Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрохимическое определение метаболической активности бактериальных и дрожжевых клеток и разработка микробных биосенсоров

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Электрохимическое определение метаболической активности бактериальных и дрожжевых клеток и разработка микробных биосенсоров"

На правах рукописи

ои

ХЛУПОВА Мария Евгеньевна

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ И ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК И РАЗРАБОТКА МИКРОБНЫХ БИОСЕНСОРОВ

специальность 03.01.04 - «Биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ

1 2 [м? 2012

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2012

005012628

Работа выполнена в лаборатории химической энзимологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук РАН

Научный руководитель: доктор химических наук

Б.А. Кузнецов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Д.Н. Островский

доктор биологических наук С.Г. Игнатов :

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН (г. Пущино)

Защита состоится «22» марта 2012 г. в 12 часов на заседании

диссертационного совета Д 002.247.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 1.

Автореферат разослан «21» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат оиологических наук

Орловский А.Ф.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Быстрое детектирование микроорганизмов, растительных и животных клеток, а также определение их количества и уровня жизнедеятельности является важной задачей для медицинской практики и биотехнологии. Особого внимания заслуживает проблема быстрого детектирования патогенных микроорганизмов при распространении эпидемий, в том числе с появлением угрозы биологического терроризма. Опасность представляют некультивируемые, латентные формы патогенных микроорганизмов, которые способны восстанавливаться и переходить в активное состояние в организме хозяина. Например, покоящиеся клетки Mycobacterium tuberculosis, которые являются, как полагают многие авторы, причиной латентного туберкулеза, до сих пор не были изолированы из тканей хозяина, так как их количество в инфицированных органах или тканях, может быть крайне мало.

Немаловажной проблемой для медицинской практики остается проблема первичного скрининга антибактериальных препаратов, в том числе действующих на покоящиеся формы патогенных микроорганизмов. Для биотехнологии актуальна проблема быстрого селективного анализа малых концентраций химически агрессивных токсичных соединений.

Для решения этих проблем требуются простые и доступные экспресс методы. Таковыми являются электрохимические методы анализа, основанные на уникальном свойстве живых клеток, содержащих интактную электронтранспортную цепь (ЭТЦ), обмениваться электронами с электродом в присутствии или отсутствии редокс медиаторов. В связи с этим, была сформулирована следующая цель работы. -■'•• -

Цель исследования. Разработать новый вариант амперометрического метода для быстрого определения уровня метаболической активности клеток с целью, оценки физиологического состояния клеток при переходе в покоящееся состояние и при воздействии антибиотиков, а также для количественного анализа химически агрессивных соединений с использованием микробных биосенсоров. Были поставлены следующие задачи:

1. Найти оптимальные условия для наиболее эффективного проведения электрохимического анализа метаболической активности бактерий, позволяющие сохранить интактность клеток в течение всего эксперимента.

2. Исследовать динамику перехода Mycobacterium smegmatis в стационарную фазу и покоящееся состояние, используя параллельно методы: электрохимический метод, подсчет колоний, измерение оптической плотности, измерение интенсивности дыхания клеток по поглощению кислорода.

3. Изучить действие противотуберкулезного антибиотика рифампицина на метаболическую активность и колониеобразующую способность М. smegmatis при введении на разных стадиях роста.

4. Установить различия механизмов реакции переноса электронов с компонентов ЭТЦ клеток на электрод в присутствии редокс медиатора для прокариотических и эукариотических клеток.

5. Разработать макеты электрохимического биосенсора для определения малых концентраций химически агрессивного соединения формальдегида с использованием пермеабилизованных и интакгных дрожжевых клеток Hamenulapolymorpha.

Научная новизна работы. В настоящей работе был впервые разработан новый вариант амперометрического метода анализа клеток, отличающийся универсальностью, простотой исполнения и позволяющий сохранять интактность клеток в течение анализа. Показано, что при прямом контакте прокариотических клеток с электродом происходит перенос электронов с молекул редокс медиатора, находящихся в цитоплазматической мембране на свободно диффундирующие молекулы медиатора в гидрофильной зоне, без выхода молекул медиатора из ЦПМ, и далее на электрод. Для эукариотических клеток перенос электронов происходит только в присутствии гидрофобного медиатора, который пронизывает все структуры клетки и осуществляет перенос электронов с молекул редокс медиатора во внутренней мембране митохондрий, на свободно диффундирующие молекулы медиатора в гидрофильной зоне и далее, преодолевая границы фаз, на электрод. Разработанным электрохимическим методом впервые определена удельная метаболическая активность покоящихся форм бактерий М. smegmatis, культивируемых в неблагоприятных условиях, которая оказалась в 15 - 20 раз ниже активности клеток ранней стационарной фазы, культивируемых в благоприятных условиях. Показано, что рифампицин (10 мМ) оказывает бактериостатическое действие на бактерии М. smegmatis, культивируемые в благоприятных условиях. Культура сохраняет метаболическую активность на достаточно высоком уровне при полном ингибировании колониеобразующей способности.

Практическая значимость работы. В настоящей работе продемонстрирована возможность использования нового варианта амперометрического метода для оценки уровня метаболической активности клеток по величине установившегося стационарного тока, генерируемого клетками на электроде в присутствии редокс медиатора, а также для оценки количества клеток, в том числе покоящихся. Предлагаемый метод является универсальным и может быть использован для исследования большинства живых клеток (бактериальных, грибных, растительных и животных; аэробов и анаэробов), а также тканей и клеточных мембран, сохранивших цепь электронного переноса. Особый интерес, в частности для медицинской практики, представляет использование этого метода для исследования действия антибиотиков на активные и покоящиеся клетки с целью первичного скрининга антибактериальных препаратов.

Сконструированы макеты биосенсоров с использованием иммобилизованных пермеабилизованных и интактных дрожжевых клеток Н. polymorpha для селективного и чувствительного анализа малых концентраций токсичного соединения, формальдегида

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на следующих конференциях: XVIl"1 International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics (Florence, Italy, 2003), 8-ой Международной Пущинской Школе-Конференции "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004), XVIIIth International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics (Coimbra, Portugal, 2005).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 4 печатные работы, в числе которых 1 статья в российском и 3 в зарубежных научных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения

результатов, выводов и списка цитируемой литературы (214 наименований). Работа изложена на Ш5. страницах и содержит 22 рисунка и 9 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В качестве объектов исследования использовались следующие микроорганизмы: бактерии Esherichia coli BL 21 из коллекции культур Института биохимии РАН, микобактерии Mycobacterium smegmatis штамм mc2155, а также термотолерантные метилотрофные дрожжи Hansenula polymorpha из коллекции Института биологии клетки, Львов, Украина, любезно предоставленные профессором М.В. Гончаром. Использовали следующие штаммы дрожжей: пермеабилизованные клетки мутантного штамма Я. polymorpha С-105 (штамм с отсутствием каталазной активности -суперпродуцент алкогольоксидазы (АО) высокой активности) и интактные клетки мутантного штамма Я. polymorpha КСА-33 (штамм с ослабленной глюкозной катаболитной репрессией синтеза АО).

Среда и культивирование. Культуру М. smegmatis штамм тс2155 выращивали аэробно при 37°С в качалочных колбах (200 об мин"1) в среде Nutrient Broth ("Himedia", Индия). Для исследований использовалась 20-24 часовая культура в логарифмической фазе роста. 30-часовая культура служила инокулятом для получения некультивируемых форм бактерий. Некультивируемые формы получали на 70-72 часу от начала культивирования в дефицитной по питанию среде (лимитация К4) Hartman de Bont при 37°С в качалочных колбах (200 об мин"1) [Shleeva, 2004].

Культуру Е. coli BL 21 выращивали аэробно при 37°С в качалочных колбах (200 об мин"1) в среде с дрожжевым экстрактом и триптоном.

Пермеабилизованные клетки Н. polymorpha С-105 хранили в сухом виде при 4°С. Перед каждым экспериментом клетки (2 мг на 2.5 мл буфера) растворяли в 0,1 М К-фосфатном буфере (pH 7,0) и оставляли набухать в течение 30 мин, затем набухшие дрожжевые клетки использовались в эксперименте. Культуру интактных дрожжевых клеток Я. polymorpha КСА-33 получали на жидкой среде с глюкозой.

Расчет концентрации бактерий и дрожжей. Суспензию бактерий или дрожжей разводили последовательно в стерилизованном физиологическом растворе. Образец, объемом 100 мкл, высевался на чашки с агаризованной питательной средой (Broth Е) для бактерий или на чашки с агаризованным суслом для дрожжей. Количество микроорганизмов определялось подсчетом образующихся колоний (КОЕ) после инкубации в течение трех суток при 37°С. Истинное число колоний определялось по следующему уравнению, учитывающему возможное перекрытие колоний:

0.5035 '

где S - площадь чашки (см2), q - площадь одной колонии (см2), N -искомое полное число колоний и N„a6n - число наблюдаемых колоний. Максимальная доля площади, занимаемой неперекрывающимися колониями, была принята равной 0,503, как при случайном размещении неподвижных на плоскости дисков [Finegold, 1979].

Контроль бактериального роста. Концентрацию бактерий в суспензии во время культивирования определяли спектрофотометрически ("Beckman", США) по поглощению растворов при длине волны 600 нм (OD6oo).

Фильтрация микроорганизмов. Суспензия исследуемых клеток (М. smegmatis, Е. coli или Н. polymorphe, как интактных, так и пермеабилизованных) осаждалась на микробиологическом фильтре ("Whatman" или "Schleicher & Schull", Германия) с диаметром пор 0,45 мкм. Фильтрование проводилось с помощью вакуумной системы фильтрации, что позволяло получать отфильтрованную бактериальную массу, равномерно распределенную на площади 0,2; 0,38 или 4,2 см2.

Микроскопический анализ клеток проводился с использованием микроскопа "Ergaval" (Carl Zeiss, Йена, Германия) с целью контроля морфологических изменений в процессе образования "некультивируемых" покоящихся форм бактерий М. smegmatis, а также контроля интактности клеток. Анализ образцов проводился двумя способами: методом раздавленной капли и с использованием окрашенных препаратов. Окраска проводилась по методу Циля-Нильсена [Neelsen, 1884], после чего микобактерии были видны как красные бактерии на голубом фоне.

Электрохимический анализ клеток,

1. Амперометрический метод определения количества клеток и уровня метаболической активности по величине тока, генерируемого клетками на электроде, прижатом к слою отфильтрованных клеток, в присутствии редокс медиатора.

Электрохимическая ячейка. Электрохимические измерения проводили на потенциостате "BAS", США. В данном методе использовали термостатированную трехэлектродную ячейку с плоским дном для размещения фильтра с нанесенными клетками. В качестве рабочего электрода использовался стеклоуглеродный электрод (СУ-электрод), полированный на торце. Фильтр с нанесенными микроорганизмами помещали на дно электрохимической ячейки, термостатированной при 37°С, затем добавляли 0,5 -0,7 мл электролита, содержащего 0,1 мМ редокс медиатора (в опытах с Е. coli концентрация редокс медиатора составляла 1 мМ) в 0,1 М K-фосфатном буфере, pH 7,4.

Определение уровня метаболической активности клеток. После смачивания микробиологического фильтра с нанесенными клетками электролитом сразу начинали измерение потенциала электрода при разомкнутой цепи до остановки падения потенциала, длившееся в среднем в течение 30 мин. Затем выполняли следующие операции: 1) в интервале 0 - 50 с цепь разомкнута, идет запись падения потенциала от значения, установившегося за предыдущие 30 мин. Наблюдаемая величина тока при этом равна нулю (рис. 1а); 2) В интервале 50 - 250 с на рабочий электрод приложен потенциал +200 мВ (или +250 мВ, +350 мВ), идет запись изменения величин тока. Наблюдаемый анодный ток вначале большой величины (благодаря высокой концентрации восстановленного медиатора), затем быстро падает и достигает предела, который обусловлен равенством скоростей окисления медиатора на электроде и восстановления его клетками (рис. 1а). Величина тока на пределе, которая достигалась на 100-ой или 200-ой секунде (Ьоо) электрохимического измерения, использовалась для характеристики уровня метаболической активности клеток; 3) В интервале 250 - 400 с цепь разомкнута, идет запись падения потенциала от значения 200 мВ (рис. 1а). Начальная скорость падения

потенциала также характеризует электрохимическую и, следовательно, биологическую активность клеток, и может быть использована для анализа уровня метаболической активности и определения количества клеток (рис. 16).

о Ї 100 ш

100 200 t,cek

259 252

t, сек

Рнс. 1. Амперометрпческпіі метод определения уровня метаболической активности по велпчипе тока, генерируемого клетками Е. coli BL-21 на стеклоуглеродиом электроде, прижатом к слою сконцентрированных на микробиологическом фильтре клеток, в присутствии редокс медиатора при наложении иа электрод потенциала +200 мВ (а) и по начальной скорости падения потенциала электрода при разомкнутой цепи (б).

1 -контроль. В электрохимической ячейке над фильтром 0,7 мл электролита, содержащего 1 мМ 2,6- дихлорофенолиндофенола в 0,1 М К- фосфатном буфере, pH 7,4;

2 - На фильтре находится 1,3x10® клегок'см2, добавлено 0,7 мл того же электролита;

3 - На фильтре 1,3x10® клеток/см2, добавлено 0,7 мл того же электролита, содержащего дополнительно 5 мМ D-глюкозы.

Потенциал +200 мВ приложен на 50-ой секунде. Измерения выполнены при 37"С.

Фоновый ток. Если в образце присутствуют только мертвые клетки или клетки вовсе отсутствуют, наблюдается фоновый ток (в наших условиях около 4±2 нА), который принимается за начало отсчета величины тока, продуцируемого живыми клетками. Проверка была выполнена в специальных опытах. После обработки клеток 0.1% раствором глутарового альдегида наблюдали падение величины тока 1зх> до 4±2 нА, что означало гибель всех клеток. Гибель микроорганизмов дополнительно контролировали путем высева клеток на плотной питательной среде, а также методами микроскопии.

Разработанный вариаот амперометрического метода с прижатием рабочего электрода к слою сконцентрированных на микробиологическом фильтре клеток прнмегшли для длительного мониторинга динамики роста клеток и изменения клеточной активности. Относительное среднеквадратичное отклоните среднего значения (по результатам 8-ми независимых электрохимических измерений) одного образца составило 4.5% при 95%-ном уровне значимости. При этом отклонение единичного измерения было равно 13%. Разброс единичных измерений клеточной активности для образцов из трех разных высевов клеток составил 30%. Для выполнения исследований, в которых по ходу опытов вводились добавки, применяли другой метод, используемый при конструировании микробных биосенсоров.

2. Амперометрический метод определения метаболической активности по величине тока, генерируемого клетками, иммобилизованными на платиновом электроде, изготовленном техникой трафаретной печати (ТП-электроде).

Конструкция электрода. ТП-электрод ("BVT Technologies", Чехия) представлял собой керамическую пластину, на которую техникой трафаретной печати специальными чернилами были нанесены платина, выполняющая роль рабочего электрода, и серебро в виде 8 каналов, выполняющее роль вспомогательного электрода и электрода сравнения.

Определение уровня метаболической активности клеток. Проводили анализ редокс активности дрожжевых клеток Hansemda polymorpha в ответ на добавление формальдегида (ФА). Для этой цели на платиновом ТП-электроде иммобилизовали пермеабилизованиые или интактные дрожжевые клетки, смешанные с раствором альгината натрия. Далее электрод опускали в 100 мМ раствор СаСЬ на 2 мин для получения пленки Са-альгинатного геля, фиксирующей клетки на электроде. Электрохимические измерения проводились в аэробных условиях при постоянном перемешивании сразу после завершения иммобилизации в электрохимической ячейке при наложении постоянного потенциала +200 мВ (отн. насыщенного каломельного электрода, НКЭ) с последующим добавлением редокс медиатора и субстратов. Было рассчитано относительное среднеквадратичное отклонение среднего значения при 95%-ном уровне значимости по результатам трех независимых экспериментов, которое не превышало 20%.

3. Амперометрический метод определения скорости потребления кислорода клетками. Измерение скорости поглощения кислорода клетками проводилось двумя способами: 1) по скорости поглощения кислорода шгтактными клетками А/, smegmatis в среде выращивания (1,5 мл) в электрохимической ячейке типа Кларка, термостатируемой при 37°С; 2) по скорости поглощения кислорода дрожжевыми клетками Н. polymorpha с помощью кислородного биосенсора. Во втором случае суспензия клеток объемом 2 мл осаждалась на микробиологическом фильтре ("Whatman" или "Schleicher & Schuir, Германия) с диаметром пор 0,45 мкм и промывалась раствором 0,1 М К-фосфатного буфера (2 мл). Фильтр с нанесешюй суспензией прижимали к мембране биосенсора стороной с нанесенными клетками дрожжей, и фиксировали крышкой с сеткой. Электрод с иммобилизованными клетками опускали в 0,1 М К-фосфатный буфер (pH 7.0) при постоянном перемешивании. Измерение начиналось после наложения на электрод потенциала -600 мВ (отн. НКЭ).

Результаты и обсуждение.

I. Амперометрический метод определения уровня метаболической активности по величине стационарного тока, генерируемого клетками на электроде, прижатом к слою отфильтрованных клеток, в присутствии редокс медиатора.

Согласно поставленной цели данного исследования был разработан новый вариант амперометрического метода, позволяющий быстро определять уровень метаболической активности клеток и отличающийся универсальностью. Для достижения цели был решен ряд задач.

1. Быстрота исполнения метода. На начальной стадии настоящей работы была исследована система - суспензия бактерий (~108 клеток/мл) в растворе буфера в присутствии редокс медиатора 2,6-дихлорофенолиндофенола (2,6-ДФИ). Величина тока суспензии сильно зависела от времени экспозиции перед измерением. Это явлеіпіе было связано с медлешюй адгезией биопленки, которую бактерии предварительно создают на поверхности твердого тела, и затем адсорбцией клеток на этой биопленке [Armón, 200]]; [Busalmen, 2001]. Клетки, находящиеся на электродной поверхности, вносили бблыний вклад в измеряемую величину тока, чем клетки находящиеся в объеме раствора. Для введения бактерий в приэлектродную зону использовали прижатие рабочего электрода к слою клеток, отфильтрованных на площади, примерно равной площади поверхности электрода (см. Материалы и методы, стр. 6).

2. Иптактиость клеток при электрохимических измерениях.

Необходимым условием проведения электрохимических шмерсний и подготовки

образцов являлось сохранешіе интактности клеток. Во время электрохимического анализа клетки промывались, но ничем не обрабатывались, механически не повреждались и находились в условиях, близких к условиям культивирования. Для сохранения интактности клеток во время электрохимического анализа особенно важным оказался выбор редокс медиатора и потенциалов, при которых следует проводить измерения. Согласно литературным данным наложите на электрод потенциала больше 0,5 В (отн. Ag/AgCl) приводит к гибели клеток, адсорбироваїпіьіх на поверхности электрода, даже при быстрой развертке потенциала [Okochi, 1997]. С другой стороны, для глубокого окисления восстановленного медиатора пеобходимо приложить на электрод потенциал па 100 - 200 мВ выше, чем стандартный потенциал медиатора. Учитывая, что стандартные потенциалы применяемых медиаторов находятся в пределах от -105 до +115 (отн. НКЭ), оптимальными для работы были выбраны потенциалы +200, +250 и +350 мВ (отн. НКЭ).

На рис. 2 представлены записи величин токов и потенциалов при измерении метаболической активности бактерий М. smegmatis. Величина тока Ьоо, получеіпш в конце 200с электрохимического измерения, считая от времени наложешія принудительного потенциала, равна скорости акцептирования медиатором восстановительных эквивалентов, продуцируемых клетками. Как видно на рис. 2 а, величина тока Ьоо (отмечена кружками) только незначительно уменьшалась (<5%) при повторении каждого цикла. Это означает, что клетки, находящиеся вблизи электрода, оставались шггактными в ходе анализа. Уменьшение токов на 5% возможно связано с расходом эндогенных метаболитов, обеспечивающих энергоснабжение клетки. Оценка метаболической активности клеток была выполнена также да скорости уменьшения измеряемого потенциала при разомкнутой цепи (см. Материалы и методы). На рис. 2 а пунктирными лишили показаны значения тока, рассчитанные по начальной скорости изменешш потенциала и зарядки электрода при разомкнутой цепи. Как видно из рисунка, получены совпадающие величины тока при этих измерениях (отмечены кружками).

г

.uni б»« m I2UU JMII

Врещ, с

Рис. 2. Определение уровня метаболической активности бактерий М. smegmatis 155 шс! по величине

квазистационарного тока при наложении на электрод принудительного потенциала к по скорости изменения потенциала электрода при разомкнутой цепи.

(а )- регистрируемые

величины тока;

---величины тока,

рассчитанные по начальной скорости изменения потенциала при разомкнутой цепи.

О значение тока в конце 200 с (1;оо). считая от времени наложения принудительного потенциала, в этих точках получены совпадающие величины рассчитанного тока с регистрируемыми значениями тока.

(б) - регистрируемые

потенциалы электрода при открытой цепи;

---приложенный

потенциал +350 мВ.

3. Подбор редокс медиатора. В таблице 1 представлены тестируемые медиаторы и зависимость величин регистрируемого тока от редокс потенциала медиатора. Было показано, что оптимальным медиатором для работы с различными клетками является 2,6-дихлорофенолиндофенол (ДФИ) благодаря оптимальной тдрофобности и резистентности его восстановленной формы к кислороду. Поскольку стандартный редокс потенциал 2,6-ДФИ положительный, то он мог служить акцептором электронов, в основном, для начальных компонентов ЭТЦ практически любой клетки, независимо от состава и разветвлешости ЭТЦ. По данным таблицы 2,6-ДФИ оказался эффективным переносчиком электронов как да прокариотических, так и эукариотичееких клеток (таб. 1 жеатый цвет). Однако, для пермеабилизованных клеток 2,6-ДФИ оказался неэффективен (35 нА, оранжевый цвет), так как в таких клетках большинство компонентов ЭТЦ отсутствуют из-за выхода коферментов из клеток. Гидрофильный медиатор феррицианид оказался высокоэффективным электронным переносчиком для прокариот (таб. 1 желтый цвет) и абсолютно неэффективным для эукариотических клеток Н. ро1утогрка (48 нА). Феррицианид не способен проникать сквозь цитоштматическую мембрану (ЦПМ)

эукариотцческой клетки и не достигает внутренней мембраны митохондрий, где локализованы компоненты ЭТЦ.

Таблица 1. Зависимость величин тока, генерируемого клетками на стеклоуглеродиом электроде, от природы редокс медиатора.

Клетки Редокс медиаторы

2,6- дихлорофенолшио фенол К,,'- 0,190 В KJFeiCN)*] іч,'=. о J60 в 1,4-бенншшон Е„'= 0,275 В и- иафтоишон Е„'=0,140В

Контроль 1° 1 200, НА ,1 1 200, НА Контроль і 200, НА Iі 200, н.А Контроль 1 200, НА И 1 200. НА Контроль і 200, нА И 1 200, нА

Л/, smegmatis тсг155 23,0 91,9 55,5 577.1 71,4 150,8 21.6 114

//. potymorpha" КСА-33 Пнтактные клетки 23,0 234 55,5 48 71,4 1682 21,6 675

Н. potymorpha С-105 Пермеабилшо-ваштые к.н' п.-и 23,0 35 55,5 69 71.4 172 21,6 116

£ coli BL-21 28 75,7 92 947 „ _ _

отсутствие бактерий в конце 200с (величины тока I0;« отличаются, так как отличаются концентрации медиатора для контрольных опытов с № smeffnatts и с Е. coli)\ 1|2СШ - величина тока, продуцируемого бактериями, в присутствии медиатора в конце 200-ой секунды.'Количсство клеток Kl. smegmatis на фильтре 0,6>10" клеток/см1, "Количество клеток Я polymorphe! на фильтре 2,5* 108 клсток/см2, концентрация медиатора в опытах с М. smegniatis и дрожжевыми клетками была 0,1 мМ, 37°С; '"Количество клеток Е. coli 13х 10* клеток'см2, концентрация медиатора в опытах с Е. coli составляла 1 мМ, 37°С.

Величина тока, генерируемого клетками, линейно зависела от концентрации медиатора в исследованном интервале концентраций 0 - 0,5 мМ (рис. 3). Это означает, что для выбранной и используемой в работе концентрации 2,6-ДФИ 0,1 мМ мощность электронного потока в электрохимической цепи нампот меньше мощности потока в биологической цепи. Кроме того, увеличение концентрации медиатора яшыется возможным резервом для увеличения чувствительности метода.

Рис. 3. Зависимость величины юка (Ijm), генерируемого бактериями М. smegmatis, от концентрации (С) медиатора.

"""" в присутствии бактерий (количество клеток А/, smegmatis на фильтре 0,6*10® клеток'см3); 0 2 0 4 0 6 ' 6е3 бактерий (контроль).

[2,6-ДФИ], мМ

4. Оценка доли электронного потока, отведенной т биологической цепи, для проведения электрохимического анализа. Отвлечение потока электронов на электрохимический анализ с помощью Медиатора 2,6-ДФИ при его концентрации 0,1 мМ практически не нарушает процессов энергоснабжения клетки. Это можно показать, оценивая долю электронного потока, отводимую для проведения электрохимического анализа. Для этой цели амперометрическим методом в ячейке типа Кларка определяли активность потребления кислорода (А, мкМ/с) клетками А/. зте^аИя в анализируемой суспензии определенной концентрации (КОЕ, клеток/мл). Переводили величину активности потребления кислорода в электрические единицы (А , мкА/мл). Оценивали число клеток, находящихся в зоне действия электрода и участвующих в электрохимическом процессе (Аг, клеток). Измеряли величину тока (¡200, мкА), который генерировали клетки при 37'С и приложенном потенциале +250 мВ. Отсюда, используя отношение величии тока, приходящихся на одну клетку (величины тока, полученную в прямом электрохимическом эксперименте, и величины тока, рассчитанную по потреблению кислорода), можно рассчитать ту долю потока электронов биологической

_ /;оо • КОЕ

цепи, которая отводилась на электрохимическую реакцию: а 1 - —~——

/V ■ л

Расчеты были проведены для серии опытов. Данные суммированы в таблице 2.

Таблица 2. Оценка доли потока электронов, отводимой из биологической цепи переноса электронов для проведения электрохимического апализа активности баккрин М. smegmatis mc'JSS, и параметры, характеризующие культуру.

Характеристика бактерий Время отбора пробы, ч КОЕ • 10 кл/мл OI)«,,, А, миМ/е А*, мнА/мл Ьло* мкА Ol" %

Бактерии, культивируемые в благоприятных условиях 17 0.70 0.65 0.24 23 0.049 2.3

26 5.30 1.30 0.506 49 0.140 3.1

45 3.07 1.77 0.310 30 0.097 3,5

166 1.41 1.81 0.154 15 0.066 4.8

Бактерии, культивируемые 1) неблагоприятных условиях 17 0.089 0.046 0.054 5.2 0.018 3.7

26 0.341 0.201 0.128 12.4 0.037 3.2

45 2,30 0.64 0.097 9.4 0.070 8.1

87 0.01 0.21 0.048 4.6 0.031 7.3

А - величина дыхательной активности (А, мкМ/с), переведенная в электрические единицы (мкА/мл);

*" Я1 - доля потока электронов, формально рассчитанная величина, не учитывающая сильное понижение дыхательной активности.

Из таблицы 2 видно, что доля потока электронов биологической цепи, отводимая для проведения электрохимического анализа в условиях эксперимента всегда меньше 10%. Это означает, что влияние электрохимической реакции и ходе анализа на процессы в клетке минимальны, что является важным заключением для использования электрохимических методов в длительных экспериментах с клетками.

5. Роль экзогенных и эндогенных субстратов в поддержании уровня метаболической активности клеток. Известно, что уровень метаболизма клеток зависит от наличия в среде субстратов - глюкозы, лактата, малата, сукцината и других, в зависимости от условий выращивания и природы бактерии. Такое свойство, как увеличение регистрируемого электрохимического сигнала клеток с увеличением концентрации субстрата и достижеіше предела, используется для амперомстрического анализа субстратов «а электродах с иммобилизованными на них клетками. Было проведено исследование влияния субстратов дыхательной цепи - глюкозы, малата и других, на метаболическую активность клеток М. smegmatis. Оказалось, что величина продуцируемого тока не зависит от присутствия субстратов в широком диапазоне концеїгграций. Это явление можно объяснить наличием большого запаса гликогена у бактерий М. smegmatis, который они используют в стрессовых условиях, что было показано ранее [Belanger, 1999]. В отличие от микобактерий дрожжи Н. polymorpha и бактеріпі Е. coli чувствительны к добашіению питательных веществ. Например, в присутствии .D-глюкозы (5 мМ) величина тока, генерируемого клетками Е. coli, увеличивалась в 12 раз (рис. 1). На этом принципе построено использование бактерий и дрожжевых клеток в биосенсорах (Е. coli в биосенсоре дая определения глюкозы и //. polymorpha в биосенсоре для определения формальдегида).

6. Зависимость величины генерируемого тока от количества бактерии, осажденных па фильтре. Количество осаждеїшьіх клеток на фильтре являлось определяющим фактором независимо от способа их нанесения и промывки. Это свойство открывает возможность концентрирования клеток на фильтре, и выполнения анализа суспензии клеток с содержанием менее 105 клеток на мл. Очевидно, для электрохимического анализа других бактерий необходимо в некоторых случаях подбирать соответствующую среду, чтобы восстановить активность клеток после операций отмывки.

На рис. 4 представлена градуировочіия кривая зависимости величины тока от концентрации клеток. На верхней шкале показано соответствующее количество клеток на 1 см2 фильтра.

Начальный участок градуировочной кривой представлен на вставке рис. 4. Из графика следует, что возможно обнаружение 3-Ю6 клеток/мл при объеме фильтрации 0,5мл. Увеличеіше объема фильтрации до 15 - 30 мл позволит определить 5-Ю4 -10s клеток/мл. Практически можно детектировать 104 клеток/мл в образце объемом 15 мл. Кроме того, имеется дополнительный резерв для уменьшения предела детекции путем увеличеїшя концентрации медиатора.

Показательно, что наклон начального участка градуировочной кривой резко изменяется при плотности осажденных на фильтре клеток (~108 клеток/см2). Кривая такого вида может наблюдаться в случае, если по мере увеличеїшя количества клеток па фильтре сначала осуществляется электрохимическая реакция с монослоем клеток, а затем в реакцию включаются следующие слои. Можно предположить, что перегиб калибровочной кривой происходит как раз после образовании мопослоя. Толщина одного и даже нескольких монослоев клеток весьма мала, поэтому диффузионный поток восстановленного медиатора от любого слоя к электрода будет абсолютно идентичен к моменту времени 100 с.

25

а, КОЕ см2 х 10"7 _50

75

2.5

1

о

5

10 15 20 25

с, КОЕ ил'1 х КГ7

30

35

Рис. 4. Градуировочная кривая зависимости величины тока Цк»), генерируемого бактериями М. smegmatis, от концентрации клеток в фильтруемой суспензии (с) и от шшгнисти клеток на фильтре (<1). Объем филыруемой суспензии 0,5 мл. Вставка. Начальная линейная часть графика зависимости величины тока (11Ю) от концентрации клеток в суспензии.

Очевидно, из слоя бактерий, непосредственно примыкающего к электродной поверхности, перенос электронов проходит намного быстрее. Можно предположить, что при прямом контакте клеток с электродной поверхностью возникает возможность переноса электронов на электрод с молекул медиатора, расположенных в цитоплазматической мембране клеток. По-видимому, стадия выхода медиатора из клеточной мембраны в наружную среду сильно ограничивает общую скорость переноса электронов. Имеется ряд других свидетельств существования механизма переноса электронов между молекулами медиатора через границу фаз: 1) зависимость величины тока от приложенного потенциала не характерна для разряда свободно диффундирующих частиц; 2) расчетом показано, что время для диффузионного смещения на расстояние толщины одного слоя бактерий составляет столь малую величину 0.015 с, что никак не может вызывать уменьшение тока. На основании этих соображений были предложены схемы медиаторною переноса электронов с элементов электронтранспортиой цепи прокариот и эукариот на электрод.

II. Схемы медиаторного переноса электронов с элементов электронтранспортиой цепи клеток на электрод.

А. Для прокариотических клеток.

1. Медиаторный перенос электронов при отсутствии контакта бактерии с электродной поверхностью. Основной механизм - диффузионный перенос медиатора от цитоплазматической мембраны (ЦПМ) к электрода. Возможна параллельная реакция -предварительный перенос электрона с ЭТЦ или гидрофобного медиатора, растворенного в

ЦПМ, на медиатор, находящийся в гидрофильной зоне, вблизи ЦГ1М, и его последующая диффузия к электроду.

2. Медиаторный перенос электронов при прямом контакте бактерии с электродной поверхностью в присутствии относительно гидрофобного медиатора 2.6-ЛФИ. Основной механизм переноса электронов двустадийное туннелирование электрона: с молекул ДФИ в ЦПМ —* на молекулы ДФИ в клеточной стенке —» на электрод (схема 1). За счет исключения медленной стадии выхода медиатора из гидрофобной среды наблюдается ускорение реакции переноса электронов. Межмолекулярный электронный обмен между молекулами ДФИ в мембране создает большое количество заряженных молекул ДФИ и также заметно ускоряет реакцию туннелирования электронов с ЦПМ клетки на электрод.

дм Я1 ¿н

Схема 1. Медиаторный перенос электронов при прямом контакте бактерии с электродной поверхностью в присутствии гидрофобного медиатора 2,6-дихлорофенолинлофенола.

3. Перенос электронов при прямом контакте бактерии с электродом с участием гидрофильного медиатора феррицианид«. КчГРе(СК1я1.

Исходя из данных таблицы 1 феррицианид оказался высокоэффективным медиатором для прокариот, хотя он не проникает внутрь клетки. Можно предположить существование особого механизма сближения гидрофильного медиатора с элементами ЭТЦ, локализованными в Ц11М, учитывая, что предельное расстояние для туннелирования электрона составляет ~2 нм, а толщина клеточной мембраны ~7 нм. Возможно среди многочисленных пор, пронизывающих мембрану, имеются гидрофильные, которые не пропускают феррицианид в цитоплазму, но позволяют ему погружаться в мембран)', сокращая тем самым расстояние между объектами реакции (схема 2). Кроме того, уникальное свойство системы ферроцианид/феррицианид - высокая константа скорости межмолекулярного электронного обмена (2.4-10* 1/М-о) [2аЫ е1 а!., 2002], что дополнительно создает условия для ускорения электрохимической реакции в целом.

гидрофильного медиатора феррицианнда Kj(Fe(CN)6|.

Б. Для эукариотических клеток. Судя по данным таблицы 1 для эунаркотических клеток (Я. polymorpha) феррицианид, как переносчик электронов, оказался совершенно не активным. Это объясняется тем, что ЭТЦ эукариот находится на внутренней мембране митохондрий, на весьма большом расстоянии от внешней мембраны клетки. Напротив, гидрофобный медиатор (например, ДФИ) пронизывает все структуры эукариотической клетки и осуществляет эффективный электронный перенос. Возможно ускорение реакции за счет межмолекулярного электронного обмена на границах фаз мембран митохондрии и клетки. Предложенные схемы электронного переноса позволяют объяснить известный из литературных данных синергетический эффект действия нескольких медиаторов. Если использовать, например, смесь 2,6-ДФИ и феррицианида, то синергетическое ускорение происходит за счет дополнительной реакции на i-ранице фаз между ДФИ, локализованным в ЦПМ, и феррицианидом в гидрофильной зоне.

IH. Сравнение амперометрического метода, используемого в настоящей работе, с методом циклической вольтамперометрии (ЦВ), а также с амперометрическим методом определения скорости поглощения кислорода. Преимущества разработанного амперометрического метода.

Проанализировав собственные и литературные данные, реакции адсорбированных на электроде клеток при анализе методом ЦВ можно описать следующим образом. При развертке потенциала в области 0,5 - 1,0 В, в которой наблюдаются генерируемые токи, происходит разрушение целостности мембран клетки и субклеточных структур (как при электропорации [Kmoshita, 1977; Weaver, 1996]). Содержимое клетки и элементы ЭТЦ высвобождаются наружу и разряжаются на электроде, а регистрируемые токи быстро уменьшаются. Разрушенные клетки остаются прочно связанными с электродной

поверхностью, препятствуя последующим реакциям активных клеток па данном электроде. Метод ЦВ отличается тем, что для его выполнения не требуются медиаторы. Регистрируемый ток или количество электричества, которое участвует в одном акте реакции при анодной развертке потенциала, характеризует, очевидно, суммарный заряд отрицательных эквивалетов, который распределен по компонентам ЭТЦ. Эта величина может только качественно характеризовать уровень метаболической активности клетки.

В отличие от амперометрического метода определения скорости поглощения кислорода, который подходит только для аэробов, разработанный амперометрический метод универсален и подходит для анализа как аэробов, так и анаэробов, а также для анализа клеток с различными по составу ЭТЦ. Эффективный перенос электронов с компонентов ЭТЦ па молекулы редокс медиатора, 2,6-ДФИ, экспоненциально зависит от потенциалов, приобретаемых элементами ЭТЦ и, поэтому, осуществляется, п основном, с начальных участков ЭТЦ. Еще одно преимущество разработанного амперометрического метода - возможность накопления заряда электрода во время измерения, что в несколько раз увеличивает чувствительность метода.

IV. Динамика роста и перехода бактерий М. зтсцпими е стационарную фазу и в покоящееся состояние.

1. Лналм) урошш метаболической активности покоящихся форм бактерии по величине тока, генерируемого клетками на электроде (см. Материалы н методы, стр. 6-7). Для получения более подробной информации о клетках наряду с электрохимическими измерениями в каждом опыте параллельно проводились измерения оптической шопюсти анализируемой суспензии, дыхательной активности и подсчет КОЕ. Проводилея также микроскопический анализ клеток с целыо контроля их интахтности. На рис. 5 представлены кривые динамики роста бактерии М. $те%таН$ в благоприятных и неблагоприятных условиях. При переходе в стационарную фазу в благоприятных условиях уровень метаболической активности снижался до 49% (рис. 5а синяя кривая), в то время, как при переходе в "некультивируемое" состояние в неблагоприятных условиях уровень метаболической активности клеток падал до 8% от максимального значения (рис. 5а красная кривая). Этот уровень сохранялся или незначительно уменьшался в течение 8 суток проведения эксперимента. Величина этого уровня, выраженная в нА или в процентах от величины максимального тока, была взята дая характеристики уровня метаболизма покоящихся форм бактерий. При переходе в стационарную ({азу в благопрнятшлх условиях количество КОЕ снижалось до 27% (рис. 56 синяя кривая), а при переходе в ''»«культивируемое" состояние в неблагоприятных условиях клетки не образовывали колоний на плотной среде (рис. 56 красная кривая). Дыхательная активность бактерий, выращенных и благоприятных условиях, изменялась параллельно метаболической активности клеток, и уровень ее уменьшался до 29% в стационарной фазе (рис. 5г сшия кривая). Как известно, при переходе в стационарную фазу происходит перестройка метаболизма клетки, а именно, резко сокращается биосшггез белков конечного участка дыхательной цени, и соответственно происходит значительное уменьшение дыхательной активности. Дыхательная активность клеток, выращенных в неблагоприятных условиях, при переходе в покоящееся состояние уменьшалась до 5% (рис. 5г красная кривая). После 50 часа при росте в неблагоприятных условиях

наблюдалось падение величины (Ют, что возможно связано с процессами агрегации и лизиса клеток (рис. 5в красная кривая).

Рис. 5. Динамика роста бактерий М. smegmatis в благоприятными неблагоприятных условиях Д Зависимости величин тока (1®о) (а), КОЕ, выраженных в процентах от максимального значения (б), оптической плотности (ODmo) (с) и дыхательной активности (А) (г) от времени культивирования.

Был оценен лаг-период для кривых изменения метаболической активности и роста биомассы. В опытах с бактериями, культивируемыми в благоприятных условиях, лаг-период был минимальный (5.5 часа). При росте бактерий в неблагоприятных условиях происходите увеличение величины лаг-периода от 8 до 12 ч. Очевидно, что бактериям требуется более длительный период адаптации при пересеве шюкулята в неблагоприятные условия.

Предложенный амперометрический метод исследования динамики перехода бактерий в покоящееся состояние имеет преимущества перед другими современными методами определения цекультивируемых форм бактерий (flow cytometry, direct viable count (DVC), nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Многие из этих методов молекулярной биологии трудоемкие и требуют наличие дорогих препаратов и высокоспециализированного персонала. Главным преимуществом разработанного амперометрического метода является возможность непосредственной записи тока, характеризующего уровень метаболической

активности, без проведения предварительных операций окрашивания, подсчета клеток и амплификации, а также простота исполнения метода.

2. Определение концентрации и удслыюи метаболической активности клеток.

Электрохимическая оценка суммарной метаболической активности клеток в

образце, т.е. величина тока 1200, выраженная уравнением: Ьоо = ос!Ч, не дает отдельно информацию об удельной активности, т. е. активности в пересчете на одну клетку (а), и о количестве клеток (Р^). В общем случае необходимо знать какую-либо из этих величин из независимых опытов, например, число живых клеток, чтобы определить удельную активность. В лаг-фазе, в экспоненциальной фазе роста и в начале стационарной фазы удельная метаболическая активность клеток практически остается постоянной. Поэтому изменение во времени величины измеряемого тока 1;оо пропорционально росту количества клеток. В тех случаях, когда роста числа клеток не происходит, то изменение тока во времени пропорционально изменению уровня удельной метаболической активности. Например, при действии антибиотиков на активные клетки, ссди угасание метаболической активности происходит за время значительно меньшее, чем врет удвоения числа клеток, а также при исследовании клеток, находящихся в стационарной фазе, или при переходе активных клеток в "некультивируемос" состояние.

Можно перевести едшшцы измеряемого тока (мкА) в единицы количества клеток, по во многах случаях относительное изменение числа клеток или удельной метаболической активности, выраженных в мкА, оказывается достаточным, чтобы охарактеризовать процесс.

3. Микроскопический анализ покоящихся форм бактерий (см. Материалы и методы, стр. 6). При переходе бактерий в покоящееся "некультивируемое" состояние отдельные длинные тонкие палочки сменялись агрегатами, состоящими из укороченных уплотненных палочек. Методом окрашивашм по Цшпо-Нильсену проверялась интактность клеток, поврежденные клетки не окрашивались. Культура бактерий, выращенная в благоприятных условиях, также оцегашалась микроскопически. При переходе от экспоненциальной фазы роста к стационарной фазе наблюдалось уменьшение длины палочек и тенденция к агрегации, что в результате приводило к образованию довольно крупных с большим количеством бактерий агрегатам.

V. Анализ действия противотуберкулезного антибиотика рифампицина на метаболическую и пралиферативную активность клеток М. хтецтай$, выращенных в благоприятных условиях. Рифампнцин (10 мМ) добавляли к культуре А/. шерпайь на разных стадиях роста: 15 ч, 24 ч и 92 ч. В качестве контроля использовали бактерии, культивируемые в благоприятных условиях без добаалешш рифампицши (рис. 6 черные кривые). На рис. 6а показана динамики изменения величин тока, на рис. бб - динамика изменения величии КОЕ. Добавление рифампицши па 92 ч роста культуры никак не влияет ни на колошшобразующую способность бактерий (рис. бб зеленая кривая), Ш1 на метаболическую активность (рис. ба зеленая кривая), что может свидетельствовать о подготовке бактерий к стационарной фазе (например, утолщается клеточная стенка). При добавлении рифампицина на ранней экспоненциальной фазе роста, на 15 часу происходит сильное замедление способности образовывать колонии (рис. бб красная кривая). Величина КОЕ снижается на 57%, а на 163 ч приближается к нулю. Сшшается и уровень метаболической активности, примерно на 60% (рис. ба красная кривая). Однако этот

уровень достаточно высокий и может легко определяться электрохимически. Добавление рифамшщина на 24 часу незначительно изменяет колоний образующую способность (рис. 66 синяя кривая) и практически не изменяет метаболическую активность (рис. 6а синяя кривая).

Рис. 6. Действие рпфамппцппа на метаболическую - (а) и пролиферативиую активность - (б) бактерий Л/ smegmatis, культивируемых в благоприятных условиях, в зависимости от времени добавления рифампицина:

♦ Контроль, без добавления рифампицина

□ Ри фампицин, добавленный к культуре на 15ч роста;

А Рифампицин, добавленный к культуре на 24ч роста;

О Рифампицин, добавленный к культуре на 92ч роста

Время, ч

В литературе существует мнение, что рифампицин ингибирует стадию транскрипции бактерий. Представленные результаты показывают, что добавление рифампицина на экспоненциальной фазе роста бактерий, культивируемых в благоприятных условиях, действительно сильно замедляет пролиферативную активность бактерий и в дальнейшем ингибирует ее. Метаболическая активность бактерий, определяемая амисрометрическим методом, после добавления рифампицина на экспоненциальной фазе роста снижается, но сохраняется на достаточно высоком уровне. Это может говорить о бактериостатическом действии антибиотика рифампицина в выбранной концентрации (ЮмМ) на культуру А/. ьте%та1Ь, выращенную в благоприятных условиях.

Таким образом, разработанный амперометрический метод анализа метаболической активности клеток позволяет проводить быстрый скрининг антибактериальных препаратов, действующих как на активные бактерии, так и на покоящиеся формы бактерий.

Время, ч

VI, Определение формальдегида электрохимически с использованием иммобилизованных дрожжевых клеток Нап%епи1а ро1утогр1ш. Измерение величины тока, генерируемого живыми клетками на электроде, позволяет определять концешрацию различных соединений, что используется в аналитической химии. В этом случае иммобилизованные на электроде живые клетки исполняют роль селективных чувствительных элементов. Задачей данной работы было осуществлешю чувствительного и селективного анализа малых концентраций формальдегида (ФА). Мониторинг этого соединения, в частности, в потребительских товарах, пище и окружающей среде весьма актуален, так как в малых концентрациях это опасный канцероген и индуктор апоптоза клеток. Для повышения чувствительности и селективности амперометрического анализа ФА были выбраны пермеабилизованные клетки генетически модифицированного штамма Н. ро1утогрЬа С-105, суперпродуцигга алкогольоксидазы (АО) высокой активности, и интактные клетки мутантного штамма дрожжей Н. ро!утогрЬа КСА-33 с синтезом АО высокой активности.

1. Макет кислородного биосеисора для количественного определения формальдегида с использованием псрмсабилшоваииых дрожжевых клеток И. ро1утогр!ы С-105 (см. Материалы н методы, сгр. 8). В пермеабилизовашшх клетках прекращается функционирование большинства дегидрогеназ ввиду отсутствия в этих клетках коферментов, функционирующими остаются оксидазы, количество которых в клетке значительно меньше. Ранее [Шумакович, 2007] было показано, что сродство АО к кислород)' на несколько порядков выше сродства к 2,6-ДФИ и скорость реакции окисления ФА кислородом воздуха, катализируемой АО, (30 нмоль/с-мг фермента) намного выше скорости окисления ФА этими медиаторами. Поэтому определение ФА (в аэробных условиях) с помощью пермеабилюованпых дрожжевых клеток проводилось по скорости потребления кислорода клетками с помощью кислородного биосенсора.

На рис. 7 представлена градуировочная кривая зависимости величины тока (активности потреблети кислорода) от концентрации ФА. Разработашшй макет кислородного биосенсора с иммобилизованными пермеабилизовашшми дрожжевыми клетками позволял определять концентрацию ФА до 4 мМ (рис. 7).

2 Ампсромстрнческие характеристики

кислородного бноссисора:

Лнисйиын диапазон 0,30 - 4,0 мМ Предел дстекцип 0,27 мМ Чувствительность 0,44 мкМ с"1 мМ"1

■ I/1 ___

[формальдегид], мМ

Рис. 7. Градуировочная кривая биосснсора: зависимость величины тока (I) (активности потребления кислорода иммобилизованными пермеабплизованными дрожжевыми клетками Я ро1утогр!ш) от концентрации формальдегида.

2. Макет биосенсора для определения формальдегида с использование»! иммобшнповапных интактпых дрожжевых клеток Н. ро1утогрка КСА-33 на оспове платинового электрода, изготовленного техникой трафаретной печати (ГП-электрода), в присутствии редокс медиатора 2,6-ДФИ (см. Материалы и методы, стр.

8). На рис. 8 представлена градунровочная кривая зависимости величин тока от концентрации ФА.

[формальдегид], мМ

Амперометрические характеристики биосенсора на оспове ТП-элекгрода:

Линейный диапазон 1,07 - 7,0 мМ Предел детекции 0,74 мМ Чувствительность 10,3 нАмМ"1

Рпс. 8. Калибровочная кривая бпосенсора для определения ФА в присутствии редокс медиатора с использованием иммобилизованных пнтактных дрожжевых клеток II. рЛутогрНа.

Зависимость ответа биосенсора от концентраций ФА линейна в диапазоне от 1 -7мМ. Чувствительность сенсора составила 10.3 нА/мМ, что оказалось в 10 раз чувствительнее потенциометрического рН-зависимого биосенсора на основе шггактных дрожжевых клеток, описанного в работе [Котрап, 2000].

Относительное среднеквадратичное отклонение средней величины по пяти измерениям, выполненным на различных ТП-электродах с иммобилизованными клетками, приготовленными и используемыми в различное время, составило 25% при 95%-ном уровне достоверности. Пермеабилизованные клетки могли быть использованы в биосенсоре для определения ФА в присутствии редокс медиатора только в анаэробных условиях, поскольку в пермеабилизованных клетках сродство АО к кислороду на несколько порядков выше сродства к 2,6-ДФИ.

Выводы

1. Разработан новый вариант универсального амперометрического метода для быстрого определения количества клеток и анализа уровня метаболической активности микроорганизмов по величине тока, генерируемого клетками на электроде при сохранении их интакшости.

2. Установлены механизмы медиаторного переноса электронов с элементов электронтранспортной цепи клеток на электрод для прокариотических и эукариотических клеток.

3. С помощью разработанного метода исследована динамика роста и образования дормантных форм. Показано, что уровень метаболической активности дормантных бактерий М. smegmatis в ранней стационарной фазе в 10 - 20 раз меньше уровня активности бактерий, выращенных на оптимальной по составу среде.

4. На примере антибиотика рифампицина показана возможность использования разработанного метода для первичного скрининга антибактериальных препаратов.

5. Сконструированы макеты биосенсоров для определения формальдегида с использованием иммобилизованных интактных клеток дрожжей Натепи!а ро!утогрИа КСА-33 и пермеабилизованных клеток мутантного штамма НаметЬ ро!утогрИа С-105. Определены биоаналитические характеристики микробных биосенсоров.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах

1. Khlunova М. Kuznetsov В., Gonchar М., Ruzgas Т., Shleev S. (2007) Amperometric monitoring of redox activity in intact, permeabilised and lyophilized cells of the yeast Hansenula polymorpha. Electrochemistry Communications. 9, 1480-1485.

2. Khlunova M.. Kuznetsov В., Demkiv 0., Gonchar M„ CsOregi E., Shleev S. (2006) Intact and permeabilized cells of the yeast Hansenula polymorpha as bioselective elements for amperometric assay of formaldehyde. Talanta. 71(2), 934-940.

3. Кузнецов Б. А., Хлупова M. E.. Шлеев С. В., Капрельянц А. С., Яронолов А. И. (2006) Электрохимический метод измерения метаболической активности и количества клеток. Прикладная биохимия и микробиология. 42(5), 599-608.

4. Kuznetsov В. A., Davvdova (Khlupoval М. Е.. Shleeva М. О., Shleev S. V., Kaprelyants A. S., Yaropolov А. I. (2004) Electrochemical investigation of the dynamics of Mycobacterium smegmatis cells' transformation to dormant, nonculturable form. Bioelectrochemistry. 64(1), 125-131.

Тезисы конференций

1. Davvdova (Khlunova) M.E.. Kuznetsov B.A., Shleeva M.O., Kaprelyants A.S. (2005) Electrochemical investigation of peculiarities of metabolic activity during the transition to stationary phase and during the formation of dormant Mycobacterium smegmatis cells. Abstracts of XVIII International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics (BES), Coimbra, Portugal, 19-24 June, p. 121

2. Davvdova (Khlunova) M.E.. Kuznetsov B.A., Pavlishko H.M., Gayda G.Z., Gonchar M.V., Yaropolov A.I., Shleev S.V. (2005) On the methods of electrochemical determination of formaldehyde with permeabilised yeast cells Hansenula polymorpha., Abstracts of XVIII International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics (BES), Coimbra, Portugal, 19-24 June, p. 121

3. Давыдова (Хлупова) M.E.. Кузнецов Б.А., Шлеева М.О., Шлеев С.В., Капрельянц А.С., Ярополов А.И. (2004). Переход бактерий Mycobacterium smegmatis в некультивируемое состояние. Определение активности клеток электрохимическим методом. Сборник тезисов 8ой Международной Пущинской Школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, Россия, 17-21 мая, с. 259.

4. Kuznetsov В.А., Davydova (Khlunova) М.Е.. Shleeva M.O., Shleev S.V., Kaprelyants A.S., Yaropolov A.I. (2003). Electrochemical monitoring of formation and resuscitation of dormant bacteria. Abstracts of XVIIth International Symposium "Bioelectrochemistry and Bioenergetics, 19-24 June, Florence, Italy, p. 563.

Подписано в печать: 19.02.12

Объем: 1,5 у сл. п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 76 Отпечатано в типографии «Реглет> 105005, г. Москва, ул. Бауманская д.ЗЗ (495) 979-96-99; ww-w.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хлупова, Мария Евгеньевна, Москва

61 12-3/611

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМ. А.Н. БАХА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ

ХЛУПОВА МАРИЯ ЕВГЕНЬЕВНА

ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ И ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК И РАЗРАБОТКА МИКРОБНЫХ БИОСЕНСОРОВ.

03.01.04- биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА

БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: ДОКТОР ХИМИЧЕСКИХ НАУК Б. А. КУЗНЕЦОВ

МОСКВА-2012

Оглавление

Введение 5

Список сокращений 6

Глава 1. Литературный Обзор 7

1.1. Электрохимические реакции клеток 7

1.2. Электрохимические методы 9 1.2.1. Исторический обзор 9

1.2.1.1. Импедансометрия 11

1.2.1.2. Потенциометрия 12

1.2.1.3. Технология топливных ячеек 12

1.2.1.4. Циклическая вольтамперометрия (ЦВ) 13

1.2.1.5. Амперометрия 15 1.2.1 .Биосенсоры как перспектива использования электрохимических методов анализа 16 в микробиологических исследованиях и в аналитической химии

1.2.2.1. Биосенсоры для детекции микроорганизмов по продуктам метаболизма 17

1.2.2.2. Иммунобиосенсоры для детекции микроорганизмов 18

1.2.2.3. Геносенсоры для детекции микроорганизмов 19

1.2.2.4. Микробные биосенсоры для количественного определения различных 20 соединений. Биосенсоры для определения формальдегида (ФА)

1.2.2.5. Новые шаги в развитии технологии биосенсоров 23

1.3. Переход в покоящееся состояние — стратегия выживания. Мониторинг 23 физиологического состояния бактерий в стрессовых условиях

1.3.1. Перестройка метаболизма клеток в стрессовых условиях роста. Регуляция 23 изменений метаболизма системой «quorum sensing»

1.3.2. Покоящиеся формы микроорганизмов - формы неспорулирущих бактерий 25

1.3.3. Mycobacterium smegmatis - модель для исследования покоящихся форм рода 26 Mycobacterium

1.3.4. Методы определения покоящихся форм бактерий 28

1.3.4.1. Стандартные микробиологические методы подсчета микроорганизмов 28 (DVC)

1.3.4.2. Технология окрашивания с помощью флуоресцентных красителей 28 (также в сочетании с технологией "flowcytometry")

1.3.4.3. Методы молекулярной биологии (RT-PCR, RT-SDA, FISH, NASBA, DEP) 30 1.3.5. Определение латентных патогенных бактерий. Проблема лечения 30 антибиотиками латентной формы туберкулеза

Глава 2. Материалы и методы 33

2.1. Реактивы 33

2.2. Объекты исследования 33

2.3. Выращивание бактериальных культур 33

2.4. Расчет концентрации бактерий и дрожжей 34

2.5. Контроль бактериального роста 34

2.6. Фильтрация микроорганизмов 34

2.7. Микроскопический анализ клеток 35

2.8. Электрохимический анализ клеток 36

2.8.1. Амперометрический метод определения количества клеток и уровня метаболической активности по величине тока, генерируемого клетками на электроде, прижатом к слою сконцентрированных на микробиологическом фильтре клеток, в присутствии редокс медиатора 36

2.8.2. Амперометрический метод с использованием платинового электрода, изготовленного техникой трафаретной печати 40

2.8.3. Определение скорости потребления кислорода клетками 42 Глава 3. Результаты и обсуждение 44

3.1. Электрохимический метод. Разработка метода 44

3.1.1. Быстрота исполнения метода 44

3.1.2. Сохранение интактности клеток при электрохимических измерениях. Подбор прикладываемых потенциалов 45

3.1.3. Подбор медиатора для электрохимического анализа уровня метаболической активности клеток 47

3.1.4. Оценка доли электронного потока, отводимого из биологической цепи,

для проведения электрохимического анализа 49

3.1.5. Роль экзогенных и эндогенных субстратов в поддержании уровня метаболической активности клеток. Влияние состава среды на величину тока 52

3.1.6. Зависимость величины генерируемого тока от количества бактерий, осажденных на фильтре 53

3.2. Схемы медиаторного переноса электронов с элементов ЭТЦ клеток на электрод 56

3.2.1. Схемы медиаторного переноса электронов для прокариотических клеток 57

3.2.2. Схема медиаторного переноса электронов для эукариотических клеток 60

3.3. Динамика роста и перехода бактерийМусоЬас1епит зтедтайз в стационарную фазу при культивировании в благоприятных условиях и в покоящееся состояние при культивировании в неблагоприятных условиях 61

3.3.1. Дифференциальное уравнение скорости роста популяции клеток и его решение. Применение методов математической статистики для описания экспериментальных данных 61

3.3.2. Динамика изменений метаболической активности бактерий, колониеобразующей способности, оптической плотности суспензии клеток и дыхательной активности. Анализ параметров кривых, сигмоидных и экспоненциальных кривых роста и спада, их физический и биологический смысл 64

3.3.3. Определение концентрации и удельной метаболической активности клеток 68

3.3.4. Анализ электрохимической и дыхательной активностей, отнесенных к единице оптической плотности (ОБбоо) 68

3.3.5. Микроскопический анализ покоящихся форм бактерий 73

3.3.6. Определение количества покоящихся форм бактерий комбинированным методом, сочетающим определение электрохимической активности и колониеобразующих единиц (КОЕ) 74

3.3.7. Преимущества электрохимических методов анализа покоящегося состояния бактерий перед другими современными методами 75

3.4. Анализ действия противотуберкулезного антибиотика рифампицина на метаболическую и пролиферативную активность бактерий М. хте^айз с помощью разработанного амперометрического метода 76

3.5. Биосенсоры для определения формальдегида с использованием

иммобилизованных дрожжевых клеток Натепи1а ро1утогрка 78

3.5.1. Макет кислородного биосенсора для определения концентраций ФА с использованием пермеабилизованных дрожжевых клеток 79

3.5.2. Биосенсор для определения формальдегида в присутствие редокс-медиатора 2,6-ДФИ с использованием интактных дрожжевых клеток Н. ро1утогрка КСА-33 81

3.5.3. Сохранение КАО(Ф)Н-дегидрогеназной активности в пермеабилизованных дрожжевых клетках. 84

3.5.4. Зависимость метаболической активности интактных клеток дрожжей Н. ро1утогрка от культуральной среды 85

Заключение 86

Выводы 88

Список литературы 89

Введение

Быстрое детектирование микроорганизмов, растительных и животных клеток, а также определение их количества и уровня жизнедеятельности является важной задачей для медицинской практики и биотехнологии. Особого внимания заслуживает проблема быстрого детектирования патогенных микроорганизмов при распространении эпидемий, в том числе с появлением угрозы биологического терроризма. Опасность представляют некультивируемые, латентные формы патогенных микроорганизмов, которые способны восстанавливаться и переходить в активное состояние в организме хозяина. Например, покоящиеся клетки Mycobacterium tuberculosis, которые являются, как полагают многие авторы, причиной латентного туберкулеза, до сих пор не были изолированы из тканей хозяина, так как их количество в инфицированных органах или тканях, может быть крайне мало.

Немаловажной проблемой для медицинской практики является необходимость в первичном скрининге антибактериальных препаратов, действующих как на активные, так и на покоящиеся формы патогенных микроорганизмов. Для биотехнологии актуальной остается проблема быстрого селективного анализа малых концентраций агрессивных токсичных соединений.

Для решения этих проблем требуются простые и доступные экспресс методы. Таковыми являются электрохимические методы анализа, основанные на уникальном свойстве живых клеток, содержащих интактную электронтранспортную цепь (ЭТЦ), обмениваться электронами с электродом в присутствии или отсутствии редокс медиаторов. В связи с этим, была сформулирована следующая цель работы.

Цель исследования. Разработать новый вариант амперометрического метода для быстрого определения уровня метаболической активности клеток с целью оценки физиологического состояния клеток при переходе в покоящееся состояние и при воздействии антибиотиков, а также для количественного анализа химически агрессивных соединений с использованием микробных биосенсоров.

Были поставлены следующие задачи:

1. Найти оптимальные условия для наиболее эффективного проведения электрохимического анализа метаболической активности бактерий, позволяющие сохранить интактность клеток в течение всего эксперимента.

2. Установить различия механизмов реакции переноса электронов с компонентов ЭТЦ клеток на электрод в присутствии редокс медиатора для прокариотических и эукариотических клеток.

3. Исследовать динамику перехода МусоЪас1епит хте^ргаНя в стационарную фазу и покоящееся состояние, используя параллельно методы: электрохимический метод, подсчет колоний, измерение оптической плотности, измерение интенсивности дыхания клеток по поглощению кислорода.

4. Изучить действие противотуберкулезного антибиотика рифампицина на метаболическую активность и колониеобразующую способность М. зтецтайз при введении на разных стадиях роста.

5. Разработать макеты электрохимического биосенсора для определения малых концентраций химически агрессивного соединения формальдегида с использованием пермеабилизованных и интактных дрожжевых клеток Натепи1а ро1утогрка.

Список сокращений

АО - алкогольоксидаза

ЭТЦ - электронтранспортная цепь

ЦПМ - цитоплазматическая мембрана

ЦБ - циклическая вольтамперометрия

КОЕ - колониеобразующие единицы

ОБбоо - оптическая плотность при длине волны 600 нм

ФДГ - формальдегиддегидрогеназа

2,6- ДФИ - 2,6- дихлорофенолиндофенол

ФА - формальдегид

Ag/AgCl - хлорсеребрянный электрод

НВЭ - нормальный водородный электрод

НКЭ - насыщенный каломельный электрод

1гоо _ ток в конце 200ой секунды

СУ-электрод - стеклоуглеродный электрод

ТП-электрод - электрод, изготовленный техникой трафаретной печати 1 - удельная электрохимическая активность, отнесенная к единице ООвоо (нА/ед ООбоо) А - удельная дыхательная активность, отнесенная к единице ООбоо (мкМ с*1/ ед ООбоо)

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Электрохимические реакции клеток.

Электрохимические процессы играют существенную роль в жизнедеятельности клеток. Все живые клетки имеют систему энергоснабжения. Эта система может быть различной у разных микроорганизмов: бактерий (автотрофов, хемолитотрофов, органогетеротрофов, аэробов и анаэробов), дрожжей, клеток животных и растений. Но все живые клетки имеют общее - функционирующую ЭТЦ и содержат электронные переносчики в основном белковой природы. Как правило, эта цепь в клетках хорошо изолирована от внешней среды. Для клеток это критически важно, поскольку электрические потери приводили бы к постоянным энергетическим потерям.

Однако существуют специализированные клетки, способные переносить электроны непосредственно на внешние объекты или акцептировать электроны с них. Эти клетки имеют специальную систему для переноса электронов с цитоплазматической мембраны (ЦПМ) на внешние объекты. Эта система электронного переноса хорошо изучена на примере факультативного анаэроба бактерии Shewanella putrefaciens [Myers et. al., 1992]; [Kim et. al., 1999]; [Myers et. al., 2001]. Показано, что во внешней мембране этой бактерии присутствует многогемовый электронный переносчик типа цитохрома с, способный транспортировать электрон сквозь толщу клеточной стенки. Эта бактерия использует окислы железа или марганца в качестве акцепторов электронов. Существуют и другие механизмы транспорта электронов на внешние объекты. Предполагалось, что пили бактерии Geobacter sulfurreducens являются транспортным средством для электронов непосредственно с ЦПМ [Reguera, et. al., 2005]. Однако в последних работах установлено, что многогемовые цитохромы типа с также присутствуют во внешней мембране бактерии Geobacter sulfurreducens и играют существенную роль в реакции переноса электронов на внешние объекты, например, гуминовые вещества почвы [Voordeckers et. al., 2010]. Бактерия Thiobacillus ferrooxidans имеет в оболочке центры, прочно связывающие ионы железа, которые образуют проводящую систему близко подходящую к ЦПМ, что, в свою очередь, облегчает прямое туннелирование электронов [Sand et. al., 2001]. Термофильная бактерия Closrtidium isatidis способна восстанавливать твердые вещества во внешней среде [Compton et. al., 2000].

В природе наблюдаются и другие процессы, в которых микроорганизмы и клетки включаются в реакции электронного обмена с внешними объектами, но для которых не изучены механизмы переноса электрона через клеточную стенку и мембрану.

Установлено, что вещества гумуса могут выполнять функцию акцептора электронов для ЭПД большого числа почвенных бактерий [Lovley et al., 1996]; [Trump et. al., 2006]. Причем гуминовые кислоты могут также служить эффективным шатлом для переноса электрона от бактерии на окислы металлов и другие редокс системы [Kappler et al., 2004].

Таким образом, в природе существует большое количество микроорганизмов прямо участвующих в различных электрохимических превращениях. В настоящее время такого рода микроорганизмы используются в соответствующих технологических процессах. В бактериальной гидрометаллургии тионовые бактерии и, в частности, Tiobacillus ferrooxidans используются для выщелачивания меди, цинка, урана, золота, мышьяка при окислении сульфидных и других соединений [Каравайко и др., 1972]; [Каравайко, 1989]; [Hansford & Vargas, 2001]; [Cabrai & Ignatiadis, 2001]. Бактерии Geobacter sulfurreducens и Shewanella putrefaciens используются в безмедиаторных топливных элементах, как переносчик электронов на электрод при конверсии органических соединений [Gil et. al., 2003]; [Kim et al., 2002]. Известно, что металлические конструкции в морской воде подвергаются интенсивной коррозии при участии бактерий. Для защиты от коррозии корпуса судов покрываются материалами, ингибирующими функционирование бактерий [Beech & Gaylarde., 1999]; [Videla, 2000]. В настоящее время ведутся разработки по защите металлических конструкций с помощью бактерий, в жизненном цикле которых окислы металлов восстанавливаются до металла [Armstrong Е., et. al., 2000].

Таким образом, в природе электрохимические процессы с участием микроорганизмов весьма распространенное явление. Однако, большинство микроорганизмов сохраняют свою систему энергетического жизнеобеспечения тщательно защищенной от внешней среды. Электрохимические реакции таких микроорганизмов на электродах с приложенным потенциалом идут с исключительно малыми скоростями, и величины токов соответствуют по порядку величины токам утечки. При увеличении потенциала до 0,5 - 0,7 В (отн. НКЭ) происходит пробой ЦПМ, и клетка разрушается. Мертвые клетки электрохимически не активны [Allen, 1966]; [Kuznetsov et al., 2004].

Чтобы увеличить чувствительность, работая с интактными клетками необходимо применять редокс медиаторы, способные проникать внутрь клетки. Все компоненты ЭТЦ клеток легко обмениваются электронами с медиаторами, которые при выходе во внешнюю среду разряжаются на электроде [Ксенжек, Петрова, 1986]. Регистрируемые токи увеличиваются при этом в десятки раз.

Электрохимические реакции бактерий, происходящие на электроде в присутствии редокс медиаторов, широко используются в аналитических устройствах для определения

количества клеток и уровня их метаболической активности. Также в аналитической химии распространено конструирование биосенсоров, в которых используются живые клетки, иммобилизованные на электроде. Такие клетки исполняют роль селективных чувствительных элементов для анализа различных соединений [Ка1хПк, е! а1., 1997]; [Ткас, е! а1., 2000]; [Ьее, е! а1., 2002]; [Роро\1жг, е! а1., 2005]. В медицине электрохимические реакции клеток в присутствии редокс медиаторов используются для детекции и определения количества патогенных микроорганизмов, в том числе покоящихся латентных форм бактерий, а также для скрининга антибиотиков и антираковых препаратов [(Заг^ас&агат, 1995]; [Ни е! а1, 2000]; [РШррии, е! а1., 2010].

Механизм переноса электронов с элементов ЭТЦ на электрод в присутствии медиаторов изучен недостаточно. В частности не учитываются процессы переноса электронов между молекулами медиатора на границе фаз, и при прямом контакте клеток с поверхностью электрода, не принимается во внимание возможность туннелирования электронов на электрод с молекул медиатора, локализованных в ЦПМ и внешних слоях клеточной стенки. Сведения такого рода необходимы при конструировании биосенсоров и для разработки методов электрохимического анализа клеток.

1.2. Электрохимические методы.

1.2.1. Исторический обзор.

Все электрохимические методы изучения клеток основаны на уникальном свойстве живых клеток, содержащих интактную ЭТЦ, - обмениваться электронами с электродом в присутствии или отсутствии редокс медиаторов. Особенность электрохимических методов заключается в том, что они являются источником информации о живых клетках, в том числе, и о "некультивируемых" покоящихся микроорганизмах.

Началом электрохимических исследований с активной микробной клеточной системой можно считать 1885 год, когда бактериологами был разработан ряд методов окрашивания микроорганизмов, основанных на способности клеток восстанавливать красители, а именно на редокс реакциях клеточного мет