Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетически кодируемые флуоресцентные инструменты для исследования живых систем
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Генетически кодируемые флуоресцентные инструменты для исследования живых систем"
Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН
На правах рукописи
Чудаков Дмитрий Михайлович
ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ИНСТРУМЕНТЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИВЫХ СИСТЕМ
03.01.03 - Молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук
Москва-2011
2 1 ДП? 2011
4844311
Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Научный консультант:
Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук,
Лукьянов С.А.
Официальные оппоненты:
Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН)
Деев С.М.
Доктор химических наук, профессор (Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН)
Савицкий А.П.
Доктор биологических наук,
Васильев А.В.
(Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН) Ведущая организация:
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.
Защита состоится 18 мая 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Автореферат разослан 5 апреля 2011 г.
Учёный секретарь диссертационного совета
доктор физико-математических наук В. А. ОЛЕЙНИКОВ
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Клонирование в 1992 году гена зеленого флуоресцентного белка из гидромедузы Aequorea victoria (avGFP) положило начало разработке целого арсенала инструментов и методов для изучения живых систем. Были получены различные спектральные варианты флуоресцентных белков, позволяющие проводить эксперименты многоцветного мечения и визуализировать белок-белковые взаимодействия с использованием эффекта FRET (Förster resonance energy transfer - ферстеровский перенос энергии), фотоактивируемые флуоресцентные белки, позволяющие проводить прицельное фотомечение и слежение за органеллами и клетками, генетически кодируемые сенсоры, позволяющие визуализировать активность ферментов и изменения в концентрации различных ионов, и другие инструменты.
Тем не менее, многие достижения носили скорее теоретический характер. Можно выделить две ключевые проблемы, стоявшие перед разработчиками новых генетически кодируемых флуоресцентных инструментов. Первая - расширение палитры спектральных вариантов флуоресцентных белков до крайних областей видимого спектра - синей (максимум эмиссии флуоресценции при 440-460 нм) и дальнекрасной (максимум эмиссии флуоресценции выше 630 нм). Особый интерес, как эффективный инструмент для визуализации объектов в модельных животных, представляли дальпекрасные флуоресцентные белки, длинноволновое излучение которых наиболее эффективно проникает через толщу живых тканей. Полученные до настоящей работы варианты дальнекрасных флуоресцентных белков характеризовались крайне низкой яркостью флуоресценции и низкой фотостабильностью, что делало эти белки практически непригодными для реального применения. По тем же причинам, не находили применения на практике известные синие флуоресцентные белки.
Вторая проблема состояла в том, что практически все открытые природные флуоресцентные белки (за исключением avGFP) имели олигомерную структуру и были непригодны для исследования локализации белков, отслеживания белок-белковых взаимодействий и других исследований, в которых требуется получение конструкций слияния с целевым белком. Полученные путем мутагенеза природных белков мономерные красные флуоресцентные варианты отличались низкой яркостью сигнала, и достаточно низким, по сравнению с природными мономерными зелеными флуоресцентными белками, качеством работы в составе белков слияния. Известные обратимо фотоактивируемые флуоресцентные белки характеризовались тетрамерной природой, что делало невозможным их применение для фотомечения исследуемых белков, в том числе для развивающихся технологий флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения.
Оставался также ряд других значимых проблем, решение которых было актуально на момент начала выполнения данной работы. Так, время полу-созревания хромофора составляло для большинства полученных флуоресцентных белков многие десятки минут и даже часы, что затрудняло их применение в экспериментальных системах, требующих быстрого появления флуоресцентного сигнала. Полученные генетически кодируемые сенсоры на основе флуоресцентных белков отличались низким динамическим диапазоном изменений флуоресцентного сигнала при ответе на детектируемые ионы или исследуемую активность, что существенно осложняло получение достоверных результатов.
Настоящая работа была направлена на системное решение перечисленных выше проблем и создание панели эффективных молекулярных инструментов на основе флуоресцентных белков, способных вывести современные технологии микроскопии и in vivo имиджинга на качественно новый уровень.
Цель работы. Создание нового поколения генетически кодируемых флуоресцентных инструментов для флуоресцентной микроскопии и визуализации структур и процессов в живых тканях.
Задачи работы включали:
1. Получение полной палитры мономерных флуоресцентных белков, предназначенных для мечения целевых белков, характеризующихся высокой яркостью флуоресцентного сигнала, высокой скоростью созревания хромофора, высокой устойчивостью флуоресцентного сигнала к изменениям значения рН и фотообесцвечиванию.
2. Получение палитры ярких быстро созревающих флуоресцентных белков для мечения клеток и тканей. В том числе, получение ярких дальнекрасных флуоресцентных белков, предназначенных для эффективной визуализации объектов в модельных животных.
3. Получение генетически кодируемых сенсоров с высоким динамическим диапазоном флуоресцентного ответа (далее - «высококонтрастных» сенсоров).
4. Получение мономерных фотоактивируемых флуоресцентных белков и разработка технологий их применения.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе было получено новое поколение генетически кодируемых флуоресцентных маркеров и инструментов, существенно расширивших возможности для визуализации объектов и процессов при исследовании живых систем. Решение проблемы олигомеризации флуоресцентных белков позволило создать панель ярких мономерных флуоресцентных маркеров со спектрами флуоресценции, покрывающими всю область видимого спектра. Благодаря этому, стало возможным проводить многоцветное мечение целевых белков и органелл в живых клетках, существенно расширились возможности для отслеживания взаимодействия целевых белков и изменения внутриклеточных параметров с использованием эффекта FRET. Полученные мономерные фотоактивируемые флуоресцентные белки позволяют отслеживать перераспределение целевых белков в живых клетках, и применимы для технологий флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, в том числе двухцветной. Полученные яркие дальнекрасные флуоресцентные белки позволяют эффективно визуализировать клетки и ткани в теле интактных живых модельных организмов, а быстросозревающие флуоресцентные белки - регистрировать активность и исследовать динамику работы промотеров исследуемых генов. Получен ряд генетически кодируемых сенсоров, характеризующихся высоким динамическим диапазоном флуоресцентного ответа, позволяющих достоверно детектировать изменения, происходящие в живых клетках. Принципы организации и флуоресцентные домены полученных сенсоров могут в дальнейшем служить основой для создания высококонтрастных сенсоров с различной специфичностью.
Большинство полученных в данной работе инструментов и технологий уже сегодня находят широкое применение в области молекулярной и клеточной биологии, биологии развития, канцерогенеза, иммунологии, нейробиологии и фармакологии; они активно используются в сотнях лабораторий по всему миру, как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях.
Апробация полученных результатов. Результаты диссертационной работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: «FEBS meeting on Advanced Light Microscopy» (Семмеринг, Австрия, 2005, приглашенный доклад), «The 32nd Lome Conference on Protein Structure and Function» (Лорне, Австралия, 2007, приглашенный доклад), «3rd Annual FABLS Workshop» (Мельбурн, Австралия, 2007, приглашенный доклад), "Лазерная конфокальная микроскопия в биологии и медицине" (Звенигород, Россия, 2005, приглашенный доклад), Четвертая международная конференция "Нанобио- и другие новые и перспективные биотехнологии" (Пущино, Россия, 2007, приглашенный
доклад), «Fluorescent Proteins and Biological Sensors. Janelia Farm Conference.» (Вашингтон, США, 2007, приглашенный доклад), «Международная конференция им. Гельмгольца» (Москва, Россия, 2008, приглашенный доклад), «Symposium on Watching Biomolecules in Action» (Осака, Япония, 2009, приглашенный доклад), XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2008), "Molecular Imaging" (Крит, Греция, 2005), съезд Биохимического и молекулярно-биологического общества Германии (Мюнстер, Германия, 2004), «ASDD Symposium» (Москва-Кижи-Валаам-Санкт-петербург, Россия, 2004), «BIOCATALYSIS-2005» (Санкт-Петербург, Россия, 2005), «BIOCATALYS1S-2007» (Москва-Санкт-Петербург, Россия, 2007), Национальная конференция «Рентгеновское, Синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов» (Москва, Россия, 2009).
Публикации по теме работы. По материалам диссертации опубликовано 42 статьи в российских и международных рецензируемых журналах, а также 2 главы в книгах.
Личный вклад автора. Основные результаты работы получены лично автором или под его руководством, при непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Автор также осуществлял выбор направлений и методов исследования, анализ полученных данных и подготовку материалов к публикации.
1. Мономерные флуоресцентные белки для мечения целевых белков
В составе химерных конструкций, флуоресцентные белки широко применяются для мечения исследуемых белков в живых клетках. Такое мечение позволяет решать целый ряд задач, включая визуализацию синтеза, локализации, транслокации, взаимодействий и деградации белков в различных биологических системах в режиме реального времени. Присоединение белковой метки, представляющей собой мономерный флуоресцентный белок, в большинстве случаев не нарушает, или почти не нарушает, естественной локализации и функций белка-мишени. Однако лишь немногие природные варианты флуоресцентных белков характеризуются мономерным состоянием при физиологических концентрациях. Следует считать огромной удачей для развития экспериментальной биологии, что первый клонированный флуоресцентный белок, avGFP, оказался естественным мономером. По этой причине, avGFP и его многочисленные производные варианты с флуоресценцией в голубой (циановой), зеленой, и желтой (максимумы эмиссии от 470 до 530 нм) областях спектра, такие как ECFP, Cerulean, EGFP, Emerald, EYPP, Citrine, Venus, и другие, сегодня широко применяются в составе белков слияния. В то же время, все известные природные красные флуоресцентные белки характеризуются димерной либо тетрамерной природой. Настоящая глава посвящена описанию получения и тестирования мономерных флуоресцентных белков. Для белка TagRFP и ветки его производных вариантов с эмиссией в красной и дальнекрасной областях спектра описание дается в хронологическом порядке (TagRFP-mKate-mKate2-FusionRed). Отдельно рассматриваются синий флуоресцентный белок TagBFP и белки, полученные на основе GFP из Aequorea macrodactyla, с эмиссией в средней части видимого спектра.
1.1. TagRFP: яркий красный мономерный флуоресцентный белок
За основу для создания мономерного красного флуоресцентного белка нами был взят красный димерный (тетрамерный при высоких концентрациях) белок TurboRFP (раздел
2.2). С одной стороны, TurboRFP обладает предпочтительными характеристиками: высокой яркостью флуоресценции, высокой скоростью созревания хромофора, высокой устойчивостью к изменениям значения рН. С другой стороны, для высокогомологичного белка eqFPôll было ранее показано, что один из двух интерфейсов, отвечающих за тетрамеризацию, легко поддается дестабилизации без существенной потери спектральных характеристик и нарушения созревания хромофора. Эти данные давали основания надеяться, что мономеризация белка TurboRFP окажется менее трудоемкой, чем мономеризация белка DsRed, и завершится с меньшими потерями в яркости флуоресценции.
С использованием известной на тот момент структуры белка eqFPôll (PDB ID: 1UIS) были определены основные точки в составе так называемого гидрофильного интерфейса, отвечающего за димеризацию белка TurboRFP. По результатам анализа, для дестабилизации взаимодействий по этому интерфейсу методом сайт-направленного мутагенеза были внесены точечные замены R162E, Q166D, S180N, F198V, и F200Y. Для дестабилизации взаимодействий по другому, гидрофобному, интерфейсу TurboRFP, была введена замена N126R, предотвращающая, по данным для белка eqFPôll, межсубъединичные взаимодействия через этот интерфейс. По данным гель-фильтрационной хроматографии низкого давления, результирующий мутантный вариант характеризовался мономерной природой. Таким образом, введения этих замен оказалось достаточно для дестабилизации олигомерных форм TurboRFP.
Несмотря на существенные изменения в структуре бета-бочонка, которые неизбежны при мономеризации, полученный мутантный вариант сохранил способность к формированию хромофора и проявлению флуоресцентных свойств. Тем не менее, как и ожидалось, мономеризация резко снизила скорость созревания и яркость флуоресценции. Для восстановления утраченных характеристик была использована комбинация методов случайного и сайт-направленного ПЦР-мутагенеза. В ходе проведения случайного мутагенеза, ключевые для сохранения мономерности аминокислотные позиции были закреплены с использованием специфических праймеров. После каждого раунда случайного мутагенеза проводился визуальный анализ индивидуальных бактериальных клонов с использованием флуоресцентного стереомикроскопа, с отбором быстро созревающих вариантов, характеризующихся максимально яркой красной флуоресценцией.
Примечание: Под термином «яркость», в зависимости от контекста, подразумевается одна из двух характеристик: расчетная яркость флуоресценции, получаемая как произведение квантового выхода флуоресценции и коэффициента молярной экстинкции при максимуме возбуждения флуоресценции, либо результирующая (детектируемая) яркость флуоресцентного сигнала в живой системе, которая зависит, помимо расчетной яркости флуоресцентного белка, от ряда других параметров, таких как эффективность транскрипции и трансляции гена флуоресцентного белка, стабильность мРНК, скорость и эффективность (процент) созревания хромофора в данных условиях, скорость деградации флуоресцентного белка в живых клетках.
Аминокислотные замены, приводящие к улучшению характеристик, но не способные, согласно анализу трехмерной структуры eqFPôl 1, привести к восстановлению димеризации, объединяли методом направленного мутагенеза и использовали в качестве основы для последующих раундов случайного мутагенеза. В общей сложности, было проведено семь раундов случайного мутагенеза, результатом которых стал финальный отобранный вариант, получивший название TagRFP (от английского Tag - ярлык, бирка, и Red Fluorescent Protein - красный флуоресцентный белок).
Максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции TagRFP приходятся на 555 нм и 584 нм, соответственно (рис. 1а). Молярный коэффициент экстинкции белка TagRFP при 556 нм составляет 100 ООО М^см"1, а квантовый выход флуоресценции равен 0.48 (расчетная яркость в 2.2 раза превышает таковую красного мономерного белка mCherry, полученного
коллективом Р. Тсиена). Спектр поглощения свежевыделенного белка TagRFP характеризуется единственным максимумом при 556 нм (рис. 1Ь), что говорит о быстром и полном созревании хромофора, без образования альтернативных либо промежуточных, медленно дозревающих форм.
а Ь с
Длин» волны, нм Длине Волны, нм Объем ЗЛЮЦИИ (МП)
Рисунок 1. Характеристики белка TagRFP in vitro, а. Нормированные спектры возбуждения (прерывистая линия) и эмиссии (непрерывная линия) флуоресценции. Ь. Нормированный спектр поглощения, с. Результаты гель-фильтрации белков TurboGFP (димер, зелёная прерывистая линия), EGFP (мономер, зелёная непрерывная линия) и TagRFP (мономер, красная линия).
Флуоресцентный сигнал TagRFP отличается высокой pH-стабильностью: кажущееся значение рКа, определяемое как значение pH, при котором яркость флуоресцентного сигнала составляет половину от максимальной, составляет < 4 (Таблица 1). По данным гель-фильтрационной хроматографии низкого давления, TagRFP сохранил мономерную природу исходного варианта (рис. 1с).
Примечание: Здесь следует отметить, что позднее данные высокоэффективной жидкостной хроматографии, в ходе которой, в отличие от хроматографии низкого давления, не происходит существенного разбавления белка, показали, что при высоких концентрациях (> 1 мг/мл) белки ряда TagRFP существуют в виде равновесия димерной и мономерной форм. Тем не менее, как показано ниже, в реальных условиях в живых клетках эта слабая димеризация не нарушает работу белков ряда TagRFP в составе белков слияния.
Для практического применения, важной характеристикой флуоресцентных белков является фотостабильность флуоресценции. Сравнение скорости фотообесцвечивания белка TagRFP с другими красными флуоресцентными белками в клетках HeLa с использованием широкопольной микроскопии (постоянное облучение ртутной лампой, светофильтр 540-580 нм) и конфокального сканирующего микроскопа (сканирующее облучение линией лазера 532 нм) показало, что время полуобесцвечивания (снижения интенсивности флуоресценции на 50%) TagRFP при конфокальной микроскопии сопоставимо с таковым для ряда широко используемых флуоресцентных белков: Cerulean, EYFP, mCherry, и mPlum (при возбуждении светом соответствующих длин волн той же интенсивности), и несколько уступает mCherry при широкопольной микроскопии.
Примечание: Существуют различные подходы к сравнению фотостабильности флуоресцентных белков. В условиях облучения различной мощности и длин волн, непрерывного или сканирующего облучения, в растворе и в живых клетках, и даже при различной локализации внутри клетки, одни и те же флуоресцентные белки могут характеризоваться различной относительной фотостабильностью. Мы применяли несколько разных подходов для сравнения фотостабильности и в контексте работы следует понимать этот термин как относительную фотостабильность сравниваемых флуоресцентных белков при облучении в выбранных условиях.
При экспрессии TagRFP в эукариотических клетках, появление надежно детектируемой красной флуоресценции наблюдалось в клетках Phoenix Eco (производные от НЕК-293Т) через 8 часов после трансфекции, а в клетках HeLa - через 12 часов. В клетках линии Phoenix Eco, как правило, наблюдается высокий уровень экспрессии генетических конструкций, содержащих ориджин репликации SV40 и промотер CMV. По этой причине
мы применяем их для проверки токсичности и поведения белков в условиях высоких концентраций в живых клетках. Существенно, что, в отличие от белка mCherry, TagRFP не формировал видимых агрегатов даже через 5 дней после трансфекции. Для проверки качества работы TagRFP в составе белков слияния, был получен ряд химерных конструкций TagRFP, включая(3 -актин, а-тубулин, а-актинин, ламин-В1, a-V-интегрин, коннексин-26, коннексин-32, коннексин-43, ЕВЗ, тирозинкиназу FAK, гистон Н2В, цитокератин-18, профилин, винкулин, зиксин. При экспрессии химерных конструкций в клеточных линиях мы наблюдали яркий красный сигнал с локализациям, соответствующими ожидаемым по предыдущему опыту с проверенными мономерными флуоресцентными белками, такими как EGFP (рис. 2). Были также получены конструкции для мечения органелл, содержащие последовательность, кодирующую сигнал предшественника VIII субъединицы оксидазы цитохрома С человека, направляющий химерный белок в матрикс митохондрий, а также фрагмент 1,4-бета-галактозил трансферазы человека, направляющий белок в комплекс Гольджи. В обоих конструкциях TagRFP специфично локализовался в соответствующих компартментах клетки, и не формировал видимых агрегатов.
Ijj^R; v -^яНД
ЯШУ чЩЖ^Н
¡Hjgg
Рисунок 2. Локализация белка TagRFP и белков слияния с TagRFP в живых клетках НеЬа. а. TagRFP. Ь. TagRFP-зикcин. с. TagRFP-цитoкepaтин-18. с1. TagRFP-бeтa-aктин.
Ещё одной важной характеристикой флуорофора является время жизни флуоресценции, пропорциональное квантовому выходу флуоресценции, и в значительной степени определяющее его эффективность в качестве донора энергии при эффекте FRET. Мы сравнили время жизни флуоресценции для белков mCherry и TagRFP в клетках линии HeLa (совместно с проф. T.W.J. Gadella, Голландия). Флуоресцентный сигнал клеток, экспрессирующих TagRFP, характеризовался временем жизни флуоресценции около 2.3 не, в то время как сигнал клеток, экспрессирующих mCherry, характеризовался временем жизни флуоресценции 1.4 не, что соответствует более высокому квантовому выходу флуоресценции TagRFP. Выраженная разница во времени жизни флуоресценции позволила нам осуществить двухцветное мечение с использованием двух красных флуоресцентных белков, различаемых по времени жизни флуоресценции. Высокое время жизни флуоресценции делает белок TagRFP перспективным FRET-донором для дальне-красных акцепторов, таких как mNeptune. С другой стороны, высокий коэффициент молярной экстинкции TagRFP позволяет использовать его в качестве эффективного акцептора FRET для флуоресцентных белков с более коротковолновой эмиссией. В частности, с использованием FRET-пары TagGFP-TagRFP нами был создан высококонтрастный внутриклеточный биосенсор для детекции активности каспазы-3 - ключевого фермента апоптотического каскада (раздел 4.2.). Полученные данные показывают, что TagRFP может успешно применяться для мечения исследуемых белков, органелл и клеток, многоцветного мечения, а также для создания генетически кодируемых FRET-сенсоров. Несмотря на то, что область разработки флуоресцентных белков развивается быстрыми темпами, опубликованный в 2007 году (Merzlyak ЕМ et al., Nature Methods 2007) белок TagRFP до сегодняшнего дня остается самым ярким из когда-либо полученных мономерных красных флуоресцентных белков.
1.2. mKate и mKate2: мономерные дальнекрасные флуоресцентные белки; tdKatushka2
Получение белка mKate. Ввиду хороших спектральных характеристик и мономерной природы, TagRFP был выбран нами как основа для получения мономерного дальнекрасного флуоресцентного белка. К этому времени мы получили димерный белок Катюша (Katushka), характеризующийся дальнекрасной флуоресценцией высокой яркости (Раздел 2.4.). И TagRFP, и Katushka берут начало от одного белка дикого типа, eqFP578, и сохраняют высокую гомологию. По этой причине мы надеялись, что точечные аминокислотные замены в окружении хромофора, позаимствованные у белка Katushka, могут привести к воспроизведению его спектральных характеристик без возникновения существенных пространственных конфликтов с другими аминокислотными остатками в окружении хромофора, которые неминуемо привели бы к нарушению его созревания и/или потере флуоресцентных свойств. Методом сайт-направленного мутагенеза мы внесли ряд комбинаций замен аминокислотных остатков в микроокружение хромофора TagRFP. Среди нескольких опробованных вариантов направленного мутагенеза, сочетание позаимствованных у белка Katushka замен R69K, N148S, F181L и H203R привело к желаемому батохромному сдвигу эмиссии флуоресценции TagRFP, при сохранении приемлемой яркости и скорости созревания.
Полученный белок был назван mKate (мономерная Катюша - от monomeric и Katushka). Спектральные характеристики белка mKate приведены в Таблице 1. По данным флуорометрии, белки Katushka и mKate обладают практически идентичными спектрами возбуждения и эмиссии флуоресценции. Максимум возбуждения флуоресценции mKate приходится на 588 нм, максимум эмиссии флуоресценции - на 635 нм. Спектр поглощения mKate характеризуется единственным пиком, максимум которого совпадает с максимумом возбуждения флуоресценции, что говорит об отсутствии альтернативных либо промежуточных форм созревания хромофора в зрелом белке. По pH-стабильности флуоресценция mKate заметно уступает TagRFP (Таблица 1). При pH 7.5 квантовый выход флуоресценции mKate составляет 0.28, молярный коэффициент экстинкции при 588 нм составляет 31 500 М"1 см"1. По данным гель-фильтрации низкого давления, белок mKate сохранил мономерные свойства TagRFP, что позволяет использовать его для мечения белковых молекул.
Для проверки эффективности белка mKate в качестве флуоресцентной метки в химерных конструкциях с другими белками мы использовали модель визуализаг^и -актина иа -тубулина. В клетках линий HeLa и ЗТЗ, трансфицированных полученными рекомбинантными плазмидами, наблюдалось специфичное мечение актиновых филаментов и микротрубочек, соответственно, без присутствия видимых агрегатов флуоресцентной метки или её неспецифической локализации. Для тестирования белка mKate на цитотоксичность мы сравнили его поведение при временной трансфекции клеток линий HeLa и Phoenix Eco с белками DsRed2, DsRed-Express, mCherry и mRaspberry. Через 5-7 дней после трансфекции белки DsRed2 и DsRed-Express в значительной степени локализовались в комплексе Гольджи, а белки mCherry и mRaspberry формировали точечные агрегаты. Следует отметить, что формирование белковых агрегатов может быть токсичным для клеток и затрудняет использование агрегирующих белков для получения стабильно экспрессирующих клеточных линий и трансгенных животных. В то же время в клетках, экспрессирующих mKate, не наблюдалось видимой агрегации или неспецифичной локализации. При этом достаточно яркий флуоресцентный сигнал появлялся через 12-14 часов после трансфекции, что свидетельствует о достаточно быстром созревании хромофора mKate в клетках млекопитающих. Белок mKate характеризуется относительно высокой фотостабильностью. На момент публикации (Shcherbo D и др., Nature Methods. 2007), белок mKate являлся самым ярким мономерным флуоресцентным белком с пиком
эмиссии флуоресценции более 630 нм, оптимальным для многоцветного мечения и технологий FRET. Однако расчетная и детектируемая яркость флуоресценции mKate всё же существенно уступали яркости исходного белка TagRFP.
Получение белка mKate2. Дальнейший прогресс в разработке дальнекрасных мономерных флуоресцентных белков потребовал структурных данных, которые помогли бы лучше сориентироваться в особенностях окружения хромофора и его конформации в белке mKate. Мы надеялись, что трехмерная структура белка mKate поможет объяснить сложную кинетику процесса фотообесцвечивания белка mKate, включающую фазу усиления флуоресцентного сигнала (рис. Зс), относительно низкую рН-стабильность флуоресценции этого белка, и относительно низкую яркость его флуоресценции. В сотрудничестве с Лабораторией рентгеноструктурного анализа ИБХ РАН был проведён анализ кристаллов mKate, полученных при трёх значениях рН: 2.0, 4.2 и 7.0.Было установлено, что в mKate наблюдается рН-зависимая цис-транс изомеризация хромофорной группы. Так, при рН 2.0, 90% хромофорных групп белка mKate находятся в транс положении. Наиболее яркая флуоресценция наблюдается при значении рН 7.0, при котором лишь 10% молекул белка содержат транс-изомер хромофора. При рН 4.2 соотношение транс- и цис- форм составляет около 70% к 30%. Мы предположили, что незначительная фотоактивация при облучении в зелёной, желтой и оранжевой области (при длинах волн от 540 до 580 нм) может объясняться фотоиндуцируемой транс-цис изомеризацией хромофора. В таком случае, точечный мутагенез в микроокружении хромофора, направленный на стабилизацию хромофорной группы во флуоресцентном цис- положении, либо на дестабилизацию транспорты, должен был повысить яркость и рН-стабильность флуоресценции белка mKate. Исходя из данных рентгеноструктурного анализа можно было заключить, что остаток серина в положении 165 стабилизирует транс- конформацию хромофора, аналогично тому, как это происходит в белке eqFP611 и известных GFP-подобных хромобелках, в то время как остаток серина в положении 148 стабилизирует цис- конформацию, по аналогии с большинством красных флуоресцентных белков, включая DsRed.
Информация о трехмерной структуре белка mKate оказалась чрезвычайно полезной для дальнейшей работы. С целью дестабилизации транс-изомера хромофора mKate и смещения равновесия в пользу флуоресцентной г/ис-формы, с использованием направленного мутагенеза мы получили библиотеку вариантов mKate, содержащую варианты с кодонами всех двадцати возможных аминокислот в положении 165. Библиотека была проэкспрессирована в бактериях Е. coli, и среди 20 вариантов был отобран один, характеризующийся повышенной яркостью флуоресценции и рН-стабильностью, и сохранивший положение пика эмиссии исходного белка mKate. Этот вариант содержал аминокислотную замену S165А, что согласуется с выдвинутым выше предположением. Действительно, в отличие от гидрофильного полярного остатка серина, гидрофобный неполярный остаток аланина не способен принимать участие в сети водородных связей, стабилизирующих хромофорную группу mKate в /яранс-конформации. Соответственно, изменение соотношения изомеров в пользу флуоресцентной г/ис-формы должно приводить к увеличению яркости как при кислых, так и при физиологических значениях рН. Для ускорения созревания хромофора полученного варианта mKate-S165A мы провели два раунда случайного ПЦР-мутагенеза, с отбором наиболее ярких и быстро созревающих вариантов белка, не содержащих потенциально димеризующих замен, не характеризующихся наличием промежуточных или альтернативных форм созревания хромофора согласно спектрам поглощения и флуоресценции, и не характеризующихся гипсохромным сдвигом эмиссии флуоресценции по сравнению с белком mKate-S165A. Вариант, наиболее соответствовавший искомым характеристикам, содержал дополнительные аминокислотные замены V48A и K238R и получил название mKate2. Эти замены значительно ускоряют созревание хромофора белка при 37°С. Интересно, что
аргинин в положении 238 содержится также в белке дикого типа eqFP578, и таким образом в данном случае случайный мутагенез привел к обратной мутации. Согласно данным гель фильтрации, эта внешняя относительно структуры бета-бочонка замена не повлияла на мономерные свойства mKate2.
Максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции mKate2 близки к белку mKate и приходятся на 588 и 633 нм, соответственно. Однако, по сравнению с mKate, коэффициент молярной экстинкции при 588 нм при рН 7.5 был увеличен практически в 2 раза и составил 62 500 М"'см"', а квантовый выход флуоресценции был увеличен в 1.4 раза и составил 0.4. В результате, яркость флуоресценции mKate2, рассчитанная как произведение коэффициента молярной экстинкции и квантового выхода, составляет 74% от яркости EGFP, и в 10 раз превышает яркость известного на тот момент дальнекрасного мономерного белка mPlum. Время полусозревания mKate2 составляет менее 20 мин, что делает его самым быстро созревающим мономерным красным флуоресцентным белком (для сравнения, время полусозревания составляет 40 мин для mCherry, 75 мин для mKate и 100 мин для TagRFP). На спектре поглощения mKate2 выделяется единственный пик, соответствующий красной форме хромофора, и совпадающий по форме со спектром возбуждения флуоресценции (рис. За). По сравнению с белком mKate, флуоресценция mKate2 характеризуется значительно более высокой устойчивостью к изменению значения рН (кажущееся значение рКа = 5.4 против 6.2 у mKate) (рис. ЗЬ, Таблица 1).
300 400 500 БОО 700 800 3 4 5 6 7 8 9 10
Длина волны, нм рН
Рисунок 3. Характеристики белка mKate2 in vitro, а. Нормированные спектры поглощения (чёрная линия), возбуждения (прерывистая красная линия), и эмиссии флуоресценции (непрерывная красная линия) белка mKate2. b. Зависимость флуоресцентного сигнала белков mKate (чёрная линия) и mKate2 (красная линия) от значения рН. Пунктирными линиями показано физиологическое значение рН 7.5 и значение относительной яркости флуоресцентного сигнала, составляющее половину от максимальной для данного белка, с. Фотообесцвечивание флуоресценции различных красных и дальнекрасных флуоресцентных белков в сканирующем конфокальном микроскопе.
Для сравнения фотостабилыюсти флуоресценции белка mKate2 с наиболее известными аналогами: белками mKate, mCherry, mRaspberry и mPlum, использовались химерные конструкции флуоресцентных белков с гистоном Н2В, экспрессированные в клетках HeLa. Такой подход позволяет сравнивать фотостабильность непосредственно в живых клетках, причем ядерная локализация химерной конструкции с гистоном Н2В позволяет лучше стандартизировать эксперимент. Определялась фотостабильность как при облучении сканирующим лазером конфокального микроскопа, так и с использованием постоянного облучения ртутной лампой широкопольного флуоресцентного микроскопа. В обоих случаях, белок mKate2 характеризовался более высокой устойчивостью к обесцвечиванию, чем белки mKate, mRaspberry и mPlum, и не уступал белку mCherry. Кроме того, в ходе обесцвечивания mKate2 мы не наблюдали стадии фотоактивации, характерной для белка mKate (рис. Зс). Это наблюдение в целом согласуется с предположением о том, что незначительная фотоактивация флуоресценции белка mKate связана с транс-цис фотоизомеризацией хромофора, в то время как хромофор белка mKate2 исходно стабилизирован во флуоресцентной i/мс-конформации.
2000 3000 4000 Время, с
Тандемный белок tdKatushka2. Возможный альтернативный путь получения так называемых «псевдомономерных» флуоресцентных белков, не способных к формированию межмолекулярных димеров и применимых для мечения в составе белков слияния, это получение «тандемных» вариантов димерных белков, в которых две копии белка кодируются одной рамкой считывания. Существенное увеличение яркости и фотостабильности белка mKate в результате внесения замены S165А указывало на потенциальную возможность улучшить характеристики гомологичного белка Katushka, также содержащего серин в положении 165. Действительно, введение с помощью сайт-направленного мутагенеза замены S165А увеличило яркость флуоресценции белка Katushka на 20%. Для того чтобы получить вариант, пригодный для мечения белковых молекул, мы создали тандемный конструкт, состоящий из двух субъединиц димерного белка Katushka-S165A, соединённых гибким глицин-богатым линкером. Полученная «псевдомономерная» метка была названа tdKatushka2 (TaHÄeM-Katushka2). Коэффициент молярной экстинкции tdKatushka2 равен 2 х 66 ООО М"'см"', а квантовый выход 0.37, и таким образом расчетная яркость на тандемную молекулу tdKatushka2 превышает таковую белка EGFP в 1.46 раза. Флуоресценция белка tdKatushka2 характеризуется высокой рН-стабильностью (кажущееся значение рКа = 5.4) и фотостабильностью (рис. Зс).
Применение mKate2 и tdKatushka2 в качестве белков слияния. При временной трансфекции клеток линий HeLa и Phoenix Eco белки mKate2 и tdKatushka2 характеризовались равномерным распределением флуоресцентного сигнала по клетке без формирования видимых агрегатов или неспецифичной локализации через 4 дня после трансфекции. Эти данные говорят в пользу низкой токсичности полученных белков и о принципиальной возможности их использования в стабильно трансфицированных клеточных линиях. Было получено более 20 белков слияния, содержащих кодирующие последовательности mKate2 и tdKatushka2 и различных клеточных белков и сигналов внутриклеточной локализации. Для большинства слитных белков наблюдалась правильная локализация и функциональность (рис. 4). В частности, слитный белок тКа1е2-аннексин-1У при воздействии иономицина на клетку транслоцировался, как и ожидалось, из цитоплазмы на ядерную и клеточную мембраны (рис. 4а).
а b с d
-' : i~ï г.; \ J. •'• | ¿¿Я J - _
Рисунок 4. Локализация белков слияния с тКа1е2 в живых клетках НеЬа. а. тКа1е2-аннексин-А4, после индукции иономицином. Ь. тКа!е2-клатрин, лёгкая цепь. с. пЖЛег-УАБР. ё. тКа1е2-ЕВЗ (белок семейства КР/ЕВ, ассоциированный с микротрубочками). Масштабная линейка, 10 мкм.
Применимость шКа1е2 в трансгенных организмах. Дальнекрасная флуоресценция высокой яркости в сочетании с мономерной природой делает белок тКа1е2 перспективным маркером для мечения белков слияния в живых тканях. Для проверки возможности использования белка тКа1е2 для визуализации объектов в многоклеточных организмах, мы поместили кодирующую последовательность тКа1е2 под контроль фрагмента промотора Хап/1 шпорцевой лягушки Хепорж 1аеу1я. Полученные рекомбинантные плазмиды экспрессировались в трансгенных X. 1аеУ1$ (совместно с Лабораторией молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН). Мы наблюдали яркий флуоресцентный сигнал в передней части
головы, включая глаза и назальные плакоды (рис. 5). Для сравнения яркости и скорости созревания шКа(е и шКа1е2 мы провели микроинъекции конструкций гпКа1е и тКа1е2 в эмбрионы X. 1аеу15 на стадии двух бластомеров. В этих экспериментах, яркость флуоресцентного сигнала тКа1е2 оказалась значительно выше. В качестве модели мечения белковых молекул в целом организме мы использовали X. 1аеу1з, экспрессирующие химерный белок тКа!е-2-зиксин. Несмотря на высокий уровень экспрессии, обеспечиваемый промотором СМУ, мы не наблюдали проявлений токсичности слитного белка: головастики выглядели здоровыми и выживаемость была сопоставима с контрольными головастиками, экспрессирующими белок ЕвРР. Эти результаты свидетельствуют о низкой токсичности тКа1е2 и его применимости для мечения белков, клеток и тканей в трансгенных организмах.
Белый сеет Флуоресценция Наложение
Рисунок 5. Экспрессия тКа1е2 под контролем промотера ХапЛ в трансгенных эмбрионах X. 1аеу1$ на стадии 28. Наблюдается специфическая локализация в передней части головы, включая глаза и назальные плакоды.
1.3. Красный «супермономерный» флуоресцентный белок.
К 2009 году нами и другими коллективами был получен ряд мономерных красных и дальнекрасных флуоресцентных белков, что открыло широкие возможности для многоцветного мечения белков, приложений FRET, и других методов в современной микроскопии, основанных на использовании генетически кодируемых флуоресцентных маркеров в качестве белков слияния. Тем не менее, несмотря на очевидный успех, достигнутый в данном направлении за последние 5 лет, опыт многих лабораторий говорит о том, что доступные красные мономеры, такие как mCherry или TagRFP, все еще уступают естественным зеленым мономерным белкам в качестве маркеров в составе белков слияния. В ряде «требовательных» конструкций, известные красные мономеры могут нарушать локализацию исследуемых белков если не во всех, то в значимой части транзиентно трансфицированных клеток, особенно при высоких уровнях экспрессии, что нарушает воспроизводимость экспериментов и в целом затрудняет количественную работу. В некоторых случаях, получение стабильно трансфицированных линий с такими белками слияния также может быть затруднено. Вероятным объяснением этих проблем являются остаточная слабая димеризация, а также неспецифические взаимодействия искусственно «обнаженных» интерфейсов мономеризованных красных белков.
Мы поставили себе задачу окончательно решить эту проблему и разработать мономерный красный флуорсцентный белок, качество работы которого в составе химерных белков слияния не уступало бы лучшим зеленым флуоресцентным белкам. Как описано выше, при продолжительном культивировании клеток, экспрессирующих белок mCherry, наблюдается появление видимых флуоресцирующих агрегатов последнего. Мы предположили, что это явление указывает на способность mCherry и гомологичных белков ряда mFruits к агрегации и, возможно, к неспецифическим взаимодействиям в живых клетках. Полученные нами
белки TagRFP и mKate2 не формировали агрегатов при длительной экспрессии. Однако эти белки демонстрировали остаточную слабую димеризацию, не детектируемую методом гель фильтрации низкого давления (рис. 1с), но детектируется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, в ходе которой не происходит заметного разбавления белка (рис. 6). Мы предположили, что получение «супермономерного» варианта на основе TagRFP или mKate2 позволит создать белок, для которого не будут характерны ни проблемы белков ряда mFruits, ни проблемы слабой димеризации. Для определения ключевых позиций, которые отвечают за слабую димеризацию белков ряда TagRFP-mKate-mKate2, мы вновь обратились к данным рентгеноструктурного анализа белка mKate. Так как в ходе кристаллизации концентрация белка поднимается до очень высоких значений, даже слабо димеризующийся белок формирует строгие димеры в составе кристалла. Данные о структуре белка mKate указывали на участие в димеризации аминоксилотных остатков в позициях 164, 182 и 200, а также, что интересно, гидрофобного С-концевого участка белка, непосредственно взаимодействующего с бета-бочонком «партнера» по димеризации. Основываясь на этих данных, мы продолжили работу по мономеризации белка mKate2, в ходе которой гидрофобный С-концевой участок был заменен на гибкий глицин-богатый линкер, и проведен ряд мономеризующих замен: R164A, К182Е, Y200N. Полученный вариант, mKate2.1, отвечал основному требованию: демонстрировал строго мономерное поведение при высокоэффективной жидкостной хроматографии при нанесении в концентрациях до 10 мг/мл (рис. 6). Однако были катастрофически утеряны скорость и полнота созревания, относительная яркость флуоресцентного сигнала, а также его устойчивость к изменениям значения pH.
Работа по восстановлению спектральных характеристик полученного «супермономерного» варианта велась согласно следующему алгоритму: Библиотеки мутантных вариантов, полученные методом случайного ПЦР мутагенеза, экспрессировали в Е. coli и с использованием флуоресцентного стереомикроскопа проводили визуальный отбор из >100,000 колоний, характеризующихся наиболее яркой красной флуоресценцией. После секвенирования последовательностей отобранных 30-50 вариантов, выбирались только те из них (как правило, 2-3 варианта), которые не несли потенциально димеризующих мутаций, согласно анализу трехмерной структуры белка mKate. Отобранные варианты содержали желаемые аминокислотные замены, способные привести к ускорению созревания хромофора и/или к улучшению спектральных характеристик (увеличению квантового выхода флуоресценции и/или коэффициента молярной экстинкции). Эти замены объединяли в различных комбинациях с использованием метода вырожденного сайт-направленного мутагенеза, и полученный набор вариантов подвергали следующему раунду случайного мутагенеза. Такой цикл повторяли в общей сложности 7 раз. На некоторых этапах перед отбором клонов проводили облучение колоний Е. сой, экспрессирующих мутантные варианты белка, мощными источниками зеленого (530-560 нм) либо белого света, с целью отбора наиболее фотостабильных вариантов. Кроме того, метод вырожденного сайт-направленного мутагенеза применяли для оптимизации непосредственного окружения хромофора. Также сайт-направленным мутагенезом были
Молекулярный вес. «Да
Рисунок 6. Высокоэффективная жидкостная хроматография
белков тКа1е2, тКа1е2.1 и Рив{опЯес1 при нанесении в концентрации 10 мг/мл.
внесены замены K69R и R203H, позаимствованные от белка TagRFP, характеризующегося высокой pH-стабильностью.
В конечном итоге, нам удалось восстановить высокую pH-стабильность и яркость флуоресцентного сигнала, при сохранении «супермономерной» природы белка. Полученный белок, предназначенный для мечения белков слияния, был назван FusionRed (от fusion - белок слияния). FusionRed характеризуется пиками возбуждения и эмиссии флуоресценции при 580/608 им, отсутствием промежуточных или альтернативных форм созревания хромофора согласно спектру поглощения, высокой фотостабильностью как в конфокальной, так в широкопольной микроскопии, высокой устойчивостью к изменениям значения pH (кажущееся значение рКа = 4.2). Квантовый выход флуоресценции белка FusionRed составляет 0.19, коэффициент молярной экстинкции при 580 нм - 125 ООО М"'см"', что делает его потенциально эффективным акцептором энергии для FRET. Было получено и протестировано при экспрессии в клетках млекопитающих более 40 белков слияния FusionRed. В подавляющем большинстве случаев, качество работы FusionRed не уступало лучшим мономерным зеленым флуоресцентным белкам, и в ряде случаях превосходило качество работы белков ряда mFruits и ряда TagRFP (рис. 7).
а ь с d
/ * Ш'ШЁ "Г.. ,;.- "■Л-.',
J
i
1 — 1
Рисунок 7. Локализация белков слияния с РиэюпЯеё в клетках НеЬа. а. РивюпЯеё-кератин. Ь. FusionRed-кoннeкcин-26. с. РивтпЯеё-Иеас! (пептид, связывающий филаменты актина). FusionRed-кaвeoлин. Масштабная линейка, 10 мкм.
1.4. TagBFP: мономерный синий флуоресцентный белок на основе TagRFP.
Первые варианты синих флуоресцентных белков (blue fluorescent protein, BFP) характеризовались крайне низкой расчетной яркостью и фотостабильностью. Полученные не так давно улучшенные варианты, Azurite и EBFP2, характеризуются более высоким квантовым выходом флуоресценции и несколько более высокой фотостабильностью, но все ещё заметно уступают по расчетной яркости известным зеленым флуоресцентным белкам, в первую очередь за счет низкого коэффициента молярной экстинкции. Следует отметить, что все первые варианты синих флуоресцентных белков содержали замену Y66H в составе хромофора. Предыдущие попытки получить синий флуоресцентный белок, содержащий Тугбб в протонированном состоянии на основе зеленых флуоресцентных белков с замедленным эффектом переноса протона (excited-state proton transfer, ESPT) не привели к созданию яркого флуоресцентного варианта.
Ранее нами было показано, что хромофоры красных флуоресцентных белков DsRed-типа формируются через промежуточную синюю флуоресцентную форму, предположительно представляющую собой протонированный GFP-подобный хромофор. Эта промежуточная форма детектировалась в процессе созревания ряда красных тетрамерных флуоресцентных белков, в том числе DsRed, hsriCP и asulCP, и, скорее всего, характерна для созревания большинства красных флуоресцентных белков. Мы предположили, что методом сайт-направленного мутагенеза аминокислотных остатков в окружении хромофора красного флуоресцентного белка возможно заблокировать хромофор в промежуточной синей
флуоресцентной форме, получив таким образом новый Тугбб-содержащий синий флуоресцентный белок. В качестве исходного варианта красного флуоресцентного белка был выбран TagRFP, сочетающий высокую яркость флуоресценции и мономерную природу. Выбор позиций для сайт-направленного мутагенеза проводился на основе известной на тот момент структуры гомологичного белка eqFP611 (PDB ID: 1UIS). Нашей целью было заблокировать созревание хромофора на стадии промежуточной GFP-подобной формы и стабилизировать его в протонированном состоянии. Во всех известных красных флуоресцентных белках, входящую в состав хромофора позицию 65 занимает Met, Gin либо Glu. Мы предположили, что формирование специфичной для красного хромофора ацилиминной группы будет менее вероятно в случае замены положения 65 на алифатическую либо ароматическую аминокислоту, за счет меньшей поляризации связи 65аС-Н. Другие позиции аминокислотных остатков в окружении хромофора: 148, 165, 181 и 203 были выбраны с целью его стабилизации в протонированной форме.
В первом раунде, мы провели сайт-направленный вырожденный (с одновременной заменой на ряд возможных вариантов) мутагенез белка TagRFP по позициям Met65, Asnl48, Serl65, Phe 181 и His203. На этом этапе нам удалось получить несколько синих флуоресцентных вариантов, содержащих замены ряда: M65L,H,F/N148F,I,W/S165N,I,A,T/F181I,A,V/H203Y,F. Дальнейшая оптимизация велась с использованием метода проточной цитометрии клеток бактерий, экспрессирующих полученную библиотеку (проводилась в медицинском колледже Альберта Эйнштейна, США). После 5 последовательных раундов оптимизации методом случайного мутагенеза был получен вариант, названный TagBFP, содержащий 8 дополнительных аминокислотных замен: R69K/C179A (внутренняя), и N23D/P131T/M151T/G175S/D213N/K214N (внешние по отношению к бета-бочонку белка).
Полученный белок TagBFP характеризуется единственным пиком возбуждения флуоресценции при 402 нм, с максимумом эмиссии 457 нм. По сравнению с лучшим из разработанных ранее синим флуоресцентным белком EBFP2, TagBFP характеризуется более высоким коэффициентом молярной экстинкции (в 1.6 раза) и более высоким квантовым выходом. Расчетная яркость TagBFP выше таковой EBFP2 в 1.8 раза, что сопоставимо с яркостью широко используемых зеленых флуоресцентных белков. Время полу-созревания хромофора TagBFP при 37°С составляет 13 минут, что вдвое короче времени полусозревания EBFP2. Флуоресценция TagBFP характеризуется исключительно высокой устойчивостью к изменениям значения pH (кажущееся значение рКа < 3.0). Фотостабильность TagBFP сравнивали с наиболее фотостабильными синими флуоресцентными белками - Azurite и EBFP2, в двух системах: в каплях воды в масляной эмульсии, содержащих очищенный белок, с использованием широкопольного флуоресцентного микроскопа (100 Вт ртутная лампа, светофильтр DAPI 350/50), и в клетках HeLa, с использованием конфокального микроскопа (лазер 405 нм). В первой системе, время полу-обесцвечивания TagBFP было сопоставимо с таковым для белка Azurite и немного уступало времени EBFP2. Время полу-обесцвечивания TagBFP при облучении лазером 405 нм в сканирующем конфокальном микроскопе превышало таковое для белков EBFP2 и Azurite в 2.1 и 3.3 раза, соответственно. Согласно данным гель фильтрации низкого давления, TagBFP является мономером при нанесении в концентрации 10 мг/мл, и хорошо показал себя в работе в составе таких белков слияния как бета-актин и альфа-тубулин.
1.5. Мономерные белки средней части видимого спектра: TagCFP, TagGFP, TagYFP.
К началу нашей работы уже был разработан целый ряд вариантов флуоресцентных белков, характеризующихся эмиссией в циановой (470-480 нм), зеленой (500-510 нм) и желтой (520530 нм) областях видимого спектра. Тем не менее, некоторые их характеристики, такие как скорость созревания хромофора, устойчивость к изменениям значения pH и устойчивость к
фотообесцвечиванию, нуждались в дополнительной оптимизации. Для разработки улучшенных вариантов мы взяли за основу мономерный зеленый флуоресцентный белок Аециогеа тасго^ас1у!а, близкий к аувРР. Ключевые «классические» замены, приводящие к сдвигу пиков флуоресценции в коротковолновую (У66Ш), и длинноволновую (Т203У) области, были внесены методом сайт-направленного мутагенеза.
-у } * 'Л * 1 1 1 * В т|г
Рисунок 8. Многоцветное мечение в транзиентно трансфицированных клетках НеЬа. а. TagBFP-mito. Ь. TagCFP-p-aктин. с. TagYFP-a-тyбyлин. <1. TagRFP-roльджи. е. тКа1е-Н2В. Г Наложение.
В дальнейшем мы применили сочетание методов случайного и вырожденного сайт-направленного мутагенеза для оптимизации указанных выше характеристик. Отбор вариантов проводили визуально, с использованием флуоресцентного стереомикроскопа, с проведением предварительного фотообесцвечивания с целью селекции наиболее фотостабильных вариантов. В результате этой работы были получены циановый, зеленый и желтый мономерные флуоресцентные белки, названные Та§СРР, TagGFP и TagYFP, соответственно. Время полу-созревания хромофора при 37 °С для всех трех белков не превышает 30 мин. Флуоресценция белка TagYFP отличаются повышенной устойчивостью к изменениям рН в сравнении с аналогичными спектральными вариантами, что предположительно обусловлено входящим в состав хромофора аминокислотным остатком ТЬг65, занимаемого глицином во всех прочих мономерных вариантах желтых флуоресцентных белков. Все три результирующих белка характеризуются строго мономерной природой и хорошо показали себя при работе в составе белков слияния в живых клетках.
В общей сложности, в этой части работы нами было получено 8 основных вариантов мономерных флуоресцентных белков, сочетание которых позволяет проводить эффективное многоцветное мечение в живых клетках (рис. 8). Основные характеристики полученных мономерных белков приведены в Таблице 1.
Таблица 1. Сравнение полученных в работе мономерных флуоресцентных белков с лучшими аналогами, в том числе полученными позднее. Жирным шрифтом выделены флуоресцентные белки, полученные в настоящей работе.
белок EC, QY расч.
возб., HM ЭМ., HM M1 cm'1 яркость, от EGFP знач. pKa хара1стеристики
Azurite 383 26 000 0.55 0.43 5.0 pll , Ps+, mat+
EBFP2 383 32 000 0.56 0.54 4.5 pill,Pst.mat'
TagBFP 402 52 000 0.63 0.99 2.7 B+. pH++. Ps+, mat+
ECFP 477 32 500 0.40 0.39 4.7 pH-
Cerulean 475 36 000 0.57 0.62 4.7 Bt,pH+,Pi-
TagCFP 480 37 000 0.57 0.64 4.7 B+. pll+. mat+
EGFP 489 509 55 000 0.60 1.00 5.9 B+.Ps+
EmGFP 487 509 57 500 0.68 1.19 6.0 B+. Pi-
TagGFP 482 SOS 58 000 0.59 1.04 4.7 B+, Ps+, pll+. mat+
EYFP 514 527 84 000 0.61 1.55 6.5 B+,pH-,Cl-
Venus 515 528 92 200 0.57 1.59 6.0 B+. Pi-, Ps-
Citrine 516 529 77 000 0.76 1.77 5.7 B+, Ps-
TagYFP 508 524 64 000 0.62 1.20 5.5 B+. pH+, mat+
TagRFP-T* 555 584 81 000 0.41 0.99 4.6 B+, pH+. Ps+
mStrawberry 574 596 90 000 0.29 0.79 <4.5 B+. pH+, Ps-
TagRFP 555 S84 100 000 0.48 1.42 <4.0 B+. pH++
mCherry 587 610 72 000 0.22 0.48 <4.5 pH+, Ps+
FusionRed 580 608 125 000 0.19 0.72 4.2 B+, pll+. mat-
mRaspberry 598 625 86 000 0.15 0.39 - Ps-
mPlum 590 649 41 000 0.10 0.12 <4.5 B-, pH+. Ps-
mNeptune* 599 649 57 500 0.18 0.31 5.8 mat-, Gr
mKate 588 635 31500 0.28 0.27 6.2 pH-
mKate2 588 633 62 500 0.40 0.76 5.4 B+, pH+, Ps+, mat+
В- : низкая расчетная яркость B+ : высокая расчетная яркость (>0.60 от EGFP)
Ps-: низкая фотостабнльностъ Ps+ : высокая фотостабнльность
Pi- : выраженная обратимая фогоннактнвапня pll+ : высокая рН-собильность (кажущееся значение рКа <5.5)
рН-: низкая рН стабильность р||++ экстремально высокая рИ стабильность
(кажущееся значение рК, > 6.5) (кажущееся значение рКа <4.0)
С|- : чувствительность флуоресценции к ионам CI- mat+ : высокая скорость созревания хромофора
mat-: низкая скорость созревания хромофора
Gr : остаточная зеленая флуоресценция
•Белки TagRFP-T* и mNeptune* получены в лаборатории Р. Тсиена (США) на основе наших белков TagRFP и mKate, соответственно. QY - квантовый выход флуоресценции; ЕС, коэффициент молярной экстинкции при максимуме возбуждения.
2. Димерные флуоресцентные белки для мечения клеток и тканей.
Эта часть работы была нацелена на получение максимально эффективных флуоресцентных маркеров для мечения живых клеток и тканей, визуализации активности промотеров и других приложений, в которых не требуется получения химерных конструкций белков слияния. Для таких приложений мономерность не является необходимым свойством, и наши усилия были направлены на получение новых спектральных вариантов и оптимизацию флуоресцентных белков по таким параметрам как яркость флуоресцентного сигнала, скорость созревания хромофора, низкая токсичность, отсутствие видимой агрегации и неспецифической локализации в живых клетках, а также устойчивость к фотообесцвечиванию. На практике, яркость детектируемого сигнала при экспрессии флуоресцентного белка зависит также от других характеристик, таких как эффективность транскрипции и трансляции мРНК, стабильность мРНК и среднее времени жизни белка в клетке. Дальнейшее сравнительное тестирование в клеточных линиях и модельных животных позволяло оценить качество работы маркера по совокупности параметров.
2.1. Быстро созревающий нсагрегирующий зеленый флуоресцентный белок TurboGFP.
Один из наиболее быстро созревающих природных зеленых флуоресцентных белков, ppluGFP2 (AY268072), был ранее клонирован в нашей лаборатории из рачка Pontellina plumata (подкласс Copepoda). Белок ppluGFP2 характеризуется исключительно высокой скоростью появления яркого флуоресцентного сигнала при экспрессии как в бактериальных клетках Е. coli, так и в клетках млекопитающих. Однако, при высоких уровнях экспрессии, ppluGFP2 формирует видимые микрокристаллы (рис. 9а), что делает его высокотоксичным и малоприменимым для использования в стабильных клеточных линиях и трансгенных организмах.
Э Ь С EGFP TurboGFP
Рисунок 9. а,Ь. Конфокальная микроскопия клеток HeLa, экспрессирующих белки ppluGFP2 (а) и TurboGFP (b). После 48 часов экспрессии, ppluGFP2 формирует характерные микрокристаллы, разрушающие клетку. Белок TurboGFP равномерно распределен по клетке и не формирует видимых агрегатов, с. сравнение сигналов TurboGFP и EGFP при экспрессии в развивающихся зародышах X. laevis. Показаны стадии ранней (вверху) и средней (внизу) гаструлы.
Моделирование с использованием известной структуры белка avGFP показало, что поверхность белка ppluGFP2 преимущественно составляют отрицательно заряженные аминокислотные остатки, за исключением небольшого позитивно заряженного участка, формируемого в районе выхода N- и С-концов белка. Мы предположили, что характерная агрегация ppluGFP2 может быть вызвана электростатическими взаимодействиями между позитивно и негативно заряженными поверхностями белка. С тем чтобы экранировать позитивно заряженный участок, мы использовали сайт-направленный мутагенез для добавления отрицательно зараженных аминокислотных остатков на N- и С-концевые участки ppluGFP2. Действительно, полученный мутантный вариант характеризовался меньшей склонностью к агрегации in vitro, однако при продолжительной экспрессии в клетках HeLa по-прежнему формировал характерные микрокристаллы. Согласно данным гель-хроматографии низкого давления, ppluGFP2 характеризуется тетрамерной природой. Задавшись целью получить мономерный быстро созревающий зеленый флуоресцентный белок, мы провели несколько раундов сайт-направленного мутагенеза, преимущественно заменяя экспонированные гидрофобные аминокислотные остатки предполагаемых интерфейсов олигомеризации. В результате этой работы, нам не удалось получить мономерный мутантный вариант белка ppluGFP2, который сохранил бы свои флуоресцентные свойства. Однако, был получен белок, названный TurboGFP, характеризующийся димерной природой согласно гель-хроматографии низкого давления, и не формирующий агрегатов при продолжительной гипер-экспрессии в живых клетках. Мы предполагаем, что формирование тетрамера является необходимым событием для инициации дальнейшей олигомеризации и агрегации белка ppluGFP2.
Белок TurboGFP характеризуется яркой зеленой флуоресценцией с квантовым выходом 0.53 и коэффициентом молярной экстинкции 70 ООО М"'см"', высокой устойчивостью
флуоресцентного сигнала к изменению значения рН (кажущееся значение рКа = 5.2). При физиологических условиях (рН 7.4, 20 мМ фосфатный буфер, 0.14 M NaCl) TurboGFP сохраняет растворимость в концентрациях до 60 мг/мл. Как и белок дикого типа, TurboGFP характеризуется быстрым созреванием хромофора in vitro (время полу-созревания около 25 минут, рис. 10), и in vivo (рис. 9с). В отличие от белка дикого типа, белок TurboGFP не формирует токсичных агрегатов в живых клетках, что позволило получить стабильные экспрессионные клеточные линии (получены проф. С. Petzelt, Германия). Мы также получили дестабилизированную версию белка (TurboGFPdest), путем слияния с деградационным доменом орнитин декарбоксилазы. В транзиентно трансфецированных клетках млекопитающих, добавление циклогексимида в концентрации 100 мкг/мл (ингибитор синтеза белка), приводило к падению флуоресцентного сигнала TurboGFP с полу-временем около 2 часов.
abc d
Рисунок 10. a.b. Струкутра белка TurboGFP и кинетика его созревания, а. Показан срез поверхности белка на уровне плоскости хромофора (выделен зеленым цветом). Показан ведущий к хромофору канал, заполненный молекулами воды (выделены фиолетовым цветом) и аминокислотный остаток Val205, направленный мутагенез которого позволил сузить пространство канала. Ь. Показан тетрамер TurboGFP, в составе остается экспонированным канал, ведущий к хромофору белка (показан зеленым цветом). c,d. Кинетика ренатурации (с) и созревания (d) белков EGFP, TurboGFP и TurboGFP-V197L in vitro. Показаны нормированные кривые восстановления флуоресценции после тепловой денатурации (с) и тепловой денатурации в присутствии дитионита натрия, восстанавливающего хромофор белка (d).
В то же время, аналогичный белок слияния с белком дикого типа, ppluGFP2, оказался нечувствителен к деградации. Мы предполагаем, что формирование микроагрегатов делает ppluGFP2 недоступным для протеолитических систем клетки. Быстрое появление флуоресцентного сигнала, в сочетании с быстрой деградацией TurboGFPdest, является оптимальным сочетанием для слежения за экспрессией генов в живых тканях.
В совместной работе с др. А.Г. Евдокимовым (Pfizer), методом рентгеноструктурного анализа была решена трехмерная структура белка TurboGFP. Интересной особенностью этого белка оказался заполненный водой канал, ведущий к фенольному кольцу хромофора (рис. 10а). Этот канал остается открытым в составе тетрамера белка (рис. 10b), и предположительно может способствовать созреванию хромофора, облегчая доступ молекулярного кислорода. Действительно, полученный методом сайт-направленного мутагенеза мутантный вариант TurboGFP-V205L, в котором обнаруженный канал должен быть сужен за счет более объемного остатка лейцина, характеризовался относительно замедленной кинетикой созревания хромофора при сохранении высокой скорости сворачивания белка (рис. 10c,d).
2.2. Оранжево-красные флуоресцентные белки eqFP578 и ТигЬоКГР.
Полученные ранее красные флуоресцентные белки, в том числе клонированный в нашей лаборатории белок DsR.ec! и его производные, успешно применялись в различных приложениях и до настоящей работы. Однако, эти белки уступали по яркости зеленым флуоресцентным белкам, характеризовались неполным созреванием и строго тетрамерной природой, что существенно ограничивало круг их возможного применения. По этой причине, мы периодически проводили поиск новых красных флуоресцентных белков в окрашенных и флуоресцентных организмах классов Нус1гогоа и АпШогоа. Основной задачей мы ставили обнаружение вариантов, характеризующихся более высокой яркостью флуоресценции, полнотой созревания красного хромофора, и меньшей степенью олигомеризации - в идеальном случае мы надеялись клонировать природный мономерный красный флуоресцентный белок для целей мечения белков слияния.
Ген наиболее близкого по совокупности желаемых характеристик варианта нам удалось клонировать из морского анемона Емастаеа с/иас/псоЬг (рис. 11а), с использованием метода экспрессионных кДНК библиотек. Полученный оранжево-красный флуоресцентный белок, с максимумами возбуждения и эмиссии флуоресценции при 552 и 578 нм, соответственно, был назван eqFP578. Белок ецРР578 характеризуется молярным коэффициентом экстинкции 102 ООО М"1 см"1 при 552 нм, и квантовым выходом 0.54, с результирующей расчетной яркостью в 1.5 раза превосходящей белок 05Кеё2. Спектр поглощения ецРР578 имеет единственный пик, что указывает на полное созревание хромофора до красной формы, без образования существенных количеств альтернативных либо промежуточных форм. Как описано выше, белок ецРР578 является слабым тетрамером, что облегчило дальнейшую работу по его мономеризации (Раздел 1.1.). Интересно, что хромофорная группа ецРР611, ближайшего гомолога eqFP578, полученного ранее из Е. циас]псо1ог, находится в транс-конформации, что типично для нефлуоресцентных ОРР-подобных хромобелков. Ключевые остатки в ближайшем окружении хромофора в белках ерРР578 и еяРРб 11 идентичны, и можно с большой степенью уверенности заключить, что хромофор ецРР578 также характеризуется транс-конформацией.
Рисунок И. а. Морской анемон ЕШастаеа циш{псо1ог. Ь. Нормированные спектры возбуждения (прерывистая линия) и эмиссии (непрерывная линия) флуоресценции белка ТигЬоКРР. с. Флуоресценция белка ТигЬоКРР при экспрессии в клетках НеЬа.
Основным недостатком белка eqFP578 дикого типа как флуоресцентного маркера являлась относительно низкая скорость созревания хромофора при 37°С. С целью ускорения созревания, мы провели несколько раундов случайного ПЦР-мутагенеза. В ходе каждого раунда, после инкубации в течение 12-14 часов при +37°С проводился отбор индивидуальных бактериальных клонов по яркости сигнала, с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. Отобранный в результате этой работы вариант, названный ТигЬоКРР,
характеризовался увеличенной относительно eqFP578 яркостью флуоресценции и скоростью созревания хромофора.
Максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции TurboRFP приходятся на 553 и 574 нм, соответственно (рис. lib). Коэффициент молярной экстинкции TurboRFP при 553 нм составляет 92 000М"'см"', квантовый выход флуоресценции 0.67, и результирующая расчетная яркость в 1.7 раза превышает яркость белка DsRed2. Флуоресценция TurboRFP характеризуется высокой pH-стабильностью (кажущееся значение рКа = 4.4). Хромофор TurboRFP быстро и полно созревает при 37 °С. При продолжительной (до 7 дней) экспрессии TurboRFP в эукариотических клетках белок TurboRFP остается равномерно распределенным в цитоплазме и не формирует видимых агрегатов (рис. 11с), что свидетельствует в пользу низкой токсичности белка, необходимой для создания стабильно экспрессирующих клеточных линий и трансгенных животных. Таким образом, белок TurboRFP сочетает большинство качеств, необходимых для эффективного прижизненного мечения клеток и тканей. В дальнейшем на его основе был получен целый ряд мономерных (Раздел 1) и димерных (см. далее) флуоресцентных белков для различных приложений.
2.3. Дальнекрасный флуоресцентный белок Katushka.
Получение и характеризация. В организме млекопитающих, большая часть суммарного поглощения приходится на меланин, гемоглобин и воду таким образом, что оно остаётся минимальным в диапазоне от 650 до 1100 нм, что соответствует дальнекрасной области видимой части спектра и инфракрасной области. По этой причине, актуальной задачей для биомедицинских исследований на модельных организмах является получение ярких флуоресцентных белков с максимальным батохромным сдвигом, максимумы эмиссии которых приближались бы к 650 нм. Подобных белков до сих пор не было обнаружено в природе. По совокупности характеристик, оптимальной основой для получения яркого дальнекрасного флуоресцентного белка мы посчитали описанный выше белок TurboRFP. Мы надеялись, что тонкая настройка окружения хромофора в белке TurboRFP позволит добиться батохромного сдвига эмиссии без существенных потерь в квантовом выходе флуоресценции и коэффициенте молярной экстинкции.
Выбор ключевых положений аминокислотных остатков для направленного мутагенеза был основан на данных рентгеноструктурного анализа близкого белка eqFP611 (PDB ID: 1UIS). По результатам анализа структуры белка, мы провели одновременный вырожденный направленный мутагенез TurboRFP по положениям Asnl48, Serl65 и Phel81, в различных сочетаниях: N148GATCS/S165GATCS/F181FLIMV (125 возможных аминокислотных комбинаций), N148FLIMV/S165GATCS/F181FLIMV (125 возможных аминокислотных комбинаций), N148NKDEQHY/ S165GATCS/F181 FLIMV (175 возможных аминокислотных комбинаций). Полученные библиотеки мутантных вариантов были дополнительно подвержены случайному ПЦР-мутагенезу, который, по замыслу эксперимента, должен был помочь обнаружить аминокислотные замены, способные скомпенсировать возможные пространственные конфликты, возникшие вследствие направленного мутагенеза микроокружения хромофора. Анализ экспрессионной библиотеки в бактериях Е. coli проводили с использованием стереомикроскопа, оснащенного набором светофильтров, позволяющим предпочтительно отбирать варианты, характеризующихся дальнекрасной флуоресценцией (фильтр возбуждающего света 520-620 нм, фильтр эмиссии 650LP). Спектры эмиссии флуоресценции вариантов, характеризовавшихся наиболее яркой эмиссией флуоресценции в дальнекрасной области, регистрировались при помощи встроенного в стереомикроскоп спектрофлуориметра SMS2VIS.
В результате проведенного анализа библиотеки был отобран единственный мутантный вариант белка TurboRFP, заметно превосходящий прочие варианты по яркости дальнекрасной флуоресценции, с максимумом эмиссии при 635 нм, содержащий аминкислотные замены N148S, F181L, H199Y и H203R. Аминокислотный остаток в положении 203 находится в непосредственной близости от хромофорной группы, и полученная в результате случайного ПЦР-мутагенеза замена H203R очевидно существенно влияет на спектральные свойства флуоресцентного белка. Дополнительно, для оптимизации полученного мутантного варианта по параметрам яркости флуоресценции и скорости созревания хромофора при 37°С, было проведено 4 раунда случайного ПЦР-мутагенеза. Оптимизированный вариант получил название Katushka (Катюша, в честь Екатерины Мерзляк, одного из основных разработчиков белка).
Максимум возбуждения флуоресценции белка Katushka приходится на 588 нм, максимум эмиссии - на 635 нм, что приближает его спектральные характеристики к желаемым для эффективной визуализации в толще живых тканей. Спектр поглощения белка Katushka характеризуется единственным пиком, максимум которого совпадает с максимумом возбуждения флуоресценции. Эти данные свидетельствуют об отсутствии в зрелом белке Katushka промежуточных либо альтернативных форм созревания хромофора. Время полусозревания хромофора in vitro составляет около 20 минут. Флуоресценция белка Katushka обладает высокой устойчивостью к изменению значения pH (кажущееся значение рКа = 5.5). Квантовый выход флуоресценции белка Katushka составляет 0.34, а коэффициент молярной экстинкции 65 ООО М" см"', и расчетная яркость флуоресценции в 7-10 раз превосходила известные на тот момент спектральные аналоги, белки HcRed и mPlum. Яркость флуоресценции Katushka в области оптического окна, рассчитанная как интеграл от спектра эмиссии флуоресценции, нормированного на расчетную яркость, в пределах 650800 нм, существенно превосходит яркость известных оранжево-красных и дальнекрасных флуоресцентных белков: mPlum, eqFP611, mRaspberry, mCherry, TurboRFP, DsRed2, DsRed-Express, AQ143 и HcRed (рис. 12a,b).
Примечание: Расчет относительной яркости флуоресценции в области оптического окна был проведен по шкале длин волн, выраженной в нм. Более корректным, с учетом разницы энергий, является расчет по шкале частот. Однако, сравнение двух типов расчетных данных показало, что, в данном случае, ошибка составила не более долей процента.
Время полуобесцвечивания белка Katushka в конфокальном флуоресцентном микроскопе (лазер 543 нм) превышало время полуобесцвечивания белков Cerulean, EYFP, mCherry и mPlum приблизительно в два раза. Под воздействием облучения ртутной лампы (светофильтр 540-580 нм, мощность 200 мВт/см2) в первые 90 с наблюдалось незначительное увеличение интенсивности флуоресцентного сигнала белка Katushka, далее кинетика выгорания была близка к таковой для mCherry.
Сравнение с аналогами в живых клетках и in vivo. При экспрессии в эукариотических клеточных линиях HeLa и Phoenix Eco, яркий флуоресцентный сигнал белка Katushka появлялся через 10-14 часов после трансфекции. При экспрессии в течение 5-7 дней, белки DsRed2 и DsRed-Express преимущественно локализуются в комплексе Гольджи, а белки mCherry и mRaspberry формируют небольшие точечные агрегаты. Белковые агрегаты могут быть токсичными для клеток, что затрудняет получение стабильно экспрессирующих такие белки клеточных линий и трансгенных животных. Существенно, что даже при высоких уровнях экспрессии белок Katushka не формирует агрегатов и равномерно распределен в цитоплазме, что свидетельствует в пользу его низкой токсичности в живых клетках.
DsRed-Express Katushka
8 I I 8 § ¡ 20
P
Г 0
Отческое ок но
— Katushka
\ — mPlum
\ DsFted-Expres \ - mCherry
\ - mFfespberry
\ - eqFP611
550 600 650 700 750 Длина вогиы, hi
DO
° г ч 1
I J
x e
i
2 СЕМПЫ
OODd
Рисунок 12. Характеристики белка Katushka in vitro и in vivo. а. Спектры эмиссии избранных красных и дальнекрасных флуоресцентных белков, нормированные на расчетную яркость флуоресценции. Показано оптическое окно, оптимальное для визуализации в живых тканях. Ь. Яркости флуоресценции сравниваемых флуоресцентных белков в пределах оптического окна, вычисленные как определённые интегралы в пределах 650-800 нм. с. Трансгенные эмбрионы X. laevis, экспрессирующие белки Katushka (с, вверху) и DsRed-Express (с, внизу) под контролем промотора кардиоактина. Показаны фотографии в белом свете (1,3) и флуоресцентные изображения в родаминовом светофильтре (2,4). Показаны фотографии передней части трансгенных эмбрионов с левой стороны (с, слева) и поперечного сечения (с, справа) в плоскостях, показанных пунктиром (направление указано стрелками), d. Фотография в белом свете (вверху) и флуоресцентное изображение (внизу) 2.5-месячных лягушек X. laevis, экспрессирующих DsRed-Express (слева) и Katushka (справа) в мышечных тканях.
Для проверки возможности использования белка Katushka в экспериментах, связанных с визуализацией объектов в многоклеточных организмах, мы использовали модель лягушки X. laevis (совместно с Лабораторией молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН). Кодирующие последовательности белков Katushka, DsRed-Express и mPlum были заклонированы под контроль фрагмента промотора кардиоактина X. laevis, характеризующегося тканеспецифической активностью в скелетных мышцах и кардиомиоцитах лягушек.
В трансгенных эмбрионах, экспрессирующих Katushka, наблюдалась яркая флуоресценция в области сомитов и зачатка сердца (рис. 12с2). В то же время, в аналогичных эмбрионах, экспрессирующих сопоставимый по яркости оранжево-красный флуоресцентный белок DsRed-Express, флуоресцентный сигнал из области сердца практически не регистрировался, несмотря на яркую флуоресценцию сомитов (рис. 12с4). Различие объясняется тем, что сомиты покрыты лишь тонким слоем эпидермиса, в отличие от зачатка сердца, окружённого богатыми желтком клетками, где выраженно проявляется преимущество дальнекрасной флуоресценции при визуализации сигнала в живых тканях. Сигнал белка mPlum также не визуализировался, ввиду его низкой яркости. Впоследствии было проведено поперечное рассечение эмбрионов в области сердца. При исследовании среза, яркая флуоресценция в
области сердечного зачатка наблюдалась у эмбрионов, экспрессирующих как белок Katushka, так и белок DsRed-Express (рис. 12с2, 12с4). В лягушках, достигших возраста 2.5 месяца, сигнал белка Katushka удавалось визуализировать во всем теле, в то время как сигнал DsRed-Express лишь слабо проникал через ткани лягушек (рис. 12d). Важно отметить, что трансгенные эмбрионы, экспрессирующие белок Katushka, обладали лучшей выживаемостью (18 из 48, 38%) в сравнении с эмбрионами, экспрессирующими DsRed-Express (9 из 45, 20%). Мы также успешно получили линию трансгенных рыб Danio rerio, экспрессирующих ген белка Katushka в мышечных тканях.
Примечание: кроме того, в 2010 году другими авторами была опубликована работа, описывающая трансгенных мышей, в которых ген белка Katushka заключен между LoxP сайтами рекомбинации. Показана низкая токсичность белка при высоком уровне экспрессии во всех клетках организма, а также высокая эффективность при визуализации клеток поджелудочной железы в интактных животных.
В целом, проведенные сравнения показали, что полученный белок Katushka является предпочтительным генетически кодируемым маркером для визуализации клеток и тканей в живых модельных животных, существенно повышающим чувствительность визуализации при экспериментах на модельных животных.
2.4. Батохромные варианты белка Katushka - eqFP650 и eqFP670.
На следующем этапе этой работы мы поставили себе задачу добиться дальнейшего смещения спектров возбуждения и эмиссии флуоресценции белка Katushka в длинноволновую область. Такие дальнекрасные маркеры необходимы как для задач, требующих визуализации сигнала в толще живых тканей, так и для многоцветного мечения объектов в живых системах. В экспериментах, связанных с визуализацией в живых тканях, как правило, предпочтительны высокие концентрации репортерного белка, и его потенциальная цитотоксичность становится критичным параметром. Белок Katushka в целом характеризовался достаточно низкой токсичностью при создании стабильных линий X. laevis и D. rerio (раздел 2.3.). Тем не менее, мы предприняли усилия для отбора вариантов, характеризующихся более низкой токсичностью, с использованием предложенной недавно методики отбора нетоксичных вариантов флуоресцентных белков, в которой размер растущей колонии бактерий являлся критерием токсичности экспрессируемого бактериями белка. Мы использовали описанный метод для поиска наименее цитотоксичных вариантов белка Katushka среди модификаций, полученных ранее в ходе его разработки. В результате, в качестве основы для получения новых батохромных вариантов, был выбран белок Katushka-9-5, который характеризовался наиболее низкой токсичностью и при этом обладает спектральными характеристиками, практически идентичными белку Katushka.
Основываясь на анализе известной к этому моменту трёхмерной структуры гомологичного белка mKate (PDB ID: ЗВХВ), был отобран ряд положений аминокислотных остатков, потенциально способных повлиять на спектральные характеристики: М14, L16, М44, Т62, Y121, S148, S165, М167, R203 и L205. По этим положениям был проведен вырожденный мутагенез, при котором несколько вариантов аминокислотных замен сочетались в различных комбинациях. Дополнительно, следуя описанной выше логике мутагенеза, проведенного при получении белка Katushka, библиотеки вариантов подвергали случайному ПЦР-мутагенезу. Отбор вариантов, характеризуемых батохромным сдвигом относительно белка Katushka, проводили из более чем миллиона индивидуальных бактериальных клонов, и использованием флуоресцентного стереомикроскопа, оснащенного двумя наборами светофильтров (фильтр возбуждающего света 520-620 нм, фильтр эмиссии 650LP; фильтр возбуждающего света 590-650 нм, фильтр эмиссии 663-738 нм). В результате было отобрано
два варианта, характеризующихся выраженным сдвигом спектра эмиссии в длинноволновую область. Два полученных белка, названные eqFP650 и eqFP670, характеризуются максимумами эмиссии при 650 и 670 нм, соответственно. Относительно белка Katushka-9-5, белок eqFP650 содержит аминокислотные замены N24G и М44А, а белок eqFP670 - замены М14Т, N24G, М44С, S148N и S165N. Интересно, что остаток метионина в положении 44 также заменён на небольшой аминокислотный остаток в двух недавно опубликованных дальнекрасных флуоресцентных белках: mNeptune (производный от белка mKate) и E2-Crimson (производный от белка DsRed). Было показано, что образующаяся в результате такой замены полость занята молекулой воды, формирующей водородную связь с хромофорной группой. Можно предположить, что мутации М44А и М44С выполняют ту же функцию в белках eqFP650 и eqFP670, и что введение небольшого аминокислотного остатка в положение 44 может являться универсальным способом батохромного смещения спектра эмиссии флуоресценции белков, несущих DsRed-подобный хромофор.
Характеристика и сравнение с аналогами in vitro. Максимум возбуждения флуоресценции белка eqFP650 приходится на 592 нм, а максимум эмиссии - на 650 нм (против 588 и 635 нм белка Katushka, соответственно). В то же время, eqFP650 обладает самой высокой расчетной яркостью среди всех известных флуоресцентных белков с максимумами эмиссии более 635 нм: квантовый выход флуоресценции eqFP650 составляет 0.24, а коэффициент молярной экстинкции - 65 ООО М"1 см"1. Таким образом, при сохранении достаточно высокой яркости флуоресценции, eqFP650 характеризуется выраженным батохромным сдвигом спектра эмиссии флуоресценции относительно белка Katushka. Белок eqFP670 первый и на сегодняшний день единственный флуоресцентный белок со столь дальнекрасной эмиссией флуоресценции, около 50% которой приходится на инфракрасную область. Несмотря на то, что eqFP670 характеризуется низкой яркостью флуоресцентного сигнала (квантовый выход составляет 0.06, коэффициент молярной экстинкции - 70 000 М"1 см"'), значительный батохромный сдвиг, как спектра эмиссии, так и спектра возбуждения флуоресценции (максимумы при 605 и 670 нм соответственно) делают eqFP670 потенциально полезным инструментом как для технологий многоцветного мечения, так и, возможно, для визуализации сигнала в толще живых тканей. Расчет яркости флуоресценции в инфракрасной области, при условии возбуждения при 635 нм (распространенная линия лазера, хорошо проникающая через живые ткани) и регистрации в пределах 700-900 нм, показывает 4-кратное превосходство eqFP670 над белком Katushka. Насколько можно судить по спектрам поглощения, созревание обоих белков проходит полно, без формирования промежуточных либо альтернативных форм созревания хромофора. Время полусозревания хромофора eqFP650 in vitro составляет около 20 минут. Флуоресцентный сигнал eqFP650 и eqFP670 характеризуется высокой устойчивостью к изменению значения pH: кажущееся значение рКа = 5.7 и 4.5, соответственно. Кроме того, eqFP670 характеризуется исключительно высокой для флуоресцентных белков устойчивостью к фотообесцвечиванию, что может быть важно при необходимости проведения длительных экспериментов с продолжительным облучением и для накопления флуоресцентного сигнала. Возможно, неординарная фотостабильность eqFP670 объясняется уникальной для флуоресцентных белков комбинацией аминокислотных остатков 148N и 165N, которые должны способствовать плотной упаковке аминокислотных остатков и вытеснению молекул воды из непосредственного окружения хромофора.
Характеристика и сравнение с аналогами в живых клетках и in vivo. Белки eqFP650 и eqFP670 характеризуются достаточно высокой скоростью созревания при 37°С в Е. coli, так как яркие флуоресцентные сигналы наблюдаются уже после 10-12 часов роста бактериальных клонов. В эукариотических клетках линии HeLa через 14 часов после трансфекции мы наблюдали высокий уровень сигнала eqFP650, сигнал eqFP670 также
детектировался. В клетках линии НЕК-293Т, отличающихся более высоким уровнем экспрессии, яркость флуоресценции обоих полученных белков была высокой через 14 часов после трансфекции, при этом eqFP650 и eqFP670 были равномерно распределены по эукариотическим клеткам, видимые агрегаты отсутствовали. Для определения эффективности белков eqFP650 и eqFP670 как маркеров для визуализации клеток в толще живых тканей, клетки линии НЕК-293Т, транзиентно трансфицированные плазмидами, кодирующими последовательности белков Katushka, eqFP650, eqFP670, mNeptune и E2-Crimson, были инъецированы в ягодичную мышцу мышей. Для нормализации сигнала на эффективность трансфекции и общее число введённых клеток, последние были также котрансфицированы генетическими конструкциями, кодирующими люциферазу. Флуоресцентные и люминесцентные сигналы регистрировали при помощи системы IVIS Spectrum. Оптимальное соотношение сигнал/шум достигалось при использовании фильтров возбуждающего света 570/30 и 605/30 нм. На рисунке 13а показаны характерные изображения мышей, полученные с использованием фильтра возбуждающего света 605/30 нм и фильтра эмиссии 660/20 нм.
a be
возбуждение бО&ЗОнм
эмиссия 66(У20нм возбуждение 570i 30 нм возбуждение605/30нм
Рисунок 13. Визуализация eqFP650 и eqFP670 в мышах, а. Типичные изображения в отражённом свете (возбуждение 605/30 нм, эмиссия 660/20 нм) после внутримышечных микроинъекций клеток линии НЕК-293Т, продуцирующих белки E2-Crimson, mNeptune и eqFP650. b,c. Интенсивность флуоресцентного сигнала инъецированных клеток, регистрируемого с помощью набора светофильтров эмиссии при возбуждении на 570/30 нм (Ь) и 605/30 нм (с). Значения интенсивности флуоресценции были нормированы на интенсивность сигнала котрансфицированной светлячковой люциферазы.
Белок eqFP650 характеризовался наиболее интенсивным флуоресцентным сигналом. Количественные данные, полученные при детекции с помощью фильтров возбуждающего света 570/30 нм и 605/30 нм, нормированные на люминесцентный сигнал (рис. 13Ь,с), показывают, что на момент публикации (Shcherbo D et al., Nature Methods, 2010), eqFP650 является предпочтительным генетически кодируемым маркером для визуализации в живых тканях.
В этой части работы нами также были получены быстро созревающие димерные флуоресцентные белки TurboYFP и TurboFP602. В Таблице 2 приведены основные характеристики полученных маркеров в сравнении с лучшими аналогами.
Таблица 2. Сравнение полученных в работе димерных флуоресцентных белков с аналогами, в том числе полученными позднее. Жирным шрифтом выделены флуоресцентные белки, полученные в настоящей работе.
белок макс. возб., нм макс. эм., нм EC, M-1 cm"1 QY расч. яркость, от EGFP каж. знач. рка относительные характеристики
ppluGFP2 482 502 70 000 0.60 1.26 4.3 Т, В+. рН+. Ps-i. Mat-f, Ag
ZsGreen 493 505 43 000 0.91 1.19 Т,В+
TurboGFP 482 502 70 000 0.53 1.12 5.2 D. В+, рН+, Ps+, Mat+
ZsYellow! 529 539 20000 0.65 0.39 Т
TurboYFP 525 538 105 000 0.53 1.69 5.9 D, В+, Ps+, Mat+
DsRed2 563 582 43 800 0.55 0.73 T, B-r
DsRed-Express 555 584 38 000 0.51 0.59 T, Ps+, Mai+
DsRed-Express2 554 591 35 600 0.42 0.45 T, Ps+, Mat+
DsRed-Max 560 589 48 000 0.4 J 0.60 T, B+. Ps-, Ma!+
AsRed2 576 592 61 000 0.21 0.39 T
dTomato 554 581 69 000 0.69 1.44 D, B+. Ps+
eqFP6I1 559 611 78 000 0.45 1.06 T, B+, Ps-,
TurboRFP 553 574 92 000 0.67 1.87 4.4 D, B+, pH+, Mat+
TurboFP602 574 602 75 000 0.35 0.79 4.7 D, B+, pH+, Ps-, Mat+
katushka 588 MS 65 000 0.34 0.67 5.5 D, B+, pH+, Ps+. Mat+
Katushka2 588 633 69 000 0.37 0.77 5.5 D, B+, pH+, Ps+, Mat+
AQ143 595 635 90 000 0.04 0.11 T, B-
mNeptune* 599 64f 57 500 0.18 0.31 5.8 mat-, Gr
E2-Crimson 605 646 58 500 0.12 0.21 B1
eqFP6S0 592 «50 65 000 0.24 0.47 5.7 D, pH+,
eqFP670 605 67» 70 000 0.06 0.13 4.5 D, B-, pH+,
В+ : высокая расчетная яркость (>0.60 от EGFP)
Т: тетрамер Ps+ : высокая фотостабильность
D: димер рН+ : высокая рН-стабильность
В-: низкая расчетная яркость (кажущееся значение рКа <5.5)
Ps-: низкая фотостабильность mat+ : высокая скорость созревания хромофора Ag : выраженная агрегация Gr : остаточная зеленая флуоресценция BI: остаточная синяя флуоресценция Mat-: низкая скорость созревания хромофора
*Белок mNeptune* получен в лаборатории Р. Тсиена (США) на основе нашего белка mKate.
QY - квантовый выход флуоресценции; ЕС, коэффициент молярной экстинкции при максимуме возбуждения.
3. Фотоактивируемые флуоресцентные белки
Фотоакгивируемые флуоресцентные белки отличаются способностью к выраженному изменению спектральных свойств при облучении светом определенной длины волны. Эти изменения могут быть обратимыми либо необратимыми, и оба эффекта востребованы в различных практических приложениях. Мы приложили усилия к разработке оптимальных мономерных фотоактивируемых белков, применимых для технологий слежения за перераспределением и направленным транспортом белков слияния в живых клетках, а также для так называемых технологий сверхвысокого» разрешения, таких как PALM (Photoactivated localization microscopy, микроскопия "локализованной фотоактивации") и RESOLFT (reversible saturable optical fluorescent transition "обратимого насыщенного оптического флуоресцентного перехода"), позволяющих методами флуоресцентной микроскопии различить объекты, находящиеся на расстоянии 10-20 нм. Кроме того, нами были отработаны оптимальные протоколы фотоактивации с использованием различных систем флуоресцентных микроскопов, и предложена технология «белковых речек», позволяющая повысить разрешение изображения при отслеживании быстрой диффузии белков в живых клетках с использованием обратимой фотоактивации.
3.1. Высококонтрастный фотоактивируемый белок PS-CFP2.
Задачей этой части работы было создание необратимо фотоактивируемого зеленого флуоресцентного белка, подобного опубликованному в 2002 белку PA-GFP, но превосходящего его по «контрасту» (выраженности изменения флуоресцентных свойств при фотоактивации), и оставляющего возможность для визуализации нефотоактивированной формы, которая в белке PA-GFP отличается низкой яркостью флуоресценции и практически мгновенно фотоактивирустся при визуализации даже при малой мощности возбуждающего света. GFP-подобный хромофор в белке PA-GFP находится в протонированной форме (максимум возбуждения в области 400 нм), и переходит в депротонированную форму (максимум возбуждения в области 490 нм) при декарбоксилировании Glu222, вызываемом облучением фиолетовым (380-420 нм) светом.
В качестве основы для получения нового фотоактивируемого белка был выбран мономерный зеленый флуоресцентный белок aceGFP. Основываясь на известных структурах близких зеленых флуоресцентных белков и имеющихся на тот момент данных о белке PA-GFP, для направленного мутагенеза были выбраны аминокислотные остатки в положениях 148, 165, 220 и 222. Сочетанием различных вариантов замен по этим положениям, методом вырожденного мутагенеза были получены библиотеки мутантных вариантов aceGFP. Предварительный отбор проводился с использованием флуоресцентного стереомикроскопа, и был направлен на поиск вариантов, характеризующихся яркой флуоресценцией при возбуждении светом в фиолетовой (380-420 нм), и отсутствием флуоресценции при возбуждении светом в синей (около 450-480 нм) области спектра. На этом этапе, среди прочих, были отобраны два мутантных варианта, характеризующиеся циановой (голубой, максимум эмиссии около 470 нм) флуоресценцией и способных к необратимому переключению в зеленую флуоресцентную форму в ответ на облучение интенсивным фиолетовым светом. Циановая (а не зеленая, как в белке PA-GFP) эмиссия флуоресценции белка до фотоактивации предпочтительна, ввиду более надежного спектрального разделения с зеленой флуоресцентной формой, образующейся после фотоактивации, даже с учетом существенных отличий в спектрах возбуждения двух форм. По этой причине эти два варианта были отобраны для дальнейшей оптимизации методом случайного ПЦР-мутагенеза. В результате оптимизации был получен вариант, названный PS-CFP (фотопереключаемый циановый флуоресцентный белок, PhotoSwitchable Cyan Fluorescent Protein), содержащий, относительно aceGFP, аминокислотные замены Т62А, N121S, Н148Т, K158R, I167V, Е172К, F221L, G222E, и K238Q. В дальнейшем белок PS-CFP был ещё существенно оптимизирован методом случайного ПЦР-мутагенеза по параметрам скорости созревания и яркости флуоресцентных сигналов обоих форм. Результирующий белок, содержащий замены S108T, M153V, Т154А, был назван PS-CFP2.
Белок PS-CFP2 характеризуется циановой флуоресценцией с максимумами возбуждения и эмиссии при 400 и 468 нм, соответственно, что характерно для протонированного GFP-подобного хромофора, находящегося в условиях, замедляющих эффект переноса протона при возбуждении (excited state proton transfer, ESPT). Квантовый выход флуоресценции этой формы составляет 0.2, коэффициент молярной экстинкции - 42 000 М"1 см"1. При облучении интенсивным фиолетовым светом, PS-CFP2 необратимо переходит в зеленую флуоресцентную форму, характеризующуюся максимумами возбуждения и эмиссии флуоресценции при 490 и 511 нм, соответственно. Квантовый выход флуоресценции зеленой формы составляет 0.23, коэффициент молярной экстинкции - 47 000 М"1 см"'.
При полной фотоактивации образца белка PS-CFP2 in vitro, яркость зеленой (возбуждение при 490 нм) флуоресценции возрастает более чем в 400 раз (против 100 раз для PA-GFP), в то время как яркость циановой флуоресценции снижается в 5.5 раз. Таким образом, суммарный «контраст» фотоактивации, то есть, в данном случае, результирующее
изменение соотношения яркости флуоресцентных сигналов при переходе белка в новую форму, составляет более 2 ООО раз. Природа этой фотоконверсии, предположительно, аналогична фотоактивации белка PA-GFP. Флуоресцентный сигнал обоих форм PS-CFP2 характеризуются достаточно высокой устойчивостью к изменению значения pH (кажущееся значение рКа = 4.3 для циановой, 6.1 для зеленой формы).
При экспрессии в клетках млекопитающих, сигнал PS-CFP2 хорошо детектируется спустя 20 часов после трансфекции, равномерно распределен по клеткам, не образует видимых агрегатов при продолжительном культивировании трансфицированных клеток. Зеленая флуоресценция практически не детектируется до фотоактивации, которую предпочтительно проводить с использованием лазера 405 нм. Под воздействием фиолетового облучения ртутной лампы умеренной интенсивности фотоактивация PS-CFP2 происходит крайне медленно, что позволяет, в отличие от PA-GFP, визуализировать белок до фотоактивации и отслеживать перераспределение исходной формы, наряду с фотоактивированной.
Белок PS-CFP2 позволяет проводить эффективное прицельное фотомечение белков слияния и отслеживать их перераспределение в течение десятков минут и даже часов.
Примечание: В последующих работах других авторов было показано, что PS-CFP2 является эффективным инструментом для микроскопии сверхвысокого разрешения PALM, и составляет предпочтительную пару для двухцветной микроскопии PALM в паре с фотопереключаемыми белками, изменяющими цвет флуоресценции с зеленого на красный. Двухцветная флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения с использованием PS-CFP2 позволяет достичь разрешения, приближенного к необходимому для идентификации непосредственного взаимодействия двух белков (Shroff Н et al., PNAS 2007). Другой группой авторов было показано, что в трансгенных цыплятах, где фотоактивируемые белки могут использоваться для мечения и слежения за перемещением живых клеток, фотоактивированная форма PS-CFP2 может наблюдаться в течение нескольких суток, в отличие от всех прочих необратимо фотоактивируемых белков, сигнал которых, по тем или иным причинам, не детектируется уже через несколько часов после активации. Таким образом, белок PS-CFP2 может быть предпочтительным маркером для прицельного фотомечения живых клеток в трансгенных организмах.
3.2. Технология «белковых речек» на основе обратимо фотоактивируемых белков.
Преимуществом обратимо фотоактивируемых флуоресцентных белков является возможность многократной фотоактивации при работе с одной и той же живой клеткой, в различных её точках, на протяжении продолжительного времени, до и после интересующего внешнего воздействия. Для слежения за перераспределением белка слияния, обратимо фотоактивируемый белок можно активировать в определенной выбранной части клетки коротким локальным облучением, с использованием соответствующей линии лазера конфокального микроскопа. Для регистрации динамики быстрого перераспределения белка, последующие изображения должны быть получены максимально быстро, для чего в конфокальной микроскопии необходимо использовать высокую частоту сканирования и низкое разрешение. В то же время, для слежения за перераспределением белка, необходимо использовать низкую интенсивность возбуждающего света, ввиду того, что возбуждающий свет может привести к заметной дополнительной активации либо инактивации флуоресценции. В целом, в любой системе, время накопления сигнала и интенсивность возбуждающего света должны быть минимизированы. Таким образом, могут быть получены лишь относительно грубые изображения, описывающие быстрое перераспределение белка после локальной фотоактивации. Для решения этой проблемы, мы предложили использовать обратимо фотоактивируемые белки, позволяющие в течение короткого времени многократно повторить циклы фотоактивации и слежения за распределением белка из одной и той же точки. Полученные данные можно затем усреднить, что позволяет значительно повысить
разрешение получаемых изображений, описывающих распределение белка в течение первых миллисекунд после фотоактивации.
Для экспериментальной проверки работоспособности этого подхода, мы использовали белок а8РР595-А1480, способный к обратимой фотоактивации из нефлуоресцентной в яркую красную флуоресцентную форму при облучении интенсивным зеленым (530-570 нм) светом, и инактивации при облучении синим (оптимум при 450 нм) светом. Этот белок отличается высокой устойчивостью к обесцвечиванию, высоким «контрастом» фотоактивации, то есть, в данном случае, кратностью возрастания интенсивности флуоресцентного сигнала при фотоактивации, и достаточно низкой скоростью спонтанной релаксации до исходного нефлуоресцентного состояния (время полурелаксации около 1 минуты). Циклы фотоактивации/фотоинактивации могут быть повторены сотни раз без существенного влияния на свойства белка. Слежение за перераспределением белка проводили в живых клетках НеЬа. В параллельных экспериментах, использовался описанный выше необратимо фотоактивируемый белок Р8-СРР2. По сравнению с азРР595-А1480, Р8-СРР2 характеризуется в 3 раза более высокой расчетной яркостью активированного сигнала, и значительно более высоким контрастом фотоактивации.
В рамках одной серии изображений, полученных после одиночной фотоактивации, два белка позволили получить сходные по качеству изображения. Повторная фотоактивация Р5-СРР2 в той же точке вела к быстрому нарастанию фоновой зеленой флуоресценции и падению контраста фотоактивации вследствие необратимого характера фотопереключения. В то же время, азРР595-А148С можно было многократно активировать в одной и той же точке клетки, без заметного нарастания фонового сигнала и потери «контраста» фотоактивации. Это позволило получать сходные серии изображений, описывающих быструю динамику перераспределения белка. За счет усреднения полученных серий, удалось значительно поднять разрешение изображений (рис. 14).
РЭ-СРР2
аэРР595-А148С
а5РР595-А148в усреднение "речка"
Рисунок 14. Слежение за перераспределением необратимо фотоактивируемого белка РЭ-СРР2 и обратимо фотоактивируемого белка а5рР595-А148С из точки активации в цитозоле клеток НеЬа. Изображения получены с интервалом в 144 мс. Показаны изображения с интервалом в 720 мс. Показано время после фотоактивации, в секундах. Масштабная линейка, 10 мкм.
На практике, эта технология, получившая название «protein rivers» (белковые реки), может быть использована в различных экспериментальных системах, в которых требуется получить детализированную картину перераспределения белка из интересующей точки живой клетки. Кроме того, усреднение позволяет значительно снизить погрешность измерения и достоверно идентифицировать даже незначительные изменения в динамике перераспределения белка в живой клетке. В качестве примера, мы применили эту технологию для слежения за подвижностью белка Bid, вовлеченного в различные пути апоптоза. Бьшо показано, что при активации апоптоза, вызванной добавлением в среду стауроспорина, динамика перераспределения белка Bid в цитозоле замедляется, что указывает на формирование белковых комплексов, предположительно с белком Вах и другими белками семейства Вс1-2.
3.3. Красные мономерные и «супермономерные» обратимо фотоактивируемые белки
Описанный выше белок asFP595-A148G имеет тетрамерную природу и практически непригоден для работы в составе белков слияния. Мы задались целью получить аналогичный обратимо фотоактивируемый красный флуоресцентный белок на основе мономерного белка TagRFP (раздел 1.1.). Отталкиваясь от предыдущего опыта разработки фотоактивируемых флуоресцентных белков на основе тетрамерных вариантов GFP-подобных белков, мы провели мутагенез TagRFP по положениям 148 и 165, которые в значительной степени определяют возможность фотоиндуцируемой цис-транс-изомеризации хромофора. Мы использовали метод вырожденного мутагенеза (20 вариантов аминокислотных остатков в каждой позиции). Таким образом, полученная экспрессионная библиотека содержала 400 мутантных вариантов белка TagRFP с различным сочетанием аминокислотных остатков в положениях 148 и 165. Поиск фотоактивируемых вариантов проводился с использованием флуоресцентного стереомикроскопа, а также прямого широкопольного флуоресцентного микроскопа, позволяющего использовать полевую диафрагму для концентрированного облучения небольшого участка выбранной области колонии Е. coli светом определенной длины волны. Визуальный поиск среди 5 ООО колоний этой библиотеки выявил наличие красных флуоресцентных белков различной яркости, однако вариантов с выраженными свойствами фотоактивации обнаружено не бьшо. Основываясь на данных о трехмерной структуре близкого белка mKate (раздел 1.2.), мы предположили, что некоторые объемные аминокислотные остатки в окружении хромофора TagRFP, в частности Arg69 и Phel81, могут препятствовать цис-транс изомеризации хромофора, необходимой для проявления свойств фотоконверсии. Для преодоления этой проблемы мы обратились к белку-предшественнику TagRFP, с рабочим названием NRM14, который характеризуется несколько меньшей яркостью и скоростью созревания чем белок TagRFP. В позициях 69 и 181 в окружении хромофора, NRM14 содержит менее объемные остатки Lys69 и Leul81, аналогично природному тетрамерному фотоактивируемому белку asFP595. Действительно, поиск фотоактивируемых вариантов в библиотеке, полученной методом вырожденного мутагенеза NRM14 по положениям 148 и 165, выявил два мутантных варианта, обладающих способностью к обратимой фотоконверсии. В частности, мутантный белок, названный KFP-HC, содержал замены N148H и S165C и проявлял следующие свойства: исходная красная флуоресценция падала в 10 раз под воздействием зеленого света (530-560 нм) и была способна к восстановлению до исходного уровня при облучении синим светом (450-490 нм) или после инкубации в темноте в течение минут. При фотоинактивации происходят изменения формы спектров и положения пиков возбуждения и эмиссии, в целом характерные для цис-транс изомеризации хромофора. В «потушенном» состоянии основной пик возбуждения немного сдвигается в синюю область (максимум при 575 нм), а также появляется новый пик при 480 нм. Последний, по всей вероятности, соответствует протонированному состоянию хромофора и определяет возможность
быстрого восстановления «потушенного» белка KFP-HC облучением синим светом. KFP-НС проявляет способность к обратимой фотоконверсии и при экспрессии в клетках млекопитающих.
Однако, относительно низкая яркость флуоресцентного сигнала KFP-HC, а также достигнутые в этот период работы успехи по получению «супермономерного» красного флуоресцентного белка (раздел 1.З.), заставили нас подумать о получении аналогичного варианта с улучшенными характеристиками на основе близкого (высокогомологичного) белка FusionRed. Сравнение аминокислотных остатков в окружении хромофоров для белков KFP-HC и FusionRed выявило различия лишь по 3 ключевым позициям: K69R, H148S, и А179С (указаны аминокислотные остатки в KFP-HC и FusionRed, соответственно). Был проведен сайт-направленный мутагенез FusionRed с различным набором мутаций по этим позициям, в том числе: S148H; S148H/R69K; S148H/R69K/C179A. Анализ полученных мутантных вариантов показал, что FusionRed-S148H характеризуется низкой интенсивностью флуоресценции и достаточно быстро (< 1 мин) обесцвечивается под воздействием зеленого света (530-560 нм) как в широкопольном микроскопе (объектив 40 х, 100 Вт ртутная лампа), так и во флуоресцентном стереомикроскопе при низкой интенсивности света. Флуоресценция восстанавливалась в синем свете за несколько минут либо в темноте в течение 10-15 минут.
В то же время, яркость флуоресценции колоний Е. coli, экспрессирующих варианты FusionRed-148H,69K (далее mKateKFPl) и FusionRed-148Н,69К,179А (далее mKateKFP2) была заметно выше, чем яркость колоний, экспрессирующих FusionRed-S148H или KFP-HC. Интенсивность флуоресценции быстро (в течение десятков секунд) снижалась при облучении зеленым светом (530-560 нм) и восстанавливалась при облучении синим светом (450-490 нм) или за несколько минут в темноте. Для FusionRed при тех же условиях эффектов обратимой фотоактивации или фотообесцвечивания не наблюдалось. Таким образом, введения замен S148H и R69K оказалось достаточным для переноса способности к обратимой фотоконверсии на белок FusionRed, при сохранении приемлемой яркости флуоресценции. Более подробно фотоактивационные свойства белков mKateKFPl и mKateKFP2 были изучены для очищенных белков, иммобилизованных на металлоаффинной смоле Talon, с помощью широкопольного флуоресцентного микроскопа.
о .............................................
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
___ _t, с
Рисунок 15. Обратимая фотоконверсия белков тКа(еКРР1 на металлоаффинной смоле. Показано 100 циклов фотоинактивации/фотоактивации: 3 с облучения зеленым светом (530-560 нм), 3.5 с облучения синим светом (450-490 нм). Нижний ряд точек - потушенная флуоресценция, верхний ряд точек - восстановленная флуоресценция. Интенсивность облучения около 3 Вт/см2.
При наблюдении иммобилизованных белков под флуоресцентным микроскопом интенсивность флуоресценции быстро падала, поскольку возбуждающий зеленый свет
вызывал обратимое гашение флуоресценции белков. После кратковременного облучения синим светом, происходило восстановление красного сигнала. Путем варьирования продолжительности и интенсивности облучения зеленым и синим светом нам удалось подобрать условия для проведения многократных циклов тушения/активации белков (рис. 15). Интересно, что в ходе первых циклов тушения/активации возрастает как амплитуда изменений, так и максимальная яркость флуоресцентного сигнала. При интенсивности облучения около 3 Вт/см2 необратимое фотообесцвечивание белков и, соответственно, затухание циклов фотоконверсии происходят с большей скоростью, чем при низких интенсивностях света (измерения также проводились при 340 мВт/см2). Однако, при высокой интенсивности света фотопереключение обоих белков происходит в несколько раз быстрее. Максимум возбуждения флуоресценции для активированной формы mKateKFPl приходится на 572 нм, максимум эмиссии на 613 нм. Максимум эмиссии после тушения флуоресценции смещается до 602 нм. Максимум возбуждения флуоресценции для активированной формы mKateKFP2 составляет 580 нм, максимум эмиссии 605 нм. После тушения флуоресценции максимум эмиссии смещается до 603 нм.
В целом, белки mKateKFPl и mKateKFPl близки к белку KFP-HC по параметрам тушения и восстановления флуоресценции. Однако, mKateKFPl и mKateKFPl не содержат замен во внешней части бета-бочонка относительно FusionRed, и следовательно, наследуют его «супермономерные» свойства (раздел 1.З.), что делает их оптимальными фотоактивируемыми вараинтами для использования в составе белков слияния. Кроме того, mKateKFPl и mKateKFPl превосходят KFP-HC по яркости флуоресцентного сигнала и контрасту между активированной и потушенной формами, который достигает 30 раз для mKateKFPl и 20 раз для mKateKFP2. Эти высококонтрастные обратимо фотоактивируемые красные «супермономерные» флуоресцентные белки могут быть использованы как для локального оптического мечения белков слияния, так и для микроскопии сверхвысокого разрешения с использованием технологии PALM (показано совместно с др. Г. Шрофф, США).
3.4. Новый тип необратимой фотоконверсии зеленых флуоресцентных белков
Ещё в 1997 году было показано, что белок avGFP A. victoria и его мутантные варианты в анаэробных условиях способны к фотоконверсии в красную флуоресцентную форму. Механизм этого явления до сих пор остаётся необъясненным, но можно предполагать, что в его основе лежит фотовосстановление avGFP, по аналогии с фотоконверсией хлорофиллов в анаэробных условиях. Исследуя этот феномен, мы обнаружили, что в присутствии окислителей многие зеленые флуоресцентные белки способны к фотоиндуцируемому переключению в красную флуоресцентную форму и в присутствии кислорода. Оказалось, что облучение синим светом (например, линия лазера 488 нм) белка EGFP иммобилизованного на частицах металлоаффинной смолы, в присутствии различных электронных акцепторов (окислителей), приводит к эффективной фотоконверсии EGFP в красную флуоресцентную форму. Подобная окислительная фотоконверсия наблюдалась в присутствии красной кровяной соли (феррицианида калия, Кз[Те(СМ)б]), бензохинона и МТТ (бромида 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил тетразолия). При проведении эксперимента в присутствии МТТ на облучаемых участках наблюдалось образование характерного синего осадка восстановленного формазана, что указывает на прохождение окислительно-восстановительной реакции. В отличие от известной анаэробной фотоконверсии, не была выявлена какая-либо зависимость фотоактивации от наличия кислорода.
Для определения спектральных характеристик красной флуоресцентной формы EGFP мы провели фотоконверсию белка в водном растворе в присутствии красной кровяной соли,
облучая кювету с раствором с помощью мощных светодиодов (490 нм, 0.1 Вт/см2). После 8 минут облучения спектрофлуориметр детектировал красную флуоресценцию, характеризующуюся максимумом возбуждения при 575 нм и максимумом эмиссии при 607 нм, в отличие от красной флуоресцентной формы, образующейся при фотоконверсии avGFP в анаэробных условиях, для которой характерны пики возбуждения и эмиссии флуоресценции при 525 и 600 нм, соответственно. Квантовый выход флуоресценции составил около 0.05. Эффективность окислительной фотоконверсии линейно возрастает с увеличением интенсивности облучения. Таким образом, можно предположить, что фотоконверсия является однофотонным процессом. Образующаяся в результате фотоконверсии красная флуоресцентная форма достаточно стабильна. Так, при низких концентрациях окислителя (например, в присутствии 1 мкМ бензохинона) интенсивность красного флуоресцентного сигнала не уменьшается в течение по меньшей мере одного часа.
Дальнейшие эксперименты показали, что эндогенные внутриклеточные окислители также могут способствовать фотоконверсии EGFP. Так, процесс протекает в присутствии цитохрома с (cyt с) - гем-содержащего растворимого белка, одноэлектронного акцептора, вовлечённого в электрон-транспортную дыхательную цепь практически всех организмов. Сравнение спектров поглощения раствора, содержащего EGFP и cyt с, измеренных до и после облучения, показало сопряжённое с фотоконверсией EGFP превращение окисленной формы цитохрома (широкий пик поглощения с максимумом при 530 нм) в восстановленную (характерные узкие пики с максимумами при 520 и 550 нм). При этом контрольный образец цитохрома, облучённый в растворе, не содержащем EGFP, остался спектрально неизменным. Исходя из степени уменьшения пика поглощения EGFP при 488 нм, степени увеличения пика поглощения cyt с на 550 нм, и молярных коэффициентов экстинкции обоих белков при указанных длинах волн (55 000 и 19 000 М"'см"', соответственно), мы рассчитали выход данной окислительно-восстановительной реакции. Он составил около 1.7, что свидетельствует о высокой эффективности реакции и том, что окисление EGFP - это скорее всего двухэлектронный процесс, в результате которого может образовываться до 2-х молекул восстановленного цитохрома на одну молекулу EGFP.
Зеленые флуоресцентные белки различного происхождения, в том числе AcGFPl, TagGFP, zFP506, amFP486 и ppluGFP2 оказались способными к аналогичной фотоконверсии. В то же время, мутантные варианты GFP, несущие аминокислотные замены непосредствееннно в структуре хромофора - циановый флуоресцентный белок ECFP (замена Y66W), и синий флуоресцентный белок EBFP (замена Y66H), не проявляли характерных признаков окислительной фотоконверсии: присутствие акцепторов электронов не приводило к ускорению фотообесцвечивания, и при фотообесцвечивании не наблюдалось образования новых спектральных форм. Таким образом, можно предположить, что структура тирозин-содержащего хромофора «дикого типа» имеет определяющее значение для способности к фотоконверсии. Дальнейшие эксперименты показали, что фотоконверсия EGFP в красную форму может проходить в живых эукариотических клетках, таких как НЕК293, HeLa и ЗТЗ, в нормальных аэробных условиях, причем эффективность этого процесса различается для разных клеточных линий. Интересно, что эффективность процесса существенно различалась и для индивидуальных клеток, но при этом была примерно равной для дочерних клеток, образовавшихся в результате деления. Более того, эксперименты на эмбрионах рыбы D. rerío, экспрессирующих EGFP под контролем инсулинового промотора в ß-клетках поджелудочной железы (линия рыб предоставлена проф. Д. Онищук, Германия), а также на живых срезах мозга мыши, экспрессирующей EGFP под контролем ß-актинового промотора во всех клетках организма (мыши предоставлены проф. А. Терских, США), показали, что данный тип фотоконверсии может эффективно проходить в тканях трансгенных животных.
Обнаруженный эффект окислительной фотоконверсии зеленых флуоресцентных белков имеет перспективу использования в целом ряде практических приложений. В частности, относительная эффективность окислительной фотоконверсии может служить индикатором окислительно-восстановительного статуса клеток и клеточных органелл. Окислительная фотоконверсия зеленых флуоресцентных белков может быть использована для светоиндуцируемого воздействия на окислительно-восстановительные процессы в живой клетке, детекции белок-белковых взаимодействий (посредством определения близости электронного акцептора, химерно слитого с потенциальным белком-партнером), а также для микроскопии сверхвысокого разрешения.
3.5. Методика повышения фотостабильности зеленых флуоресцентных белков при визуализации в живых клетках.
Фотостабильность является одним из ключевых характеристик флуоресцентных белков, как маркёров для различных применений во флуоресцентной микроскопии, в значительной степени определяющим соотношение сигнал/шум, качество изображения и возможность проведения длительных экспериментов и количественных измерений. Описанный выше эффект окислительной фотоконверсии зеленых флуоресцентных белков позволил предложить эффективный способ повышения их фотосгабильности при визуализации в живых клетках. Так как присутствие окислителей повышало эффективность фотоконверсии, сопряженную с уменьшением зелёной флуоресценции, мы предположили, что, светоиндуцируемый перенос электронов в значительной степени ответственен за фотообесцвечивание. В таком случае, удаление компонентов, способных играть роль электрон-акцепторов, должно приводить к замедлению фотообесцвечивания зелёных флуоресцентных белков.
Действительно, сравнительные эксперименты показали, что использование для культивирования среды DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), не содержащей рибофлавина, либо среды DMEM, из которой были исключены все витамины, позволяет увеличить фотостабильность зеленых флуоресцентных белков до 5 и 9 раз, соответственно, по сравнению со стандартной средой DMEM (линия клеток НЕК293Т, широкопольная флуоресцентная микроскопия, объектив 63х, интенсивность облучения около 1 Вт/см2). Этот эффект выражено проявлялся и для белков слияния с зелеными флуоресцентными белками, а также для активированных форм фотоактивируемых флуоресцентных белков PA-GFP и PS-CFP2 (Таблица 3). Другие компоненты, используемые в средах для культивирования, такие как антибиотики пенициллин и стрептомицин, зародышёвая сыворотка, L-глутамин, не оказывали существенного влияния на фотостабильность зеленых флуоресцентных белков.
Таблица 3. Увеличение фотостабильности флуоресцентных белков при изменении состава среды.
Увеличение времени полуобесцвечивания
Флуоресцентный белок по сравнению с DMEM, раз
среда без рибофлавина среда без витаминов
TagGFP2 2.0 3.3
AcGFPl 1.7 2.1
EGFP 5.1 9.3
EGFP-актин 3.5 5.9
EGFP-тубулин 4.4 6.4
mitoEGFP 1.4 1.4
PA-GFP (активированный) 1.3 4.5
PS-CFP2 (активированный) 3.0 4.3
В то же время, продолжительное культивирование клеток в обедненных средах для культивирования не приводило к нарушению их морфологии, способности к делению, прикреплению и подвижности. Таким образом, можно заключить, что среды без витаминов и, в частности, среда без рибофлавина могут успешно применяться для экспериментов, связанных с флуоресцентной визуализацией живых клеток, длительностью до нескольких суток.
4. Генетически кодируемые сенсоры на основе флуоресцентных белков.
Генетически кодируемые сенсоры - один из самых сложных типов инструментов, которые могут быть получены на основе флуоресцентных белков. С одной стороны, разнообразие и высокая специфичность природных белковых доменов, способных изменять конформацию при связывании определенного иона или под воздействием той или иной модификации, предоставляет широкий выбор для конструирования сенсоров различной специфичности. С другой стороны, достаточно сложной задачей является преобразование этих конформационных изменений в выраженный ответ сенсора, заключающийся в детектируемых изменениях спектральных характеристик флуоресцентного белка. В настоящей работе нашей задачей являлось получение сенсоров двух основных типов - на основе пермутированных флуоресцентных белков и на основе FRET-nap флуоресцентных белков, характеризуемых максимально выраженным изменением флуоресцентных свойств при ответе на детектируемый ион или активность.
4.1. Сенсоры ионов кальция на основе пермутированных флуоресцентных белков.
Метод кольцевой пермутации (circular permutation), при котором на уровне гена нативные N- и С- концы белка соединяют с помощью пептидного линкера, с образованием новых N- и С-концов в другой части молекулы, позволяет расположить детекторные белковые домены в непосредственной близости от хромофора. Благодаря этому, происходящие в детекторных доменах конформационные изменения могут оказывать существенное влияние на флуоресцентные свойства сенсора.
Для создания кальциевых сенсоров мы использовали подход, основанный на присоединении к С- и N-концам варианта флуоресцентного белка, пермутированного по позициям 147-146, кальмодулина (СаМ) и его пептида-мишени М13 (фрагмент легкой цепи киназы миозина), соответственно (рис. 16а). При связывании ионов кальция, СаМ претерпевает глубокие конформационные перестройки, что обусловливает его взаимодействие с М13 в составе химерного конструкта. В свою очередь, это вызывает конформационные изменения аминокислотного окружения хромофора и может повлиять на соотношение его нейтральной (протонированной) и заряженной (депротонированной) форм, а также на квантовый выход флуоресценции и коэффициент молярной экстинкции, что, в конечном итоге, выражается в изменении флуоресцентных свойств сенсора. Такой подход к созданию генетически кодируемых кальциевых сенсоров уже применялся ранее при создании сенсоров GCaMP и Pericam, и может называться классическим. Для нас представляла интерес возможность произвести тонкую настройку окружения хромофора, с целью повышения «контраста» срабатывания сенсора, то есть выраженности изменений в яркости флуоресцентного сигнала в ответ на связывание ионов кальция.
На тот момент ещё не было получено данных о трехмерной структуре кальциевых сенсоров на основе пермутированных флуоресцентных белков, таких как GCaMP и Pericam. Основываясь на данных о структуре непермутированного avGFP (PDB ID:1 GFL), мы предположили, что в кальциевых сенсорах данного типа, в которых «разрыв» при
пермутации проводили в районе 146 положения, аминокислотные остатки 145 и 148 сохраняют контакт с хромофором, в то время как соседние аминокислотные остатки, один из которых предшествует позиции 148, а другой следует за позицией 145, оказываются «выходящими» из бета-бочонка и через короткие линкерные участки ведут к доменам М13 и кальмодулина, соответственно.
Действительно, сравнение аминокислотных последовательностей опубликованных ранее кальциевых сенсоров на основе пермутированных флуоресцентных белков указывало, что аминокислотные остатки в позициях 145, 148 и 203 оказывают существенное влияние на их свойства. В надежде подобрать оптимальный вариант окружения хромофора, обеспечивающий максимальную яркость флуоресцентного сигнала и высокий «контраст» срабатывания сенсора, мы сконструировали ряд вариантов кальциевых сенсоров. В частности, было получено 9 вариантов, в которых пермутированный зеленый флуоресцентный белок содержал различные комбинации аминокислотных остатков по положениям 145 (Ser, Ala, Thr) и 148 (Asp, Glu, Asn), в то время как положение 203 занимал Phe. Полученные варианты характеризовались различными ответами на добавление ионов кальция. Так, варианты сенсора, несущие в 148 положении Asn, отвечали лишь незначительным изменением флуоресцентного сигнала. Варианты сенсора, содержащие в 148 положении Glu или Asp, характеризовались единственным пиком возбуждения (максимум при 490 им) и эмиссии флуоресценции (максимум при 515-520 нм), и отвечали на присутствие ионов кальция выраженным увеличением относительной яркости флуоресцентного сигнала, без существенных изменений в форме спектра. Для вариантов, содержащих Glul48, увеличение яркости флуоресцентного сигнала составило до 14.5 раз.
Таким образом, нам удалось добиться изменений флуоресцентного сигнала, рекордных как для кальциевых сенсоров, так и в целом для генетически кодируемых сенсоров на основе флуоресцентных белков. Тем не менее, полученные варианты были малопригодны для реальной работы с клетками млекопитающих, так как характеризовались низкой скоростью созревания хромофора при 37°С и недостаточной яркостью флуоресцентного сигнала. Для ускорения созревания, пермутированный флуоресцентный белок в составе сенсора Thrl45/Glul48 оптимизировали с использованием метода случайного мутагенеза. Среди полученных мутантных вариантов сенсора был отобран наиболее яркий и быстро созревающий, получивший название Case 12 (от Calcium sensor), характеризующийся in vitro 12-кратным возрастанием эмиссии флуоресценции в ответ на добавление 10-1000 мкМ ионов кальция (рис. 16Ъ). С целью получения варианта, аналогичного исходному Serl45/Glul48, методом сайт-направленного мутагенеза в Casel2 была внесена замена Thrl45Ser. Результирующий мутантный вариант, названный Caselô, характеризуется меньшей скоростью созревания хромофора и несколько меньшей яркостью, однако реагирует на добавление ионов кальция даже более выраженным, 16-кратным возрастанием яркости флуоресцентного сигнала.
Сенсоры Casel2 и Caselô были затем более детально протестированы in vitro и в живых клетках. Изменения в спектрах поглощения Case 12 и Caselô в ответ на добавление ионов кальция отражают перераспределение между нейтральной (протонированной) и заряженной (депротонированной) формами хромофора в пользу последней. Расчетная яркость флуоресценции Casel2 и Casel6 в присутствии ионов кальция составляет 0.35 и 0.28 от расчетной яркости белка EGFP, соответственно, что сопоставимо с расчетной яркостью сенсора GCaMP2, характеризующегося значительно менее выраженным флуоресцентным ответом. Сенсоры Casel2 и Caselô реагируют выраженным возрастанием яркости флуоресцентного сигнала на добавление ионов кальция в диапазоне от нескольких сотен нМ до 10 мкМ. Таким образом, динамический диапазон измеряемых концентраций соответствует основному интересующему исследователей диапазону физиологических
концентраций ионов кальция в цитозоле. Флуоресцентный ответ достигает половины своего максимального значения при концентрации ионов кальция около 1 мкМ (рис. 16с).
Общим недостатком, характерным для сенсоров на основе пермутированных флуоресцентных белков, является высокая зависимость флуоресцентного сигнала от изменения значения рН. Так, для кальциевых сенсоров ряда Репсатэ кажущееся значение рК„ в кальций-связанной форме варьирует от 7.9 до 8.5. Соответственно, при физиологических значениях рН (7.4 - 7.5) эти сенсоры демонстрируют достаточно низкую яркость флуоресценции, и высокую зависимость от небольших колебаний значения рН. Кажущееся значение рКа для сенсоров СаэеИ и Сазе16 в присутствии 200 мкМ кальция составляет 7.2 (рис. 16с1). Таким образом, флуоресценция полученных нами сенсоров также в значительной степени зависит от изменения значения рН, однако отличается относительно более высокой устойчивостью по сравнению с аналогами.
Ь
8- 20 I о
400 500
Длина волны (нм)
400 500
Длина волны (ни)
г 140
г 120
100
3 80
ч 60
40
£ 20
в 0
| EQTA
50 -40 30 20 10 -
О 50 100 150 200 250 о 100 200 300 400
Время (с) Время (с)
Рисунок 16. Характеристика сенсора Casel2 in vitro и в живых клетках, а. Принцип доменной организации кальциевого сенсора Casel2 и близких сенсоров на основе пермутированного флуоресцентного белка. Ь. Максимальный флуоресцентный ответ Casel2 in vitro. Показаны спектры возбуждения и эмиссии флуоресценции в присутствии 0.5 мМ EGTA и 1 мМ Са24, при рН 7.4. с. Кривые титрования флуоресцентного ответа Casel2 на Са2+ при рН 7.4. d. Зависимость флуоресценции Casel2 от рН в присутствии 0.5 мМ EGTA и 0.2 мМ Са2*. е. Спектры поглощения Casel2 в присутствии 0.5 мМ EGTA (пунктирные линии) и 0.4 мМ Са2+ (сплошные линии) при рН 7.4. f. Характерный флуоресцентный ответ сенсора Casel2 в клетках HeLa при добавлении кальциевого ионофора А23187 в присутствии 2 мМ Са2+, с последующим хелатированием Са2+. g. Флуоресцентный ответ сенсора Case 12 в клетках М21 (клеток меланомы человека) на добавление 100 цМ АТР.
При экспрессии сенсора Case 12 в клетках HeLa, наблюдается зеленая флуоресценция низкой интенсивности. При добавлении в среду 20-30 мкМ ионофора А23187, позволяющего ионам кальция свободно проходить в цитозоль живых клеток (концентрация кальция в стандартной среде 2 мМ), наблюдается 5-кратное возрастание интенсивности флуоресценции. Последующее добавление 20 мМ EGTA, хелатирующего ионы кальция, вызывает 10-12 кратное падение яркости флуоресцентного сигнала (Рис. 16f). Сходные результаты были получены для сенсора Case 16. Для сравнения, аналогичный сенсор GCaMP2 демонстрировал лишь 2-кратное возрастание яркости флуоресцентного сигнала при добавлении ионофора А23187, и 4-кратное падение сигнала при добавлении 20 мМ EGTA. Case 12 позволяет отслеживать изменения в концентрации ионов кальция в живых клетках в ответ на различные стимулы. В частности, мы показали, что Case 12 позволяет надежно визуализировать характерные осцилляции концентрации ионов кальция в цитозоле, индуцируемые добавлением 100 мкМ АТФ (Рис. 16g). При экспрессии в кортикальных нейронах (совместно с Лабораторией мембранологии НЦЗД РАМН), Case 12 позволял отслеживать изменения в концентрации ионов кальция в ответ на стимуляцию глутаматом (100 мкМ), и последующее добавление протонофора FCCP (1 мкМ) наравне с широко используемым химическим сенсором Fura-2FF. Для слежения за локальными изменениями в концентрации ионов кальция в клетках, мы получили два варианта сенсора Case 12: мембранно локализованный, содержащий на N-конце белка сигнал мембранной локализации нейромодулина, и вариант, таргетированный в матрикс митохондрий, содержащий на N-конце белка удвоенный сигнал митохондриальной локализации из VIII субъединицы предшественника цитохромоксидазы С. При экспрессии в клетках HeLa оба варианта сенсора избирательно локализовались в соответствующих компартментах - на внутренней стороне плазматической мембраны или матриксе митохондрий, соответственно, и сохраняли функциональность.
В совместной работе с лабораторией проф. С. Каспарова (Великобритания) сенсор Case 12 был использован для исследования действия фрагмента ангиотензина (Angl-7, 200-1000 нМ) на ростральную часть продолговатого мозга крысы. С использованием технологии аденовирусной трансфекции и тканеспецифичной экспрессии было показано, что в ответ на Angl-7 в астроцитах происходят колебания концентрации кальция различной амплитуды и продолжительности, в то время как активации нейрональных клеток не наблюдалось (рис. 17). Позднее проф. С. Каспарову удалось успешно применить эту технологию для слежения за рН-индуцируемыми всплесками кальция в астроцитах стволовой области мозга в модельных животных in vivo (Gonrine et al., Science 2010). abc
250
Alf ЮОиЫ
Рисунок 17. Флуоресцентный ответ сенсора Сазе12 при специфической экспрессии в астроцитах крысы. Показан участок органотипического среза мозга. При добавлении 100 мМ АТФ Са$е12 реагировал выраженным увеличением интенсивности флуоресцентного сигнала, а. Исходная флуоресценция. Ь. 3 мин. после добавления АТФ. с. Изменения флуоресцентного сигнала, прослеженные для отдельных астроцитов. Увеличение яркости флуоресценции Сазе12 для отдельных клеток превысило 300%.
В совместном исследовании с др. М. Lorenz (Novartis), методом рентгеноструктурного анализа была впервые была решена структура GCaMP-подобного кальциевого сенсора (Case 16) в присутствии низкой концентрации Са2+, при которой два из четырех Са-связывающих участков кальмодулина заняты ионами кальция. В то время как С-концевая пара кальций-связывающих участков характеризуется высокой аффинностью к ионам кальция (заполнены при концентрациях ниже 500 нМ), N-концевая пара заполняется при более высоких концентрациях ионов кальция (выше 500 нМ). По всей вероятности, начальная фаза кальций-зависимого флуоресцентного ответа сенсоров на основе кальмодулина, в диапазоне 100-500 нМ, определяется именно конформационными изменениями, вызванными заполнением первых двух кальций-связывающих участков. Полученные структурные данные показали, что в этой промежуточной конформации сенсор характеризуется лишь частичным взаимодействием кальмодулина с пептидом М13 (рис. 18а). Кроме того, существенно, что окружение хромофора в этой промежуточной форме сенсора значительно отличается от такового для гомологичного кальциевого сенсора GCaMP2 в Са2+-насыщенной форме, структура которого была описана ранее. Эти данные вносят существенный вклад в понимание механизмов действия кальциевых сенсоров на основе пермутированных вариантов флуоресцентных белков и открывают новые возможности для получения улучшенных версий кальций-чувствительных индикаторов. Также была решена трехмерная структура кальциевого сенсора Case 12 при высокой концентрации ионов кальция, которая подтвердила данные предыдущей работы других авторов, согласно которым при высоких концентрациях сенсора формируются гомодимеры, в составе которых домен кальмодулина каждой молекулы сенсора симметрично взаимодействует с М13-пептидом другой молекулы (рис. 18Ь). Сопоставление данных о димеризации и флуоресцентном ответе кальциевых сенсоров данного типа in vitro показало, что при формировании гомодимеров флуоресцентный ответ на связывание ионов кальция отсутствует. Таким образом, формирование гомодимеров может быть причиной нарушения функциональности сенсоров при высоких локальных концентрациях.
Рисунок 18. Полученные структуры кальциевых сенсоров, а. Структура сенсора Сазе16, полученная при низкой концентрации ионов кальция. Пептид М13 показан синим, пермутированный флуоресцентный белок - зеленым, 14- и С-концевые участки кальмодулина - красным, 2 иона Са2* -желтым цветом. В составе сенсора, только С-концевой Са2+-связанный участок кальмодулина взаимодействует с пептидом М13. Ь. Структура сенсора Сазе12, полученная при высокой концентрации ионов кальция. Две молекулы сенсора (показаны синим и красным цветом) формируют межмолекулярный комплекс, в котором пептид М13 каждой цепи взаимодействует с кальмодулином второй цепи.
В этой работе мы также показали, что высокие концентрации свободного пептида М13, но не кальмодулина, эффективно блокируют флуоресцентный ответ сенсоров Case 12 и Case 16 in vitro. Мы предполагаем, что подобные межмолекулярные взаимодействия с эндогенными субстратами кальмодулина в живых клетках могут препятствовать функциональной работе сенсоров этого типа в определенных типах клеток, в частности, в нейрональных клетках.
4.2. Высококонтрастные сенсоры на основе FRET-nap флуоресцентных белков
Генетически кодируемые сенсоры с использованием эффекта FRET между двумя спектральными вариантами флуоресцентных белков активно используются в различных исследованиях на живых клетках и in vivo. В большинстве случаев, регистрируемыми параметрами при работе с FRET-сенсорами являются интенсивности флуоресценции донорного и акцепторного флуоресцентных белков при возбуждении донора. В значительной степени, ограничения метода связаны с относительно небольшими и зачастую трудно регистрируемыми изменениями в соотношении яркости флуоресценции донора и акцептора при их сближении и удалении, а также с эффективным спектральным разделением спектров эмиссии донора и акцептора FRET. Следует отметить также, что существенное влияние на эффективность FRET оказывают возможные взаимодействия между донором и акцептором энергии в составе молекулы сенсора. Вследствие этого, выбор оптимальной FRET-пары флуоресцентных белков из множества существующих вариантов, наряду с собственно дизайном конструкции, имеет важнейшее значение для разработки эффективных генетически кодируемых сенсоров. Наша работа была направлена на разработку модельных «высококонтрастных» сенсоров, FRET-пары флуоресцентных белков которых могли бы впоследствии использоваться для получения эффективных сенсоров различной специфичности.
FRET-пара PS-CFP2/phiYFP. Описанный выше (раздел 3.1.) фотоактивируемый белок PS-CFP2 требует для активации облучения фиолетовым светом высокой интенсивности, как правило - локального облучения в клетке лазером 405 нм. При умеренных интенсивностях возбуждающего света фотоактивации не происходит, и этот белок может быть использован в качестве стабильного цианового флуоресцентного маркера. Положение максимумов возбуждения и эмиссии флуоресценции (400 и 468 нм, соответственно) делает PS-CFP2 предпочтительным донором энергии для желтых флуоресцентных белков, обеспечивая одновременно высокую эффективность FRET (за счет большой области перекрывания спектров эмиссии цианового и возбуждения желтого флуоресцентных белков) и надежное разделение возбуждения и эмиссии флуоресценции. Расчетное значение радиуса Фёрстера для пары PS-CFP2/phiYFP превышает 6 нм, что говорит о потенциально высокой эффективности переноса энергии. В качестве модельного сенсора на основе этой пары, нами был сконструирован сенсор протеолитической активности, в котором пара PS-CFP/phiYFP была разделена 16-а.о. линкером, содержащим сайт узнавания фактором свертывания крови Ха. При возбуждении на 400 нм неразрезанный конструкт PS-CFP-Xa-phiYFP характеризовался преимущественно желтой эмиссией флуоресценции, которая снижалась по мере разрезания линкерной последовательности фактором Ха in vitro. Полное разрезание конструкта PS-CFP-Xa-phiYFP приводило к выраженному (до 7.8 раза) падению интенсивности желтой флуоресценции, и лишь небольшому возрастанию яркости циановой флуоресценции (1.15 раза). Для практического применения важно, что выраженность спектральных изменений в диапазоне 525-550 нм позволяет проводить измерения для FRET-пары PS-CFP/phiYFP в одном канале эмиссии. В сотрудничестве с лабораторией Биокатализа ИБХ РАН, на основе FRET пары PS-CFP2/phiYFP был получен и успешно применен в работе сенсор протеазной активности летального фактора сибирской язвы.
FRET-пара TagGFP/TagRFP. Мы провели сравнительный теоретический и экспериментальный анализ ряда пар флуоресцентных белков из палитры Tag (раздел 1), на предмет выявления оптимальных FRET-nap, которые могли бы быть использованы для детекции белок-белковых взаимодействий и при разработке генетически кодируемых сенсоров. Наибольший потенциал показали белок TagRFP, как эффективный акцептор энергии в паре с зелеными флуоресцентными белками, такими как TagGFP, и белок mKate2, как эффективный акцептор энергии в паре с желтыми флуоресцентными белками, такими как TagYFP. Расчетный радиус Фёрстера для пары TagGFP/TagRFP составляет 5.71 нм, что говорит о потенциально высокой эффективности резонансного переноса энергии. В то же время, максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции двух этих белков дистанцированы на 73 и 79 нм, соответственно, что позволяет надежно разделять их сигналы при регистрации.
В качестве модельного FRET сенсора для исследуемых пар белков, в том числе для пары TagGFP/TagRFP, мы получили конструкты, в которых флуоресцентные белки соединены посредством 17 а.о. линкера, содержащего сайт DEVD, узнаваемый каспазой 3. Подобные сенсоры позволяют отслеживать активность каспазы 3 в живых клетках, возникающую при апоптозе. Сенсор на основе пары TagGFP/TagRFP получил название CaspeR3-GR (репортер активности каспазы 3). Соотношение яркости флуоресценции эмиссии донора и акцептора (при возбуждении на 490 нм) после специфичного протеолиза CaspeR3-GR каспазой-3 in vitro изменяется в 4.9 раза. Достаточно выраженный (до 3.8 раз) ответ CaspeR3-GR демонстрирует и в живых клетках, при индукции апоптоза стауроспорином -неселективным ингибитором внутриклеточных протеинкиназ. Позднее на основе этой FRET пары мы также получили специфичные высококонтрастные сенсоры протеазной активности гранзима В.
Сенсор мембранного потенциала на основе FRET-пары mCitrine/mKatc2. Генетически кодируемые сенсоры мембранного потенциала представляют собой перспективный инструмент для мониторинга электрической активности клеток, в том числе специфичных популяций нейронов в тканях мозга. Последние из опубликованных ранее вариантов VSFPs были разработаны на основе потенциал-зависимой фосфатазы Ciona intestinalis (Ci-VSD), соединенной с цианово-желтой донорно-акцепторной парой Cerulean/Citrine (сенсор VSFP2.3) или зелено-оранжевой донорно-акцепторной парой флуоресцентных белков mUKG/mKO (сенсор Mermaid). Совместно с лабораторией проф. Т Кнопфеля (Япония) мы разработали улучшенный вариант генетически кодируемого сенсора мембранного потенциала, названный VSFP2.4, на основе FRET-пары желтого флуоресцентного белка mCitrine и дальнекрасного белка mKate2. Для изучения потенциал-зависимого ответа VSFP2.4 был экспрессироваи в клетках линии РС12, морфологическая гомогенность которых облегчает количественную флуориметрию при локальной фиксации потенциала (patch-clamp). Потенциал-зависимый ответ VSFP2.4 сравнивали с ответами сенсоров VSFP2.3 и Mermaid. Показано, что динамический диапазон VSFP2.4 сопоставим с таковым для VSFP2.3 и Mermaid (12.4, 13.3 и 12.9%, соответственно). По сравнению с VSFP2.3, VSFP2.4 является более надежным сенсором мембранного потенциала экспериментах in vivo, поскольку измерение флуоресценции акцептора (mKate2) в дальнекрасном канале позволяет элиминировать зеленую автофлуоресценцию, поглощение света гемоглобином и, следовательно, повысить уровень сигнал/шум. Спектральные свойства VSFP2.4 позволяют визуализировать его флуоресценцию в толще тканей с использованием двухфотонной микроскопии. Благодаря более быстрому ответу VSFP2.4 предпочтительнее использовать в экспериментах с быстрой кинетикой при детекции изменений флуоресценции в одном канале, поскольку изменение интенсивности флуоресценции донора энергии составляет для VSFP2.4 9.4%, что является максимальным значением для сенсоров мембранного потенциала.
В Таблице 4 приведены основные характеристики FRET пар флуоресцентных белков, использованных для создания высококонтрастных сенсоров.
Таблица 4. Избранные FRET пары флуоресцентных белков. Показаны пары, отобранные в настоящей работе (выделены жирным шрифтом), и лучшие аналоги.
FRET пара Макс возб. флуор. донора, нм Макс эм. флуор. донора, нм Макс. возб. флуор. акцептора, нм Макс. эм. флуор. акцептора, нм QV донора ЕС акцептора, M-1 cm"1 радиус Фёрстера (Ко), нм
EBFP2-mfiGFP 383 489 509 0.56 57 500 4.8
TagBFP-TagGFP 402 483 506 0.63 56 500 5.3
ECFP-EYFP 477 515 527 0.40 83 400 4.9
PS-CFP2-phiYFP 400 468 525 537 0.20 130 000 6.1
EGFP-mCheny 489 509 587 610 0.60 72 000 5.1
TagGFP-TagRFP 482 505 555 584 0.59 100 000 5.7
Venus-mCherry 515 528 587 610 0.57 72 000 5.7
mCitrine-mKate2 516 529 588 633 0.57 62 500 5.7
- квантовый выход флуоресценции; ЕС - коэффициент молярной экстинкции при максимуме возбуждения.
Выводы
1. Получена палитра из 8 ярких мономерных флуоресцентных белков для мечения целевых белков, с максимумами эмиссии от 457 до 635 нм. Белки TagBFP, TagCFP, TagRFP и тКа1е2, максимумы эмиссии флуоресценции которых приходятся на 457, 480, 584 и 633 нм, соответственно, характеризуются самой высокой расчетной яркостью среди мономерных флуоресцентных белков своих цветовых классов. Белок FusionRed превосходит все прочие красные флуоресцентные белки по качеству работы в составе белков слияния.
2. Получена палитра из 7 димерных флуоресцентных белков с максимумами эмиссии от 502 до 670 нм, характеризующихся высокой скоростью созревания хромофора. Показано, что высокая скорость созревания белка ТиАовРР обусловлена наличием специфичного канала в структуре белка, ведущего к фенольному кольцу хромофора. Показано, что белки КаШвКка и ецРР650, благодаря сочетанию высокой расчетной яркости и дальнекрасной флуоресценции, являются лучшими маркерами для визуализации в толще тканей в живых модельных животных. Полученный белок eqFP670 характеризуется самой длинноволновой эмиссией флуоресценции среди когда-либо разработанных флуоресцентных белков.
3. Получен ряд мономерных фотоактивируемых флуоресцентных белков, характеризуемых высокой расчетной яркостью и фотостабильностью активируемого флуоресцентного сигнала, применимых для технологий флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. Предложена технология «белковых речек», позволяющая повысить разрешение изображения при отслеживании быстрой диффузии белков в живых клетках с использованием повторных циклов обратимой фотоактивации.
4. Открыта способность зеленых флуоресцентных белков к необратимой фотоконверсии в красную форму в присутствии акцепторов электронов, в качестве которых могут выступать как неорганические, так и органические окислители. Показано, что в этой реакции зеленый флуоресцентный белок выступает в качестве эффективного свето-индуцируемого донора электронов. Показано, что окислительная фотоконверсия зеленых флуоресцентных белков может быть индуцирована в живых эукариотических клетках и трансгенных животных за счет внутриклеточных акцепторов электронов.
5. Показано, что фотостабильность зеленых флуоресцентных белков в живых клетках может быть значительно (до 10 раз) повышена за счет снижения эффективности окислительной фотоконверсии, путем удаления из среды рибофлавина и некоторых других витаминов, способных выступать в качестве электрон-акцепторов.
6. Получены генетически кодируемые сенсоры ионов кальция на основе пермутированного флуоресцентного белка, характеризуемые более чем 10-кратным возрастанием яркости флуоресценции в субмикромолярном диапазоне измеряемых концентраций. Оптимизированные варианты сенсоров, Case 12 и Case 16, характеризуются быстрым созреванием хромофора при 37°С и высокой расчетной яркостью флуоресценции. Продемонстрирована высокая эффективность полученных сенсоров в живых клетках и тканях, в том числе в органотипических срезах мозга.
7. Получены данные о структурно-функциональной организации кальциевых сенсоров на основе пермутированных флуоресцентных белков. Показано, что в промежуточной конформации, в которой только два из четырех кальций-связывающих участков кальмодулина заняты ионами кальция, сенсоры характеризуются лишь частичным взаимодействием кальмодулина с пептидом М13. Показано, что при высоких концентрациях сенсора в присутствии ионов кальция формируются нефункциональные гомодимеры.
8. Получен ряд генетически кодируемых сенсоров на основе эффекта FRET между двумя флуоресцентными белками, в том числе сенсоры специфичных протеазных активностей: фактора Ха, каспазы-3, гранзима В, а также сенсор мембранного потенциала. Показано, что полученные сенсоры характеризуются высоким изменением соотношения пиков эмиссии в ответ на детектируемые процессы. Высокая яркость флуоресценции, низкая рН-зависимость флуоресцентного сигнала, высокая фотостабильность и выраженный флуоресцентный ответ позволяют применять эти сенсоры в качестве надежных репортеров в фундаментальных и прикладных исследованиях.
Список публикаций по теме диссертации
Обзоры:
1. Chudakov D.M., Matz, M.V., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Fluorescent Proteins and their Applications in Imaging Living Cells and Tissues. Physiological Reviews, 2010 Jul;90(3):l 103-63.
2. Fluorescent proteins as light-inducible photochemical partners. Lukyanov KA, Serebrovskaya EO, Lukyanov S, Chudakov DM. Photochem PhotobiolScL 2010 Oct 28;9(10):1301-6.
3. Шкроб M.A., Мишин A.C., Чудаков Д.М., Лабас Ю.А., Лукьянов К.А. Хромобелки семейства зеленого флуоресцентного белка: свойства и применение. Биоорган, химия, 2008;34(5):581—590.
4. Суслова Е.А., Чудаков Д.М. Генетически кодируемые внутриклеточные сенсоры на основе флуоресцентных белков. Биохимия, 2007;72(7):683-97.
5. Chudakov D.M., Lukyanov S., Lukyanov K.A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends Biotechnol. 2005,23, 605-613.
6. Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Lukyanov S., Verkhusha V.V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Review Mol CellBiol. 2005, 6, 885-891.
7. Чудаков Д.М., Лукьянов К.А. Использование зеленого флуоресцентного белка (GFP) и его гомологов для изучения подвижности белков in vivo. Биохимия, 2003, 68, 1166-1172.
Статьи:
8. Verkhusha VV, Chudakov DM, Gurskaya NG, Lukyanov S, Lukyanov KA. Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins. Chem Biol. 2004, 11:845-54.
9. Bulina ME, Lukyanov KA, Yampolsky IV, Chudakov DM, Staroverov DB, Shcheglov AS, Gurskaya NG, Lukyanov S. New class of blue animal pigments based on frizzled and kringle protein domains. J Biol Chem. 2004,279:43367-70.
10. Chudakov DM, Verkhusha VV, Staroverov DB, Souslova EA, Lukyanov S, Lukyanov KA. Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nature Biotech. 2004,22,1435-1439.
11. Quillin ML, Anstrom DM, Shu X, O'leary S, Kallio K, Chudakov DM, Remington SJ. Kindling Fluorescent Protein from Anemonia sulcata: Dark-State Structure at 1.38 A Resolution. Biochemistry. 2005,44:5774-5787.
12. Shkrob MA, Yanushevich YG, Chudakov DM, Gurskaya NG, Labas YA, Poponov SY, Mudrik NN, Lukyanov S, Lukyanov KA. Far-red fluorescent proteins evolved from a blue chromoprotein from Actinia equina. Biochem J. 2005,392: 649-654.
13. Souslova EA, Chudakov DM. Photoswitchable cyan fluorescent protein as a FRET donor. Microsc Res Tech. 2006, 69, 207-209.
14. Bulina ME*, Chudakov DM*, Britanova OV, Yanushevich YG, Staroverov DB, Chepurnykh TV, Merzlyak EM, Shkrob MA, Lukyanov S, Lukyanov KA. A genetically encoded photosensitizer. Nature Biotech. 2006,24,95-99. »Contributed equally.
15. Bulina ME, Lukyanov KA, Britanova OV, Onichtchouk D, Lukyanov S, Chudakov DM. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nature Protocols 2006,1,947-953.
16. Chudakov DM, Chepurnykh TV, Belousov W, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fast and precise protein tracking using repeated reversible photoactivation. Traffic 2006, 7, 1304-1310.
17. Evdokimov AG, Pokross ME, Egorov NS, Zaraisky AG, Yampolsky IV, Merzlyak EM, Shkoporov AN, Sander I, Lukyanov KA, Chudakov DM. Structural basis for the fast maturation of Arthropoda green fluorescent protein. EMBO Rep. 2006, 7,1006-1012.
18. Shcherbo D, Merzlyak EM, Chepurnykh TV, Fradkov AF, Ermakova GV, Solovieva EA, Lukyanov KA, Bogdanova EA, Zaraisky AG, Lukyanov S, Chudakov DM. Bright far-red fluorcsccnt protein for whole-body imaging. Nature Methods. 2007, 4, 741-746.
19. Merzlyak EM, Goedhart J, Shcherbo D, Bulina ME, Shcheglov AS, Fradkov AF, Gaintzeva A, Lukyanov KA, Lukyanov S, Gadella TW, Chudakov DM. Bright monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime. Nature Methods. 2007,4, 555-557.
20. Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 2007,42:553, 555, 557.
21. Souslova EA, Belousov VV, Lock J, Stromblad S, Kasparov S, Bolshakov AP, Pinelis VG, Labas YA, Lukyanov S, Mayr LM, Chudakov DM. Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range. BMCBiotechnol. 2007, 7:37.
22. Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protoc. 2007, 2, 2024-2032.
23. Плетнева H.B., Плетнев С.В., Чудаков Д.М., Тихонова Т.В., Попов В.О., Мартынов В.И., Влодавер А.., Даутер 3., Плетнев В.З. Пространственная структура желтого флуоресцентного белка ZYFP538 (Zoanthus sp.) при разрешении 1.8 А Биоорган, химия. 2007, 33; 421-430.
24. Subach ОМ, Gundorov IS, Yoshimura М, Subach FV, Zhang J, Griienwald D, Souslova EA, Chudakov DM, Verkhusha VV. Conversion of red fluorescent protein into a bright blue probe. Chem Biol. 2008 Oct 20; 15(10).
25. Pletnev S, Shcherbo D, Chudakov DM, Pletneva N, Merzlyak EM, Wlodawer A, Dauter Z, Pletnev V.A Crystallographic Study of Bright Far-Red Fluorescent Protein mKate Reveals pH-induced cis-trans Isomerization of the Chromophore. J Biol Chem. 2008 Oct 24;283(43):28980-7.
26. М.Ю. Захарова, C.A. Дубилей, Д.М. Чудаков, А.Г. Габибов, И.Г. Шемякин, А,В. Колесников. Субстратная специфичность летального фактора сибирской язвы. Докл. Академии Наук. 2008;418:14-7. (получен и использован сенсор на основе FRET-пары флуоресцентных белков).
27. Shcherbo D, Murphy CS, Ermakova GV, Solovieva EA, Chepurnykh TV, Shcheglov AS, Verkhusha VV, Pletnev VZ, Hazelwood KL, Roche PM, Lukyanov S, Zaraisky AG, Davidson MW, Chudakov DM. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 2009 Mar 15;418(3):567-74.
28. Mutoh H, Perron A, Dimitrov D, Iwamoto Y, Akemann W, Chudakov DM, KnOpfel T. Spectrally-resolved response properties of the three most advanced FRET based fluorescent protein voltage probes. PLoS ONE. 2009;4(2):e4555.
29. Shcherbo D, Souslova EA, Goedhart J, Chepurnykh TV, Gaintzeva A, Shemiakina II, Gadella TW, Lukyanov S, Chudakov DM. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnol. 2009 Mar 25;9:24.
30. Zakharova MY, Kuznetcov NA, Dubiley SA, Kozyr AV, Fedorova OS, Chudakov DM, Knorre DG, Shemyakin IG, Gabibov AG, Kolesnikov AV. Substrate recognition of anthrax lethal factor examined by combinatorial and pre-steady-state kinetic approaches. J Biol Chem. 2009 Jul 3;284(27): 17902-13. (получен и использован сенсор на основе FRET-пары флуоресцентных белков).
31. Bogdanov AM, Mishin AS, Yampolsky IV, Belousov VV, Chudakov DM, Subach FV, Verkhusha VV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Green fluorescent proteins are light-induced electron donors. Nature Chem Biol. 2009 Jul;5(7):459-61.
32. Pletnev S, Gurskaya NG, Pletneva NV, Lukyanov KA, Chudakov DM, Martynov VI, Popov VO, Kovalchuk MV, Wlodawer A, Dauter Z, Pletnev V. Structural basis for phototoxicity of the genetically encoded photosensitizer KillerRed. J Biol Chem. 2009 Nov 13;284(46):32028-39.
33. Bogdanov AM, Bogdanova EA, Chudakov DM, Gorodnicheva TV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Cell culture medium affects GFP photostability: a solution. Nature Methods. 2009 Dec;6(12):859-60.
34. Guo F, Liu B, Tang F, Lane S, Souslova EA, Chudakov DM, Paton JF, Kasparov S. Astroglia are a possible cellular substrate of angiotensin 1-7) effects in the rostral ventro-lateral medulla. Cardiovasc Res. 2010 Aug l;87(3):578-84. (тестирование и применение генетически кодируемого кальциевого сенсора Casel2).
35. Koutsopolous OS, Laine D., Osellame LD, Chudakov DM, Parton RG, Frazier AE, Ryan MT. Human Miltons associate with mitochondria and induce microtubule-dependent remodeling of mitochondrial networks. BBA - Molecular Cell Research, 2010 May;1803(5):564-74. (тестирование и применение флуоресцентных и фотоактивируемых флуоресцентных белков).
36. Л. Чжан, Н. Г. Гурская, Е. Е. Копанцева, Н. Н. Мудрик, Л. Л. Вагнер, К. А. Лукьянов, Д. М. Чудаков. Выявление аминокислотных остатков, ответственных за способность к обратимой фотоконверсии мономерного красного флуоресцентного белка TagRFP. Биоорган, химия, 2010, 36(2); 187-192.
37. Zhdanov AV, Ward MW, Taylor CT, Souslova EA, Chudakov DM, Prehn JH, Papkovsky DB. Extracellular calcium depletion transiently elevates oxygen consumption in neurosecretory PC12 cells through activation of mitochondrial Na(+)/Ca(2+) exchange. Biochim Biophys Acta. 2010 Sep;1797(9):1627-1637. (тестирование и применение генетически кодируемого кальциевого сенсора Casel2).
38. Leder L, Stark W, Freuler F, Marsh M, Meyerhofer M, Stettler T, Mayr LM, Britanova OV, Strukova LA, Chudakov DM, Souslova EA. The Structure of Ca2+ Sensor Casel6 Reveals the Mechanism of Reaction to Low Ca2+ Concentrations. Sensors. 2010, 10(9), 8143-8160; doi.10.3390/sl00908143.
39. Shcherbo D, Shemiakina II, Ryabova AV, Luker KE, Schmidt ВТ, Souslova EA, Gorodnicheva TV, Strukova L, Shidlovskiy KM, Britanova OV, Zaraisky AG, Lukyanov KA, Loschenov VB, Luker GD, Chudakov DM. Near-infrared fluorescent proteins. Nature Methods. 2010 Oct;7( 10):827-9.
40. Teh C, Chudakov DM, Poon K, Mamedov IZ, Sek J, Shidlovsky K, Lukyanov S, and Korzh V. Optogenetic in vivo cell manipulation in KillerRed-expressing zebrafish transgenics. BMC Developmental Biology. 2010 Nov 2;10:110.
41. M. Figueiredo, S. Lane, F. Tang, B-H. Liu, N. Marina, V. Kasymov, E. A. Souslova, D.M. Chudakov, A. Gourine, A.G. Teschemacher, S. Kasparov. Optogenetic experimentation on astrocytes. Experimental Physiology. 2011 Jan;96(l):40-50.
42. Light-induced blockage of cell division with a chromatin-targeted phototoxic fluorescent protein. Serebrovskaya EO, Gorodnicheva TV, Ermakova GV, Solovieva EA, Sharonov GV, Zagaynova EV, Chudakov DM, Lukyanov S, Zaraisky AG, Lukyanov KA. Biochem J. 2011 doi: 10.1042/BJ20101217.
Главы в книгах:
1. Chudakov D.M., and Lukyanov K.A. (2005) Using photoactivatable GFPs to study protein dynamics and function. In Jorde, L.B., Little, P.F.R., Dunn, M.J. and Subramaniam, S. (Eds), Encyclopedia of Genetics, Genomics, Proteomics and Bioinformatics. John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2129-2137.
2. Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Fradkov A.F., Labas Y.A., Matz M.V. and Lukyanov S.A. (2005) Discovery and properties of GFP-like proteins from non-bioluminescent Anthozoa In: Green fluorescent protein: properties, applications and protocols. 2nd edition, Chalfle, M., Kain, S., Eds., John Wiley & Sons Ltd, New Jersey, 121-138.
Патенты:
1. United States Patent 7,638,615. Fluorescent proteins and methods for using same. Issued December 29, 2009, Inventors: Lukyanov; Sergey A. (Moscow, RU), Chudakov; Dmitry M. (Moscow, RU).
2. Европейский патент EP1994149 - Novel fluorescent proteins and methods for using same. Inventors: Lukyanov; Sergey A. (Moscow, RU), Chudakov; Dmitry M. (Moscow, RU).
3. Патент РФ № 2395581. Новые флуоресцентные белки из Entacmaea quadricolor и способ их получения. Авторы: Лукьянов Сергей Анатольевич (RU), Чудаков Дмитрий Михайлович (RU).
Заказ № 194-А/03/2011 Подписано в печать 29.03.2011 Тираж 120 экз. Усл. п.л. 2.5
.^--Сч. ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30
)) www.cfr.ru ; е-таИ:т/о@с/г.ги
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Чудаков, Дмитрий Михайлович
Определения
Список сокращений ^
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ !
1.1. Происхождение и предполагаемые функции GFP-подобных белков ]
A. Происхождение GFP-подобных белков
B. Биологические функции GFP-подобных белков
1.2. Пространственная структура и разнообразие хромофоров
A. Структура GFP-подобных белков
B. Хромофор зеленых флуоресцентных белков
C. Природное разнообразие хромофоров GFP-подобных белков
D. Хромофоры и спектральные варианты мутантных вариантов ФБ З
1.3. Характеристики ФБ, существенные для практического применения
A. Яркость флуоресцентного сигнала
B. Скорость созревания хромофора
C. Фотостабилыюсть и нежелательная фотоконверсия
D. Олигомеризация и агрегация
E. рН-стабильность
1.4. Основные методы с использованием ФБ
A. Мечение белков слияния
B. Технологии фотообесцвечивания
C. Внутриклеточная локализация
D. Визуализация активности промоторов
E. Клеточные «таймеры»
F. Мечение клеток и тканей
G. Мечение ДНК и РНК
1.5. Исследование белок-белковых взаимодействий с использованием ФБ
A. Ферстеровский резонансный перенос энергии (FRET)
B. Флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия (FCCS)
C. Флуоресцентная комплементация (расщепление флуоресцентных белков)
1.6. Фотоактивируемые флуоресцентные белки
A. Структурная основа для фотоактивации
B. Ключевые параметры фотоактивируемых флуоресцентных белков
C. Обратимо фотоактивируемые флуоресцентные белки
D. Необратимо фотоактивируемые флуоресцентные белки
E. Флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения
1.7. Генетически кодируемые сенсоры на основе ФБ
A. Возможности генетически кодируемых сенсоров
B. Сенсоры на основе одного ФБ без дополнительных белковых доменов
C. Сенсоры на основе ФБ, слитного с чувствительным белковым доменом
D. Сенсоры на основе эффекта FRET
E. Сенсоры на основе транслокации 107 Цели и задачи работы
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
A. Тактика и стратегия получения и оптимизации флуоресцентных белков
B. Оборудование
C. Реактивы
D. Бактериальные штаммы и клеточные линии
E. Методы исследования и анализа данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Мономерные флуоресцентные белки для мечения целевых белков
A. TagRFP: яркий красный мономерный флуоресцентный белок
B. mKate и mKate2: мономерные дальнекрасные флуоресцентные белки; tdKatushka
C. Красный «супермономерный» флуоресцентный белок
D. TagBFP: мономерный синий флуоресцентный белок на основе TagRFP
E. Мономерные белки средней части видимого спектра: TagCFP, TagGFP, TagYFP
3.2. Димерные флуоресцентные белки для мечения клеток и тканей
A. Быстро созревающий неагрегирующий зеленый ФБ TurboGFP
B. Оранжево-красные флуоресцентные белки eqFP578 и TurboRFP '
C. Дальнекрасный флуоресцентный белок Katushka
D. Батохромные варианты белка Katushka - eqFP650 и eqFP
3.3. Фотоактивируемые флуоресцентные белки
A. Высококонтрастный фотоактивируемый белок PS-CFP
B. Технология «белковых речек» на основе обратимо фотоактивируемых белков
C. Красные мономерные и «супермономерные» обратимо фотоактивируемые белки
D. Новый тип необратимой фотоконверсии зеленых флуоресцентных белков
E. Повышение фотостабильности зеленых ФБ при визуализации в живых клетках
3.4. Генетически кодируемые сенсоры
A. Сенсоры ионов кальция на основе пермутированных флуоресцентных белков
B. Высококонтрастные сенсоры на основе FRET-nap флуоресцентных белков 194 Выводы 199 Заключение 202 Благодарности 204 Список публикаций по теме диссертации 205 Список цитируемой литературы
Определения
GFP-подобный белок. Под этим понятием подразумеваются все белки, родственные белку avGFP из Aequorea victoria, то есть имеющие близкую к нему пространственную структуру, включая флуоресцентные белки (ФБ), нефлуоресцентные, но окрашенные хромобелки (ХБ), а также некоторые бесцветные варианты. Соответственно, под термином ФБ здесь мы подразумеваем именно GFP-подобные флуоресцентные белки, но не прочие варианты флуоресцирующих протеинов, такие как, например, белок iLov (Chapman et al, 2008) или билевердин-связывающий белок (Shu et al, 2009).
Нумерация аминокислотных остатков. Для удобства восприятия, нумерация аминокислотных остатков для всех GFP-подобных белков приводится в соответствии с выравниванием с белком avGFP.
Яркость. Под термином «яркость», в зависимости от контекста, подразумевается одна из двух характеристик: расчетная яркость флуоресценции, получаемая как произведение квантового выхода флуоресценции и коэффициента молярной экстинкции при максимуме возбуждения флуоресценции, либо результирующая (детектируемая) яркость флуоресцентного сигнала в живой системе, которая зависит, помимо расчетной яркости флуоресцентного белка, от ряда других параметров, таких как эффективность транскрипции и трансляции гена флуоресцентного белка, стабильность мРНК, скорость и эффективность (процент) созревания хромофора в данных условиях, скорость деградации флуоресцентного белка в живых клетках.
Фотостабильность. Устойчивость флуоресцентного белка к обесцвечиванию. До сегодняшнего дня не существует единого подхода к сравнению фотостабильности флуоресцентных белков. Более того, в условиях облучения различной мощности и длин волн, непрерывного или сканирующего облучения, в растворе и в живых клетках в различных линиях живых клеток, при различной локализации внутри клетки, одни и те же флуоресцентные белки могут характеризоваться совершенно различной относительной фотостабильностью. Мы применяли различные подходы для сравнения фотостабильности и в контексте работы следует понимать этот термин как относительную фотостабильность сравниваемых флуоресцентных белков при облучении в идентичных выбранных условиях. рКа. Для удобства сравнения, устойчивость сигнала флуоресцентных белков к изменениям значения рН принято описывать величиной кажущегося значение рКа хромофора, определяемой как значение рН, при котором яркость флуоресцентного сигнала составляет половину от максимальной. В большинстве случаев, эта величина приближенно соответствует константе диссоциации протона фенольного кольца хромофора.
Контраст. Применительно к фотоактивируемым флуоресцентным белкам: выраженность изменений флуоресцентных свойств при фотоактивации. Имеется в виду кратность возрастания яркости наблюдаемого флуоресцентного сигнала при фотоактивации из нефлуоресцентной во флуоресцентную форму, либо результирующее изменение соотношения яркости флуоресцентных сигналов при переходе белка из, например, зеленой, в красную флуоресцентную форму. Применительно к генетически кодируемым сенсорам: выраженность изменений флуоресцентных свойств при срабатывании сенсора, то есть при связывании определенного иона, взаимодействии с определенным лигандом, модификации определенным ферментом.
Список сокращений
УФ ультрафиолетовая область спектра;
ФБ флуоресцентный белок
ХБ хромобелок
ЭПР Эндоплазматический ретикулум avGFP Aequorea victoria green fluorescent protein зелёный флуоресцентный белок Aequorea victoria)
BFP blue fluorescent protein (синий флуоресцентный белок)
BiFC bimolecular fluorescence complementation бимолекулярная флуоресцентная комплементация) BRET bioluminescence resonance energy transfer биолюминесцентный резонансный перенос энергии) CFP cyan fluorescent protein (голубой флуоресцентный белок)
ESPT excited state proton transfer (эффект переноса протона при возбуждении)
FCCS fluorescence cross-correlation spectroscopy флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия) FLIM fluorescence lifetime imaging microscopy (время жизни флуоресценции)
FLIP fluorescence loss in photobleaching метод затухания флуоресценции при фотообесцвечивании) FRAP fluorescence recovery after photobleaching метод восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания) FRET forster resonance energy transfer (ферстеровский перенос энергии)
G2F globular-2 fragment (глобулярный фрагмент 2)
GFP green fluorescent protein (зелёный флуоресцентный белок)
NA numerical aperture (числовая апертура объектива)
NK natural killer (натуральные киллеры)
PALM photoactivated localization microscopy микроскопия локализованной фотоактивации) PSF point spread function (функция рассеяния точки)
RESOLFT reversible saturable optical fluorescent transition (микроскопия обратимого насыщенного оптического флуоресцентного перехода) RFP red fluorescent protein (красный флуоресцентный белок)
ROI region of interest интересующий участок, например, участок живой клетки при микроскопии) SPIM selective plane illumination microscopy микроскопия с селективным облучением плоскости)
Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетически кодируемые флуоресцентные инструменты для исследования живых систем"
Термин GFP (green fluorescent protein) — зеленый флуоресцентный белок — сегодня известен не только ученым. Многие слышали о трансгенных флуоресцентных кроликах, свиньях и кошках, у кого-то в домашних аквариумах уже содержатся трансгенные флуоресцентные рыбы Danio rerio. Однако, почти 50 лет назад, когда первый флуоресцентный белок, avGFP, был впервые выделен О. Шимомурой и коллегами из медузы Aequorea victoria (Shimomura et al, 1962), и на протяжении 30 лет после этого открытия, изучение белков этого семейства представляло интерес лишь для узкого круга специалистов, исследовавших люминесценцию и флуоресценцию морских обитателей. Только после клонирования в 1992 году гена avGFP (Prasher et al, 1992) и демонстрации возможности использования его в качестве генетически кодируемой флуоресцентной метки для визуализации процессов in vivo (Chalfie et al, 1994), отношение к теме флуоресцентных белков принципиально изменилось.
Уникальность флуоресцентного белка как генетически кодируемого маркера, обладающего низкой токсичностью, высокой яркостью и фотостабильностью флуоресцентного сигнала, а также независимость возникновения флуоресценции от наличия специфических субстратов или воздействия ферментов, вызвали резкий рост интереса к новым открывшимся возможностям для in vivo микроскопии. ФБ быстро превратились в эффективный инструмент для визуализации объектов, структур и процессов в живых клетках и организмах. Интерес исследователей к структуре, биохимии и биофизике ФБ привел к стремительному росту числа научных публикаций, посвященных ФБ и их применению для решения задач молекулярной и клеточной биологии (рис. 1).
Ряд гомологичных белков этого семейства был найден у организмов родов Hydrozoa и Anthozoa, обладающих биолюминесценцией (биологической формой хемилюминесценции). Возбуждение флуоресценции в этих белках происходит после поглощения биолюминесцентной энергии (так называемый биолюминесцентный резонансный перенос энергии, Bioluminescence Resonance Energy Transfer, BRET). r- 2500
1962
1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008 2010 открытие GFP из Aequorea victoria клонирование гена GFP
ФБ и ХБ из коралловых полипов
ФБ из рачков ФБ из ланцет -копепод никое, гребневика структура структура GFP структура хромофора DsRed структура хромофора Kaede
Нобелевская премия за GFP
-2000
- 1500
- 1000 -500 мечение биосенсоры биосенсоры на микроскопия при помощи на Основе основе пермути- сверх-высокого GFP FRET рованных ФБ разрешения
CFP YFP пермути- Фото- улучшенные варианты
BFP рованный активируемые BFPs, YFPs, RFPs,
ФБ ФБ дальнекрасные ФБ
Рисунок 1. Временная шкала основных событий в области исследования и применения GFP-подобных белков. Зеленым цветом окрашены ключевые моменты в области изучения природного разнообразия; синим - в области исследования структур и хромофоров; оранжевым - разработка новых вариантов ФБ; фиолетовым - появление новых технологий на основе ФБ. Схематичные рисунки над шкалой показывают представителей соответствующих групп организмов, несущих ФБ и ХБ (слева направо: медузы, морские анемоны, копеподы, ланцетники). Столбцы над шкалой показывают число научных статей за соответствующий год, которые находятся в базе данных PubMed при поиске с использованием термина "green fluorescent protein" (этот поиск, безусловно, не дает полной информации, но отражает общую динамику публикаций, посвященных изучению и применению ФБ).
Позднее GFP-подобные белки были также обнаружены и у морских существ, не имеющих биолюминесценции, в том числе красные ФБ (Matz et al, 1999), а также нефлуоресцентные окрашенные хромобелки (ХБ) (Lukyanov et al, 2000) из коралловых полипов. Дальнейшие исследования показали существование GFP-подобных белков и у эволюционно далеких организмов, таких как ракообразные (Shagin et al, 2004), гребневики (патентная заявка W02008041107) и даже хордовые (ланцетники) (Deheyn et al, 2007) (см. раздел 1.1.)- Вслед за расшифровкой структуры хромофора avGFP ((Shimomura, 1979), уточнена в работе (Cody et al, 1993)), был описан ряд вариантов хромофоров у других природных ФБ, таких как красные хромофоры типа DsRed (Gross et al, 2000) и Kaede (Mizuno et al, 2003) и другие (см. раздел 1.2.).
Дальнейшее усовершенствование ФБ с различными спектральными характеристиками открыло новые горизонты для разработки принципиально новых методов исследования живых систем. В современной науке ФБ находят применение для исследования организации и функционирования живых систем на самых разных уровнях. ФБ, гены которых встроены в одну рамку считывания с интересующим исследователя белком, позволяют визуально исследовать его локализацию, перемещение, скорость деградации, и даже «старение» (т.е. определять время, прошедшее с момента синтеза белка) в живых системах. Разнообразие ФБ позволяет одновременно использовать несколько меток разных цветов при исследовании локализации и взаимодействия различных белков в клетке. Фотоактивируемые ФБ позволяют отслеживать помеченные ими молекулы в пространстве и времени, а также добиваться сверх-высокого разрешения методами флуоресцентной микроскопии. Нуклеиновые кислоты также могут быть помечены с помощью ФБ с использованием ДНК и РНК-связывающих белковых доменов. ФБ, снабженные специфическими сигналами локализации, направляются в клеточные органеллы, позволяя исследовать их морфологию, наблюдать процессы их слияние и расхождения, а также, например, сегрегацию в процессе клеточного деления. ФБ используются как инструмент для мечения индивидуальных клеток и определенных тканей, позволяя наблюдать их морфологию, локализацию, изменение (например, в процессе эмбрионального развития или роста опухоли), стадии митоза клетки и другие важнейшие клеточные события. Наконец, целые организмы могут быть помечены с помощью флуоресцентных белков для того, например, чтобы отличить трансгенный организм от организма дикого типа.
С использованием ФБ могут проводиться и более сложные функциональные исследования. Стала возможным визуализация белок-белковых взаимодействий в живых клетках (см. раздел 1.5.), прямое наблюдение включения и выключения интересующего исследователя промотора, ко-активации двух промоторов и, ретроспективно, «истории» активации промотора на уровне целого организма. Яркие и быстро созревающие ФБ, «клеточные часы» и «таймеры» на основе ФБ, составляют мощный инструментарий для ученого, исследующего процессы в живых тканях в реальном времени (см. раздел 1.4.). Флуоресцентные сенсоры, составляющие обширную область применения ФБ, основаны на изменении спектральных характеристик молекулы под воздействием окружающей среды. Такие, полностью генетически кодируемые, сенсоры позволяют визуально определять активность исследуемых белков (например, киназ или протеаз), концентрации внутриклеточных ионов, различных метаболитов и медиаторов (Н+, Са , СГ , Н2О2, цАМФ, и др.), а также другие параметры в живых клетках и тканях (см. раздел 1.7.).
Совокупность методов на основе ФБ вывела возможности современной молекулярной и клеточной биологии на новый уровень. Весь описанный арсенал методов с использованием ФБ может применяться и активно применяется не только в фундаментально-научных исследованиях, но и для масштабного скрининга лекарственных препаратов, и в доклинических испытаниях на лабораторных животных. Не случайно достижения в области ФБ были отмечены нобелевской премией 2008 года «за открытие и разработку методов использования ФБ». Доступная сегодня палитра ФБ является результатом интенсивного исследования их природного разнообразия и биохимии. Перспективы практического применения ФБ вдохновляли исследователей на подробное изучение филогении ФБ и их биологических функций, пространственной организации ФБ, химической структуры и механизма формирования их хромофоров, оптических характеристик и их структурных детерминант. В ходе исследования ФБ было сделано множество интересных открытий и сформулирован ряд важных вопросов в области биохимии, молекулярной эволюции, физиологии и экологии морских обитателей (см. раздел 1.1.), В свою очередь, фундаментальные открытия в области биохимии ФБ нередко выливались в создание новых вариантов ФБ и технологий, имеющих практическое применение.
Таким образом, клонирование в 1992 году гена зеленого флуоресцентного белка из гидромедузы Aequorea victoria положило начало разработке целого арсенала инструментов и методов для изучения живых систем. Тем не менее, долгое время многие достижения носили скорее теоретический характер. Можно выделить две ключевые проблемы, стоявшие перед разработчиками новых генетически кодируемых флуоресцентных инструментов.
Первая - расширение палитры спектральных вариантов флуоресцентных белков до крайних областей видимого спектра — синей (максимум эмиссии флуоресценции при 440-460 нм) и дальнекрасной (максимум эмиссии флуоресценции выше 630 нм). Особый интерес, как эффективный инструмент для визуализации объектов в модельных животных, представляли дальнекрасные флуоресцентные белки, длинноволновое излучение которых наиболее эффективно проникает через толщу живых тканей. Полученные до настоящей работы варианты дальнекрасных флуоресцентных белков характеризовались крайне низкой яркостью флуоресценции и низкой фотостабильностью, что делало эти белки практически непригодными для реального применения. По тем же причинам, не находили применения на практике известные синие флуоресцентные белки.
Вторая проблема состояла в том, что практически все открытые природные флуоресцентные белки (за исключением avGFP) имели олигомерную структуру и были непригодны для исследования локализации белков, отслеживания белок-белковых взаимодействий и других исследований, в которых требуется получение конструкций слияния с целевым белком. Полученные путем мутагенеза природных белков мономерные красные флуоресцентные варианты отличались низкой яркостью сигнала, и достаточно низким, по сравнению с природными мономерными зелеными флуоресцентными белками, качеством работы в составе белков слияния. Известные обратимо фотоактивируемые флуоресцентные белки характеризовались тетрамерной природой, что делало невозможным их применение для фотомечения исследуемых белков, в том числе для развивающихся технологий флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения.
Оставался также ряд других значимых проблем, решение которых было актуально на момент начала выполнения данной работы. Так, время полусозревания хромофора составляло для большинства полученных флуоресцентных белков многие десятки минут и даже часы, что затрудняло их применение в экспериментальных системах, требующих быстрого появления флуоресцентного сигнала. Полученные генетически кодируемые сенсоры на основе флуоресцентных белков отличались низким динамическим диапазоном изменений флуоресцентного сигнала при ответе на детектируемые ионы или исследуемую активность, что существенно осложняло получение достоверных результатов.
Настоящая работа была направлена на системное решение перечисленных выше проблем и создание панели эффективных молекулярных инструментов на основе флуоресцентных белков, способных вывести современные технологии микроскопии и in vivo имиджинга на качественно новый уровень.
1. Обзор литературы
Настоящий обзор литературы обобщает современные представления о структуре, биохимии и эволюции уникального семейства ОБР-подобных белков, а таюке описывает многообразие существующих методов экспериментальной биологии, основанных на их применении.
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Чудаков, Дмитрий Михайлович
Выводы
1. Получена палитра из 8 ярких мономерных флуоресцентных белков для мечения целевых белков, с максимумами эмиссии от 457 до 635 нм. Белки TagBFP, TagCFP, TagRFP и шКа1е2, максимумы эмиссии флуоресценции которых приходятся на 457, 480, 584 и 633 нм, соответственно, характеризуются самой высокой расчетной яркостью среди мономерных флуоресцентных белков своих цветовых классов. Белок РизюпЕ.ес1 превосходит все прочие красные флуоресцентные белки по качеству работы в составе белков слияния.
2. Получена палитра из 7 димерных флуоресцентных белков с максимумами эмиссии от 502 до 670 нм, характеризующихся высокой скоростью созревания хромофора. Показано, что высокая скорость созревания белка ТигЬоСРР обусловлена наличием специфичного канала в структуре белка, ведущего к фенольному кольцу хромофора. Показано, что белки КаШэЬка и едРР650, благодаря сочетанию высокой расчетной яркости и дальнекрасной флуоресценции, являются лучшими маркерами для визуализации в толще тканей в живых модельных животных. Полученный белок eqFP670 характеризуется самой длинноволновой эмиссией флуоресценции среди когда-либо разработанных флуоресцентных белков.
3. Получен ряд мономерных фотоактивируемых флуоресцентных белков, характеризуемых высокой расчетной яркостью и фотостабильностью активируемого флуоресцентного сигнала, применимых для технологий флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. Предложена технология «белковых речек», позволяющая повысить разрешение изображения при отслеживании быстрой диффузии белков в живых клетках с использованием повторных циклов обратимой фотоактивации.
4. Открыта способность зеленых флуоресцентных белков к необратимой фотоконверсии в красную форму в присутствии акцепторов электронов, в качестве которых могут выступать как неорганические, так и органические окислители. Показано, что в этой реакции зеленый флуоресцентный белок выступает в качестве эффективного свето-индуцируемого донора электронов. Показано, что окислительная фотоконверсия зеленых флуоресцентных белков может быть индуцировара в живых эукариотических клетках и трансгенных животных за счет внутриклеточных акцепторов электронов.
5. Показано, что фотостабильность зеленых флуоресцентных белков в живых клетках может быть значительно (до 10 раз) повышена за счет снижения эффективности окислительной фотоконверсии, путем удаления из среды рибофлавина и некоторых других витаминов, способных выступать в качестве электрон-акцепторов.
6. Получены генетически кодируемые сенсоры ионов кальция на основе пермутированного флуоресцентного белка, характеризуемые более чем 10-кратным возрастанием яркости флуоресценции в субмикромолярном диапазоне измеряемых концентраций. Оптимизированные варианты сенсоров, Case 12 и Case 16, характеризуются быстрым созреванием хромофора при 37°С и высокой расчетной яркостью флуоресценции. Продемонстрирована высокая эффективность полученных сенсоров в живых клетках и тканях, в том числе в органотипических срезах мозга.
7. Получены данные о структурно-функциональной организации кальциевых сенсоров на основе пермутированных флуоресцентных белков. Показано, что в промежуточной конформации, в которой только два из четырех кальций-связывающих участков кальмодулина заняты ионами кальция, сенсоры характеризуются лишь частичным взаимодействием кальмодулина с пептидом М13. Показано, что при высоких концентрациях сенсора в присутствии ионов кальция формируются нефункциональные гомодимеры.
8. Получен ряд генетически кодируемых сенсоров на основе эффекта FRET между двумя флуоресцентными белками, в том числе сенсоры специфичных протеазных активностей: фактора Ха, каспазы-3, гранзима В, а также сенсор мембранного потенциала. Показано, что полученные сенсоры характеризуются высоким изменением соотношения пиков эмиссии в ответ на детектируемые процессы. Высокая яркость флуоресценции, низкая рН-зависимость флуоресцентного сигнала, высокая фотостабильность и выраженный флуоресцентный ответ позволяют применять эти сенсоры в качестве надежных репортеров в фундаментальных и прикладных исследованиях.
Заключение
В настоящей работе было получено новое поколение генетически кодируемых флуоресцентных маркеров и инструментов, принципиально расширивших возможности для визуализации объектов и процессов при исследовании живых систем.
Решение проблемы олигомеризации флуоресцентных белков позволило создать панель ярких мономерных флуоресцентных маркеров со спектрами флуоресценции, покрывающими всю область видимого спектра. Благодаря этому, стало возможным проводить многоцветное мечение целевых белков и органелл в живых клетках, существенно расширились возможности для отслеживания взаимодействия целевых белков и изменения внутриклеточных параметров с использованием эффекта FRET.
Полученные мономерные фотоактивируемые флуоресцентные белки позволяют отслеживать перераспределение целевых белков в живых клетках, и применимы для технологий флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, в том числе двухцветной.
Полученные яркие дальнекрасные флуоресцентные белки позволяют эффективно визуализировать клетки и ткани в теле интактных живых модельных организмов, а быстросозревающие флуоресцентные белки -регистрировать активность и исследовать динамику работы промоторов исследуемых генов.
Открыта способность зеленых флуоресцентных белков выступать в качестве эффективных свето-индуцируемых доноров электронов. Это открытие имеет непосредственное практическое значение для приложений флуоресцентных белков, и, в частности, позволило многократно повысить фотостабильность зеленых ФБ при визуализации в живых клетках. С другой стороны, огромный фундаментальный интерес представляет вероятная связь этого свойства зеленых ФБ с их функциональной ролью в морских организмах.
Получен ряд генетически кодируемых сенсоров, характеризующихся высоким динамическим диапазоном флуоресцентного ответа, позволяющих достоверно детектировать изменения, происходящие в живых клетках. Принципы организации и флуоресцентные домены полученных сенсоров могут в дальнейшем служить основой для создания высококонтрастных сенсоров с различной специфичностью.
Большинство полученных в данной работе инструментов и технологий уже сегодня находят широкое применение в области молекулярной и клеточной биологии, биологии развития, канцерогенеза, иммунологии, нейробиологии и фармакологии; они активно используются в сотнях лабораторий и компаний по всему миру, как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях.
Благодарности
Автор не берется перечислить всех, кому должен быть благодарен за возможность плодотворно работать в такой увлекательной области фундаментальной и прикладной науки.
Хочу поблагодарить сотрудников Отдела геномики и постгеномных технологий, включающего сегодня целый ряд лабораторий и групп, сотрудников взаимодействующих с нами лабораторий ИБХ РАН, в первую очередь Лаборатории молекулярных основ эмбриогенеза, Лаборатории рентгеноструктурного анализа, Лаборатории биокатализа, Лаборатории оптической микроскопии и спектроскопии биомолекул, Лаборатории клеточных взаимодействий, Группы химии хромопротеинов, а также технопарка ИБХ и компании Евроген.
Хочу выразить глубокую признательность своим наставникам, Сергею и Константину Лукьяновым, за постоянную поддержку и предоставленную с самого начала работы свободу эксперимента.
Отдельно хочу поблагодарить людей, благодаря которым когда-то ощутил вкус научной работы, в первую очередь Екатерину Мерзляк, Михаила Матца, Юлию Малееву.
Благодарю своих оппонентов: члена-корреспондента РАН, Сергея Михайловича Деева, доктора химических наук, профессора, Александра Павловича Савицкого, доктора биологических наук, Андрея Валентиновича Васильева, представителя ведущей организации - доктора биологических наук, Дмитрия Борисовича Зорова.
Благодарю членов диссертационного совета ИБХ РАН.
Благодарю свою семью, свою жену, своих друзей.
Список публикаций по теме диссертации
Обзоры:
1. Chudakov D.M., Matz, M.V., Lukyanov S., Lukyanov К.A. Fluorescent Proteins and their Applications in Imaging Living Cells and Tissues. Physiological Reviews, 2010 Jul;90(3):l 103-63.
2. Lukyanov KA, Serebrovskaya EO, Lukyanov S, Chudakov DM. Fluorescent proteins as light-inducible photochemical partners. Photochem Photobiol Sci. 2010 Oct 28;9(10):1301-6.
3. Шкроб M.A., Мишин A.C., Чудаков Д.М., Лабас Ю.А., Лукьянов К.А. Хромобелки семейства зеленого флуоресцентного белка: свойства и применение. Биоорган, химия, 2008;34(5):581—590.
4. Суслова Е.А., Чудаков Д.М. Генетически кодируемые внутриклеточные сенсоры на основе флуоресцентных белков. Биохимия, 2007;72(7):683-97.
5. Chudakov D.M., Lukyanov S., Lukyanov К.А. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends Biotechnol. 2005, 23, 605-613.
6. Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Lukyanov S., Verkhusha Y.V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Review Mol. Cell Biol. 2005, 6, 885-891.
7. Чудаков Д.М., Лукьянов К.А. Использование зеленого флуоресцентного белка (GFP) и его гомологов для изучения подвижности белков in vivo. Биохимия, 2003, 68, 1166-1172.
Статьи:
8. Verkhusha W, Chudakov DM, Gurskaya NG, Lukyanov S, Lukyanov KA. Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins. С h em Biol. 2004, 11:845-54.
9. Bulina ME, Lukyanov KA, Yampolsky IV, Chudakov DM, Staroverov DB, Shcheglov AS, Gurskaya NG, Lukyanov S. New class of blue animal pigments based on frizzled and kringle protein domains. J Biol Chem. 2004, 279:43367-70.
10. Chudakov DM, Verkhusha VV, Staroverov DB, Souslova EA, Lukyanov S, Lukyanov KA. Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nature Biotech. 2004, 22, 1435-1439.
11. Quillin ML, Anstrom DM, Shu X, O'leary S, Kallio K, Chudakov DM, Remington SJ. Kindling Fluorescent Protein from Anemonia sulcata: Dark-State Structure at 1.38 A Resolution. Biochemistry. 2005, 44:5774-5787.
12. Shkrob MA, Yanushevich YG, Chudakov DM, Gurskaya NG, Labas YA, Poponov SY, Mudrik NN, Lukyanov S, Lukyanov KA. Far-red fluorescent proteins evolved from a blue chromoprotein from Actinia equina. Biochem J. 2005, 392: 649-654.
13. Souslova EA, Chudakov DM. Photoswitchable cyan fluorescent protein as a FRET donor. Microsc Res Tech. 2006, 69, 207-209.
14. Bulina ME*, Chudakov DM*, Britanova OV, Yanushevich YG, Staroverov DB, Chepurnykh TV, Merzlyak EM, Shkrob MA, Lukyanov S, Lukyanov KA. A genetically encoded photosensitizer. Nature Biotech. 2006, 24, 95-99. ^Contributed equally.
15. Bulina ME, Lukyanov KA, Britanova OV, Onichtchouk D, Lukyanov S, Chudakov DM. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nature Protocols 2006, 1, 947-953.
16. Chudakov DM, Chepurnykh TV, Belousov W, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fast and precise protein tracking using repeated reversible photoactivation. Traffic 2006, 7, 1304-1310.
17. Evdokimov AG, Pokross ME, Egorov NS, Zaraisky AG, Yampolsky IV, Merzlyak EM, Shkoporov AN, Sander I, Lukyanov KA, Chudakov DM. Structural basis for the fast maturation of Arthropoda green fluorescent protein. EMBO Rep. 2006, 7, 1006-1012.
18. Shcherbo D, Merzlyak EM, Chepurnykh TV, Fradkov AF, Ermakova GV, Solovieva EA, Lukyanov KA, Bogdanova EA, Zaraisky AG, Lukyanov S, Chudakov DM. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 2007, 4, 741-746.
19. Merzlyak EM, Goedhart J, Shcherbo D, Bulina ME, Shcheglov AS, Fradkov AF, Gaintzeva A, Lukyanov KA, Lukyanov S, Gadella TW, Chudakov DM. Bright monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime. Nature Methods. 2007, 4, 555-557.
20. Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 2007, 42:553, 555, 557.
21. Souslova EA, Belousov VV, Lock J, Stromblad S, Kasparov S, Bolshakov AP, Pinelis VG, Labas YA, Lukyanov S, Mayr LM, Chudakov DM. Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range. BMC Biotechnol. 2007, 7:37.
22. Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protoc. 2007, 2, 2024-2032.
23. Плетнева Н.В., Плетнев С.В., Чудаков Д.М., Тихонова Т.В., Попов В.О., Мартынов В.И., Влодавер А., Даутер 3., Плетнев В.З. Пространственная структура желтого флуоресцентного белка zYFP538 (Zoanthus sp.) при разрешении 1.8 А Биоорган, химия. 2007, 33; 421-430.
24. Subach ОМ, Gundorov IS, Yoshimura М, Subach FV, Zhang J, Gruenwald D, Souslova EA, Chudakov DM, Verkhusha VV. Conversion of red fluorescent protein into a bright blue probe. Chem Biol. 2008 Oct 20; 15(10).
25. Pletnev S, Shcherbo D, Chudakov DM, Pletneva N, Merzlyak EM, Wlodawer A, Dauter Z, Pletnev V.A Crystallographic Study of Bright Far-Red Fluorescent Protein mKate Reveals pH-induced cis-trans Isomerization of the Chromophore. J Biol Chem. 2008 Oct 24;283(43):28980-7.
26. М.Ю. Захарова, C.A. Дубилей, Д.М. Чудаков, А.Г. Габибов, И.Г. Шемякин, А.В. Колесников. Субстратная специфичность летального фактора сибирской язвы .Докл. Академии Наук. 2008;418:14-7. (получен и использован сенсор на основе FRET-пары флуоресцентных белков).
27. Shcherbo D, Murphy CS, Ermakova GV, Solovieva EA, Chepurnykh TV, Shcheglov AS, Verkhusha W, Pletnev VZ, Hazelwood KL, Roche PM, Lukyanov S, Zaraisky AG, Davidson MW, Chudakov DM. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 2009 Mar 15;418(3):567-74.
28. Mutoh H, Perron A, Dimitrov D, Iwamoto Y, Akemann W, Chudakov DM, Knopfel T. Spectrally-resolved response properties of the three most advanced FRET based fluorescent protein voltage probes. PLoS ONE. 2009;4(2):e4555.
29. Shcherbo D, Souslova EA, Goedhart J, Chepurnykh TV, Gaintzeva A, Shemiakina II, Gadella TW, Lukyanov S, Chudakov DM. Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins. BMC Biotechnol. 2009 Mar 25;9:24.
30. Zakharova MY, Kuznetcov NA, Dubiley SA, Kozyr AV, Fedorova OS, Chudakov DM, Knorre DG, Shemyakin IG, Gabibov AG, Kolesnikov AV. Substrate recognition of anthrax lethal factor examined by combinatorial and pre-steady-state kinetic approaches. J Biol Chem. 2009 Jul 3;284(27): 1790213. (получен и использован сенсор на основе FRET-пары флуоресцентных белков).
31. Bogdanov AM, Mishin AS, Yampolsky IV, Belousov VV, Chudakov DM, Subach FV, Verkhusha VV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Green fluorescent proteins are light-induced electron donors. Nature Chem Biol. 2009 Jul;5(7):459-61.
32. Pletnev S, Gurskaya NG, Pletneva NV, Lukyanov KA, Chudakov DM, Martynov VI, Popov VO, Kovalchuk MV, Wlodawer A, Dauter Z, Pletnev V. Structural basis for phototoxicity of the genetically encoded photosensitizer KillerRed. J Biol Chem. 2009 Nov 13;284(46):32028-39.
33. Bogdanov AM, Bogdanova EA, Chudakov DM, Gorodnicheva TV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Cell culture medium affects GFP photostability: a solution. Nature Methods. 2009 Dec;6(12):859-60.
34. Guo F, Liu B, Tang F, Lane S, Souslova EA, Chudakov DM, Paton JF, Kasparov S. Astroglia are a possible cellular substrate of angiotensin(l-7) effects in the rostral ventro-lateral medulla. Cardiovasc Res. 2010 Aug l;87(3):578-84. (тестирование и применение генетически кодируемого кальциевого сенсора Case 12).
35. Koutsopolous OS, Laine D., Osellame LD, Chudakov DM, Parton RG, Frazier AE, Ryan MT. Human Miltons associate with mitochondria and induce microtubule-dependent remodeling of mitochondrial networks. BBA -Molecular Cell Research, 2010 May;1803(5):564-74. (тестирование и применение флуоресцентных и фотоактивируемых флуоресцентных белков).
36. JL Чжан, Н. Г. Гурская, Е. Е. Копанцева, Н. Н. Мудрик, JI. Л. Вагнер, К. А. Лукьянов, Д. М. Чудаков. Выявление аминокислотных остатков, ответственных за способность к обратимой фотоконверсии мономерного красного флуоресцентного белка TagRFP. Биоорган, химия, 2010, 36(2); 187-192.
37. Zhdanov AV, Ward MW, Taylor CT, Souslova EA, Chudakov DM, Prehn JH, Papkovsky DB. Extracellular calcium depletion transiently elevates oxygen consumption in neurosecretory PC 12 cells through activation of mitochondrial Na(+)/Ca(2+) exchange. Biochim Biophys Acta. 2010 Sep;1797(9):1627-1637. (тестирование и применение генетически кодируемого кальциевого сенсора Case 12).
38. Leder L, Stark W, Freuler F, Marsh M, Meyerhofer M, Stettler T, Mayr LM, Britanova OV, Strukova LA, Chudakov DM, Souslova EA. The Structure of Ca2+ Sensor Case 16 Reveals the Mechanism of Reaction to Low Ca2+ Concentrations. Sensors. 2010, 10(9), 8143-8160; doi:10.3390/sl00908143.
39. Shcherbo D, Shemiakina II, Ryabova AV, Luker KE, Schmidt ВТ, Souslova EA, Gorodnicheva TV, Strukova L, Shidlovskiy KM, Britanova OV, Zaraisky AG, Lukyanov KA, Loschenov VB, Luker GD, Chudakov DM. Near-infrared fluorescent proteins. Nature Methods. 2010 Oct;7(10):827-9.
40. Teh C, Chudakov DM, Poon K, Mamedov IZ, Sek J, Shidlovsky K, Lukyanov S, and Korzh V. Optogenetic in vivo cell manipulation in KillerRed-expressing zebrafish transgenics. BMC Developmental Biology. 2010 Nov 2; 10:110.
41. M. Figueiredo, S. Lane, F. Tang, B-H. Liu, N. Marina, V. Kasymov, E. A. Souslova, D.M. Chudakov, A. Gourine, A.G. Teschemacher, S. Kasparov. Optogenetic experimentation on astrocytes. Experimental Physiology. 2011 Jan;96(l):40-50.
42. Light-induced blockage of cell division with a chromatin-targeted phototoxic fluorescent protein. Serebrovskaya EO, Gorodnicheva TV, Ermakova GV, Solovieva EA, Sharonov GV, Zagaynova EV, Chudakov DM, Lukyanov S, Zaraisky AG, Lukyanov KA. Biochem J. 2011 doi:10.1042/BJ20101217.
Главы в книгах:
1. Chudakov D.M., and Lukyanov K.A. (2005) Using photoactivatable GFPs to study protein dynamics and function. In Jorde, L.B., Little, P.F.R., Dunn, MJ. and Subramaniam, S. (Eds), Encyclopedia of Genetics, Genomics, Proteomics and Bioinformatics. John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2129-2137.
2. Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Fradkov A.F., Labas Y.A., Matz M.V. and Lukyanov SA. (2005) Discovery and properties of GFP-like proteins from non-bioluminescent Anthozoa In: Green fluorescent protein: properties, applications and protocols. 2nd edition, Chalfie, M., Kain, S., Eds., John Wiley & Sons Ltd, New Jersey, 121-138.
Патенты:
1. United States Patent 7,638,615. Fluorescent proteins and methods for using same. Issued December 29, 2009, Inventors: Lukyanov; Sergey A. (Moscow, RU), Chudakov; Dmitry M. (Moscow, RU).
2. Европейский патент ЕР 1994149 - Novel fluorescent proteins and methods for using same. Inventors: Lukyanov; Sergey A. (Moscow, RU), Chudakov; Dmitry M. (Moscow, RU).
3. Патент РФ № 2395581. Новые флуоресцентные белки из Entacmaea quadricolor и способ их получения. Авторы: Лукьянов Сергей Анатольевич (RU), Чудаков Дмитрий Михайлович (RU).
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Чудаков, Дмитрий Михайлович, Москва
1. Abbe E (1873) Beitrage zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrmehmung. Arc F Mikr Anat 9: 413-420
2. Ai HW, Hazelwood KL, Davidson MW, Campbell RE (2008) Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat Methods 5: 401-403
3. Ai HW, Shaner NC, Cheng Z, Tsien RY, Campbell RE (2007) Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins. Biochemistry 46: 5904-5910
4. Alieva NO, Konzen KA, Field SF, Meleshkevitch EA, Hunt ME, Beltran-Ramirez V, Miller DJ, Wiedenmann J, Salih A, Matz MV (2008) Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE 3: e2680
5. Ando R, Flors C, Mizuno H, Hofkens J, Miyawaki A (2007) Highlighted generation of fluorescence signals using simultaneous two-color irradiation on Dronpa mutants. Biophys J 92: L97-99
6. Ando R, Hama H, Yamamoto-Hino M, Mizuno H, Miyawaki A (2002) An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sei U S A 99: 12651-12656
7. Ando R, Mizuno H, Miyawaki A (2004) Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting. Science 306: 1370-1373
8. Andresen M, Stiel AC, Foiling J, Wenzel D, Schonle A, Egner A, Eggeling C, Hell SW, Jakobs S (2008) Photoswitchable fluorescent proteins enable monochromatic multilabel imaging and dual color fluorescence nanoscopy. Nat Biotechnol 26: 1035-1040
9. Andresen M, Stiel AC, Trowitzseh S, Weber G, Eggeling C, Wahl MC, Hell SW, Jakobs S (2007) Structural basis for reversible photoswitching in Dronpa. Proc Natl Acad Sei U S A 104: 13005-13009
10. Andresen M, Wahl MC, Stiel AC, Grater F, Schafer LV, Trowitzseh S, Weber G, Eggeling C, Grubmuller H, Hell SW et al (2005) Structure and mechanism of the reversible photoswitch of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sei USA 102: 13070-13074
11. Ashby MC, Ibaraki K, Henley JM (2004) It's green outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP. Trends Neurosci 27: 257-261
12. Ataka K, Pieribone VA (2002) A genetically targetable fluorescent probe of channel gating with rapid kinetics. Biophys J 82: 509-516
13. Awaji T, Hirasawa A, Shirakawa H, Tsujimoto G, Miyazaki S (2001) Novel green fluorescent protein-based ratiometric indicators for monitoring pH in defined intracellular microdomains. Biochem Biophys Res Commun 289: 457-462
14. Bacia K, Kim SA, Schwüle P (2006) Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nat Methods 3: 83-89
15. Baehler PJ, Biondi RM, van Bemmelen M, Veron M, Reymond CD (2002) Random insertion of green fluorescent protein into the regulatory subunit of cyclic adenosine monophosphate-dependent protein kinase. Methods Mol Biol 183: 5768
16. Baird GS, Zacharias DA, Tsien RY (1999) Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sei USA 96: 11241-11246
17. Baird GS, Zacharias DA, Tsien RY (2000) Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc Natl Acad Sei US A 97: 11984-11989
18. Baker BJ, Mutoh H, Dimitrov D, Akemann W, Perron A, Iwamoto Y, Jin L, Cohen LB, Isacoff EY, Pieribone VA et al (2008) Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Biol 36: 53-67
19. Baltrusch S, Lenzen S (2008) Monitoring of glucose-regulated single insulin secretory granule movement by selective photoactivation. Diabetologia 51: 989996
20. Barondeau DP, Kassmann CJ, Tainer JA, Getzoff ED (2002) Structural chemistry of a green fluorescent protein Zn biosensor. J Am Chem Soc 124: 3522-3524
21. Bastiaens PI, Squire A (1999) Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol 9: 48-52
22. Baudendistel N, Muller G, Waldeck W, Angel P, Langowski J (2005) Two-hybrid fluorescence cross-correlation spectroscopy detects protein-protein interactions in vivo. Chemphyschem 6: 984-990
23. Baumann D, Cook M, Ma L, Mushegian A, Sanders E, Schwartz J, Yu CR (2008) A family of GFP-like proteins with different spectral properties in lancelet Branchiostoma floridae. Biol Direct 3: 28
24. Beach DL, Salmon ED, Bloom K (1999) Localization and anchoring of mRNA in budding yeast. CurrBiol 9: 569-578
25. Belousov VV, Fradkov AF, Lukyanov KA, Staroverov DB, Shakhbazov KS, Terskikh AV, Lukyanov S (2006) Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods 3: 281-286
26. Bertrand E, Chartrand P, Schaefer M, Shenoy SM, Singer RH, Long RM (1998) Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell 2: 437-445
27. Bomati EK, Manning G, Deheyn DD (2009) Amphioxus encodes the largest known family of green fluorescent proteins, which have diversified into distinct functional classes. BMC Evol Biol 9: 77
28. Bulina ME, Chudakov DM, Britanova OV, Yanushevich YG, Staroverov DB, Chepurnykh TV, Merzlyak EM, Shkrob MA, Lukyanov S, Lukyanov KA (2006) A genetically encoded photosensitizer. Nat Biotechnol 24: 95-99
29. Cabantous S, Terwilliger TC, Waldo GS (2005b) Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein. Nat Biotechnol 23: 102-107
30. Cabantous S, Waldo GS (2006) In vivo and in vitro protein solubility assays using split GFP. Nat Methods 3: 845-854
31. Carlson HJ, Campbell RE (2009) Genetically encoded FRET-based biosensors for multiparameter fluorescence imaging. Curr Opin Biotechnol 20: 19-27
32. Cavanagh HD, Petroll WM, Jester JV (1993) The application of confocal microscopy to the study of living systems. Neurosci Biobehav Rev 17: 483-498
33. Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263: 802-805
34. Chapman S, Faulkner C, Kaiserli E, Garcia-Mata C, Savenkov EI, Roberts AG, Oparka KJ, Christie JM (2008) The photoreversible fluorescent protein iLOV outperforms GFP as a reporter of plant virus infection. Proc Natl Acad Sci USA 105: 20038-20043
35. Chudakov DM, Belousov VV, Zaraisky AG, Novoselov VV, Staroverov DB, Zorov DB, Lukyanov S, Lukyanov KA (2003a) Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nat Biotechnol 21: 191-194
36. Chudakov DM, Feofanov AV, Mudrik NN, Lukyanov S, Lukyanov KA (2003b) Chromophore environment provides clue to "kindling fluorescent protein" riddle. J Biol Chem 278: 7215-7219
37. Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA (2005) Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends Biotechnol 23: 605-613
38. Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA (2007a) Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nat Protoc 2: 2024-2032
39. Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA (2007b) Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques 42: 553, 555, 557 passim
40. Chudakov DM, Verkhusha VV, Staroverov DB, Souslova EA, Lukyanov S, Lukyanov KA (2004) Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nat Biotechnol 22: 1435-1439
41. Cody CW, Prasher DC, Westler WM, Prendergast FG, Ward WW (1993) Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein. Biochemistry 32: 1212-1218
42. Corish P, Tyler-Smith C (1999) Attenuation of green fluorescent protein half-life in mammalian cells. Protein Eng 12: 1035-1040
43. Cormack BP, Valdivia RH, Falkow S (1996) FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene 173: 33-38
44. Culter MW, Ward WW (1997) In Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons, Hastings JW, Kriska LJ, Stanley PE (eds) pp 403-406. New York: Wiley & Sons
45. Cvackova Z, Masata M, Stanek D, Fidlerova H, Raska I (2009) Chromatin position in human HepG2 cells: although being non-random, significantly changed in daughter cells. J Struct Biol 165: 107-117
46. Czirok A, Zach J, Kozel BA, Mecham RP, Davis EC, Rongish BJ (2006) Elastic fiber macro-assembly is a hierarchical, cell motion-mediated process. J Cell Physiol 207: 97-106
47. D'Angelo C, Denzel A, Vogt A, Matz MV, Oswald F, Salih A, Nienhaus G-U, Wiedenmann J (2008) Blue light regulation of GFP-like protein expression in reef-building corals. Mar Ecol Prog Ser 364: 97-106
48. Daigle N, Ellenberg J (2007) LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods 4: 633-636
49. Deheyn DD, Kubokawa K, McCarthy JK, Murakami A, Porrachia M, Rouse GW, Holland ND (2007) Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol Bull 213: 95-100
50. Demidov VV, Dokholyan NV, Witte-Hoffmann C, Chalasani P, Yiu HW, Ding F, Yu Y, Cantor CR, Broude NE (2006) Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization. Proc Natl Acad Sei U S A 103: 20522056
51. Denk W, Strickler JH, Webb WW (1990) Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science 248: 73-76
52. Dieguez-Hurtado R, Martin J, Martinez-Corral I, Martinez MD, Megias D, Olmeda D, Ortega S (2011) A Cre-reporter transgenic mouse expressing the far-red fluorescent protein Katushka. Genesis 49: 36-45
53. Dooley CT, Dore TM, Hanson GT, Jackson WC, Remington SJ, Tsien RY (2004) Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J Biol Chem 279: 22284-22293
54. Dove SG, Hoegh-Guldberg O, Ranganathan S (2001) Major colour patterns of reef-building corals are due to a family of GFP-like proteins. Coral Reefs 19: 197204
55. Dufour P, Dufour S, Castonguay A, McCarthy N, De Köninck Y (2006) Two-photon laser scanning fluorescence microscopy for functional cellular imaging: Advantages and challenges or One photon is good. but two is better! Med Sei (Paris) 22: 837-844
56. Duncan RR, Greaves J, Wiegand UK, Matskevich I, Bodammer G, Apps DK, Shipston MJ, Chow RH (2003) Functional and spatial segregation of secretory vesicle pools according to vesicle age. Nature 422: 176-180
57. Ehrig T, O'Kane DJ, Prendergast FG (1995) Green-fluorescent protein mutants with altered fluorescence excitation spectra. FEBS Lett 367: 163-166
58. Elowitz MB, Surette MG, Wolf PE, Stock J, Leibler S (1997) Photoactivation turns green fluorescent protein red. Curr Biol 7: 809-812
59. Evdokimov AG, Pokross ME, Egorov NS, Zaraisky AG, Yampolsky IV, Merzlyak EM, Shkoporov AN, Sander I, Lukyanov KA, Chudakov DM (2006) Structural basis for the fast maturation of Arthropoda green fluorescent protein. EMBO Rep 7: 1006-1012
60. Falk MM, Baker SM, Gumpert AM, Segretain D, Buckheit RW, 3rd (2009) Gap Junction Turnover Is Achieved by the Internalization of Small Endocytic DoubleMembrane Vesicles. Mol Biol Cell 20: 3342-3352
61. Fan JY, Cui ZQ, Wei HP, Zhang ZP, Zhou YF, Wang YP, Zhang XE (2008) Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun 367: 47-53
62. Fernandez-Suarez M, Ting AY (2008) Fluorescent probes for super-resolution imaging in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol 9: 929-943
63. Field SF, Bulina MY, Kelmanson IV, Bielawski JP, Matz MV (2006) Adaptive evolution of multicolored fluorescent proteins in reef-building corals. J Mol Evol 62: 332-339
64. Förster T (1948) Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann Physik 55: 437
65. Forward RB (1988) Diel vertical migration: Zooplankton photobiology and behaviour. Oceanogr Mar Biiol Annu Rev 26: 361-393
66. Fradkov AF, Verkhusha W, Staroverov DB, Bulina ME, Yanushevich YG, Martynov VI, Lukyanov S, Lukyanov KA (2002) Far-red fluorescent tag for protein labelling. Biochem J 368: 17-21
67. Fraser ST, Hadjantonakis AK, Sahr KE, Willey S, Kelly OG, Jones EA, Dickinson ME, Baron MH (2005) Using a histone yellow fluorescent protein fusion for tagging and tracking endothelial cells in ES cells and mice. Genesis 42: 162-171
68. Fusco D, Accornero N, Lavoie B, Shenoy SM, Blanchard JM, Singer RH, Bertrand E (2003) Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. CurrBiol 13: 161-167
69. Galperin E, Verkhusha W, Sorkin A (2004) Three-chromophore FRET microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells. Nat Methods 1: 209-217
70. Gandia J, Galino J, Amaral OB, Soriano A, Lluis C, Franco R, Ciruela F (2008) Detection of higher-order G protein-coupled receptor oligomers by a combined BRET-BiFC technique. FEBS Lett 582: 2979-2984
71. Gasser SM (2002) Visualizing chromatin dynamics in interphase nuclei. Science 296: 1412-1416
72. Gautam SG, Perron A, Mutoh H, Knopfel T (2009) Exploration of fluorescent protein voltage probes based on circularly permuted fluorescent proteins. Front Neuroengineering 2: 14
73. Giordano L, Jovin TM, Irie M, Jares-Erijman EA (2002) Diheteroarylethenes as thermally stable photoswitchable acceptors in photochromic fluorescence resonance energy transfer (pcFRET). J Am Chem Soc 124: 7481-7489
74. Goedhart J, Vermeer JE, Adjobo-Hermans MJ, van Weeren L, Gadella TW, Jr. (2007) Sensitive detection of p65 homodimers using red-shifted and fluorescent protein-based FRET couples. PLoS ONE 2: el011
75. Gourine AV, Kasymov V, Marina N, Tang F, Figueiredo MF, Lane S, Teschemacher AG, Spyer KM, Deisseroth K, Kasparov S (2010) Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP. Science 329: 571-575
76. Griesbeck O (2004) Fluorescent proteins as sensors for cellular functions. Curr Opin Neurobiol 14: 636-641
77. Grinberg AV, Hu CD, Kerppola TK (2004) Visualization of Myc/Max/Mad family dimers and the competition for dimerization in living cells. Mol Cell Biol 24: 4294-4308
78. Gross LA, Baird GS, Hoffman RC, Baldridge KK, Tsien RY (2000) The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 11990-11995.
79. Guo Y, Rebecchi M, Scarlata S (2005) Phospholipase Cbeta2 binds to and inhibits phospholipase Cdeltal. J Biol Chem 280: 1438-1447
80. Gurskaya NG, Savitsky AP, Yanushevich YG, Lukyanov SA, Lukyanov KA (2001) Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis. BMC Biochem 2: 6
81. Gurskaya NG, Verkhusha VV, Shcheglov AS, Staroverov DB, Chepurnykh TV, Fradkov AF, Lukyanov S, Lukyanov KA (2006) Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat Biotechnol 24: 461-465
82. Gusev VE, Karabutov AA (1993) Laser Optoacoustics, New York: American Institute of Physics
83. Gustafsson MG, Agard DA, Sedat JW (1999) I5M: 3D widefield light microscopy with better than 100 nm axial resolution. J Microsc 195: 10-16
84. Habuchi S, Ando R, Dedecker P, Verheijen W, Mizuno H, Miyawaki A, Hofkens J (2005) Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 9511-9516
85. Halin C, Rodrigo Mora J, Sumen C, von Andrian UH (2005) In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu Rev Cell Dev Biol 21: 581-603
86. Hanson GT, Aggeler R, Oglesbee D, Cannon M, Capaldi RA, Tsien RY, Remington SJ (2004) Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J Biol Chem 279: 13044-13053
87. Harpur AG, Wouters FS, Bastiaens PI (2001) Imaging FRET between spectrally similar GFP molecules in single cells. Nat Biotechnol 19: 167-169
88. Heim R, Cubitt AB, Tsien RY (1995) Improved green fluorescence. Nature 373: 663-664
89. Heim R, Prasher DC, Tsien RY (1994) Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A 91: 1250112504
90. Heim R, Tsien RY (1996) Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. Curr Biol 6: 178-182
91. Hell SW (2007) Far-field optical nanoscopy. Science 316: 1153-1158
92. Hell SW, Stelzer EHK (1992) Fundamental improvement of resolution with a 4Pi-confocal fluorescence microscope using two-photon excitation. Opt Comm 93: 277-282
93. Henderson JN, Ai HW, Campbell RE, Remington SJ (2007) Structural basis for reversible photobleaching of a green fluorescent protein homologue. Proc Natl Acad Sci U S A 104: 6672-6677
94. Henderson JN, Gepshtein R, Heenan JR, Kallio K, Huppert D, Remington SJ (2009) Structure and mechanism of the photoactivatable green fluorescent protein. J Am Chem Soc 131:4176-4177
95. Henderson JN, Remington SJ (2005) Crystal structures and mutational analysis of amFP486, a cyan fluorescent protein from Anemonia majano. Proc Natl Acad Sci US A 102: 12712-12717
96. Henikoff S, Ahmad K, Platero JS, van Steensel B (2000) Heterochromatic deposition of centromeric histone H3-like proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 716-721
97. Hess ST, Girirajan TP, Mason MD (2006) Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J 91: 4258-4272
98. Hess ST, Gould TJ, Gudheti MV, Maas SA, Mills KD, Zimmerberg J (2007) Dynamic clustered distribution of hemagglutinin resolved at 40 nm in living cell membranes discriminates between raft theories. Proc Natl Acad Sci USA 104: 17370-17375
99. Heydorn A, Lundholt BK, Praestegaard M, Pagliaro L (2006) Protein translocation assays: key tools for accessing new biological information with high-throughput microscopy. Methods Enzymol 414: 513-530
100. Hirrlinger PG, Scheller A, Braun C, Quintela-Schneider M, Fuss B, Hirrlinger J, Kirchhoff F (2005) Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice. Mol Cell Neurosci 30: 291-303
101. Ho SN, Hunt HD, Horton RM, Pullen JK, Pease LR (1989) Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene 77: 51-59
102. Hoffman RM (2002a) Green fluorescent protein imaging of tumor cells in mice. Lab Anim (NY) 31: 34-41
103. Hoffman RM (2002b) In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ 9: 786-789
104. Hoffman RM (2002c) Whole-body fluorescence imaging with green fluorescence protein. Methods Mol Biol 183: 135-148
105. Hoffman RM (2004a) Imaging tumor angiogenesis with fluorescent proteins. APMIS 112: 441-449
106. Hoffman RM (2004b) In vivo imaging with fluorescent proteins: the new cell biology. Acta Histochem 106: 77-87
107. Hoffman RM (2005a) Advantages of multi-color fluorescent proteins for whole-body and in vivo cellular imaging. J Biomed Opt 10: 41202
108. Hoffman RM (2005b) In vivo cell biology of cancer cells visualized with fluorescent proteins. Curr Top Dev Biol 70: 121-144
109. Hoffman RM (2005c) The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nat Rev Cancer 5: 796-806
110. Hoffman RM (2008a) A better fluorescent protein for whole-body imaging. Trends Biotechnol 26: 1-4
111. Hoffman RM (2008b) Recent advances on in vivo imaging with fluorescent proteins. Methods Cell Biol 85: 485-495
112. Hoffman RM (2009) Imaging cancer dynamics in vivo at the tumor and cellular level with fluorescent proteins. Clin Exp Metastasis 26: 345-355
113. Hoffman RM, Yang M (2006) Whole-body imaging with fluorescent proteins. Nat Protoc 1: 1429-1438
114. Hopf M, Gohring W, Mann K, Timpl R (2001a) Mapping of binding sites for nidogens, fibulin-2, fibronectin and heparin to different IG modules of perlecan. J Mol Biol 311: 529-541
115. Hopf M, Gohring W, Ries A, Timpl R, Hohenester E (2001b) Crystal structure and mutational analysis of a perlecan-binding fragment of nidogen-1. Nat Struct Biol 8: 634-640
116. Hu CD, Chinenov Y, Kerppola TK (2002) Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell 9: 789-798
117. Hu CD, Kerppola TK (2003) Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat Biotechnol 21: 539-545
118. Huisken J, Swoger J, Del Bene F, Wittbrodt J, Stelzer EH (2004) Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science 305: 1007-1009
119. Jach G, Pesch M, Richter K, Frings S, Uhrig JF (2006) An improved mRFPl adds red to bimolecular fluorescence complementation. Nat Methods 3: 597-600
120. Jakobs S, Schauss AC, Hell SW (2003) Photoconversion of matrix targeted GFP enables analysis of continuity and intermixing of the mitochondrial lumen. FEBS Lett 554: 194-200
121. Jares-Erijman EA, Jovin TM (2006) Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr Opin Chem Biol 10: 409-416
122. Jayaraman S, Haggie P, Wachter RM, Remington SJ, Verkman AS (2000) Mechanism and cellular applications of a green fluorescent protein-based halide sensor. J Biol Chem 275: 6047-6050
123. Johnson DE, Ai HW, Wong P, Young JD, Campbell RE, Casey J (2009) Red fluorescent protein pH biosensor to detect concentrative nucleoside transport. J Biol Chem 284: 20499-20511
124. Johnson FH, Shimomura O, Saiga Y, Gershman LC, Reynolds GT, Waters JR (1962) Quantum efficiency of Cypridina luminescence, with a note on that of Aequorea. J Cell Comp Physiol 60: 85-103
125. Kanda T, Sullivan KF, Wahl GM (1998) Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol 8: 377-385
126. Karasawa S, Araki T, Nagai T, Mizuno H, Miyawaki A (2004) Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer. Biochem J 381: 307-312
127. Kato N, Lam E (2001) Detection of chromosomes tagged with green fluorescent protein in live Arabidopsis thaliana plants. Genome Biol 2: RESEARCH0045
128. Kawaguti S (1944) On the physiology of reef corals. VI. Study of the pigments. Palao Trop Biol Stn Stud 2: 617-674
129. Kawai Y, Sato M, Umezawa Y (2004) Single color fluorescent indicators of protein phosphorylation for multicolor imaging of intracellular signal flow dynamics. Anal Chem 76: 6144-6149
130. Kerppola TK (2006) Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation. Nat Rev Mol Cell Biol 7: 449-456
131. Kerppola TK (2008) Bimolecular fluorescence complementation: visualization of molecular interactions in living cells. Methods Cell Biol 85: 431-470
132. Kettling U, Koltermann A, Schwille P, Eigen M (1998) Real-time enzyme kinetics monitored by dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A 95: 1416-1420
133. Kikuchi A, Fukumura E, Karasawa S, Mizuno H, Miyawaki A, Shiro Y (2008) Structural characterization of a thiazoline-containing chromophore in an orange fluorescent protein, monomeric Kusabira Orange. Biochemistry 47: 11573-11580
134. Kim SA, Heinze KG, Bacia K, Waxham MN, Schwille P (2005) Two-photon cross-correlation analysis of intracellular reactions with variable stoichiometry. Biophys J 88: 4319-4336
135. Kim SA, Heinze KG, Waxham MN, Schwille P (2004) Intracellular calmodulin availability accessed with two-photon cross-correlation. Proc Natl Acad Sci USA 101: 105-110
136. Kim SA, Schwille P (2003) Intracellular applications of fluorescence correlation spectroscopy: prospects for neuroscience. Curr Opin Neurobiol 13: 583-590
137. Kirber MT, Chen K, Keaney JF, Jr. (2007) YFP photoconversion revisited: confirmation of the CFP-like species. Nat Methods 4: 767-768
138. Knauer SK, Moodt S, Berg T, Liebel U, Pepperkok R, Stauber RH (2005) Translocation biosensors to study signal-specific nucleo-cytoplasmic transport, protease activity and protein-protein interactions. Traffic 6: 594-606
139. Kneen M, Farinas J, Li Y, Verkman AS (1998) Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys J 74: 1591-1599
140. Knopfel T, Tomita K, Shimazaki R, Sakai R (2003) Optical recordings of membrane potential using genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Methods 30: 42-48
141. Kodama Y, Wada M (2009) Simultaneous visualization of two protein complexes in a single plant cell using multicolor fluorescence complementation analysis. Plant Mol Biol 70:211-217
142. Kogure T, Karasawa S, Araki T, Saito K, Kinjo M, Miyawaki A (2006) A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat Biotechnol 24: 577-581
143. Kohl T, Heinze KG, Kuhlemann R, Koltermann A, Schwille P (2002) A protease assay for two-photon crosscorrelation and FRET analysis based solely on fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 12161-12166
144. Konig K (2000) Multiphoton microscopy in life sciences. J Microsc 200: 83-104
145. Koster AJ, Klumperman J (2003) Electron microscopy in cell biology: integrating structure and function. Nat Rev Mol Cell Biol Suppl: SS6-10
146. Kozel BA, Rongish BJ, Czirok A, Zach J, Little CD, Davis EC, Knutsen RH, Wagenseil JE, Levy MA, Mecham RP (2006) Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters. J Cell Physiol 207: 8796
147. Kremers GJ, Goedhart J (2008) Visible fluorescent proteins for FRET" in "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. "FRET and FLIM Techniques" 33: 171-224
148. Kremers GJ, Goedhart J, van den Heuvel DJ, Gerritsen HC, Gadella TW, Jr.2007) Improved green and blue fluorescent proteins for expression in bacteria and mammalian cells. Biochemistry 46: 3775-3783
149. Kremers GJ, Goedhart J, van Munster EB, Gadella TW, Jr. (2006) Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius. Biochemistry 45: 6570-6580
150. Kremers GJ, Hazelwood KL, Murphy CS, Davidson MW, Piston DW (2009) Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nat Methods 6: 355-358
151. Kremers GJ, Piston DW (2008) Turning fluorescent proteins into energy-saving light bulbs. Nat Methods 5: 472-473
152. X, Zhao X, Fang Y, Jiang X, Duong T, Fan C, Huang CC, Kain SR (1998) Generation of destabilized green fluorescent protein as a transcription reporter. J Biol Chem 273: 34970-34975
153. Magliery TJ, Wilson CG, Pan W, Mishler D, Ghosh I, Hamilton AD, Regan L (2005) Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: scope and mechanism. J Am Chem Soc 127: 146-157
154. Malinouski M, Zhou Y, Belousov W, Hatfield DL, Gladyshev VN (2011) Hydrogen peroxide probes directed to different cellular compartments. PLoS ONE 6:el4564
155. Mank M, Santos AF, Direnberger S, Mrsic-Flogel TD, Hofer SB, Stein V, Hendel T, Reiff DF, Levelt C, Borst A et al (2008) A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nat Methods 5: 805-811
156. Manley S, Gillette JM, Patterson GH, Shroff H, Hess HF, Betzig E, Lippincott-Schwartz J (2008) High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat Methods 5: 155-157
157. Marchant JS, Stutzmann GE, Leissring MA, LaFerla FM, Parker I (2001) Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol 19: 645-649
158. Marriott G, Mao S, Sakata T, Ran J, Jackson DK, Petchprayoon C, Gomez TJ, Warp E, Tulyathan O, Aaron HL et al (2008) Optical lock-in detection imaging microscopy for contrast-enhanced imaging in living cells. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 17789-17794
159. Marshall NJ, Cronin TW, Frank TM (2003) Visual adaptations in crustaceans: Chromatic, developmental, and temporal aspects. In Sensory Processing in Aquatic Environments., Collin SP, Marshall NJ (eds) pp 343-372. New York: Springer
160. Martynov VI, Maksimov BI, Martynova NY, Pakhomov AA, Gurskaya NG, Lukyanov SA (2003) A purple-blue chromoprotein from Goniopora tenuidens belongs to the DsRed subfamily of GFP-like proteins. J Biol Chem 278: 4628846292
161. Martynova N, Eroshkin F, Ermakova G, Bayramov A, Gray J, Grainger R, Zaraisky A (2004) Patterning the forebrain: FoxA4a/Pintallavis and Xvent2 determine the posterior limit of Xanfl expression in the neural plate. Development 131:2329-2338
162. Matz MV, Fradkov AF, Labas YA, Savitsky AP, Zaraisky AG, Markelov ML, Lukyanov SA (1999) Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol 17: 969-973
163. Matz MV, Labas YA, Ugalde J (2006a) Evolution of functions and color in GFP-like proteins. In Green Fluorescent Protein: Properties, Applications and Protocols, 2nd ed., Chalfie M, Kain, S. R. (ed). Wiley
164. Matz MV, Marshall NJ, Vorobyev M (2006b) Are corals colorful? Photochem Photobiol 82: 345-350
165. Matzke AJ, Huettel B, van der Winden J, Matzke M (2005) Use of two-color fluorescence-tagged transgenes to study interphase chromosomes in living plants. Plant Physiol 139: 1586-1596
166. Mazel CH, Lesser MP, Gorbunov MY, Barry TM, Farrell JH, Wyman KD, Falkowski PG (2003) Green-fluorescent proteins in Caribbean corals. Limnol Oceanogr 48: 402-411
167. McAnaney TB, Park ES, Hanson GT, Remington SJ, Boxer SG (2002) Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 2. Excited-state dynamics. Biochemistry 41: 15489-15494
168. McKinney SA, Murphy CS, Hazelwood KL, Davidson MW, Looger LL (2009) A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods 6: 131133
169. Mempel TR, Scimone ML, Mora JR, von Andrian UH (2004) In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr Opin Immunol 16: 406-417
170. Mena MA, Treynor TP, Mayo SL, Daugherty PS (2006) Blue fluorescent proteins with enhanced brightness and photostability from a structurally targeted library. Nat Biotechnol 24: 1569-1571
171. Merzlyak EM, Goedhart J, Shcherbo D, Bulina ME, Shcheglov AS, Fradkov AF, Gaintzeva A, Lukyanov KA, Lukyanov S, Gadella TW et al (2007) Bright monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime. Nat Methods 4: 555-557
172. Miesenböck G, De Angelis DA, Rothman JE (1998) Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature 394: 192-195
173. Mirabella R, Franken C, van der Krogt GN, Bisseling T, Geurts R (2004) Use of the fluorescent timer DsRED-E5 as reporter to monitor dynamics of gene activity in plants. Plant Physiol 135: 1879-1887
174. Mishin AS, Subach FV, Yampolsky IV, King W, Lukyanov KA, Verkhusha W (2008) The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry 47: 4666-4673
175. Mishina NM, Tyurin-Kuzmin PA, Markvicheva KN, Vorotnikov AV, Tkachuk VA, Laketa V, Schultz C, Lukyanov S, Belousov VV (2011) Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally? Antioxid Redox Signal 14: 1-7
176. Miyatsuka T, Li Z, German MS (2009) The chronology of islet differentiation revealed by temporal cell labeling. Diabetes 58: 1863-1868
177. Miyawaki A (2003) Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. Dev Cell 4: 295-305
178. Miyawaki A, Tsien RY (2000) Monitoring protein conformations and interactions by fluorescence resonance energy transfer between mutants of green fluorescent protein. Methods Enzymol 327: 472-500
179. Mizuno H, Mal TK, Tong Kl, Ando R, Furuta T, Ikura M, Miyawaki A (2003) Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein. Mol Cell 12: 1051-1058
180. Mohun TJ, Garrett N, Gurdon JB (1986) Upstream sequences required for tissue-specific activation of the cardiac actin gene in Xenopus laevis embryos. EMBO J 5:3185-3193
181. Molina AJ, Shirihai OS (2009) Monitoring mitochondrial dynamics with photoactivatable green fluorescent protein. Methods Enzymol 457: 289-304
182. Morin JG (1983) Coastal bioluminescence: patterns and functions. Bull Mar Sci 33: 787-817
183. Morin JG, Hastings JW (1971) Energy transfer in a bioluminescent system. J Cell Physiol 77: 313-318
184. Morise H, Shimomur.O, Johnson FH, Winant J (1974) Intermolecular Energy-Transfer in Bioluminescent System of Aequorea. Biochemistry 13: 2656-2662
185. Murata Y, Iwasaki H, Sasaki M, Inaba K, Okamura Y (2005) Phosphoinositide phosphatase activity coupled to an intrinsic voltage sensor. Nature 435: 1239-1243
186. Nagai T, Ibata K, Park ES, Kubota M, Mikoshiba K, Miyawaki A (2002) A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat Biotechnol 20: 87-90
187. Nagai T, Sawano A, Park ES, Miyawaki A (2001) Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 3197-3202
188. Nagai T, Yamada S, Tominaga T, Ichikawa M, Miyawaki A (2004) Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 10554-10559
189. Nakai J, Ohkura M, Imoto K (2001) A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol 19: 137-141
190. Nakanishi T, Ikawa M, Yamada S, Toshimori K, Okabe M (2001) Alkalinization of acrosome measured by GFP as a pH indicator and its relation to sperm capacitation. Dev Biol 237: 222-231
191. Nienhaus K, Nar H, Heilker R, Wiedenmann J, Nienhaus GU (2008) Trans-cis isomerization is responsible for the red-shifted fluorescence in variants of the red fluorescent protein eqFP611. J Am Chem Soc 130: 12578-12579
192. Nienhaus K, Vallone B, Renzi F, Wiedenmann J, Nienhaus GU (2003) Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of the red fluorescent protein eqFP611. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 59: 1253-1255
193. Nyqvist D, Mattsson G, Kohler M, Lev-Ram V, Andersson A, Carlsson PO, Nordin A, Berggren PO, Jansson L (2005) Pancreatic islet function in a transgenic mouse expressing fluorescent protein. J Endocrinol 186: 333-341
194. Ohashi T, Galiacy SD, Briscoe G, Erickson HP (2007) An experimental study of GFP-based FRET, with application to intrinsically unstructured proteins. Protein Sci 16: 1429-1438
195. Ohkura M, Matsuzaki M, Kasai H, Imoto K, Nakai J (2005) Genetically encoded bright Ca2+ probe applicable for dynamic Ca2+ imaging of dendritic spines. Anal Chem 77: 5861-5869
196. Ormo M, Cubitt AB, Kallio K, Gross LA, Tsien RY, Remington SJ (1996) Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science 273: 13921395
197. Ozawa T, Natori Y, Sato M, Umezawa Y (2007) Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods 4: 413-419
198. Pakhomov AA, Pletneva NY, Balashova TA, Martynov VI (2006) Structure and reactivity of the chromophore of a GFP-like chromoprotein from Condylactis gigantea. Biochemistry 45: 7256-7264
199. Palmer AE, Giacomello M, Kortemme T, Hires SA, Lev-Ram V, Baker D, Tsien RY (2006) Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs. Chem Biol 13: 521-530
200. Partridge JC (1990) The colour sensitivity and vision of fishes. In Light and life in the sea, Herring PJ, Campbell AK, Whitfield M, Maddock L (eds) pp 167-184. Cambridge: Cambridge University Press
201. Passamaneck YJ, Di Gregorio A, Papaioannou VE, Hadjantonakis AK (2006) Live imaging of fluorescent proteins in chordate embryos: from ascidians to mice. Microsc Res Tech 69: 160-167
202. Patterson GH, Lippincott-Schwartz J (2002) A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science 297: 1873-1877
203. Patterson GH, Lippincott-Schwartz J (2004) Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP. Methods 32: 445-450
204. Pedelacq JD, Cabantous S, Tran T, Terwilliger TC, Waldo GS (2006) Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol 24: 79-88
205. Pepperkok R, Squire A, Geley S, Bastiaens PI (1999) Simultaneous detection of multiple green fluorescent proteins in live cells by fluorescence lifetime imaging microscopy. Curr Biol 9: 269-272
206. Petersen J, Wilmann PG, Beddoe T, Oakley AJ, Devenish RJ, Prescott M, Rossjohn J (2003) The 2.0-A crystal structure of eqFP611, a far red fluorescent protein from the sea anemone Entacmaea quadricolor. J Biol Chem 278: 4462644631
207. Phair RD, Misteli T (2000) High mobility of proteins in the mammalian cell nucleus. Nature 404: 604-609
208. Piston DW, Kremers GJ (2007) Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci 32: 407-414
209. Plautz JD, Day RN, Dailey GM, Welsh SB, Hall JC, Halpain S, Kay SA (1996) Green fluorescent protein and its derivatives as versatile markers for gene expression in living Drosophila melanogaster, plant and mammalian cells. Gene 173: 83-87
210. Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, Prendergast FG, Cormier MJ (1992) Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 111 : 229-233
211. Prescott M, Ling M, Beddoe T, Oakley AJ, Dove S, Hoegh-Guldberg O, Devenish RJ, Rossjohn J (2003) The 2.2 A crystal structure of a pocilloporin pigment reveals a nonplanar chromophore conformation. Structure 11: 275-284
212. Querido E, Chartrand P (2008) Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells. Methods Cell Biol 85: 273-292
213. Quillin ML, Anstrom DM, Shu X, O'Leary S, Kallio K, Chudakov DM, Remington SJ (2005) Kindling Fluorescent Protein from Anemonia sulcata: Dark-State Structure at 1.38 A ResolutionQ. Biochemistry 44: 5774-5787
214. Rackham O, Brown CM (2004) Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J 23: 3346-3355
215. Razansky D, Baeten J, Ntziachristos V (2009a) Sensitivity of molecular target detection by multispectral optoacoustic tomography (MSOT). Med Phys 36: 939945
216. Razansky D, Distel M, Vinegoni C, Ma R, Perrimon N, KoËster RW, Ntziachristos V (2009b) Multispectral opto-acoustic tomography of deep-seated fluorescent proteins in vivo. Nat Photonics 3:412-417
217. Razansky D, Vinegoni C, Ntziachristos V (2009c) Imaging of mesoscopic-scale organisms using selective-plane optoacoustic tomography. Phys Med Biol 54: 2769-2777
218. Reid BG, Flynn GC (1997) Chromophore formation in green fluorescent protein. Biochemistry 36: 6786-6791
219. Remington SJ (2006) Fluorescent proteins: maturation, photochemistry and photophysics. Curr Opin Struct Biol
220. Remington SJ, Wächter RM, Yarbrough DK, Branchaud B, Anderson DC, Kallio K, Lukyanov KA (2005) zFP538, a yellow-fluorescent protein from Zoanthus, contains a novel three-ring chromophore. Biochemistry 44: 202-212
221. Rizzo MA, Springer GH, Granada B, Piston DW (2004) An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat Biotechnol 22: 445-449
222. Rizzuto R, Brini M, De Giorgi F, Rossi R, Heim R, Tsien RY, Pozzan T (1996) Double labelling of subcellular structures with organelle-targeted GFP mutants in vivo. Curr Biol 6: 183-188
223. Robinett CC, Straight A, Li G, Willhelm C, Sudlow G, Murray A, Belmont AS (1996) In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J Cell Biol 135: 1685-1700
224. Rocheleau JY, Edidin M, Piston DW (2003) Intrasequence GFP in class I MHC molecules, a rigid probe for fluorescence anisotropy measurements of the membrane environment. Biophys J 84: 4078-4086
225. Rodriguez AJ, Condeelis J, Singer RH, Dictenberg JB (2007) Imaging mRNA movement from transcription sites to translation sites. Semin Cell Dev Biol 18: 202-208
226. Rusanov AL, Ivashina TV, Vinokurov LM, Fiks, II, Orlova AG, Turchin IV, Meerovich IG, Zherdeva W, Savitsky AP (2010) Lifetime imaging of FRET between red fluorescent proteins. J Biophotonics 3: 774-783
227. Sakai R, Repunte-Canonigo V, Raj CD, Knopfel T (2001) Design and characterization of a DNA-encoded, voltage-sensitive fluorescent protein. Eur J Neurosci 13: 2314-2318
228. Sakaue-Sawano A, Kurokawa H, Morimura T, Hanyu A, Hama H, Osawa H, Kashiwagi S, Fukami K, Miyata T, Miyoshi H et al (2008) Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell 132: 487-498
229. Salih A, Larkum A, Cox G, Kuhl M (2000) Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature 408: 850-853
230. Sankaranarayanan S, De Angelis D, Rothman JE, Ryan TA (2000) The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys J 79: 21992208
231. Sato T, Takahoko M, Okamoto H (2006) HuC.'Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo. Genesis 44: 136-142
232. Sawin KE, Nurse P (1997) Photoactivation of green fluorescent protein. Curr Biol 7: R606-607
233. Schnitzler CE, Keenan RJ, McCord R, Matysik A, Christianson LM, Haddock SH (2008) Spectral diversity of fluorescent proteins from the anthozoan Corynactis californica. Mar Biotechnol (NY) 10: 328-342
234. Schultz C, Schleifenbaum A, Goedhart J, Gadella TW, Jr. (2005) Multiparameter imaging for the analysis of intracellular signaling. Chembiochem 6: 1323-1330
235. Schwille P, Meyer-Almes FJ, Rigler R (1997) Dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy for multicomponent diffusional analysis in solution. Biophys J 72: 1878-1886
236. Serebrovskaya EO, Edelweiss EF, Stremovskiy OA, Lukyanov KA, Chudakov DM, Deyev SM (2009) Targeting cancer cells by using an antireceptor antibody-photosensitizer fusion protein. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 9221-9225
237. Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE, Tsien RY (2004) Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol 22: 1567-1572
238. Shaner NC, Lin MZ, McKeown MR, Steinbach PA, Hazelwood KL, Davidson MW, Tsien RY (2008) Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods 5: 545-551
239. Shaner NC, Patterson GH, Davidson MW (2007) Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci 120: 4247-4260
240. Shaner NC, Steinbach PA, Tsien RY (2005) A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods 2: 905-909
241. Shcherbo D, Merzlyak EM, Chepurnykh TV, Fradkov AF, Ermakova GV, Solovieva EA, Lukyanov KA, Bogdanova EA, Zaraisky AG, Lukyanov S et al (2007) Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat Methods 4: 741-746
242. Shcherbo D, Murphy CS, Ermakova GV, Solovieva EA, Chepurnykh TV, Shcheglov AS, Verkhusha VV, Pletnev VZ, Hazelwood KL, Roche PM et al (2009) Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J 418: 567-574
243. Shimomura O (1979) Structure of the chromophore of Aequorea green fluorescent protein. FEBS Lett 104: 220-222
244. Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y (1962) Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol 59: 223-239
245. Shroff H, Galbraith CG, Galbraith JA, White H, Gillette J, Olenych S, Davidson MW, Betzig E (2007) Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. Proc Natl Acad Sci USA 104: 20308-20313
246. Shu X, Royant A, Lin MZ, Aguilera TA, Lev-Ram V, Steinbach PA, Tsien RY (2009) Mammalian expression of infrared fluorescent proteins engineered from a bacterial phytochrome. Science 324: 804-807
247. Shu X, Shaner NC, Yarbrough CA, Tsien RY, Remington SJ (2006) Novel chromophores and buried charges control color in mFruits. Biochemistry 45: 96399647
248. Shyu YJ, Liu H, Deng X, Hu CD (2006) Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques 40: 61-66
249. Shyu YJ, Suarez CD, Hu CD (2008a) Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci USA 105: 151-156
250. Shyu YJ, Suarez CD, Hu CD (2008b) Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat Protoc 3: 1693-1702
251. Siegel MS, Isacoff EY (1997) A genetically encoded optical probe of membrane voltage. Neuron 19: 735-741
252. Siegel RM, Chan FK, Zacharias DA, Swofford R, Holmes KL, Tsien RY, Lenardo MJ (2000) Measurement of molecular interactions in living cells by fluorescence resonance energy transfer between variants of the green fluorescent protein. Sei STKE 2000: PL1
253. Sinnecker D, Voigt P, Hellwig N, Schaefer M (2005) Reversible photobleaching of enhanced green fluorescent proteins. Biochemistry 44: 7085-7094
254. Sniegowski JA, Lappe JW, Patel HN, Huffinan HA, Wächter RM (2005a) Base catalysis of chromophore formation in Arg96 and Glu222 variants of green fluorescent protein. J Biol Chem 280: 26248-26255
255. Sniegowski JA, Phail ME, Wächter RM (2005b) Maturation efficiency, trypsin sensitivity, and optical properties of Arg96, Glu222, and Gly67 variants of green fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun 332: 657-663
256. Solimena M, Gerdes HH (2003) Secretory granules: and the last shall be first. Trends Cell Biol 13: 399-402
257. Souslova EA, Belousov VV, Lock JG, Stromblad S, Kasparov S, Bolshakov AP, Pinelis VG, Labas YA, Lukyanov S, Mayr LM et al (2007) Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range. BMC Biotechnol 7: 37
258. Souslova EA, Chudakov DM (2007) Genetically encoded intracellular sensors based on fluorescent proteins. Biochemistry (Mose) 72: 683-697
259. Srivastava J, Barber DL, Jacobson MP (2007) Intracellular pH sensors: design principles and functional significance. Physiology (Bethesda) 22: 30-39
260. Stark DA, Kulesa PM (2007) An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev Dyn 236: 1583-1594
261. Stiel AC, Andresen M, Bock H, Hilbert M, Schilde J, Schonle A, Eggeling C, Egner A, Hell SW, Jakobs S (2008) Generation of monomeric reversibly switchable red fluorescent proteins for far-field fluorescence nanoscopy. Biophys J 95: 2989-2997
262. Stiel AC, Trowitzsch S, Weber G, Andresen M, Eggeling C, Hell SW, Jakobs S, Wahl MC (2007) 1.8 A bright-state structure of the reversibly switchablefluorescent protein Dronpa guides the generation of fast switching variants. Biochem J 402: 35-42
263. Strack RL, Strongin DE, Bhattacharyya D, Tao W, Berman A, Broxmeyer HE, Keenan RJ, Glick BS (2008) A noncytotoxic DsRed variant for whole-cell labeling. Nat Methods 5: 955-957
264. Subach FV, Patterson GH, Manley S, Gillette JM, Lippincott-Schwartz J, Verkhusha VV (2009a) Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat Methods 6: 153-159
265. Subach FV, Subach OM, Gundorov IS, Morozova KS, Piatkevich KD, Cuervo AM, Verkhusha W (2009b) Monomeric fluorescent timers that change color from blue to red report on cellular trafficking. Nat Chem Biol 5: 118-126
266. Subach FV, Zhang L, Gadella TW, Gurskaya NG, Lukyanov KA, Verkhusha VV (2010) Red fluorescent protein with reversibly photoswitchable absorbance for photochromic FRET. Chem Biol 17: 745-755
267. Subach OM, Gundorov IS, Yoshimura M, Subach FV, Zhang J, Gruenwald D, Souslova EA, Chudakov DM, Verkhusha VV (2008) Conversion of red fluorescent protein into a bright blue probe. Chem Biol 15: 1116-1124
268. Sugita M, Shiba Y (2005) Genetic tracing shows segregation of taste neuronal circuitries for bitter and sweet. Science 309: 781-785
269. Tachibana K, Hara M, Hattori Y, Kishimoto T (2008) Cyclin B-cdkl controls pronuclear union in interphase. Curr Biol 18: 1308-1313
270. Tallini YN, Ohkura M, Choi BR, Ji G, Imoto K, Doran R, Lee J, Plan P, Wilson J, Xin HB et al (2006) Imaging cellular signals in the heart in vivo: Cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proc Natl Acad Sci U S A 103: 4753-4758
271. Terskikh A, Fradkov A, Ermakova G, Zaraisky A, Tan P, Kajava AV, Zhao X, Lukyanov S, Matz M, Kim S et al (2000) "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science 290: 1585-1588
272. Tian L, Hires SA, Mao T, Huber D, Chiappe ME, Chalasani SH, Petreanu L, Akerboom J, McKinney SA, Schreiter ER et al (2009) Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods 6: 875-881
273. Tomosugi W, Matsuda T, Tani T, Nemoto T, Kotera I, Saito K, Horikawa K, Nagai T (2009) An ultramarine fluorescent protein with increased photostability and pH insensitivity. Nat Methods 6: 351-353
274. Tomura M, Yoshida N, Tanaka J, Karasawa S, Miwa Y, Miyawaki A, Kanagawa O (2008) Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proc Natl Acad Sei U S A 105: 10871-10876
275. Tsien RY (1998) The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem 67: 509-544
276. Tunggal J, Wartenberg M, Paulsson M, Smyth N (2003) Expression of the nidogen-binding site of the laminin gamma 1 chain disturbs basement membrane formation and maintenance in F9 embryoid bodies. J Cell Sei 116: 803-812
277. Tyagi S (2009) Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods 6: 331-338
278. Valencia-Burton M, McCullough RM, Cantor CR, Broude NE (2007) RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods 4: 421-427
279. VanEngelenburg SB, Palmer AE (2008) Fluorescent biosensors of protein function. Curr Opin Chem Biol 12: 60-65
280. Verkhusha W, Chudakov DM, Gurskaya NG, Lukyanov S, Lukyanov KA (2004) Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins. Chem Biol 11: 845-854
281. Verkhusha W, Kuznetsova IM, Stepanenko OV, Zaraisky AG, Shavlovsky MM, Turoverov KK, Uversky VN (2003) High stability of Discosoma DsRed as compared to Aequorea EGFP. Biochemistry 42: 7879-7884
282. Verkhusha W, Lukyanov KA (2004) The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. Nat Biotechnol 22: 289-296
283. Verkhusha VV, Sorkin A (2005) Conversion of the monomeric red fluorescent protein into a photoactivatable probe. Chem Biol 12: 279-285
284. Vincent P, Maskos U, Charvet I, Bourgeais L, Stoppini L, Leresche N, Changeux JP, Lambert R, Meda P, Paupardin-Tritsch D (2006) Live imaging of neural structure and function by fibred fluorescence microscopy. EMBO Rep 7: 11541161
285. Vinkenborg JL, Evers TH, Reulen SW, Meijer EW, Merkx M (2007) Enhanced sensitivity of FRET-based protease sensors by redesign of the GFP dimerization interface. Chembiochem 8:1119-1121
286. Vogel SS, Thaler C, Koushik SV (2006) Fanciful FRET. Sci STKE 2006: re2
287. Waadt R, Schmidt LK, Lohse M, Hashimoto K, Bock R, Kudla J (2008) Multicolor bimolecular fluorescence complementation reveals simultaneous formation of alternative CBL/CIPK complexes in planta. Plant J 56: 505-516
288. Wachter RM, Remington SJ (1999) Sensitivity of the yellow variant of green fluorescent protein to halides and nitrate. Curr Biol 9: R628-629
289. Wall MA, Socolich M, Ranganathan R (2000) The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed. Nat Struct Biol 7: 1133-1138
290. Wang F, Dennis JE, Awadallah A, Solchaga LA, Molter J, Kuang Y, Salem N, Lin Y, Tian H, Kolthammer JA et al (2009) Transcriptional profiling of human mesenchymal stem cells transduced with reporter genes for imaging. Physiol Genomics 37: 23-34
291. Wang L, Jackson WC, Steinbach PA, Tsien RY (2004) Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation. Proc Natl Acad Sci U S A 101: 16745-16749
292. Wang L, Tsien RY (2006) Evolving proteins in mammalian cells using somatic hypermutation. Nat Protoc 1: 1346-1350
293. Wang Q, Shui B, Kotlikoff MI, Sondermann H (2008) Structural basis for calcium sensing by GCaMP2. Structure 16: 1817-1827
294. Wang S, Hazelrigg T (1994) Implications for bed mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis. Nature 369: 400-403
295. Wang X, Pang Y, Ku G, Xie X, Stoica G, Wang LV (2003) Noninvasive laser-induced photoacoustic tomography for structural and functional in vivo imaging of the brain. Nat Biotechnol 21: 803-806
296. Ward WW, Cormier MJ (1976) Invitro Energy-Transfer in Renilla Bioluminescence. J Phys Chem 80: 2289-2291
297. Wiedenmann J, Elke C, Spindler KD, Funke W (2000) Cracks in the beta-can: fluorescent proteins from Anemonia sulcata (Anthozoa, Actinaria). Proc Natl Acad Sci US A 97: 14091-14096
298. Wiedenmann J, Nienhaus GU (2006) Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family. Expert Rev Proteomics 3: 361-374
299. Wiedenmann J, Schenk A, Rocker C, Girod A, Spindler KD, Nienhaus GU (2002) A far-red fluorescent protein with fast maturation and reduced oligomerization tendency from Entacmaea quadricolor (Anthozoa, Actinaria). Proc Natl Acad Sci US A99: 11646-11651
300. Wiedenmann J, Vallone B, Renzi F, Nienhaus K, Ivanchenko S, Rocker C, Nienhaus GU (2005) Red fluorescent protein eqFP611 and its genetically engineered dimeric variants. J Biomed Opt 10: 14003
301. Willem M, Miosge N, Halfter W, Smyth N, Jannetti I, Burghart E, Timpl R, Mayer U (2002) Specific ablation of the nidogen-binding site in the laminin gamma 1 chain interferes with kidney and lung development. Development 129: 2711-2722
302. Wilmann PG, Battad J, Petersen J, Wilce MC, Dove S, Devenish RJ, Prescott M, Rossjohn J (2006b) The 2.1 A crystal structure of copGFP, a representative member of the copepod clade within the green fluorescent protein superfamily. J Mol Biol 359: 890-900
303. Wilmann PG, Turcic K, Battad JM, Wilce MC, Devenish RJ, Prescott M, Rossjohn J (2006c) The 1.7 A crystal structure of Dronpa: a photoswitchable green fluorescent protein. J Mol Biol 364: 213-224
304. Wu JC, Spin JM, Cao F, Lin S, Xie X, Gheysens O, Chen IY, Sheikh AY, Robbins RC, Tsalenko A et al (2006) Transcriptional profiling of reporter genes used for molecular imaging of embryonic stem cell transplantation. Physiol Genomics 25: 29-38
305. Yang M, Baranov E, Jiang P, Sun FX, Li XM, Li L, Hasegawa S, Bouvet M, Al-Tuwaijri M, Chishima T et al (2000a) Whole-body optical imaging of green fluorescent protein-expressing tumors and metastases. Proc Natl Acad Sci USA 97: 1206-1211
306. Yang M, Baranov E, Moossa AR, Penman S, Hoffman RM (2000b) Visualizing gene expression by whole-body fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci USA 97: 12278-12282
307. Yang TT, Cheng L, Kain SR (1996) Optimized codon usage and chromophore mutations provide enhanced sensitivity with the green fluorescent protein. Nucleic Acids Res 24: 4592-4593
308. Yarbrough D, Wachter RM, Kallio K, Matz MV, Remington SJ (2001) Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0-A resolution. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 462-467
309. Young P, Feng G (2004) Labeling neurons in vivo for morphological and functional studies. Curr Opin Neurobiol 14: 642-646
310. Yu J, Xiao J, Ren X, Lao K, Xie XS (2006) Probing gene expression in live cells, one protein molecule at a time. Science 311: 1600-1603
311. Yu YA, Shabahang S, Timiryasova TM, Zhang Q, Beltz R, Gentschev I, Goebel W, Szalay AA (2004) Visualization of tumors and metastases in live animals withbacteria and vaccinia virus encoding light-emitting proteins. Nat Biotechnol 22: 313-320
312. Yu YA, Timiryasova T, Zhang Q, Beltz R, Szalay AA (2003) Optical imaging: bacteria, viruses, and mammalian cells encoding light-emitting proteins reveal the locations of primary tumors and metastases in animals. Anal Bioanal Chem 377: 964-972
313. Zacharias DA, Violin JD, Newton AC, Tsien RY (2002) Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science 296: 913-916
314. Zamyatnin AA, Jr., Solovyev AG, Bozhkov PV, Valkonen JP, Morozov SY, Savenkov EI (2006) Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J 46: 145-154
315. Zapata-Hommer O, Griesbeck O (2003) Efficiently folding and circularly permuted variants of the Sapphire mutant of GFP. BMC Biotechnol 3: 5
316. Zhang J, Campbell RE, Ting AY, Tsien RY (2002) Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat Rev Mol Cell Biol 3: 906-918
317. Zhang L, Gurskaya NG, Merzlyak EM, Staroverov DB, Mudrik NN, Samarkina ON, Vinokurov LM, Lukyanov S, Lukyanov KA (2007) Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. Biotechniques 42: 446450
318. Zhang S, Ma C, Chalfie M (2004) Combinatorial marking of cells and organelles with reconstituted fluorescent proteins. Cell 119: 137-144
319. Zubova NN, Korolenko VA, Astafyev AA, Petrukhin AN, Vinokurov LM, Sarkisov OM, Savitsky AP (2005) Brightness of yellow fluorescent protein from coral (zFP538) depends on aggregation. Biochemistry 44: 3982-3993
320. Зубова НН, Булавина АЮ, А.П. С (2003) Спектральные и физико-химические свойства зелёного (GFP) и красного (drFP583) флуоресцирующих белков. Успехи биологической химии 43: 163-224
321. Зубова НН, Савицкий АП (2005) Зубова H.H., Савицкий А.П. Молекулярные клеточные сенсоры, созданные на основе цветных флуоресцирующих белков. I. Сенсоры pH, ионов С1—, Са2+, Zn2+, Cu2+. Успехи биологической химии45: 391-455.
-
Чудаков, Дмитрий Михайлович
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2011
-
ВАК 03.01.03
- Исследование сигнальных функций пероксида водорода в процессе фагоцитоза
- Методы анализа процессинга и деградации мРНК с помощью флуоресцентных белков
- Исследование сигнальной функции пероксида водорода с помощью генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов
- Генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры окислительно-восстановительных процессов в живых системах
- Генетически кодируемый фотосенсибилизатор как инструмент воздействия на жизнеспособность и скорость пролиферации клеток эукариот
