Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосенсоры активных форм кислорода и других редокс-активных соединений

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Биосенсоры активных форм кислорода и других редокс-активных соединений"

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

Белоусов Всеволод Вадимович

Биосенсоры активных форм кислорода и других редокс-активных соединений: создание и применение в

живых системах

специальность - 03-01-03 - молекулярная биология

005061773

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

1 з и; он т

Москва 2013

005061773

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков. М.М. Шемякина и Ю А. Овчинникова РАН

Научный консультант:

Лукьянов Сергей Анатольевич, Академик РАН, доктор биологических наук Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор, Директор Ширинский Владимир Института экспериментальной кардиологии ФГБУ Павлович

РКНПК Минздравсоцразвития

Доктор биологических наук, заведующий Лебедев Юрий

Лабораторией сравнительной и функциональной Борисович

геномики Института биоорганической химии им. академиков. М.М. Шемякина и Ю А. Овчинникова РАН.

Доктор биологических наук, заведующий Лабораторией биоэнергетики клетки Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университета имени М.В .Ломоносова.

Ведущая организация:

Институт биохимии имени А.Н.Баха Российской Академии Наук.

Защита состоится «27» июня 2013 года в 10:00 на заседании диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН по адресу 117871, Москва В-437, ул Миклухо-Маклая, д10/16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю А. Овчинникова РАН Автореферат разослан 22 мая 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук В.А.Олейников

Черняк Борис Викторович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Кислород является центральной молекулой для аэробных форм жизни. Кислород служит не только терминальным акцептором электронов в дыхательных цепях, но и регулятором большого числа метаболических и сигнальных процессов в живых системах. Поток электронов от субстратов к акцепторам проходит через редокс-пары активных соединений. Некоторые из этих редокс-пар также играют роль глобальных регуляторов жизнедеятельности живых систем.

Многие процессы в клетках регулируются кислородом не непосредственно, а через его активные формы. Активные формы кислорода (АФК) синтезируются в клетке как спонтанно, в результате утечки электронов в дыхательных цепях, так и направленно, в результате функционирования специализированных ферментативных систем. Ввиду крайне высокой реакционной способности АФК, их синтез и распространение строго контролируется клеткой. Нарушение контроля ведет к неспецифическому повреждению биологических макромолекул и аберрантной активации сигнальных каскадов: состоянию, известному как «окислительный стресс». Окислительный стресс прочно ассоциирован с развитием огромного числа патологий: нейродегенеративных заболеваний, патологий сердечно-сосудистой системы, нарушений иммунитета и др. Не удивительно, что активные формы кислорода, их синтез, распространение и утилизация являются центральными объектами исследований сотен лабораторий медико-биологического профиля во всем мире.

Вместе с тем, на протяжении нескольких десятилетий, с момента открытия АФК в живых системах по настоящее время, отсутствовали методы, позволяющие детектировать АФК в живых системах в режиме реального времени. С одной стороны, большое количество красителей, люминесцентных соединений и электродов позволяло количественно и специфично детектировать АФК in vitro в изолированных препаратах ферментов и органелл, в различных гомогенатах и субклеточных фракциях. С другой стороны, внутриклеточные флуоресцентные красители на основе синтетических хромофоров не обладали достаточной специфичностью к определенным формам АФК и в основном отражали протекание неких окислительно-восстановительных сигналов в клетке. Кроме того, из-за фотодинамического эффекта эти красители сами генерировали АФК при облучении видимым светом в процессе микроскопии. Другим существенным недостатком синтетических красителей является их необратимость и невозможность их адресной доставки к субклеточным структурам.

В то время как красители для детекции АФК были несовершенны, но широко применялись за неимением лучших методов, детекция состояния других ключевых редокс-пар, таких как НАД+/НАДН, in vivo была вообще невозможна. Все это послужило поводом к созданию нами методической платформы для детекции редокс-активных соединений, основанной на генетически кодируемых флуоресцентных индикаторах. Настоящая работа посвящена созданию таких сенсоров, их усовершенствованию и, наконец, применению для ответов на ключевые вопросы редокс-биологии: где и когда образуются АФК в живых системах?

Цель работы. Настоящая работа была направлена на создание генетически-кодируемых флуоресцентных индикаторов активных форм кислорода и других

редокс-активных соединений и их применение в живых системах. Для этого нами были поставлены и реализованы следующие задачи:

1. Создание и характеризация генетически кодируемого сенсора для детекции пероксида водорода в живых системах.

2. Усовершенствование сенсоров пероксида водорода.

3. Использование сенсоров пероксида водорода в режиме детекции времени жизни флуоресценции.

4. Улучшение пространственного разрешения детекции Н202 в клетке с помощью иммобилизованных версий индикаторов Н202. Изучение динамики микродоменов Н202 в цитоплазме при активации тирозинкиназных каскадов.

5. Получение сенсора для одновременной детекции Н202 и фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата и изучение с его помощью динамики липидной и пероксидной сигнальных систем при образовании иммунологического синапса в Т-лимфоцитах.

6. Изучение динамики и роли Н202 в макрофагах при фагоцитозе.

7. Создание сенсора пероксида водорода, флуоресцирующего в красной области спектра.

8. Создание сенсора для детекции соотношения НАД+/НАДН в клетках.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые были созданы генетически кодируемые индикаторы пероксида водорода. Биосенсор НуРег стал первым в мире инструментом, позволившим отслеживать динамику пероксида водорода в живых клетках и тканях. Его специфичность и обратимость делает НуРег незаменимым в исследованиях физиологических и патологических состояний, ассоциированных с продукцией АФК. Преимуществами сенсора НуРег являются также рациометрический сигнал и полностью белковая природа самого сенсора, что позволяет локализовать его в различных внутриклеточных компартментах и предоставляет широкие возможности создания трансгенных животных, экспрессирующих сенсор.

Вслед за НуРег, были получены сенсоры НуРег-2 и НуРег-3, отличающиеся увеличенным, по сравнению с НуРег, динамическим диапазоном. Использование этих сенсоров существенно упрощает детекцию небольших концентраций Н202. Был также создан красный флуоресцентный индикатор Н202, HyPer-Red.

На примере сенсоров НуРег и НуРег-3 впервые было продемонстрировано, что сенсоры на базе одного флуорофора (пермутированного флуоресцентного белка) способны менять время жизни флуоресценции. Сенсоры были успешно применены для детекции Н202 гп vivo в режиме детекции времени жизни флуоресценции FLIM.

Белковая природа сенсора НуРег позволила нам создать метод детекции локальных изменений концентрации Н202 на уровне суб-компартментов. Сшивая НуРег с белками, локализованными на различных клеточных мембранах, мы впервые продемонстрировали существование микродоменов Н202, ассоциированных с активированной рецепторными тирозинкиназами и резидентной ретикулярной тирозинфосфатазой РТР-1В. В ходе выполнения данной части работы мы впервые получили прямое доказательство того, что пероксид водорода локализован вблизи мест его производства и его диффузия в цитоплазме существенно ограничена.

Путем комбинирования биосенсора НуРег в одном химерном белке с РН-доменом киназы ВТК нам удалось создать сенсор, позволяющий одновременно детектировать Н202 (по изменению соотношения пиков возбуждения сенсора НуРег) и фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат (по транслокации сенсора из цитоплазмы на

плазматическую мембрану). С помощью данного сенсора нам впервые удалось наблюдать активность обеих сигнальных систем, липидной и окислительно-восстановительной, в иммунологическом синапсе, образуемом Th-лимфоцитом в процессе активации Т-клеточного рецептора антиген-презентирующими структурами. Мы показали, что не только активность Р13-киназы, но и продукция Н202 поляризованы в активируемых Т-клетках.

Биосенсор НуРег позволил нам впервые пронаблюдать за динамикой Н2О2 в фагоцитирующих макрофагах. Мы установили, что пероксид водорода, генерируемый макрофагами, участвует в регуляции МАР-киназ и служит для перепрограммирования фагоцитировавших клеток.

Получен генетически кодируемый флуоресцентный сенсор соотношения НАД+/НАДН, первый сенсор, способный детектировать редокс-состояние данной пары в компартментах, сильно различающихся по количеству НАДН: в цитоплазме и митохондриальном матриксе.

Методическая платформа для детекции АФК и других редокс-активных веществ, созданная в данной работе, применяется в настоящее время сотнями лабораторий в мире, являясь, фактически, безальтернативной в экспериментах, исследующих динамику окислительных процессов. Принципы конструирования биосенсоров, разработанные нами при создании индикаторов семейства НуРег, успешно применяются в других лабораториях при создании биосенсоров. Ведутся работы по созданию на базе биосенсоров Н202 систем скрининга лекарственных препаратов, направленных на ингибирование ферментативных систем, генерирующих АФК.

Апробация полученных результатов. Результаты диссертационной работы были представлены на российских и международных симпозиумах и конференциях, в том числе: "Сканирующая конфокальная микроскопия в биологии и медицине" 2005, Звенигород, Россия, приглашенный доклад; "Advanced Technologies in Biological Imaging" symposium, 2006, Хельсинки, Финляндия, приглашенный доклад; "In vitro molecular imaging" conference, 2007, Сан-Диего, США, приглашенный доклад; "Global Imaging Summit-2007: The application of Molecular and cellular imaging in drug discovery", 2007, Цюрих, Швейцария, приглашенный доклад; "Global Imaging Summit 2008", Кельн, Германия, приглашенный доклад; NIPS International Workshop "From photon to mind - Advanced Nonlinear Imaging and Biosensors", 2008, Оказаки, Япония, приглашенный доклад; EMBL Chemical Biology 2008, Гейдельберг, Германия; Gordon Research conference on Thiol-based Redox Regulation and Signaling, 2008, Барга, Италия, приглашенный доклад; Gordon Research conference on Nox Family NADPH Oxidases, 2010, Jle Диаблере, Швейцария приглашенный доклад; Gordon Research conference on Thiol-based Redox Regulation and Signaling, 2010, Барга, Италия, приглашенный доклад.

Публикации по теме работы: По материалам диссертации опубликовано 19 статей в российских и международных научных журналах.

Личный вклад автора. Основные результаты были получены лично автором, либо под его непосредственным руководством. Автор осуществлял планирование и проведение экспериментов, выбор методов, анализ и подготовку результатов к публикации.

1. Создание генетически кодируемого флуоресцентного индикатора для детекции пероксида водорода.

1.1. Создание сенсора и его характеризация in vitro

Мы создали 11 химерных молекул, в которых циркулярно-пермутированный желтый флуоресцентный белок (cpYFP) внедрен между поверхностными аминокислотами в положениях 205-222 белка OxyR-RD. Между cpYFP и OxyR-RD были внесены короткие аминокислотные линкеры, Ser-Ala-Gly и Gly-Thr. Все 11 химерных молекул при экспрессии в Е. coli флуоресцировали, причем один из них имел 2 пика возбуждения, 420 и 500 нм, и один пик эмиссии 516 нм. Мы обнаружили, что добавление 100 мкМ Н202 к суспензии клеток вызывало увеличение флуоресцентного сигнала в клонах 205-206 и 218-219 (номера обозначают позицию интеграции cpYFP в OxyR-RD) и понижение флуоресценции в клонах 211-212 и 214215 при возбуждении в области 500 нм. В присутствии каталазы в инкубационной среде Н202-зависимых изменений флуоресценции в этих клонах зафиксировано не было.

Рисунок 1. Генетически кодируемый флуоресцентный индикатор НуРег: схема строения и реакция окисления пероксидом водорода.

Для дальнейших экспериментов был выбран клон 205-206, названый НуРег (от Hydrogen Peroxide) (Рис.1), который оказался рациометрическим: при взаимодействии с Н202 пик возбуждения на 420нм снижался пропорционально возрастанию пика на 500нм (Рис. 2). Очевидным преимуществом рациометрического сенсора является то, что все его показания не зависят от количества экспрессированного белка, артефактов движения и изменения формы клеток. Для того чтобы проверить, являются ли наблюдаемые изменения результатом активности OxyR-RD, мы заменили аминокислотные остатки Cysl99 и/или Cys208 на Ser в участке OxyR-RD биосенсора НуРег. Во всех мутантных вариантах, в которых Ser заместил один или оба а.о. Cys, изменений флуоресценции при добавлении Н202 обнаружено не было.

Для проверки чувствительности и селективности НуРег мы провели ряд экспериментов in vitro с использованием очищенного белка. Для поддержания тиоловых групп в восстановленном состоянии все стадии выделения проводили в буфере, содержащем 5мМ 2-меркаптоэтанол. Полученный белок в конечной концентрации 25 нМ был помещен в тот же буфер, содержащий 0,5 мМ 2-меркаптоэтанол. Минимальная концентрация Н202 , способная вызывать изменения

флуоресценции НуРег, составляла 25нМ (Рис. 2Б). Добавление 250нМ Н202 приводило к полному окислению НуРег.

А

Б

Е SO J-.-,-,-,-,-,-3— I -■-■-■-■-■-■

s WO 420 440 460 480 500 520 540 S 400 420 440 460 450 500 520

Длина волны (нм) Длина волны (нм)

В Г

Е Р_,_,_,_,_,_,

s 400 420 440 460 400 500 520

Длина волны (нм)

J ooj-,-,-,-,-_

0 10 20 30 40 50 Время(МИН)

50

Рисунок 2. Спектр НуРег и его изменения в ответ на Н202. А. Спектр возбуждения НуРег имеет два пика, 420 и 500 нм, и один пик эмиссии, 516 нм. Б. Изменения спектра возбуждения НуРег in vitro при взаимодействии с Н202. В. Изменения спектра возбуждения НуРег в цитоплазме клеток Е. coli при взаимодействии с Н202. Г. НуРег демонстрирует обратимый ответ на пероксид водорода.

Для определения селективности НуРег мы проверили взаимодействует ли он с другими окислителями. Ни один из тестируемых окислителей, кроме Н202, не вызывал изменений флуоресценции НуРег. Для получения супероксид-аниона мы использовали ксантин-ксантиноксидазную систему. Во избежание возможного окисления НуРег пероксидом водорода, образующимся при дисмутации супероксида, в реакционный буфер была добавлена каталаза. Действительно, в отсутствии каталазы, ксантин-ксантин окислительная реакция приводила к быстрому окислению НуРег, однако добавление каталазы полностью предотвращало этот процесс. Окисленный глутатион (в концентрации 1мМ) также был неспособен вызывать окисление НуРег. Активные формы азота, оксид азота N0 (который, как было показано, индуцирует активацию ОхуЯ) и пероксинитрит тоже не проявили способности вызвать изменения в флуоресценции НуРег.

Так же как и большинство сенсоров, сконструированных на базе циркулярно-пермутированных желтых флуоресцентных белков, флуоресценция НуРег является рН-зависимой, с рКа 8,5.

1.2. Чувствительность НуРег к Н202 в бактериальных и эукариотических клетках

Мы провели косвенную калибровку биосенсора НуРег, экспрессирующегося в цитоплазме клеток Е. coli (Рис. 2В). В суспензии клеток минимальная концентрация добавляемого Н202, необходимая для детектируемых изменений флуоресценции, составляла 5мкМ. Такая же минимальная концентрация добавляемого к клеткам Е. coli Н202 была описана для активации белка OxyR дикого типа. Разница между минимальным количеством Н202, достаточного для окисления НуРег in vitro и in vivo, вероятно, связана с деградацией Н202 каталазой и другими ферментами, либо с ограничениями свободной диффузии Н202 через плазматическую мембрану.

Мы предположили, что окисленный НуРег, как и белок OxyR дикого типа, будет восстанавливаться внутри клеток. Для проверки обратимости НуРег мы провели несколько циклов окисления биосенсора, экспрессируемого в цитоплазме клеток Е. coli, путем повторных добавлений Н202 в присутствии 50 Ед/мл каталазы (Рис. 2Г). В таких условиях Н202 сначала реагирует с НуРег, а затем быстро удаляется каталазой. Результаты экспериментов показали, что в клетках флуоресценция НуРег сначала быстро возрастала, а потом восстанавливалась до начального уровня через несколько минут после добавления Н202.

Для определения работоспособности НуРег в клетках млекопитающих мы переклонировали его в экспрессионный вектор CI (Clontech), что позволило экспрессировать НуРег в культуре эукариотических клеток. Мы обнаружили флуоресценцию НуРег в клетках HeLa при облучении клеток фиолетовым или синим светом при помощи флуоресцентного микроскопа. Как и ожидалось, добавление 50 мкМ Н202 приводило к быстрым и обратимым изменениям флуоресценции НуРег в обоих каналах (Рис. ЗА).

А Б

/--

1 10 100 1.000 нд(цМ)

Рисунок 3. НуРег в культуре эукариотических клеток. А. Изменения флуоресценции сенсора в клетках при возбуждении в области 500 нм (F500) и 420 нм (F420). Б. Калибровка ответа сенсора на добавленный к клеткам Н202, выполненная с помощью проточной цитометрии.

С целью охарактеризовать чувствительность НуРег в клетках млекопитающих мы провели калибровку соотношений пиков биосенсора в цитоплазме стабильно трансфецированных клеток линии COS-7 с помощью сортировки клеток, активируемой флуоресценцией (FACS, Fluorescence-activated cell sorting). Мы обнаружили, что минимальная концентрация Н202, необходимая для возникновения изменений флуоресценции НуРег, составляла, как и в случае бактериальной суспензии, 5 мкМ (Рис 3. Б). Эти результаты показали, что в клетках млекопитающих OxyR-домен биосенсора НуРег правильно сворачивается и сохраняет свою высокую чувствительность к 1Ь02.

1.3. Детекция Н202 в условиях физиологической стимуляции

Для исследования способности НуРег детектировать низкие уровни Н202, продуцируемого в условиях физиологической стимуляции, мы обрабатывали клетки PC-12, экспрессирующие НуРег в цитоплазме, раствором фактора роста нейронов (NGF), который, как известно, индуцирует быструю и кратковременную продукцию АФК. Действительно, мы смогли зафиксировать изменения уровня Н202 в цитоплазме стимулированных клеток (Рис. 4).

Рисунок 4. НуРег позволяет детектировать низкие концентрации Н202, образующиеся в ответ на стимуляцию клеток ростовыми факторами. Показана динамика ответа отдельных клеток PC 12 на NGF (красная и зеленая кривые). Черная кривая соответствует типичной нестимулированной клетке.

Время (мин)

Мы обнаружили два паттерна клеточного ответа (у 22 клеток в четырех независимых экспериментах). В большинстве клеток (п=15) уровень Н202 начинал расти почти сразу после добавления фактора роста. Уровень Н202 возрастал и достигал максимума в течение 3-7 минут, далее следовало падение до начального уровня в течение 10-20 минут. Кроме того, часть клеток (п=7) продемонстрировали двухфазную кинетику роста Н202. В этих клетках небольшой кратковременный подъем уровня Н202 сменялся вторым сильным и резким подъёмом Н202. Далее флуоресценция НуРег постепенно достигала начального уровня. Для проверки возможности появления изменений в флуоресценции из-за колебаний рН мы инкубировали клетки с рН-чувствительным красителем BCECF-AM. В результате никаких изменений рН в течение 60 минут после добавления NGF зафиксировано не было.

2. НуРег-2, сенсор Н202 с увеличенным динамическим диапазоном

2.1. Исследование динамического диапазона мутантной версии сенсора HyPer-N353SA406V, соединенной с последовательностью сигнала ядерного экспорта.

В процессе переклонирования НуРег для соединения его последовательности с последовательностью сигнала ядерного экспорта был получен мутантный вариант НуРег, содержащий две случайные значимые нуклеотидные замены, вероятно, возникшие на этапе ПЦР. Первая мутация была локализована в последовательности флуоресцентного белка (N353S в НуРег , соответствующая N121S в зелёном флуоресцентном белке GFP). Вторая мутация в НуРег затронула участок OxyR: замена A406V соответствует А233 V в OxyR дикого типа (Рис. 5).

О 100 200 300 400 500 600

Время (сек)

Рисунок 5. НуРег с заменами N3538 и А406У демонстрирует увеличенный динамический диапазон изменения сигнала в ответ на добавление Н202. А. НуРег состоит из пермутированного флуоресцентного белка срУРР, интегрированного в белок ОхуЯ-ЯЭ между аминокислотными остатками 205 и 206. Он содержит два цистеина, С121 и С382 (С199 и С208 по номенклатуре \vtOxyR), образующих дисульфидную связь при взаимодействии с Н202. Остаток N353 соответствует N1218 составе \vtGFP. А406 соответствует А233 в составе \vtOxyR. Б. Схема эксперимента с клетками, культивируемыми на р-слайдах. В. Серия изображений, иллюстрирующих динамику изменений отношения Р500/Р420 в клетках, экспрессирующих НуРег-№538-А406У в ответ на добавление 100 мкМ Н202. Номера на кадрах отражают время в секундах. Н202 был добавлен между 2м и Зм кадрами. Шкала 40 мкМ. Здесь и далее псевдоцвета иллюстрируют соотношение пиков флуоресценции сенсора при возбуждении в области 500 нм и в области 420 нм (Р500/Р420). Г Динамика изменений сигнала сенсора в клетках, показанных на панели В (черные линии) в сравнении с клетками, экспрессирующими биосенсор НуРег (красные линии).

При экспрессии в клетках линии НеЬа новый мутантный сенсор обладал увеличенным динамическим диапазоном по сравнению с таковым у обычного НуРег. Для выяснения истинной величины динамического диапазона необходима быстрая

смена концентрации Н202, чтобы обеспечить на начальном этапе абсолютное преобладание реакции окисления сенсора над реакцией его восстановления внутриклеточными системами тиол-дисульфидного обмена. С целью тщательного измерения амплитуды ответа на Н202 мы разработали простой тест для немедленного измерения в клетке изменений концентрации Н202. Для культивирования, трансфекции и наблюдений за клетками после добавления Н202 мы использовали ц,-слайды. Схема эксперимента показана на Рис. 5Б. Общий объем ц-слайда-1У, состоящего из канала с двумя резервуарами, составляет 120 мкл. Перед началом наблюдения мы удаляли 90 мкл среды из одного резервуара. Оставшиеся 30 мкл среды оставались внутри канала. После выбора клеток для наблюдения и установки фокуса мы начали серию наблюдений. После фотографирования нескольких первых кадров мы добавляли одной каплей 90-100 мкл Н202-содержащей среды в передний резервуар. При таких условиях новая среда моментально замещала среду внутри канала. В ответ на добавление избыточных количеств Н202 (ЮОмкМ) к клеткам, экспрессирующим НуРег-Ы3538-А406У-ЫЕ8, соотношение пиков Р500/Р420 биосенсора изменялось в 6-7 раз (Рис. 5Г).

А

Рисунок 6. Сравнение НуРег и НуРег-2: Ответ на пероксид водорода. А. Изменения соотношения F500/F420 в ответ на добавление 100 мкМ Н2Ог к клеткам, экспрессирующим НуРег-2 (верхний ряд изображений) и НуРег (нижний ряд изображений). Числа отражают время в секундах для обоих рядов изображений. Шкала 40 мкМ. Б. Типичная динамика изменений соотношения F500/F420 в ответ на экзогенный Н202 в клетках, экспрессирующих НуРег-2 (черная кривая), НуРег (красная кривая) и НуРег N353S (синяя кривая). Продолжение сравнения см. в разделе, посвященном сенсору НуРег-3.

Для выяснения причины увеличения динамического диапазона мы внесли в сенсор перечисленные мутации по отдельности. Добавление NES к НуРег не влияло на динамический диапазон сенсора. Мы внесли в НуРег мутации N353S или A406V и проэкспрессировали полученные варианты белков в клетках линии HeLa. Было обнаружено, что мутант HyPerA406V проявлял повышенный динамический

Б

Время (сек)

диапазон, в то время как замена N353S никак не изменяла спектральные свойства НуРег (Рис. 6). Соответственно, замена A406V является единственной причиной изменений свойств биосенсора, который получил название НуРег-2.

Мы провели анализ свойств внутриклеточного НуРег-2 в сравнении с НуРег при ответе на добавление к клеткам Н202. Для этого мы измеряли время полуокисления и полувосстановления сенсоров. Было обнаружено, что НуРег окисляется и восстанавливается быстрее, чем НуРег-2 (Рис. 7 В, Г). Оба времени, и полуокисления и полувостановления, для НуРег-2 были вдвое больше по сравнению с НуРег. Это может указывать на снижение скорости реакции сенсора с Н202 и доступности дисульфидной связи OxyR в НуРег-2 для восстанавливающих ферментов.

2.2. Для НуРег-2 характерно олигомерное состояние, в отличие от НуРег

Мутация A233V OxyR, соответствующая мутации A406V в НуРег, ранее была описана как одна из дестабилизирующих интерфейс димеризации OxyR дикого типа. Мы предположили, что дестабилизация димеризации ведет к повышенной мобильности т.н. «редокс-петли», участка между 205 а.о. и 225а.о. (согласно номенклатуре wtOxyR). Альфа-спираль, содержащая А233, во-первых, расположена в интерфейсе димеризации, во-вторых, фланкирует с С-конца редокс-петлю, в которую в сенсоре НуРег встроен cpYFP. Для выявления олигомерных состояний НуРег и НуРег-2 мы провели гель-фильтрационную хроматографию (Рис. 8). К нашему удивлению, белок НуРег-2 присутствовал только в виде димера, вне зависимости от концентрации белка, в то время как элюат белка НуРег представлял собой смесь димеров и мономеров в концентрированных образцах и только мономеры в разбавленных образцах. На основании полученных данных можно предположить, что либо НуРег и НуРег-2 имеют другую структуру димеризационного интерфейса по сравнению с таковым wtOxyR, либо что замена аланина 233 на более гидрофобный валин стабилизирует димер НуРег-2 посредством гидрофобных взаимодействий с II10 и L124 (нумерация wtOxyR).

3. НуРег-3: Сочетание преимуществ НуРег и НуРег-2

3.1. Создание НуРег-3

Белок OxyR дикого типа функционирует в качестве димера. Его димеризационный интерфейс состоит из аминокислотных остатков 226-233, локализованных в регуляторном домене, так же присутствующем в НуРег. Результаты гель-фильтрации показали, что НуРег является мономером или слабым димером, в зависимости от концентрации. Тем не менее, оказалось, что мутации аминокислотных остатков димеризационного интерфейса играют ключевую роль в определении динамического диапазона биосенсора. Так, мутация A406V в НуРег (соответствующая A233V в OxyR) привела к созданию биосенсора НуРег-2, у которого, по сравнению с НуРег, динамический диапазон (максимальное изменение соотношения пиков F500/F420 в ответ на окисление) вдвое шире. НуРег-2 формирует прочные димеры, проявляя сравнительно медленную окислительно-восстановительную кинетику, которая может ограничивать временное разрешение детектирования Н202 (15).

Время (мин)

Полу-окисление

гп

НуРвг-3 HyPer-H34Y--A406V

S °

8-е

Полу-восстановление

НуРег-З HyPer-H34Y--A406V

Рисунок 7. Сравнение сенсора НуРег-З с НуРег-2 и НуРег. А. Изменения соотношения F500/F420 в ответ на добавление 150 мкМ Н202 к клеткам, экспрессирующим НуРег-З (верхний ряд изображений) и НуРег (нижний ряд изображений). Числа отражают время в секундах для обоих рядов изображений. Шкала 40 мкМ. Б. Типичная динамика изменений соотношения F500/F420 в ответ на экзогенный Н202 в клетках, экспрессирующих НуРег-З (черная кривая), НуРег-2 (красная кривая) и НуРег (синяя кривая). В. Времена полу-окисления НуРег, НуРег-2, НуРег-З, и HyPer-H34Y-A406V. Нулевой момент времени соответствует моменту добавления Н202. Показаны средние значения и стандартное отклонение. Г. Времена полу-восстановления НуРег, НуРег-2, НуРег-З, и HyPer-H34Y-A406V. Нулевой момент времени соответствует максимальному значению F500/F420. Показаны средние значения и стандартное отклонение. Данные панелей В и Г получены в результате обработки 7 экспериментов для НуРег, 10 для НуРег-2, 10 для НуРег-З, и 4 для HyPer-H34Y-A406V; >10 клеток в каждом эксперименте.

Мы предположили, что другие мутации в той же области интерфейса в молекулах НуРег и НуРег-2 могли бы привести нас к получению биосенсора с улучшенными окислительно-восстановительными характеристиками, такими как более широкий динамический диапазон и более быстрый отклик. Несколько фенотипических мутаций в области димеризационного интерфейса OxyR были

описаны в литературе: II 10D (конститутивно-активный OxyR), F219A (с ослабленной индукцией oxyS), L124D (с ослабленной индукцией oxyS) и H114Y (конститутивно-активный OxyR). Несмотря на то, что мы не можем предсказать как каждая из мутаций изменит свойства НуРег (например, A406V усиливает димеризацию НуРег, в то время как аналогичная мутация A233V в OxyR ослабляет его димеризацию), мы воспроизвели описанные выше мутации в НуРег. Мутации I110D, F219A and L124D привели к получению вариантов сенсора с чрезвычайно низким динамическим диапазоном. Однако, в результате замены H114Y (соответствующая H34Y в НуРег) был получен биосенсор HyPer-H34Y с высоким соотношением сигнала к шуму, названный НуРег-3 (Рис. 7). Мы провели измерения полупериодов окисления и восстановления для НуРег, НуРег-2 и НуРег-3. Полупериод окисления НуРег-3 был в 1,4 раза быстрее, чем окисления НуРег-2. Полупериод восстановления НуРег-3 был наиболее коротким среди всех исследуемых образцов (Рис. 7 В, Г).

3.2. Аффинность и скорость реакции с Н202.

Различия в значениях полупериодов окисления могут вытекать из разницы аффинности биосенсоров к Н202 или из разных скоростей их реакции с Н202. Поскольку нам не удалось выделить восстановленную форму НуРег-3, мы провели измерения кинетик, используя быструю флуоресцентную микроскопию клеток млекопитающих, экспрессирующих разные версии биосенсоров. Культивирование клеток на ц-слайдах позволило изменять концентрацию Н202 в клетках достаточно быстро, чтобы измерять скорость реакции псевдо-первого порядка. Ранее мы выяснили, что минимальные концентрации Н202, которые были способны индуцировать заметные изменения флуоресценции НуРег составляли 25нМ для выделенного биосенсора и 5 мкМ для НуРег в цитоплазме Е. coli или эукариотических клеток. Эти данные согласуются с данными, полученными для wtOxyR. Исходя из этого, мы определили наличие -200-500 кратного градиента Н202 через плазматическую мембрану. Мы показали, что концентрации Н202, инициирующие скорость реакции (Кох) с сенсором, составляющую половину от максимальной, составляют 160 нМ для НуРег, 290 нМ для НуРег-2 и 260 нМ для НуРег-3 (принимая во внимание падение концентрации Н202 при пересечении ПМ в 500 раз). Константы скорости реакций псевдо-первого порядка (Ks) составили 5-Ю5 М'Чек"1 для НуРег, 1.2-105 M''-сек"1 для НуРег-2 и 2.5-105 M''-сек"1 для НуРег-3. Таким образом, причиной медленного ответа НуРег-2 является более медленная, по сравнению с остальными сенсорами, скорость реакции с Н202. Нурег-3 имеет промежуточные значения между НуРег и НуРег-2 как по полупериоду окисления, так и скорости реакции с Н202. Несмотря на то, что воссоздать восстановление НуРег глутаредоксином или тиоредоксином in vitro довольно трудно, различия в полупериоде восстановления сенсоров наиболее вероятно отражают разницу скоростей реакции окисленных боисенсоров с тиол-восстанавливающими системами клетки. Первоначальный спад соотношения пиков F500/F420 во время восстановления не сильно зависит от остаточной концентрации Н202, так как почти все молекулы биосенсора окислены.

3.3. Сравнение спектральных характеристик сенсоров

Следующей задачей было сравнение яркости сенсоров, для чего методом металл-аффинной хроматографии были выделены соответствующие белки. Поскольку нам не

удалось выделить НуРег-3 в восстановленной форме, измерения проводили только для окисленных форм всех трех биосенсоров. Все версии сенсоров имели одинаково низкий квантовый выход 0,1, но значения коэффициентов экстинкции (КЭ) биосенсоров сильно различались. КЭ/яркость при 490нм составили 17,000/1,700, 25,000/2,500 и 17,000/1,700 М '-см"1 для НуРег, НуРег-2 и НуРег-3 соответственно, что составляет 5-7% яркости EGFP.

3.4. Сверхмедленный сенсор Н202

Далее мы проверили как комбинация двух мутаций, A406V и H34Y, повлияет на свойства сенсоров. HyPer-H34Y-A406V показал тот же динамический диапазон, что и его «родительские» варианты, НуРег-2 и НуРег-3, однако полупериоды восстановления и окисления у HyPer-H34Y-A406V были очень малы (Рис. 7 В, Г). Таким образом, HyPer-H34Y-A406V не может быть использован в качестве Н202-сенсора в реальном времени, но представляет потенциальный интерес как «запоминающий» индикатор Н202, у которого окисленная форма продолжает существовать в течение длительного периода, помогая ретроспективно определить те клетки in vitro или in vivo, которые ответили на какие-либо стимулы повышением концентрации Н202.

3.5. Олигомерное состояние НуРег-3

Мутация H34Y влияет на димеризационный интерфейс OxyR-RD. НуРег-2 формирует прочные димеры, в то время как НуРег преимущественно находится в мономерном состоянии. Потенциально, димеризация является необходимым условием для расширения динамического диапазона Hyper. Для того, чтобы оценить димеризационное состояние НуРег-3 мы использовали методику гель-фильтрации. При концентрации 0,02 мг/мл элюированный НуРег-3 находился преимущественно в мономерном виде, димеризуясь при значительном увеличении концентрации (Рис. 8).

Молекулярная масса (кДа)

Рисунок 8. Олигомерное состояние НуРег, НуРег-2 и НуРег-3.

Прочность димеризации увеличивается в последовательности: НуРег <НуРег-3 <НуРег-2, однако, это не коррелирует напрямую со значениями динамического

диапазона, так как НуРег-2 и НуРег-3 в этом отношении равны. Таким образом, димерное состояние не является необходимым условием для повышения динамического диапазона сенсора. Тем не менее, димеризация, видимо, влияет на скорости реакций окисленных сенсоров с клеточными тиол-восстанавливающими системами, так как мономерные версии, НуРег и НуРег-3, быстрее восстанавливаются в клетке, чем строго димерный НуРег-2.

3.6. HyPer-3 in vivo: модель раны в Danio rerio.

Недавно, для наблюдений градиентов Н202 в толще тканей хвоста рыбы Данио (zebrafish, Danio rerio) при ранении был успешно применен НуРег. Градиент Н202 начинал формироваться в течение 3 минут после нанесения раны и достигал максимума примерно на 20 минуте, проникая на 100-200 мкм в эпителий хвостового плавника с уменьшением градиента концентрации. Градиент Н202 нужен для привлечения в область воспаления нейтрофилов, использующих градиент как хемотактический сигнал. Мы протестировали производительность НуРег-3 в сравнении с НуРег на этой модели. мРНК, кодирующая НуРег-3, была инъецирована в эмбрионы Danio rerio на стадии одной клетки. За флуоресценцией сенсора наблюдали в течение 3 дней после оплодотворения (3 dpf). Несмотря на одинаковую яркость НуРег-3 и НуРег в изолированном виде, in vivo нам удалось детектировать достаточно интенсивную флуоресценцию лишь для НуРег, тогда как флуоресценция НуРег-3 была слишком слабой. Для получения оптимального уровня экспрессии мы решили создать трансгенную линию Danio rerio, экспрессирующих НуРег-3 под контролем промотора (3-актина. Такие трансгенные животные экспрессировали НуРег-3 во всех клетках (Рис. 9А).

А

Рисунок 9. Сравнение ответов НуРег-3 и НуРег на Н202 в модели раны in vivo. А. Фотография в проходящем свете (вверху) и во флуоресцентном режиме (внизу) рыбы Danio rerio на стадии 3,5 дней после оплодотворения, экспрессирующей НуРег-3 под контролем промотора Р-актина. Вертикальная белая линия иллюстрирует план нанесения раны. Сильная флуоресценция в сердце соответствует маркеру трансгенеза cmlc2:egfp (обведено красным). Б. Изменения соотношения F500/F420 в ране эмбрионов, экспрессирующих НуРег-3 (слева) и НуРег (справа). Числа отражают время после нанесения раны в минутах. Шкала 100 мкм.

Нанесение раны трансгенным животным путем ампутации кончика хвостового плавника приводило к появлению выраженного градиента Н202 в хвостовом отделе рыб (Рис 9Б). Важно отметить, что из-за улучшенного динамического диапазона НуРег-3 детектируемые изменения соотношения F500/F420 были сильнее, по сравнению с НуРег (Рис 9Б). Максимальное изменение соотношения пиков для НуРег составляло 1,72±0,18, в то время как для НуРег-3 было детектировано увеличение соотношения пиков в 2,53±0,39 раза (10 НуРег и 7 НуРег-3 эмбрионов в трех независимых экспериментах, данные представляют величины среднего и стандартное отклонение). Таким образом, для мониторинга градиентов Н2О2 в тканях наиболее подходящим биосенсором оказался НуРег-3.

3.7. Использование НуРег и НуРег-3 в режиме FLIM

Микроскопия с детекцией времени жизни флуоресценции (Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM) предоставляет собой особый режим наблюдения, часто используемый для мониторинга биологических процессов при помощи сенсоров, основанных на флуоресцентном резонансном переносе энергии (FRET). После изменений эффективности FRET, время жизни донорного флуорофора изменяется, что позволяет проводить достоверную количественную оценку относительной доли молекул в различных FRET-состояниях. Однако, для одно-флуорофорных сенсоров использование FLIM ограничено несколькими сообщениями о наличии pH-зависимых изменений времени жизни флуоресценции у GFP-подобных белков. Мы исследовали изменяется ли время жизни флуоресценции НуРег и НуРег-3 при взаимодействии с Н202. В сотрудничестве с проф. Theodoras Gadella мы провели FLIM клеток HeLa, экспрессирующих НуРег или НуРег-3, до и после добавления насыщающего количества Н202 (100 мкМ). Для обоих биосенсоров было показано, что интенсивность флуоресценции депротонированного хромофора, возбужденного при 488нм, возрастала, а время жизни флуоресценции уменьшалось при добавлении Н202. Данные для НуРег-3 представлены на Рисунке 10.

Для НуРег времена жизни флуоресценции, измеренные по фазе и модуляции, составляли 1,27±0.04 нсек и 1.73±0.02 нсек, соответственно (п=20, количество клеток в 3 экспериментах). Разница между смещением фазы и модуляции времени жизни флуоресценции говорит о мультиэкспоненциальном спаде возбужденного состояния. После добавления Н202 у НуРег времена жизни флуоресценции, измеренные по фазе и модуляции, понизились до 1.02±0.06 нсек и 1.44±0.13 нсек, соответственно (п=20).

В случае с НуРег-3 (Рис. 10 А), окисление понижало времена жизни флуоресценции с 1.29±0.04 нсек (фаза) и 1.77±0.05 нсек (модуляция) до 0.92±0.01 нсек (фаза) и 1.12±0.02 нсек (модуляция) (п=11). Важно отметить, что время жизни флуоресценции сенсоров понижалось в ответ на окисление, в то время как яркость возрастала. Так как значение квантового выхода пропорционально измеряемому времени жизни флуоресценции, окисление НуРег-3 вызывало 25-30% снижение квантового выхода. Однако, интенсивность флуоресценции при окислении возрастала в 5 раз, что говорит о значительном увеличении коэффициента экстинкции. Таким образом, как НуРег, так и НуРег-3 пригодны для FLIM, но НуРег-3 демонстрирует более выраженные изменения времени жизни флуоресценции при окислении.

Таи (модуляция) Таи (модуляция)

Таи (нсек)

Рисунок 10. Детекция пероксида водорода с помощью НуРег-3 в режиме FLIM. А. Изменение времени жизни флуоресценции НуРег-3 при взаимодействии с Н202. Слева: микрофотографии клеток HeLa, экспрессирующих НуРег-3, до добавления Н202. Справа: микрофотографии клеток спустя одну минуту после добавления 100 мкМ Н202. Изображения сверху вниз интенсивность флуоресценции; время жизни флуоресценции, вычисленное по фазе, с соответствующими графиками распределения интенсивности и времени жизни флуоресценции; время жизни флуоресценции, вычисленное по модуляции, с соответствующими графиками распределения интенсивности и времени жизни флуоресценции. Б. Продукция Н202 в ране хвостового плавника, детектируемая в режиме FLIM. Левое и правое изображения представляют интенсивность флуоресценции и изображение FLIM, соответственно. Область ROI 1 соответствует области раны, ROI2 соответствует участку ткани вдали от раны. В. График распределения времени жизни флуоресценции в областях ROI1 и ROI2 панели Б.

Мы проверили возможность детектировать с помощью FLIM и НуРег-3 продукцию Н202 в модели воспаления в рыбе Danio rerio. Протокол нанесения раны был идентичен описанному ранее для рациометрического наблюдения. Мы успешно детектировали изменения времени жизни флуоресценции НуРег-3, индуцированные

Таи (фаза)

повреждением тканей (Рис. 10 Б). Паттерн изменений времени жизни флуоресценции совпадал для FLIM (Рис. 10 Б) и рациометрического (Рис. 9 Б) способов детекции, демонстрируя градиент Н2О2 с большими концентрациями оксиданта в области повреждения.

FLIM в настоящее время активно используется по многих лабораториях, поскольку имеет ряд преимуществ, таких как использование одной длины волны для возбуждения одного сенсора, количественное считывание параметров, меньшая интерференция со стороны светорассеяния или частичного выцветания, и независимость от уровня экспрессии. До сих пор идея о том, что время жизни флуоресценции может изменяться в одно-хромофорных сенсорах из-за изменений в окружении хромофора, не принималась в расчет разработчиками сенсоров. Применимость FLIM для наблюдения за НуРег-3 указывает на то, что такой тип микроскопии может быть применен и к другим сенсорам, в основе которых лежит циркулярно-пермутированный флуоресцентный белок (cpFP), например, Са2+ сенсоры, Perceval, Peredox и другие.

Несмотря на возможность работы в режиме FLIM, рациометрическое наблюдение за НуРег и НуРег-3 пока что остается предпочтительным методом в силу более выраженных изменений сигнала. Тем не менее, во многих случаях метод FLIM может быть выгодным, а, следовательно, разработка сенсоров для детекции с помощью FLIM является важным направлением.

4. Исследование микродоменов пероксида водорода с помощью локализованных сенсоров

4.1. Создание локализованных версий сенсора НуРег

Локализация сигнальных молекул вблизи их мест действия является центральным принципом клеточной передачи сигнала. Колокализация многокомпонентных сигнальных комплексов осуществляется через белковые каркасы, которые позволяют достичь большей специфичности, чем в случае простой диффузии того же набора участников процесса. Предполагают, что системы, продуцирующие активные формы кислорода (АФК) также следуют этому принципу благодаря специфической локализации продукции АФК и ограниченному распространению их в клетке. Однако из-за отсутствия адекватных методов до недавнего времени не удавалось непосредственно детектировать локальную продукцию АФК и напрямую подтвердить модель компартментализации редокс-сигналинга. Тем не менее, теоретические расчеты и косвенные данные по внутриклеточному распределению ЫАОРН-оксидаз и их адаптерных белков, а также локальному контролю распространения АФК, свидетельствовали в пользу высокой степени локализации продукции, деградации и действия последних.

В случае классического рецепторного сигналинга в ответ на взаимодействие лиганда с рецептором в клетке продуцируется диффундирующий вторичный мессенджер, который передает сигнал путем взаимодействия со своей мишенью. Подобный механизм одновременно способствует и распространению сигнала в пространстве, и амплификации сигнала, так как большинство вторичных

мессенджеров продуцируются ферментативным путем. Как правило, вторичные мессенджеры - это маленькие диффундирующие молекулы, которые способны быстро активировать белки-эффекторы (например, протеинкиназы, фосфатазы, ионные каналы) путем связывания с ними или химической модификации. Наиболее хорошо изученными вторичными мессенджерами являются циклические нуклеотиды (цАМФ, цГМФ), модифицированные липиды (инозитолфосфаты, эйкозаноиды) и ионы (Са2+). В целом, вторичные мессенджеры характеризуются специфичностью по отношению к своей мишени, а также в большинстве случаев ограниченным распространением в пределах места продукции.

Исторически сложилось мнение, что АФК являются побочным продуктом окислительного метаболизма и не имеют специфической функции. Однако открытие того, что АФК участвуют в регуляции многих сигнальных путей, позволило рассматривать внутриклеточную продукцию АФК как ответ клеток на окружающие стимулы. Какие же именно АФК способны играть роль вторичных мессенджеров?

Основным свойством вторичного мессенджера является специфичность по отношению к эффектору в сигнальном пути. Специфичность действия АФК может достигаться как за счет кинетики реакций, так и пространственными отношениями между мессенджером и мишенью. Основным механизмом, благодаря которому Н2О2 может выполнять сигнальную функцию, является специфичная, обратимая модификация некоторых аминокислотных остатков в белках. В основном к таким остаткам относятся цистеины, однако и другие аминокислоты могут подвергаться окислению Н202. Пероксид водорода действует как сигнальная молекула через прямое взаимодействие с аминокислотными остатками белка-мишени или опосредованно, через пероксидазы. В одних случаях, продукты таких реакций ингибируют функцию белка, блокируя важные каталитические аминокислотные остатки, например, цистеины в активных центрах протеиновых тирозинфосфатаз. В других случаях, модификации в белке-мишени могут привести к изменению конформации или изменениям во взаимодействии с другими белками и таким образом привести к активации или ингибированию функции модифицируемого белка или связанных с ним белков.

Одним из наиболее характерных и хорошо изученных примеров сигнальной функции Н2О2 являются тирозинкиназные каскады. Ростовые факторы стимулируют клеточный ответ через активацию тирозинкиназных рецепторов (Г1ТК), локализованных на плазматической мембране клетки. Связывание ростового фактора приводит к олигомеризации рецептора и активации его тирозинкиназного домена с последующей индукцией каскада фосфорилирования. ЯТК, связанные с лигандом, интернализуются в составе эндосомы и далее либо деградируют либо рециклизуются обратно на плазматическую мембрану.

Протеиновые тирозинфосфатазы (РТР) ответственны за терминацию сигнальных каскадов, путем дефосфорилирования активных 11ТК и других фосфорилированных белков. Большинство РТР конститутивно активны в клетке. Таким образом, для успешного прохождения ЮТС сигналинга важным условием является ингибирование РТР. Эндогенный Н202 участвует в контроле активности РТР через реакцию обратимого окисления тиолатов в активном центре этих ферментов. В результате, временная инактивация РТР смещает динамическое равновесие фосфорилирования/ дефосфорилирования 11ТК в сторону реакции фосфорилирования.

Тирозинфосфатаза РТР-1В отвечает за дефосфорилирование многих активированных ЯТК, в том числе рецепторов эпидермального фактора роста (ЕОРЯ)

и тромбоцитарного фактора роста (PDGFR). РТР-IB локализуется на цитоплазматической стороне эндоплазматического ретикулума (ЭПР), С-концевой домен фермента заякорен в мембране ЭПР. РТР-IB дефосфорилирует EGFR и PDGFR в участках контакта ЭПР с мембраной, содержащей активированный рецептор, и таким образом терминирует сигнальный каскад. Поэтому для успешного прохождения сигналов от RTK важным моментом является временная инактивация РТР-IB. Несмотря на то, что окисление РТР-IB Н202 было показано и in vivo и in vitro, механизм окисления этого фермента и других РТР оставался загадкой. Не было ясно, как РТР, которые имеют константу скорости реакции с Н202 1 0 - 103 М 'с"1, способны эффективно конкурировать с пулом пероксиредоксинов (Ргх) с константами, достигающими 2*107 М"'с"'. Для решения этого парадокса предложена модель компартментапизованного редокс-сигналинга. Однако предложенная модель требовала экспериментального подтверждения: наблюдение в реальном времени за динамикой генерации Н202 в различных внутриклеточных компартментах в ходе активации RTK сигналинга в живой клетке.

Обратимость генетически кодируемых сенсоров позволяет детектировать динамику концентраций Н202 в реальном времени в живой клетке. Однако пространственное разрешение метода с использованием НуРег не позволяет детектировать локальные повышения Н202, так как из-за быстрой диффузии сенсора в клетке происходит «размывание» сигнала даже в случае, когда Н202 продуцируется локально. Однако проблему низкого пространственного разрешения метода удалось преодолеть «заякориванием» сенсора на цитоплазматических поверхностях клеточных мембранах.

А Г

EGFR 121 оК НуРег )

Н2О2

1 1,5 2

Время (мин)

Рисунок 11. А. Схема белка EGFR-HyPer. Б. Внутриклеточная локализация белка ЕОРК-НуРег в нестимулированных клетках линии НеЬа-КуоШ после 3 часов инкубации в бессывороточной среде. Масштабная линейка - 10 мкм. В. Ответ EGFR-HyPer на добавление Н202 к клеткам НеЬа-КуоШ.

Мы предположили, что генерация пероксида водорода должна колокализоваться либо с активированным тирозинкиназным рецептором, либо с фосфатазой РТР-1В, либо с ними обоими. Чтобы оценить возможность первого варианта, мы направили НуРег на плазматическую мембрану (ПМ) и эндосомы при помощи химерных белков содержащих сенсор НуРег, сшитый с С-концевой областью рецептора EGFR (Рис. 11) или PDGFR. Химерные белки EGFR(l-1210)-HyPer и PDGFR (1-1106)-НуPer были проэкспрессированы в клетках линии HeLa-Kyoto и NIH-3T3, соответственно. В условиях голодания по сыворотке, флуоресценция в основном была локализована на ПМ в обоих типах клеток. Во многих клетках линии NIH-3T3 белок PDGFR-HyPer был локализован как на ПМ, так и на эндосомо-подобных эндомембранах.

4.2. Продукция пероксида водорода при активации EGFR

Стимуляция клеток HeLa фактором EGF приводила к быстрой интернализации EGFR-HyPer в эндоцитарные везикулы (Рис. 12А). Важно отметить, что доля флуоресценции, сохраняющаяся на плазматической мембране после интернализации основной части рецептора EGFR-HyPer, отражает наличие неинтернализованных рецепторных молекул и позволяет сравнивать уровень Н202 на плазматической мембране и в эндосомах. Мы выявили, что существенное повышение уровня Н202 в эндосомальной фракции начинается в течение 7-10 мин после стимуляции. Концентрация Н202 достигала плато в течение следующих 10 - 15 мин, а затем следовала вторая волна генерации Н202 (Рис. 12 В). Однако, в области, в которой сенсор EGFR-HyPer находился на ПМ, никакого увеличения соотношения F500/ F420 не происходило. Более того, сенсор, ассоциированный с плазматической мембраной, становился более восстановленным, из чего можно предполагать либо прекращение Н202-продуцирующей активности на плазматической мембране либо перемещение Н202- продуцирующей системы с ПМ в эндосомы. Полученные данные указывают на то, что эндосомы, содержащие интернализованный рецептор, представляют собой компартмент, ответственный за производство Н202. Добавление ингибитора NADPH-оксидазы, дифенилениодониума (DPI), в концентрации 5мкМ быстро приводило к полному ингибированию продукции Н202. Эти данные указывают на то, что вероятнее всего в эндосомах основным источником АФК являются NADPH-оксидазы. Отсутствие окисления Hyper, ассоциированного с ПМ, показывает что, во-первых, на ПМ не происходило активации NADPH-оксидаз и продукции АФК, во-вторых, диффузия Н202 ограничена несколькими микрометрами. Действительно, в случае свободной диффузии Н202 по всей цитоплазме ПМ-ассоциированный НуРег был бы окислен пероксидом водорода, образованным эндосомами. Важно отметить, что соотношение F500/ F420 часто различается между соседствующими эндосомами (Рис. 12 Б, Г), что говорит в пользу жесткого ограничения диффузии Н202 . Таким образом, мы предполагаем, что анти-оксидантная система клетки деградирует Н202 задолго до того как он сможет достичь отдаленных компартментов клетки.

4.3. Продукция пероксида водорода при активации PDGFR

Известно, что пероксид водорода продуцируется в ответ на активацию разнообразных тирозинкиназных рецепторов (RTK). Однако, различаются ли пространственно-временные паттерны продукции Н202 в клетках линий, экспрессирующих разные типы RTK, пока не известно. Для ответа на этот вопрос мы

провели стимуляцию МН-ЗТЗ фибробластов, экпрессирующих РОСРЯ-НуРег (Рис. 13) тромбоцитарным фактором роста РБОР.

Рисунок 12. Динамика изменения внутриклеточной концентрации Н202 в ответ на стимуляцию ЕвР. А. Серия конфокальных изображений клеток линии НеЬа-КуоШ, экспрессирующих рЕСЕЯ-НуРег. Клетки стимулированы ЕвЕ (50 нг/мл) в начальный момент серии (0 мин), соответствующие временные точки в минутах отмечены на каждом изображении. Верхний ряд серии изображений представляет внутриклеточное распределение отношения Е500/Е420. Нижний ряд серии изображений представляет внутриклеточное распределение флуоресцентного сигнала ЕйЕЯ-НуРег (в канале с возбуждением флуоресценции при 488 нм). Ераницы и ядро одной из клеток обведены. Масштабная линейка: 15 мкм. Шкала цветов отражает отношениеЕ500/Р420 (черный-0; белый-3).

Б. Конфокальное рациометрическое изображение выделенной внутриклеточной области, содержащей интернализованный ЕОЕЯ-НуРег. Интенсивность сигнала вдоль линий показана на графике (Е). Масштабная линейка: 5 мкм. В. Ерафики, отражающие изменение концентрации Н202 на ПМ (красный) и эндосомах (черный) клеток, изображенных на панели (А). Г. Распределение отношения Р500/Р420 сигналов НуРег вдоль верхней (красный) и нижней (черный) линий, отмеченных на изображении (Б). (Изображение репрезентативное по 37 клеткам из трех экспериментов).

Рисунок 13. А. Схема химерного белка РООРГ1-НуРег. Б. Внутриклеточная локализация РБОРК-НуРег в клетках линии №Н-ЗТЗ после 2 часов инкубации в бессывороточной среде. Масштабная линейка - 10 мкм.

В отличие от клеток HeLa, экспрессирующих EGFR-HyPer, мы не обнаружили интенсивной интернализации PDGFR-HyPer в эндосомы. Напротив, наблюдалось активное формирование филоподий и изменение формы клеток в ответ на стимуляцию. Рецептор оставался на ПМ. Пространственно-временная картина производства пероксида водорода также отличалась от таковой в клетках линии HeLa-Kyoto. В клетках, экпрессирующих PDGFR-HyPer, основное формирование Н202 происходило на ПМ (Рис. 14 А), в том числе и на филоподиях (Рис. 14 Б). Уровень Н202 начинал расти в течение 1 минуты после добавления PDGF (Рис 14 Г, Д) и выходил на максимум через 10 минут, далее наблюдался небольшой спад, связанный с частичным восстановлением сенсора в течение 10 минут, после чего следовала вторая волна генерации Н202. Флуоресценция Hyper, ассоциированная с PDGFR-содержащими эндомембранами, оставалась почти без изменений в течение первых 20 минут после стимуляции, а потом начинала расти (Рис 14 Г)). Полученные результаты показывают, что в условиях стимуляции PDGFR плазматические мембраны клеток NIH-3T3 содержат пул активных НАДН-оксидаз. Отсутствие диффузии Н202 от ПМ к эндомембранам, которое также наблюдалось и в клетках линии HeLa, означает быструю деградацию Н202 внутриклеточными антиоксидантными системами. Увеличение Н202 в NIH-3T3 фибробластах оказалось чувствительно к DPI, что говорит в пользу того, что Nox могут служить источником

4.4. Продукция пероксида водорода на поверхности ЭПР

Одной из мишеней Н202 является фосфатаза РТР-IB, которая окисляется при активации рецепторных тирозиновых киназ. Ранее было показано, что мембраны, содержащие активированные рецепторы EGFR и PDGFR контактируют с РТР-1В микродоменами мембран ЭПР, в результате чего происходит дефосфорилирование рецепторов. В то же время, наши результаты показали, что мембраны, содержащие активированные рецепторы, также продолжают активно производить пероксид водорода, вероятно, благодаря активности НАДН-оксидаз, который ингибирует РТР-1В. Другим возможным источником Н202 для окисления РТР-IB может служить пул НАДН-оксидаз, находящихся на эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР). Мы предположили, что данные о динамике [Н202] на мембранах ЭПР позволят выяснить вопрос о том ЭПР-связанные или ЭПР-несвязанные НАДН-оксидазы являются источником окислителя. Для исследования динамики Н202 на ЭПР мы создали гибридный белок, состоящий из сенсора НуРег и «хвостового якоря» (tail anchor, ТА), С-концевого участка (24а.о.) белка РТР-IB, который необходим для заякоревания этого белка на цитоплазматической поверхности мембран ЭПР (Рис. 15).

АФК.

ВЕдиЯ Щ ■ ¥Ш 2.5 *-------\

■о ^ У ¡екая плоскость

"Ч. 1 Я С

НЕи^Ч

эндомембраны ПМ

Время (мин)

Время (мин)

Рисунок 14. Динамика изменения внутриклеточной концентрации Н202 в ответ на стимуляцию РЭОР. А. Серия конфокальных изображений клеток линии 1Ч1Н-ЗТЗ, экспрессирующих рРПЮРК-НуРег. Клетки стимулированы РГХУН (10 нг/мл) в начальный момент серии (0 мин). Масштабная линейка: 15 мкм. Б. Продукция Н202 в филоподиях в клетке линии >ПН-ЗТЗ, экспрессирующей рРООРЯ-НуРег, в ответ на стимуляцию РОйБ (10 нг/мл). Масштабная линейка: 15 мкм. Шкала цветов отражает отношение Р500/Р420 (чёрный-0; белый-2,5). В Иллюстрация событий, показанных на панели Б: в ответ на добавление РОвР клетка начинает менять свою форму, что приводит к смещению клеточного ядра из конфокальной оптической плоскости и появление в ней «дорзальной» ПМ. Видно интенсивное формирование филоподий на ПМ, а также продукцию Н202. Г. Графики, отражающие изменение концентрации Н202 на ПМ (красный) и внутриклеточных мембран (эндомембран), содержащих РООНК-НуРег, (черный) клетки, изображенной на панели А. Д. График продукции Н202 в филоподиях клетки, изображенной на панели Б. (Изображения А и Г репрезентативные по 27 клеткам из трех экспериментов).

В ответ на стимуляцию рецептора ЕСРЯ в клетках линии НеЬа сенсор НуРег-ТА детектировал возрастание Н202 около мембран ЭПР (Рис. 16). Однако временной паттерн флуоресцентного ответа отличался от такового у ЕОРК-НуРсг. После стимуляции первая волна Н202 начиналась с задержкой менее минуты и

продолжалась 10-15 минут, затем следовала вторая волна Н202 намного большей амплитуды (Рис. 16 В). Эта вторая волна окисления НуРег-ТА означает либо производство Н202 непосредственно на ЭПР, либо достижение молекулами окислителя из эндосомного пула мембран ЭПР. Первый пик Н202, несмотря на более низкую амплитуду, детектируется задолго до появления энодосомально-ассоциированного пула Н202. Из этого следует, что ЭПР-ассоциированная продукция Н202 активируется быстрее, чем появляется Н202 из эндосом.

( НуРег )j ТА | Б_ В

1 1,5 2 2,5 3

Время (мин)

Рисунок 15. А. Схема белка НуРег-ТА. Б. Внутриклеточная локализация белка НуРег-ТА в клетках линии НеЬа-КуоШ и (В) в клетках линии №Н-ЗТЗ. Масштабная линейка - 10 мкм. Г. Ответ НуРег-ТА на добавление 200 мкМ Н202.

Добавление фактора PDGF к клеткам линии NIH-3T3, экспрессирующим НуРег-ТА, приводило к заметным изменениям флуоресценции сенсора, отражающим интенсивную продукцию Н202 около ЭПР фибробластов (Рис. 16 Б, Г). Форма и амплитуда изменений Н202 на ЭПР были сильно схожи с таковыми на ПМ в варианте с PDGFR-HyPer.

В отличие от ненаправленных сенсоров, иммобилизованные варианты НуРег позволили значительно повысить пространственное разрешение при наблюдении за Н202. Используя этот подход, мы впервые продемонстрировали микродомены, в которых происходит генерация Н202 при сигнальных каскадах RTK. В ответ на активацию EGFR в клетках линии HeLa значительное количество Н202 было образовано на эндосомах. Следовательно, эндосомы, несущие интернализованные рецепторы EGF, обладают обеими активностями, требующимися для поддержания фосфорилирования мишеней сигнального каскада после активации тирозиновых киназ: RTK фосфорилируют субстраты, в то время как НАДН-оксидазы прямо в этом же месте поставляют АФК, которые ингибируют РТР и другие мишени. Такие эндосомы представляют собой мощный функциональный блок внутриклеточного EGFR и редокс-сигналинга. Быстрый скачок Н202 на ЭПР, возможно, необходим для немедленного ингибирования РТР-IB на этих мембранах. Однако механизм, необходимый для первоначальной активации ЭПР-резидентных Nox ещё предстоит определить.

О 10 20 30

Время (мин)

Рисунок 16. Динамика изменения концентрации Н202 у цитоплазматической поверхности мембраны ЭПР в ответ на стимуляцию клеток факторами роста. А. Серия флуоресцентных микрофотографий клеток НеЬа-КуоШ, экспрессирующих рНуРег-ТА. Клетки стимулированы ЕвР (50 нг/мл) в начальный момент серии (0). Масштабная линейка: 15 мкм. Б. Конфокальные изображения клетки линии 1Ч1Н-ЗТЗ, экспрессирующей рНуРег-ТА, при стимуляции РЭОР (10 нг/мл). Масштабная линейка 10 мкм. В. График изменения концентрации Н202 в клетках на панели А. Г. График изменения концентрации Н202 в клетке на панели Б. Изображение репрезентативно по 11 клеткам НеЬа-КуоШ и 43 клеткам МН-ЗТЗ из трех экспериментов в каждом случае.

Время (мин)

Исходя из отсутствия окисления ПМ-ассоциированного НуРег в клетках линии НеЬа-КуоШ, можно предположить, что производство Н202 и множество его мишеней

25

локализованы внутри клетки. Напротив, данные об активации Nox на ПМ фибробластов говорят в поддержку существования внеклеточных мишеней пероксида водорода, произведенного в ответ на активацию PDGFR. Действительно, поскольку диффузия Н202 в цитоплазме ограничена несколькими микронами, Н202 для паракринной сигнализации должен продуцироваться НАДН-оксидазами, находящимися на ПМ.

Полученные при помощи иммобилизованных вариантов НуРег данные, в совокупности с исследованиями распределения Н202 в тканях, наглядно демонстрируют, как биологические системы контролируют высоко реактивные и легко диффундирующие молекулы, а так же используют их в сигнальных путях.

5. Создание двойного биосенсора для одновременной детекции фосфатидилинозитол-(3,4,5)-трифосфата (PIP3) и пероксида водорода

5.1. Двойной биосенсор

На сегодняшний день создано множество флуоресцентных белков, сенсоров на их основе и синтетических красителей различных цветов, позволяющих регистрировать многие процессы в живой клетке. Комбинация флуорофоров, имеющих различные спектры, в одной клетке позволяет осуществить многопараметрическое исследование, т.е. визуализацию несколько клеточных процессов одновременно. Основные способы регистрации сигналов для таких флуоресцентных сенсоров могут быть следующими - 1) изменение яркости, 2) изменение отношения между пиками возбуждения или эмиссии флуоресценции (рациометрический сигнал) и 3) транслокация сенсора из одного компартмента клетки в другой. В настоящий момент созданы первые многопараметрические флуоресцентные индикаторы, но до сих пор нет индикатора, комбинирующего свойства рациометрического сенсора и транслокацию. Мы поставили перед собой задачу создать индикатор, одновременно детектирующий продукцию Н202 и активность PI-3-киназы (PI3K).

Внутриклеточная передача сигнала с участием фосфорилированных форм фосфатидилинозитола (PI), фосфоинозитидов (PIP), происходит в ответ на активацию рецепторов на плазматической мембране, таких как тирозинкиназные рецепторы, рецепторы, сопряженные с G-белком, и интегрины. Различные формы PIP находятся во всех внутриклеточных мембранах и участвуют в регуляции многих сигнальных процессов, как правило, через привлечение на мембраны Р1Р-взаимодействующих белковых доменов. Эти домены отличаются друг от друга по специфичности к разным формам PIP. PI и PIP могут быть фосфорилированы фосфатидилинозитолкиназами и дефосфорилированы липидными фосфатазами. Одним из наиболее изученных липидных вторичных мессенджеров является фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат (Р1Рз). Фосфатидилинозитол-З-киназа (PI3K) фосфорилирует фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат с образованием Р1Р3, который в дальнейшем может быть дефосфорилирован липидной фосфатазой PTEN.

Образование в мембране липидных мессенджеров может быть обнаружено с помощью химерных флуоресцентных белков, слитых с Р1Р-чувствительными белковыми доменами. Такие флуоресцентные белки-слияния транслоцируются из цитоплазмы к мембране в ответ на появление PIP. По изменению таких параметров, как распределение интенсивности флуоресценции между цитоплазмой и мембраной

можно оценивать пространственно-временной характер действия липидных киназ и фосфатаз.

Генерация пероксида водорода NADPH-оксидазами и сигнализация с участием липидов являются кооперативными процессами. Сборка компонентов комплекса NADPH-оксидазы на мембране и ее активация зависят от появления продуктов активности PI3K. Н202, продуцируемый NADPH-оксидазами, окисляет тиолат в активном центре фосфатазы PTEN, что тем самым увеличивает время жизни продуктов PI3K.

Так как липидная и окислительно-восстановительная сигнализация взаимосвязаны, то стратегия одновременного наблюдения за появлением Р1Р3 и продукцией Н202 является высоко востребованной.

Для создания двойного биосенсора для детекции PIP3 и Н202, мы сшили НуРег с РН- доменом тирозин киназы Брютона (Bruton's tyrosine kinase (ВТК)), содержащим мутацию Е41К для увеличения сродства домена к PIP3. Полученный сенсор, названный PIP-SHOW (PIP3 and -SH Oxidation Watching) (Рис. 17 A), флуоресцировал в ожидаемом диапазоне длин волн (500-550 нм) при экспрессии в фибробластах NIH-3T3. Мы проверили сохраняет ли PIP-SHOW способность обоих доменов, ВТК-РН-Е41К и НуРег, отвечать на соответствующие стимулы, PIP3 и Н202. Добавление Н202 приводило к такому же, как и у НуРег, изменению соотношения пиков возбуждения флуоресценции сенсора PIP-SHOW (Рис.17 В). Частичное перераспределение биосенсора на ПМ наблюдалось при инкубации клеток с 10 мкМ раствором мембрано-проницаемой фотоактивируемой версии PIP3 (cgPIP3/AM) и последующим кратким освещением светом 405нм, а также при стимуляции клеток ростовыми факторами (Рис.17 Б).

Таким образом, оба домена, транслокационный РН-домен и НуРег, сработали корректно. В ходе экспериментов по проверке сенсора было установлено, что PIP-SHOW способен одновременно детектировать Р1РЗ и Н202 в клетках NIH-3T3, стимулированных тромбоцитарным ростовым фактором.

А_

|втк-РН-Е41к}С НуРег

Б -PDGF +PDGF

Время (мин)

Рисунок 17. Индикатор PIP-SHOW. А. Схема сенсора. Б. Конфокальная микрофотографии клетки линии NIH-3T3, экспрессирующей PIP-SHOW, до стимуляции и через 3 мин после стимуляции PDGF. Отмечены области интереса (ОИ): на плазматической мембране (1) и в цитоплазме (2). По изменению интенсивности флуоресценции в ОИ1 и ОИ2 рассчитывали степень транслокации индикатора по формуле T=(Fmem - Fcyt0)/Fcyt0, где Fmem= ОИ2, Fcyt0= ОИ 1. В. Ответ PIP-SHOW на добавление к клеткам Н202 (200 мкМ).

5.2. Активация PI-3K и продукция Н202 в Тн-лимфоцитах при формировании иммунологического синапса

На следующем этапе мы использовали PIP-SHOW для изучения динамики липидной и редокс-зависимой сигнальных систем, происходящей на начальных фазах активации клеток CD4+ Т-хелперов (Th) человека. Временная экспрессия биосенсора PIP-SHOW в первичных Th-лимфоцитах приводила к его локализации как в цитоплазме, так и в ядре. Однако, некоторая доля сенсоров была локализована на мембранах, что указывает на пред-существующую PI3K активность (Рис. 18).

Ex.505nm

FS05/F420

клетка

Ex.420nm

клетка

Время (мин)

Время (мин)

Рисунок 18. Динамика изменения концентрации Н202 и PIP3 у цитоплазматической поверхности плазматической мембраны Тн-лимфоцитов при формировании иммунологического синапса (НС). А. Серия флуоресцентных микрофотографий Тн-лимфоцита, формирующего ИС с микросферой, покрытой анти- CD3/aHTH-CD28, (микросферы добавлены в начальный момент времени). Верхний ряд изображений - клетка и две микросферы в канале проходящего света (микросферы черные), следующие два ряда демонстрируют распределение флуоресценции в двух каналах с возбуждением при 420 нм и 505 нм, нижний ряд - отношение F505/F420, что отражает распределение Н202 в клетке. Масштабная линейка: 10 мкм. Б. График, отражающий активацию PI-3K и распределение Н202 в Тн-лимфоците. Черным цветом показано изменение распределения Р1Р3, красным цветом - изменение концентрации Н202 в клетке. В. Среднее значение активности PI-3K и продукции Н202 по 28 Тн-клеткам из трех экспериментов (показана стандартная ошибка среднего).

Стимуляция Th-лимфоцитов, экспрессирущих PIP-SHOW, при помощи микросфер, покрытых анти-С03/С028-антителами, приводила к установлению стабильных контактов, иммунологических синапсов (ИС), между лимфоцитами и микросферами (Рис. 18 А). Далее происходило немедленное массовое перераспределение PIP-SHOW в ИС, свидетельствующее о локальном повышении уровня PIP3 (Рис. 18 Б, В). Биосенсор оставался в регионе иммунологического контакта на протяжении всего эксперимента (до 1 часа).

Стоит отметить, что в активированных клетках наблюдалось снижение активности PI3K в остальной части ПМ, кольцевой паттерн флуоресценции исчезал, как только образовывался ИС (Рис. 18 А). Кроме того, формирование ИС приводило к быстрому подъему уровня Н2О2, примерно через минуту после транслокации PIP3-сенсора (Fig. 3). Интересно, в большинстве клеток продукция Н202 была максимальной в области, соседствующей с центральным синапсом (Рис. 18 А), что подразумевает подковообразную локализацию ферментов NOX/DUOX вокруг центрального ИС. DPI быстро снижал продукцию Н202, из чего можно предположить, что ПМ-локализованные белки NOX/DUOX являются источниками Н202.

В Th-лимфоцитах человека, как и в клетках NIH-3T3, не было обнаружено уменьшения PIP3 в ответ на добавление DPI, что говорит об отсутствии быстрой положительной обратной связи между PI3K и NOX/DUOX. Как и ожидалось, ингибирование PI3K вортманнином приводило к быстрому снижению обоих параметров, активности PI3K и продукции Н202.

Мы продемонстрировали, что новый двух-параметрический биосенсор PIP-SHOW хорошо подходит для слежения за уровнями PIP3 и Н202 одновременно, и таким образом может служить прототипом для сенсоров с комбинированными показаниями. Концепция сшивания транслокационного домена с рациометрическим сенсором потенциально широко применима и в других комбинациях, в том числе в таких, которые позволят исследовать динамику внутриклеточного сигналинга. Мы полагаем, что различные сенсорные домены, работающие по принципу транслокации, могут быть использованы в паре с любыми рациометрическими индикаторами вне зависимости от того, являются ли последние одиночными флуорофорами или FRET-парами. Рациометрические сенсоры могут служить в качестве флуоресцентной метки вместо обычных флуоресцентных белков и к тому же предоставлять дополнительную информацию о параметрах, таких как концентрация вторичного мессенджера в экспериментах с покадровой съемкой. Очевидные другие преимущества состоят в том, что задействована только малая часть используемого спектра и, следовательно, могут быть использованы другие цвета в дополнительных сенсорах для осуществления многопараметрических наблюдений. Наконец, важным преимуществом является то, что для двух-параметрического считывания информации нужно проэкспрессировать только одну плазмидную конструкцию.

6. Исследование динамики и функции Н202 при фагоцитозе

Фагоцитоз специализированными клетками-фагоцитами является одним из основных механизмов элиминации клеток патогенов в организме. Функции фагоцитов осуществляют в основном нейтрофилы и макрофаги, захватывающие патоген в специализированную органеллу - фагосому, где происходит деградация чужеродной клетки.

Одним из основных механизмов инактивации патогена внутри фагосомы считалось его окисление активными формами кислорода- супероксид-анион-радикалом и пероксидом водорода, продуцируемыми ЫАОРН-оксидазой плазматической мембраны. В пользу этой точки зрения свидетельствовал молекулярный механизм хронического грануломатоза, наследственного заболевания, при котором организм человека не способен эффективно бороться с заболеваниями, вызываемыми одноклеточными микроорганизмами. Причиной хронического грануломатоза является мутация в какой-либо из субъединиц НАБРН-оксидазы, приводящая к неспособности фермента переносить восстановительные эквиваленты с МАОРН на кислород.

В то же время, гомологи фагоцитарной ЫАОРН-оксидазы были обнаружены практически во всех типах клеток, где активация этих ферментов необходима для прохождения сигнала на начальных внутриклеточных стадиях каскадов, активируемых рецепторными тирозинкиназами. Пероксид водорода ингибирует тирозинфосфатазы и, таким образом, динамическое равновесие реакций фосфорилирования - дефосфорилирования смещается в сторону фосфорилирования, что в конечном счете приводит к активации МАР-киназ.

Так как механизм активации ЫАОРН-оксидазы в фагоцитах в целом сходен с таковым в нефагоцитарных клетках, можно предположить активацию МАР-киназ и при фагоцитозе, несмотря на то, что рецепторы, активируемые при связывании патогена, не обладают собственной тирозинкиназной активностью. Однако фагоцитирующие клетки и продукция ими активных форм кислорода исследовались ранее, в основном, в контексте их функции. Незначительное количество разрозненных данных свидетельствует в пользу активации МАР-киназ при фагоцитозе, но взаимосвязь между разными МАР-киназными каскадами и их зависимость от активности КАОРН-оксидаз остаются неисследованными.

В данной части работы мы исследовали продукцию Н2О2 в макрофагах в режиме реального времени и связь этой продукции с активацией МАР-киназных каскадов р38 и Егк1/2.

6.1. Изучение динамики продукции пероксида водорода при фагоцитозе

Из результатов проведенных другими группами исследователей продукции Н2Ог макрофагами ЛА\У264.7 в процессе фагоцитоза опсонизированного полисахарида клеточной стенки дрожжей зимозана (Орг) следует, что концентрация Н202 начинает расти через несколько минут после добавления к клеткам Орг, достигает максимума через приблизительно 40 минут и постепенно снижается. Снижения концентрации до исходной не наблюдается в течение нескольких часов. Подобные исследования ранее проводились только для популяций макрофагов ЯА\\'264.7 и некоторых других фагоцитов. Используя высокоселективный к Н202 флуоресцентный краситель Ашр1ех икгаЯес!, мы также получили схожую кривую, отражающую продукцию Н202 популяцией фагоцитирующих КА\¥264.7 (Рис. 19). Таким образом, наша экспериментальная система представляет собой «классическую» модель для исследования динамики окислительного взрыва при фагоцитозе.

Время (мин.)

Рисунок 19. Зависимость продукции Н202 популяцией макрофагов ЯА\У264.7

фагоцитирующих Орг, от времени. Зимозан добавлен в начальный момент времени в культуральную чашку с 1 х 10б клеток ЯАДУ264.7. Показаны среднее значение и стандартное отклонение.

Для визуализации окислительного взрыва в индивидуальных макрофагах мы использовали клетки RAW264.7, временно экспрессирующие НуРег. Для получения серий изображений отдельных фагоцитирующих макрофагов применяли конфокальную флуоресцентную микроскопию. На примере отдельных клеток RAW264.7 было установлено, что концентрация Н202 внутри клетки начинала расти немедленно после захвата гранулы Opz, достигала максимума через 2 минуты, и возвращалась на исходный уровень через 10-15 минут (Рис. 20). При частоте съёмки 1 раз в 10 секунд с выдержками порядка 100-200 мсек сигнал НуРег был делокализован в цитоплазме, специфической локализации окисленного HyPer-Cyto вокруг фагосом не наблюдалось, что свидетельствует, по всей видимости, о "размывании" сигнала за счет внутриклеточной диффузии сенсора.

В некоторых клетках происходило более одного кратковременного повышения уровня продукции внутриклеточного Н202, причём «всплески» продукции Н202 следовали немедленно за захватом одной или нескольких гранул (Рис.20 В, Г).

Полученные нами графики продукции Н202 в индивидуальных фагоцитрующих макрофагах радикально отличаются от аналогичных графиков для популяций клеток.

При постановке эксперимента, когда в культуральную чашку с фагоцитами добавляют гранулы Opz, захват отдельными клетками гранул происходит в разное время. Кроме того, в некоторых клетках происходит несколько повышений концентрации Н202, что на графике содержания АФК в среде с фагоцитирующими клетками отражается замедлением падения концентрации АФК. Таким образом, разницу между результатами, полученными с помощью НуРег, и графиками продукции АФК популяцией макрофагов RAW264.7 можно объяснить асинхронностью и гетерогенностью профилей продукции Н202 индивидуальных фагоцитов.

Рисунок 20. Окислительный взрыв в индивидуальных макрофагах НА\¥264.7, фагоцитирующих гранулы опсонизированного зимозана (Орг). А, В. Серии конфокальных рациометрических изображений фагоцитирующих гранулы Орг макрофагов, экспрессирующих НуРег-СуШ; серия В- конфокальные рациометрические изображения макрофага ЯА\\'264.7, в цитоплазме которого происходит два кратковременных всплеска продукции Н202. Масштабная линейка 20 мкм. Б, Г. Графики, отражающие изменение содержания Н202 в цитоплазме макрофагов, изображенных на панелях А и В, соответственно. Моменты захвата гранул Орг в фагосомы на панели В отмечены звездочками, а на панели Г отмечены стрелками.

6.2. Исследование активации МАР-киназ при фагоцитозе

Как правило, для получения информации об активации МАР-киназных каскадов используют электрофорез образцов в денатурирующих условиях с последующей детекцией фосфорилированных форм МАР-киназ с помощью специфичных антител. Однако, в случае исследования активации МАР-киназ в модели фагоцитоза, данный метод несет в себе возможность ошибочной интерпретации полученных результатов. Так например, при проведении ингибиторного анализа фосфорилирования МАР-киназ ингибирующий эффект какого-либо химического соединения может свидетельствовать как об ингибировании вышестоящей ступени сигнального каскада, так и о влиянии этого вещества на эффективность фагоцитоза. Для получения наиболее достоверной картины, мы использовали комбинацию двух независимых методов - вестерн-блотгинга и иммуноцитохимического окрашивания клеток антителами к фосфорилированным формам МАР-киназ р38 и Егк1/2.

Активация р38 и Егк1/2 при фагоцитозе. Мы обнаружили, что добавление к макрофагам опсонизированных гранул полисахарида клеточной стенки дрожжей зимозана приводит к быстрой активации обоих исследуемых нами сигнальных

каскадов (Рис. 21). Для того чтобы проверить, является ли активация следствием фагоцитоза зимозана или происходит под влиянием низкомолекулярных примесей в суспензии зимозана, мы фиксировали клетки RAW 264.7 через 10 мин после добавления зимозана с последующей иммуноцитохимической детекцией фосфорилированных форм р38 и Erkl/2 (Р-р38 и P-Erkl/2). Такая постановка эксперимента позволяет получить изображения фагоцитировавших и нефагоцитировавших клеток в одном поле зрения. Результаты, приведенные на Рис. 22, позволяют утверждать, что активация и р38, и Erkl/2 происходит в результате фагоцитоза. Видно, что в фагоцитировавших клетках обе киназы находятся в фосфорилированной форме, тогда как клетки, не содержащие зимозана, демонстрируют лишь фоновое окрашивание.

(а)

Контроль Аро Wort SB PD NAC '_ +"_ + "_ +'

--- _ »-Ш. — — » —P38

а-тубулин

(б)

Контроль Аро Wort SB PD NAC +"7 +"- +"- +"7 +"7 +'

_________ P-Erkl/2

— ¿^¿^¿¿¿¿^ ¿SS Erkl/2 w eш _ ^m а-тубулин

Рисунок 21. Вестерн-блоттинг лизатов клеток RAW264.7, проинкубированных в присутствии 0,5шМ специфического ингибитора NADPH оксидазы апоцинина (Аро), 10 пМ ингибитора Р13-киназы вортманнина (Wort), 10 мкМ ингибитора р38 SB 203580 (SB), 20 мкМ ингибитора МАРКК Erkl/2 киназы МЕК-1 PD 98059 (PD), и 1 шМ антиоксиданта N-ацетилцистеина (NAC) либо в отсутствие ингибиторов (контроль). Клетки были стимулированы добавлением опсонизированного зимозана (+), либо, в качестве контроля, PBS (-). Клетки лизировали спустя 10 минут после стимуляции, (а) Вестерн-блоттинг с антителами к фосфорилированной форме р38 (Р-р38), суммарному пулу р38 (р38) и к а-тубулину. (б) Вестерн-блоттинг с антителами к фосфорилированной форме Erkl/2 (Р- Erkl/2), суммарному пулу Erkl/2 (Erkl/2) и к а-тубулину.

Следует отметить, что в нестимулированных клетках небольшая фоновая активация р38 и Erkl/2 выявляется как при иммуноцитохимической детекции, так и с помощью вестерн-блоттинга разделенных образцов. В литературе присутствуют разнородные и противоречивые данные о необходимости активности этих киназ для осуществления фагоцитоза. Инкубация клеток с ингибитором киназы р38, SB 203580, приводит к некоторому снижению интенсивности фагоцитоза. При этом, по данным

как вестерн-блоттинга (Рис 21), так и иммуноцитохимического окрашивания (Рис. 22), и в фагоцитировавших и в контрольных (нестимулированных) клетках значительно падает степень фосфорилирования самой р38, что доказывает наличие положительной обратной связи в активации этого каскада. Степень фосфорилирования Erkl/2, напротив, возрастает при ингибировании р38 как в фагоцитировавших, так и в контрольных клетках (Рис.21), что свидетельствует об ингибировании Erkl/2-каскада киназой р38.

В свою очередь, инкубация клеток в присутствии PD 98059, ингибитора киназы МЕК-1, фосфорилирующей киназы Erkl/2, приводит к значительному снижению числа фагоцитировавших клеток и снижению степени фосфорилирования киназ Erkl/2 по данным как вестерн-блоттинга (Рис. 21), так и иммуноцитохимического окрашивания (Рис. 22). При этом, по данным вестерн-блоттинга, в контрольных (нестимулированных) клетках наблюдается значительная активация р38 (Рис. 21), что указывает на ингибирование каскада р38 каскадом Erkl/2.

Приведенные данные позволяют утверждать, что каскады Erkl/2 и р38 активируются при комплемент-опосредованном фагоцитозе. Начальная фоновая активность как р38, так и Erkl/2, необходима для эффективного осуществления фагоцитоза. Оба каскада взаимно ингибируют друг друга, что является, по-видимому, защитой от избыточной активации одного из них.

Зависимость фосфорилирования р38 и Erkl/2 от активности NADPH-оксидазы. Как было упомянуто выше, NADPH-оксидазы присутствуют практически во всех типах клеток, где выполняют сигнальную функцию, инактивируя тирозинфосфатазы. Мы предположили, что в фагоцитирующих клетках активность NADPH-оксидазы также необходима для успешной активации МАР-киназ. Для проверки данного предположения, мы инкубировали клетки RAW 264.7 в присутствии апоцинина, специфичного ингибитора NADPH-оксидаз. Добавление апоцинина в конечной концентрации 1.5 мМ полностью блокировало фагоцитоз. Использование меньшей концентрации (0.5 мМ) позволило частично восстановить способность клеток к фагоцитозу (Таблица 1). Данные иммуноцитохимического окрашивания (Рис. 22) позволяют утверждать, что ингибирование NADPH-оксидазы приводит к ингибированию фосфорилирования Erkl/2. Таким образом, для прохождения Erkl/2 каскада требуется активация фагоцитарной NADPH оксидазы, что свидетельствует в пользу сигнальной функции пероксида водорода в фагоцитах. Кроме того, некоторый фоновый уровень активности NADPH-оксидазы абсолютно необходим для эффективного осуществления фагоцитоза.

Каскад р38, напротив, активируется при ингибировании NADPH-оксидазы в нестимулированных клетках, что, по-видимому, является следствием ингибирования Erkl/2-каскада (Рис. 21).

Таким образом, из двух исследуемых каскадов, р38 и Erkl/2, лишь последний активируется по механизму, предусматривающему генерацию активных форм кислорода NADPH-оксидазой.

и

(в)

. tl"

(г)

(д) •*— - #

(е) •и ш* - «А V Ж» S* ^ * » 1 * * л

Рисунок 22.

Иммуноцитохимическое окрашивание клеток КАУ/264Л, стимулированных опсонизированным зимозаном в отсутствие ингибиторов (а, г) и в присутствии Р098059 (б), 8В203580 (д), апоцинина (в, е). Клетки окрашены с

использованием антител к фосфорилированной форме Егк1/2 (а-в) или к фосфорилированной форме р38 (г-е). Стрелка указывает на фагоцитированные гранулы зимозана.

Зависимость фосфорилирования р38 и Erkl/2 от активности фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) и антиоксидантов. Мы предположили, что эффекты апоцинина на фагоцитоз и степень активации МАР-киназных каскадов должны воспроизводиться при ингибировании PI3K вортманнином, поскольку известно, что активация PDK необходима для сборки активного комплекса фагоцитарной NADPH-оксидазы. Действительно, инкубация с вортманнином как контрольных (нестимулированных) клеток, так и обработка клеток с последующей стимуляцией зимозаном, практически полностью воспроизводила все эффекты апоцинина: блокирование фагоцитоза, ингибирование Erkl/2, активация р38 в нестимулированных клетках (Рис. 21, таблица 1).

Поскольку роль NADPH-оксидазы в активации Erkl/2 опосредована продукцией супероксид-анион-радикала, эффекты ингибиторов NADPH-оксидазы должны быть сходны с эффектами антиоксидантов. Действительно, при инкубации клеток RAW 264.7 в присутствии TV-ацетилцистеина наблюдалось практически полное ингибирование фагоцитоза (Таблица 1), снижение уровня фосфорилирования Erkl/2 (Рис. 21), рост уровня фосфорилирования р38 в контрольных (нестимулированных) клетках (Рис. 21). Полученные данные позволяют предполагать, что роль NADPH-оксидазы в активации Erkl/2 действительно связана с продукцией этим ферментом активных форм кислорода.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что МАР-киназы р38 и Erkl/2 принимают активное участие в процессе фагоцитоза, включая инициацию захвата патогена клеткой. Оба каскада осуществляют негативную регуляцию друг

друга и активируются при фагоцитозе. При этом активация Егк1/2-каскада опосредована активными формами кислорода, образующимися в процессе фагоцитоза в результате работы ЫАОРН-оксидазы плазматической мембраны. Активация р38 не требует участия ЫАБРН-оксидазы.

Таблица 1. Влияние ингибиторов на эффективность фагоцитоза зимозана клетками ЯА\У264.7.

Реагент Ингибируемый фермент или эффект Кол-во фагоцитировавших клеток, %

нет 45 ± 10

Апоцинин, 1,5 мМ ЫАЭРН оксидаза 0

Апоцинин, 0,5 мМ 13 ± 9

вВ 203580,10 мкМ р38 23 ± 11

РБ 98059, 20 мкМ МЕК-1, фосфорилирующая киназа для Егк1/2 20± 11

Ы-ацетилцистеин, 10 мМ антиоксидант 0

Ы-ацетилцистеин, 1 мМ 6 ± 3

Вортманнин, 10 нМ Р13 киназа 0

6.3. Пероксид водорода подавляет фагоцитоз

Кратковременный контролируемый характер продукции Н2О2 макрофагами в совокупности с редокс-зависимой активацией Егк позволяет предполагать, что пероксид водорода задействован в перепрограммировании клетки после события фагоцитоза. Основная функция макрофагов заключается в презентировании антигенов фагоцитированного патогена. Мы обратили внимание, что большинство макрофагов фагоцитируют единожды, после чего их подвижность уменьшается, и способность к фагоцитозу теряется. Мы предположили, что Н2О2 индуцирует выключение программы фагоцитоза в макрофагах. Для проверки этой гипотезы макрофаги ЯА\¥264,7 были проинкубированы в среде, содержащей 100 нМ Н202 перед индукцией фагоцитоза. Инкубация макрофагов с Н202 вызвала не только уменьшение количества фагоцитирующих клеток (фагоцитарного индекса) в 2 раза, но и уменьшение среднего количества захваченных гранул на клетку (фагоцитарного числа) в 6 раз (Рис. 23). Таким образом, было установлено, что добавление к клеткам субмикромолярных количеств Н202 приводит к существенному снижению эффективности фагоцитоза.

А

Б

Рисунок 23. Влияние Н202 на эффективность фагоцитоза макрофагами 11А\¥264.7 опсонизированного зимозана. А. Влияние преинкубации с 100 нм Н202 на среднее количество гранул, интернализованных одним макрофагом, (п>30, показано стандартное отклонение). Б. Влияние преинкубации с 100 нм Н202 на общее число фагоцитировавших макрофагов (п>30 показано стандартное отклонение).

Как было показано выше, во время фагоцитоза в макрофаге происходит всплеск продукции Н202, возможно распространяющийся из цитоплазмы в ядро. Известно, что Н202 и некоторые продукты реакций пероксида водорода способны привести к повреждению биомолекул, в т.ч. и ДНК. Можно предположить, что механизм, ограничивающий количество и интенсивность окислительных взрывов в фагоцитирующей клетке, направлен в первую очередь на защиту фагоцита от разрушения собственными АФК. В отличие от короткоживущих нейтрофилов, основной задачей которых является фагоцитоз, после чего они уходят в апоптоз, активированные фагоцитозом патогенных клеток макрофаги живут длительное время, осуществляют презентацию антигенов лимфоцитам и вырабатывают большое количество цитокинов. Таким образом, в макрофагах должны функционировать какие-то дополнительные механизмы защиты от апоптоза, связанного с фагоцитозом. Приведенные данные позволяют предположить участие Н202 в сигнальных процессах, задействованных в такой защите.

7. Создание красного флуоресцентного белка НуРег-НЕГ)

7.1. Дизайн НуРег-ЯЕО.

Красные СРР-подобные белки наиболее удобны для микроскопии в толстых слоях тканей, т.к. основные поглощающие свет в биологических объектах вещества -вода, меланин, гемоглобин, - имеют минимальный коэффициент поглощения в диапазоне длин волн 600-1100 нм, а свет с большей длинной волны лучше проходит сквозь плотные слои клеток, а значит - лучше подходит для возбуждения флуоресценции в тканях. Это делает их предпочтительными флуоресцентными доменами для биосенсоров.

С целью создания красного флуоресцентного биосенсора на пероксид водорода мы произвели замену желтого флуоресцентного белка срУБР в конструкции НуРег на

37

cpRED, циркулярно-пермутрированный вариант красного флуоресцентного белка mApple, который ранее был использован во флуоресцентном биосенсоре на кальций R-GEC01. В результате случайного мутагенеза с использованием вырожденных праймеров было получено несколько экспрессионных библиотек, кодирующих сенсоры с различной длиной аминокислотных линкерных участков соединяющих N-и С-концы cpRED с Н202-чувствительным доменом OxyR-RD. Чтобы получить варианты сенсоров с наилучшими характеристиками сворачивания и созревания хромофора cpRed, во всех библиотеках последовательности линкерных участков были подвергнуты случайному мутагенезу. В результате анализа клонов нами был обнаружен вариант, созревающий при 37°С, демонстрирующий 80% возрастание флуоресценции в ответ на добавление Н202, который был назван HyPer-RED . Этот белок содержал следующие последовательности линкеров: линкер 1 - Pro-Arg-Thr; линкер 2 - Ala-Gly-Val.

7.2. Характеризация индикатора HyPer-RED

Для определения спектральных свойств и чувствительности HyPer-RED мы выделили белок при помощи металл-аффинной хроматографии. На рисунке 24 показан спектр флуоресценции очищенного HyPer-RED . Биосенсор обладает пиком возбуждения 575 нм и пиком эмиссии 605 нм. Титрование возрастающими концентрациями пероксида водорода в диапазоне 10-300 нМ показало, что минимальная концентрация Н202, вызывающая ответную реакцию сенсора, составляет 20 нМ, а насыщение происходит при ЗООнМ. Полученные результаты показали, что HyPer-RED обладает такой же чувствительностью, что и НуРег на базе YFP. Cysl99 является ключевым а.о., реагирующим с Н202, и формирующим дисульфидную связь с Cys208, как в wtOxyR, так и в НуРег. Для проверки участия этого же а.о. в процессе взаимодействия HyPerRed с Н202 мы заменили Cysl99 (нумерация согласно wtOxyR номенклатуре) на Ser. HyPer-RED -C199S, несмотря на такие же спектральные свойства как и у HyPer-RED, не был чувствителен к Н202. Таким образом, изменения флуоресценции HyPer-RED в ответ на окисление пероксидом водорода происходят в результате такой же окислительно-восстановительной реакции как в OxyR или НуРег.

Флуоресценция большинство флуоресцентных белков зависит от pH. Мы провели измерения pH-зависимости пробы HyPer-RED. Кривая титрования pH окисленной формы HyPer-RED была такой же, как и у R-GECO в Са-связанном состоянии, а рКа составляла 8.5. Нам не удалось определить рКа для восстановленной формы HyPer-RED в связи с тем, что очистка и хранение белка в аэрированных растворах приводили к частичному или даже полоному окислению биосенсора.

Для оценки яркости биосенсора мы измерили его коэффициент экстинкции и квантового выхода. Квантовый выход очищенного HyPer-RED составлял 0,29. Коэффициент экстинкции и яркость при 577 нм составляли 31000/9000 М^см"1, что в 5 раз больше (по яркости), чем у НуРег.

Далее мы изучили чувствительность HyPer-RED к экзогенному Н202 при экспрессии в цитоплазме бактерий E.coli. Мы суспендировали бактериальные клетки в PBS и измеряли спектр их флуоресценции до и после добавления Н202 в концентрациях 30-300 мкМ. Минимальный ответ пробы был детектирован при добавлении 10 мкМ Н202, что близко к концентрации пероксида водорода,

38

необходимой для активации НуРег и wtOxyR in vivo. 300 мкМ Н202 приводил к насыщению биосенсора Стоит отметить, что окисление HyPer-RED обратимо: после полного окисления сенсор восстанавливается в течение 8-10 минут и становится доступным для нового цикла окисления.

7.3. HyPer-RED в клетках млекопитающих.

С помощью методов флуоресцентной микроскопии мы изучили воздействие Н202 на сенсор HyPer-RED, экспрессированный в цитоплазме культуры клеток HeLa Kyoto. Для определения чувствительности биосенсора, в процессе микроскопии мы добавляли возрастающие концентрации пероксида водорода во внеклеточную среду. Добавление 6 мкМ пероксида водорода вызывали первые детектируемые изменения в интенсивности флуоресценции биосенсора. Полученные данные схожи с результатами аналогичных экспериментов с этой пробой в цитоплазме клеток Е. coli, а так же с зелёной версией биосенсора НуРег. Добавление 200 мкМ Н202 приводило к максимуму ответа (Рис. 24 Б). Таким образом, биосенсор HyPer-RED может быть использован для детектирования Н202 в эукариотических клетках.

550 600 650

Длина волны (нм)

100 150 200 250 300 Время (мин)

Рисунок 24. Красный флуоресцентный сенсор HyPer-RED. А. Спектр флуоресценции HyPer-RED. Максимум возбуждения 575 нм, максимум эмиссии 605 нм. Б. Динамика ответа сенсора в клетках HeLa на добавление 200 мкМ Н202.

Далее мы определили кинетические параметры НуРег-11ЕО в цитоплазме эукариотических клеток. Параметры окисления НуРег-ЯЕО были такими же, как и у НуРег и \vtOxyR. Концентрация Н202, при которой скорость взаимодействия с сенсором составляла половину от максимальной (Кох), составляла 140 нМ (принимая во внимание 500-кратный градиент [Н202] через плазматическую мембрану). Константа реакции псевдо-первого порядка (Кб) составила 3-105 М"'-сек"'. Полупериод восстановления для НуРег-ЯЕЭ был выше по сравнению с НуРег и близок к восстановлению сенсора НуРег2. Вариант НуРег-ЯЕО-С1998 не реагировал на Н202 в клетках млекопитающих.

8. RexYFP: генетически кодируемый сенсор для детекции соотношения НАД+/НАДН.

На протяжении долгого времени считалось, что главная функция НАД+ и НАДН заключается в их участии в процессах энергетического обмена в клетках. Но за последние несколько лет представление о функциях этих молекул расширилось. НАД+ и НАДН участвуют в регуляции многих важнейших процессах клетки, таких как регуляция внутриклеточного Са2+, регуляция экспрессии генов. Известно их участие в процессах старения и клеточной гибели. Важнейшим клеточным параметром является соотношение НАД+ к НАДН. НАД+/НАДН индекс отражает окислительно-восстановительный и общий метаболический статус клетки. В цитоплазме значение этого параметра строго регулируется и может изменяться от 700 до 1, в то время как в митохондриях диапазон изменений составляет от 7-8 до 1.

На сегодняшний день прямых методов регистрации изменений НАД+/НАДН соотношения в клетках в режиме реального времени не существует. Широко распространенные УФ- и двух-фотонная микроскопия позволяют визуализировать лишь флуоресцирующий НАДН, но не дают информации о динамике изменений НАД+, а, следовательно, и НАДТНАДН соотношения. Вместе с НАДН детектируются и окисленные флавины, флуоресцирующие в той же области спектра. Кроме того, микроскопия обеих упомянутых разновидностей оказывает на клетки значительное повреждающее воздействие.

Мы разработали новый метод, позволяющий регистрировать динамику изменения соотношения НАД+/НАДН в клетках. На основе белка T-Rex (из Thermus aquaticus), который является природным сенсором НАД+/НАДН, и желтого флуоресцентного белка cpYFP мы создали генетически кодируемый флуоресцентный сенсор для детекции НАД+/НАДН.

8.1. Конструкция и спектральные характеристики RexYFP

Для создания флуоресцентного индикатора для соотношения НАД+/НАДН мы выбрали белок T-Rex из Thermus aquaticus в качестве сенсорного домена на соотношение НАД+/НАДН. T-Rex пребывает в двух конформационных состояниях, зависящих от уровня НАДН в системе. Мы интегрировали cpYFP в последовательность T-Rex, предполагая, что конформационные изменения T-Rex вызовут изменения спектральных характеристик флуоресцентного белка в составе конструкции T-Rex-cpYFP, что позволит осуществлять мониторинг динамики НАД+/НАДН соотношения. Мы создали несколько подобных конструкций, где флуоресцентный белок был вставлен по разным позициям белка T-Rex. Отбор лучшего клона (cpYFP в котором был интегрирован между остатками 79-80) и его последующий случайный мутагенез привели к появлению сенсора, названного RexYFP (Рис. 25А). Спектр флуоресценции RexYFP обладает двумя пиками возбуждения (пик на 490 нм и слабовыраженный на 420 нм) и одним пиком эмиссии на 516 нм (Рис. 25 Б).

8.2. Определение чувствительности RexYFP к изменениям НАД+/НАДН соотношения

Из-за высокого сродства к НАДН выделенный белок T-Rex находится частично в связанном состоянии. Перед экспериментом мы освободили очищенный белок от связанного НАДН с помощью осаждения сульфатом аммония в кислых условиях. Добавление даже небольшого количества НАДН (25 нМ) в пробу, содержащей аро-

ЯехУРР (250 нМ), приводило к уменьшению интенсивности флуоресценции белка. Интенсивность пика возбуждения флуоресценции ЯехУРР при 490 нм уменьшается при увеличении концентрации НАДН в пробе, в то время как интенсивность при 420 нм практически не изменяется (Рис. 25 В). В дальнейшем мы определили сигнал 11ехУРР как соотношение интенсивности 420 нм к 490 нм (Р420/Р490). А Б

УМ 175 (238) 17Р169 (232)Г

[Т-Дех 1-79

РАЗ 313 (130)

г

-791 | срУРР [ рГ^ /$АС\ / СТ\

Дех 80-211 |

600

(V

Л 400 и

400 420 440 460 480 500 520 540

Длина волны (нм)

- НехУРР

— +25 пМ МАОН

— +50 пМ НАОН -+100 пт МАОН

- + 500 пт ИДОН

360 380 400 420 440 460 480 500 520

Длина волны (нм)

-МАО -АТР -ЧАОРН

Нуклеотид (нМ)

Рисунок 25. ЫехУРР: схема и спектральные свойства. А. Схема ЯехУРР. Синий-части Т-гех, желтый- срУРР, красный- аминокислотные линкеры. Перечислены замены в структуре срУБР в результате случайного мутагенеза. Б. Спектр флуоресценции ЯехУРР. В. Изменение спектра возбуждения гехУРР при добавлении НАДН. Г. Изменения сигнала сенсора при титровании различными нуклеотидами.

Нуклеотид связывающие домены, основу которых составляет укладка Россмана, отличаются по своей чувствительности к различным нуклеотидам. Мы протестировали сродство ЯехУРР к различным нуклеотидам, главным образом к НАДН, НАД+, НАДФН и АТФ в диапазоне концентраций от 10 нМ до 1 мМ (Рис. 25 Г). Мы обнаружили, что даже избыточные концентрации НАД+ и АТФ не вызывают значимых изменений флуоресценции ЯехУРР. Связывание НАДН вызывает изменение сигнала, значение константы сродства (К') составляет 85 нМ. НАДФН также влияет на значение сигнала Р420/Р490, но значение константы сродства для НАДФН гораздо меньше и составляет 7,9 мкМ. Поскольку пул НАДФ+/НАДФН более восстановлен по сравнению с пулом НАД+/НАДН в цитоплазме потенциальное влияние ИАОРН в живых клетках не может быть исключено.

T-Rex способен связывать НАД+ и НАДН, но с разным сродством. В цитоплазме клеток млекопитающих приблизительная величина соотношения между свободными НАД+ и НАДН составляет около 700. Мы использовали сопряженную ферментативную систему для определения чувствительности RexYFP к изменениям НАД+/НАДН соотношения. В реакции, катализируемой гексокиназой, глюкоза превращается в глюкозо-6-фосфат. Глюкоза-6-фосфат, в свою очередь, является субстратом для глюкозо-6-фосфат дегидрогеназной реакции, в ходе которой образуется 6-фосфоглюконат с использованием НАД+ в качестве кофактора.

В каждой серии экспериментов в реакционной смеси, содержащей глюкозу, Mg-АТФ, НАД1' и глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу, мы использовали разные концентрации RexYFP (100, 250, 750 нМ). Реакцию начинали добавлением гексокиназы. Образование НАДН в пробе вызывало увеличение поглощения при 340 нм при одновременном уменьшении интенсивности возбуждения пика 490 нм в этой же пробе, в то время как интенсивность на 420 нм оставалась неизменной (означает рост F420/F490) (Рис. 26). Мы установили, что RexYFP отвечает даже на небольшие количества НАДН, который появляется на начальных стадиях реакции. Таким образом, будучи в составе сенсора, домен T-Rex сохранил способность отвечать на небольшие изменения концентрации НАДН даже в присутствии избытка НАД+, АТФ и АДФ. Сигнал RexYFP не зависел от его концентрации в пробе.

600 п

Ф

Л 400-н и О X

I

а

X

350 400 450 500

Длина волны (нм)

о , о з-

Ln Ц_

гч

•ч-

20 30

НАД+/НАДН

Рисунок 26. Изменения спектра RexYFP при изменении соотношения НАД+/НАДН. А. Спектр возбуждения флуоресценции сопряженной ферментативной системы, содержащей НАДН и RexYFP. Б. Зависимость сигнала сенсора от соотношения НАДТНАДН.

8.3. КехУРР в эукариотических клетках: решение проблемы рН зависимости

Для тестирования RexYFP в эукариотических клетках, мы проэкспрессировали сенсор в клетках линии НеЬа. Поскольку интенсивность пика возбуждения флуоресценции при 420 нм сенсора очень мала, в клетках мы ожидали отсутствие флуоресценции или очень слабую флуоресценцию при возбуждении лазером 405 нм. Однако, интенсивность флуоресценции оказалась достаточной, чтобы определять и в клетках сигнал сенсора как Р420/Р490.

Рисунок 27. RexYFP в культуре клеток млекопитающих. А. Изменение сигнала сенсоров RexYFP и Peredox на добавление пирувата и лактата к клеткам HeLa. Сигнал RexYFP нормализован на изменения рН. Б, В. Изменения соотношения НАД+/НАДН в цитоплазме и в митохондриальном матриксе при ингибировании митохондриального комплекса II (Б) и при разобщении дыхательной цепи с последующим ингибированием комплекса I (В).

RexYFP обладает рН зависимостью, как и другие белки на основе cpYFP. Многие внутриклеточные процессы могут вызывать колебания рН. Закисление среды вызывает снижение интенсивности флуоресценции RexYFP при возбуждении 490 нм, что приводит к появлению ложного сигнала. Для того, чтобы учесть влияние рН на сигнал сенсора, в качестве контроля мы использовали белок HyPer-C199S (SypHer). HyPer - генетически кодируемый флуоресцентный сенсор для детекции Н2О2. Мутация C199S делает сенсор нечувствительным к Н2С>2, однако сохраняет его чувствительность к рН. Мы определили, что в физиологическом диапазоне рН (6,5 -8,0) изменения флуоресценции обоих сенсоров практически идентичны. Таким образом, необходимо нормировать сигнал RexYFP на сигнал SypHer, учитывая влияние рН, что дает достоверную информацию об изменениях НАД+/НАДН соотношения в клетках.

Чтобы подтвердить правильность нашего подхода мы добавляли пируват и лактат к клеткам, экспрессирующим RexYFP. Используя восьмилуночные слайды ц-Slide 8 well (ibidi) и покадровый мультипозиционный режим съемки конфокального микроскопа, мы смогли одновременно детектировать сигналы в клетках, экспрессирующих и другие сенсоры, в частности SypHer и Peredox. Транспорт лактата и пирувата вызывает закисление цитоплазмы клеток. Мы нормировали сигнал RexYFP (FRexYFp420/FRexYFp490) на сигнал SypHer (FSypHer420/FSypHer490). Оба сигнала были усреднены по большому количеству клеток. Нормированный сигнал RexYFP (F'RexYFp/F'SypHer, где F'=F420/F490) не зависит от рН колебаний. Мы сравнили рН-нормированный сигнал RexYFP с сигналом ранее опубликованного сенсора Peredox в ответ на добавление пирувата и лактата (Рис. 27 А). После добавления 5 мМ пирувата оба сенсора RexYFP и Peredox детектировали снижение НАДН в цитоплазме. Избыток лактата (20 мМ) в среде быстро приводил к повышению НАДН. В последующие 10 мин баланс между НАД1" и НАДН возвращался к первоначальному уровню. Схожие характер и амплитуда ответа обоих сенсоров позволяют сделать вывод об эффективности нормирования сигнала RexYFP на эффект рН при мониторинге НАД+/НАДН соотношения.

8.4. Определение НАДТНАДН соотношения с помощью ЛехУРР в митохондриях и цитоплазме

Митохондрии являются главным потребителем НАДН в клетке. При этом не ясно распространяются ли изменения окислительно-восстановительного состояния митохондриального матрикса в цитоплазму. Значение НАД+/НАДН соотношения приблизительно в 100 раз меньше в митохондриях, чем в цитоплазме. Регеёох не может быть использован для детектирования динамики НАД+/НАДН соотношения в митохондриях из-за своего высокого сродства к НАДН. ЯехУРР обладает меньшим сродством, поэтому мы использовали его для детекции НАД+/НАДН в митохондриях. Для этого мы создали версию ЯехУРР с И-концевой последовательностью митохондриальной локализации (ЯехУРР-тко). Подобным образом мы использовали митохондриальную версию ЗурНег для нормирования сигнала ЛехУРР-тко на колебания рН в митохондриях.

Мы исследовали эффекты ингибиторов дыхательной цепи митохондрий на динамику изменения НАД+/НАДН соотношения в цитоплазме и митохондриях клеток. Мы установили, что добавление 3-нитропропионовой кислоты (1 мМ), которая является ингибитором комплекса И, привело к снижению НАДН в матриксе митохондрий (Рис. 27 Б). В то же время НАД+/НАДН соотношение в цитоплазме оставалось постоянным.

Разобщающий агент карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон (СССР) в концентрации 5 мкМ привел к окислению НАДН. Данный эффект оказался более выраженным в митохондриях, чем в цитоплазме (Рис. 27. В). Последующее добавление 25 мкМ ротенона к тем же самым клеткам вызывало повышение НАДН в обоих компартментах, при этом эффект ротенона был более выражен в цитоплазме (Рис. 27. В). По какой-то причине восстановительные эквиваленты после окисления накапливаются в цитоплазме быстрее, чем в митохондриях. Примечательно, что ответ ЯехУРР на добавление ротенона более быстрый в условиях СССР-индуцированного уменьшения НАДН, чем при инкубировании клеток сразу только с ротеноном. СССР вызывает закисление как в матриксе митохондрий, так и в цитоплазме.

Таким образом, ЯехУРР с нормированием на колебания рН подходит для детектирования динамики НАД+/НАДН соотношения в различных клеточных компартментах.

Выводы:

1. Создан генетически кодируемый флуоресцентный сенсор для внутриклеточной детекции пероксида водорода НуРег. Сенсор демонстрирует рациометрические изменения спектра возбуждения, реагирует специфично с пероксидом водорода и не взаимодействует с другими протестированными оксидантами.

2. Получен и охарактеризован сенсор НуРег-2, имеющий увеличенный в два раза, по сравнению с НуРег, динамический диапазон. Мутация А406У, отличающая НуРег-2 от НуРег, локализована в димеризационном интерфейсе ОхуЛ, делая НуРег-2 строгим димером по сравнению с мономерным НуРег. Однако НуРег-2 характеризуется более медленным, по сравнению с НуРег, окислением и восстановлением в клетке.

3. Сенсор HyPer-3, несущий мутацию H34Y, также локализованную в димеризационном интерфейсе OxyR, сочетает высокий динамический диапазон характерный для НуРег-2 и высокие скорости окисления и восстановления, характерные для НуРег. Высокий динамический диапазон НуРег-3 существенно упрощает детекцию Н2С>2 в тканях in vivo.

4. Сенсоры на основе одного флуорофора способны менять время жизни флуоресценции при активации, что позволяет наблюдать за ними с помощью микроскопии с детекцией времени жизни флуоресценции (FLIM).

5. Создан красный флуоресцентный генетически кодируемый индикатор пероксида водорода HyPer-RED. Параметры взаимодействия сенсора с Н202 сходны с таковыми для НуРег.

6. Локализация НуРег на цитоплазматической поверхности клеточных мембран путем создания химер НуРег с мембранными белками позволяет существенно увеличить пространственное разрешение детекции Н202.

7. Пероксид водорода, образующийся в клетке при активации тирозинкиназных каскадов, локализован в микродоменах, ассоциированных с плазматической мембраной, эндосомами и мембраной эндоплазматического ретикулума. Диффузия П202 в клетке строго ограничена, пероксид водорода окисляет тиолаты лишь в пределах микродоменов.

8. Получен двойной биосенсор, позволяющий детектировать одновременно продукцию фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата (по транслокации сенсора из цитоплазмы на плазматическую мембрану) и динамику [Н202] (по изменению рациометрического сигнала сенсора). С помощью данного сенсора продемонстрирована поляризация активности Р13-киназы и пероксида водорода в Th-лимфоцитах при образовании иммунологического синапса.

9. Исследована продукция Н202 в фагоцитирующих макрофагах. При наблюдении за динамикой Н202 на уровне отдельных клеток видно, что всплеск НАДРН-оксидазной активности носит кратковременный и контролируемый характер.

10. Пероксид водорода в макрофагах регулирует активацию МАР-киназ при фагоцитозе. Одна из функций Н202 в макрофагах состоит в предотвращении повторных событий фагоцитоза одной и той же клеткой.

11. Получен генетически кодируемый флуоресцентный индикатор для детекции соотношения НАД+/НАДН в различных компартментах клетки и разработана стратегия использования сенсоров на базе cpYFP в условиях сильных колебаний pH.

Список публикаций по теме диссертации

Обзоры

1. Зоров Д.Б., Банникова С.Ю., Белоусов В.В., Высоких М.Ю., Зорова Л.Д., Исаев Н.К., Красников Б.Ф., Плотников Е.Ю. Друзья или враги. Активные формы кислорода и азота. Биохимия, 2005; 70 (2), 265-272.

2. Murphy MP, Holmgren A, Larsson N.-G., Halliwell В, Chang С, Kalyanaraman В, Rhee S.-G., Thornalley P, Partridge L, Gems D, Nyström T, Belousov V, Schumacker P, and Winterbourn C. Unravelling the Biological Roles of Reactive Oxygen Species. Cell Metabolism. 2011; 13(4), 361-366.

3. Lukyanov KA, Belousov VV. Biophotonics: The slow fade of cell fluorescence. Nature Photonics. 2012; 6, 641-643.

4. Ткачук B.A., Тюрин-Кузьмин П.А., Белоусов B.B., Воротников A.B. Пероксид водорода как новый вторичный посредник. Биологические мембраны. 2012; 29 (12), 1-17.

5. Белоусов В.В., Ениколопов Г.Н., Мишина Н.М. Компартментализация передачи сигналов, опосредованных активными формами кислорода. Биоорганическая химия. 2013; 39 (4), 1-17.

Статьи

6. Belousov VV, Fradkov AF, Lukyanov KA, Staroverov DB, Shakhbazov KS, Terskikh AV, Lukyanov S. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Methods. 2006 Apr;3(4):281-286.

7. Chudakov DM, Chepurnykh TV, Belousov W, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fast and precise protein tracking using repeated reversible photoactivation. Traffic. 2006;7(10): 1304-1310.

8. Souslova EA, Belousov W, Lock JG, Strömblad S, Kasparov S, Bolshakov AP, Pinelis VG, Labas YA, Lukyanov S, Mayr LM, Chudakov DM. Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range. BMC Biotechnology. 2007. 29;7:37.

9. Markvicheva KN, Bogdanova EA, Staroverov DB, Lukyanov S, Belousov VV. Imaging of intracellular hydrogen peroxide production with HyPer upon stimulation of HeLa cells with epidermal growth factor. Methods in Molecular Biology. 2009;476:76-83.

10. Bogdanov AM, Mishin AS, Yampolsky IV, Belousov VV, Chudakov DM, Subach FV, Verkhusha VV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Green fluorescent proteins are light-induced electron donors. Nature Chemical Biology. 2009;5(7):459-461.

11. Марквичева K.H., Гороховатский А.Ю., Мишина H.M., Мудрик H.H., Винокуров JI.M., Лукьянов С.А., Белоусов В.В. Сигнальная функция фагоцитарной NADPH-оксидазы: активация МАР-киназных каскадов при фагоцитозе. Биоорганическая химия. 2010; 36: 133-138.

12. Тюрин-Кузьмин П.А., Агаронян K.M., Морозов Я.И., Мишина Н.М., Белоусов В.В., Воротников A.B. НАД(Ф)Н оксидаза регулирует EGF-зависимую

46

пролиферацию клеток по механизму, отличному от активации ERK1/2 МАР-киназ. Биофизика. 2010; 55: 1048-1056.

13. Malinouski М, Zhou Y, Belousov W, Hatfield DL, Gladyshev VN. Hydrogen peroxide probes directed to different cellular compartments. PLoS One. 2011; 6(1): el4564.

14. Mishina NM, Tyurin-Kuzmin PA, Markvicheva KN, Vorotnikov AV, Tkachuk VA, Laketa V, Schultz С, Lukyanov S, Belousov VV. Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally? Antioxidants & Redox Signaling. 2011; 14(1): 1-7.

15. Markvicheva KN, Bilan DS, Mishina NM, Gorokhovatsky AY, Vinokurov LM, Lukyanov S, Belousov W. A genetically encoded sensor for H2O2 with expanded dynamic range. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 2011; 19(3): 1079-1084.

16. Mishina NM, Bogeski I, Bolotin DA, Hoth M, Niemeyer BA, Schultz С, Zagaynova EV, Lukyanov S, Belousov W. Can We See PIP(3) and Hydrogen Peroxide with a Single Probe? Antioxidants & Redox Signaling. 2012; 17(3): 505-512.

17. Bilan DS, Päse L, Joosen L, Gorokhovatsky AY, Ermakova YG, Grabher C, Gadella TWJ, Schultz С, Lukyanov S, Belousov VV. HyPer-3: a genetically encoded H202 probe with improved performance for ratiometric and fluorescence lifetime imaging. ACS Chemical Biology. 2013 Mar 15; 8(3): 535-542.

18. Mishina NM, Markvicheva KN, Bilan DS, Matlashov ME, Shirmanova MV, Liebl D, Schultz С, Lukyanov S, Belousov VV. Visualization of intracellular hydrogen peroxide with HyPer, a genetically encoded fluorescent probe. Methods in Enzymology. 2013; 526: 45-59.

19. Mishina NM, Markvicheva KN, Fradkov AF, Zagaynova EV, Schultz С, Lukyanov S, Belousov W. Imaging H202 microdomains in receptor tyrosine kinases signaling. Methods in Enzymology. 2013; 526: 175-187.

Заказ № 30-р/05/2013 Подписано в печать 14.05.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2,4

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:zak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Белоусов, Всеволод Вадимович, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

На правах рукописи

05201351079

Белоусов Всеволод Вадимович

Биосенсоры активных форм кислорода и других редокс-активных соединений: создание и применение в

живых системах

специальность - 03-01-03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук

Научный консультант:

Академик РАН, доктор биологических наук Лукьянов Сергей Анатольевич

Москва 2013

Оглавление

Введение 3

Обзор литературы 4

Компартментализация передачи сигналов, опосредованных активными 5 формами кислорода

Источники АФК: НАДФН оксидазы 25

Источники АФК: митохондрии 50

Методы детекции АФК 57

Генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы 69

Цель работы 92

Материалы и методы 93

Результаты 109

Создание генетически кодируемого флуоресцентного индикатора для 109 детекции пероксида водорода

НуРег-2, сенсор Н202 с увеличенным динамическим диапазоном 119

НуРег-3: Сочетание преимуществ НуРег и НуРег-2 124

Исследование микродоменов пероксида водорода с помощью 133 локализованных сенсоров

Создание двойного биосенсора для одновременной детекции 149 фосфатидилинозитол-(3,4,5)-трифосфата (PIP3) и пероксида водорода

Исследование динамики и функции Н202 при фагоцитозе 158

Создание красного флуоресцентного белка HyPer-RED 168

Генетически кодируемый сенсор для детекции соотношения НАД+/НАДН 171

Обсуждение 179

Выводы 197

Заключение 199

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 201

Список сокращений 204

Благодарности 207

Список цитируемой литературы 208

Введение

Кислород является центральной молекулой для аэробных форм жизни. Кислород служит не только терминальным акцептором электронов в дыхательных цепях, но и регулятором большого числа метаболических и сигнальных процессов в живых системах. Поток электронов от субстратов к акцепторам проходит через редокс-пары активных соединений. Некоторые из этих редокс-пар также играют роль глобальных регуляторов жизнедеятельности живых систем.

Многие процессы в клетках регулируются кислородом не непосредственно, а через его активные формы. Активные формы кислорода (АФК) синтезируются в клетке как спонтанно, в результате утечки электронов в дыхательных цепях, так и направленно, в результате функционирования специализированных ферментативных систем. Ввиду крайне высокой реакционной способности АФК, их синтез и распространение строго контролируется клеткой. Нарушение контроля ведет к неспецифическому повреждению биологических макромолекул и аберрантной активации сигнальных каскадов: состоянию, известному как «окислительный стресс». Окислительный стресс прочно ассоциирован с развитием огромного числа патологий: нейродегенеративных заболеваний, патологий сердечно-сосудистой системы, нарушений иммунитета и др. Не удивительно, что активные формы кислорода, их синтез, распространение и утилизация являются центральными объектами исследований сотен лабораторий медико-биологического профиля во всем мире.

Вместе с тем, на протяжении нескольких десятилетий, с момента открытия АФК в живых системах по настоящее время, отсутствовали методы, позволяющие детектировать АФК в живых системах в режиме реального времени. С одной стороны, большое количество красителей, люминесцентных соединений и электродов позволяло количественно и специфично детектировать АФК in vitro в изолированных препаратах ферментов и органелл, в различных гомогенатах и субклеточных фракциях. С другой стороны, внутриклеточные флуоресцентные красители на основе синтетических хромофоров не обладали достаточной специфичностью к определенным формам АФК и в основном отражали протекание неких окислительно-восстановительных сигналов в клетке.

Кроме того, из-за фотодинамического эффекта эти красители сами генерировали АФК при облучении видимым светом в процессе микроскопии. Другим существенным недостатком синтетических красителей является их необратимость и невозможность их адресной доставки к субклеточным структурам.

В то время как красители для детекции АФК были несовершенны, но широко применялись за неимением лучших методов, детекция состояния других ключевых редокс-пар, таких как НАДТНАДН, in vivo была вообще невозможна. Все это послужило поводом к созданию нами методической платформы для детекции редокс-активных соединений, основанной на генетически кодируемых флуоресцентных индикаторах. Настоящая работа посвящена созданию таких сенсоров, их усовершенствованию и, наконец, применению для ответов на ключевые вопросы редокс-биологии: где и когда образуются АФК в живых системах?

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Биологии и химии активных форм кислорода и свободных радикалов посвящено огромное количество литературных источников. Поэтому в настоящем обзоре мы не пытались классифицировать многочисленные АФК, их реакции и источники. Вместо этого мы попытались сосредоточить внимание на сравнительно новых аспектах биохимии АФК, в первую очередь на пространственно-временной локализации продукции АФК в клетках. Именно компартментализация АФК наделяет некоторые из них функцией молекул-мессенджеров. Нам также показалось важным подробно рассмотреть НАДФН-оксидазы, как основные физиологические продуценты супероксида и Н202. Именно белки этого семейства генерируют Н2О2 в изучаемых нами в рамках данной работы системах. Традиционные представления об АФК в клетке рассматривали митохондрии как главный источник оксидантов в клетке. Мы коротко рассмотрим взаимоотношения АФК и митохондрий в одном из разделов обзора. Наконец, данная работа посвящена разработке новых методов детекции редокс-активных соединений. Мы сочли необходимым дать читателю

представление о традиционных методах детекции АФК, их достоинствах и недостатках. Заключительный раздел обзора литературы посвящен принципам создания и разнообразию генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов. Так как некоторые редокс-индикаторы появлялись в последние годы, уже после публикации нами работ по биосенсору пероксида водорода НуРег, рассмотреть их свойства было бы интересно в контексте сравнения с сенсорами, являющимися предметом данной работы. Поэтому мы перенесли обсуждение редокс-сенсоров в раздел «Обсуждение результатов».

1.1. Компартментализация передачи сигналов, опосредованных активными формами кислорода

Существует большое количество обзорных работ, посвященных активным формам кислорода, их разновидностям, а также практически бесконечному числу их потенциальных реакций: многие из них являются радикалами и чрезвычайно сильными неспецифичными окислителями [1-5]. Нам же хотелось бы сосредоточить внимание читателя на физиологических механизмах функционирования АФК и, главным образом, на тех их мишенях, которые главным образом определяют сигнальные функции оксидантов.

В данном обзоре мы позволим себе ввести два термина, облегчающих подачу материала. Понятие «внутриклеточная передача сигнала» мы заменили на более краткий вариант «сигналинг». Альтернативным вариантом могло бы послужить слово «сигнализация», но, к сожалению, в русском языке оно прочно ассоциировано с понятиями далекими от биохимии. Словосочетание «окислительно-восстановительный» мы также решили заменять на ёмкое «редокс» (от англ. redox = reduction-oxidation). Таким образом, понятие «окислительно-восстановительная внутриклеточная передача сигнала», являющееся центральной темой данной части обзора, мы будем заменять на «редокс-сигналинг».

В случае классического рецепторного сигналинга в ответ на взаимодействие лиганда с рецептором в клетке продуцируется диффундирующий вторичный мессенджер, который передает сигнал путем

взаимодействия со своей мишенью. Подобный механизм одновременно способствует и распространению сигнала в пространстве, и амплификации сигнала, так как большинство вторичных мессенджеров продуцируются ферментативным путем. Как правило, вторичные мессенджеры - это маленькие диффундирующие молекулы, которые способны быстро активировать белки-эффекторы (например, протеинкиназы, фосфатазы, ионные каналы) путем связывания с ними или химической модификации. Наиболее хорошо изученными вторичными мессенджерами являются циклические нуклеотиды (цАМФ, цГМФ), модифицированные липиды (инозитолфосфаты, эйкозаноиды) и ионы (Са2+). В целом, вторичные мессенджеры характеризуются специфичностью по отношению к своей мишени, а также в большинстве случаев ограниченным распространением в пределах места продукции.

Исторически сложилось мнение, что АФК являются побочным продуктом окислительного метаболизма и не имеют специфической функции. Однако открытие того, что АФК участвуют в регуляции многих сигнальных путей, позволило рассматривать внутриклеточную продукцию АФК как ответ клеток на окружающие стимулы. Какие же именно АФК способны играть роль вторичных мессенджеров?

Основным свойством вторичного мессенджера является специфичность по отношению к эффектору в сигнальном пути. Специфичность действия АФК может достигаться как засчет кинетики реакций, так и пространственными отношениями между мессенджером и мишенью. Однако зачастую при обсуждении сигнальных механизмов не учитывается кинетика реакций АФК с потенциальными мишенями в условиях конкуренции с ферментами антиоксидантной системы.

Супероксид анион радикал (далее супероксид) 02*~ окисляет тиолы до тиил-радикала, который далее может инициировать радикальную цепную реакцию. Однако константа скорости для этой реакции довольно небольшая (около 103 М"1 с"1 при рН 7.4) [5]. В действительности окисление тиолов супероксидом скорее представляет собой реакцию с протонированным Н02* (рКа для О'2 - 4.7) чем с самим 02*. При рН 7 константа скорости реакции окисления тиолов супероксидом становится незначительной по сравнению с

константами скорости (более 109М"1 с"1) для цитоплазматических и

митохондриальных супероксиддисмутаз [6]. Когда супероксид продуцируется НАДФН-оксидазой, он имеет возможность принять участие в сигналинге, однако внутри клетки супероксид под действием супероксиддисмутаз мгновенно дисмутирует в Н2О2. Таким образом, наиболее вероятная сигнальная роль супероксида in vivo - это быть предшественником Н2О2.

Однако может оказаться, что сигнальная функция супероксида недооценена. Существует группа белков, претендующих на роль внутриклеточных сенсоров супероксида, а именно некоторые Fe-S-кластер-содержащие белки, в которых один из ионов железа, составляющих кластер, обращен в водную фазу. Такой ион может легко подвергаться окислению супероксидом, что вызывает разборку Fe-S кластера и, как следствие, изменение конформации белка. Наиболее изученными «рецепторами» супероксида подобного рода являются белки SoxR из Escherichia coli [7-9] и аконитазы [1013]. В условиях окислительного стресса 2Fe-2S кластер-содержащий SoxR в цитоплазме E.coli подвергается окислению супероксидом, в результате чего Fe-S кластер теряет целостность. Белок, изменив конформацию, запускает транскрипцию ряда генов, в том числе супероксиддисмутазы. Подобным образом окисляется и железо 4Fe-4S кластера аконитаз (другое название цито плазматической аконитазы- ERP1, iron regulatory protein). IRP1 с разобранным кластером приобретает способность связываться с РНК, содержащей участок IRE (iron responsive element) и подавлять трансляцию ряда белков, в числе которых ферритины, митохондриальная аконитаза и транскрипционный фактор HIF-2a. По сути, механизм супероксид-опосредованного переключения функций Fe-S кластерных белков может оказаться универсальным путем передачи сигналов, связанных с энергетическими функциями клетки, поскольку многие Fe-S кластерные белки задействованы в транспорте электронов от окисляемых субстратов к конечным акцепторам.

Гидроксил-радикал ОН*~ является крайне реакционноспособным и не имеет специфичности в реакциях практически с любыми органическими молекулами. Гидроксил-радикал образуется в качестве вторичного продукта

свободнорадикальных реакций с участием супероксида и пероксида водорода. Поэтому эта молекула не рассматривается в качестве мессенджера.

Синглетный кислород ('Ог) продуцируется в клетках неферментативным путем, поэтому нет никаких данных о времени и месте специфической продукции в клетке, что является одним из критериев вторичного мессенджера. Кроме того не было обнаружено ни одного физиологического процесса окисления с участием синглетного кислорода, что также исключает его из рассмотрения в качестве сигнальной молекулы.

Среди всех АФК именно пероксид водорода претендует на звание вторичного мессенджера благодаря своей контролируемой ферментативной продукции и деградации, которые обеспечивают специфичность времени и места продукции, а также особенностям его химических реакций, которые обеспечивают специфичность окисления тиолов.

Пероксид водорода как сигнальная молекула. Продукция пероксида водорода.

В контексте сигнальной функции изучается, прежде всего, пероксид водорода, образующийся в клетке в реакции дисмутации супероксида (Уравнение 1), который в свою очередь генерируется НАДФН-оксидазами.

202-~ + 2Н+ Н202 + 02 (1)

Использование цитотоксичной молекулы в качестве сигнала имеет очевидный риск для клетки, поэтому не удивительно, что продукция Н202 в высокой степени регулируется. Активация НАДФН-оксидаз осуществляется через контролируемую многостадийную сборку активного комплекса на мембране. Процесс сборки запускается в ответ на стимуляцию клеток, например, факторами роста и цитокинами [14]. Пероксид водорода, продуцируемый внеклеточно, может проникать в клетку и также вносить вклад в редокс-сигналинг [15].

В равной степени важным фактором, влияющим на сигнальную функцию Н202, является топология его продукции. НАДФН-оксидазы переносят электроны из цитоплазмы в компартменты, топологически эквивалентные внеклеточному пространству: просвет эндосом, люмен эндоплазматического

ретикулума и собственно во внеклеточную среду [14]. Там и образуется супероксид, являющийся предшественником Н2О2. Как Н202 оказывается в цитоплазме? Осуществляется ли дисмутация супероксида в топологически внешних компартментах с последующей диффузией в цитоплазму пероксида водорода или супероксид проникает в цитоплазму где и происходит дисмутация? Существуют данные в пользу обеих моделей. Так, группой Джона Энгельгардта показано, что супероксид транспортируется в цитоплазму через анионные каналы [16]. С другой стороны, реакция дисмутации достаточно эффективна и в отсутствии супероксиддисмутаз, причем скорость реакции возрастает при снижении рН. Поэтому для поздних эндосом, в которых рН смещен в сторону кислых значений, можно ожидать образования Н202 в люмене с последующей диффузией в цитоплазму. И хотя Н202 может свободно диффундировать через мембраны in vitro, изменения в составе липидов и белков мембран, а также присутствие каналов для Н202 (например, аквапоринов) могут регулировать проницаемость мембран для Н202 [17-19] и возможность взаимодействия со специфичными белками-мишенями.

Механизм передачи сигнала с помощью Н202

Основным механизмом, благодаря которому Н202 может выполнять сигнальную функцию, является специфичная, обратимая модификация некоторых аминокислотных остатков в белках. В основном к таким остаткам относятся цистеины, однако и другие аминокислоты могут подвергаться окислению Н202. Пероксид водорода действует как сигнальная молекула через прямое взаимодействие с аминокислотными остатками белка-мишени или опосредованно, через пероксидазы. В одних случаях, продукты таких реакций ингибируют функцию белка, блокируя важные каталитические аминокислотные остатки, например, цистеины в активных центрах протеиновых тирозинфосфатаз [20-23]. В других случаях, модификации в белке-мишени могут привести к изменению конформации или изменениям во взаимодействии с другими белками и таким образом привести к активации или ингибированию функции модифицируемого белка или связанных с ним белков [24, 25].

Модификация тиоловых остатков

Одним из наиболее важных факторов, влияющих на возможность белка взаимодействовать с Н2О2 и, в результате, принимать участие в редокс-сигналинге, является скорость реакции белка с Н202. Так как Н202 взаимодействует с тиолатами остатков цистеина, то доступность тиолатов и степень их депротонирования являются лимитирующими факторами, определяющими их взаимодействие. Благодаря этим двум факторам действие Н202 является специфичным, что и наблюдается в процессе редокс-сигналинга. Доступность остатка зависит от структуры белка. Белки, участвующие в редокс-сигналинге, имеют тиолы, которые доступны