Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние полиморфизма гена каталазы на индуцированный окислительным стрессом апоптоз лейкоцитов и клеток меланомы кожи

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Влияние полиморфизма гена каталазы на индуцированный окислительным стрессом апоптоз лейкоцитов и клеток меланомы кожи"

На правах рукописи

Комина Анна Владимировна

ВЛИЯНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА КАТАЛАЗЫ НА ИНДУЦИРОВАННЫЙ ОКИСЛИТЕЛЬНЫМ СТРЕССОМ

АПОПТОЗ ЛЕЙКОЦИТОВ И КЛЕТОК МЕЛАНОМЫ КОЖИ

03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1овосибирск - 2014 005558714

005558714

Работа выполнена на кафедре патологической физиологии ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф.Войно-Ясенецкого» МЗ РФ.

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

доцент Рукша Татьяна Геннадьевна

доктор биологических наук,

доцент Постникова Ольга Алексеевна

Официальные оппоненты:

Гуляева Людмила Федоровна, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза ФГБУ НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск).

Архипов Сергей Алексеевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией цитологии и клеточных культур ФГБУ Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН (Новосибирск).

Ведущая организация:

ФГБНУ Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии, лаборатория ультраструктурных исследований (Новосибирск).

Защита состоится: « _» 2015 г. в /^¿час.

на заседании совета Д 001.037.01 в ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН по адресу 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН http://pathomorphology.soramn.ru/

Автореферат разослан « » 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного сове™ доктор биологических

профессор

Молодых Ольга Павловна

Актуальность темы. Разработка и внедрение технологий молеку-лярно-генетического скрининга как основы индивидуализированной медицины обусловливают необходимость исследования механизмов развития патологических состояний в зависимости от мутационного статуса пациента. Оценка только рисков развития патологий, опирающаяся на полиморфизм генов, является недостаточной для создания новых эффективных способов терапии и профилактики заболеваний. Необходимо изучение молекулярно-клеточных процессов, приводящих к патологии клетки в зависимости от генетического статуса.

Одним из основных механизмов повреждения клетки является повышение содержания активных форм кислорода. Эти соединения составляют неотъемлемую часть клеточного метаболизма, в норме они выполняют важные защитные, регуляторные и иные функции (Reth М., 2002; Ree S.G., 2003). При этом уровень активных форм кислорода в клетке регулируется антиоксидантной системой, при нарушении функционирования которой развивается состояние окислительного стресса. Роль последнего доказана в возникновении большого числа заболеваний, в том числе заболеваний кожи, а также формировании нейродегенеративных процессов (Васенина Е.Е., Левин О.С., 2013). Кроме того, окислительный стресс влечет за собой нарушение в клетке процессов, регулируемых активными формами кислорода, — пролиферации, дифференцировки, апоптоза, что может индуцировать развитие злокачественных новообразований (Klaunig J.E., et al., 2010; Grigorov В., 2012).

Каталаза является одним из наиболее значимых ферментов антиоксидантной системы. Ее основной функцией считают утилизацию пероксида водорода в условиях окислительного стресса. В многочисленных экспериментальных исследованиях неоднократно описывались различные изменения функционирования каталазы, вызванные, в том числе, мутациями в гене, кодирующем данный фермент. Показано, что это может приводить к повышению рисков развития ряда заболеваний (Chistiakov D.A. et al., 2005; Ahn J. et al., 2006; I-lebert-Schuster M. et al., 2012). Так, однонуклеотидную замену ОТ в промоторной части гена каталазы в положении -262 связывают как с изменением активности данного фермента в клетках, так и с уровнем его экспрессии (Forsberg L. et al., 2001). Это вызывает изменение рисков развития таких заболеваний, как атеросклероз, бронхиальная астма, асбестоз и др. (Franko А. et al., 2008; Letonja М. et al., 2011; Babusikova E. et al., 2013). Однако механизмы нарушений, происходящих в клетке с изменением функциональной активности каталазы, до конца не исследованы.

Клетки кожи в высокой степени подвержены воздействию активных форм кислорода, что связано с развитием меланомы, базалыю-клеточного и плоскоклеточного рака кожи из-за изменений процессов передачи сигнала, появления нестабильности генома, нарушений динамики клеточного цикла (Swalwell Н., 2012; Taddei M.L., 2012). Возможности индукции апоптоза в опухолевых клетках рассматривают в качестве перспективного

направления в терапии злокачественных новообразований (Luo T.Y. et al., 2014; Zhang S. etal., 2014). Пероксид водорода, утилизируемый каталазой, играет важную роль в регуляции апоптоза (Clcmenta M.-V. et al., 1998; Cerella С. et al., 2009). Нарушения апоптоза наблюдаются при развитии злокачественных новообразований, что обеспечивает жизнеспособность опухоли.

Реализация апоптоза происходит в различных типах клеток с помощью разных молекулярных механизмов, что важно учитывать при разработке эффективных средств противоопухолевой терапии. В этом аспекте одной из перспективных мишеней для индукции апоптоза опухолевых клеток может быть белок-транслокатор TSPO, который может принимать участие в индукции апоптоза с помощью разных механизмов (Грачев Д. Е., 2009).

На основе вышесказанного исследование биологического поведения клеток с различными антиоксидантными свойствами, а также их функционирования в условиях окислительного стресса как одного из факторов развития патологических изменений, имеет существенное значение для понимания как механизмов опухолевого роста, так и разработки новых подходов терапии злокачественных новообразований.

Цель работы - изучить влияние полиморфизма гена каталазы на жизнеспособность и уровень апоптотической и некротической гибели лейкоцитов и опухолевых клеток кожи при индукции окислительного стресса.

Задачи исследования:

1. Выявить особенности активности каталазы в нормальных и опухолевых клетках в зависимости от варианта полиморфизма С262Т гена каталазы.

2. Оценить активность каталазы в мононуклеарных лейкоцитах с различным генотипом С262Т и клетках меланомы кожи в условиях окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода в диапазоне концентраций 400 - 1000 мкмоль/л.

3. Оценить выраженность апоптоза мононуклеарных лейкоцитов в зависимости от активности каталазы, а также клеток меланомы кожи в условиях окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода в диапазоне концентраций 400 - 1000 мкмоль/л.

4. Определить изменения экспрессии апоптоз-ассоциированного белка TSPO под воздействием окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода в диапазоне концентраций 400 - 1000 мкмоль/л в зависимости от активности каталазы.

5. Оценить связь между экспрессией TSPO и выраженностью апоптоза, индуцированного пероксидом водорода, и определить функциональную роль TSPO в реализации изменений, вызванных окислительным стрессом.

Научная новизна. Впервые произведено исследование активности каталазы в условиях окислительного стресса в клетках с различными физиологическими уровнями активности каталазы в зависимости от варианта полиморфизма гена каталазы. Впервые оценена жизнеспособность

клеток, их устойчивость к окислительному стрессу, индуцированному пероксидом водорода, в зависимости от уровня активности каталазы.

Впервые показано, что лица, обладающие «диким» вариантом генотипа каталазы -262СС, имеют повышенный риск развития меланомы и плоскоклеточного рака кожи по сравнению с лицами, содержащими мутантный аллель в данном положении гена каталазы (-262СТ и -262ТТ).

Впервые выявлено, что изменение уровня митохондриального апоптоз-ассоциированного белка Т8РО напрямую не связано с выраженностью окислительного стресса, индуцированного действием пероксида водорода, что может свидетельствовать об отсутствии роли данного белка в развитии апоптоза.

Теоретическая и практическая значимость. Произведена характери-зация биологического поведения клеток мононуклеарных лейкоцитов и меланомы кожи в зависимости от эффективности работы каталазы, выявлены различия их функциональной активности при индукции окислительного стресса пероксидом водорода в концентрациях 400 мкмоль/л, 700 мкмоль/л и 1000 мкмоль/л, что может быть применено для разъяснения патогенеза заболеваний, сопряженных с развитием окислительного стресса.

Полученные экспериментальные данные о различии в распределении полиморфизма С-262Т среди здоровых людей и больных меланомой кожи и плоскоклеточным раком кожи указывают на значимость полиморфизма С-262Т в прогнозировании развития меланомы кожи и плоскоклеточного рака. Это позволяет расценивать полиморфизм С-262Т гена каталазы как один из критериев при оценке риска развития меланомы кожи и плоскоклеточного рака кожи, что необходимо учитывать при разработке способов профилактики данных заболеваний.

Выявлено, что снижение устойчивости мононуклеарных лейкоцитов к окислительному стрессу связано с конститутивной активностью каталазы, зависит от генотипа, что, соответственно, может обусловливать дифференцированную роль фермента в развитии патологических изменений, индуцированных окислительным стрессом.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Полиморфизм гена каталазы С262Т определяет различную активность фермента в клетках периферической крови, а также меланомы кожи.

2. При краткосрочной индукции окислительного стресса активность каталазы является стабильной и не зависит от мутационного статуса гена, при этом мононуклеарные лейкоциты с генотипом ТТ и сниженной активностью каталазы обладают меньшей устойчивостью к окислительному стрессу, что выражается в индукции некроза и апоптоза в данном типе клеток.

3. Меланома клеточной линии Вго обладает чувствительностью к окислительному стрессу, индуцированному пероксидом водорода в концентрации 1000 мкмоль/л, демонстрируя при этом изменение доли живых, апоптотических и некротических клеток.

4. Экспрессия гена ТБРО в мононуклеарных лейкоцитах в условиях окислительного стресса, индуцированного пероксидом водорода, не коррелирует с концентрацией пероксида водорода и уровнем апоптоза в клетках, что может являться свидетельством отсутствия роли данного белка в редокс-зависимом апоптозе.

Внедрение результатов исследования. Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, внедрены в учебный процесс кафедры патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии имени проф. В.В.Иванова ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого Минздрава РФ».

Апробация работы. Основные положения диссертации изложены на VII Сибирском физиологическом съезде с международным участием (Красноярск, 2012), заседании проблемной комиссии ГБОУ ВПО КрасГ-МУ Минздрава РФ (протокол заседания № 1 от 25.04.2012) и заседании проблемной комиссии ГБОУ ВПО КрасГМУ Минздрава РФ (протокол заседания № 4 от 16.06.2014).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе в 3 журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования статей, содержащих результаты диссертационных исследований.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа содержит 15 рисунков, 3 таблицы. Библиографический список содержит 137 источников, из которых 34 отечественных и 103 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Биопсийный материал меланомы кожи и плоскоклеточного рака кожи был получен из Краевого государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Красноярское краевое патологоанатомическое бюро». Культура клеток меланомы кожи человека ВГЮ была получена в Институте клинической иммунологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. На проведение исследования получено разрешение Локального этического комитета КрасГМУ (№ 36/2011 от 22.12.2011).

Для определения варианта полиморфизма гена САТ С-262Т, ассоциированного с активностью каталазы, в нормальных клетках использованы образцы венозной крови, взятые у здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет, у которых на момент исследования не было выявлено заболеваний, в том числе связанных с нарушением окислительно-восстановительных процессов. Количество исследуемых включало 103 человека, которые составили контрольную группу при оценке особенностей распределения частот полиморфизма С-262Т гена каталазы в опухолевых клетках. Среди исследуемых здоровых добровольцев было 82 женщины (средний возраст 24,35±6,80 лет) и 21 мужчина (средний возраст 22,14±3,60 лет).

Для определения полиморфизма каталазы С-262Т в опухолевых клетках исследованы 50 биоптатов первичной меланомы кожи различной локализации. Наиболее часто меланома локализовалась на лице (31,7%), верхних конечностях (21,4%), шее (14,6%), нижних конечностях (12,2%). Исследованы также 50 биоптатов плоскоклеточного рака кожи, полученные от онкологических больных Красноярского краевого онкологического диспансера.

Среди пациентов с меланомой кожи было 63% женщин и 37% мужчин. Средний возраст женщин составил 50,28±14,34 лет (18-76 лет), возраст мужчин —53,07±12,17 лет (29- 75 лет). Среди пациентов с плоскоклеточным раком кожи преобладали мужчины (71,1 %). Средний возраст женщин составил 66,9±13,83 лет (48 - 82 года), мужчин - 62,03±14,50 лет (24-81 год). Основным местом локализации плоскоклеточного рака была кожа головы (включая расположение на нижней губе, ушной раковине, нижней челюсти) — 76,0 %. Различия в возрасте здоровых лиц и пациентов с новообразованиями кожи были признаны не оказывающими влияние на результат исследования на основании данных, показавших, что распределение полиморфизма С-262Т гена каталазы в различных возрастных группах людей в возрасте от I до 75 лет достоверно не различается (Паук В.В. и др., 2008).

Выделение ДНК и ПДРФ-аналнз. Выделение ДНК осуществляли при помощи комплекта реагентов ДНК-сорб В (Amplisens, Россия). Для получения ДНК из биоптатов кожи, заключенных в парафиновые блоки, производили предварительную депарафинизацию ксилолом по стандартной методике.

Определение варианта полиморфизма гена каталазы в нормальных и опухолевых клетках проводили методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ). Праймеры (ООО «Сибэн-зим», Новосибирск) были созданы по ранее описанной последовательности (Zarbock R. et al., 2007) для представления сайта рестрикции EcoR V (BioLabs, New England) в диком аллеле (GATATC). После постановки реакций амплификации и рестрикции ампликонов эндонуклеазой EcoR V осуществляли электрофоретическое разделение рестриктов в 10% полиакриламидном геле и оценку их длин при окраске бромистым этидием. В случае отсутствия в гене каталазы нуклеотидпой замены в положении -262, ПЦР продукты разрезались на фрагменты длиной 157 п.н. и 33 п.н. При наличии замены (предположительно С-262Т) сайт узнавания рестриктазой нарушался, и ампликон длиной 190 п.н. оставался неразрезанным.

Выделение мононуклеарных лейкоцитов из периферической крови здоровых добровольцев осуществляли посредством градиентного центрифугирования с раствором Диакол (Диа-М, Россия). Клетки мононуклеарных лейкоцитов и меланомы клеточной линии Вго культивировали в питательной среде RPMI-1640 с добавлением бычьей фетальной сыворотки (10%)

и антибиотиков (100 ЕД/мл пенициллина и 0,25 мкг/мл амфотерицина В).

Индукция окислительного стресса. Индукцию окислительного стресса производили добавлением в культуральную среду пероксида водорода до конечных концентраций 400 мкмоль/л, 700 мкмоль/л и 1000 мкмоль/л. Для оценки уровня активности каталазы в условиях окислительного стресса после индукции инкубирование продолжали в течение 1 ч, для оценки выраженности клеточного апоптоза - 24 ч.

Анализ активности каталазы. Активность каталазы оценивали фотометрическим методом на спектрофотометре СФ-46 (JIOMO, Россия) по методике (Королюк М.А. и др., 1988). Полученное значение активности каталазы в эритроцитах отражало число миллимолей пероксида водорода, разрушенных каталазой за 1 мин в пересчете на 1 г гемоглобина. Активность каталазы в мононуклеарных лейкоцитах выражали в относительных единицах по сравнению с активностью в контрольных образцах, не подвергавшихся индукции окислительного стресса. Значение активности каталазы в контрольных образцах в этом случае принимали за единицу.

Оценка выраженности апоптоза и некроза клеток. Выраженность апоптоза оценивали визуально при помощи окраски клеток акридиновым оранжевым/бромистым этидием (АО/ЕВ) (Gerbu Biothechnick GmbH, MP Biomedicals Inc.) (Ribble D. et al., 2005). Концентрация каждого красителя составляла 8 мг/мл. При этом живая клетка под микроскопом имела округлую форму, крупное ядро, имеющее относительно равномерную окраску и занимающее почти всю клетку, четкий ровный контур. Апоптотические клетки распознавали по конденсированному, иногда фрагментированному содержимому, окрашенному в зеленый, реже желтый, цвет. Некротические клетки приобретали яркое красно-оранжевое окрашивание.

Живые клетки меланомы линии Вго при окраске акридиновым оранжевым/бромистым этидием отличались крупными размерами и неровной поверхностью; их цитоплазма и ядро также равномерно окрашивались в зеленый цвет. В апоптотических клетках присутствовало ядро желто-оранжевого цвета. Некротические клетки имели красно-оранжевую окраску.

Подсчитывали долю живых, апоптотических и некротических клеток в культуре при исследовании в флуоресцентном микроскопе (увеличение х400). Анализировали не менее 100 клеток.

ПЦР в реальном времени. Для измерения относительного уровня экспрессии белка- гранслокатора TSPO в клетках производили выделение мРНК из мононуклеарных лейкоцитов с использованием комплекта реагентов «Рибо-золь В» (AmpliSens, Россия) по прилагаемому протоколу. После выделения РНК осуществляли реакцию обратной транскрипции с применением комплекта реагентов «Реверта» (AmpliSens, Россия). Полученную кДНК использовали для постановки ПЦР в реальном времени. Использовали специфичные праймеры к TSPO (TaqMan®Assay, Applied Biosystems, США). В качестве эндогенного контроля использовали Р-актин (Human АСТВ (Beta Actin) Endogenous Control; Applied Biosystems,

США). Рассчитывали относительное количество (relative quantitation, RQ) TSPO в клетках с индукцией окислительного стресса по сравнению с контрольной культурой. В контрольной культуре уровень TSPO принимали за единицу.

Статистическая обработка результатов. Относительные шансы развития новообразований рассчитывали как отношение содержания Т и С аллелей в образцах новообразований кожи по сравнению с таковым в контрольной популяции. Для оценки относительных шансов (Odds ratio, OR) и 95% доверительного интервала (Confidence Interval, CI) использовали программу GraphPad InStat v3.10. Результаты исследования активности каталазы, а также данные по оценке выраженности апоптоза и уровня мРНК белка-транслокатора сравнивали с помощью непараметрического критерия Крускала-Уоллиса с использованием программы Statistica 6.0. Достоверность различий в доле живых клеток в образцах мононуклеар-ных лейкоцитов с нормальной активностью каталазы и клетках меланомы линии Вго при равных концентрациях пероксида водорода осуществляли по U-критерию Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Формирование групп нормальных клеток с различной активностью каталазы. Выявление клеточных культур с различными уровнями активности каталазы представляет некоторые затруднения в силу отсутствия явного фенотипического проявления сниженной активности каталазы. Однако существует множество исследований, показавших, что активность каталазы связана с полиморфизмом С-262Т в кодирующем ее гене CAT (Forsberg L. et al., 2001; Nadif R. et al., 2005; Ahn J. et ai., 2006; Bastaki M. et al., 2006). Поэтому первым этапом работы стало определение варианта полиморфизма С-262Т гена CAT в мононуклеарных лейкоцитах здоровых добровольных доноров с целью получения групп с различными вариантами полиморфизма, а значит и активностью каталазы. В результате проведенного исследования было получено 3 группы культур мононуклеарных лейкоцитов с вариантами полиморфизма: -262СС, -262СТ и -262ТТ. В каждой группе определяли активность каталазы в эритроцитах, поскольку мембрана эритроцитов рассматривается как модельный индикатор окислительно-восстановительного статуса клетки и организма в целом (Кашулина А.П., 2011).

Результаты измерения активности каталазы в образцах подтвердили предположение, что нуклеотидные замены в положении -262 отражаются на активности каталазы (рис. 1). В образцах с гетерозиготным вариантом СТ активность фермента снизилась на 13% и составила 0,58 ммоль/г белка-мин по сравнению с 0,66 ммоль/г белка-мин в образцах СС (р = 0,035). Аналогичное снижение было отмечено в образцах с заменами в обоих аллелях гена (-262ТТ) - 0,58 ммоль/г белка-мин (р = 0,016).

*

сз ¡3

О

3

сс ст тт

варианты генотипов

Рис. 1. Активность каталазы в эритроцитах здоровых добровольцев с различными вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы. Данные представлены в виде медианных значений и верхних и нижних квартилей. * - различия достоверны по критерию Крускала-Уоллиса (р<0,05).

Полученные данные по активности каталазы в эритроцитах согласуются с результатами других исследователей: активность каталазы в клетках с генотипами ТТ и СТ достоверно ниже таковой в клетках с «диким» вариантом генотипа - СС. Однако, согласно результатам исследований, нуклеотидные замены -262ТТ и -262СТ в гене каталазы могут иметь различные проявления в виде изменения рисков развития тех или иных заболеваний (Ююскуап Б. с! а!., 2013; Гейк Т. ег а1., 2013). Поэтому, несмотря на близость значений активности каталазы в двух группах с мутацией С-262Т, для дальнейшего исследования нами были оставлены все три группы клеток.

Сравнение распределения полиморфизма С-262Т гена каталазы в здоровых и опухолевых клетках. На следующем этапе работы было исследовано распределение полиморфизма С-262Т в промоторной части гена каталазы у пациентов в клетках меланомы кожи и плоскоклеточного рака кожи по сравнению со здоровой группой для выявления возможных изменений активности каталазы.

При исследовании полиморфизма в клетках меланомы кожи генотипы -262СТ и ТТ не были выявлены ни в одном из образцов. Частота аллеля С составила 1,0.

При анализе полиморфизма гена каталазы в клетках меланомы клеточной линии Вго было обнаружено, что в них нет мутации -262С>Т в промоторной области каталазы. Это свидетельствует о том, что клетки меланомы Вго относятся к «дикому» типу (генотипа СС) (рис. 2), что совпадает с результатами, полученными в образцах опухолевой ткани.

Исследования ДНК образцов плоскоклеточного рака показали наличие мутации в гетерозиготном состоянии (СТ) в 5 случаях из 50 (частота генотипа р = 0,10). Гомозиготный мутантный вариант ТТ выявлен не был.

0,8 § 0,7 § 0.6

12 3 4

Рис. 2. Электрофорез ДНК-фрагментов гена каталазы в нормальных клетках и клетках меланомы линии Вго после рестрикции эндонуклеазой EcoR V. I - маркерная ДНК ЮОЬр Ladder (Медиген, Россия); 2 - образец с вариантом генотипа -262СТ; 3 - образец с вариантом генотипа -262СС; 4 - образен ДНК меланомы клеточной линии BRO.

Остальные 47 образцов (р = 0,95) не содержали мутантного аллеля. Частота аллеля "Г в клетках кожи при плоскоклеточном раке составила 0,05.

Отношение шансов развития меланомы кожи ОЯ в исследуемых группах составило 0,022 (95% достоверный интервал 0,001-0,36, р<1 • 10-4). Для плоскоклеточного рака данный показатель равен 0,24 (95% достоверный интервал 0,09-0,67, р = 6,7-10-3). У лиц с генотипами -262СТ и -262ТТ шанс развития меланомы кожи в 45,5 раз ниже, а шанс развития плоскоклеточного рака кожи в 4,2 раза ниже, чем у людей с диким вариантом -262СС.

Подобный феномен можно объяснить необходимостью поддержания стабильной концентрации активных форм кислорода для обеспечения жизнеспособности клеток.

Возможно, именно поэтому для развития опухоли необходима эффективная работа антиоксидантной системы, не имеющая дефектов. Можно предположить, что антиоксидантная система клетки с мутантным генотипом Т/Т в промоторной части гена каталазы в положении -262 является менее эффективной за счет сниженной активности каталазы. В этом случае опухолевая клетка, не сумев поддержать концентрацию активных форм кислорода, необходимую для роста и развития, переходит в состояние апоптоза.

Согласно многочисленным исследованиям, риск развития меланомы кожи связан с фототипом кожи. Доказано, что лица с 1 и 11 фототипами кожи по классификации Д. Фитцпатрика (люди с белой или светлой кожей, способной образовывать лишь незначительное количество пигмента под действием солнечных лучей) обладают повышенным риском развития меланомы кожи (Фитцпатрик Д.Е., Элинг Д.Л., 1999; Кудрявцев Д.В. и др., 2006). Можно предположить, что сочетание светлого фототипа кожи с высокой активностью каталазы, обусловленной, в частности, генотипом

-262СС, является прогностическим фактором и может быть учтено при разработке мер по профилактике онкологических заболеваний кожи. Лицам с таким сочетанием признаков следует воздерживаться от длительного воздействия ультрафиолетового облучения.

Определение активности каталазы в лейкоцитах периферической крови в состоянии окислительного стресса. Несмотря на отсутствие значимых проявлений сниженной активности каталазы в организме в физиологическом состоянии, в ряде работ отмечено изменение риска развития некоторых заболеваний, связанных с действием активных форм кислорода в зависимости от наличия мутации в гене каталазы. Это позволяет предположить, что существенные изменения в работе антиоксидантной системы в этом случае возникают не в норме, а в ответ на окислительный стресс, когда каталаза играет ключевую роль в работе антиоксидантной системы (Mueller S. et al., 1997). В этой связи задачей следующего этапа данной работы было определение характера изменений, происходящих в нормальных и опухолевых клетках, различных по С262Т генотипу каталазы, в условиях окислительного стресса.

Окислительный стресс был индуцирован в мононуклеарных лейкоцитах 9 лиц с различными вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы посредством добавления пероксида водорода в культуру до конечных концентраций 400, 700 и 1000 мкмоль/л (рис. 3). Для оценки изменения активности каталазы на окислительный стресс опирались на данные исследований, показавших, что цитотоксический эффект пероксида водорода на клетки глиомы зависит от его концентрации в культуре клеток (Gülden М. et al., 2010). На основе данных этого исследования было выбрано время инкубации в присутствии пероксида водорода - 1 ч.

Несмотря на кажущуюся очевидной тенденцию, статистически значимой корреляции между концентрацией пероксида водорода в куль-туральной среде и изменением активности каталазы в мононуклеарных лейкоцитах ни для одного из вариантов полиморфизма CAT С-262Т выявлено не было. Значение критерия Крускала-Уоллиса составило: для варианта СС - Н = 7,15 (р=0,067), для варианта CT - Н = 5,43 (р=0,143) и для варианта TT - Н = 2,94 (р=0,401). При сравнении по критерию Крускала-Уоллиса образцов с различными вариантами полиморфизма при равных концентрациях Н202 в культуралыюй среде достоверных различий в относительном значении активности каталазы выявлено не было (р<0,05). Значение Н-критерия для трех вариантов полиморфизма для образцов с 400 мкмоль/л Н202 составило 3,82 (р=0,15), для 700 мкмоль/л Н202 - 5,42 (р=0,07), для 1000 мкмоль/л Н202 - 5,60 (р=0,06).

При оценке активности каталазы в клетках меланомы клеточной линии Вго также не наблюдалось достоверных изменений при инкубации в присутствии пероксида водорода в различных концентрациях. Значение относительной активности фермента колебалось около контрольного (Н = 1,17, р=0,760).

£ 1,5 г

¿5 [Н202], мкмодь/л

—•—вариант СС ~~ вариант CT —•—вариант TT

Рис. 3. Зависимость активности каталазы в мононуклеарных лейкоцитах от концентрации пероксида водорода в кулыуральной среде. Значение активности каталазы в культуре без пероксида водорода принято за единицу (данные представлены в виде медианных значений и верхних и нижних квартилей).

Таким образом, краткосрочный ответ на окислительный стресс, индуцированный пероксидом водорода, в клетках с различной конститутивной активностью каталазы оказался однотипным. И хотя нельзя не отметить близкое к достоверному повышение активности каталазы в образцах группы СС (р = 0,067), возможно, более важным в данном случае является рассмотрение активности в условиях окислительного стресса с позиции базовой активности каталазы, так как изначально активность данного фермента в группах CT и TT была ниже, чем в группе СС. При возникновении окислительного стресса она не изменилась, оставшись на прежнем, пониженном, уровне. Данный факт, вероятно, не может не отразиться на дельнейшем поведении клеток в условиях окислительного стресса. С этих позиций можно объяснить изменение рисков развития патологий, связанных с действием активных форм кислорода.

Оценка выраженности аноптоза клеток при индукции окислительного стресса. Возможное изменение активности антиоксидантных ферментов при продолжительном окислительном стрессе предполагает изменения функционировании клеток, подверженных стрессу.

Окраска клеток акридиновым оранжевым/бромистым этидием позволяет довольно четко разделить живые, апоптогические и некротические клетки (Ribble D. et al., 2005). Живые лейкоциты идентифицировались как ровные клетки округлой формы, имеющие относительно равномерное окрашивание внутреннего содержимого в зеленый цвет (рис. 4, А).

На стадии раннего аноптоза клеточное ядро приобретало неправильную форму, внутреннее содержимое ядра и клетки в целом конденсировалось, окрашиваясь более интенсивно, чем остальная часть клетки. За счет выпячиваний цитоплазмы, контур клетки становился неровным и размытым (рис. 4, Б). На более поздних стадиях в клетках была заметна

Рис. 4. Мононуклеарные лейкоциты при окраске акридиновым оранжевым/ бромистым этидием.

А - живые клетки имеют четкий контур, округлую форму и равномерное окрашивание содержимого в зеленый цвет: Б - клетки в состоянии раннего апоптоза отличаются конденсированным содержимым и нечетким контуром.

фрагментация ядра, проявляющаяся в виде скопления нескольких ярко-зеленых округлых образований внутри цитоплазмы одной клетки. Сама цитоплазма при этом имела гораздо более слабое окрашивание в зеленый либо оранжевый цвет. Клетки, близкие к завершению апоптоза, имели вид скоплений мелких округлых апоптотическях телец. Некротические клетки окрашивались в красно-оранжевый цвет, контрастируя с живыми и апоптотическими клетками.

В результате эксперимента показано постепенное снижение числа живых клеток во всех культурах мононуклеарных лейкоцитов с ростом концентрации пероксида водорода (рис. 5). При 1 ООО мкмоль/л Н202 процент живых клеток в группе СС достоверно снизился с 95.9 до 62,33% (р=0,013), в группе СТ- с 95,05 до 54.81 % (р=0,013), в группе ТТ- с 95,59 до 42,64% (р=0,019). Параллельно росла доля апоптотических клеток. При 1000 мкмоль/л Н202 в группе СС она составила 23,08%о (р=0,013), в группе С Г - 3 1,11 % (р=0.013). В группе клеток с низкой активностью каталазы и генотипом -262ТТ снижение доли живых клеток при 1000 мкмоль/л пероксида водорода происходило за счет не апоптотических, а некротических клеток (18,85%; р=0,013).

При межгрупповом сравнении по непараметрическому критерию Кру-скала-Уоллиса выявлено повышение содержания некротических клеток в группе -262ТТ относительно СС при концентрации пероксида водорода 400 мкмоль/л (р=0,034). При увеличении концентрации пероксида водорода до 700 мкмоль/л в группе "ГТ доля клеток стала достоверно ниже таковой в группе СС: 54,44 по сравнению с 69,53% клеток (р=0,022), Доля апоптотических клеток в ТТ-группе составила 34,44%, что значимо выше, чем в группе СС (17,19%, р=0.022).

В гетерозиготных образцах -262СТ доли живых, апоптотических и некротических клеток статистически значимо не отличались от таковых в образцах СС и ТТ.

сс

*

[Н202], мкмоль/л

тт

*

|Н202], мкмоль/л

□ живые клетки ЕЗ апоптотические клетки Н некротические клетки

ст

[Н20-|, мкмоль/л

Рис 5. Сравнительное распределение долей живых, апоптотических и некротических клеток мононуклеарных лейкоцитов с различными вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы в зависимости от концентрации перок-сида водорода в культуральной среде (представлены медианные значения и верхний и нижний квартили). * - р<0,05 для клеток одного варианта генотипа С-262Т при различных концентрациях пероксида водорода. Цифрами 1-5 обозначены достоверные различия в доле клеток между генотипами СС и ТТ при равных концентрациях пероксида водорода при р < 0,05 (при множественном сравнении по Н-критерию Крускала-Уоллиса).

Полученные результаты позволяют заключить, что мононуклеарные лейкоциты с вариантами полиморфизма -262СС и -262СТ гена каталазы обеспечивают более адекватный ответ на окислительный стресс, вызванный пероксидом водорода. И только концентрация Н202 1 ООО мкмоль/л становится для них критичной, повышая долю некротических клеток. В это же время для клеток -262ТТ даже при небольшой концентрации пероксида водорода 400 мкмоль/л показана сниженная устойчивость к окислительному стрессу. И даже в том случае, когда клетка может обеспечить адекватный ответ в виде перехода в состояние апоптоза (при более высоких концентрациях), доля апоптотических клеток для группы ТТ оказывается выше, чем для группы СС при аналогичных условиях.

Клетки с гетерозиготным вариантом CT в положении -262 гена CAT показывают сниженную активность каталазы, но, очевидно, это снижение не столь критично, чтобы приводить к значимому снижению устойчивости клеток к окислительному стрессу по сравнению с клетками с вариантом ТТ. Генотип -262СТ оказывается промежуточной формой при изменении работы каталазы за счет мутации. Снижается активность фермента, но в этом случае, возможно, компенсаторных механизмов в клетках оказывается достаточно для того, чтобы поддерживать про/антиоксидантный баланс даже в состоянии окислительного стресса. Напротив, при наличии мутации в обоих аллелях гена изменения активности каталазы оказываются более значимыми и уже не могут быть компенсированными.

Предшественниками клеток меланомы яв.1[яются меланоциты, характеризующиеся высокой устойчивостью к окислительному стрессу благодаря пигменту меланину. Можно полагать, что клетки меланомы линии Вго, не содержащие мутации С-262Т в промоторной части гена каталазы и в отсутствие изменений активности данного фермента в условиях окислительного стресса, будут обладать хорошей выживаемостью в присутствии пероксида водорода.

После инкубации с пероксидом водорода в концентрациях 400, 700 и 1 ООО мкмоль/л и окраски акридиновым оранжевым/бромистым этидием в культуре клеток меланомы линии Вго наблюдался небольшой рост числа клеток с признаками апоптотической гибели. Происходило достоверное снижение доли живых клеток в культурах, инкубированных с 1000 мкмоль/л пероксида водорода, однако даже при этой концентрации выживаемость клеток меланомы составила 79,81% (р=0,019), что значимо выше доли живых клеток в аналогичной культуре мононуклеарных лейкоцитов с нормальной активностью каталазы (сравнение по критерию Манна-Уит-ни, р=0,049 для каждой пары показателей). Число апоптотических клеток в этом случае составило 17,65% (р=0,019). Доля некротических клеток значимо не изменилась (рис. 6).

Более высокая устойчивость к окислительному стрессу клеток меланомы по сравнению с мононуклеарными лейкоцитами вполне объяснима. И все же клетки меланомы Вго показывают достоверное снижение доли живых клеток при воздействии 1 ммоль/л пероксида водорода, той же концентрации, что и лейкоциты. Вопреки предположениям, клетки меланомы обладают чувствительностью к пероксиду водорода, хоть и в меньшей степени, чем лейкоциты.

Ранее было показано, что в клетках меланомы под воздействием прооксидантов может наблюдаться повреждение митохондрий и клетки в целом (Newman R.A. et al„ 2006). Активные формы кислорода были названы поэтому «ахиллесовой пятой» меланомы (Fruehauf J.P., Trapp V., 2008). Однако в других исследованиях показано, что повышение уровня активных форм кислорода, влекущее за собой гибель части клеток, может способствовать активации процессов пролиферации и метастазирования в

120 -100

80 -60 40 -20

0

0

1000

400 700

[Н202], мкмоль/л □ живые клетки Ианоптоз в некроз

Рис. 6. Сравнительное распределение долей живых, апоптотических и некротических клеток в культуре меланомы Вго в зависимости от концентрации пероксида водорода в культуре. * - р<0,05.

других клетках опухоли (Sander С. S. et al., 2003), что соответствует современным представлениям о гетерогенности опухолевой ткани. При оценке устойчивости одиннадцати раковых клеточных линий (не включающих рак кожи) показано, что лишь 55% исследуемых клеточных линий устойчивы к воздействию пероксида водорода, причем это связано с уровнем активности каталазы (Klingelhoeffer С. et al., 2012).

Следовательно, устойчивость клеток меланомы к апоптозу, индуцированному окислительным стрессом, может зависеть от типа клеточной линии меланомы. В таком случае, несмотря на наличие чувствительности клеток меланомы отдельных клеточных линий, включая линию Вго, к окислительному стрессу, индуцированному пероксидом водорода, для разработки новых подходов к терапии данного злокачественного новообразования метод индукции апоптоза в клетках активными формами кислорода может оказаться неприемлемым. Возможность использования такого метода требует уточнения.

Определение уровня экспрессии белка-транслокатора (TSPO) в лейкоцитах при индукции окислительного стресса в клетках в зависимости от полиморфизма С-262Т гена каталазы. TSPO рассматривается как маркерный белок митохондриального сигнального пути апоптоза (Corsi L. et al., 2008; Xiaolong Q. et al., 2012). Помимо этого, в ряде работ продемонстрирована роль TSPO в продукции активных форм кислорода в клетке (Lehtonen M.N., 2012; Zeno S., 2012). В этой связи определение уровня TSPO в нормальных и опухолевых клетках с различными вариантами полиморфизма гена каталазы может объяснять особенности развития апоптоза в этих системах.

Вместе с тем, в настоящем исследовании было отмечено отсутствие корреляции между вариантом полиморфизма С-262Т в промоторной части гена каталазы и изменением уровня TSPO для всех исследуемых

7 6

О 200 400 600 800 1000

[Н202], мкмоль/л

—Ф—СС —в— СТ —А— ТТ

Рис. 7. Относительное количество мРНК ТБРО к р-актину (Я(3) в культурах мононуклеарных лейкоцитов с различными вариантами полиморфизма С 262Т гена каталазы в зависимости от концентрации пероксида водорода в культуре.

образцов. Более того, изменения уровня мРНК белка-транслокатора относительно мРНК Р-актина оказались разнонаправленными и не поддавались единому объяснению. Для многих образцов наблюдался значимый дозозависимый эффект концентрации пероксида водорода на уровень экспрессии ТБРО.

При статистической обработке данных по группам с различными вариантами полиморфизма С-262Т были получены медианные значения, не имеющие достоверных различий ни при изменении концентрации пероксида водорода, ни между вариантами полиморфизма для каждой концентрации (рис. 7).

Полученные результаты указывают на то, что воздействие экзогенного пероксида водорода имеет иной механизм индукции апоптоза, нежели при его эндогенном возникновении. В большинстве исследований мы встречаем информацию о том, что пероксид водорода обладает высокой проницаемостью через мембраны клеток, однако делаются попытки опровергнуть это утверждение (втепшкоуа У.О., 2010). Это также может объяснить полученные нами результаты: недостаточная проницаемость через мембраны не позволяет пероксиду водорода быстро проникнуть в клетку и достичь митохондриальной мембраны. В этом случае молекулы пероксида водорода в первую очередь могут приводить к активации рецепторов клеточных мембран, стимулируя, например, рецепторный сигнальный путь апоптоза. Кроме того, полученные результаты также позволяют предположить, что пероксид водорода не оказывает влияния на уровень апоптоз-ассоциированного митохондриального белка Т8РО в клетке, либо оказывает на него влияние в совокупности с рядом дополнительных факторов.

выводы

1. Полиморфизм гена катапазы С-262Т обусловливает изменение активности каталазы в нормальных (мононуклеарные лейкоциты) и опухолевых клетках (клетки меланомы кожи и плоскоклеточного рака кожи).

2. В мононуклеарных лейкоцитах и клетках меланомы в условиях окислительного стресса, вызванного пероксидом водорода в диапазоне концентраций 400 - 1000 мкмоль/л, сохраняется стабильная активность каталазы вне зависимости от полиморфизма гена CAT.

3. Мононуклеарные лейкоциты с генотипом ТТ и сниженной активностью каталазы характеризуются сниженной устойчивостью к окислительному стрессу и повышенной апоптотической и/или некротической гибелью.

4. Клетки меланомы линии Вго резистентны к индукции окислительного стресса пероксидом водорода в концентрациях 400, 700 мкмоль/л, но обладают чувствительностью к его воздействию в концентрации 1000 мкмоль/л, что выражается в увеличении доли апоптотических клеток.

5. Экспрессия TSPO - митохондриального, апоптоз-ассоциирован-ного белка - в клетках меланомы кожи и мононуклеарных лейкоцитах характеризуется разнонаправленностью вне зависимости от варианта полиморфизма гена каталазы С-262Т.

6. Изменение уровня экспрессии TSPO не зависит от активности каталазы и не коррелирует с выраженностью апоптоза в культурах мононуклеарных лейкоцитов при индукции окислительного стресса, что указывает на отсутствие функциональной роли данного белка в реализации апоптоза, сопряженного с повышенной концентрацией активных форм кислорода.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Выявление уровня активности каталазы посредством определения варианта полиморфизма С-262Т гена CAT может быть использовано для формирования новых подходов к профилактике злокачественных новообразований кожи, а также других заболеваний, связанных с развитием окислительного стресса.

2. Лицам, обладающим диким вариантом полиморфизма гена каталазы -262СС, необходимо воздерживаться от повреждающего действия ультрафиолетового излучения.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ

CAT - ген, кодирующий фермент каталазу;

TSPO - белок-транслокатор;

кДНК - комплементарная ДНК;

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота;

ПДРФ-анализ - анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Комина А. В., Рукша Т.Г. Модуляция апоптоза в мононуклеарных лейкоцитах с различными вариантами полиморфизма С-262Т гена ката-лазы // Цитология. - 2014. - Т. 56, № 8. - С. 599-603.

2. Комина А.В., Гырылова С.Н., Рукша Т.Г. Полиморфизм гена ката-лазы и развитие плоскоклеточного рака кожи // Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. - 2013. - № 3. - С. 45-47.

3. Комина А.В., Рукша Т.Г. Анализ распределения и влияние полиморфизма гена каталазы (-262С/Т) на функциональную активность клеток крови // Материалы съезда физиологов с международным участием (27-29 июня 2012). - Красноярск, 2012. - С. 241-242.

4. Komina A.V., Korostileva К.А., Gyrylova S.N., Belonogov R.N., Ruksha T.G. Interaction between single nucleotide polymorphism in catalase gene and catalase activity under the conditions of oxidative stress //Physiol. Res. -2012. - Vol. 61, № 6. - P. 655-658.

5. Комина A.B., Коростилева K.A., Рукша Т.Г. Роль полиморфизма С-262Т в промоторной области гена каталазы в развитии плоскоклеточного рака кожи // Сборник статей межрегиональной НПК Актуальные вопросы онкологии. - Красноярск, 2011. - С. 78-81.

6. Комина А.В., Рукша Т.Г. Распределение полиморфных вариантов гена каталазы у больных злокачественными новообразованиями кожи в Красноярском крае // Сборник статей юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию доктора медицинских наук, профессора Захарова Геннадия Алексеевича. Актуальные проблемы патофизиологии. - Бишкек, 2011. - С. 186-189.

Соискатель

А.В.Комина

Подписано в печать 10.11.2014. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 1.0. Тираж 100 экз. Заказ № 30. Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58. ул. Русская, 39. т. 306-67-39