670111 449 451 607 624
16501у, 16701и 451 623
1 бЗАвр 450 623
Нет 600 650
т№рШпе 165Азр 16501у, 16701и 1655ег, 16701и 460 467 466 640 633 628
Нет 587 610
тСЬеггу 165С1и, 167А1а 457 610
1655ег, 16701и 456 610
Нет 574 596
тЭйашЬеггу 165А5р 165А5р. 1671.еи 438 438 573 572
Нет 548 562
тОтапще 165А5р, 167&у 165Азр, 167А1а 165Азр, 167Ьеи 16501и, 167А1а 433 434 441 436 560 560 563 561
165Л1а, 16701и 441 561
Нет 548 559
тКО 16501и 439 560
паксиллииом. кератином, а-тубулином, гистоном Н2В. и цитохром С оксидазой. Эти конструкции слияния хорошо встраивались в соответствующие эндогенные клеточные структуры, указывая, что белки LSS-mKate ведут себя как мономеры в клетках. Однако в случае белка mKeima не все его конструкции слияния хорошо встраивались в эндогенные клеточные структуры. В случае актина, актинина и тубулина белки слияния демонстрировали заметную агрегацию, и повышенный внутриклеточный фоновый сигнал для белков слияния с актином, паксиллином и тубулином. Эти данные, вместе с результатами анализа in vitro, указывают на высокую склонность белка mKeima к образованию димеров.
Яркость и фотостабильность белков LSS-mKate позволяет проводить эксперименты по визушшзации внутриклеточной динамики в течение достаточно длительных промежутков времени. Микроскопия митохондрий, меченных LSS-mKate белками, в течение 40 минут под эпифлуоресцентным микроскопом с широким полем зрения показала отсутствие заметного фотообесвечивания флуоресцентных белков. Нормированные значения фотостабильности LSS-mKatel и LSS-mKate2 в живых клетках линии HeLa при высокой мощности возбуждающего света были в 3,6 раз и в 2 раза выше, чем у известного ECFP.
Клетки аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231, аденокарциномы молочной железы крысы MTLn3 и клетки MTLn3 со сверхэкспрессией рецептора эпидермального фактора роста ErbBl стабильно экспрессирующие гены белков LSS-mKate, локализованных в цитоплазме либо ядрах клеток, характеризовались высокой яркостью флуоресценции и нормальной скоростью пролиферации в культуре, тем самым указывая на низкую цитотоксичность FPs.
Уровень флуоресценция LSS-mKate в стабильных клеточных линиях не претерпевал заметных изменений в течение как минимум нескольких пассажей. Флуоресценция LSS-mKate в стабильных клеточных линиях MDA-MB-231 и MTLn3 демонстрировала хорошую фотостабильность в процессе получения изображений в течение длительных промежутков времени. Полувремена фотообесцвечивания в этих условиях оказались сходными с полученными для очищенных белков LSS-mKate. Наблюдаемое деление клеток во время длительной микроскопии свидетельствует о низкой фототоксичности использующихся LSS-mKate белков.
Наложение
Ш'и ■J|y КЗ
lfp jtßipi Е
ж . Щ X □
Ex 436/20 Em 605/40 Ex 570/30 Em 615/40
Рис. 7. Флуоресцентная микроскопия белков слияния LSS-mKatel, LSS-mKate2, и mKeima с гистоном Н2В, которые были совместно экспрессированы с mCherrv-a-тубулином. в живых клетках линии HeLa. Флуоресцентные изображения (левая колонка; красный цвет) были получены с использованием фильтров 436/20 для возбуждения и 605/40 для флуоресценции. Изображения стандартной красной флуоресценции (средняя колонка: зеленый цвет) были получены с использованием фильтров 570/30 для возбуждения и 615/40 для флуоресценции. В правой колонке представлены наложения изображений левой и центральной колонок. Маштабный отрезок равен 10 мкм.
С целью проверить возможность применения белков LSS-mKate в качестве дополнительного красного цвета при визуализации с существующими красными FPs со стандартным Стоксовым сдвигом, конструкции белков слияния LSS-mKate и mKeima были одновременно экспрессированы вместе с конструкциями mCherry-a-тубулии, TagRFP-a-актинин. и mKate-VSVG (белок ts045 вируса везикулярного стоматита G) в живых клетках линии HeLa (на Рис. 7 показаны клетки, экспрессирующие гены белков слияния LSS-mKatel, LSS-mKate2, и mKeima с гистоном Н2В. которые были совместно экспрессированы с тСЬеггу-а-тубулином). Два набора фильтров позволили визуализировать оба белка LSS-mKate с белками mCherry, TagRFP (Merzlyak et.а!.. 2007), или mKate без перекрывания сигналов между каналами. Белок mKeima демонстрировал сильную красную флуоресценцию при возбуждении светом 570/30, который, препятствовал получению изображений структур mChen-у-а-тубулин. TagRFP-а-актинин, и mKate-VSVG отдельно от белков слияния с mKeima. Красную флуоресценцию белков LSS-mKate при возбуждении 570/30 им не наблюдали даже в клетках с высоким уровнем экспрессии данных белков.
6. Многоцветная двухфотонная микроскопия в живых мышах
Для проведения многоцветной двухфотолной микроскопии ш vivo была использована модель ксенотрансплантанта метастатических клеток рака молочной железы у мышей. Гены белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 были стабильно экспрессированы в ядрах MTLn3 клеток. Дополнительно, в клетках
экспрессирующих LSS-mKatel, были коэкспрессированы белки ECFP в комплексе Гольджи и EGFP в цитоплазме. Таким образом, МТЬпЗ клетки, экспрессирующие LSS-mKatel могут быть легко отличимы от клеток, которые экспрессируют LSS-mKate2, по различным флуоресцентным сигналам. Данная особенность позволяет сравнивать физико-химические свойства LSS-mKate белков in vivo в абсолютно одинаковых условиях.
Смесь полученных флуоресцентных клеток была трансплантирована в молочную железу ТКИД (тяжелый комбинированный иммунодефицит) мышей. Через четыре недели введенные клетки сформировали раковую опухоль размером в несколько миллиметров. Кожа возле опухоли была заменена на оптическое стекло, что позволяло проводить микроскопию раковых клеток живой мыши в течение последующих нескольких недель.
|/,> ,-s— А ,/А-Щ- у f ¿ ш,- -——■< '§£, .— fJt • ■
ж '>> rfk f '.л J Г Г | £ w ■- Щ ,,,■
«IS-M ¿/-'»•А ■ vr - ' vV. ® !: 1 & ' ' * ; 1Щ'- * ' »i* *
Рис. 8. Прижизненная визуализация клеток раковой опухали в мыши с использованием двухфотонного возбуждения. Представлены изображения клеток МТЬпЗ с сверхэкспрессией ErbBl и стабильной экспрессией белков слияния сигнала ядерной локализации с LSS-mKatel (красный), |5-1,4-галактозилтрансферазы с ECFP (синий), и F.GFP (зеленый) в цитоплазме клетки, или со стабильной экспрессией белка слияния сигнала ядерной локализации с LSS-mK.ate2 (красный). Сигнал флуоресценции получали одновременно с сигналом генерации второй гармоники от коллагеновых волокон (серый). Изображения клеток опухоли получали в глубину по оси Z на 125 мкм с шагом в 5 мкм, на данном рисунке представлена серия снимков раковой опухоли на глубине 55, 60, 65, 70 и 75 мкм.
Эмпирически была найдена оптимальная длина волны двухфотонного лазера для одновременного возбуждения белков LSS-mKate, ECFP и EGFP. которая составила -870 им. Двухфотонный сканирующий микроскоп позволил получить серию изображений раковой опухоли с шагом в 5 микрон с максимальным проникновением вглубь ткани до 125 микрон (Рис. 8). Анализ полученных изображений показал, что LSS-mKate белки локализованы в ядрах и присутствуют практически во всех клетках опухоли. Яркость белка LSS-mKate2 in vivo оказалась в два раза выше яркости LSS-mKatel, что соответствует соотношению яркостей данных белков in vitro. Следует отметить, что по мере проникновения вглубь ткани
яркость ECFP и EGFP уменьшалась сильнее, чем яркость LSS-mKate белков. На глубине 100 микрон флуоресценция ECFP и EGFP была уже тусклой тусклой.
Пространственное разрешение снимков клеток раковой опухоли позволяли точно определить положение каждой отдельно взятой клетки и расположение в ней ядра, комплекса Гольджи и цитоплазмы. Это достоинство было использовано для изучения движения раковых клеток in vivo и для исследования взаимного расположения органелл клеток в раковой опухоли. В дельнейших экспериментах был использован белок LSS-mKatel. Предполагалось, что если удастся детектировать флуоресценцию LSS-mKatel в тканях живых мышей, то флуоресценция более яркого и фотостабильного LSS-mKate2 так же может быть надежно детектирована в подобных условиях.
Для визуализации движения клеток были получены серии снимков раковой опухоли до 60 микрон вглубь. Фотостабилыюсть LSS-mKatel при двухфотонном возбуждении была достаточна для длительной микроскопии MTLn3 клеток с гиперэкспрессией ErbBl в выбранном поле. Микроскопию определенной области опухоли проводили в течение 45-60 минут со сканированиями Z-серий каждые 5 минут. Обычно, наибольшей подвижностью раковые клетки обладают в непосредственной близости от кровеносного сосуда. Для облегчения поиска кровеносных сосудов, находящихся в бластоме, в кровь мыши непосредственно перед микроскопией был впрыснут комплекс флуоресцеин-декстран. Удалось проследить судьбу отдельной раковой клетки, которая мигрировала в бластоме в течение часа. Использование LSS-mKatel в комбинации с ECFP позволяет получать изображения раковых клеток в живых мышах с субклеточным разрешением, достаточным для детализации пространственного расположения клеточных органелл. Такое преимущество высокого разрешения было использовано для анализа взаимного расположения пар комплекс Гольджи-ядро в потенциально поляризованных клетках раковой опухоли (Рис. 9, а и б). Ранее было описано, что комплекс Гольджи идет впереди ядра во время миграции раковых клеток, вызванной искусственным повреждением тканей (ранением) (Nobes et.ai, 1999). Более того было установлено, что поляризация раковых клеток происходит в непосредственной близости к кровеносным сосудам (Wyckoff et.ai, 2000). Следовательно, в данной работе было проанализировано взаимное расположение пар комплекс Гольджи-
40 80 120160200240280320360400 Расстояние до сосуда, мкм
Отношение: 0-90 градусов/90-180 градусов
® ®кЗплекс Гольджи Р"с. 9- (а) Изображения расположения пар клеточная мембрана ЯДрО-КОМПЛвКС ГОЛЬДЖИ И ПОЛЯрИЗЭЦИИ
клеток in vivo, полученные с использованием двухфотонного возбуждения.
Представленные изображения клеток МП.пЗ со сверхэкспрессией ErbBI и стабильной экспрессией белков слияния сигнала ядерной локализации с LSS-mKalel (красный) и [3-1,4-галактозилтрансферазы с ECFP (синий), и флуоресцеии-декстраном (кровеносные сосуды, зеленый) показывают пары ядро-аппарат Гольджи (желтые стрелки) выстроившиеся в линию по соседству с кровеносным сосудом опухоли, Маштабный отрезок равен 50 мкм. (б) Диаграмма, демонстрирующая метод для расчета угла оси ядро-комплекс Гольджи относительно оси, направленной перпендикулярно к центру кровеносного сосуда. Расстояния ядро-сосуд рассчитывали по линейным сегментам (пример показан на (а), линии, обозначенные желтыми точками, отмеченные как I, 2 и 3). (в) Анализ углов расположения ядро-аппарат Гольджи-сосуд. Горизонтальная ось показывает расстояния от сосуда к ядру, вертикальная ось показывает количество пар 6 8 10 12 14 16 18 20 ядро-аппарат Гольджи характеризующихся Сегмент сосуда или малым углом (<90°, черные столбцы) или
большим углом (>90°, серые столбцы) расположения, рассчитанным относительно Олижайшего сегмента кровеносного сосуда. Данные представлены как значение ± SEM Столбцы графы (г) показывают отношение количества пар с низким углом (<90°) к количеству пар с высоким углом (>90°) в пределах 0-40 мкм для 21 различных сегментов сосуда.
ядро по отношению к центру ближайшего кровеносного сосуда, как функция
расстояния до сосуда (Рис. 9, в). Серии снимков по оси Z были произведены с шагом
в 2 мкм, углы расположения комплекса Гольджи к ядру рассчитывали по отношению
к перпендикулярной ориентации ядра клетки и центра ближайшего кровеносного
сосуда (Рис. 9, б, диаграмма). Для анализа кровеносные сосуды были
сегментированы на линейные области (Рис. 9, а, желтые пунктирные линии).
Проводили сравнение ориентации с углами менее 90° и углами более чем 90° (положение - аппарат Гольджи предшествующий ядру = 0 градусов). Хотя на расстоянии до сосуда больше чем 40 мкм значения углов расположения аппарата Гольджи распределялись случайным образом (0-180°), в пределах 40 мкм наблюдалось 50% увеличение пар аппарат Гольджи-ядро с углами меньше чем 90°
(/' < 0,05). Однако в пределах 40 мкм не все сегменты сосудов характеризовались увеличением количества ориентации с низкими величинами углов ориентации пар комплекс Гольджи-ядро (Рис. 9, г). Из 21 сегмента сосудов, содержащих пары аппарат Гольджи-ядро в пределах 40 мкм, приблизительно 70% сегментов обладали большинством пар комплекс Гольджи-ядро с углами расположения меньше чем 90°. Почти 25% сегментов сосуда содержали в два раза большее количество пар комплекс Гольджи-ядро с низким значением угла расположения, что указывает на поляризацию по направлению к центру кровеносного сосуда.
ВЫВОДЫ
1. Методами молекулярного клонирования и направленной эволюции на основе кДНК мономерного красного FP mKate, созданы мономерные красные FPs, названные LSS-mKatel и LSS-mKate2 с максимумами возбуждения/флуоресценции 463/624 нм и 460/605 им, соответственно.
2. Определены аминокислотные последовательности новых белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 и установлено влияние каждой введенной аминокислотной замены на основные физико-химические характеристики белков.
3. Были подробно исследованы основные физико-химические характеристики флуоресцентных белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 in vitro и in vivo. Определены двухфотонные характеристики LSS-mKatel и LSS-mKate2 белков, такие как двухфотонные спектры возбуждения и полупериоды фотообесцвечивания при двухфотонном возбуждении.
4. Были определены третичные структуры белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 с разрешением 2.0 и 1.5 Á. Изучены зависимости спектральных характеристик белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 от температуры, рН среды, протонно-дейтериевого состава растворителя, введения точечных аминокислотных замен. На основании полученных данных было доказано, что перенос протона в возбужденном состянии (ESPT) ответсвенен за большой Стоксов сдвиг в белках LSS-mKatel и LSS-mKate2.
5. Впервые была предложена схема рационального дизайна новых красных флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом на основе уже существующих красных флуоресцентных белков. Используя данную стратегию, была получена серия флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом,
которые обладают максимумами флуоресценции в широком диапазоне длин волн от 560 до 640 нм.
6. На модельных экспериментах продемонстрированы возможности LSS-mKatel и LSS-mKate2 в качестве оптимальных флуоресцентных маркеров для мечения клеточных белков.
7. Показано, что новые FPs LSS-mKate расширяют возможности многоцветного мечения клеток для двухфотонной микроскопии, добавляя новый красный цвет, и спектрально отличаются от существующих красных FPs при использовании для многоцветной стандартной микроскопии.
8. Впервые была проведена многоцветовая двухфотонная микроскопия живых тканей с субклеточным разрешением в режиме реального времени. Данное преимущество было использовано для определения взаимного расположения органелл клеток в раковой опухоли как функции расстояния до ближайшего кровеносного сосуда. Анализ полученных изображенный показал поляризацию пар комплекс Гольджи-ядро в раковых клетках, расположенных в непоредственной близости от кровеносного сосуда (менее 40 мкм).
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Петкевич, К.Д., Ефременко, E.H., Верхуша, В.В., Варфоломеев, С.Д. Красные флуоресцентные белки и их свойства. // Успехи химии, 2010, 79(3), 273-290.
2. Piatkevich K.P.. Malashkevich V.N., Almo S.C., and Verkhusha V.V. Engineering ESPT pathways based on structural analysis of LSSmKate red fluorescent proteins with large Stokes shift. II J. Am. Chem. Soc., 2010, 132:10762-70.
3. Piatkevich, K.P.. and Verkhusha V.V. Advances in engineering of fluorescent proteins and photoactivatable proteins with red emission. // Curr. Opin. Chem. Biol., 2010, 14: 2329.
4. Piatkevich, K.P., Hulit. J., Subach, O.M., Wu, В., Abdulla, A., Segall, J.E., and Verkhusha, V.V. // Monomeric red fluorescent proteins with a large Stokes shift. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2010,107: 5369-5374.
5. Morozova, K.S., Piatkevich, K.P., Gould, T.J., Zhang, J., Bewersdorf, J., and Verkhusha, V.V. Far-red fluorescent protein excitable with red lasers for flow cytometry and superresolution STED nanoscopy. // Biophys. J., 2010, 99:L13-15.
6. Subach, F.V., Subach, O.M, Gundorov, I.S., Morozova, K.S., Piatkevich, K.P.. Cuervo, A.M., and Verkhusha, V.V. // Monomeric fluorescent timers that change color from blue to red. Nature Chem. Biol., 2009, 5: 118-126.
7. Subach, O.M., Malashkevich, V.N., Zencheck, W.D., Morozova, K.S., Piatkevich,
K.P.. Almo, S.C., and Verkhusha, V.V. // Structural characterization of acylimine-
26
containing blue and red chromophores in mTagBFP and TagRFP fluorescent proteins. Chem. Biol. (Cellpress), 2010, 17: 333-341.
8. Subach O., Subach F., Morozova K., Piatkevich K.. Cuervo A., Verkhusha V. Development of new fluorescent proteins: a bright blue mTagBFP and the changing color from blue to red fluorescent timers. // The American Society for Cell Biology 48й Annual Meeting. 2008, San Francisco, USA, December 13-17, p. 124.
9. Петкевич К.Д.. Субач O.M., Верхуша B.B., Варфоломеев С.Д. Разработка мономерного флуоресцентного белка с большим стоксовым сдвигом. // VII Ежегодная Международная Молодежная Конференция ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая Физика». 2008, Москва, Россия, 11-13 ноября, с. 168-169.
10. Петкевич К.Д.. Субач О.М., Верхуша В.В., Варфоломеев С.Д. Создание мономерного красного флуоресцентного белка для мультифотонной микроскопии. // XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2009». 2009, Москва, Россия, 13-18 апреля, с. 27.
11. Piatkevich K.D.. Verkhusha V.V., Varfolomeyev S.D. A large Stokes shift red fluorescent protein for fluorescence energy transfer applications. // Intern. Conf. «Biocatalysis-2009: Fundamentals&Applications». 2009, Arkhangelsk, Russia, 19-24 June, p. 120.
12. Петкевич К.Д.. Верхуша B.B., Варфоломеев С.Д. Эффективная FRET-napa на основе красного флуоресцентого белка с большим Стоксовым сдвигом. // III Международная конференция: "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины", 2009, Ростов-на-Дону, Россия, 1-4 октября, с. 107-108.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ТКИД - тяжелый комбинированный иммунодефицит
ESPT - перенос протона в возбужденном состоянии
FRET - индуктивно-резонансный (Фёрстеровский) перенос энергии
FP - флуоресцентный белок
FPs - флуоресцентные белки
GFP - зеленый флуоресцентный белок
Подписано в печать:
14.01.2011
Заказ № 4834 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.auioreferat.ru
Содержание диссертации, кандидата химических наук, Петкевич, Кирилл Дмитриевич
ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Структурные свойства СЖР-иодобных красных флуоресцентных белков.
1.1.1. Кристаллическая структура флуоресцентных белков.
1.1.2. Структура и образование хромофора.
1.2. Физико-химические свойства красных флуоресцентных белков.
1.2.1. Источники флуоресцентных белков и хромопротеинов.
1.2.2. Агрегация.
1.2.3. Олигомеризация.
1.2.4. Созревание: фолдинг белка и образование хромофора.
1.2.5. Фотостабильность.
1.2.6. рН-устойчивость флуоресценции.
1.3. Улучшенные мономерные красные флуоресцентные белки.
1.4. Фотофизика и фотохимия флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом.
1.5. Применение красных флуоресцентных белков.
1.5.1. Красные флуоресцентные белки как репортерные маркеры.
1.5.2. Методы, основанные на индуктивно-резонансном переносе энергии.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы.
2.1.1. Реактивы.
2.1.2. Олигодезоксирибонуклеотиды, которые использовались дляПЦР.
2.1.3. Буферные растворы.
2.1.4. Питательные среды для микробиологических исследований.
2.1.5. Среды для клеточной биологии.
2.2. Методы молекулярной биологии.
2.2.1. Амплификация генов.
2.2.2. Гидролиз ДНК эндонуклеазой рестрикции.
2.2.3. Лигирование.
2.2.4. Трансформация бактерий.
2.2.5. Выделение плазмид.
2.2.6. Определение нуклеогидной последовательности.
2.2.7. Мутагенез со случайными заменами.
2.2.8. Направленный мутагенез.
2.2.9. Электрофорез в агарозном геле.
2.2.10. Скринирование библиотек мутантов.
2.2.11. Конструирование плазмид для клеток млекопитающих.
2.3. Выделение и характернзация рекомбинантных РРб.
2.3.1. Выделение и очистка белков.
2.3.2. Электрофорез белков.
2.3.3. Определение основных характеристик рекомбинантных белков.
2.3.4. Кристаллизация белков Ь88-тКа1е1 и Ь88-тКа1е2.
2.3.5. Сбор данных рентгеновской дифракции, решение и уточнение кристаллических структур.
2.4. Методы клеточной биологии.
2.4.1. Культивация и трансфекция клеток линии НеЬа.
2.4.2. Культивация и трансфекция клеток линий МТЪпЗ,
МТЪпЗ со сверхэкспрессией ЕгЬВ1 и МБА-МВ-231.
2.4.3. Получения клеточных линий стабильно эксперссирующих флуоресцентные белки.
2.4.4. Трансплантация раковых клеток в молочную железу ТКИД мышей.
2.5. Флуоресцентная микроскопия.
2.5.1. Микроскопия бактериальных колоний.
2.5.2. Флуоресцентная микроскопия животных клеток.
2.5.3. Флуоресцентная микроскопия животных клеток в культуре в режиме реального времени.
2.5.4. Прижизненная двухфотонная микроскопия миграции раковых клеток в опухоли.
2.5.5. Анализ поляризации пар ядро-комплекс Гольджи в клетках опухоли.
2.6. Общая схема создания новых красных ЖР.
2.6.1. Стратегия направленной молекулярной эволюции.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Создание красных флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом.
3.2. Основные физико-химические характеристики очищенных белков Ь88-тК^е1 и Ь88-тКа(е2.
3.3. Кристаллическая структура белков Ь88-тКа(е1 и Ь88-тКа1е2.
3.4. Микроокружение хромофоров в белках Ь88-тКа1с1 и Ь88-тК^е2.
3.5. Зависимость спектральных свойств белков
Ь88-тКа1е1 и Ь88-тКа1е2 от рН.
3.6. Температурные и изотопные эффекты в белках Ь88-тКа1е1 и Ь88-тКа1е2.
3.7. Конверсия стандартных флуоресцентных белков во флуоресцентные белки с большим Стоксовым сдвигом.
3.8. Характсризация белков Ь88-тКа1е1 и LSS-mKate2 в живых клетках.
3.9. Многоцветная двухфотонная микроскопия в живых мышах.
4. ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. Характеристики красных РРэ Ь88-тКа1е1 и Ь88-шКа1е2.
4.2. Зависимость спектральных свойств белков
Ь88-тКа1е1 и 1,88-тКЖе2 от рН.
4.3. Предполагаемый фотоцикл для белков Ь88-тКа1е.
4.4. Свойства мутантных белков с большим Стоксовым сдвигом, полученных из стандартных ЕРв.
4.5. Многоцветная двухфотонная микроскопия в живых мышах.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и применение мономерных красных флуоресцентных белков с большим стоксовым сдвигом"
Актуальность темы. В последнее десятилетие одним из наиболее приоритетных методов исследований в биологии и медицине стала визуализация различных процессов, происходящих в живых организмах, тканях или клетках в режиме реального времени с помощью флуоресцентных маркеров. Особое место среди них занимает зеленый флуоресцентный белок (вРР), его варианты и гомологи. Главными преимуществами ОБР-подобных белков при их использовании являются высокая стабильность и способность к формированию хромофора без участия кофакторов, ферментов или каких-либо субстратов, кроме молекулярного кислорода [1, 2]. Таким образом, возникает возможность образования хромофора и возникновения свечения непосредственно в живых организмах, тканях или клетках [3]. Оказалось, что И- и С-концы флуоресцентных белков (ИРб) доступны для создания гибридных белков, что позволяет осуществлять сшивку флуоресцентного белка с белком-мишенью. При этом флуоресцентный белок (БР) не оказывает влияние на локализацию и функцию исследуемого белка. Это свойство делает ОБР-подобные белки уникальными генетически кодируемыми флуоресцентными маркерами, которые стали незаменимыми инструментами для изучения взаимодействия белков, их локализации и транспорта [4, 5], а также биосенсоров внутриклеточных метаболитов, позволяющих определять концентрацию Са2+ и цАМФ, рН, мембранный потенциал, активность некоторых ферментов (например, каспаз, киназ и протеаз) в живой клетке [6, 7, 8]. Разработаны методы, позволяющие детектировать взаимодействия между интересующими белками [9, 10].
Клонирование генов ОРР-подобных белков, флуоресцирующих в желтой, оранжевой, красной и дальней красной областях спектра, явилось очередным этапом в использование флуоресцентных белков при проведении исследований в области биологии [11]. Одновременное использование нескольких БРб с разными спектральными характеристиками привело к развитию современных методов исследований, позволяющих изучение многофакторных процессов в живой клетке и многоклеточном организме [12]. Последующие научные исследования посттрансляционной химии, структуры и свойств ОРР-подобных белков позволили разработать подходы к созданию новых флуоресцентных белков с улучшенными и даже заданными свойствами, которые нашли свое применение в биотехнологии и микроскопии [13-18].
Все красные БРб дикого типа, так же как и первые улучшенные версии на их основе, обладали рядом существенных недостатков, таких как неполное и медленное образование хромофора, примесь зеленой флуоресцентной формы хромофора, склонность к агрегации и олигомеризации [19]. Любой из перечисленных недостатков значительно ограничивает применение РР. Получение оптимальных красных РРб является очень актуальной проблемой, решение которой значительно расширяет возможности применения БРв в биологии и биотехнологии. В настоящее время наиболее эффективным методом получения улучшенных версий красных РРб является сочетание случайного и сайтнапрваленного мутагенеза с высоко эффективными техниками сортировки и отбора клеток [20, 21]. Данная стратегия уже была успешно использована для получения ряда РРб с заранее заданными физико-химическими характеристиками [22-24].
Практическая значимость красных флуоресцентных белков особенно велика для микроскопии тканей и целых организмов, так как свет с большей длиной волны лучше проникает в биологические образцы. Это объясняется тем, что вода, меланин и гемоглобин, основные вещества, которые поглощают свет в биологических тканях, имеют минимальный коэффициент экстинкции в диапазоне длин волн от 600 до 1100 нм [25]. Данный диапазон длин волн называется "оптическим окном" и является оптимальным для микроскопии биологических тканей и целых организмов. Более того, использование РРэ с максимумом флуоресценции выше 600 нм может повысить чувствительность детекции флуоресценции. Это связано с тем, что автофлуоресценция клеток (флуоресценция флавинов, витаминов, ЫАО(Р)Н) и светорассеивание в тканях уменьшаются с увеличением длины волны.
На данный момент одним из лучших методов, позволяющих получать высококачественное трехмерное изображение живых тканей на глубину вплоть до 1 миллиметра, является мультифотонная микроскопия [26]. В двухфотонном микроскопе обычно используется сапфировый лазер, испускающий инфракрасное излучение. Использование красных РРв в мультифотонной микроскопии может открыть новые возможности для проведения исследований живых тканей и целых организмов с субклеточным разрешением в режиме реального времени. Однако красные РРб не могут быть эффективно возбуждены стандартным коммерчески доступным инфракрасным лазером, так как спектры их двухфотонного поглощения лежат в более длинноволновой области относительно рабочего диапазона длин волн двухфотонного лазера [27]. Возможным подходом к решению данной проблемы может быть разработка красного FP спектр возбуждения которого смещен в коротковолновую область, или, другими словами, красного FP с большим Стоксовым сдвигом.
В настоящее время существует острая необходимость дальнейшего развития методов визуализации биологических объектов для выяснения фундаментальных основ жизнедеятельности клеток в условиях нормы и патологий различного происхождения. Создание новых вариантов флуоресцентных белков с длиной волны флуоресценции более 600 нм и при этом характеризующиеся большим Стоксовым сдвигом является актуальной задачей, которая имеет большое теоретическое и практическое значение. Более того, сочетание подобных белков с зеленым или синим FPs может быть также использовано для многоцветной мультифотонной микроскопии, что позволит одновременно наблюдать за нескольким клеточными процессами. Введение этих белков в практику экспериментальной работы невозможно без выяснения механизмов, лежащих в основе спектральных свойств FPs, а также изучения связи между их структурой и оптическими, а также биохимическими характеристиками. Изучение механизма большого Стоксового сдвига в красных флуоресцентных белках может позволить рациональный дизайн новых красных FPs с большим Стоксовым сдвигом на основе существующих стандартных флуоресцентных белков.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлось создание на основе гена белка mKate новых мономерных красных FPs с большим Стоксовым сдвигом, с длиной волны максимума флуоресценции более 600 нм, исследование связи особенностей первичной структуры новых белков с их спектральными свойствами и фотохимическими характеристиками, а также оценка возможности практического применения новых красных FPs в белках слияния с различными клеточными белками в живых клетках в качестве флуоресцентного маркера для многоцветной одно- и мультифотонной микроскопии in vivo.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Методами молекулярного клонирования и эволюции создать новые красные флуоресцентные белки с большим Стоксовым сдвигом, обладающие длиной волны максимума флуоресценции более 600 нм на основе гена мономерного красного FP mKate (длина волны флуоресценции 635 нм).
2. Измерить спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции, спектры двухфотонного поглощения, определить величины фотостабильности, квантового выхода, коэффициента экстинкции. яркости, скорости созревания хромофора и рН-стабильности флуоресценции, исследовать олигомерное состояние LSS-mKate белков. Сравнить полученные характеристики с соответствующими значениями для существующего красного флуоресцентного белка с большим Стоксовым сдвигом mKeima (Стоксов сдвиг состовляет 180 нм) и другими страндартыми флуоресцентными белками других диапозонов флуоресценции.
3. Установить аминокислотные замены, ответственные за увеличение Стоксового сдвига флуоресценции, а также влияющие на биохимические характеристики новых LSS-mKate белков. Установить молекулярный механизм флуоресценции LSS-mKate белков.
4. Проанализировать возможности практического использования белков LSS-mKate в живых клетках путем создания и анализа экспрессии его химерных генетических конструкций с клеточными белками в клетках млекопитающих, а также с помощью однофотонной микроскопии показать возможности многоцветного мечения клеток новыми LSS-mKate 1 и LSS-mKate2 и уже известными красными FPs в живых тканях.
5. Исследовать возможности практиктического использования белков LSS-mKate 1 и LSS-mKate2 для многоцветной двухфотонной микроскопии живых тканей и организмов.
Объект исследования — метод создания мономерных флуоресцентных белков с длиной волны флуоресценции более 600 нм и большим Стокосовым сдвигом, связь первичной структуры с флуоресцентными и биохимическими свойствами новых FPs; возможность их применения в клетчной биологии и онкологии.
Предмет исследования — ген FP mKate, мутантные варианты mKate, флуоресцентные белки LSS-mKate, их первичная, вторичная и третичная структуры, спектральные и фотохимические характеристики, химерные конструкции LSS-mKate белков с клеточными белками.
Методы исслдования - молекулярное клонировние, электрофорез в полиакриламидном геле, методы трансфекции клеток в культуре, случайный и сайт-направленный мутагенезы, анализ первичной структуры ДНК, кристаллизация белков, спектрофотометрия, спектрофлуориметрия, проточная цитофлуориметрия, флуоресцентная одно- и двухфотонная микроскопии.
Научная новизна полученных результатов. Созданы два новых красных РРб ЬББ-шКа1е1 и Ь88-тКа1е2 с максимумами возбуждения около 460 нм и максимумами флуоресценции более 600 нм. Полученные Ь88-тКа1е белки обладали улучшеными физико-химическими свойствами по сравнению с таковыми для единственного ранее опубликованного красного белка с большим Стоксовым сдвигом тКеппа. Определены аминокислотные последовательности полученных белков. Установлены аминокислотные остатки, ответственные за сдвиг максимумов возбуждения в коротковолновую область и биохимические свойтсва новых белков.
Описаны спектральные и фотохимические свойства Ь88-тКаге1 и Ь88-тКМе2. Измерены полупериоды формирования хромофора, эффективность созревания хромофора и рН-зависимость интенсивности флуоресценции для Ь88-тКа1е белков. Установлено, что флуоресценция Ь88-тКа1е1 и Р88-тКа1е2 является самой рН-стабильной из все известных красных флуоресцентных белков. Установлены структурно-функциональные изменения белка тКа{е, которые определяют флуоресцентные и биохимические свойства ЬЗв-шКаге белков в процессе искусственного отбора.
Впервые показано, при сравнении с аналогичными характеристиками уже существующего красного РТ тКеппа с большим Стоксовым сдвигом, Ь88-тКа1е белки обладают существенными преимуществами для применения в клеточной биологии.
Были решены кристаллические структуры белков Ь88-тКа1с1 и 1>88-тКа1е2 во флуоресцентных состояниях с разрешением 2.0 и 1.5 А. Изучены зависимости спектральных характеристик белков Ь88-тКа1е1 и Ь88-шКа1е2 от температуры, рН среды, протонно-дейтериевого состава растворителя. На основании полученных данных были предложены молекулярные механизмы большого Стоксового сдвига для Ь88-тКа1е1 и Р88-тКа1е2.
Впервые была предложена схема рационального дизайна новых красных флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом на основе уже существующих стандартных красных флуоресцентных белков. Используя данную стратегию, была получена серия флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом, которые обладают максимумами флуоресценции в широком диапазоне длин волн от 560 до 640 нм.
Показано, что новые РРэ Ь88-шКа1е расширяют возможности многоцветного мечения клеток для двухфотонной микроскопии, добавляя новый красный цвет, и спектрально отличаются от существующих красных РРб при использовании для многоцветной однофотонной микроскопии. Впервые была проведена многоцветовая двухфотонная микроскопия с субклеточным разрешением в режиме реального времени живых тканей. Данное преимущество было использовано для анализа взаимного расположения органелл клеток в раковой опухоли как функции расстояния до ближайшего кровеносного сосуда. Высокая фотостабильность LSS-mKate белков сделала возможным длительное наблюдение за отдельно взятой клеткой при ее миграции в раковой опухоли. Анализ полученных изображенный показал, поляризацию пар комплекс Гольджи-ядро в раковых клетках, расположенных в непоредственной близости от кровеносного сосуда (менее 40 мкм).
Практическое значение полученных результатов. Практическое значение результатов диссертационной работы состоит прежде всего в том, что новые красные флуоресцентные белки LSS-mKate могут быть эффективно использованы для многоцветной двухфотонной микроскопии живых тканей. Спектральные характеристики LSS-mKate белков оптимальны для визуализации живых клеток и тканей с субклеточным разрешением в течение длительного времени. Белки LSS-mKate лишены таких серьезных недостатков, как склонность к агрегации в живых клетках, низкая рН-стабильность и остаточная зеленая флуоресценция и, таким образом, имеют большой потенциал применения в биотехнологии. Созданные FPs раскрывают новые возможности многоцветного мечения биологических объектов, поскольку могут быть эффективно спектрально разрешены с другими стандартными флуоресцентными белками. В паре с уже существующими синими FPs, LSS-mKatel и LSS-mKate2 могут использоваться для создания молекулярных биосенсоров, работающих на основе безизлучательного переноса энергии (FRET). Белки LSS-mKate возбуждаются стандартными синими лазерами 407 им и 457 нм проточных цитофлуориметров, благодаря чему могут стать полезным инструментом для биомедицинских исследований.
Предложенная схема рационального дизайна красных флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом может быть использована для получения новых подобных FPs с улучшенными и заданными свойствами.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В 1663 году английский естествоиспытатель Роберт Гук, рассматривая тонкий срез бутылочной пробки под примитивным микроскопом, заметил, что изучаемый предмет пронизан мельчайшими отверстиями и порами. Наблюдаемое напомнило Гуку медовые соты или монашеские кельи, которые назывались "cellula". Роберт Гук дал им название ячейки или клетки, тем самым введя термин для обозначения минимальных строительных блоков всех живых организмов. Изобретенный Гуком микроскоп с 50 кратным увеличением позволил заглянуть в раннее не видимый микроскопический мир. Спустя 330 лет другое знаменательное открытие позволило взглянуть на мир клеток в другом свете. Это был 1994 год, когда Мартин Чалфи с сотрудниками опубликовали в журнале Science статью, в которой показали, что GFP из медузы Aequorea victoria может быть использован как маркер локализации белков, гены которых экспрессируются в клетках бактерий и червей [28]. Совместно с новыми методами микроскопии клонирование гена GFP и его гомологов и последующее успешное их применение в живых клетках качественно изменило проведение исследований в биологии и медицине. В настоящее время GFP и его гомологи являются одними из наиболее широко используемых генетически кодируемых маркеров в различных областях биологии и медицины.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Петкевич, Кирилл Дмитриевич
выводы
В данной диссертационной работе приведены результаты разработки и исследования структурно-функциональных свойств новых красных РРэ Ь58-тКа!е1 и Ь88-тКа1е2 с большим Стоксовым сдвигом: аминокислотной последовательности и замен, ответственных за красную флуоресценцию с большим Стоксовым сдвигом, скорость и эффективность созревания хромофора, зависимость интенсивности флуоресценции от рН. Проведены измерения спектральных и фотохимических характеристик Ь88-тКа1е1 и Ь88-шКа1е2 и их сравнение с соответствующими параметрами единственного известного красного БР с большим Стоксовым сдвигом тКета. Белки 1Х8-тКа1е1 и Ь88-тКаге2 характеризуются быстрым и полным созреванием хромофора, высокой рН и фотостабильностью и низкой цитотоксичностью, что делает эти белки привлекательными флуоресцентными маркерами для молекулярной и клеточной биологии. Решены кристаллические структуры ЬЗй-тКаСе 1 и Ь88-тКа1е2 в их флуоресцентном состоянии с разрешением 2.0 и 1.5 А, соответственно. Анализ кристаллических структур Ь88-тКаге1 и Ь88-шКа1е2 совместно с данными мутагенеза и спектроскопическими исследованиями позволили установить молекулярный механизм красной флуоресценции с большим Стоксовым сдвигом. Понимание структурных особенностей белков Ь88-тКа1е позволило разработать стратегию для рационального дизайна РРб с большим Стоксовым сдвигом. Данная стратегия была успешно использована для получения серии новых оранжевых и красных БРб с большим Стоксовым сдвигом. Продемонстрированы возможности и преимущества практического применения Ь88-тКа1е1 и Ь88-шКа1е2 как дополнительного красного цвета в клеточной биологии на примерах флуоресцентной микроскопии.
1. Методами молекулярного клонирования и эволюции на основе кДНК мономерного красного БР шКа!е (максимумы возбуждения 588 нм и флуоресценции 635 нм), созданы мономерный красный флуоресцентные белки Ь88-тКа1е1 и Ь88-шКа1е2 с максимумами возбуждения и флуоресценции 463/624 нм и 460/605 нм, соответственно.
2. Установлено, что аминокислотнае последовательности новых белков Ь88-тКа1е1 и Ь88-тКаГе2 отличается от исходного тКа1е заменами шести аминокислотных остатков, а именно ЬуБб9Туг, Рго13ПЪг, 8ег14801у, Меаб701и, ТЫ-ШБег, МеП96Уа1 и Ьув69Туг, РгоШТЬг, 8ег14801у, Меаб7Азр, ТЬг1838ег, Ме1196Уа1, соотвественно. Введение глутаминовой или аспарагиновой аминокислот (167Glu или 167Asp), которые находятся в микроокружении хромофорного фенольного цикла, приводит к возниконовения красной флуоресценции с большим Стоксовым сдвигом. Мутации Lys69Tyr и Serl48Gly значительно повышают рН- и фотостабильность, а замены ProlSlThr и Thrl83Ser увеличивают скорость и полноту созревания хромофора.
3. В работе представлены результаты измерений основных физико-химических характеристик FP LSS-mKatel и LSS-mKate2: квантовые выходы равны 0.08 и 0.17; молярные коэффициенты экстинкции равны 31,200 и 26,000 М^см"1; рН-стабилыюсть с величинами рКа равными 3.2 и 2.7; полупериод фотообесцвечивания - 60 и 44 секунд; полупериоды созревания при 37°С равные 100 и 150 минутам; и показана мономерность полученных белков. Определены двухфотонные характеристики LSS-mKatel и LSS-mKate2 белков, такие как двухфотонные спектры возбуждения и полупериоды фотообесцвечивания при двухфотонном возбуждении.
4. Показано, что, по сравнению с единственным описанным красным FPs с большим Стоксовым сдвигом mKeima, LSS-mKatel и LSS-mKate2 обладают рядом преимуществ, такими как высокая рН-стабильность и фотостабильность, отсутствие остаточной красной флуоресценции со стандартным Стоксовым сдвигом. Более того LSS-mKatel и LSS-mKate2 являются самыми рН-стабильными белками среди всех красных FPs известных на данный момент.
5. Были решены кристаллические структуры белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 во флуоресцентных состояниях с разрешением 2.0 и 1.5 А. Изучены зависимости спектральных характеристик белков LSS-mKatel и LSS-mKate2 от температуры. рН среды, протонно-дейтериевого состава растворителя. На основании полученных данных было доказано, что перенос протона в возбужденном состянии ESPT ответсвенен за большой Стоксов сдвиг в белках LSS-mKatel и LSS-mKate2.
6. Впервые была предложена схема рационального дизайна новых красных флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом на основе уже существующих стандартных красных флуоресцентных белков. Используя данную стратегию, была получена серия флуоресцентных белков с большим Стоксовым сдвигом, которые обладают максимумами флуоресценции в широком диапазоне длин волн от 560 до 640 нм.
7. На модельных экспериментах продемонстрированы возможности Ь88-тКа1е1 и ЬББ-шКа1е2 как флуоресцентных маркеров. Созданы белки слияния Ь88-тКа1е1 и Ь88-тКа1е2 с 6-ю различными клеточными белками и 3-мя локализующими пептидами. Отмечена специфическая локализация всех меченых клеточных белков, отсутствие агрегатов и высокая рН- и фотостабильность, что свидетельствует об оптимальности Ь88-тКа1е белков в качестве клеточного маркера.
8. Показано, что новые РРб Ь88-тКа1е расширяют возможности многоцветного мечения клеток для двухфотонной микроскопии, добавляя новый красный цвет, и спектрально отличаются от существующих красных РРб при использовании для многоцветной однофотонной микроскопии.
9. Впервые была проведена многоцветовая двухфотонная микроскопия с субклеточным разрешением в режиме реального времени живых тканей. Данное преимущество было использовано для анализа взаимного расположения органелл клеток в раковой опухоли как функции расстояния до ближайшего кровеносного сосуда. Высокая фотостабильность ЬБ8-тКа1е белков сделала возможным длительное наблюдение за отдельно взятой клеткой при ее миграции в раковой опухоли. Анализ полученных изображенный показал поляризацию пар комплекс Гольджи-ядро в раковых клетках, расположенных в непоредственной близости от кровеносного сосуда (менее 40 мкм).
Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Петкевич, Кирилл Дмитриевич, Москва
1. Heim R. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein / R.Heim, D. C. Prasher, R. Y. Tsien // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1994. - V. 91. - P. 1250112504.
2. Tsien R. Y. The green fluorescent protein / R. Y. Tsien // Annu. Rev. Biochem. 1998. — V. 67. -P. 509-544.
3. Understanding, improving and using green fluorescent proteins / A. B. Cubitt, R. Heim, S. R. Adams et al. // Trends Biochem. Sei. 1995. - V. 20. - P. 448-455.
4. Review — The fluorescent toolbox for assessing protein location and function / B. N. G. Giepmans, S. R. Adams, M. H. Ellisman and R. Y. Tsien // Science. 2006. - V. 312. - P. 217224.
5. Fluorescent proteins as biomarkers and biosensors: throwing color lights on molecular and cellular processes / O.V. Stepanenko, V.V. Verkhusha, I.M. Kuznetsova et al. // Curr. Protein Pept. Sei. 2008. - V. 9. - P. 338-369.
6. Zacharias D. A. Recent advances in technology for measuring and manipulating cell signals / D. A. Zacharias, G. S. Baird, R. Y. Tsien // Curr. Opin. Neurobiol. 2000. - V. 10. - P. 416-421.
7. Dynamic redistribution of calmodulin in HeLa cells during cell division as revealed by a GFP-calmodulin fusion protein technique / C. J. Li, R. Heim, P. Lu et al. // J. Cell Sei. 1999.- V. 112. -P. 1567-1577.
8. Transgenic mice expressing a pH and Cl-sensing yellow-fluorescent protein under the control of a potassium channel promoter / F. Metzger, V. Repunte-Canonigo, S. Matsushita et al. // Eur. J. Neurosci. 2002. - V. 15. - P. 40-50.
9. Hu C. D. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis / C. D. Ни, Т. K. Kerppola // Nat. Biotechnol. — 2003.-V. 21.-P. 539-545.
10. Shaner N.C. Advances in fluorescent protein technology / Shaner N.C., Patterson G.H., Davidson M.W. // J. Cell Sei. 2007. - V. 120. - P. 4247-4260.
11. Heim R. Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence energy transfer / R. Heim, R.Y.Tsien // Curr. Biol. 1996. - V. 6. - P. 178-182.
12. Far-red fluorescent proteins evolved from a blue chromoprotein from Actinia equina / Shkrob, M.A., Yanushevich, Y.G., Chudakov D.M. et al. // Biochem. J. 2005. - V. 392. - P. 649-654.
13. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore / Mishin A.S., Subach F.V., Yampolsky I.V. et al. // Biochemistry. 2008. - V. 47. -P. 4666-4673.
14. Optimized and far-red-emitting variants of fluorescent protein eqFP611 / Kredel S., Nienhaus K., Oswald F. et al. // Chem. Biol. 2008. - V. 15. - P. 224-233.
15. Global Protein Stability Profiling in Mammalian Cells / Yen H. C. S., Xu Q. K., Chou D. M. et al. // Science. 2008. - V. 322. - P. 918-923.
16. Wu L. Syntheses of highly fluorescent GFP-chromophore analogues / L. Wu, K. J. Burgess // Am. Chem. Soc. 2008. - V. 130. - P. 4089-4096.
17. Piatkevich, K.D., Efremenko, E.N., Verkhusha, V.V., and Varfolomeev, S.D. Red fluorescent proteins and their properties. Russ. Chem. Reviews 2010, 79: 243-258.
18. Campbell RE, Tour O, Palmer AE, Steinbach PA, Baird GS, Zacharias DA, Tsien RY. A monomeric red fluorescent protein. Proc Natl Acad Sei USA. 2002 Jun 11;99(12):7877-82.
19. Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE, Tsien RY. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 2004 Dec;22(l2): 1567-72.
20. Subach OM, Gundorov IS, Yoshimura M, Subach FV, Zhang J, Grüenwald D, Souslova EA, Chudakov DM, Verkhusha VV. Conversion of red fluorescent protein into a bright blue probe. Chem Biol. 2008 Oct 20;15(10):1116-24.
21. Subach FV, Subach OM, Gundorov IS, Morozova KS, Piatkevich KD, Cuervo AM, Verkhusha VV. Monomeric fluorescent timers that change color from blue to red report on cellular trafficking. Nat Chem Biol. 2009 Feb;5(2):l 18-26.
22. Subach FV, Patterson GH, Manley S, Gillette JM, Lippincott-Schwartz J, Verkhusha VV.Photoaetivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat Methods. 2009 Feb;6(2): 153-9.
23. König K. Multiphoton microscopy in life sciences. J Microsc. 2000 Nov;200(Pt 2):83-104.
24. Zipfel WR, Williams RM, Webb WW. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 2003 Nov;21(l 1): 1369-77.
25. Drobizhev M, Tillo S, Makarov NS, Hughes TE, Rebane A. Absolute two-photon absorption spectra and two-photon brightness of orange and red fluorescent proteins. J Phys Chem B. 2009 Jan 29;113(4):855-9.
26. Green fluorescent protein as a marker for gene expression / M. Chalfle, Y. Tu, G. Euskirchen et al. // Science. 1994,-V. 263.-P. 802-805.
27. Wall MA, Socolich M, Ranganathan R. The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed. Nat Struct Biol. 2000 Dec;7(12):l 133-8.
28. Yarbrough D, Wächter RM, Kallio K, Matz MV, Remington SJ. Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. Proc Natl Acad Sei USA. 2001 Jan 16;98(2):462-7.
29. Vrzheshch PV, Akovbian NA, Varfolomeyev SD, Verkhusha VV. Denaturation and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions. FEBS Lett. 2000 Dec 29;487(2):203-8.
30. Petersen J, Wilmann PG, Beddoe T, Oakley AJ, Devenish RJ, Prescott M, Rossjohn J. The 2.0-A crystal structure of eqFPôll, a far red fluorescent protein from the sea anemone Entacmaea quadricolor. J Biol Chem. 2003 Nov 7;278(45):44626-31.
31. He X, Bell AF, Tonge PJ. Synthesis and spectroscopic studies of model red fluorescent protein chromophores. Org Lett. 2002 May 2;4(9): 1523-6.
32. Gross LA, Baird GS, Hoffman RC, Baldridge KK, Tsien RY. The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc Natl Acad Sei USA. 2000 Oct 24;97(22): 11990-5.
33. Remington SJ, Wächter RM, Yarbrough DK, Branchaud B, Anderson DC, Kallio K, Lukyanov KA. zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore. Biochemistry. 2005 Jan 11;44(1):202-12.
34. Quillin ML, Anstrom DM, Shu X, O'Leary S, Kallio K, Chudakov DM, Remington SJ. Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution. Biochemistry. 2005 Apr 19;44(15):5774-87.
35. Yampolsky IV, Remington SJ, Martynov VI, Potapov VK, Lukyanov S, Lukyanov KA. Synthesis and properties of the chromophore of the asFP595 chromoprotein from Anemonia sulcata. Biochemistry. 2005 Apr 19;44(15):5788-93.
36. Ugalde JA, Chang BS, Matz MV. Evolution of coral pigments recreated. Science. 2004 Sep 3;305(5689):1433.
37. Sniegowski JA, Lappe JW, Patel HN, Huffman HA, Wächter RM. Base catalysis of chromophore formation in Arg96 and Glu222 variants of green fluorescent protein. J Biol Chem. 2005 Jul 15;280(28):26248-55.
38. Bulina ME, Chudakov DM, Mudrik NN, Lukyanov KA. Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. BMC Biochem. 2002 Apr 24;3:7.
39. Lin MZ, McKeown MR, Ng HL, Aguilera TA, Shaner NC, Campbell RE, Adams SR, Gross LA, Ma W, Alber T, Tsien RY. Autofluorescent proteins with excitation in the optical window for intravital imaging in mammals. Chem Biol. 2009 Nov 25;16(11):1169-79.
40. Nienhaus K, Nar H, Heilker R, Wiedenmann J, Nienhaus GU. Trans-cis. isomerization is responsible for the red-shifted fluorescence in variants of the red fluorescent protein eqFP611. J Am Chem Soc. 2008 Sep 24;130(38):12578-9.
41. Remington S. J. Structural basis for understanding spectral variations in green fluorescent protein / S. J. Remington // Methods Enzymol. 2000. - V. 305. - P. 196-211.
42. Defining the role of arginine 96 in green fluorescent protein fluorophore biosynthesis / T.I. Wood, D.P. Barondeau, C. Hitomi et al. // Biochemistry. 2005. - V. 44. - P. 16211-16220.
43. Amino acid substitutions around the chromophore of the chromoprotein Rtms5 influence polypeptide cleavage / K. Turcic, A. Pettikiriarachchi, J. Battad et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. -2006. V. 340. - P. 1139-1143.
44. Voliani V, Bizzarri R, Nifosi R, Abbruzzetti S, Grandi E, Viappiani C, Beltram F. Cis-trans photoisomerization of fluorescent-protein chromophores. J Phys Chem B. 2008 Aug 28; 112(34): 10714-22.
45. Day RN, Davidson MW. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 2009 0ct;38(10):2887-921.
46. Labas Y A, Gurskaya NG, Yanushevich YG, Fradkov AF, Lukyanov KA, Lukyanov SA, Matz MY. Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 2002 Apr 2;99(7):4256-61.
47. Wiedenmann J, Elke C, Spindler KD, Funke W Cracks in the beta-can: fluorescent proteins from Anemonia sulcata (Anthozoa, Actinaria). Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Dec 19;97(26):14091-6.
48. Gurskaya NG, Fradkov AF, Terskikh A, Matz MV, Labas YA, Martynov VI, Yanushevich YG, Lukyanov KA, Lukyanov SA. GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. FEBS Lett. 2001 Oct 19;507(l):16-20.
49. Shcherbo D, Merzlyak EM, Chepurnykh TV, Fradkov AF, Ermakova GV, Solovieva EA, Lukyanov KA, Bogdanova EA, Zaraisky AG, Lukyanov S, Chudakov DM. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods. 2007 Sep;4(9):741-6.
50. Karasawa S, Araki T, Nagai T, Mizuno H, Miyawaki A. Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 2004 Jul l;381(Pt 1):307-12.
51. Yanushevich YG, Staroverov DB, Savitsky AP, Fradkov AF, Gurskaya NG, Bulina ME, Lukyanov KA, Lukyanov SA. A strategy for the generation of non-aggregating mutants of Anthozoa fluorescent proteins. FEBS Lett. 2002 Jan 30;511(1-3):11-4.
52. Baird GS, Zacharias DA, Tsien RY. Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Oct 24;97(22):11984-9.
53. Bevis BJ, Glick BS. Rapidly maturing variants of the Discosoma red fluorescent protein (DsRed). Nat Biotechnol. 2002 Jan;20(l):83-7.
54. Mizuno H, Sawano A, Eli P, Hama H, Miyawaki A. Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer. Biochemistry. 2001 Feb 27;40(8):2502-10.
55. Lauf U, Lopez P, Falk MM. Expression of fluorescently tagged connexins: a novel approach to rescue function of oligomeric DsRed-tagged proteins. FEBS Lett. 2001 Jun 1;498(1):11-5.
56. Heikal AA, Hess ST, Baird GS, Tsien RY, Webb WW. Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins: coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Oct 24;97(22): 11996-2001.
57. Kogure T, Karasawa S, Araki T, Saito K, Kinjo M, Miyawaki A. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat Biotechnol. 2006 May;24(5):577-81.
58. Wang Z, Shah JV, Chen Z, Sun CH, Berns MW. Fluorescence correlation spectroscopy investigation of a GFP mutant-enhanced cyan fluorescent protein and its tubulin fusion in living cells with two-photon excitation. J Biomed Opt. 2004 Mar-Apr;9(2):395-403.
59. Subach FV, Patterson GH, Renz M, Lippincott-Schwartz J, Verkhusha VV. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein lor two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 2010 May 12; 132(18>:6481-91.
60. Jain RK, Joyce PB, Molinete M, Halban PA, Gorr SU. Oligomerization of green fluorescent protein in the secretory pathway of endocrine cells. Biochem J. 2001 Dec 15;360(Pt 3):645-9.
61. Chen JC, Viollier PH, Shapiro L. A membrane metalloprotease participates in the sequential degradation of a Caulobacter polarity determinant. Mol Microbiol. 2005 Feb;55(4):1085-103.
62. Fradkov AF, Verkhusha W, Staroverov DB, Bulina ME, Yanushevich YG, Martynov VI, Lukyanov S, Lukyanov KA. Far-red fluorescent tag for protein labelling. Biochem J. 2002 Nov 15;368(Pt 1): 17-21.
63. Kogure T, Kawano H, Abe Y, Miyawaki A. Fluorescence imaging using a fluorescent protein with a large Stokes shift. Methods. 2008 Jul;45(3):223-6.
64. Shcherbo D, Murphy CS, Ermakova GV, Solovieva EA, Chepurnykh TV, Shcheglov AS, Verkhusha VV, Pletnev VZ, Hazelwood KL, Roche PM, Lukyanov S, Zaraisky AG, Davidson
65. MW, Chudakov DM. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 2009 Mar 15;418(3):567-74.
66. Shaner NC, Lin MZ, McKeown MR, Steinbach PA, Hazelwood KL, Davidson MW, Tsien RY. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 2008 Jun;5(6):545-51.
67. Shaner NC, Steinbach PA, Tsien RY. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2005 Dec;2(12):905-9.
68. Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 2010 Jul;90(3):l 103-63.
69. Wang L, Jackson WC, Steinbach PA, Tsien RY. Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation. Proc Natl Acad Sei USA. 2004 Nov 30; 101 (48): 16745-9.
70. Shu X, Royant A, Lin MZ, Aguilera TA, Lev-Ram V, Steinbach PA, Tsien RY. Mammalian expression of infrared fluorescent proteins engineered from a bacterial phytochrome. Science. 2009 May 8;324(5928):804-7.
71. Violot S, Carpentier P, Blanchoin L, Bourgeois D. Reverse pH-dependence of chromophore protonation explains the large Stokes shift of the red fluorescent protein mKeima. J Am Chem Soc. 2009 Aug 5;131(30):10356-7.
72. Shu X, Wang L, Colip L, Kallio K, Remington SJ. Unique interactions between the chromophore and glutamate 16 lead to far-red emission in a red fluorescent protein. Protein Sei. 2009 Feb;18(2):460-6.
73. Morozova KS, Piatkevich KD, Gould TJ, Zhang J, Bewersdorf J, Verkhusha VV. Far-red fluorescent protein excitable with red lasers for flow cytometry and superresolution STED nanoscopy. Biophys J. 2010 Jul 21;99(2):L13-5.
74. Wiehler J, Jung G, Seebacher C, Zumbusch A, Steipe B. Mutagenic stabilization of the photocycle intermediate of green fluorescent protein (GFP). Chembiochem. 2003 Nov 7;4(11):1164-71.
75. Shu X, Leiderman P, Gepshtein R, Smith NR, Kallio K, Huppert D, Remington S J. An alternative excited-state proton transfer pathway in green fluorescent protein variant S205V. Protein Sei. 2007 Dec;16(12):2703-10.
76. McAnaney TB, Shi X, Abbyad P, Jung H, Remington SJ, Boxer SG. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 3. Temperature dependence of proton transfer. Biochemistry. 2005 Jun 21;44(24):8701-11.
77. Stoner-Ma D, Jaye AA, Ronayne KL, Nappa J, Tonge PJ, Meech SR. Ultrafast Electronic and Vibrational Dynamics of Stabilized A State Mutants of the Green Fluorescent Protein (GFP): Snipping the Proton Wire. Chem Phys. 2008 Jun 23;350(1-3):193-200.
78. Nienhaus K, Renzi F, Vallone B, Wiedenmann J, Nienhaus GU. Chromophore-protein interactions in the anthozoan green fluorescent protein asFP499. Biophys J. 2006 Dec 1;91(11):4210-20.
79. Girkin JM, Poland S, Wright AJ. Adaptive optics for deeper imaging of biological samples. Curr Opin Biotechnol. 2009 Feb;20(l):106-10.
80. Gould TJ, Gunewardene MS, Gudheti MV, Verkhusha W, Yin SR, Gosse JA, Hess ST. Nanoscale imaging of molecular positions and anisotropics. Nat Methods. 2008 Dec;5(12):1027-30.
81. Piatkevich KD, Verkhusha VV. Advances in engineering of fluorescent proteins and photoactivatable proteins with red emission. Curr Opin Chem Biol. 2010 Feb;14(l):23-9.
82. Lukyanov KA, Chudakov DM, Lukyanov S, Verkhusha W. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005 Nov;6(l 1):885-91.
83. Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends Biotechnol. 2005 Dec;23(12):605-13.
84. EGFP and DsRed expressing cultures of Escherichia coli imaged by confocal, two-photon and fluorescence lifetime microscopy / S. Jakobs, V. Subramaniam, A. Schonle et al. // FEBS Lett. 2000. - V. 479.-P. 131-135.
85. Red fluorescent protein (DsRed) as a reporter in Saccharomyces cerevisiae / F. Rodrigues, M. van Hemert, H. Y. Steensma et al. //J. Bacteriol. 2001. -V. 183. - P. 3791-3794.
86. An enhanced mutant of red fluorescent protein DsRed for double labeling and developmental timer of neural fiber bundle formation / V. V. Verkhusha, H. Otsuna, T. Awasaki et al. // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276. - P. 29621-29624.
87. Werdien D. FLP and Cre recombinase function in Xenopus embryos / D. Werdien, G. Peiler, G.U. Ryffel //Nucleic Acids Res. 2001. -V. 29. - P. 53.
88. Kawano H, Kogure T, Abe Y, Mizuno H, Miyawaki A. Two-photon dual-color imaging using fluorescent proteins. Nat Methods. 2008 May;5(5):373-4.
89. Gould TJ, Verkhusha VV, Hess ST. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nat Protoc. 2009;4(3):291-308
90. Chudakov DM, Verkhusha W, Staroverov DB, Souslova EA, Lukyanov S, Lukyanov KA. Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nat Biotechnol. 2004 Nov;22(ll): 1435-9.
91. Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat Protoc. 2007;2(8):2024-32
92. Domingo B, Sabariegos R, Picazo F, Llopis J.Imaging FRET standards by steady-state fluorescence and lifetime methods. Microsc Res Tech. 2007 Dec;70(12):1010-21.
93. Anderson KI, Sanderson J, Gerwig S, Peychl J. A new configuration of the Zeiss LSM 510 for simultaneous optical separation of green and red fluorescent protein pairs. Cytometry A. 2006 Aug l;69(8):920-9.
94. Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer / S. Karasawa, T. Araki, T. Nagai et al.} // Biochem J. -2004.-V. 381.-P. 307-312.
95. Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Förster radius / G.-J. Kremers, J. Goedhart, E. B. van Munster, T. W. Gadella // Biochemistry. 2006 - V. 45. - P. 6570-6579.
96. Galperin E. Three-chromophore FRET microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells / E. Galperin, V.V. Verkhusha, A. Sorkin // Nat Methods. 2004. - V. 1. - P. 209-217.
97. Tavare L. Some probabilistic and statistical problems of the analysis of DNA sequences / L. Tavare // Lect. Math. Life Sei. 1986. -V. 17. P. 57-86.
98. Neylon C. Chemical and biochemical strategies for the randomization of protein encoding DNA sequences: library construction methods for directed evolution / C. Neylon // Nucleic. Acids. Res. 2004. - V. 32. - P. 1448-1459.
99. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction / S.N. Ho, H.D. Hunt, R.M. Horton et al. // Gene. 1989. -V. 77. - P. 51-59.
100. Laemmli. U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 / U. K. Laemmli //Nature. 1970. - V. 227. - P.680-685.
101. Born M. Principles of Optics: Electromagnetic Theory of Propagation, Interference and Diffraction of Light / M. Born, E. Wolf // New York: Cambridge University Press. 1997.
102. Hillesheim LN, Chen Y, Miiller JD. Dual-color photon counting histogram analysis of mRFPl and EGFP in living cells. Biophys J. 2006 Dec 1;91(11):4273-84.
103. Nagy A, Wu J, Berland KM. Observation volumes and {gamma}-factors in two-photon fluorescence fluctuation spectroscopy. Biophys J. 2005 Sep;89(3):2077-90.
104. Z Otwinowski, W Minor Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode Methods in enzymology, 1997,276, 307-326.
105. Storoni LC, McCoy AJ, Read RJ. Likelihood-enhanced fast rotation functions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004 Mar;60(Pt 3):432-8.
106. Collaborative Computational Project, Number 4. The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1994 Sep l;50(Pt 5):760-3.
107. Emsley P, Cowtan K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004 Dec;60(Pt 12 Pt l):2126-32.
108. Hooft RW, Vriend G, Sander C, Abola EE. Errors in protein structures. Nature. 1996 May 23;381(6580):272.
109. R. A. Laskowski, M. W. MacArthur, D. S. Moss and J. M. Thornton PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures J. Appl. Cryst. (1993). 26, 283291.
110. Krissinel E, Henrick K. Secondary-structure matching (SSM), a new tool for fast protein structure alignment in three dimensions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2004 Dec;60(Pt 12 Pt l):2256-68.
111. Segall JE, Tyerech S, Boselli L, Masseling S, Helft J, Chan A, Jones J, Condeelis J. EGF stimulates lamellipod extension in metastatic mammary adenocarcinoma cells by an actin-dependent mechanism. Clin Exp Metastasis. 1996 Jan;14(l):61-72.
112. Bailly M, Yan L, Whitesides GM, Condeelis JS, Segall JE Regulation of protrusion shape and adhesion to the substratum during chemotactic responses of mammalian carcinoma cells. Exp Cell Res. 1998 Jun 15;241(2):285-99.
113. Hernandez L, Smirnova T, Kedrin D, Wyckoff J, Zhu L, Stanley ER, Cox D, Muller WJ, Pollard JW, Van Rooijen N, Segall JE. The EGF/CSF-1 paracrine invasion loop can be triggered by heregulin betal and CXCL12. Cancer Res. 2009 Apr l;69(7):3221-7.
114. Sternberg S.R. Biomedical image processing / S.R. Sternberg // IEEE Comput. 1983. — V. 16.-P. 22-34.
115. Rasband WS (1997-2006) ImageJ. National Institutes of Health, Bethesda, MD, http://rsb.info.nih.gov/ij/
116. Kedrin D, Gligorijevic B, Wyckoff J, Verkhusha W, Condeelis J, Segall JE, van Rheenen J. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 2008 Dec;5(12):1019-21.
117. Wyckoff J, Wang W, Lin EY, Wang Y, Pixley F, Stanley ER, Graf T, Pollard JW, Segall J, Condeelis J. A paracrine loop between tumor cells and macrophages is required for tumor cell migration in mammary tumors. Cancer Res. 2004 Oct l;64(19):7022-9.
118. Condeelis J, Segall JE. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 2003 Dec;3(12):921-30.
119. Bogdanov AM, Mishin AS, Yampolsky IV, Belousov VV, Chudakov DM, Subach FV, Verkhusha VV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Green fluorescent proteins are light-induced electron donors. Nat Chem Bioh 2009 Jul;5(7):459-61.
120. Nobes CD, Hall A. Rho GTPases control polarity, protrusion, and adhesion during cell movement. J Cell Biol. 1999 Mar 22; 144(6): 1235-44.
121. Wyckoff JB, Jones JG, Condeelis JS, Segall JE. A critical step in metastasis: in vivo analysis of intravasation at the primary tumor. Cancer Res. 2000 May 1 ;60(9):2504-l 1.
122. Flores-Ramírez G, Rivera M, Morales-Pablos A, Osuna J, Soberón X, Gaytán P. The effect of amino acid deletions and substitutions in the longest loop of GFP. BMC Chem Biol. 2007 Jun 26;7:1.
123. Kupfer A, Louvard D, Singer SJ. Polarization of the Golgi apparatus and the microtubule-organizing center in cultured fibroblasts at the edge of an experimental wound. Proc Natl Acad Sci USA. 1982 Apr;79(8):2603-7.
124. Bershadsky AD, Futerman AH. Disruption of the Golgi apparatus by brefeldin A blocks cell polarization and inhibits directed cell migration. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Jun 7;91(12):5686-9.
125. Gotlieb AI, Spector W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 1981 May;103(2):271-82.
126. Wyckoff JB, Wang Y, Lin EY, Li JF, Goswami S, Stanley ER, Segall JE, Pollard JW, Condeelis J. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 2007 Mar 15;67(6):2649-56
127. Devreotes P, Janetopoulos C. Eukaryotic chemotaxis: distinctions between directional sensing and polarization. J Biol Chem. 2003 Jun 6;278(23):20445-8.
-
Петкевич, Кирилл Дмитриевич
-
кандидата химических наук
-
Москва, 2011
-
ВАК 03.01.04
- Флуоресцентные маркеры для молекулярной и клеточной биологии: флуоресцентные таймеры, постоянно флуоресцирующие и фотоактивируемые белки
- Красные и дальне-красные флуоресцентные белки, оптимизированные для мечения белков слияния
- Дальнекрасные флуоресцентные белки
- Влияние аминокислотных замен на спектральные свойства флуоресцентных белков на примере mRFP1
- Характеристика новых линий репортерных мышей для изучения экспрессии фактора некроза опухолей in vivo и in vitro
