Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование сигнальных функций пероксида водорода в процессе фагоцитоза

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование сигнальных функций пероксида водорода в процессе фагоцитоза"

Учреждение российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

на правах рукописи

Марквичёва Ксения Николаевна

ИССЛЕДОВАНИЕ СИГНАЛЬНЫХ ФУНКЦИЙ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА В ПРОЦЕССЕ ФАГОЦИТОЗА

специальность-03.01.03 - молекулярная биология 004613968

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 5 НОЯ 2010

Москва 2010

004613968

Работа выполнена в лаборатории молекулярных технологий Института биоорганнческой химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Всеволод Вадимович Белоусов

Официальные оппоненты:

Юрий Борисович Лебедев, доктор биологических наук, заведующий лабораторией сравнительной и функциональной геномикн Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Александр Вячеславович Воротников, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник кафедры биологической и медицинской химии, факультет фундаментальной медицины, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Ведущая организация:

Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет имели М.В. Ломоносова

Защита состоится «24» ноября 2010 г. в 10:00 па заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117871, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автореферат разослан «22» октября 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук

В. А. Олейников

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Основными источниками активных форм кислорода (АФК) в клетках являются митохондрии и мембранные ферменты NADPH оксидазы (NOX). Продукция ферментами NOX супероксид-анион радикала (02'") и пероксида водорода (Н2О2) была впервые открыта в фагоцитирующих нейтрофилах. Это явление получило название «окислительного взрыва» и долгое время связывалось только с токсичностью АФК для бактериальных или иных чужеродныз клеток, захваченных в фагосому. Однако впоследствии стали стремительно накапливаться данные об экспрессии ферментов семейства NOX практически во всех тканях и клетках многоклеточных. Стало понятно, что в нефагоцитирующих клетках Н2О2, производимый ферментами NOX, задействован во внутриклеточной передаче сигнала. Пероксид водорода окисляет цистеины в активном центре тирозин-фосфатаз и других белков, модулируя таким образом их активность и, следовательно, активность связанных с ними сигнальных каскадов. Сигнальная функция АФК стала объектом интенсивных исследований относительно недавно, так что актуальными задачами на сегодня являются непосредственное изучения сигнальных процессов с участием АФК и разработка новых методов исследования клеточных АФК Ы vivo.

Важно отметить что как повышенная, так и пониженная продукция клетками эндогенных АФК связана с нейродегенеративными и сосудистыми заболеваниями, патологиями иммунной системы. Таким образом, понимание функций эндогенного Н2О2 в разных типах клеток важно не только для фундаментальных исследований процессов внутриклеточной передачи сигнала или фагоцитоза, но и для биомедицинских и фармакологических исследований.

Лучшими инструментами для изучения сигнальной функции АФК в индивидуальных живых клетках являются генетически кодируемые биосенсоры на основе гомологов зеленого флуоресцентного белка GFP. Биосенсор НуРег, созданный ранее в нашей лаборатории, позволяет с высокой специфичностью детектировать субмикромолярные концентрации Н202 в клетке. Ввиду растущей значимости исследования сигнальных каскадов с участием Н2Ог усовершенствование биосенсора НуРег представляется актуальной задачей.

Цели и задачи работы. Целью работы было изучение сигнальной роли фагоцитарной NADPH оксидазы в процессе фагоцитоза, а также усовершенствование основного

молекулярного инструмента для визуализации внутриклеточного Н202, биосенсора НуРег. Для достижения цели предстояло решить следующие задачи:

1) Разработка метода визуализации с помощью НуРег эндогенного Н202, вырабатываемого клетками при различных физиологических стимуляциях.

2) Изучение динамики продукции Н202 фагоцитирущими макрофагами.

3) Выявление взаимосвязи активации фагоцитарной NOX с активацией основных МАРК (Mitogen-Activated Protein Kinase) каскадов.

4) Оптимизация биосенсора НуРег с целью увеличения диапазона флуоресцентного ответа.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы впервые получены серии изображений, отражающих продукцию пероксида водорода в индивидуальной живой клетке после физиологической стимуляции ростовыми факторами и в процессе фагоцитоза. Анализ полученных изображений позволяет лучше понять сигнальную роль АФК. Апробированы и оптимизированы методики прижизненной конфокальной и флуоресцентной микроскопии фагоцитирующих клеток. Оптимизированные в ходе данной работы методики могут применяться для фундаментальных исследований клеточной биологии и биомедицинских исследований. Изучена взаимосвязь активации NADPH оксидазы и основных МАРК каскадов в процессе фагоцитоза, что особенно важно в контексте растущей значимости МАР-киназ как мишеней лекарственных препаратов. Разработаны новые версии НуРег с увеличенным диапазоном флуоресцентного ответа, НуРег2 и HyPer-H36Y. Усовершенствованные биосенсоры позволяют осуществить более подробное исследование эндогенного Н202 в индивидуальных живых клетках.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 104 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 184 ссылки. Диссертация содержит 25 рисунков и 1 таблицу.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были доложены на VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва, Россия, 2006), XIX Международной Конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Гурзуф, Украина, 2007), Международной Конференции в честь 75-летия со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва,

Россия, 2009), конференции по химической биологии EMBL (EMBL, Гейдельберг, Германия), V Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и переспективы развития» (Москва, Россия, 2009), а также на 49-ой ежегодной конференции The American Society For Cell Biology (Сан-Диего, США, 2009).

Публикации. По материалам работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах.

Содержание работы

I. Изучение продукции Н2О2 в индивидуальной клетке

Открытое в 1933 году явление интенсивного потребления кислорода фагоцитирующими клетками млекопитающих получило название окислительного или дыхательного взрыва. Именно наличием окислительного взрыва у фагоцитов долгое время объяснялась способность макрофагов и нейтрофилов инактивировать захваченных в фагосому бактерий и эукариотические клетки. Считалось, что разрушение чужеродных клеток в фагосомах происходит путём окисления их АФК, производимыми NADPH оксидазами. Сегодня показано, что в разрушении патогенных клеток в фагосомах главную роль играет электрогенная активность NOX, а не продукция АФК. Закачивая электроны в просвет фагосомы, NOX создает градиент отрицательного заряда, который компенсируется протонами и ионами К+. Активный транспорт в просвет фагосомы ионов К приводит сначала к тому, что изначально закисленная среда фаголизосомы нейтрализуется, а затем и защелачивается. В фаголизосоме создается оптимальная среда для активации протеиназ, которые разрушают поглощенные фагоцитом клетки.

Радикальное изменение взглядов на способы, которыми фагоцит инактивирует чужеродные клетки, в совокупности со сведениями о сигнальной функции Н2О2 в нефагоцитирующих клетках, сделало особенно интересными исследования сигнальной роли Н2О2 в процессе фагоцитоза. До настоящего времени исследования сигнального аспекта окислительного взрыва в фагоцитозе проводились методами, подразумевающими оценку продукции Н2О2 популяцией фагоцитов, а детекция продукции АФК осуществлялась с применением необратимо взаимодействующих с АФК красителей. Однако детекция продукции АФК фагоцитами в кювете или в культуральной чашке не позволяют изучить динамику продукции Н2О2 в отдельно взятой фагоцитирующей клетке in vivo. В данной работе впервые изучена динамика продукции Н2О2 в индивидуальных живых фагоцитирующих и нефагоцитирующих клетках. Полученные для фагоцитов

данные сопоставлены с данными об активации двух основных МАР-киназных сигнальных каскадов, Erkl/2 и рЗВ, при фагоцитозе.

Основным инструментом для изучения эндогенного Н2О2 в рамках данного исследования является биосенсор НуРег. НуРег представляет собой химерный флуоресцентный белок, состоящий из чувствительного к Н2О2 и флуоресцентного доменов. Входящий в состав НуРег регуляторный домен транскрипционного фактора E.coli OxyR (OxyR-RD) содержит в активном центре два цистеиновых остатка, образующих под действием Н2О2 дисульфидную связь, приводящую к изменению конформации всего домена. OxyR-RD в составе НуРег обладает высокой селективностью к Н2О2, в отсутствии Н2О2 дисульфидная связь быстро восстанавливается тиол-восстанавливающими системами клетки, происходит реактивация НуРег. Флуоресцентный домен НуРег представляет собой вариант жёлтого флуоресцентного белка cpYFP с двумя пиками поглощения (420 и 500 нм) и эмиссией при 510 нм. cpYFP интегрирован в OxyR-RD с помощью 2-х коротких полипептидных линкеров. Изменение конформации OxyR-RD под действием Hi02 приводит к изменению соотношения двух пиков поглощения cpYFP: интенсивность поглощения хромофора cpYFP при 500 нм (F500) растёт пропорционально уменьшению поглощения при 420 нм (F420). Сигнал НуРег можно детектировать не только как изменение интенсивности поглощения в одном из двух пиков cpYFP, но и как отношение двух величин (F500/F420), и в этом случае он не зависит от уровня экспрессии сенсора в клетке.

Визуализация низких концентраций эндогенного Н2О2 в клетках HeLa, стимулированных эпидермальным фактором роста

Ранее НуРег применялся для детекции продукции Н2О2 клетками PC-12 при стимуляции их фактором роста нервов (NGF). Чтобы проверить, вызывают ли другие ростовые факторы продукцию Н2О2, и отработать условия микроскопии, была показана продукция Н2О2 клетками HeLa, простимулированными эпидермальным фактором роста (EGF). Мы установили, что при стимуляции EGF клеток HeLa, экспрессирующих НуРег, происходит легко детектируемый всплеск эндогенной продукции Н2О2 (рис.1). Для малоподвижных клеток HeLa детекция поглощения только в области 480 нм оказалась вполне достаточной для визуализации низких концентраций эндогенного Н2О2. Концентрация эндогенного Н2О2 в цитоплазме стимулированных EGF клеток HeLa через 40-60 минут после стимуляции составила приблизительно от 25 до 100 нМ в зависимости от клетки.

Время (сек.)

Рис.1. Продукция Н202 в HeLa при стимуляции фактором роста эпидермиса (EGF).

(а) Конфокальная микроскопия клеток HeLa, экспрессирующих HyPer-Cyto, псевдоцвета соответствуют разным интенсивностям зеленой флуоресценции: чёрный — нет флуоресценции, красный - максимальная интенсивность флуоресценции, (б) Графики продукции Н2О2 6-ю индивидуальными клетками HeLa, показанными на панели (а) после стимуляции, EGF добавлен к клеткам в 0-ой момент времени. Кривые представляют собой зависимость интенсивности флуоресценции НуРег (возбуждение 488 нм, эмиссия 520 нм) от времени. Масгитабная линейка 40 мкм.

Графики продукции Н2О2 значительно отличались между соседними клетками. Обращает на себя внимание выраженная двухфазность процесса генерации Н2О2. Примечательно, что по литературным данным подобная двухфазность с похожими временными характеристиками прослеживается при активации МАРК каскадов в клетках HeLa простимулированных EGF, что косвенно подтверждает связь эндогенного Н2О2 с модуляцией активности МАРК в данном процессе. Таким образом, была продемонстрирована возможность детекции эндогенного Н2О2 с помощью НуРег, а также наличие гетерогенности ответа на физиологическую стимуляцию в одной популяции клеток. Следующим этапом работы было изучение с помощью НуРег окислительного взрыва в фагоцитах.

Изучение динамики продукции Н2О2 макрофагами RA W264.7, фагоцирующими гранулы опсонизированного сывороткой зимозана

Из результатов проведенных другими группами исследований продукции Н2Ог макрофагами RAW264.7 в процессе фагоцитоза опсонизированного полисахарида клеточной стенки дрожжей зимозана (Opz) следует, что концентрация Н2О2 начинает расти через несколько минут после добавления к клеткам Opz, достигает максимума через

приблизительно 40 минут и постепенно снижается. Снижение концентрации до исходной не наблюдается в течение нескольких часов. Подобные исследования ранее проводились только для популяций макрофагов RAW264.7 и некоторых других фагоцитов. Используя высокоселективный к Н2О2 флуоресцентный краситель Amplex UltraRed, мы также получили схожую кривую, отражающую продукцию Н2О2 популяцией фагоцитирующих RAW264.7 (рис. 2). Таким образом, наша экспериментальная система представляет собой «классическую» модель для исследования динамики окислительного взрыва при фагоцитозе.

— 160.

6 140. -----"""v.

к ■? V \

3« / XI

5 J loo. / ^

Z D /

с. S 80 ■ / У* "с. г

S|M- /

40. /

"О {—^_Ш _

О :0 40 60 80 100 Время (мни.)

Для визуализации окислительного взрыва в индивидуальных макрофагах мы использовали клетки RAW264.7, транзиентно экспрессирующие HyPer-Cyto. Для получения серий изображений отдельных фагоцитирующих макрофагов применяли конфокальную флуоресцентную микроскопию. Поскольку макрофаги обладают высокой подвижностью, в качестве сигнала НуРег мы рассматривали отношение интенсивностей поглощения при 420 и 500 нм (F500/F420). Сигнал, представляющий собой отношение двух величин (рациометрический), отражает только концентрацию Н2О2, и не зависит от изменения плотности цитоплазмы, движения клеток и уровня экспрессии биосенсора. На примере отдельных клеток RAW264.7 было установлено, что концентрация Н2О2 внутри клетки начинает расти немедленно после захвата гранулы Opz, достигает максимума через 2 минуты, и возвращается на исходный уровень через 10-15 минут (рис.3 б, г). При частоте съёмки 1 раз в 10 секунд сигнал HyPer-Cyto был делокализован в цитоплазме, специфической локализации окисленного HyPer-Cyto вокруг фагосом не наблюдалось (рис.3 а, б).

В некоторых клетках происходит более одного кратковременного повышения уровня продукции внутриклеточного Н2С>2, причём «всплески» продукции Н2О2 следовали немедленно за захватом одной или нескольких гранул (рис.3 а, в).

Полученные нами графики продукции Н2Ог в индивидуальных фагоцитрующих макрофагах радикально отличаются от аналогичных графиков для популяций клеток.

Рис.2. Продукции Н2О2 популяцией макрофагов ЛА1У264.7 фагоцитирующих Орг. Зимозан добавлен в 0-ой момент времени в культуральную чашку с 1 х 1СР клеток ЯА \V264.7.

(а)

(б)

(г)

Время (мни.)

Время (мин.)

Рис.3. Окислительный взрыв в индивидуальных макрофагах ИЛ №'264.7, фагоцитирующих гранулы опсонизированного зимозана (Орг). Все клетки экспрессируют НуРег-СуЮ. Серия конфокальных рациометрических изображений макрофага РА IV.264.7, в цитоплазме которого происходит два кратковременных всплеска продукции Н20 (а), показанных на графике (в). Серия конфокальных рациометрических изображений двух фагоцитирующих макрофагов (б), и графики продукции Н2О2 нижней клеткой (красная линия) и верхней клеткой (чёрная линия) (г). Моменты захвата гранул Орг в отмечены стрелочками, шкала цветов отражает отношение Р500/Р420 (чёрный -О; белый - 4). Масштабная линейка 10 мкм.

При такой постановке эксперимента, когда в культуральную чашку с фагоцитами добавляют гранулы Орг, захват отдельными клетками гранул происходит в разное время. Кроме того, в некоторых клетках происходит несколько повышений концентрации Н2О2,

что на графике содержания АФК в среде с фагоцитирующими клетками отражается замедлением падения концентрации АФК. Таким образом, разницу между результатами, полученными с помощью НуРег, и графиками продукции АФК популяцией макрофагов ЯА\¥264.7 можно объяснить асинхронностью и гетерогенностью профилей продукции Н2О2 индивидуальных фагоцитов.

Изучение распределения Н2О2, производимого в процессе фагоцитоза, между ядром и

цитоплазмой фагоцита.

Надо отметить, что HyPer-Cyto при экспрессии в клетках распределяется равномерно между ядром и цитоплазмой. Ферментов ядерной локализации, продуцирующих АФК, на сегодня не выявлено, так что присутствие в ядре клеток RAW 264.7 окисленного НуРег может объясняться только диффузией из цитоплазмы Н2О2, или окисленного НуРег. Кроме того, ядро клетки в нормальном состоянии отличается по своему окислительно-восстановительному потенциалу от цитоплазмы, так что изучение различий в концентрации Н2О2 в ядре и цитоплазме во время окислительного взрыва представляется интересной задачей.

Для решения этой задачи были сконструированы HyPer-NLS (НуРег- Nuclear Localization Signal) ядерной локализации и локализующийся в цитоплазме HyPer-NLS (НуРег- Nuclear Export Signal) (рис.4).

(а)

(б)

%

9 %

/

«•Р

й'

-

Рис.4. Флуоресцентная микрофотография макрофагов RA W264.7, экспрессирующих НуРег- Nuclear Localization Signal (HyPer-NLS) (а) и HyPer-Nuclear Export Signal (HyPer-NES) (б). Масштабная линейка 10 мкм.

При коэкспрессии НуРег-МЬЭ и НуРег-ЫЕв в одной клетке не происходит «перемешивания» НуРег, находящегося в ядре, с НуРег из цитоплазмы. Таким образом, детекция окислительного взрыва в макрофагах ЯА\¥264.7, коэкспрессирующих обе конструкции, позволяет установить локализацию источника АФК при окислительном взрыве и источник окисленного НуРег в ядре.

После визуализации окислительного взрыва в макрофагах ЯАШ264.7, коэкспрессирующих НуРег^ЬЭ и НуРег-ЫЕЗ, и анализа графиков содержания Н2О2 в цитоплазме и ядре, было установлено, что величина Р500/Р420 выше в цитоплазме. Форма

кривых и времена достижения максимальных концентраций Н2О2 в ядре и цитоплазме совпадают (рис.5). Это позволяет говорить о 1) поддержании более низких базальных концентраций НгСЬ в ядре по сравнению с цитоплазмой фагоцитирующего макрофага 11А\¥264.7 2) том, что Н2О2 диффундирует из цитоплазмы в ядро.

(а)

(б)

10 20 Время (мин.)

Рис.5. Окислительный взрыв в индивидуальном мкрофаге ЛА Ц'264.7 в процессе фагоцитоза: (а) серия конфокальных рациометрических изображений фагоцитирующего макрофага, котрансфецированнрго НуРег-ИЬБ и НуРег-МЬБ; (б) графики, отражающие изменение содержания Н2О2 в ядре (красная линия) и цитоплазме (чёрная линия) фагоцитирующего макрофага, изображенного на панели (а) Чёрный цвет соответствует величине Р500/Р420 0; белый - 4; Масштабная линейка! О мкм.

Описанные эксперименты с макрофагами ЯАШ264.7 наглядно показывают, что фагоциты контролируют концентрацию Н2О2 в процессе фагоцитоза, а в некоторых фагоцитирующих клетках может происходить более одного кратковременного повышения концентрации Н2О2. Показано, что изменение уровня внеклеточных АФК в популяции фагоцитов отражают не ход окислительного взрыва в индивидуальной клетке, а кумулятивный асинхронный ответ множества клеток с различными индивидуальными особенностями продукции АФК. Быстрое, по сравнению с экспериментами с НеЬа и ростовыми факторами, окисление и восстановление НуРег во время фагоцитоза может свидетельствовать о сигнальной функции Н2О2 именно в этом процессе. Следующим этапом работы было более подробное исследование сигнальной функции Н2О2 в процессе фагоцитоза.

Изучение влияния Н2О2 на эффективность фагоцитоза

Пероксид водорода, производимый макрофагами при окислительном взрыве, предположительно может выступать в качестве сигнальной молекулы. Однако, аспекты

«поведения» фагоцитирующего макрофага, связанные с активацией каскадов, контролируемых Н2О2, в настоящее время практически неизвестны.

Было обнаружено, что в рамках изучаемой экспериментальной модели большинство макрофагов фагоцитируют от 1 до 9 гранул Орг практически одновременно, за 1-2 минуты, после чего фагоцитоз прекращается. В 20% случаев макрофаг после быстрой интернализации первых гранул продолжает фагоцитировать, причём такие фагоциты уходят в апоптоз сразу после прекращения фагоцитоза. Таким образом, возможно, интернализация макрофагом первой «порции» гранул зимозана снижает вероятность интернализации этим же макрофагом зимозана в дальнейшем.

Было предположено, что продуцируемый при окислительном взрыве Н2О2 используется макрофагами для предотвращения захвата большого количества гранул зимозана. Для проверки этой гипотезы макрофаги КА\¥264.7 были проинкубированы в среде, содержащей 100 нМ Н2О2 перед индукцией фагоцитоза. Инкубация макрофагов с Н2О2 вызвала не только уменьшение количества фагоцитирующих клеток (фагоцитарного индекса) в 2 раза, но и уменьшение среднего количества захваченных гранул на клетку (фагоцитарного числа) в 6 раз (рис.6).

Контроль 100 нМ 11:0; Контроль 100 нМ 11:0;

Рис.6. Влияние Н2О2 на эффективность фагоцитоза макрофагами К А №'264.7 опсонизированного зимозана. Влияние преинкубации с 100 нм Н2О2 на среднее количество гранул, интернализованных одним макрофагом, (п>30, показано стандартное отклонение) (а), и на общее число фагоцитирующих макрофагов (п<30, показано стандартное отклонение)(б).

Таким образом, было установлено, что добавление к клеткам субмикромолярных и микромолярных количеств Н2О2 приводит к существенному снижению эффективности фагоцитоза.

Как было показано ранее, во время фагоцитоза в макрофаге происходит всплеск продукции Н2О2, распространяющийся из цитоплазмы в ядро. Известно, что Н2О2 и некоторые продукты реакций пероксида водорода способны привести к повреждению

биомолекул, в т.ч. и ДНК. Можно предположить, что механизм, ограничивающий количество и интенсивность окислительных взрывов в фагоцитирующей клетке, направлен в первую очередь на защиту фагоцита от разрушения собственными АФК. В отличие от короткоживущих нейтрофилов, основной задачей которых является фагоцитоз, после чего они уходят в апоптоз, активированные фагоцитозом патогенных клеток макрофаги живут длительное время, осуществляют презентацию антигенов лимфоцитам и вырабатывают большое количество цитокинов. Таким образом, в макрофагах должны функционировать какие-то дополнительные механизмы защиты от апоптоза, связанного с фагоцитозом. Приведенные данные позволяют предположить участие Н2О2 в сигнальных процессах, задействованных в такой защите.

II. Изучение сигнальной функции NADPH оксидазы при активации каскадов р38 и Erkl/2 в фагоцитирующих макрофагах RAW264.7

Хорошо известно, что активность ферментов NOX не обязательно связана с фагоцитозом. Она также необходима для прохождения процессов, универсально представленных в разных клетках. Производимая NADPH оксидазами Н202 модулирует активность протеиновых тирозиновых фосфатаз (РТР), и, как следствие, MAP (Mitogen-Activated Protein Kinase) киназных каскадов. МАРК представляют собой серин-треониновые протеинкиназы, обеспечивающие клеточный ответ на различные физиологические стимулы (факторы роста, цитокины, хемокины и другие вещества, вызывающие активацию рецепторов на поверхности клетки). Три основных группы МАР-киназных каскадов - каскады Erk 1/2, р38 и Jnk. Регуляция активности МАРК осуществляется множеством ферментов, в том числе и фосфатазами РТР, содержащими в активном центре обратимо окисляемый тиолат. Хотя подобные МАРК каскады исследовались в основном на нефагоцитирующих клетках, справедливо было бы предположить наличие подобной регуляции и в фагоцитах. Значительное количество довольно разрозненных данных позволяют предположить активацию МАРК при фагоцитозе, однако взаимосвязь между разными каскадами и их зависимость от активности NOX остаются неисследованными. В данной работе была поставлена задача исследовать активацию двух МАРК каскадов, р38 и Erkl/2, в процессе фагоцитоза.

Как правило, для получения информации об активации МАРК каскадов, используют электрофорез образцов в денатурирующих условиях с последующей детекцией фосфорилированных форм МАРК с помощью специфичных антител. Однако при исследовании активации МАРК в процессе фагоцитоза данный метод несет в себе

возможность ошибочной интерпретации полученных результатов. Так, например, при проведении ингибиторного анализа фосфорилирования МАРК, ингибирующий эффект какого-либо химического соединения может свидетельствовать как об ингибировании вышестоящей ступени сигнального каскада, так и о снижении эффективности фагоцитоза под влиянием этого вещества. Для получения наиболее достоверной картины, мы использовали комбинацию двух независимых методов: вестерн-блотгинг, совмещенный с ингибиторным анализом, и иммуноцитохимическое окрашивание клеток антителами к фосфорилированным формам МАР-киназ р38 и Erkl/2. Было обнаружено, что добавление опсонизированных гранул зимозана к макрофагам приводит к быстрой активации обоих исследуемых нами сигнальных каскадов (рис.7).

(а)

Контроль Аро Wort SB PD NAC

P-p38 p38

а-тубулин

P-Krkl/2

Erkl/2

а-тубулин

- +"- +" - +'

(б) Контроль Аро Wort SB PD NAC

г- +"- +' 7 + "т t" 7 +

- - -- . ..

---- -- ■ iii« Я»

Рис.7. Вестерн-блоттинг лизатов клеток RAW264.7, проинкубированных в присутствии 0,5 тМ специфического ингибитора NADPH оксидазы апоцинина (Аро), 10 пМ ингибитора Р13-киназы вортманнина (Wort), 10 мкМ ингибитора р38 SB 203580 (SB), 20 мкМ ингибитора МАРКИ Erkl/2 киназы МЕК-1 PD 98059 (PD), и 1 тМ антиоксиданта N-ацетилцистеина (NAC), либо в отсутствие ингибиторов (контроль). Клетки были стимулированы добавлением опсонизированного зимозана (+), либо, в качестве контроля, PBS (-). Клетки лизировали спустя 10 минут после стимуляции, (а) Вестерн-блоттинг с антителами к фосфорилированной форме р38 (Р-р38), суммарному пулу р38 (р38) и к а-тубулину. (б) Вестерн-блоттинг с антителами к фосфорилированной форме Erkl/2 (Р-ErkI/2), суммарному пулу Erkl/2 (Erkl/2) и к а-тубулину.

Чтобы проверить, является ли активация следствием фагоцитоза зимозана или происходит под влиянием низкомолекулярных примесей в суспензии зимозана, клетки RAW264.7 фиксировали через 10 минут после добавления суспензии зимозана с последующей иммуноцитохимической детекцией фосфорилированной р38 (Р-р38) и фосфорилированой Erk (Р-Erkl/2). Такая постановка эксперимента позволила получить изображения

фагоцитировавших и нефагоцитировавших клеток в одном поле зрения. Результаты, приведенные на рис. 7 и 8 позволяют утверждать, что активация р38 и Егк1/2 происходит в результате фагоцитоза. Видно, что в фагоцитировавших клетках обе киназы находятся в фосфорилированной форме, тогда как клетки, в которых не содержится гранул зимозана, дают лишь фоновое окрашивание.

Рис.8.

Иммуноцитохимическое окрашивание клеток ЛЛ \V264.7,

стимулированных Орг в

отсутствие ингибиторов (а,г), и в присутствии 203580 (б), Рй 98059 (д) либо апоцинина (в,е). Клетки окрашены с использованием антител к фосфорнлированной форме Егк1/2 (а-в) или р38 (г-д). Стрелки указывает на фагоцитированные гранулы зимозана,

масштабная линейка 20 мкм.

В нестимулированных гранулами Орг макрофагах небольшая фоновая активация р38 и Егк 1 /2 выявляется и при иммуноцитохимической детекции (рис.8), и с помощью вестерн-блоттинга (рис.7). Интересно, что инкубация клеток с ингибитором киназы р38, ЭВ 203580, приводит к снижению интенсивности фагоцитоза (таб.1). Степень фосфорилирования Егк1/2, напротив, возрастает при ингибировании р38 как в фагоцитировавших, так и в контрольных клетках (Рис.7 б), что свидетельствует об ингибировании каскада Егк1/2 каскадом р38.

В свою очередь, инкубация клеток в присутствии РЭ 98059, ингибитора киназы МЕК-1, фосфорилирующей киназы для Егк1/2, приводит к заметному снижению числа фагоцитировавших клеток (таб.1) и снижению степени фосфорилирования киназ Егк 1/2 как в по данным вестерн-блоттинга (рис.7 б), так и в отдельных фагоцитировавших клетках (Рис.8 б). При этом по данным вестерн-блоттинга, в контрольных (нестимулированных) клетках наблюдается значительная активация р38 (Рис.7 а), что указывает на ингибирование каскада р38 каскадом Егк 1/2.

Таб. 1. Влияние ингибиторов на эффективность фагоцитоза зимозана клетками

RAW264.7.

Реагент Действие Кол-во фагоцитировавших клеток, %

нет 45 ± 10

Апоцинин, 1,5 мМ ингибитор NADPH оксидазы 0

Апоцинин, 0,5 мМ 13 ±9

SB 203580, 10 мкМ ингибитор р38 23 ± 11

PD 98059, 20 мкМ ингибитор МЕК-1, фосфорилирующей Erkl/2 киназы 20 ±11

N-ацетилцистеин, 10 мМ антиоксидант 0

N-ацетилцистеин, 1 мМ 6± 3

Вортманнин, 10 нМ ингибитор PI3 киназы 0

Таким образом, была показана не только активация каскадов р38 и Erkl/2 в фагоцитирующих клетках, но и их взаимное угнетение. Следующим этапом работы было выявление связи фагоцитарной NOX с активацией МАР-киназных сигнальных каскадов.

Изучение зависимости фосфорилирования р38 и Erkl/2 от активности NADPH

оксидазы

Было предположено, что в фагоцитирующих клетках активность NADPH оксидазы также необходима для успешной активации МАРК. Для проверки данного предположения, клетки RAW 264.7 инкубировали в присутствии апоцинина, специфичного ингибитора NADPH оксидаз NOXI и N0X2. Добавление апоцинина до конечной концентрации 1,5 мМ полностью блокировало фагоцитоз, использование меньшей концентрации (0,5 мМ) частично блокировало фагоцитоз (таб.1). Данные иммуноцитохимического окрашивания позволяют утверждать, что ингибирование NOX приводит к ингибированию фосфорилирования Erkl/2 (рис.7 б). Следовательно, для активации каскада Erkl/2 требуется активация фагоцитарной NADPH оксидазы, что также свидетельствует в пользу сигнальной функции Н2О2 в фагоцитах. Кроме того, некоторый фоновый уровень активности NADPH оксидазы необходим для эффективного осуществления фагоцитоза. Каскад р38, напротив, активируется при ингибировании NADPH оксидазы в нестимулированных клетках (рис.7 а), что, по-видимому, является следствием ингибирования каскада Erkl/2.

Таким образом, из двух исследавиных каскадов, р38 и Егк1/2, только Егк1/2 активируется по механизму, предусматривающему генерацию Н2О2 NADPH оксидазой.

Изучение зависимости фосфорилирования р38 и Егк1/2 от активности фосфоинозитид-3-киназы (РНК) и антиоксидантов

Ассоциация на мембране и активация ферментов КОХ связана с появлением в мембране фосфатидилинозитола-3,4,5-трифосфата (Р13), производимого фосфатидилиназитол-3-киназой (Р13К). Чтобы удостовериться в наличии связи ассоциации КОХ и активации МАРК каскадов, мы исследовали влияние специфического ингибитора Р13К на фагоцитоз. Поскольку активация РБК необходима для сборки активного комплекса фагоцитарной КОХ, мы предположили, что влияние ингибитора КОХ апоцинина на фагоцитоз и активацию МАРК должны воспроизводиться при ингибировании Р13К высокоспецифичным ингибитором вортманнином. Действительно, инкубация с вортманнином как контрольных (нестимулированных) клеток, так и обработка клеток с последующей стимуляцией зимозаном, практически полностью воспроизводила все эффекты апоцинина: блокирование фагоцитоза, ингибирование Егк1/2, активацию р38 в нестимулированных клетках (рис.7).

Роль КАОРН оксидазы в активации Егк1/2 опосредована продукцией супероксид-анион радикала, дисмутирующего в Н2О2, следовательно эффекты ингибиторов КАОРН оксидазы должны быть сходны с эффектами антиоксидантов. Действительно, при инкубации клеток 11А\У264.7 в присутствии К-ацетилцистеина наблюдалось практически полное ингибирование фагоцитоза (таб.1), снижение уровня фосфорилирования Егк1/2 (рис.7 б), и рост уровня фосфорилирования р38 в контрольных (нестимулированных) клетках (рис.7 а) Следовательно, роль КОХ в активации Егк1/2 с высокой вероятностью связана с продукцией этим ферментом Н2О2.

Результаты проделанной работы позволяют утверждать, что МАР-киназы р38 и Егк1/2 принимают активное участие в процессе фагоцитоза. Начальная фоновая активность как р38, так и Егк1/2 существенна для эффективного осуществления фагоцитоза. Оба каскада взаимно ингибируют друг друга, что является, по-видимому, защитой от избыточной активации одного из них.

Активация каскада Егк1/2 опосредована АФК, образующимися в процессе фагоцитоза в результате работы КАОРН оксидазы плазматической мембраны. Активация р38 не требует участия КАОРН оксидазы.

Известно, что активация каскадов р38 и Erkl/2 приводит к выбору разных форм клеточного ответа. Баланс этих каскадов определяет, будет ли клетка пролиферировать, дифференцироваться, или подвергнется апоптозу. Наиболее вероятно, что в фагоцитировавшей клетке осуществляется конкурентная активация обоих каскадов и выбор дальнейшей судьбы клетки зависит от дополнительных факторов, например от того, насколько сама клетка оказывается поврежденной в условиях повышения продукции АФК. Вместе с тем, одним из основных выводов данного исследования является то, что фагоцитарная NADPH оксидаза, а вместе с ней и АФК, являются нормальными компонентами внутриклеточных сигнальных каскадов, а цепочка «стимул - NADPH оксидаза - MAP киназы - клеточный ответ» является универсальной для различных типов клеток фагоцитарной и нефагоцитарной природы.

III. Создание новых вариантов НуРег с увеличенным динамическим диапазоном

флуоресцентного ответа на Н2О2

С момента создания биосенсора НуРег в 2006 г. непрерывно предпринимались попытки его усовершенствования, направленные на увеличение диапазона флуоресцентного ответа на Н202.

НуРег зарекомендовал себя удобным молекулярном инструментом для исследования продукции эндогенного Н2О2 в ряде физиологических процессов. Однако во всех исследованиях продукции Н202 при физиологической стимуляции живых клеток, не достигается максимального диапазона ответа биосенсора, равного приблизительно 3. Таким образом динамический диапазон ответа данного сенсора не обладает желаемой амплитудой. Следовательно, была поставлена задача создать НуРег с увеличенным динамическим диапазоном флуоресцентного ответа.

Получение НуРег2

Ранее мы предполагали, что все флуоресцентные свойства НуРег, в том числе и диапазон ответа на окисление, зависят исключительно от GFP-подобного домена НуРег, cpYFP. Для создания более контрастной версии НуРег применяли случайный и направленный мутагенез линкеров и cpYFP, заменяли cpYFP на другие флуоресцентные белки, но все получаемые в результате мутагенезов варианты НуРег были хуже или сравнимы с исходным биосенсором.

При переклонировании гена НуРег для получения НуРег-ЫЕБ, в одном из клонов НуРег-ОТЭ были обнаружены две случайные мутации, приведшие к аминокислотным заменам. Одна из замен в последовательности НуРег-ЫЕ8, N3538, локализованная в срУРР соответствовала N1215 в вРР, вторая, А406У, соответствовала А233У в ОхуЯ дикого типа (wtOxyR). Проэкспрессированый в клетках НеЬа НуРег-ЫЕЭ с двумя аминокислотными заменами (НуРег-№538-А406У-ЫЕ8) обладал существенно большим динамическим диапазоном ответа на Н2О2, чем НуРег-СуЬ. Проведенные измерения показали, что динамический диапазон, т.е. соотношение Р500/Р420 НуРег-СуТо и НуРег-МЕЭ не отличается и составляет приблизительно 3, а Р500/Р420 для НуРег-Ш538-А406У^Е8 и полученного нами НуРег-Н3538-А406У-Су1о составляет от 6 до 7 (рис. 9).

Рис.9. Сравнение флуоресцентного ответа НуРег-Сую и НуРег-1Ч353$-А406У-Су(о,

проэкспрессированных в НеЬа, на добавление 100 мкМ Н2О2: (а) серия изображений клеток, экспрессирующих НуРег-Ы3538-А406У-Су1о, между 2-ым и 3-им кадром к клеткам добавлен Н2О2 до концентрации 100 мкМ.. Псевдоцвета отражают соотношение Р500/Р420, черный соответствует величине 0,5, белый — 8,0; (б) график изменения Р500/Р420 для НуРег-Сую (красная линия) и НуРег-Ы3538-А40бУ-Су1о (чёрная линия), представляющая ответ биосенсоров на добавление к клеткам, изображенным на панели (а) 100 мкМ И2О2. Масштабная линейка 20 мкм.

100 200 300 400 500 600

Время (сек.)

Поскольку добавление последовательности NES не привело к увеличению диапазона флуоресцентного ответа НуРег, был сделан вывод о ключевой роли одной или обеих мутаций (N353 S и A406V) в изменении свойств биосенсора.

Чтобы установить, какая именно из мутаций, приводит к изменению свойств НуРег, были сконструированы HyPer-N353S и HyPer-A406V цитоплазматической локализации. Было показано, что только замена A406V приводит к изменению динамического диапазона НуРег. HyPer-A406V был назван НуРег2 (рис.10).

Рис.10. Изменение Р500/1'420 в ответ на добавление 100 мкМ Н2О2 к клеткам НеЬа экспрессирующим НуРег (красная линия), НуРег^3538 (синяя линия) и НуРег-А406У (НуРег2, чёрная линия).

Сравнение времен полуокисления и полувосстановления НуРег и Ну Рей показало, что для НуРег2 эти времена в 2 раза больше, чем для НуРег (рис.11).

(а)

(б)

J0

20

S 10

I

Г m

« 100

НуРег

HyPetí НуРег-НЗбУ

НуРег

m

НуРег2 НуРег-НЗбУ

Рис.11. Средние времена полуокисления (а) и полувосстановления (б) трёх вариантов НуРег, (п=20, Р<0.05).

Мутация по позиции A233V в wtOxyR, соответствующая замене по позиции A406V в НуРег, описана ранее как дестабилизирующая интерфейс димеризации белка wtOxtR. Мы предположили, что дестабилизация димерного состояния OxyR-RD в составе НуРег2 могла привести к большей подвижности участка пептидной цепи с 205 по 225 а.о., в который интегрирован cpYFP. Для оценки олигомерного состояния НуРег и НуРег2 применили гель-фильтрационную хроматографию. Была установлена склонность НуРег к

образованию димерной формы в высоких концентрациях, при этом в разбавленном состоянии НуРег присутствует в растворе в качестве мономерного белка, в то время как НуРег2, вопреки нашим ожиданиям, оказался белком, находящимся в димерной форме даже в низких концентрациях (рис.12).

Рис.12. Гель фильтрация 4-х вариантов НуРег, синяя линия соответствует концентрации 1 мг/мл, красная - 0,02 мг/мл.

Результаты гель-фильтрации НуРег и НуРег2 и их сравнение с литературными данными могут свидетельствовать больших структурных различиях интерфейсов димеризации НуРег и wtOxyR. Также можно предположить, что более гидрофобный по сравнению с аланином валин в позиции 233 для wtOxyR (406 для НуРег), способствует димерезации НуРег2 за счёт гидрофобных взаимодействий с II10 и L124.

Детекция эндогенного Н202, производимого клетками NIH-3T3 при стимуляции фактором роста тромбоцитов (PDGF)

Чтобы показать большую, по сравнению с НуРег, эффективность НуРег2 для визуализации низких концентрации эндогенного Н2О2, мы сравнили графики продукции Н2О2 клетками NIH-3T3 трансфецированными НуРег и НуРег2, в ответ на стимуляцию PDGF (Platelet-derived growth factor).

Масса белка (Н)а)

Рис.13. Продукция Н2О2 мышиными

фибробластами ШН-ЗТЗ в ответ на стимуляцию фактором роста

тромбоцитов (РООР)

серия конфокальных

рациометрических изображений клеток ШН-ЗТЗ, экспрессирующих НуРег2 (а) и НуРег (б), 10 нг/мл РййР добавлено к клеткам в 0-ой момент времени, чёрный цвет соответствует величине Р500/Р420 0,5; белый - 3 (в). Графики изменения флуоресцентного сигнала (Р500/Р420) в клетках ШН-ЗТЗ, продуцирующих низкие концентрации эндогенного Н2О2 в ответ на стимуляцию РйОР. Чёрная линия соответствует НуРег2 экстраядерной локализации, красная -НуРег. Масштабная

линейка 20 мкм.

Мышиные фибробласты №Н-ЗТЗ были выбраны для данного эксперимента ввиду наличия у них выраженного физиологического ответа на РОйР. В ответ на РООР наблюдался плавный рост продукции Н2О2 в цитоплазме клеток ШН-ЗТЗ, причём амплитуда ответа (Р500/Р420) НуРег2, оказалась значительно большей, чем НуРег (рис.13). Таким образом, НуРег2 является более совершенным биосенсором для детекции низких концентраций эндогеннго Н202.

Однако НуРег2 по сравнению с исходным НуРег обладал существенно большими временами полуокисления (активации) и полувосстановления (реактивации) (рис.11). Следующим этапом работы было создание биосенсора с увеличенным динамическим диапазоном флуоресцентного ответа, но с меньшими временами активации и реактивации.

Создание и изучение НуРег-НЗбУ

Анализ положения случайной замены А406У в НуРег и её влияния на свойства биосенсора подвёл нас к предположению, что и другие аминокислотные замены в интерфейсе димеризации \vtOxyR могут изменить свойства НуРег. Позиции 1Л24 и Н114 описаны в литературе, как ключевые для образования димера \vtOxyR. Аминокислотные замены 1Л240 и Н114У, по-видимому, снижают способность OxyR димеризоваться. Нами были сконструированы и протестированы варианты НуРег с заменами в инерфейсе димеризации ОхуЯ4Ш НуРег-НЗбУ (Н114У для \vtOxyR) и НуРег-Ь460 (1Л240 для \vtOxyR). НуРег-Ь46В обладал пониженным по сравнению с исходным НуРег диапазоном ответа (рис.14), в то время как НуРег-НЗбУ, обладая значительно меньшими, чем НуРег2, временами полуокисления и полувосстановления (рис.11), сохранил при этом повышенную контрастность (рис 14).

200 400 Время (сек.)

600

-НуРег2

-НуРег

-НуРег-НЗбУ

-НуРег-Ь46Б

Рис.14. Сравнение

диапазонов

флуоресцентного ответа (Р500/Р420) четырёх

вариантов НуРег. Графики отражают изменение

интенсивностей флуоресцентного ответа биосенсоров,

экспрессипрованных в НеЬа, после добавления к клеткам 100лшМН202.

Интересно, что НуРег-Ь46Э не способен к димеризации, в то время как НуРег-НЗбУ образует димеры, хотя в низких концентрациях, в отличие от НуРег2, присутствует в растворе и в мономерной форме (рис.12).

Таким образом, были получены варианты НуРег с увеличенным диапазоном флуоресцентного ответа. Анализ мутаций, детерминировавших диапазон флуоресцентного ответа НуРег2, позволил нам получить НуРег-НЗбУ. НуРег-НЗбУ обладает повышенной по сравнению с НуРег амплитудой флуоресцентного ответа и реактивируется в два раза быстрее, чем НуРег2. Применение новых вариантов НуРег особенно удобно для визуализации низких уровней эндогенного Н2О2, участвующего во внутриклеточной передачи сигнала.

Интересно, что мутантные формы белка ОхуЯ ОхуЯ-А233У, по данным ряда исследований, обладают пониженной способностью к димеризации. Эта же мутация в ОхуК-Ы) в составе НуРег привела к обратному результату.

Мы предполагаем, что значительная часть изменения соотношения пиков поглощения НуРег, НуРег2 и НуРег-НЗбУ при окислении их Н2О2 связана с процессом димеризации этих белков. Это логично следует из сопоставления низкой амплитуды флуоресцентного ответа на Н202 не способного к димеризации НуРег-ЫбИ, средней амплитуды ответа способного к частичной димеризации НуРег, и высокой амплитуды ответа легко димеризующихся НуРег2 и Нурег-НЗбУ.

Таким образом, в этой части работы были созданы и охарактеризованы новые варианты биосенсорных белков, обладающие большим контрастом флуоресцентного ответа на Н2О2, чем исходный биосенсор НуРег. Применение этих биосенсоров в дальнейшем позволит лучше понять широкий спектр физиологических процессов с участием эндогенного пероксида водорода, и поможет более подробно изучить роль АФК в нормальных и патологических состояниях живого организма.

Выводы

1) В данной работе предложены и оптимизированы методы, позволяющие детектировать продукцию пероксида водорода на уровне индивидуальных клеток in vivo. С помощью флуоресцентного генетически кодируемого биосенсора НуРег показана продукция пероксида водорода в фагоцитирующих макрофагах и прстимулированных факторами роста клетках HeLa и NIH-3T3.

2) Продукция пероксида водорода при окислительном взрыве в фагоцитирующих макрофагах носит кратковременный характер. Зависимость концентрации пероксида водорода от времени, измеренная для индивидуальных клеток, принципиально отличается от таковой, измеренной для популяции фагоцитирующих клеток.

3) Пероксид водорода, производимый макрофагом при фагоцитозе, выполняет сигнальную функцию в фагоцитах. Активация МАР-киназного каскада Erkl/2 при фагоцитозе зависит от продукции пероксида водорода NADPH оксидазами.

4) Продукция пероксида водорода является достаточным условием снижения вероятности повторных событий фагоцитоза в одной и той же клетке. На основе полученных данных сформулирована гипотеза о существовании в макрофагах сигнальных процессов, проходящих с участием пероксида водорода и приводящих к подавлению фагоцитоза.

5) Новые варианты биосенсора НуРег, разработанные и охарактеризованные в данной работе, обладают увеличенным, по сравнению с исходным биосенсором, диапазоном флуоресцентного ответа на пероксид водорода. Мутации, влияющие на динамический диапазон флуоресцентного ответа биосенсора, локализованы в чувствительном к пероксиду водорода, а не во флуоресцентном домене.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Markvicheva, K.N., Bogdanova, Е.А., Staroverov, D.B., Lukyanov, S., & Belousov, V.V., Imaging of intracellular hydrogen peroxide production with HyPer upon stimulation of HeLa cells with epidermal growth factor. Methods MolBiol 476, 76-83 (2009).

2. Markvicheva, K.N., Bilan, D.S., Mishina, N.M., Gorokhovatsky, A.Y., Vinokurov, L.M., Lukyanov S., Belousov, V.V. A genetically encoded sensor for H(2)0(2) with expanded dynamic range. Bioorg Med Chem.(20\G)

3. Марквичева, K.H., Гороховатский, А.Ю., Мишина, H.M., Мудрик, Н.Н., Винокуров, JI.M., Лукьянов, С.А., Белоусов, В.В. Сигнальная функция фагоцитарной NADPH-оксидазы: активация МАР-киназных каскадов при фагоцитозе. Биоорг.химия, 36 (1): 133-138(2010).

Тезисы докладов на конференциях

1. Белоусов, В.В., Чудоков, Д.М., Суслова, Е.А, Марквичева, К.Н., Шашкова, А.А., Фрадков, А.Ф., Лукьянов, СЛ. Новые внутриклеточные сенсоры на основе зеленого флуоресцентного белка. VIII чтения, посвященные памяти акад. Ю.А.Овчинникова, (ИБХ РАН, Москва, Россия, 2006).

2. Markvicheva, K.N., Belousov, V.V., Terskikh, A.V., Shakhbazov, K.S., Fradkov, A.F., Lukyanov, K.A., Lukyanov, S.A. Study and optimization of genetically encoded fluorescent probe for detection of hydrogen pyroxide, Nineteenth International Conference "New Information Technology in Medicine, Pharmacology Biology and Ecology" (Gurzuf, Ukraine, 2007).

3. Belousov, V.V., Markvicheva, K.N., Safronova, N.M., Leibl, D., Schultz, C. Real-time monitoring of intracellular hydrogen peroxide production in phagocyting macrophages using HyPer, a genetically encoded fluorescent probe, EMBL Chemical Biology Conference (European Molecular Biology Laboratory, Hiedelberg, Germany, 2008).

4. Лукьянов, C.A., Белоусов, B.B., Чудаков, Д.М., Марквичева, К.Н., Мишина Н.М., Суслова, Е.А. Наномолекулярные внутриклеточные биосенсоры: современные достижения и перспективы развития, V Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и переспективы развития» (Москва, Россия, 2009).

5. Марквичева, К.Н., Мишина, Н.М., Белоусов, В.В., Лукьянов, С.А. Роль NADPH оксидазы в активации МАР-киназных каскадов при фагоцитозе. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения акад. Ю.А. Овчинникова, (ИБХ РАН, Москва, Россия, 2009).

6. Markvicheva K.N., Belousov V.V, Mishina, N.M., Shultz, С. The role of NADPH oxidase in MAP kinase cascades activation at phagocytosis, 49-th annual meeting of The American Society for Cell Biology (San-Diego, USA, 2009).

Заказ№ 153-а/10/10 Подписано в печать 21.10.2010 Тираж 85 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.rn

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Марквичева, Ксения Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

ГЛАВА I: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Активные формы кислорода в живых клетках

Открытие активных форм кислорода

Окислительный взрыв» в фагоцитах

Фагоцитарная МЛИРН оксидаза и другие ферменты МОХ

Основные источники активных форм кислорода в клетке

Ферменты, осуществляющие деградацию А ФК в клетке

Тиоредоксиновая и глутаредоксиновая системы

Разнообразие активных форм кислорода

Пероксид водорода как сигнальная молекула

II. Современные представления о механизмах фагоцитоза

Фагоциты

Профессиональные фагоциты

Рецепторы фагоцитоза 29 ^

Сигнальные каскады фагоцитоза

МЛР-киназы при фагоцитозе

Сопряженные с фагоцитозом процессы

Механизмы уничтожения клеток патогена

III. Измерение продукции АФК в клетках

Флуоресцентные химические красители для детекции А ФК

Хемилюминесцентные методы определения АФК

Колориметрические методы определения супероксид аниона

Флуоресцентные белки

ГЛАВА II: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Оборудование

Методы

ГЛАВА III: РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

I. Изучение продукции Н2О2 в индивидуальной клетке

Визуализация низких концентраций эндогенного Н202 в клетках НеЬа, стимулированных эпидермальным фактором роста

Изучение динамики продукции Н2О2 макрофагами RAW264.7, фагоцирующими гранулы опсонизированного сывороткой зимозана

Изучение распределения Н2О2, производимого в процессе фагоцитоза, между ядром и цитоплазмой фагоцита

Изучение влияния Н2О2 на эффективность фагоцитоза

П. Изучение сигнальной функции NADPH оксидазы при активации каскадов р38 и Erkl/2 в фагоцитирующих макрофагах

RAW264.

Изучение зависимости фосфорилирования р38 и Erkl/2 от активности NADPH оксидазы

Изучение зависимости фосфорилирования р38 и Erkl/2 от активности фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и антиоксидантов

III. Создание новых вариантов НуРег с увеличенным динамическим диапазоном флуоресцентного ответа на Н2О

Получение ИуРег

Детекция эндогенного Н202, производимого клетками NIH- 85 ЗТЗ при стимуляции фактором роста тромбоцитов

Создание и изучение HyPer-H36Y

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование сигнальных функций пероксида водорода в процессе фагоцитоза"

Во всех живых клетках непрерывно идут процессы- подстройки метаболизма в соответствии с внешними воздействиями, к которым относятся изменения химического состава и физических свойств окружающей клетку среды. Если клетка входит в состав многоклеточного организма, то во внешней среде постоянно появляются биологически активные вещества, производимые другими клетками организма. В любой клетке всегда задействованы разнообразные механизмы восприятия и передачи внешней информации и механизмы, регулирующие метаболизм клетки в соответствие с происходящими во внешней среде изменениями. Киназно-фосфатазные сигнальные каскады являются распространенным вариантом таких механизмов.

Около 2% генов человека кодируют протеиновые киназы и фосфатазы, а около 30% всех белков человека постоянно подвергаются фосфорилированию и дефосфорилированию. Киназно-фосфатазные сигнальные каскады участвуют в регуляции большинства аспектов жизнедеятельности клетки.

Регуляция активности киназ осуществляется белками активаторами и репрессорами, молекулами-мессенджерами небелковой природы, пространственным совмещением киназы с субстратом, димеризацией и аутофосфорилированием.

Антагонистами киназ являются фосфатазы, осуществляющие дефосфорилирование субстратов. Регуляция активности фосфатаз также может осуществляться очень разнообразными путями. Один из важнейших механизмов - окисление и восстановления редокс-активных цистеинов в составе фосфатаз. Селективное окисление цистеинов в активных центрах фосфатаз осуществляется пероксидом водрода, производимым ферментами ЫАБРН оксидазами (МОХ).

Примечательно, что впервые КАРРН оксидазы были открыты и охарактеризованы в нейтрофилах. Именно активность КАЭРН оксидаз обеспечивает т.н. окислительный взрыв, то есть явление увеличения немитохондриального потребления кислорода фагоцитирующими клетками. После открытия окислительного взрыва, продукция ИАОРН оксидазами супероксид-анион радикала и пероксида водорода рассматривали только с точки зрения токсичности активных форм кислорода (АФК) для интернализованных в фагоцит бактериальных или эукариотических клеток. В последнее время более подробное изучение механизмов фагоцитоза показало, что ключевая роль в обезвреживании чужеродных клеток в фагосомах принадлежит в большей степени протеазам, нежели пероксиду водорода и супероксид-анион радикалу. Ввиду низкой реактивности, пероксид водорода плохо подходит на роль токсического агента, однако, попадая в фагосому, способен при реакции с СГ образовывать гипохлорную кислоту, существенно более эффективную для окислительного разрушения бактериальныз клеток. Однако сам по себе пероксид водорода, легко диффундирующий сквозь липидные мембраны и поэтому не накапливающийся в фагосоме, вряд ли может рассматриваться, как высокотоксичное для бактериальных клеток вещество.

В последнее время показана ключевая роль NADPH оксидазы в создании условий для активации протеаз в фаголизосоме. Перенося электроны через мембрану, NADPH оксидаза участвует в создании в просвете фагосомы необходимых для активации протеаз условий.

Наряду с изучением путей, которыми фагоцит уничтожает бактериальные клетки в фагосомах, стали появляться всё новые данные о нахождении «главного фагоцитарного фермента» "NADPH оксидазы в нефагоцитирующих клетках. Была показана сигнальная функция для ферментов NOX в нефагоцитирющих клетках. Активность NADPH оксидаз в нефагоцитирующих клетках оказалась связаной с модуляцией активностей разнообразных сигнальных каскадов.

Таким образом, изучение АФК-зависимой внутриклеточной передачи сигнала в последнее время привело к переосмыслению феномена продукции супероксид аниона и пероксида водорода в эукариотических клетках. Особенно интересным авторам данной работы кажется изучения окислительного взрыва в фагоцитирующих клетках. Ещё 30 лет назад окислительный взрыв в фагоцитах рассматривался исключительно как способ разрушить клетки патогена с помощью АФК. В настоящее время, предположение о существовании сигнального аспекта окислительного взрыва, когда пероксид водорода выступает в качестве сигнальной молекулы, выглядит всё более правдоподобным.

Важность изучения киназно-фосфатазных каскадов в живых клетках сложно переоценить. Это важнейшие регуляторные механизмы, которые, по сути, осуществляют связь между влияющими на клетки внешними факторами, биохимическими реакциями, идущими в самих клетках, и «поведением» клеток. Подробное изучение путей внутриклеточной передачи сигнала одинаково важно и для фундаментальных и для прикладных исследований в области клеточной биологии.

Исследования внутриклеточной передачи сигнала с участием пероксида водорода и других АФК \п vivo затрудняются отсутствием достаточно быстрых и специфичеых методов детекции.

Кроме того, изучение внутриклеточной передачи сигнала подразумевает возможность изучать локализацию продукции АФК в живых интактных клетках.

Наиболее удачными инструментами для изучения редокс процессов в интактных индивидуальных клетках являются биосенсоры на базе флуоресцентных белков. На сегодня разработано и успешно применяется в клеточной биологии несколько генетически кодируемых сенсоров на базе зеленого флуоресцентного белка ОБР. Они представляют собой химерные белки, состоящие из флуоресцентного домена и домена, несущего редокс-активные цистеины.

При окислении цистеинов чувствительного домена происходит изменение спектра поглощения флуоресцентного белка, при восстановлении цистеинов тиол-восстанавливающими системами клетки происходит возвращение формы спектра в исходное состояние.

К недостаткам таких биосенсоров можно отнести меньший, по сравнению с другими методами детекции АФК, уровень сигнала по отношению к шуму. Кроме того, хромофорные группы всех вРР-подобных белков изменяют флуоресцентные свойства при изменении показателя рН. Словом, генетически кодируемые биосенсоры имеюр ряд недостатков, и, как и любые другие молекулярно-биологические инструменты, нуждаются в непрерывном усовершенствовании.

Таким образом, главной целью работы было изучение сигнальной роли фагоцитарной ^ШРН оксидазы в процессе фагоцитоза. Улучшение применяемого в работе молекулярного инструмента, внутриклеточного высокочувствительного к пероксиду водорода биосенсора НуРег, так же входило в наши задачи.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Целью работы было изучение сигнальной роли фагоцитарной NADPH оксидазы в процессе фагоцитоза, а также усовершенствование основного молекулярного инструмента для визуализации внутриклеточного Н2О2, биосенсора НуРег. Для достижения цели предстояло решить следующие задачи:

1) Разработка метода визуализации с помощью НуРег эндогенного Н2О2, вырабатываемого клетками при различных физиологических стимуляциях.

2) Изучение динамики продукции Н2О2 фагоцитирущими макрофагами.

3) Выявление взаимосвязи активации фагоцитарной NADPH оксидазы с активацией основных МАРК (Mitogen-Activated Protein Kinase) каскадов в фагоцитирующих макрофагах.

4) Оптимизация биосенсора НуРег с целью увеличения диапазона флуоресцентного ответа.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Марквичева, Ксения Николаевна

выводы

1) В данной работе предложены и оптимизированы методы, позволяющие детектировать продукцию пероксида водорода на уровне индивидуальных клеток in vivo. С помощью флуоресцентного генетически кодируемого биосенсора НуРег показана продукция пероксида водорода в фагоцитирующих макрофагах и стимулированных факторами роста клетках HeLa и NIH-3T3.

2) Продукция пероксида водорода при окислительном взрыве в фагоцитирующих макрофагах носит кратковременный характер. Зависимость концентрации пероксида водорода от времени, измеренная для индивидуальных клеток, принципиально отличается от таковой, измеренной для популяции фагоцитирующих клеток.

3) Пероксид водорода, производимый макрофагами при фагоцитозе, выполняет сигнальную функцию в фагоцитах. Активация МАР-киназного каскада Erkl/2 при фагоцитозе зависит от продукции пероксида водорода NADPH оксидазами.

4) Продукция пероксида водорода является достаточным условием снижения вероятности повторных событий фагоцитоза в одной и той же клетке. На основе полученных данных сформулирована гипотеза о существовании в макрофагах сигнальных процессов, проходящих с участием пероксида водорода и приводящих к подавлению фагоцитоза.

5) Новые варианты биосенсора НуРег, разработанные и охарактеризованные в данной работе, обладают увеличенным, по сравнению с исходным биосенсором, диапазоном флуоресцентного ответа на пероксид водорода. Мутации, влияющие на динамический диапазон флуоресцентного ответа биосенсора, локализованы в чувствительном к пероксиду водорода, а не во флуоресцентном домене.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Марквичева, Ксения Николаевна, Москва

1. Gerschman, R., Gilbert, D.L., Nye, S.W., Dwyer, P., & Fenn, W.O., Oxygen poisoning and xirradiation: a mechanism in common. Science 119 (3097), 623-626 (1954).

2. Michaelis, L., Fundamentals of oxidation and respiration. Sci Prog (New Haven) 5, 119-1481947).

3. Harman, D., Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. J Gerontol 11 (3), 298-300 (1956).

4. McCord, J.M. & Fridovich, I., Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem 244 (22), 6049-6055 (1969).

5. Forman, H.J., Fukuto, J.M., & Torres, M., Redox signaling: thiol chemistry defines which reactive oxygen and nitrogen species can act as second messengers. Am J Physiol Cell Physiol 287 (2), C246-256 (2004).

6. Sbarra, A.J. & Karnovsky, M.L., The biochemical basis of phagocytosis. I. Metabolic changes during the ingestion of particles by polymorphonuclear leukocytes. J Biol Chem 234 (6), 13551362 (1959).

7. Rossi, F. & Zatti, M., Biochemical aspects of phagocytosis in polymorphonuclear leucocytes. NADH and NADPH oxidation by the granules of resting and phagocytizing cells. Experientia 20 (1), 21-23 (1964).

8. Goldstein, I.M., Roos, D., Kaplan, H.B., & Weissmann, G., Complement and immunoglobulins stimulate superoxide production by human leukocytes independently of phagocytosis. J Clin Invest 56(5), 1155-1163 (1975).

9. Goldstein, I.M., Cerqueira, M., Lind, S., & Kaplan, H.B., Evidence that the superoxidegenerating system of human leukocytes is associated with the cell surface. J Clin Invest 59 (2), 249-254 (1977).16