Исследование сигнальной функции пероксида водорода с помощью генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов

Мишина, Наталия Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование сигнальной функции пероксида водорода с помощью генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование сигнальной функции пероксида водорода с помощью генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов"

Учреждение российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

на правах рукописи

Мишина Наталия Михайловна

ИССЛЕДОВАНИЕ СИГНАЛЬНОЙ ФУНКЦИИ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА С ПОМОЩЬЮ ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ИНДИКАТОРОВ

специальность - 03.01.03 - молекулярная биология

2 0 о ИТ 2П11

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2011

4857895

Работа выполнена в лаборатории молекулярных технологий Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Всеволод Вадимович Белоусов

Официальные оппоненты:

Зарайский Андрей Георгиевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярных основ эмбриогенеза Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Минин Александр Александрович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудши группы клеточной биологии Института белка РАН.

Ведущая организация:

Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственны!" университет имени М.В. Ломоносова

Защита состоится 26 октября 2011 г. в 10:00 на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РА! по адресу: 117871, ГСП-7, Москва В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан «23» сентября 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор физико-математических наук ^^Олейников

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. За последние годы представления о роли активных форм кислорода (АФК) в регуляции внутриклеточных процессов существенно расширились. Показано участие АФК в регуляции клеточной пролиферации, миграции, дифференцировки, а также экспрессии генов. АФК играют важную роль в таких процессах, как иммунные реакции, эмбриогенез, разнообразные патологии на организменном уровне.

Из всех АФК только пероксид водорода (Н202) обладает всеми необходимыми свойствами для выполнения функции вторичного мессенджера, действуя путем специфичного обратимого окисления редокс-активных тиоловых групп в остатках цистеинов некоторых белков.

Благодаря появлению генетически кодируемых индикаторов на основе флуоресцентных белков стало возможным исследовать сигнальную роль Н202 на уровне индивидуальных живых клеток. Особый научно-практический интерес представляет возможность использования таких индикаторов для изучения внутриклеточной локальной продукции и динамики изменения концентрации Н202, что ранее представлялось невозможным из-за отсутствия адекватных методов.

Ввиду растущей значимости исследования сигнальных каскадов с участием Н202 разработка новых подходов использования генетически кодируемых индикаторов представляется актуальной задачей. Не менее важным является изучение базовых принципов организации окислительно-восстановительной передачи сигнала в клетке.

Продукция Н202 специализированными ферментативными системами является частью сложных сигнальных каскадов, в которых задействовано множество ферментов и вторичных мессенджеров. Так, например, окислительно-восстановительная передача сигнала тесно взаимосвязана с продукцией липидных мессенджеров - фосфорилированных форм фосфатидилинозитола. Поэтому важной задачей является разработка методов одновременной регистрации активностей нескольких сигнальных систем в одной клетке.

Нарушения нормальной внутриклеточной продукции Н202 связаны с тяжелыми нейродегенеративными и сосудистыми заболеваниями, с патологиями иммунной системы. Таким образом, понимание функций эндогенного Н202 в клеточных процессах важно как для фундаментальных исследований процессов внутриклеточной передачи сигнала, так и для биомедицинских исследований.

Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение внутриклеточной локализации и динамики изменения концентрации Н202 в различных цитоплазматических субкомпартментах клетки при активации сигнальных каскадов. В рамках сформулированной цели были поставлены следующие задачи:

1. Создать флуоресцентные индикаторы на основе биосенсора Ну Per с локализацией в различных цитоплазматических субкомпартментах клетки.

2. Исследовать с помощью полученных индикаторов локализацию и динамику изменения уровня эндогенного Н202 в ответ на активацию тирозинкиназных рецепторов.

3. Создать генетически кодируемый флуоресцентный индикатор для одновременной детекции Н202 и активности фосфатидилинозитол-З'-киназы для использования в многопараметрической флуоресцентной микроскопии сигнальных процессов в живой клетке.

Научная новизна и практическая ценность работы. Предложен новый подход к исследованию распределения и динамики изменения концентрации Н202 в различных цитоплазматических субкомпартментах живой клетки с помощью вариантов белка-индикатора НуРег. Используя данный подход, удалось впервые визуализировать локальную продукцию Н202 в индивидуальных живых клетках в ответ на физиологическую стимуляцию ростовыми факторами. Полученные данные подтверждают гипотезу компартментализованной окислительно-восстановительной сигнализации, а также позволяют лучше понять роль Н202 в клетках в нормальном физиологическом состоянии. Разработан и оптимизирован генетически кодируемый флуоресцентный индикатор, позволяющий одновременно следить за изменением концентраций Н202 и фосфатидилинозитол-3,4,5-фосфата. Показано, что полученный «двойной» индикатор BtkPH-E41K-HyPer можно использовать для прижизненной многопараметрической визуализации внутриклеточных процессов с помощью флуоресцентной микроскопии. С помощью BtkPH-E41K-HyPer удалось впервые зарегистрировать локальную продукцию Н202 и активацию фосфатидилинозитол-З'-киназы при формировании иммунологического синапса в CD4+ Тн-лимфоцитах. Полученный индикатор может быть использован в качестве прототипа для разработки других многопараметрических биосенсоров, что в дальнейшем позволит расширить возможности использования флуоресцентных индикаторов в фундаментальных и прикладных биомедицинских исследованиях.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 110 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 225 ссылок. Диссертация содержит 32 рисунка и 3 таблицы.

Апробация работы. Работа прошла апробацию на Международной Конференции в честь 75-летия со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2009), на школе-

еминаре по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цитоскелета и путей ередачи сигнала (Санкт-Петербург, 2009), на XXIII Международной зимней молодежной аучной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и иотехнологии» (Москва, 2011), а также на международном EMBO|EMBL Симпозиуме Seeing is Believing - Imaging the Processes of Life» (Гейдельберг, Германия, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи в ецензируемых журналах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Динамика продукции Н2О2 в отдельных внутриклеточных

компартментах в процессе активации тирозинкиназных рецепторов

Ростовые факторы стимулируют клеточный ответ через активацию тирозинкиназных >ецепторов (ТКР), локализованных на плазматической мембране (ПМ). Связывание »остового фактора приводит к олигомеризации рецептора и активации его ирозинкиназного домена и последующей индукции каскадов фосфорилирования. ТКР, ;вязанные с лигандом, как правило, интернализуются в составе эндосомы и далее либо (еградируют, либо рециклизуются обратно на плазматическую мембрану. Протеиновые ирозинфосфатазы (РТР - от Protein Tyrosine Phosphatase) ответственны за терминацию тредачи сигнала путем дефосфорилирования активного ТКР. Так как большинство РТР юнститутивно активны в клетке, для успешного прохождения каскадов [юсфорилирования важным условием является ингибирование РТР. Эндогенный Н202 'частвуст в контроле активности РТР через реакцию обратимого окисления тиолатов в 1ктивных центрах этих ферментов. В результате, временная инактивация РТР смещает щнамическое равновесие фосфорилирования/дефосфорилирования ТКР в сторону реакции [юсфорилирования.

Тирозинфосфатаза РТР-IB отвечает за дефосфорилирование многих активированных ГКР, в том числе рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR - от Epidermal Growth -actor Receptor) и тромбоцитарного фактора роста (PDGFR - от Platelet-Derived Growth Factor Receptor). РТР-IB локализуется на цитоплазматической стороне эндоплазматического ретикулума (ЭПР) с помощью С-концевого домена, заякоренного в мембране ЭПР. РТР-IB дефосфорилирует EGFR и PDGFR в участках контакта ЭПР с мембранами, содержащими активированный рецептор, и таким образом терминирует сигнальный каскад. Несмотря на то, что инактивация РТР-IB пероксидом водорода была показана in vivo и in vitro, механизм окисления этого фермента и других РТР остается загадкой. Не ясно, как РТР, которые имеют константу скорости реакции с пероксидом водорода 10 — 103 М"'с"', способны эффективно конкурировать с пулом пероксиредоксинов (Ргх), белков-антиоксидантов, реагирующих с Н202 с константой скорости 107 М 'с"1.

В настоящий момент для решения этого парадокса предложена модель компартментализованной окислительно-восстановительной сигнализации. Эта модель предполагает, что тиолаты белка-мишени (например, РТР) окисляются Н202, продуцированным ферментами, находящимися в том же внутриклеточном компартменте, что и белок-мишень. В таком случае, локальная концентрация Н202 может быть настолько высока, что позволит полностью окислить окружающие Ргх, а вслед за ними и остальные мишени. Однако предложенная модель требует экспериментального подтверждения. Для определения локализации активированных NADPH-оксидаз, продуцирующих Н202, существенным является наблюдение в реальном времени за динамикой Н202 в различных внутриклеточных компартментах в ходе активации ТКР каскадов в живой клетке. Эндосомы, ПМ и мембрана ЭПР потенциально могут быть местом продукции Н202, так как известно, что каждый из этих субкомпартментов содержит NADPH-оксидазы.

До настоящего времени детекция продукции АФК в клетке осуществлялась с применением необратимо взаимодействующих с АФК красителей. Однако такие методы имеют ряд ограничений, не позволяющих наблюдать за динамикой продукции АФК в отдельной живой клетке. С другой стороны, продукция Н202 в клетке может быть эффективно детектирована с помощью генетически кодируемых флуоресцентных белков-сенсоров. Преимуществами генетически кодируемых сенсоров на основе GFP являются обратимый ответ, низкая токсичность для клеток, возможность локализации в различных внутриклеточных компартментах. Так, биосенсор НуРег, созданный ранее в нашей лаборатории, позволяет с высокой специфичностью детектировать субмикромолярные концентрации Н202 в клетке.

НуРег представляет собой химерный флуоресцентный белок, состоящий из чувствительного к Н202 и флуоресцентного доменов. Входящий в состав НуРег регуляторный домен транскрипционного фактора Е. coli OxyR (OxyR-RD) содержит в активном центре два цистеиновых остатка, образующих под действием Н202 дисульфидную связь, приводящую к изменению конформации всего домена. OxyR-RD обладает высокой селективностью к Н202, в отсутствии Н202 дисульфидная связь быстро восстанавливается тиол-восстанавливающими системами клетки, происходит реактивация НуРег. Флуоресцентный домен НуРег представляет собой вариант жёлтого флуоресцентного белка cpYFP с двумя пиками поглощения (420 нм и 500 нм) и эмиссией при 510 нм. cpYFP интегрирован в OxyR-RD с помощью двух коротких полипептидных линкеров. Образование дисульфидной связи в OxyR-RD под действием Н202 приводит к изменению соотношения двух пиков поглощения cpYFP: интенсивность поглощения хромофора cpYFP при 500 нм (F500) растёт пропорционально уменьшению поглощения при 420 нм (F420). Сигнал НуРег определяют как отношение двух величин F500/F420, поэтому он не зависит от уровня экспрессии сенсора в клетке.

Однако пространственное разрешение метода с использованием НуРег не позволяет детектировать локальные повышения концентрации Н202 в клетке, так как из-за быстрой диффузии биосенсора в цитоплазме происходит «размывание» сигнала (Рис.1).

1,6

Е6Г

О мин (-ЕйР)

15 мин (+ЕСР)

- клетка 4

0,8

Время (мин)

Рис. 1. Продукция Н2О2 в клетках линии Не1.а-Куо1о в ответ на стимуляцию ЕСР.

[А] Микрофотографии представляют распределение сигнала НуРег (Р500/Р420) в клетках линии НеЬа-КуоШ, экспрессирующих рНуРег-суа. Первое изображение соответствует нулевой точке до добавления ЕСР, второе изображение демонстрирует те же клетки через 15 мин после добавления ЕСР. Границы клеток на первом изображении обведены. Масштабная линейка: 15 мкм. Шкала цветов отражает отношение Р500/Р420 (чёрный-0; белый-3).

(Б) Графики отражающие изменение концентрации Н2О2 в отмеченных клетках на микрофотографии А. ЕСР добавлен через 1 мин.

В данной работе для увеличения пространственного разрешения сигнала биосенсора НуРег был локализован в пределах нескольких субкомпартментов цитоплазмы живой клетки. Мы предположили, что продукция Н202 в клетке должна колокализоваться либо с активированным рецептором, либо с РТР-1В, либо с обоими белками. Мы поставили перед собой задачу создать конструкции, позволяющие локализовать биосенсор НуРег на цитоплазматической стороне плазматической, ретикулярной и эндосомальной мембран, т.е. в тех же субкомпартментах, в которых локализованы основные участники ТКР сигнализации. В качестве экспериментальной модели в данной работе был использован процесс активации тирозинкиназных каскадов в клетках линий НеЬа-КуоШ и МН-ЗТЗ в ответ на стимуляцию факторами роста ЕвР и РОвР, соответственно.

1.1. Динамика продукции Н2О2 вблизи плазматической мембраны и

эндосом при активации тирозинкиназных рецепторов в живой клетке

Для локализации биосенсора НуРег на ПМ и мембране эндосом была создана генетическая конструкция, кодирующая химерный белок, в котором С-конец БОРЯ через короткий линкерный полипептид связан с И-концом НуРег. Данная конструкция была создана на основе ранее опубликованной конструкции рЕСРЯ-УРР. С помощью методов молекулярного клонирования в исходном векторе рЕОРЯ-УРР нуклеотидная

Создание сенсора ЕвРЯ-НуРег

последовательность, кодирующая УБР, была заменена на нуклеотидную последовательность, кодирующую биосенсор НуРег (Рис. 2А).

А _

И Еет 1210К НуРег )

Рис. 2. Схема белка ЕСРИ-НуРег (А) и его внутриклеточная локализация (Б) в клетках линии НеЬа-КуоЮ после 3 часов инкубации в бессывороточной среде. Масштабная линейка - 10 мкм.

Полученная генетическая рекомбинантная конструкция рЕСРЯ-НуРег была экспрессирована в клетках линии НеЬа-КуоШ. После продолжительной инкубации в бессывороточной среде в течение 2-4 часов флуоресцентный сигнал в клетках был локализован преимущественно на ПМ (Рис. 2Б). НуРег в составе химерного белка сохранял свойства биосенсора и реагировал на добавление экзогенного Н202 ростом соотношения Р500/Е420.

Исследование динамики продукции НгОг с помощью химерного белка ЕвРЯ-НуРег в клетках линии НеЬа-КуоЫ

Клетки линии НеЬа-КуоЮ, экспрессирующие рЕОРК-НуРег, перед экспериментом инкубировали в бессывороточной среде в течение 2-4 часов. При инкубации в бессывороточной среде в клетках приостанавливаются основные сигнальные процессы. В ходе микроскопии таких клеток в ответ на стимуляцию ростовым фактором ЕБЕ, в течение 10 минут наблюдали перераспределение флуоресцентного сигнала с ПМ в цитоплазмитические гранулы, что соответствует процессу интернализации активированного тирозинкиназного рецептора в составе эндосом (Рис. ЗА). Необходимо отметить, что в то же время в этих клетках часть флуоресцентного сигнала оставалась на ПМ, что отражало фракцию неинтернализованного рецептора. При анализе полученных изображений мы обнаружили, что существенный рост уровня Н202 происходил в эндосомальной фракции и начинался через 7-10 минут после стимуляции клеток ЕвЕ. Рост концентрации Н202 выходил на плато в течение следующих 5-10 мин, после чего начиналась вторая волна продукции Н202 (Рис. ЗВ).

Однако, в то же время фракция биосенсора, которая осталась на ПМ, демонстрирует падение отношения Р500/Е420, то есть НуРег становится более восстановленным. Этот процесс может быть связан либо с терминацией продукции Н2О2 на ПМ, либо с транслокацией Н202-продуцирующей системы из ПМ в мембраны эндосом.

Рис. 3. Динамика изменения внутриклеточной концентрации Н2О2 в ответ на стимуляцию ЕСР.

(A) Серия конфокальных изображений клеток линии НеЬа-КуоЬ), экспрессирующих рЕвРЯ-НуРег. Клетки стимулированы ЕСР (50 нг/мл] в начальный момент серии (0 мин], соответствующие временные точки в минутах отмечены на каждом изображении. Верхний ряд серии изображений представляет внутриклеточное распределение отношения Р500/Р420. Нижний ряд серии изображений представляет внутриклеточное распределение флуоресцентного сигнала ЕСРК-НуРег (в канале с возбуждением флуоресценции при 488 нм]. Границы и ядро одной из клеток обведены. Масштабная линейка: 15 мкм. Шкала цветов отражает отношение Р500/Р420 (чёрный-0; белый-3}.

(Б) Конфокальное рациометрическое изображение выделенной внутриклеточной области, содержащей интернализованный ЕСРИ-НуРег. Интенсивность сигнала вдоль линий показана на графике (Г). Масштабная линейка: 5 мкм.

(B) Графики, отражающие изменение концентрации Н2О2 на ПМ (красный] и эндосомах (черный] клеток, изображенных на панели (А].

(Г] Распределение отношения Р500/Р420 сигналов НуРег вдоль верхней (красный] и нижней (черный] линий, отмеченных на изображении (Б].

Можно предположить, что эндосомы, содержащие интернализованный рецептор, являются компартментом, ответственным за генерацию Н202. Добавление дифенилениодониума (ОР1), ингибитора ИАОРН-оксидазы, в концентрации 5 мкМ, приводило к быстрому снижению продукции Н202, что свидетельствует о ЫАБРН-оксидазе как о наиболее вероятном источнике АФК в эндосомах (Рис. 4).

DPI

2.0

Рис. 4. DPI ингибирует продукцию Н2О2 на мембране эндосом, содержащих интернализованный рецептор.

График, отражающий изменение концентрации Н2О2 вблизи мембран эндосом, содержащих интернализованный EGFR-HyPer в клетках линии HeLa-Kyoto после стимуляции 50 нг/мл EGF (начальная точка) и последующего добавления 5 мкМ DPI (отмечено стрелкой).

1.0

Время (мин)

Отсутствие окисления ЕСРЯ-НуРег, ассоциированного с ПМ, свидетельствует о том, что, во-первых, в этом процессе нет активации ЫАВРН-оксидазы и продукции АФК на ПМ, и, во-вторых, что диффузионное расстояние Н202 ограничено несколькими микрометрами. Действительно, если бы Н202 диффундировал в цитоплазме свободно, то ЕОРЯ-НуРег, ассоциированный с ПМ, был бы окислен Н202, продуцированным на эндосомах. Важно заметить, что значение Р500/Р420 для ЕвРЯ-НуРег отличается даже для соседних эндосом (Рис. ЗБ, Г), что также свидетельствует о том, что диффузия Н202 в цитоплазме клетки строго ограничена. На основании полученных данных мы предполагаем, что клеточная антиоксидантная система нейтрализует Н202 до того, как Н202 диффундирует в другие компартменты за пределом места генерации.

Пероксид водорода продуцируется в ответ на активацию многих ТКР, однако не известными остаются отличия в динамике и локализации продукции Н202 между типами клеток, экспрессирующими различные тирозинкиназные рецепторы. Мы исследовали динамику продукции Н202 при активации другого тирозинкиназного рецептора, РОвРЯ, в клетках линии МН-ЗТЗ при стимуляции их тромбоцитарным ростовым фактором (РБОР). Известно, что мышиные фибробласты №Н-ЗТЗ обладают выраженным физиологическим ответом на стимуляцию РЭОР.

Для исследования продукции Н202 вблизи РООРЯ мы создали генетическую конструкцию РБОРЯ-НуРег на базе опубликованной конструкции РБОРЯ-ОРР. В результате, полученная конструкция рРИСРЯ-НуРег кодирует химерный белок (Рис. 5А), в котором С-конец РБОРЯ через короткий линкерный полипептид связан с Ы-концом НуРег.

Создание сенсора PDGFR-HyPer

PDGFR

TioeK НуРег )

Рис. 5. Схема химерного белка РВСРИ-НуРег (А) и его внутриклеточная локализация [Б] в клетках линии М1Н-ЗТЗ после 2 часов голодания в бессывороточной среде. Масштабная линейка - 10 мкм.

При экспрессии рРОСРЯ-НуРег в фибробластах линии №Н-ЗТЗ после продолжительного голодания в течение 2-4 часов флуоресцентный сигнал был преимущественно локализован на ПМ (Рис. 5Б). НуРег в составе химерного белка РООРЯ-НуРег сохранял свои сенсорные свойства и реагировал на добавление экзогенного Н202 ростом соотношения Р500/Р420.

Исследование динамики продукции Н2О2 с помощью химерного белка РОвРЯ-НуРег в

Мышиные фибробласты NIH-3T3, экспрессирующие pPDGFR-HyPer, перед экспериментом инкубировали в бессывороточной среде в течение 2-4 часов. После стимуляции клеток ростовым фактором PDGF мы наблюдали интенсивное формирование филоподий и изменение формы клеток. В отличие от аналогичного эксперимента на клетках линии HeLa-Kyoto, в клетках NIH-3T3, экспрессирующих pPDGFR-HyPer, основная продукция Н202 была ассоциирована с ПМ, особенно в филоподиях (Рис. 6А, Б). Концентрация Н202 начинала расти через 1 мин после добавления PDGF (Рис. 6Г, Д) и достигала максимума через 10 минут. В течение следующих 10 минут происходило частичное восстановление сенсора, и начиналась вторая волна генерации Н202 (Рис. 6Г).

Флуоресценция PDGFR-HyPer, ассоциированного с эндомембранами (внутриклеточными мембранами, содержащими PDGFR-HyPer), в течение первых 20 минут после стимуляции клеток оставалась практически без изменений, а затем начинала расти (Рис. 6F). Таким образом, при стимуляции NIH-3T3 пул активных NADPH-оксидаз локализован в ПМ.

Отсутствие диффузии Н202 от ПМ к эндомембранам свидетельствует о быстрой деградации Н202 внутриклеточной антиоксидантной системой. При добавлении к пре-стимулированным фибробластам NIH-3T3 ингибитора NADPH-оксидаз, DPI, происходило быстрое падение концентрации Н202, что подтверждает роль NADPH-оксидаз как главных источников АФК.

клетках линии NIH-3T3

Рис. 6. Динамика изменения внутриклеточной концентрации Н2О2 в ответ на стимуляцию РОСР.

(A) Серия конфокальных изображений клеток линии ШН-ЗТЗ, экспрессирующих рРОСИ?-ЯуРег. Клетки стимулированы РОСР (10 нг/мл) в начальный момент серии (0 мин). Масштабная линейка: 15 мкм.

(Б) Продукция Н202 в филоподиях в клетке линии Ы1Н-ЗТЗ, экспрессирующей рРОСРД-ЯуРег, в ответ на стимуляцию РЭвР [10 нг/мл). Масштабная линейка: 15 мкм. Шкала цветов отражает отношение Р500/Р420 [чёрный-0; белый-2,5).

(B) Иллюстрация событий, показанных в (Б): в ответ на добавление РРвР клетка начинает менять свою форму, что приводит к смещению клеточного ядра из конфокальной оптической плоскости и появление в ней «дорзальной» ПМ. Видно интенсивное формирование филоподий на ПМ, а также продукция Н2О2.

(Г) Графики, отражающие изменение концентрации Н2О2 на ПМ [красный) и эндомембранах [черный) клетки, изображенной на панели (А).

(Д) График продукции Н2О2 в филоподиях клетки, изображенной на панели (Б).

1.2. Динамика продукции Н2О2 вблизи мембраны ЭПР при активации тирозинкиназных рецепторов в живой клетке

Известно, что в процессе активации ТКР фосфатаза РТР-1В окисляется пероксидом водорода. Ранее было показано, что мембраны, содержащие активированный БвРЯ и РООРЯ контактируют с микродоменами мембраны ЭПР, которые содержат РТР-1В. В таких контактирующих участках происходит дефосфорилирование рецептора. Источником Н202, окисляющего РТР-1В могут служить ЫАОРН-оксидазы, как колокализованные с активированным ТКР, так и локализованные на мембране ЭПР, вблизи РТР-1В. Мы предположили, что регистрация динамики изменения концентрации Н202 вблизи мембраны ЭПР даст информацию о том, являются ли ЫАОРН-оксидазы, локализованные на ЭПР, источниками окислителя в процессе активации ТКР.

Создание сенсора НуРег-ТА Для детекции Н202 на цитоплазматической стороне ЭПР мы создали генетическую конструкцию pHyPer-ТА (ТА = tail anchor), кодирующую белок-слияния сенсора с С-концевой последовательностью РТР-IB, позволяющей заякорить белок в мембране ЭПР (Рис. 7А). При экспрессии pHyPer-ТА в клетках HeLa-Kyoto и NIH-3T3 локализация флуоресцентного сигнала при сопоставлении с локализацией ранее описанного белка EYFP-PTP1 В, соответствовала мембране ЭПР (Рис. 7Б).

( НуРег )j ТА |

Рис. 7. Схема белка НуРег-ТА (А) и его внутриклеточная локализация (Б) в клетках линии НеЬа-Куои) после 3 часов в бессывороточной среде. Масштабная линейка - 10 мкм.

Исследование динамики продукции Н2О2 с помощью химерного белка рНуРег-ТА в клетках линии НеЬа-КуоЮ и Ы1Н-ЗТЗ

При добавлении ЕвР к клеткам НеЬа-КуоШ, экспрессирующим рНуРег-ТА, мы детектировали рост концентрации Н202 вблизи мембраны ЭПР (Рис. 8А). Однако динамика роста концентрации отличалась от той, которую мы наблюдали в эксперименте с ЕОРЯ-НуРег.

В 2.5

О 5 10 15 ,, 20 , 25 30 35

Л 1

Р488/Р405г

I # I * г « <" 1 с г

^ о }

Ех.405пт

\ \ N Л

м { ( п

^ V у У $ "

Ех.488пт

Рис. 8. Динамика изменения концентрации Н2О2 у цитоплазматической поверхности мембраны ЭПР в ответ на стимуляцию клеток факторами роста.

(A] Серия флуоресцентных микрофотографий клеток НеЬа-КуоЬ), экспрессирующих рНуРег-ТА. Клетки стимулированы ЕСР (50 нг/мл] в начальный момент серии (0). Масштабная линейка: 15 мкм.

(Б) Конфокальные изображения клетки линии N111-313, экспрессирующей рНуРег-ТА, при стимуляции РОвР (10 нг/мл). Масштабная линейка: 10 мкм.

(B) График изменения концентрации Н2О2 в клетках на панели (А). (Г) График изменения концентрации Н2О2 в клетке на панели (Б).

Первая волна роста концентрации Н202 началась через минуту после стимуляции клеток и продолжалась в течение 10-15 минут до начала второй волны роста концентрации Н202 (Рис. 8В). Вероятно, вторая волна окисления НуРег-ТА в клетках НеЬа-КуоШ отражает либо прямую продукцию Н202 на ЭПР, либо пул Н202, продуцированного на мембранах эндосом. Первая волна роста концентрации Н202 на мембране ЭПР начиналась сразу после стимуляции клеток, еще до того, как пул эндосомального Н202 может быть

зарегистрирован с помощью EGFR-HyPer. Это свидетельствует о том, что активация продукции Н202 на мембранах ЭПР происходит быстрее, чем появление Н202, который продуцируется на эндосомах.

В аналогичном эксперименте с клетками NIH-3T3, экспрессирующими рНуРег-ТА, стимуляция PDGF приводила к значительному росту отношения F500/F420 биосенсора, что отражает интенсивную продукцию Н202 у мембраны ЭПР в фибробластах (Рис. 8Б). При сопоставлении графиков, отражающих продукцию Н202 вблизи мембраны ЭПР (Рис. 8Г) и ПМ (Рис. 6Г), видно, что они сходны по форме и амплитуде.

Таким образом, в первые минуты после стимуляции клеток мы наблюдали отсутствие окисления НуРег в PDGFR-содержащих эндомембранах, но, вместе с тем, накопление окисленной формы HyPer-ТА на ЭПР и PDGFR-HyPer на ПМ, что подкрепляет вывод об ограниченной диффузии Н202 в цитоплазме.

Сопоставление динамики окисления HyPer-ТА, EGFR-HyPer и PDGFR-HyPer позволяет предположить существование двух (эндосомальной и ретикулярной) независимо регулируемых систем продукции Н202 в клетках HeLa-Kyoto и единой для ПМ и ЭПР системы в клетках NIH-3T3.

2. Создание индикатора для многопараметрической флуоресцентной микроскопии

Разнообразие флуоресцентных белков, сенсоров и химических красок различных цветов позволяют визуализировать многие сигнальные процессы в живой клетке. Комбинация флуорофоров, имеющих различные спектры, в одной клетке позволяет осуществить многопараметрическое исследование, т.е. визуализацию несколько клеточных процессов одновременно.

Внутриклеточная передача сигнала с участием фосфорилированных форм фосфатидилинозитола (PI), фосфоинозитидов (PIP), запускается в ответ на активацию рецепторов на плазматической мембране, таких как тирозинкиназные рецепторы, рецепторы, сопряженные с G-белками, и интегрины. Различные формы PIP находятся во всех внутриклеточных мембранах и участвуют в регуляции многих сигнальных процессов, как правило, через привлечение белков с PIP-взаимодействующими доменами. Эти домены отличаются друг от друга по специфичности к разным формам PIP. PI и PIP могут быть фосфорилированы фосфатидилинозитолкиназами и дефосфорилированы липидными фосфатазами. Одним из наиболее изученных липидных вторичных мессенджеров является фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат (Р1Р3). Фосфатидилинозитол-З-киназа (PI-3K) фосфорилирует фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат с образованием Р1Рз, который в дальнейшем может быть дефосфорилирован липидной фосфатазой PTEN.

Образование в мембране липидных мессенджеров может быть обнаружено с помощью химерных флуоресцентных белков, слитых с PIP-чувствительными белковыми доменами. Такие флуоресцентные белки-слияния транслоцируются из цитоплазмы на мембрану в

ответ на появление PIP. По распределению интенсивности флуоресценции между цитоплазмой и мембраной можно оценивать пространственно-временной характер действия липидных киназ и фосфатаз.

Существуют свидетельства того, что продукция пероксида водорода NADPH-оксидазами и сигнализация с участием липидов являются кооперативными процессами. Так, известно, что сборка компонентов комплекса NADPH-оксидазы на мембране и ее активация зависят от появления в мембране продуктов активности PI-3K. В свою очередь, Н2О2, продуцируемый NADPH-оксидазами, способен окислять тиолат в активном центре фосфатазы PTEN, временно ингибируя ее, что тем самым увеличивает время жизни продуктов PI-3K. Таким образом, исследование взаимосвязи липидной и окислительно-восстановительной сигнализации требуют появления стратегии одновременного наблюдения за динамикой PIP3 и продукцией Н202.

2.1 Создание индикатора с комбинированными свойствами

Для создания индикатора с комбинированными свойствами мы использовали РН-домен тирозинкиназы Btk (Bruton's tyrosine kinase). Данный РН-домен специфично взаимодействует с Р1Р3 и позволяет тирозинкиназе Btk в ответ на активацию PI-3K транслоцироваться из цитоплазмы к ПМ. На основе ранее опубликованного конструкта eGFP-BtkPH нами был создан генетический конструкт, кодирующий белок-слияния, в котором N-конец биосенсора НуРег через короткий полипептидный линкер связан с РН-доменом Btk (BtkPH). Известно, что мутантный вариант протеинкиназы Btk с заменой в РН-домене Е41К имеет повышенное сродство к PIP3. Поэтому для увеличения аффинности биосенсора к PIP3 в последовательность, кодирующую BtkPH, с помощью направленного мутагенеза была внесена мутация Е41К (Рис. 9А). Полученный вектор pBtkPH-E41K-HyPer далее был экспрессирован в клетках линии NIH-3T3. В клетках флуоресцентный сигнал был равномерно распределен между цитоплазмой и ядром. При добавлении к клеткам Н202 (200 мкМ) наблюдался значительный рост отношения F500/F420, что свидетельствует о том, что биосенсор НуРег в составе химерного белка BtkPH-E41K-Hyper не потерял свои сенсорные свойства.

2.2 Многопараметрическое исследование с помощью биосенсора BtkPH-E41K-HyPer в живой клетке

Активация PI-3K и продукция Н2О2 в клетках NIH-3T3 при активации PDGFR

Работа биосенсора BtkPH-E41K-HyPer была протестирована в клетках линии NIH-3T3 в ответ на стимуляцию ростовым фактором PDGF. Добавление PDGF (10 нг/мл) к фибробластам NIH-3T3 инициировало транслокацию биосенсора на ПМ, и приводило к росту соотношения F500/F420, что отражает активацию PI-3K и рост концентрации Н202 в области ПМ (Рис. 9Б).

| ВТК-РН-Е4П<}<^~

НуРег

I"0,2

■5

V0 Е

<и е

1 2 3 4 5 6 7

Время (мин)

1 2 3 4 5 6 7

Время (мин)

е.

и.

Е -0.4

и_

и! -0 4

Е 0) Е

0 1 2 3 4 5 6

Время (мин)

0 1 2 3 4 5 6

Время (мин)

Рис. 9. Динамика изменения концентрации Н2О2 и Р1Рз у цитоплазматической поверхности плазматической мембраны в ответ на стимуляцию клеток РОСР.

[A] Схема конструкта белка В1кРН-Е41К-НуРег.

(Б) Серия флуоресцентных микрофотографий клеток 1М1Н-ЗТЗ, экспрессирующих pBtkPH-E41K■ НуРег, сразу после стимуляции РОйР (10 нг/мл). Соответствующие временные точки в минутах отмечены на каждом изображении. Верхний ряд серии изображений является рациометрическим и представляет внутриклеточное распределение отношения Р500/Р420, отражающего изменения концентрации Н2О2. Средний и нижний ряды изображений демонстрирует внутриклеточное распределение В1кРН-Е41К-НуРег. На первом изображении из верхнего ряда обведены отдельные клетки и пронумерованы 1-4. Масштабная линейка: 15 мкм.

(B) Графики отражающие активацию Р1-ЗК и изменение концентрации Н2О2 в каждой отдельной клетке на панели (Б). Черным цветом показано изменение распределения Р1Рз, красным цветом -изменение концентрации Н202 в клетке.

Для количественной оценки продукции Р1Рз и Н202 мы проанализировали динамику процессов в отдельных клетках (Рис. 9В). Степень транслокации была рассчитана по формуле Т=(Ртст - Рсум)/Рсу,„ (где Ртеш - интенсивность флуоресценции на ПМ, Рсу1о -интенсивность флуоресценции в цитоплазме).

Анализ динамики флуоресцентных сигналов обоих процессов в отдельных клетках показал, что оба сигнала изначально ведут себя высоко кооперативно, что является ожидаемым, т.к. активация Р1-ЗК предшествует активации ЫАБРН-оксидаз.

Однако, хотя появление Р1Р3 и Н202 регистрируются одновременно, в дальнейшем падение концентрации Н202 происходит независимо от накопления Р1Рз, который является более продолжительным во времени. Это может свидетельствовать о том, что оба процесса необязательно сопряжены друг с другом в течение длительного периода.

Следует заметить, что в процессе транслокации часть биосенсора всегда оставалась в цитоплазме, что позволяло сравнивать изменения соотношения Р500/Р420 между ПМ и цитоплазмой. Из Рис. 9Б. видно, что продукция Н202 в фибробластах ЫШ-ЗТЗ происходит преимущественно на ПМ, а диффузия Н202 вглубь клетки ограничена, что согласуется с наблюдениям, полученным в первой части работы.

Так как активация Р1-ЗК предшествует активации ИАОРН-оксидаз, мы проверили, приводит ли ингибирование Р1-ЗК также к снижению продукции Н202. Преинкубация клеток с вортманнином в течение 20 минут приводила к ингибированию и Р1-ЗК и продукции Н202 (Рис. 10А).

Рис. 10. Графики отражающие изменение распределения PIP3 (черный) и концентрации Н2О2 (красный) в клетках NIH-3T3 ответ на (А) пре-инкубацию клеток с вортманнином (500 мкМ) и последующую стимуляцию PDGF (0 мин) и (Б) стимуляцию PDGF и добавление DPI (60 мкМ).

Добавление к пре-стимулированным фибробластам ингибитора NADPH-оксидаз, дифенилениодониума (DPI) приводило к быстрому падению отношения F500/F420 индикатора BtkPH-E41K-HyPer, что отражает снижение продукции Н202 (Рис. 10Б).

Активация PI-ЗКи продукция Н2О2 в Тн-лимфоцитах при активации TCR

«Двойной» биосенсор BtkPH-E41K-HyPer был использован для изучения липидной и окислительно-восстановительной сигнализации в человеческих CD4+ Т-хэлперных лимфоцитах в процессе формирования иммунологического синапса. Т-лимфоциты становится активными в результате взаимодействия с антиген-презентирующими клетками (АПК). Т-клеточный рецептор (TCR - от T-Cell Receptor) взаимодействует со своим лигандом - процессированным антигеном, связанным с главным комплексом гистосовместимости на поверхности АПК. Во время активации Т-лимфоцит поляризуется и формирует плотный контакт, т. н. иммунологический синапс (ИС), с АПК. В исследованиях in vitro формирование ИС может быть смоделировано с помощью инкубации клеток с микросферами, покрытыми антителами anTn-CD3/aiiTH-CD28. Известно, что формирование ИС приводит к активации PI-3K и, как следствие, повышению концентрации Р1Р3 и в области ИС, и в остальных частях ПМ. Также известно, что активация TCR способствует продукции АФК в клетке.

Однако динамика изменения концентрации в реальном времени и локализация продукции Н202 при формировании ИС не была изучена. Для одновременной визуализации PI-3K активации и продукции Н202 был использовали BtkPH-E41K-HyPer.

При экспрессии в Тн-лимфоцитах человека флуоресцентный сигнал был распределен между цитоплазмой и ядром. Однако во многих клетках еще до стимуляции рецептора часть флуоресцентного сигнала уже была локализована на ПМ, что свидетельствует о некотором базовом уровне активности PI-3K. Стимуляция Тн-лимфоцитов, экспрессирующих BtkPH-E41K-HyPer, с помощью микросфер, покрытыми анти-СОЗ/анти-CD28 антителами, приводила к быстрому появлению контакта между Тн-лимфоцитами и микросферами (Рис. 11 А).

Мы наблюдали мгновенное и значительное перераспределение флуоресцентного индикатора в область ИС на ранних этапах формирования контакта: большая часть индикатора локализовалась в области ИС и оставалась там в течение всего эксперимента (до 1 ч). Важно заметить, что активность PI-3K снизилась на остальных участках мембраны активированных клеток, что отражалось отсутствием выраженной локализации флуоресцентного сигнала на других участках ПМ (Рис. 11 А).

80-

■0.5

0.6

10 15

Время (мин)

Рис. 11. Динамика изменения концентрации Н202 и Р1Р3 у цитоплазматической поверхности плазматической мембраны Тн-лимфоцитов при формировании иммунологического синапса

(A) Серия флуоресцентных микрофотографий Тн-лимфоцита, формирующего ИС с микросферой, покрытым aHTH-CD3/aHTH-CD28, (добавлен в начальное время). Верхний ряд изображений -клетка и две микросферы в канале проходящего света (микросферы черные), следующие два ряда демонстрируют распределение флуоресценции в двух каналах с возбуждением при 420 нм и 505 нм, нижний ряд - отношение F505/F420, что отражает распределение Н2О2 в клетке. Масштабная линейка: 10 мкм.

(Б) График, отражающий активацию PI-3K и распределение Н2О2 в Тн-лимфоците. Черным цветом показано изменение распределения Р1Рз, красным цветом - изменение концентрации Н2О2 в клетке.

(B) Среднее значение активности PI-3K и продукции Н2О2 по 28 Тн-клеткам из трех экспериментов (стандартная ошибка среднего).

Эксперименты были проведены в университете Саарланда (Германия) на микроскопе Zeiss Cell Observer HS.

Мы исследовали продукцию Н202 Тн-лимфоцитами по изменению отношения F500/F420 в процессе активации клеток. Формирование ИС сопровождалось быстрым ростом концентрации Н2О2 через ~ 1 мин. после транслокации биосенсора в ИС (Рис.11 Б-В). Часть цитоплазмы, ассоциированная с ПМ, демонстрировала более высокий уровень концентрации Н2О2. Добавление к стимулированным Тн-лимфоцитам DPI приводило к быстрому ингибированию продукции Н202 (Рис. 12А), что свидетельствует о наличии ассоциированной с ПМ NADPH-оксидазы в качестве источника Н202.

(ИС),

А Б

—--т - - _ --.микросфера * - ------— микросфера

Рис. 12. Графики, отражающие изменение распределения Р1Рз (черный) и концентрации Н2О2 (красный) в Тн-лимфоцитах в ответ на добавление ингибиторов.

(А) Дифенилениодониум (DPI) ингибирует продукцию Н2О2 в Тн-лимфоцитах после формирования иммунологического синапса. AHTH-CD3/aHTH-CD28 микросферы добавлены в начальной точке. (Б) Добавление к Тн-лимфоцитам вортманнина, ингибитора PI-3K, приводит к падению уровня Р1Рз и Н2О2. AHTH-CD3/aHTH-CD28 микросферы добавлены в начальной точке.

В случае ингибирования PI-3K добавлением вортманнина к пре-стимулированным Тн-лимфоцитам с помощью BtkPH-E41K-HyPer регистрировали снижение активности и PI-3K, и продукции Н2О2 в области ИС (Рис. 12Б).

Заключение

В настоящей работе были получены варианты биосенсора для детекции пероксида водорода, НуРег, локализованные на мембранах различных внутриклеточных компартментов. Использование данного подхода позволило визуализировать динамику концентраций Н2Ог с большим пространственным разрешением. С помощью полученных биосенсоров мы впервые продемонстрировали наличие микродоменов продукции Н202 в процессе ТКР сигнализации.

С помощью индикатора ЕОРЯ-НуРег в стимулированных ростовым фактором клетках НеЬа-КуоЮ впервые было показано, что значительная продукция Н202 происходит на эндосомах, а не на плазматической мембране. Можно предположить, что эндосомы, содержащие интернализованный ЕОИ*. и продуцирующие Н202, играют важную роль в поддержании каскада фосфорилирования: активный рецептор фосфорилирует субстраты, а продуцирующийся здесь же, Н2О2 ингибирует РТР, создавая, таким образом, петлю положительной обратной связи. Кроме того, использование ЕОЕЯ-НуРег позволило определить, что в цитоплазме стимулированных клеток свободная диффузия Н202 в значительной степени ограничена (до 1-2 мкм).

В фибробластах линии МН-ЗТЗ с помощью РООРЯ-НуРег была показана продукция Н202, локализованная преимущественно на ПМ. В отличие от клеток НсЬа-КуоЮ активация ЫАОРН-оксидаз на ПМ в фибробластах свидетельствует о возможных внеклеточных мишенях Н202, продуцируемого в ответ на активацию РПСРЯ.

С помощью НуРег-ТА в клетках линии НеЬа-КуоШ и Ы1Н-ЗТЗ бьша показана независимая продукция Н202, быстро активирующаяся на ЭПР в ответ на активацию ТКР. Такой быстрый рост концентрации Н202 на ЭПР сразу после стимуляции клеток может быть необходим для немедленного ингибирования фосфатазы РТР-1В на мембране ЭПР. Окисление НуРег-ТА после активации и ЕОРЯ и РОвРЯ может служить моделью для изучения роли ингибирования РТР-1В пероксидом водорода.

Для исследования взаимосвязи продукции Н202 и активации Р1-ЗК был создан «двойной» индикатор В1кРН-Е41К-НуРег. Тестирование работы индикатора в фибробластах Ы1Н-ЗТЗ в ответ на стимуляцию ТКР показало возможность одновременной детекции продукции Н202 и Р1Рз. В СЭ4+ Тн-лимфоцитах с помощью В1кРН-Е41К-НуРег удалось впервые показать локальную активность фосфатидилинозитол-З'-киназы и продукцию Н202 в области иммунологического синапса. Важно заметить, что преимуществом «двойного» индикатора является возможность использования всего одной экспрессионной конструкции для детекции двух параметров в клетке. Другим очевидным преимуществом является то, что спектральные свойства ВЙсРН-Е41К-Нурег позволяют одновременно независимо наблюдать также за другими флуоресцентными белками, которые имеют спектр, неперекрывающийся со спектром белка НуРег. Таким образом, можно добавить еще один параметр для исследования в той же клетке, если его белком-репортером будет, например, красный флуоресцентный белок. Полученный индикатор В1кРН-Е41К-НуРег может быть использован как прототип для создания других подобных индикаторов с комбинированными свойствами. Подобные многопараметрические генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы могут быть востребованы в широком круге задач системной биологии.

выводы

1. На основе биосенсора НуРег созданы локализованные флуоресцентные индикаторы РОСРЯ-НуРег, ЕОРЯ-НуРсг и НуРег-ТА для детекции Н202 в близком окружении рецепторов РПОРК и ЕвРЯ, а также на цитоплазматической стороне мембраны эндоплазматического ретикулума.

2. С помощью полученных индикаторов впервые визуализирована локальная продукция и динамика Н202 в клетке в ответ на активацию тирозинкиназных рецепторов. Установлено, что в клетках эпителиальной линии НеЬа-КуоШ продукция Н202 происходит на мембранах эндосом и эндоплазматического ретикулума. В фибробластах линии МН-ЗТЗ продукция Н202 локализована на плазматической мембране и мембране эндоплазматического ретикулума. Таким образом, активация тирозинкиназных рецепторов, характерных для клеток разного происхождения, стимулирует различающиеся между собой паттерны генерации Н202.

I. Диффузия 11202 в цитоплазме эукариотических клеток ограничена 1-2 мкм, то есть мишенью Н202 являются только те белки, которые находятся в непосредственной близости от места его генерации.

I. Создан генетически кодируемый флуоресцентный индикатор В1кРН-Е41К-НуРег для одновременной детекции Н202 и активности фосфатидилинозитол-З'-киназы. На клетках линии МН-ЗТЗ продемонстрирована возможность использования полученного индикатора в многопараметрическом исследовании внутриклеточных сигнальных процессов. С использованием В1кРН-Е41К-НуРег впервые показана локальная активность фосфатидилинозитол-З'-киназы и продукция Н202 в области иммунологического синапса в С1)4+ Тн-лимфоцитах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Mishina N.M., Tyurin-Kuzmin P.A., Markvicheva K.N., Vorotnikov A.V., Tkachuk VA., Laketa V., Schultz C., Lukyanov S., Belousov V. V. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally? Antioxid Redox Signal. 2011, 14 (1), 1-7.

2. Тюрин-Кузьмин П.А., Агаронян K.M., Морозов Я.И., Мишина Н.М., Белоусов В.В., Воротников А.В. НАД(Ф)Н оксидаза регулирует EGF-зависимую пролиферацию клеток по механизму, отличному от активации ERK1/2 МАР-киназ. Биофизика. 2010, 55 (6), 1048-1056

3. Markvicheva K.N., Bilan D.S., Mishina N.M., Gorokhovatsky A.Y., Vinokurov L.M., Lukyanov S., Belousov V.V. A genetically encoded sensor for H(2)0(2) with expanded dynamic range. BioorgMed Chem. 2010, 19(3): 1079-84.

4. Марквичева K.H., Гороховатский А.Ю., Мишина H.M., Мудрик Н.Н., Винокуров JI.M., Лукьянов С.А., Белоусов В.В. Сигнальная функция фагоцитарной NADPH-оксидазы: активация МАР-киназных каскадов при фагоцитозе. Биоорг.химия, 2010,36 (1): 133-138.

Тезисы докладов на конференциях

1. Imaging of intracellular hydrogen peroxide localization following activation of tyrosine kinase receptors. Mishina N.M., Tyurin-Kuzmin P., Markvicheva K., Vorotnikov A., Schultz C„ Lukyanov S., Belousov V. Abstracts of papers presented at EMBO|EMBL Symposium: "Seeing is Believing - Imaging the Processes of Life". EMBL АТС, Heidelberg, Germany, 2011, page 126.

2. Локализация пероксида водорода в клетке при активации тирозинкиназных рецепторов. Мишина Н.М., Тюрин-Кузьмин П.А., Воротников А.В., Белоусов В.В. Тезисы докладов и стендовых сообщений на XXIII Международной зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". ИБХ РАН, Москва, 2011, стр. 11.

3. Локализация пероксида водорода в клетке при активации сигнальных каскадов тирозинкиназных рецепторов. Мишина Н.М., Тюрин-Кузьмин П.А., Воротников А.В., Белоусов В.В. Школа-семинар по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цитоскелета и путей передачи сигнала. (Санкт-Петербург, Институт цитологии РАН, 2009). Цитология. - 2010. -Том 52, N 3. - С. 262-263.

4. Изучение локализации перекиси водорода в клетке при активации тирозинкиназных рецепторов. Тюрин-Кузьмин П.А., Сафронова Н.М., Воротников А.В., Белоусов В.В. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, приуроченная к 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Конкурс молодых ученых). ИБХ РАН, Москва, 2009, стр. 247.

5. Создание внутриклеточных белковых биосенсоров нового поколения. Белоусов В.В., Марквичева К.Н., Сафронова Н.М., Воротников А.В., Тюрин-Кузьмин П.А., Калинина Н.И., Коптелова Н.В., Кудряшова Т.В., Макаревич П.И., Ребриков Д.В., Стамбольский Д.В.,. Шаронов Г.В. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы». ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва, 2009, стр. 23.

Заказ № 70-а/09/2011 Подписано в печать 22.09.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 )) www.cfr.ru ; e-mailAnfo@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мишина, Наталия Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I: ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА, КАК УЧАСТНИКИ

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ СИГНАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ

1.1. История

1.2. Источники АФК в клетке

1.3. Сигнальные функции АФК

1.4. Пероксид водорода как сигнальная молекула

Продукция пероксида водорода

Механизм передачи сигнала с помощью Н

Модификация тиоловых остатков

Деградация Н

И. ИАБРН-ОКСИДАЗЫ: ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

II. 1. История открытия КАОРН-оксидаз

2. Строение и активация КАБРН-оксидазы на примере КАБРН- ^ оксидазы фагоцитов (N0x2)

Строение N0x

Активация N0x

П.З. Представители семейства Кох, доменная структура и общие принципы активации

П.4. Физиологическая роль Кох-белков

11.5. Кох-белки и заболевания

III. КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИЯ СИГНАЛИЗАЦИИ С УЧАСТИЕМ АФК

III. 1. Компартментализация за счет кинетических и диффузионных ограничений

III. 2. Компартментализация за счет специфической локализации ^ источника: локализация КАБРН-оксидаз

Локализация КАБРН-оксидаз, участвующих в процессе ^ направленного движения клетки

Кавеолы/липидные рафты

Эндосомы

Эндоплазматический ретикулум

IV. МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ Н202 В КЛЕТКАХ

IV. 1. Детекция внутриклеточного Н202 с помощью 5-(и 6-) -хлорметил-2',7'-дихлордигидрофлуоресцииндиацетата (СМ-ОСРН-ОА)

IV.2. Визуализация внутриклеточного Н202 с помощью Регоху Green 1 и Peroxy Crimson

IV.3. Визуализация внутриклеточного Н202 с помощью SKAP-tag

Г/.4. Визуализация Н202 с помощью генетически кодируемых редокс-чувствительных флуоресцентных белков roGFP и roGFP гоСРР-Огр

НуРег

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ

ГЛАВА II: МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

II. 1 МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

II. 1.1. Оборудование

II .1.2. Материалы

Реактивы

Ферменты для молекулярного клонирования и метериалы для ПЦР

Векторы

Буферные растворы

Бактериальные штаммы и среды

Ростовые факторы и микросферы

Ингибиторы Р13-киназы и КАБРН-оксидазы

Клеточные линии и среды

Материалы для конфокальной и флуоресцентной микроскопии

П.2. МЕТОДЫ

П.2.1. Молекулярное клонирование

Амплификация ДНК

Электрофорез в агарозном геле

Выделение плазмидной ДНК

Рестрикция и лигирование

Очистка ДНК

Направленный мутагенез кодирующей последовательности ДНК

Трансформация компетентных клеток Е. coli

Определение нуклеотидной последовательности ДНК 62 1122. Создание экспрессионных конструкций, кодирующих белкислияния

И.2.3. Культура эукариотических клеток

Эукариотические клетки

Трансфекция эукариотических клеток

И.2.4. Микроскопия

Подготовка клеток к эксперименту

Конфокальная микроскопия

Флуоресцентная микроскопия клеток

Обработка полученных изображений

ГЛАВА III: РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

III. 1. ДИНАМИКА ПРОДУКЦИИ Н202 В ОТДЕЛЬНЫХ

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ КОМПАРТМЕНТАХ В ПРОЦЕССЕ 68 АКТИВАЦИИ ТИРОЗИНКИНАЗНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

III. 1.1. Исследование динамики продукции Н202 вблизи ПМ и эндосом ^ ^ при активации ТКР в живой клетке

Создание сенсора ЕвРІІ-НуРег

Исследование динамики продукции Н202 с помощью химерного белка ЕОРЯ-НуРег в клетках линии НеЬа-КуоШ

Исследование динамики продукции Н202 с помощью химерного белка РООРЯ-НуРег в клетках линии МН-ЗТЗ

III. 1.2. Динамика продукции Н202 вблизи мембраны ЭПР при активации тирозинкиназных рецепторов в живой клетке

Исследование динамики продукции Н202 с помощью химерного белка НуРег-ТА в клетках линии НеЬа-КуоШ и МН-ЗТЗ

Ш.2. СОЗДАНИЕ ИНДИКАТОРА ДЛЯ МНОГОПАРАМЕТРИЧЕСКОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ.

Ш.2.2 Многопараметрическое исследование с помощью биосенсора ЕЙкРН-Е41 К-НуРег в живой клетке

Активация Р1-ЗК и продукция Н202 в клетках МН-ЗТЗ при активации РБОРЯ

Активация Р1-ЗК и продукция Н202 в ТН-лимфоцитах при активации ТСЯ

Создание сенсора РОвРЯ-НуРег

Создание сенсора НуРег-ТА

Ш.2.1. Создание и оптимизирование «двойного» индикатора

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование сигнальной функции пероксида водорода с помощью генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов"

За последние годы представления о роли активных форм кислорода (АФК) в регуляции внутриклеточных процессов существенно расширились. Показано участие АФК в регуляции клеточной пролиферации, миграции, дифференцировки и экспрессии генов. АФК играют важную роль в таких процессах, как иммунные реакции, эмбриогенез, разнообразные патологии на организменном уровне.

Основным источником АФК в клетке являются трансмембранные ферментативные комплексы - КАБРН-оксидазы. Так известно, что при стимуляции тирозинкиназных рецепторов происходит активация КАБРН-оксидазы, которая продуцирует супероксид-анион и как следствие пероксид водорода (Н202).

Из всех АФК только Н202 обладает всеми необходимыми свойствами для выполнения функции вторичного мессенджера. Так, Н202 относительно стабилен по сравнению с другими АФК, благодаря маленьким размерам и отсутствию полярности Н202 способен легко диффундировать во внутриклеточной среде, в том числе сквозь липидные бислои. Н202 играет роль внутриклеточного вторичного мессенджера, действуя путем специфичного обратимого окисления небольшого числа активных тиоловых групп в остатках цистеинов тирозиновых фосфатаз и других белков-регуляторов процессов внутриклеточной передачи сигнала.

Предполагают, что внутриклеточные сигнальные эффекты Н202 осуществляются в соответствии с моделью компартментализованной окислительно-восстановительной передачи сигнала, когда белок-мишень и источник Н202 находятся в непосредственной близости друг от друга. Действительно, в настоящий момент известны специфические сайты локализации ИАОРН-оксидаз и их регуляторных белков в различных внутриклеточных компартментах, а также важное значение таких сайтов для процессов клеточной миграции, пролиферации и дифференцировки. Однако до сих пор не удавалось визуализировать локальную продукцию Н202 в клетке и выявить внутриклеточные мембранные компартменты, ответственные за продукцию Н202 при активации сигнальных каскадов.

Изучение динамики и локализации продукции Н202 в ходе разнообразных клеточных процессов представлялось невозможным до недавнего времени. Благодаря появлению в арсенале генетически кодируемых сенсоров на основе флуоресцентных белков стало возможным проводить исследования сигнальной роли Н202 на уровне индивидуальных живых клеток. По сравнению с химически синтезированными флуоресцентными красителями, генетически кодируемые сенсоры имеют ряд преимуществ. Они экспрессируются самой клеткой и не требуют внешнего добавления или инъекции; использование сигналов внутриклеточной локализации позволяет направить подобные индикаторы в различные компартменты живой клетки; также могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие генетически кодируемые сенсоры в определенных тканях в определенный период времени. Особый научно-практический интерес представляет собой возможность использования таких индикаторов для изучения внутриклеточной локальной продукции и динамики изменения концентрации Н202, что не удавалось исследовать с помощью химических индикаторов.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Мишина, Наталия Михайловна

Выводы

1. На основе биосенсора НуРег созданы локализованные флуоресцентные индикаторы РБСРЯ-НуРег, ЕвРЯ-НуРег и НуРег-ТА для детекции Н2О2 в близком окружении рецепторов РБОРЯ и ЕвРЯ, а также на цитоплазматической стороне мембраны эндоплазматического ретикулума.

2. С помощью полученных индикаторов впервые визуализирована локальная продукция и динамика Н2О2 в клетке в ответ на активацию тирозинкиназных рецепторов. Установлено, что в клетках эпителиальной линии НеЬа-Куо1о продукция Н2О2 происходит на мембранах эндосом и эндоплазматического ретикулума. В фибробластах линии МН-ЗТЗ продукция Н202 локализована на плазматической мембране и мембране эндоплазматического ретикулума. Таким образом, активация тирозинкиназных рецепторов, характерных для клеток разного происхождения, стимулирует различающиеся между собой паттерны генерации Н202.

3. Диффузия Н2Ог в цитоплазме эукариотических клеток ограничена 1-2 МКМ, ТО есть мишенью Н2О2 являются только те белки, которые находятся в непосредственной близости от места его генерации.

4. Создан генетически кодируемый флуоресцентный индикатор В1кРН-Е41К-НуРег для одновременной детекции Н202 и активности фосфатидилинозитол-З'-киназы. На клетках линии ШН-ЗТЗ продемонстрирована возможность использования полученного индикатора в многопараметрическом исследовании внутриклеточных сигнальных процессов. С использованием В1кРН-Е41 К-НуРег впервые показана локальная активность фосфатидилинозитол-З'-киназы и продукция Н2О2 в области иммунологического синапса в СБ4+ Тн-лимфоцитах.

Заключение

В настоящей работе предложен новый подход к исследованию распределения и динамики изменения концентрации Н202 в различных цитоплазматических субкомпартментах живой клетки с помощью локализованных вариантов белка-индикатора НуРег.

С помощью индикатора ЕОРЯ-НуРег в стимулированных эпидермальным ростовым фактором клетках НеЬа-КуоШ впервые было показано, что значительная продукция Н202 происходит на эндосомах, а не на плазматической мембране. Таким образом, эндосомы, содержащие интернализованный ЕвРЯ и продуцирующие Н202, играют важную роль в поддержании каскада фосфорилирования: активный рецептор фосфорилирует субстраты, а продуцирующийся здесь же Н202 ингибирует РТР, создавая, таким образом, петлю положительной обратной связи. Кроме того, использование ЕОРЯ-НуРег позволило определить, что в цитоплазме клеток свободная диффузия Н202 в значительной степени ограничена (до 1-2 мкм).

В фибробластах линии МН-ЗТЗ с помощью индикатора РБОРЯ-НуРег была показана продукция Н202, локализованная преимущественно на плазматической мембране. В отличие от клеток НеЬа-КуоШ, активация ЫА1)РН-оксидаз на плазматической мембране в фибробластах свидетельствует о возможных внеклеточных мишенях Н202, продуцируемого в ответ на активацию РБвРЯ.

С помощью индикатора НуРег-ТА в клетках линии НеЬа-КуоШ и ШН-ЗТЗ была показана продукция Н202, быстро активирующаяся на эндоплазматическом ретикулуме в ответ на стимуляцию тирозинкиназных рецепторов. Такой быстрый рост концентрации Н202 на эндоплазматическом ретикулуме сразу после стимуляции клеток может быть необходим для немедленного ингибирования фосфатазы РТР-1В на мембране эндоплазматического ретикулума. Окисление НуРег-ТА после активации и ЕвРЯ и РБОРЯ может служить моделью для изучения роли ингибирования РТР-1В пероксидом водорода.

Таким образом, используя данный подход, удалось впервые визуализировать локальную продукцию Н202 в индивидуальных живых клетках в ответ на физиологическую стимуляцию ростовыми факторами. Полученные данные подтверждают гипотезу о компартментализованной окислительно-восстановительной сигнализации, а также позволяют лучше понять роль Н202 в клетках в нормальном физиологическом состоянии.

Для исследования взаимосвязи продукции Н202 и активации Р1-ЗК был создан «двойной» индикатор В1кРН-Е41К-НуРег, позволяющий одновременно следить за изменением концентраций Н202 и фосфатидилинозитол-3,4,5-фосфата. Тестирование работы индикатора в фибробластах МН-ЗТЗ в ответ на стимуляцию тирозинкиназных рецепторов показало возможность одновременной детекции продукции Н2О2 и Р1Р3. В СБ4+ Тн-лимфоцитах с помощью В1кРН-Е41 К-НуРег удалось впервые показать локальную активность фосфатидилинозитол-З'-киназы и продукцию Н2О2 в области иммунологического синапса. Важно заметить, что преимуществом «двойного» индикатора является возможность использования всего одной экспрессионной конструкции для детекции двух параметров в клетке. Другим очевидным преимуществом является то, что спектральные свойства В1кРН-Е41 К-Нурег позволяют одновременно независимо наблюдать также за другими флуоресцентными белками, которые имеют спектр, неперекрывающийся со спектром белка НуРег, что позволяет добавить еще один параметр для исследования в той же клетке.

Полученный индикатор В1кРН-Е41 К-НуРег может быть использован как прототип для создания других подобных индикаторов с комбинированными свойствами. Подобные многопараметрические генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы могут быть востребованы в широком круге задач системной биологии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мишина, Наталия Михайловна, Москва

1. Commoner B, Townsend J & Pake GE (1954) Free radicals in biological materials. Nature174,689-91.

2. Boveris A & Chance B (1973) The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. Generalproperties and effect of hyperbaric oxygen. The Biochemical journal 134,707-16.

3. Mills GC (1957) Hemoglobin catabolism. I. Glutathione peroxidase, an erythrocyte enzymewhich protects hemoglobin from oxidative breakdown. The Journal of biological chemistry 229, 189-97.

4. McCord JM & Fridovich I (1969) Superoxide dismutase. An enzymic function forerythrocuprein (hemocuprein). The Journal of biological chemistry 244,6049-55.

5. Sbarra AJ & Karnovsky ML (1959) The biochemical basis of phagocytosis. I. Metabolicchanges during the ingestion of particles by polymorphonuclear leukocytes. The Journal of biological chemistry 234,1355-62.

6. Rossi F & Zatti M (1964) Biochemical aspects of phagocytosis in polymorphonuclearleucocytes. NADH and NADPH oxidation by the granules of resting and phagocytizing cells. Experientia 20,21-3.

7. Klebanoff SJ (1970) Myeloperoxidase: contribution to the microbicidal activity of intactleukocytes. Science (New York, N.Y.) 169,1095-7.

8. Quie PG, White JG, Holmes B & Good RA (1967) In vitro bactericidal capacity of humanpolymorphonuclear leukocytes: diminished activity in chronic granulomatous disease of childhood. The Journal of clinical investigation 46,668-79.

9. Holmes B, Page AR & Good RA (1967) Studies of the metabolic activity of leukocytes frompatients with a genetic abnormality of phagocytic function. The Journal of clinical investigation 46,1422-32.

10. Segal AW, Jones OT, Webster D & Allison AC (1978) Absence of a newly describedcytochrome b from neutrophils of patients with chronic granulomatous disease. Lancet 2, 446-9.

11. Segal AW & Jones OT (1978) Novel cytochrome b system in phagocytic vacuoles of humangranulocytes. Nature 276, 515-7.

12. Royer-Pokora B, Kunkel LM, Monaco AP, Goff SC, Newburger PE, Baehner RL, Cole FS,

13. Curnutte JT & Orkin SH (1986) Cloning the gene for an inherited human disorder-chronic granulomatous disease-on the basis of its chromosomal location. Nature 322,32-8.

14. Czech MP (1976) Differential effects of sulfhydryl reagents on activation and deactivation ofthe fat cell hexose transport system. The Journal of biological chemistry 251,1164-70.

15. Mukherjee SP, Lane RH & Lynn WS (1978) Endogenous hydrogen peroxide andperoxidative metabolism in adipocytes in response to insulin and sulfhydryl reagents. Biochemical pharmacology 27, 2589-94.15

Информация о работе

Мишина, Наталия Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Исследование сигнальной функции пероксида водорода с помощью генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы