Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры окислительно-восстановительных процессов в живых системах

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры окислительно-восстановительных процессов в живых системах"

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

На правах рукописи

Билан Дмитрий Сергеевич

Генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры окислительно-восстановительных процессов в живых системах

специальность -03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

11 АПР 2014

Москва 2014 005547121

005547121

Работа выполнена в Группе биологии активных форм кислорода в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН).

Научный руководитель:

Белоусов Всеволод Вадимович, доктор биологических наук. Официальные оппоненты:

Черняк Борис Викторович, доктор биологических наук, заведующий Лабораторией биоэнергетики клетки Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова.

Воротников Александр Вячеславович, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Лаборатории молекулярной эндокринологии Института экспериментальной кардиологии, Российский кардиологический научно-производственный комплекс Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им.

A.Н. Баха РАН.

Защита состоится « 28 » мая 2014 года в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при ИБХ РАН по адресу: 117997, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте wvvw.ibch.ru ИБХ РАН. Автореферат разослан « » 2014 года.

Ученый секретарь диссертацнонпого совета, доктор физико-математических паук

B.Л. Олейников "

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Окислительно-восстановительные процессы играют ключевую роль в клетках любых организмов. Широкий спектр биохимических реакций зависит от тонкой регуляции окислительно-восстановительных систем клетки. Исследования последних десятилетий показали, что многочисленные окислительно-восстановительные преобразования внутри клеток в ответ на разные стимулы формируют очень сложную сеть взаимодействующих компонентов и требуют их подробного изучения. Некоторые соединения, представленные в клетке параллельно в окисленном и восстановленном состояниях, формируют универсальные сопряженные окислительно-восстановительные или, так называемые, активные редокс пары, например, НАД+/НАДН, НАДФ+/НАДФН и окисленный/восстановленный глутатион (0880/08Н).

Для аэробных организмов кислород занимает важнейшее место в регуляции жизненно необходимых внутриклеточных процессов, в том числе и окислительно-восстановительных. В настоящий момент известны сигнальные функции кислорода, которые осуществляются через его активные формы (АФК). АФК образуются в ходе протекания многих биохимических процессов как спонтанно, так и целенаправленно при нормальном физиологическом состоянии клеток. Особое внимание уделяют пероксиду водорода, Н2О2, который активирует клеточные сигнальные каскады и выступает в качестве вторичного мессенджера.

Но до недавнего времени изучение окислительно-восстановительных процессов в живых системах в режиме реального времени было невозможным, поскольку отсутствовали подходящие методы. Для регистрации АФК существуют различные синтетические красители. Но многие среди них, как правило, не являются специфичными, а их реакции необратимы. Что касается изучения в живых клетках активных редокс пар, то до недавнего времени вообще не существовало подходящих методов. Многие проблемы были решены благодаря созданию генетически кодируемых биосенсоров на основе флуоресцентных белков.

Одно из направлений настоящей работы посвящено оптимизации свойств уже существующего и в настоящий момент широко применяемого во всем мире биосенсора на пероксид водорода НуРег. Другая важная часть работы направлена на создание абсолютно нового биосенсора, который позволит регистрировать динамику изменения такого важного параметра, как соотношение НАД+/НАДН в живых клетках и их компартментах.

Цель работы. Цель настоящей работы заключалась в усовершенствовании генетически кодируемого флуоресцентного биосенсора для пероксида водорода НуРег, а также создание флуоресцентного генетически кодируемого сенсора на основе бактериального белка T-Rex (Thermits thermophilus) и пермутированного желтого флуоресцентного белка cpYFP для исследования динамики изменения соотношения НАД+/НАДН в живых системах. Для выполнения сформулированной цели были поставлены и реализованы следующие задачи:

1. Методом направленного мутагенеза создать и провести отбор усовершенствованной версии НуРег.

2. Охарактеризовать усовершенствованную версию НуРег в условиях in vitro и in vivo.

3. Оценить возможность использования биосенсора НуРег и его усовершенствованной версии в режиме детекции времени жизни флуоресценции.

4. Создать генетически кодируемый флуоресцентный сенсор для регистрации соотношения НАД+/НАДН на основе бактериального белка T-Rex и интегрированного в его последовательность пермутированного желтого флуоресцентного белка cpYFP.

5. Охарактеризовать полученный сенсор для регистрации соотношения НАД+/НАДН в системе in vitro и в условиях живой клетки на уровне отдельных компартментов.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе был усовершенствован генетически кодируемый флуоресцентный сенсор для регистрации пероксида водорода НуРег путем введения в его структуру мутации H34Y. Полученный вариант биосенсора, НуРег-3, обладает рядом преимуществ перед НуРег и созданным ранее улучшенным вариантом НуРег-2. В частности, НуРег-3 обладает сравнимым с НуРег-2 динамическим диапазоном ответа, но при этом его скорости окисления и последующего восстановления существенно выше, что делает НуРег-3 более предпочтительным инструментом для регистрации быстрых колебаний Н2О2 в живых системах.

Тестирование НуРег-3 в системе in vivo на модели раны хвостового плавника Danio rerio продемонстрировало, что предпочтительнее использовать именно НуРег-3 с его более контрастным ответом по сравнению с НуРег.

Впервые, на примере биосенсоров НуРег и НуРег-3 было показано, что время жизни флуоресценции может зависеть от изменения окружения хромофора в одно-флуорофорных сенсорах. Оба сенсора были успешно применены для регистрации Н2О2 in vivo с использованием микроскопии в режиме FLIM.

На основе бактериального белка T-Rex из Thermus aquaticus и интегрированного в его последовательность пермутированного желтого флуоресцентного белка cpYFP был создан биосенсор RexYFP для регистрации динамики изменения соотношения НАД+/НАДН в живых системах, а также был разработан подход, позволяющий устранять влияние колебаний рН на сигнал сенсора.

RexYFP был охарактеризован в системе in vitro и протестирован в клетках эукариот. RexYFP на данный момент является единственным биосенсором, с помощью которого можно регистрировать динамику изменения соотношения НАД+/НАДН как в цитоплазме, так и в митохондриях клеток.

Главными результатами работы являются улучшение созданного ранее и ныне широкого известного биосенсора НуРег, а также создание абсолютно нового биосенсора RexYFP - единственного в своем роде, позволяющего регистрировать соотношение НАД+/НАДН в разных компартментах клетки.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 127 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов, заключения, списка сокращений и списка литературы, включающего 304 ссылки. Диссертация содержит 35 рисунков.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были доложены на X чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова, 2011, Москва, Россия; «Mechanisms in Biology» 38th FEBS Congress, 2013, Санкт-Петербург, Россия; «Seeing is Believing — Imaging the Processes of Life» EMBO/EMBL Symposia, 2013, Гейдельберг, Германия.

Публикации. По материалам работы опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах, 2 патента РФ.

Содержание работы

1. Усовершенствование генетически кодируемого биосенсора НуРег, созданного для регистрации пероксида ворода

В 2006 году в ИБХ РАН Белоусовым В. В. впервые был создан генетически кодируемый флуоресцентный сенсор НуРег для регистрации Н2О2, что послужило мощным стимулом для изучения роли этой молекулы в живой материи, а также создании других инструментов, основанных на принципе работы НуРег.

Биосенсор НуРег широко применяется в различных исследованиях, связанных с изучением роли молекулы Н2О2 в живых системах. С помощью НуРег можно эффективно исследовать роль Н2О2 в процессах клеточного апоптоза, ответа клетки на стимуляцию факторами роста, биосенсор позволяет визуализировать колебания концентрации Н2О2 в цитоплазме, митохондриях и других компартментах при различных физиологических и патологических процессах.

Конструкция НуРег основана на чувствительном к Н2О2 домене бактериального белка Е. coli OxyR и связанного с ним пермутированного желтого флуоресцентного белка cpYFP. OxyR специфично окисляется Н2О2 и претерпевает конформационные изменения за счет образования дисульфидной связи между цистеиновыми остатками Cys-199 и Cys-208. В результате этих внутримолекулярных перестроек происходит изменение спектра возбуждения флуоресценции белка. Для НуРег характерно наличие двух пиков возбуждения флуоресценции с максимумами на 420 им и 500нм, и один пик эмиссии с максимумом на 516 нм. В присутствии Н2О2 для биосенсора наблюдается пропорциональное увеличение интенсивности возбуждения при 500 нм и уменьшение при 420 нм. Таким образом, изменяется и соотношение интенсивностей флуоресценции (F500/F420), возбуждаемых отдельно длинами волн 420 нм и 500 нм.

Реакция НуРег является обратимой и специфичной для Н2О2. Однако, для многих биологических моделей, в которых концентрация Н2О2 меняется незначительно, динамический диапазон сенсора является недостаточным. На протяжении последнего времени предпринимались попытки улучшения НуРег. Не так давно с помощью метода случайного мутагенеза была создана первая улучшенная версия биосенсора, названная НуРег-2. Эта версия демонстрировала больший динамический диапазон ответа на Н2О2 (максимальное изменение соотношения пиков F500/F420 в ответ на окисление) по сравнению с исходным вариантом приблизительно в 2 раза. Как оказалось, ключевую роль в улучшении динамического диапазона НуРег-2 сыграла единственная замена Ala в положении 406 на Val. Замена в НуРег-2

4

соответствует известной по литературным данным мутации A233V в OxyR дикого типа в области, ответственной за димеризацию молекулы. Однако при улучшенном динамическом диапазоне НуРег-2 все же потерял некоторые из своих положительных свойств. НуРег-2 формирует прочные димеры, что было показано с помощью метода гель-фильтрации, в отличие от мономерного НуРег. Кроме того, НуРег-2 демонстрирует сравнительно медленную, по сравнению с НуРег, кинетику реакций окисления и восстановления, что может сказываться на временном разрешении детектирования

н2о2.

1.1. НуРег-3 - версия биосенсора, сочетающая в себе полезные качества НуРег и НуРег-2

Мы попытались создать версию НуРег с улучшенным динамическим диапазоном, не изменяя при этом других полезных свойств биосенсора. Точечная мутация A233V в структуре OxyR каким-то образом привела к изменению динамического диапазона НуРег. Не исключено, что интерфейс, ответственный за формирования димера, может отличаться для OxyR дикого типа и в составе химерной конструкции НуРег. Мы предположили, что и другие мутации в этой же области могут привести к появлению биосенсора с улучшенными характеристиками.

Мы протестировали несколько вариантов НуРег с точечными мутациями в той же области, что и A233V для НуРег-2. Опираясь на результат НуРег-2, мы не могли предположить, как именно и какие мутации изменят свойства биосенсора. Поэтому мы протестировали мутации I110D, L124D, H114Y и F219A белка OxyR, которые ранее были охарактеризованы для белка дикого типа как фенотипические, то есть влияющие на активность wtOxyR. Все эти мутации в большей или меньшей степени влияют на димерное состояние OxyR.

Проэкспрессировав полученные версии НуРег с мутациями I110D, L124D, H114Y и F219A в эукариотических клетках HeLa Kyoto, мы определили их сигнал (F500/F420) в ответ на добавление в среду 150 мкМ Н2О2. Мутации I110D, L124D и F219A в составе биосенсора привели к сильному уменьшению его динамического диапазона по сравнению с изначальным вариантом НуРег. Более успешной оказалась версия с введенной мутацией H114Y, сигнал НуРег в этом случае стал сравним с сигналом НуРег-2 по динамическому диапазону (Рис. 1).

Время (мин)

120 100 Í4 80

ф

Полу-окисление

НуРег-2

HyPer-3 HyPer-H34Y--A406V

16

14

312 5

s.10

18 ф _

Полу-восстановление

+

НуРег НуРег-2 НуРег-3 HyPer-H34Y--A406V

Рисунок 1. Сравнение свойств биосенсора НуРег-3 с НуРег и НуРег-2

А) Изменение соотношения F500/F420 в клетках HeLa Kyoto, экспрессирующих HvPer-3 (верхний ряд) и НуРег (нижний ряд) при добавлении 150 мкМ Н2О2. Числа обозначают время в секундах. Шкала 40 мкм. Клетки окрашены в псевдоцвета, соответствующие значениям соотношения F500/F420 (черный цвет соответствует минимальному значению, белый - максимальному). Б) Динамика изменения соотношения F500/F420 в клетках HeLa Kyoto, экспрессирующих НуРег (синяя линия). НуРег-2 (красная линия) и НуРег-3 (черная линия) при добавлении 150 мкМ HiOi. В) Полупериод окисления НуРег, НуРег-2, НуРег-3 и HyPer-H34Y-A406V. Точка времени О секунд соответствует моменту добавления Н2О2 Г) Полупериод восстановления НуРег. НуРег-2, НуРег-3 и HyPer-H34Y-A406V. Точка времени 0 минут соответствует максимальному значению соотношения F500/F420, достигнутому после добавления Н2О2. На диаграммах В и Г показаны средние значения (построены по результатам 7 независимых экспериментов для НуРег. 10 для НуРег-2, 10 для НуРег-3. 4 для НуРег-H34Y-A406V) и стандартное отклонение.

Более того, для HyPer-H114Y характерны более высокие скорости окисления и восстановления по сравнению с НуРег-2. Мы измерили полупериоды окисления и восстановления для НуРег, НуРег-2 и HyPer-H114Y. Полупериод окисления НуРег-H114Y приблизительно в 1,4 раза меньше, чем для НуРег-2. Полупериод восстановления HyPer-H114Y сопоставим с восстановлением НуРег и значительно короче по сравнению с НуРег-2 (Рис. 1 В,Г). Новый полученный вариант биосенсора с мутацией H114Y, отличающийся высоким динамическим диапазоном и быстрым ответом, мы назвали НуРег-3. Мутация H114Y в OxyR дикого типа соответствует позиции H34Y в НуРег.

1.2. Сравнение аффинности и скорости реакции полученного НуРег-3 с НуРег и НуРег-2

Разница полупериодов окисления НуРег, НуРег-2 и НуРег-3 может быть связана с разной аффинностью этих биосенсоров к своему субстрату, что может быть вызвано мутациями. С другой стороны, это может быть связано с тем, что скорость реакции исследуемых биосенсоров с Н2О2 отличается.

Поскольку нам не удалось выделить белковый препарат НуРег в полностью восстановленном состоянии, измерение кинетики реакции мы провели в эукариотических клетках для каждого вида сенсора. Для этой цели мы использовали ц-слайды, в которых мы культивировали клетки и проводили флуоресцентную микроскопию. Преимуществом этих слайдов является небольшой рабочий объем (100 мкл), это позволяет очень быстро заменять клеточную среду при частом режиме съемки микроскопа и измерять скорость реакций псевдопервого порядка. Ранее для НуРег было определено, что выделенный белок реагирует на добавление Н2О2 от 25 нМ. В клетках Е. coli и цитоплазме эукариот сигнал сенсора детектируем от 5 мкМ эндогенного Н2О2. Эти данные согласуются с данными, полученные для OxyR дикого типа. Это позволило нам определить наличие приблизительно 200-500-кратного градиента Н2О2 через цитоплазматическую мембрану. С учетом этого мы установили, что концентрации Н2О2, при которых скорость реакции между сенсором и Н2О2 равна половине от максимальной, составляют 160 нМ для НуРег, 290 нМ для НуРег-2, 260 нМ для НуРег-3. Константы скорости реакции псевдопервого порядка (Ks) равны 5-105 М"1 сек"' для НуРег, 1,2-105 М"1 сек"1 для НуРег-2 и 2,510s М"1 сек"1 для НуРег-3. Среди всех вариантов НуРег именно для НуРег-2 характерна самая низкая скорость реакции, что объясняет его более медленный ответ на Н2О2. В то время как НуРег-3 занимает промежуточное положение между НуРег и НуРег-2 по скорости реакции с Н2О2 и

7

полупериоду окисления. Вероятнее всего, что разные полупериоды восстановления биосенсоров также связаны с отличиями в скоростях реакций окисленных НуРег, НуРег-2 и НуРег-3 с клеточными тиол-восстанавливающими компонентами клетки.

1.3. Сравнение спектральных характеристик НуРег-3 с НуРег и НуРег-2

Мы сравнили яркость всех имеющихся вариантов НуРег на выделенных препаратах. Все измерения мы проводили с окисленной формой белков, чего легко добиться путем добавления Н2О2 к пробе. Квантовый выход для НуРег, НуРег-2 и НуРег-3 имеет одинаковое значение и составляет 0,1. При этом значения коэффициентов экстинкции отличаются. Коэффициенты экстинкции при 490 нм составляют 17000 М"1 см"1 для НуРег, 25000 М"1 см"' для НуРег-2 и 17000 М"1 см"1 для НуРег-3. Учитывая значение квантового выхода, яркость для НуРег равна 1700 М"1 см"1, для НуРег-2 - 2500 М"1 см"1, для НуРег-3 - 1700 М"1 см"1, что составляет 5-7 % от яркости ЕвРР.

1.4. Сравнение олигомерного состояния НуРег-3 с НуРег и НуРег-2

Мутация Н34У в составе НуРег-3 находится в той же области белка ОхуК, что и мутация А406У в НуРег-2. Эта область отвечает за димеризацию белка ОхуК дикого типа. В то время как НуРег преимущественно находится в мономерном состоянии, мутация А406У в ОхуЯ-части НуРег-2 сделала биосенсор строгим димером. Мы определили какой эффект вызывает мутация Н34У, находящаяся в том же интерфейсе. Для этого воспользовались методом гель-фильтрационной хроматографии.

Оказалось, что при низкой концентрации в растворе (0,02 мг/мл) НуРег-3 находится преимущественно в мономерном состоянии, при увеличении концентрации (до 1 мг/мл) образуется смесь димерной и мономерной форм белка (Рис. 2). Таким образом, по своему олигомерному состоянию НуРег-3 ближе к НуРег, а мутации А406У и Н34У оказывают разное влияние на олигомеризацию белка. Это говорит о том, что увеличенный динамический диапазон НуРег-2 и НуРег-3, по всей видимости, не зависит от олигомерного состояния этих белков. Но существует некая корреляция между скоростями реакций окисления/восстановления и олигомерным состоянием этих белков. Мы определили, что самым медленным сенсором является димерный НуРег-2, а самым быстрым - мономерный НуРег. Что же касается НуРег-3, то он как раз занимает среднюю позицию между НуРег и НуРег-2 по всем перечисленным параметрам.

Молекулярная масса (кДа)

Рисунок 2. Результаты гель-фильтрационной хроматографии для НуРег, НуРег-2 и НуРег-3

Представлены профили элюции для всех трех белков. Красные и черные линии обозначают низкие и высокие концентрации белка в наносимой пробе, соответственно.

1.5. НуРег с объединенными мутациями A406V и H34Y

Мы предположили, что объединение двух мутаций A406V и H34Y в одной конструкции НуРег приведет к появлению варианта с еще более лучшими показателями. Однако созданный HyPer-A406V-H34Y отличался по своим свойствам от всех существующих. Динамический диапазон НуРег с двумя мутациями сравним с НуРег-2 и НуРег-3. Но для HyPer-A406V-H34Y оказались характерными очень длинные полу периоды окисления и восстановления (Рис. 1). Этот вариант НуРег в гораздо меньшей степени пригоден для его использования в регистрации Н2О2 в режиме реального времени, чем НуРег, НуРег-3 и даже НуРег-2, но может быть рассмотрен в качестве долговременного индикатора, благодаря тому, что длительное время пребывает в окисленном состоянии после стимуляции.

1.6. Тестирование HyPer-3 in vivo: модель раны в Danio rerio

Ранее НуРег был успешно применен для визуализации градиента Н2О2 в тканях

zebrafish Danio rerio на модели раны хвостового плавника. Градиент концентрации

Н2О2 начинал формироваться через 3 минуты после нанесения раны и достигал своего

максимального значения примерно через 20 минут, распространяясь на 100-200 мкм

9

вглубь эпителия хвостового плавника. Градиент Н2О2 служит для привлечения нейтрофилов в область воспаления. На этой модели мы протестировали НуРег-3. Для этого в эмбрионы Danio rerio на стадии одной клетки мы инъецировали мРНК, кодирующую НуРег-3, после чего наблюдали за флуоресценцией образца в течение последующих трех дней. Эту же самую процедуру мы проделали с НуРег. Несмотря на то, что по яркости выделенные белки НуРег и НуРег-3 не отличаются, по какой-то причине в используемой модели in vivo флуоресцентный сигнал НуРег-3 оказался очень слабым.

Для получения оптимального уровня экспрессии и, следовательно, стабильного флуоресцентного сигнала мы, в сотрудничестве с группой Clemens Grabher (Технологический институт Карлсруэ, Германия) создали трансгенную линию zebrafisli Danio rerio, которая экспрессирует НуРег-3 под контролем промотора ß-актина. Таким образом, все клетки полученного трансгенного животного экспрессируют НуРег-3 (Рис. 3). Для экспериментов отбирали трансгенных особей со средним уровнем экспрессии.

Путем ампутации кончика хвостового плавника 3,5-дневных особей мы воспроизводили модель раны, нанесение которой приводило к возникновению градиента концентрации Н2О2 в хвостовой области (Рис. 3 Б).

Благодаря увеличенному динамическому диапазону НуРег-3 соотношение F500/F420 этого биосенсора изменяется сильнее, чем для НуРег в этой же модели (Рис. 3 Б). Максимальное изменение соотношения F500/F420 составляло 1,72 ± 0,18 для НуРег и 2,53 ± 0,39 для НуРег-3 (полученные данные усреднены по 10 измерениям для НуРег и 7 измерениям для НуРег-3 в трех независимых экспериментах; приведены средние значения и стандартное отклонение).

Таким образом, НуРег-3 представляет собой еще более лучший индикатор для регистрации Н202 в системе in vivo, чем НуРег. Ранее было показано, что изменение сигнала НуРег в описанной модели раны является pH-независимым.

1.7. Использование НуРег-3 и НуРег в FLIM микроскопии

Микроскопия с измерением времени жизни флуоресценции FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy) часто применяется для мониторинга биологических процессов с помощью методов, основанных на взаимодействиях FRET. При изменении эффективности FRET изменяется и время жизни донорного флуорофора. что позволяет осуществлять количественную оценку относительной доли молекул в разных FRET состояниях. При использовании FLIM гораздо меньше помех, связанных с светорассеянием или фотообесцвечиванием, сигнал не зависит от уровня экспрессии и

10

ему можно дать количественную оценку. Метод FLIM ранее не использовался для сенсоров с одним флуорофором, поскольку считалось, что в отсутствие флуорофора-акцептора (т.е. вне FRET-пары) время жизни флуоресценции сенсора не меняется сколь-нибудь значительно. Известны лишь данные, что время жизни флуоресценции некоторых GFP-подобных белков зависит от изменения величины рН.

А

Б

Рисунок 3. Сравнение ответов НуРег-3 и НуРег на Н2О2 в модели раны для zebrafish Danio rerio

А) Фотографии трансгенной рыбы Danio rerio, экспрессирующей НуРег-3 под контролем промотора [i-актина, на стадии развития 3,5 дней в проходящем свете (верхний снимок) и в режиме регистрации флуоресценции (нижний снимок). Вертикальная белая линия отмечает область нанесения раны. Область сердца, обведенная красной линией, с высокой интенсивностью флуоресценции содержит маркер трансгенеза cmlc2:egfp. Б) Сравнение изменений соотношения F500/F420 в области хвостового плавника Danio rerio при нанесении раны отдельно для НуРег-3 (слева) и НуРег (справа). Цветовая гамма соответствует значениям соотношения F500/F420 от нулевого (черный) до максимачьного (белый). Цифрами отмечено время в минутах от момента нанесения раны. Шкала 100 мкм.

Мы проверили, изменяется ли время жизни флуоресценции НуРег-3 и НуРег при

их взаимодействии с Н2О2. Для этого провели микроскопию в режиме FLIM клеток

HeLa, экспрессирующих НуРег-3 и НуРег, до и после добавления 100 мкМ Н2О2.

Интенсивность флуоресценции, возбуждаемой при 488 нм, увеличивалась для обеих

проб после добавления И2О2, при этом время жизни флуоресценции биосенсоров

уменьшалось (Рис. 4).

Для НуРег измеренные по фазе и модуляции времена жизни флуоресценции

составили 1,27 ± 0,04 не и 1,73 ± 0,02 не, соответственно (усредненные значения но 20

клеткам в 3 независимых экспериментах). Разница между фазой и модуляцией времени

жизни флуоресценции свидетельствует о мультиэкспоненциальном затухании

11

возбужденного состояния. После добавления Н2О2 к этим же клеткам измеренные по фазе и модуляции времена жизни флуоресценции для НуРег изменились и составили 1,02 ± 0,06 не и 1,44 ±0,13 не, соответственно.

В случае НуРег-3 измеренные по фазе и модуляции времена жизни составили 1,29 ± 0,04 не и 1,77 ± 0,05 не, соответственно. При окислении времена жизни флуоресценции НуРег-3 тоже падают до значений 0,92 ± 0,01 не (по фазе) и 1,12 ± 0,02 не (по модуляции) (усредненные значения по 11 клеткам в 3 независимых экспериментах) (рисунок 4 А). Примечательно, что при окислении молекул НуРег возрастала яркость, но при этом понижалось время жизни флуоресценции. Поскольку величина квантового выхода пропорциональна времени жизни флуоресценции, при окислении НуРег-3 происходит падение величины квантового выхода на 25 - 30 %. И в то же время окисление вызывает увеличение интенсивности флуоресценции примерно в 5 раз, что объясняется увеличением коэффициента экстинкции.

Таким образом, НуРег и НуРег-3 могут быть использованы в микроскопии в режиме FLIM, при этом для НуРег-3 характерно более выраженное изменение времени жизни флуоресценции при окислении.

Далее мы проверили возможность использования FLIM с помощью НуРег-3 ш vivo на уже используемой нами модели раны в zebrafish Danio rerio. Используя описанный выше протокол, мы провели FLIM в области раны (рисунок 4 Б, В). Оказалось, что и с помощью FLIM можно регистрировать градиент Н2О2, распространяющийся от раны вглубь эпителия хвостового плавника zebrafish, поскольку время жизни флуоресценции окисленного и восстановленного НуРег-3 отличается.

Таким образом, нами был получен усовершенствованный вариант НуРег-3, который отличается от НуРег расширенным динамическим диапазоном, а от НуРег-2 более быстрыми реакциями окисления и последующего восстановления в живых клетках, а также мономерным состоянием. Мы также продемонстрировали преимущества использования НуРег-3 в системе /я vivo и в микроскопии в режиме FLIM.

Tau (модуляция)

Tau (нсек)

Tau (модуляция)

т

Tau (нсек)

Рисунок 4. Регистрация времени жизни флуоресценции НуРег-3

А) FLIM HyPer-З при добавлении Н2О2 Слева изображены клетки HeLa, экспрессирующие HyPer-З, до добавления HiOi. Справа те же клетки, но уже через минуту после добавления 100 мкМ Н2О1. Сверху вниз изображены: средняя интенсивность флуоресценции, увеличивающаяся после добавления Н2О2; время жизни флуоресценции, измеренное по фазе, с соответствующими графиками распределения интенсивности флуоресг/енции и времени жизни флуоресценции; время жизни флуоресценции, измеренное по модуляции, с соответствующими графиками распределения интенсивности флуоресценции и времени жизни флуоресценции. Б) Регистрация Н2О2 в модели раны хвостового плавника zebrafish Danio rerio с использованием FL1M HyPer-З. Слева представлен снимок, отражающий интенсивность флуоресценции; справа - изображение FLIM. ROJ1 соответствует области раны; R012 соответствует области, расположенной далеко от нее. В) График распределения времени жизни флуоресценции в областях ROI1 и ROI2.

13

2. Создание генетически кодируемого флуоресцентного биосенсора для регистрации соотношения НАД+/НАДН

До недавнего времени методов, позволяющих регистрировать динамику изменения соотношения НАД+/НАДН в живых системах, не существовало. С помощью УФ и двух-фотонной микроскопии можно было детектировать лишь флуоресцирующий НАДН, но более важным клеточным показателем является именно соотношение окисленной и восстановленной форм данного кофактора. От клеточного соотношения НАДУНАДН зависит протекание многих важнейших биохимических реакций, а сам параметр отражает общее окислительно-восстановительное состояние клетки. Однако недостаток методов долгое время затруднял исследование этого важного клеточного показателя в живых системах.

Мы разработали метод, который позволяет регистрировать в режиме реального времени динамику изменения соотношения НАД+/НАДН в живых системах на уровне не только единичных клеток, но и на уровне отдельных внутриклеточных компартментов, в том числе митохондрий. Полученный биосенсор для регистрации соотношения НАД+/НАДН, который мы назвали впоследствии ЯехУРР, основан на бактериальном белке Т-Лех (из ТИегтш адиаИст) и пермутированного желтого флуоресцентного белка срУРР.

2.1. Конструкция и спектральные характеристики ИехУКР

В качестве основы разрабатываемого нами биосенсора для регистрации динамики изменения соотношения НАДУНАДН мы выбрали белок Т-Лех из ТИегтш адааНсш, который в этих бактериях выступает в качестве природного сенсора для регистрации данного клеточного параметра. В клетках для белка Т-Яех характерны два конформационных состояния, взаимные переходы которых зависят от показателя соотношения НАД+/НАДН. В аэрированных условиях белок находится в НАД+-связывающем состоянии, при этом он образует прочный комплекс с определенными последовательностями ДНК, выступая в качестве репрессора некоторых бактериальных генов. В аэробных условиях значение соотношения НАДУНАДН в клетке снижается, Т-Яех сразу связывает НАДН, поскольку именно к восстановленной форме кофактора этот белок имеет набольшее сродство. При этом структура Т-Яех претерпевает конформационные изменения и переходит в более компактную, которая уже не связывает ДНК.

Для создания биосенсора на основе Т-Яех мы решили попробовать визуализировать реакцию бактериального белка на изменение соотношения

14

НАДТНАДН. Для этого мы выбрали несколько позиций в структуре T-Rex и на уровне гена вставили последовательность cpYFP, создав, таким образом, несколько вариантов химерной конструкции T-Rex-cpYFP. На первом этапе создания биосенсора было необходимо отобрать такую конструкцию химерного белка, в которой конформационные изменения T-Rex передавались бы и на флуоресцентный белок, вызывая при этом изменения в его спектре. Важно, чтобы в химерном белке T-Rex по-прежнему обладал способностью к регистрации соотношения НАД+/НАДН, a cpYFP не утрачивал флуоресцентных свойств. Всего было проанализировано 11 вариантов Т-Rex-cpYFP, отличающихся положением cpYFP в структуре T-Rex. Во всех позициях cpYFP был интегрирован в структуру T-Rex через короткие пептидные линкеры SAG и GT, ранее пермутант cpYFP с подобными линкерами уже был использован для создания биосенсора НуРег.

Все версии полученного химерного белка мы проэкспрессировали в клетках Е. coli штамма XL 1 Blue, чтобы из всех созданных конструкций отобрать флуоресцентные. Оказалось, что в составе большинства версий химерного белка cpYFP либо полностью утратил, либо значительно снизил свою способность к флуоресценции. Лишь конструкции, в которых cpYFP был интегрирован в структуру T-Rex по позициям 79-80, 99-100 и 116-117, были флуоресцирующими. При этом по интенсивности флуоресценции в большей степени среди всех выделялся химерный белок T-Rex-79-80-cpYFP. Его полную генетическую конструкцию мы подвергли случайному мутагенезу в целях улучшения свойств белка. И действительно, из полученной библиотеки нам удалось найти клон, который отличался более быстрым созреванием хромофора и еще большей интенсивностью флуоресценции по сравнению с исходным вариантом. После секвенирования последовательности отобранной конструкции мы установили, что на улучшение характеристик белка повлияли появившиеся мутации L169P, Y175N и D313G, все расположенные в последовательности cpYFP. Именно этот химерный белок T-Rex-79-80-cpYFP(L169P-Y175N-D313G) позже и стал биосенсором для регистрации соотношения НАД+/НАДН, который мы будем далее называть RexYFP (Рис. 5). Были получены и другие пробные версии биосенсора, но все они в итоге уступили конечному варианту на разных этапах исследования.

Белок RexYFP был выделен. Спектр возбуждения флуоресценции представлен одним пиком с максимумом на 490 нм, для спектра эмиссии характерен пик с максимумом интенсивности на 516 нм (Рис. 5 Б).

360 380 400 420 440 460 460 500 520

Длина волны (нм)

НАД НАДРН

■ НАДН АТФ

Нуклеотид(мкМ)

- ИехУИ>

- 50 нМ НАДН

- 250 ИМ НАДН

- 1 мкМ НАДН

+ НАДН

490 нм

Рисунок 5. Структура и спектральные характеристики ЛехУБР

A) Схема структуры ЯехУРР. Биосенсор состоит из срУБР (изображен желтым), который интегрирован в структуру Т-Яех (изображен синим) в позицию между 79 и 80 аминокислотными остатками через короткие пептидные линкеры &4С и СТ (изображены красным). На схеме отмечены мутации, присутствующие в структуре ЯехУБР (номера в скобках соответствуют позициям ЕУБР). Б) Спектр флуоресценции КехУРР. Спектр возбуждения флуоресценции (черная кривая) имеет выраженный пик с максимумом при 490 нм. максимум эмиссии составляет при 516 нм (красная линия).

B) Изменение спектра возбуждения флуоресценг/ии ЯехУРР (250 нМ в пробе) при увеличении концентрации НАДН в той же самой пробе (до 50 нМ, 250 нМ и 1мкМ). Г) Зависимость сигнала ЯехУРР (Р490норм=1/Р490, приведено к 1) от концентрации нуклеотидов НАД* (красная кривая), НАДН (черная кривая). НАДФН (зеленая кривая), АТФ (синяя кривая) в диапазоне концентраций от 10 нМ до 50 мкМ. Усредненные кривые построены по результатам пяти независимых экспериментов.

2.2. Определение чувствительности ИехУГР

При выделении белок Т-Яех частично находится в НАДН-связанном состоянии из-за его высокого сродства именно к восстановленной форме кофактора. Для устранения связанного клеточного НАДН мы перед каждым экспериментом

16

переосаждали белок с помощью сульфата аммония в кислых условиях, после чего вновь растворяли. Качество очистки оценивали по спектрам поглощения пробы, поскольку НАДН поглощает при 340 нм.

Далее к пробе очищенного белка (250 нМ) добавляли НАДН и регистрировали спектры возбуждения флуоресценции. Даже добавление небольшого количества НАДН к пробе приводило к уменьшению интенсивности пика (Рис. 5 В). В дальнейшем мы определяли сигнал биосенсора ЯехУРР, как обратную величину значения интенсивности флуоресценции, возбуждаемой при 490 нм (1/Р490). При таком подходе увеличение концентрации НАДН в системе приводит к увеличению сигнала биосенсора.

Известно, что все нуклеотид связывающие домены белков могут отличаться по своей чувствительности к разным нуклеотидам. Мы проверили сродство ЯехУРР к основным клеточным нуклеотидам: к НАД4, НАДН, НАДФН и АТФ в диапазоне концентраций от 10 нМ до 50 мкМ при концентрации белка в пробе 250 нМ (Рис. 5 Г).

Было показано, что АТФ и НАД+ не вызывают изменений флуоресценции ЯехУРР даже при больших концентрациях. Сигнал изменяется в присутствии НАДН и НАДФН, но значения константы сродства (К') для этих нуклеотидов разные. Для НАДН это значение составляет 180 нМ, а для НАДФН - 6,2 мкМ. При этом следует помнить, что внутриклеточная концентрация НАДФ ниже, чем НАД (в клетках печени крысы примерно в 10 раз), но при нормальных физиологических условиях общий пул НАДФ в клетке более восстановлен, в отличие от пула НАД. Мы не исключаем вероятности того, что при некоторых условиях НАДФН все же может влиять на сигнал ЯехУРР.

При нормальных физиологических условиях в цитоплазме клеток млекопитающих соотношение между свободными 11АД+ и НАДН может варьировать от 1 до 700. Это означает, что окисленная форма кофактора всегда присутствует в клетке в большей концентрации, чем восстановленная. Для того чтобы проверить как будет изменяться сигнал биосенсора при увеличении НАДН в пробе на фоне уже имеющегося избытка НАД+, мы использовали сопряженную ферментативную систему (Рис. 6 А). В системе участвует гексокиназа, которая катализирует реакцию превращения глюкозы в глюкозо-6-фосфат. Во второй реакции сопряженной системы дегидрогеназа превращает глюкозо-6-фосфат в 6-фосфоглюконат и переносит восстановительные эквиваленты на НАД+. Таким образом, при функционировании данной системы происходит постепенное увеличение концентрации НАДН в пробе до тех пор, пока не расходуется НАД+.

АТФ АДФ

РехУРР

НАД НАДН + Н

Глюкоза

Глюкоза-^^^^^^ 6-фосфат 2

6-фосфоглюконат Ь

1 - Гексокиназа

2 - Глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа

В

350 400 450 500

Длина волны (нм)

4,5-, 4,0 -3,5 а 3,0

Э1 лг|

Л 2.5-

чГ

" 2,01.51,0-

V.

20г 10"

5-

ИехУРР — НуРегС1995

10 20 30 40

соотношение НАД*/НАДН

РН

Рисунок 6. Зависимость сигнал Яех УРР от соотношения НАД"/НАДН и величины рН

А) Схема сопряженной ферментативной системы для определения зависимости сигнала ЯехУРР от значений соотношения НАД*/НАДН. Б) Изменение спектра возбуждения флуоресценции пробы, содержащей ЯехУРР и все компоненты работающей сопряженной системы. Временной интервал между спектрами составляет 30 секунд. В) Зависимость сигнала ЯехУРР (Р490нирЛ,=1/Р490. приведено к 1) от значений соотношения НАД*/НАДН. Усредненная кривая построена по результатам трех независимых экспериментов. Г) Зависимость интенсивности флуоресценции хромофора срУРР (Р490трм=Р490, приведено к 1) в составе НуРег-С1998 (красная линия) и ЯехУРР (черная линия) от значений рН среды. Кривые построены по результатам двух независимых экспериментов.

В состав реакционной смеси входили глюкоза, 1^-АТФ, НАД+, гднжозо-6-фосфатдегидрогеназа и ЛехУРР. Реакцию начинали добавлением гексокиназы. Образование НАДН в системе приводит к увеличению поглощения пробы при 340 нм с одновременным падением интенсивности пика возбуждения флуоресценции на 490 нм биосенсора ЯехУРР (Рис. 6 Б). Подобрав предварительно оптимальную скорость реакции, в каждой временной точке мы рассчитали значение соотношения НАД /НАДН в пробе и определили зависимость сигнала ЯехУРР от величины этого

параметра (Рис. 6 В). Данный эксперимент продемонстрировал, что RexYFP способен детектировать небольшие количества НАДН даже на фоне избытка других нуклеотидов, в частности НАД+ и АТФ. В каждой серии эксперимента мы использовали разные концентрации биосенсора (100, 250, 750 нМ), сохраняя при этом все остальные параметры, и убедились, что сигнал RexYFP не зависит от его концентрации в пробе.

Во всех экспериментах in vitro мы также контролировали значение рН реакционных смесей. Поэтому следует подчеркнуть, что изменения сигнала RexYFP в наших экспериментах не вызвано изменением величины рН.

2.3. Подбор рН-контроля при работе с биосенсором RexYFP в живых системах

Как и другие биосенсоры, созданные на основе cpYFP, сигнал RexYFP обладает рН-зависимостью. При работе с биосенсором в клетках эукариот мы убедились, что многие физиологические процессы, связанные с изменением соотношения НАД+/НАДН, связаны также и с рН-колебаниями. Закисление среды приводит к понижению флуоресценции RexYFP, это может привести к возникновению ложного сигнала. Для того чтобы учесть влияние рН на сигнал RexYFP мы использовали контрольный белок HyPer-C199S (SypHer), который тоже создан на основе пермутанта cpYFP и, следовательно, должен иметь схожую рН-зависимость. НуРег является генетически кодируемым биосенсором для регистрации Н2О2. Мутация C199S делает этот сенсор нечувствительным к своему субстрату, но рН-зависимость cpYFP остается прежней. Таким образом, изменения флуоресцентного сигнала SypHer свидетельствуют лишь об изменениях величины рН среды. Для подтверждения одинаковой рН-зависимости RexYFP и SypHer, оба белка были выделены. Мы сравнили рН-зависимость флуоресценции, возбуждаемой при 490 нм, для обоих белков (Рис. 6 Г). Оказалось, что для белков характерны разные величины рКа, несмотря на то, что оба они содержат один и тот же флуоресцентный белок в своей основе. Для SypHer величина рК,, составляет 8,5, в то время как для RexYFP - 7,6. Несмотря на различия в рКц для биосенсоров характерно одинаковое изменение флуоресценции (приблизительно в 8 раз) в физиологическом диапазоне изменений рН (6,5 - 8,0).

В дальнейшем мы решили нормировать сигнал RexYFP на сигнал SypHer, полученные при одинаковых условиях эксперимента. Такой подход позволяет учитывать влияние рН и дает достоверную информацию об изменении внутриклеточного соотношения НАД7НАДН.

2.4. Использование RexYFP в клетках эукариот

На следующем этапе исследования мы проверили возможность биосенсора RexYFP функционировать в живых клетках. Для этого мы проэкспрессировали конструкцию биосенсора в клетках линий HeLa и НЕК293.

В экспериментах, связанных с микроскопией клеток, мы использовали восьмилуночные слайды (ц-Slide 8 well, ibidi) и покадровый мультипозиционный режим съемки микроскопа. Это позволило нам детектировать сигналы сразу нескольких биосенсоров одновременно.

К клеткам, экспрессирующих RexYFP и SypHer, мы добавляли лактат и пируват. Обе добавки вызывали мгновенное падение сигнала RexYFP. При этом снижение интенсивности флуоресценции наблюдалось и для рН-сенсора SypHer. Изменение сигнала вызвано закислением цитоплазмы, поскольку транспорт лактата и пирувата через цитоплазматическую мембрану осуществляется благодаря Н+-симпорту. Мы усреднили сигналы биосенсоров по большому количеству клеток и нормировали усредненный сигнал RexYFP на сигнал SypHer. Нормированный сигнал RexYFP не зависит от рН-колебаний и отражает изменение соотношения НАД+/НАДН в клетке. Сигнал RexYFP на добавление пирувата и лактата мы сравнили с сигналом еще одного биосенсора на соотношение НАД+/НЛДН Peredox, опубликованного ранее. Peredox также представляет собой химерный белок, но в отличие от RexYFP, пермутант флуоресцентного белка T-Sapphire связан с двумя субъединицами T-Rex. Поэтому механизм работы Peredox основан на межмолекулярных взаимодействиях двух субъединиц в составе димера T-Rex. При увеличении НАДН в системе интенсивность флуоресценции Peredox растет. Дня рациометрического измерения к Peredox был пришит флуоресцентный белок mCherry, поэтому сигнал этого биосенсора регистрируют как F405/F561. При тестировании биосенсора RexYFP мы одновременно проводили те же самые эксперименты с Peredox, сравнивая полученные результаты.

На рисунке 7 А,Б приведены сравнения сигналов RexYFP и Peredox в ответ на добавление к клеткам линии НЕК293 пирувата и лактата. После добавления 5 мМ пирувата оба сенсора регистрировали падение цитоплазматического НАДН. А добавление избытка лактата (20 мМ) в среду наоборот привело к быстрому повышению НАДН, при этом после 15 минут от момента добавки соотношение окисленной и восстановленной форм кофактора вернулось приблизительно к прежнему значению. RexYFP и Peredox демонстрируют схожие характер и амплитуду ответа. Это позволяет

сделать вывод о том, что предложенный нами способ контроля рН-изменений в клетке и нормирование сигнала КехУРР вполне эффективен.

♦5 мМ пируват (ЗехУРР

• Регедох

5 10 15

Время, мин

Регескж

5 10 15

Время, мин

Время, мин

Рисунок 7. Сравнение сигналов ИехУГР и Регейох в экспериментах с живыми

клетками

Изменения сигналов Вех УРР (синие линии) и Регес!ох (красные линии) в ответ на добавление А) 5 мМ пирувата Б) 20 мМ лактата В) 5 мкМротенона. Используемые линии клеток в эксперименте с пируватом и лактатом НЕК293, с ротеноном - НеЬа. Сигнал Регес!ох рассчитывается как Г405/Г-'561, сигнал Не.хУРР рассчитывается как Р490ИуГег.с^Р490КсхП^ Кривые обоих биосенсоров построены по результатам 3 независимых экспериментов

Митохондрии являются главными потребителями НАДН в клетке. До сих пор оставалось неясным передаются ли изменения окислительно-восстановительного состояния матрикса митохондрий в цитоплазму. Мы ингибировали дыхательную цепь митохондрий на уровне комплекса I, используя ингибитор ротенон. С помощью биосенсоров ЯехУРР и Реге(1ох регистрировали изменения соотношения НАД+/НАДН в цитоплазме. Оба сенсора регистрировали увеличение цитоплазматического НАДН при инкубации клеток с 5 мкМ ротенона. Вероятно, это связано с тем, что ингибирование

комплекса I приводит к накоплению НАДН в матриксе митохондрий. При этом происходит восстановление пула НАД и в цитоплазме (Рис. 7 В).

Ингибирование дыхательной цепи митохондрий с помощью ротенона приводит к более медленному восстановлению пула НАД по сравнению с динамикой, которую мы прежде наблюдали при добавлении лактата. Регес1ох достигает максимума ответа быстрее, чем ЯехУРР. Это связано, скорее всего, с тем, что Регескж имеет большее сродство к НАДН, его константа сродства составляет около 5 нМ. По этой причине Регес1ох не может быть использован для работы в митохондриях, в условиях с более высокими концентрациями НАДН. В матриксе митохондрий соотношение НАД+/НАДН приблизительно в сто раз ниже по сравнению с цитоплазмой.

2.5. Сравнение окислительно-восстановительного состояния пула НАД в цитоплазме и матриксе митохондрий с помощью ИехУЕР

Мы создали митохондриальную версию биосенсора ЯехУРР, названную ЯехУКР-мито, поместив на Ы-конец белка последовательность митохондриальной локализации. Влияние рН мы учитывали с помощью 8урНег с митохондриальной локализацией (йурНег-мито). В каждом эксперименте в одинаковых условиях мы параллельно регистрировали сигналы сразу четырех биосенсоров: ЗурНег, 8урНег-мито, ЯехУРР и ЯехУРР-мито.

Мы вновь убедились в том, что при ингибировании комплекса I с помощью ротенона происходит восстановление пула НАД в цитоплазме. Этот процесс наблюдался и в матриксе митохондрий (Рис. 8 А).

В другой серии экспериментов мы ингибировали комплекс II дыхательной цепи митохондрий с помощью ингибитора 3-нитропропионовой кислоты (З-ЫР). Ингибирование комплекса II привело к незначительному уменьшению НАДН в матриксе митохондрий, в то время как в цитоплазме соотношение НАД+/НАДН не изменилось (Рис. 8 Б). Комплекс II благодаря окислению сукцината поставляет дополнительные электроны в цепь. Возможно, комплекс I частично компенсирует работу заингибированного комплекса II, что приводит к большему расходованию НАДН.

Добавление разобщающего агента цианид м-хлорофенилгидразона (СССР) в концентрации 5 мкМ привело к закислению цитоплазмы и матрикса митохондрий. При этом в матриксе митохондрий значительно снизился НАДН, а в цитоплазме ЯехУРР регистрировал наоборот незначительное повышение восстановленной формы кофактора (Рис. 8 В). Последующее добавление к этой же самой пробе 25 мкМ

22

ротенона способствовало небольшому увеличению НАДН, причем в обоих компартментах (Рис. 8 Г).

1,2-1

20 40

Время, мин

о- Мито *~Цито

20 10 Время, мин

♦ 25 мкМ ротенон

20 40

Время, мин

20 40

Время, мин

Рисунок 8. Сравнение сигналов ЛехУРР с цитоплазматической и

митохондриальной локализацией

Изменения сигналов НехУРР с цитоплазматической локализацией (синие линии) и митохондриачьной (зеленые линии) в клетках НеЬа при добавлении А) 25 мкМ ротенона Б) 1 мМ 3-нитропропионовой кислоты (З-ЫР) В) 5 мкМ цианид м-хлорофенилгидразона (СССР) Г) 5 мкМ СССР с последующим добавлением 25 мкМ ротенона. Сигнач КехУРР рассчитывается как Р490нурег-С199$(м11то/Р'490]1ехурр(шгго) для цитоплазматической и митохондриачьной версий биосенсоров. Усредненные кривые построены по результатам четырех независимых экспериментов с добавлением З-ЫР и по результатам трех для всех остальных.

На основании полученных результатов можно заключить, что созданный биосенсор КехУРР совместно с подходом нормирования его сигнала на рН-колебания является хорошим инструментом, позволяющим регистрировать изменения соотношения НАД+/НАДН в живых клетках и их компартментах.

Выводы

1. Получена и охарактеризована усовершенствованная версия биосенсора Ну Per, регистрирующего пероксид водорода. Версия была названа НуРег-3, она отличается высоким динамическим диапазоном по сравнению с НуРег и высокими скоростями реакций окисления и последующего восстановления по сравнению с предыдущей версией НуРег-2. Преимущества НуРег-3 были продемонстрированы in vivo на модели раны zebrafish Danio rerio.

2. Впервые было показано на примере НуРег и НуРег-3, что при изменении окружения хромофора может изменяться время жизни флуоресценции некоторых сенсоров с одним флуорофором. Мы показали, что подобные сенсоры могут быть успешно использованы в микроскопии с режимом детекции времени жизни флуоресценции (FLIM).

3. Получен и охарактеризован генетически кодируемый флуоресцентный биосенсор RexYFP для регистрации динамики изменения соотношения НАД+/НАДН в живых системах в режиме реального времени. RexYFP является единственным в своем роде сенсором, позволяющим регистрировать соотношение НАД7НАДН в цитоплазме и матриксе митохондрий.

4. На примере RexYFP была разработана и применена стратегия использования сенсоров на основе cpYFP в условиях значительных изменений величины рН в пределах физиологического диапазона.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Markvicheva KN, Bilan DS, Mishina NM, Gorokhovatsky AY, Vinokurov LM, Lukyanov S, Belousov VV. A genetically encoded sensor for H2O2 with expanded dynamic range. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2011; 19(3): 1079-1084.

2. Bilan DS, Pase L, Joosen L, Gorokhovatsky AY, Ermakova YG, Grabher C, Gadella TWJ, Schultz C, Lukyanov S, Belousov VV. HyPer-3: a genetically encoded H202 probe with improved performance for ratiometric and fluorescence lifetime imaging. ACS Chemical Biology. 2013; 8(3): 535-542.

3. Mishina NM, Markvicheva KN, Bilan DS, Matlashov ME, Shirmanova MV, Liebl D, Schultz C, Lukyanov S, Belousov VV. Visualization of intracellular hydrogen peroxide with HyPer, a genetically encoded fluorescent probe. Methods in Enzymology. 2013; 526: 45-59.

4. Bilan DS, Matlashov ME, Gorokhovatsky AY, Schultz C, Enikolopov G, Belousov VV. Genetically encoded fluorescent indicator for imaging NAD(+)/NADH ratio changes in different cellular compartments. Biochimica et Biophysica Acta. 2014; 1840(3): 951-957.

Патенты

1. Патент РФ № 2493260. Билан Д.С., Белоусов В.В., Лукьянов С.А. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, кассета экспрессии, клетка, продуцирующая биосенсор, выделенный флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор, оперативно слитая с нуклеиновой кислотой, кодирующей сигнал внутриклеточной локализации, 20.09.2013. http://www.freepatent.ru/patents/2493260

2. Заявка на изобретение № 2012112582. Билан Д.С., Белоусов В.В., Лукьянов С.А. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор, кассета экспрессии, клетка продуцирующая флуоресцентный биосенсор, выделенный флуоресцентный биосенсор, 10.10.2013. http://bankpatentov.ru/node/450587

Тезисы докладов на конференциях

1. Билан Д.С., Белоусов В.В. Генетически кодируемый флуоресцентный сенсор для регистрации соотношения НАДТНАДН. X чтение памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова, 2011, Москва, Россия.

2. Bilan D, Matlashov М, Gorokhovatsky A, Schultz С, Enikolopov G, Belousov V. Genetically encoded fluorescent indicator for NAD+/NADH ratio imaging in different cellular compartments. «Mechanisms in Byology», The 38th FEBS Congress, 2013, St. Petersburg, Russia.

3. Ermakova Y, Bilan D, Mishina N, Markvicheva K, Enikolopov G, Belousov V. Genetically encoded red fluorescent probe for intracellular H202 detection. «Mechanisms in Byology», The 38th FEBS Congress, 2013, St. Petersburg, Russia.

4. Bilan D, Ermakova Y, Mishina N, Matlashov M, Subach O, Subach F, Schultz C, Enikolopov G, Belousov V. Expanding a HyPer family of genetically encoded redox probes. «Seeing is Believing - Imaging the Processes of Life» EMBO/EMBL Symposia, 2013, Hiedelberg, Germany.

Подписано в печать:

14.03.2014

Заказ №9415 Тираж-70 экз. Печать трафаретная. Объем: 1,4усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Билан, Дмитрий Сергеевич, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

На правах рукописи

04201457655

Билан Дмитрий Сергеевич

Генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры окислительно-восстановительных процессов в живых системах

специальность - 03.01.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Белоусов Всеволод Вадимович

Москва 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................6

1.1. Активные формы кислорода (АФК) и их роль в клетке.........................6

1.1.1. Основные типы АФК и их источники в клетках.................................6

1.1.2. Участие АФК в клеточном сигналинге.............................................13

1.1.3. Антиоксидантные системы клеток.................................................17

1.1.4. Химические методы регистрации АФК...........................................25

1.2. Основные редокс пары клетки........................................................33

1.2.1. Соотношение НАД+/НАДН..........................................................34

1.2.1.1. Структурные особенности НАД, синтез и транспорт...................34

1.2.1.2. Роль НАД+ и НАДН в энергетическом метаболизме клеток..........38

1.2.1.3. Другие функции соотношения НАД+/НАДН.............................39

1.2.1.4. Транскрипционный фактор Rex - природный сенсор соотношения НАД+/НАДН...............................................................................44

1.2.1.5. Методы регистрации НАД1" и НАДН.......................................47

1.2.2. Соотношение НАДФ+/НАДФН...................................................50

1.2.3. Соотношение GSSG/GSH.................................................................51

1.3. Флуоресцентные белки..................................................................52

1.3.1. Общие структурные особенности флуоресцентных белков.................52

1.3.2. Сенсоры на основе флуоресцентных белков....................................54

1.3.3. Флуоресцентные сенсоры для регистрации окислительно-восстановительных процессов.............................................................58

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ.................................................................................62

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................63

2.1. Оборудование..............................................................................63

2.2. Материалы..................................................................................63

2.3. Методы.......................................................................................66

2.3.1. Методы молекулярного клонирования...........................................66

2.3.2. Методы работы с белком.............................................................69

2.3.3. Культура эукариотических клеток................................................71

2.3.4. Разведение и трансгенез Danio rerio..............................................72

2.3.5. Микроскопия...........................................................................72

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ........................................................75

3.1. Усовершенствование генетически кодируемого биосенсора НуРег,

созданного для регистрации пероксида водорода.................................75

3.1.1 НуРег-3 - версия биосенсора, сочетающая в себе полезные качества

НуРег и НуРег-2.......................................................................76

3.1.2. Сравнение аффинности и скорости реакции полученного НуРег-3 с НуРег и НуРег-2.......................................................................79

3.1.3. Сравнение спектральных характеристик НуРег-3 с НуРег и НуРег-2....80

3.1.4. Сравнение олигомерного состояния НуРег-3 с НуРег и НуРег-2.........80

3.1.5. НуРег с объединенными мутациями A406V и H34Y.........................81

3.1.6. Тестирование HyPer-3 in vivo......................................................82

3.1.7. Использование НуРег-3 и НуРег в FL1M микроскопии......................83

3.2. Создание генетически кодируемого флуоресцентного биосенсора для регистрации соотношения НАД+/НАДН.............................................86

3.2.1. Конструкция и спектральные характеристики RexYFP......................86

3.2.2. Определение чувствительности RexYFP........................................89

3.2.3. Подбор рН-контроля при работе с биосенсором RexYFP в живых системах.................................................................................91

3.2.4. Использование RexYFP в клетках эукариот....................................92

3.2.5. Сравнение окислительно-восстановительного состояния пула НАД в цитоплазме и матриксе митохондрий с помощью RexYFP..................94

3.2.6. RexYFP по отношению к другим биосенсорам, регистрирующих соотношение НАД+/НАДН..........................................................96

ВЫВОДЫ............................................................................................98

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................99

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................102

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................105

ВВЕДЕНИЕ

Окислительно-восстановительные процессы играют ключевую роль в клетках любых организмов. Широкий спектр биохимических реакций зависит от тонкой регуляции окислительно-восстановительных систем клетки. Некоторые из таких систем, как, например, дыхательная цепь митохондрий, на сегодняшний день довольно подробно изучены. Однако исследования последних десятилетий показали, что многочисленные окислительно-восстановительные преобразования внутри клеток в ответ на разные стимулы формируют очень сложную сеть взаимодействующих компонентов и требуют их дальнейшего изучения. Окислительно-восстановительные процессы подразумевают направленные потоки электронов, в переносе которых участвуют самые различные соединения. Некоторые соединения, представленные в клетке параллельно в окисленном и восстановленном состояниях, формируют универсальные сопряженные окислительно-восстановительные или, так называемые, активные редокс пары. Среди таких редокс пар следует отметить НАД+/НАДН, НАДФ+/НАДФН и окисленный/восстановленный глутатион (ОЗвС/ОБН). Универсальность этих редокс пар заключается в том, что они участвуют в регуляции самых разнообразных клеточных процессов, поэтому соотношение окисленной и восстановленной форм этих соединений являются важными клеточными показателями.

Для аэробных организмов кислород занимает важнейшее место в регуляции жизненно необходимых внутриклеточных процессов, в том числе и окислительно-восстановительных. В дыхательных электронтранспортных цепях, производящих энергию, именно кислород служит конечным акцептором электронов. На этом роль кислорода в живых клетках не ограничивается. К настоящему времени накопилось достаточно данных, на основании которых можно утверждать о сигнальных функциях кислорода, которые осуществляются через его активные формы (АФК). АФК образуются в ходе протекания многих биохимических процессов как спонтанно, так и целенаправленно. На раннем этапе АФК приписывали негативную роль, поскольку они способны вызывать окислительные повреждения макромолекул. По этой причине они вовлечены в формирование многих патологических состояний, а также в процессы старения. Но оказалось, что АФК образуются и при нормальном физиологическом состоянии клеток, при этом их концентрация и время жизни строго контролируются специализированными системами. Особое внимание уделяют пероксиду водорода, Н2О2, который активирует клеточные сигнальные каскады и выступает в качестве вторичного мессенджера.

Но до недавнего времени изучение окислительно-восстановительных процессов в живых системах в режиме реального времени было невозможным, поскольку отсутствовали подходящие методы. Для регистрации АФК существуют различные синтетические красители. Применение некоторых из этих красителей возможно лишь в условиях in vitro, что, естественно, не отображает реальную картину. Красители, способные проникать внутрь клеток, как правило, не являются специфичными, а их реакции необратимы. Кроме того, на сигналы таких индикаторов часто накладываются артефакты, связанные с наличием побочных реакций. Не существовало методов и для изучения в живых клетках активных редокс пар.

Многие проблемы были решены благодаря созданию генетически кодируемых биосенсоров на основе флуоресцентных белков. На сегодняшний день создание генетически кодируемых биосенсоров является стремительно развивающейся и очень перспективной областью науки, В настоящее время биосенсоры нового поколения позволяют в режиме реального времени и в живых системах регистрировать исследуемые вещества, в том числе и некоторые виды АФК. НуРег является первым флуоресцентным генетически кодируемым сенсором, который позволяет регистрировать динамику изменения внутриклеточного Н2О2 на уровне целостного организма, клетки или отдельного клеточного компартмента. Реакция НуРег является обратимой и специфичной для Н2О2.-Однако^ для многих_биологических моделей, в которых концентрация Н2О2 меняется незначительно, динамический диапазон сенсора является недостаточным. х

Одно из направлений настоящей работы посвящено-^оптимизации свойств уже существующего и в настоящий момент широко применяемого^о^всем мире биосенсора НуРег. Другая важная часть работы направлена на создание абсолютно нового биосенсора, который позволит регистрировать динамику изменения такого важного параметра, как соотношение НАД+/НАДН в живых клетках и их компартментах.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА (АФК) И ИХ РОЛЬ В КЛЕТКЕ

Поскольку АФК играют важную роль в регуляции многих окислительно-восстановительных процессов в клетке, данную часть главы мы посвящаем АФК. А именно, какие типы АФК существуют, как они образуются в клетке, каким образом они могут осуществлять те или иные функции. Окислительно-восстановительные процессы подразумевают собой строго контролируемый и обратимый механизм, мы рассмотрим ключевые компоненты антиоксидантных систем клетки. Кроме того, рассмотрим наиболее популярные методы изучения АФК до появления генетически кодируемых индикаторов.

1.1.1. Основные типы АФК и их источники в клетках

В результате биохимических процессов, а также в качестве побочных продуктов, в клетках живых организмов постоянно образуются АФК. Образование АФК происходит в результате переноса электронов на молекулярный кислород, постоянно присутствующий в клетках аэробных организмов. В результате одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода О2 образуется супероксид анион радикал (далее "супероксид") О2" (уравнение 1), который лежит в основе образования всех прочих типов АФК.

02 + е —► 02* (1)

Работа клеточных электронтранспортных цепей является одним из источников образования О2' в клетках [1, 2]. У млекопитающих это происходит за счет работы электронтранспортной цепи митохондрий. В норме поток электронов последовательно перемещается по цепи трансмембранных белковых комплексов митохондрий. Этот процесс сопряжен с перекачиванием протонов через мембрану, что вызывает генерацию протонного потенциала. В дальнейшем АТФ-синтаза использует этот потенциал для преобразования энергии в молекулы АТФ. Однако на уровне комплексов I и III дыхательной цепи митохондрий может происходить утечка электронов, которые восстанавливают доступный кислород, что и приводит к образованию супероксида [1, 3]. Предполагают, что от 0,15 до 2 % электронов от общего их потока через дыхательную цепь митохондрий приходится на генерацию супероксида [3,4].

Ферментативная система ксантиноксидоредуктазы, играющая важную роль в катабализме пуринов, является еще одним источником супероксид аниона в клетке. Этот фермент был обнаружен в двух формах, одна из которых является ксантиндегидрогеназой, а вторая претерпевает посттрансляционные модификации и называется ксантиноксидазой [5]. Было изучено, что при окислении пуринов именно ксантиноксидаза способствует образованию О2* [6].

Синтазы оксида азота (NO-синтазы, NOS), осуществляющие синтез N0 в клетке, также могут в качестве побочного продукта реакции служить источниками Ог' [7, 8].

Одним из главных источников О2' в клетке является реакция, осуществляемая белками семейства NOX (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases), которые по своей природе являются трансмембранными НАДФН-оксидазами. Используя НАДФН в качестве донора, эти ферментные комплексы осуществляют перенос электронов через биологические мембраны. Кислород служит акцептором электронов, что и приводит к образованию большого количества супероксид аниона [9, 10] (уравнение 2).

НАДФН + 02 НАДФ+ + Н+ + 02'~ (2)

На рисунке 1 представлено схематичное изображение основных источников образования О2* в клетках эукариот.

ксантин

оксирадуктааа

НАДФН

Рисунок 1. Основные источники внутриклеточного супероксид аниона О2

Ассоциированный с мембраной ферментативный комплекс НАДФН-оксидазы осуществляет одноэлектронное восстановление О2 до О2 . Для стабилизации комплекса КОХ каталитическая субъединица связывает регуляторные. На схеме представлены и другие источники О2 : ксантиноксидоредуктаза, ЫО-синтазы и дыхательная цепь митохондрий на уровне комплексов I и III. Адаптировано из [11].

Белки семейства КОХ заслуживают особого внимания и более подробного рассмотрения. Дело в том, что именно благодаря изучению этих сложных комплексов

НАД»'

стало понятно, что роль АФК в самых разнообразных клетках очень обширна, и эта роль не ограничивается одним лишь повреждающим фактором, как считалось ранее.

Еще до открытия НАДФН-оксидаз были независимо описаны явления дыхательного или, по-другому, окислительного взрыва для различных типов клеток из разных источников [9]. Дыхательный взрыв представляет собой генерацию АФК в клетке при некоторых ее состояниях. В частности, давно известно, что дыхательный взрыв фагоцитов связан с генерацией Н2О2 [12]. Однако, лишь позднее было установлено, что изначальным продуктом дыхательного взрыва является О2' , а не Н202 [13].

Важным толчком в понимании механизма дыхательного взрыва послужило изучение редкого генетического заболевания хронического грануломатоза. Оказалось, что для фагоцитов больных этим заболеванием характерно отсутствие дыхательного взрыва, но при этом фагоциты сохраняют способности к фагоцитозу и хемотаксису [1416]. Уже позднее был определен белковый комплекс, отсутствие которого в фагоцитах являлось причиной возникновения этого заболевания. Каталитическая субъединица этого нового комплекса, оказавшегося НАДФН-оксидазой, была названа др91рЬох или N0X2 по новой номенклатуре [17-19].

В фагоцитирующих клетках N0X2 является одним из важнейших компонентов для борьбы с патогенами [20, 21]. Процесс фагоцитоза активирует комплекс N0X2, расположенный в мембране фагосом. N0X2 осуществляет перенос электронов внутрь фагосомы с цитоплазматической стороны клетки, используя НАДФН в качестве донора. Это приводит к мощной генерации Ог" внутри фагосомы, быстро превращающегося в Н2О2. В случае нейтрофилов, благодаря миелопероксидазе с участием Н2О2 образуется еще более реактивное соединение - хлорноватистая кислота, которая является эффективным противомикробным агентом [22]. На рисунке 2 представлена схема генерации АФК в фагосоме нейтрофила при его борьбе с патогенными микроорганизмами.

Позднее генерация АФК была обнаружена и в других типах клеток. Самое интересное, что большинство из этих клеток не имеют никакого отношения к фагоцитозу. Впоследствии были найдены и изучены гомологи N0X2. Первым найденным таким гомологом стал N0X1 [23, 24]. За N0X1 практически сразу последовали открытия N0X3 [25, 26], N0X4 [27, 28], N0X5 [26, 29], а также 0ШХ1 и 0110X2 [30,31].

^ Бактерии *

Нейтрофил

Плазматическая мембрана

Мембрана

Цитоплазма фагосомы

НАДФН

НАДФ

Сливающаяся с фагосомой гранула

HOCI + ОН-

Рисунок 2. Механизм генерации ЛФК НЛДФН-оксидазой в нейтрофилах при фагоцитозе

В фагосоме нейтрофила происходит окислительный взрыв. При фагоцитозе активируется трансмембранный комплекс N0X2, который переносит электроны с цитоплазматического НАДФН на кислород внутрь фагосомы через ее мембрану. Одноэлектронное восстановление О2 приводит к образованию О2 , который быстро дисмутирует в Н2О2. Миелопероксидаза (МРО) катализирует реакцию образования НОС1 [32].

Поскольку все представители семейства ЫОХ являются трансмембранными НАДФН-оксидазами и осуществляют перенос электронов через мембраны, для них характерны некоторые общие структурные особенности (рисунок 3). В частности, у всех представителей ЫОХ каталитическая субъединица содержит НАДФН-связывающий участок на С-конце, а также область связывания кофермента ФАД. Трансмембранная часть представлена шестью консервативными доменами, в составе третьего и пятого доменов располагаются по два высоко консервативных гистидиновых остатка. У разных представителей семейства может быть характерно наличие дополнительных доменов или структурных особенностей [9].

Рисунок 3. Общие структурные особенности каталитической

субъединицы представителей семейства NOX

Трансмембранная часть состоит из шести консервативных доменов. III и V домены участвуют в связывании двух ассиметричных гемов, благодаря наличию в структурах каждого из этих доменов двух гистидиновых остатков. На

цитоплазматическом С-конце расположены домены для связывания НАДФН и ФАД [9].

Помимо трансмембранной части, в состав комплекса NOX часто входят различные регуляторные субъединицы, котор�