Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие анионных полисахаридов с фосфатидилхолиновыми мембранами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие анионных полисахаридов с фосфатидилхолиновыми мембранами"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА СЯТЯЕРКлОЯ РЕВОЛЩЙИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНА1ЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ии.М.Л.Лсмоноооза

Биологический факультет

На правах рукописи

МАРКУ2ЙН Юрий Яковлевич

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНИОННЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ С &СФА7ЩВДХ0ЛИН0ВНМИ МЕМБРАНАМИ

03.00.02 (биофизика)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991 г.

Работа выполнена в Институте биоорганической химии СО АН СССР

Научный руководитель к.б.н. Будкер В.Г. ■ Официальные оппоненты чл.-корр. АН СССР Чизыадкев Ю.Д.

д.й.ы. Иванов И.И.

Ведущая организация Институт биофизики клетки, г. Пущино

Защита состоится 1991 г. в час. на засе-

дании специализированного совета К.053.05.68 в Московском государственном университете км. М.В. Ломоносова, 119899, Мога4ва, ГСП, Ленинские горы.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета.

Автореферат разослан се+сг.1991 г. Ученый секретарь специализированного

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Полисахариды, в частности, глжозшжногли-каш локализуются преимущественно на внешней сторош клеточных мембран в составе протеогликанов и гликолипидов, во внеклеточном матршс се (гликокаликсе). Эти полиггери участвуют в процессах адсорбции-десорбции частиц на мембране, рецепции гормонов, взаимного узнавания клеток, к?л(ушшх реакциях, дкф-ференцировке и пролиферации, влияют на синтез полисахаридов в клетке. Пр:язеденные данные согласуются с представлениями об участии полисахаридов во впутркклэточпых процессах, однако, пе дают ясного предст&влешш о характере и нзхшшзме этого участия . Мэаду тем, нсследовапкз функциональной роли полисахаридов, в том числе глгяоэамизогликЕЗов, во внутриклеточных процессах является одшм из наиболее актуальных направлений соз-ремзппой 1!ембрглолопш п прэдставляэтся вгягвм для рзозяия вопросов кек об'цего, та:: и практического значен«.!.

Можно предполагать, что адсорбция полисахаридов по мембране природит к определенна» кзгзпейаям в фагико-хшячвских свойствах кэкврчпя, к эти нгмапэязлдогсякеобходаам ус-ловнем^унзщ.'окхфсзашико^атлзкса. Изучение эффектов такого родз на природной <л?':Срете счспь трудно из-за ее слозноЗ организации. ИскусстгепЕ1:э г.:;гюра:м, как известно, достаточно хорссо гсздтнруют некоторое свойствапртродпгх гздзбраяк, поэтому, могут быть кспользовзкк кал адекватная кодэль лтвдпой части биологической I якЗргааг. До последнего времени били проделана дтаь едажшшне р-Ооты по ггаучг;3!гтолисахарлд-!.?2г?5р8.н-шхко?.!ЛЛ8есоп. Поэтому, представляется сктуаяьпкмиссладова-няе подобных взз:г-!одеЯстЕ!й.

Научная новизна. Епервиз представлено полное описсппе процесса адсорбция апиоигах полисахаридов пз фосфатншлхолиповоЗ »'ембразе в присутствия даупалзптных катионов. Установлена функция двувалентннх катионов з стабилизациикокптвса. Проведено изучение процессако/лплэк сообразовали вяноееих полисахаридов с бислоЯпжот лигададои мэмбрсла'*и (БПМ) и монола-мелляршми везш:ула?ш в присутствш! двувалентных катионов.

Разнообразными физико-химическими методами зарегистрированы конкретные изменениям свойствах модельных ичцщхяяшх мембран при адсорбции полисахаридов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение процесса адсорбции кислых полисахаридов на модельных фосфатидилхолиновых инекоторых природных мембранах , а также изменения характеристик мембран в результате адсорбции. В представленной работе рассматриваются следупцие вопросы:

а)комплеясообразование ионов Саг+ с липидами мембраны и полисахаридами;

б) физико-химическая характеристикапроцессакомплексооб-разования полисахаридов с липидами мембраны в присутствии катионов Са2+;

в) изменение электрических и механических параметров искусственных и некоторых природных мембран при образовании комплекса;

г) фузогенная активность полисахаридов;

д) изменение фазового поведения липидов при взаимодействии с полисахаридами в присутствии двувалентных катионов.

Были сформулированы следушие экспериментальные задачи:

1) создание комплекса измерительной аппаратуры для проведения электрометрических измерений;

2) выяснение условий формирования комплекса анионных полисахаридов, фосфатидилхолина и ионов Са2+;

3) оценка параметров взаимодействия мевду молекулами полисахаридов, липидов и Са2+ в тройном комплексе;

4) исследование влияния полисахаридов на проницаемость липидных мембран ;

Б) определение электрических и механических параметров мембран при адсорбции полисахаридов, изменение фазового поведения липидных молекул;

6) изучение фузогенной активности полисахаридов;

7) исследование влияния гепаринана ионную проницаемость эритроцитов.

Теоретическое и практическое значение. Настоящее экспериментальное исследование развивает современные представления о механизмах взаимодействия полисахаридов с биологическими мембранами и о возможных механизмах влияния поверхностных полисахаридов на внутриклеточные процессы. Данные, указывающие на изменение свойств бислоя в комплексе, вероятно, свидетельствуют о важном значении фосфолипидных доменов в биологических мембранах в реализации функций внеклеточных полисахаридов и протеогликанов. Эффект изменения ионной проницаемости эритроцитов человекаможет иметь практическое значение в экспериментальной и клинической медицине.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано б печатных работ. Из них: 5 - статьи, 1 - тезисы доклада. Результаты исследований были долоаены на Всесоюзном симпозиуме "Одиночные ионные каналы биологических мембран" (Симферополь, 1989 г.) и на viii Всесоюзном-рабочем совеоании по биоэлектрохимия мембран (Рига, 1990 г.).

Объем работы. Материалы диссертации изложены на 153 страницах машинописного текста, включая 31 рисунок и 1 таблицу. Список использованной литературы составляет 209 источников, в том числе - 176 иностранных. Работа состоит из 4-х глав, введения, выводов и списка литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Адсорбция декстран сульфата на фосфатидилхолиновых мембранах.

В данной работе показана возмозиость образования тройного комплекса на примере искусственных фосфатидилхо лшовых мембран и анионных полисахаридов: гепарина, гиалурововой кислоты, атакге близкого по структуре сульфатированного полисахарида декстран сульфата в присутствии двувалентных катионов металлов. Изучались изменения свойств мембран в результате такого взаимодействия.

Для изучения связывания декстран сульфата с монолгмелляр-ными везикулами из фосфатидилхолина использовали [3Шдекстран сульфат, полученный из нерадиоаятивного полисахарида заменой

атоаов водорода на тритий. К суспензии больпзн каполглгэлдяр-ЕЖЕаз1ЕЧглдоба2кг-Ел: [^Шдогстрсл суль£й? н С&С^. Нар::сун-по 1 пр^вздзгзЕртая адсорбщпз [^Пдазстргп сульфатацвБЛМ в коордгггатах Схотчарда. ср:шоа прл шпжоа соотвсйзаии концаптраций [3Н]дэг.страд сульфат/фосфаткдилхолш (к а о,05 * ♦ 0,08) соответствует коопэраггшяс^гулср^теру связывания. 1Сривую Сг.зтчарда для ЫьО.ОЗ кошо прибли=знно еппроксзклтро-ватьпрсУо2азвюй 11 = (1,0-Ю5-4,б-Ю5 •Н)*9,о-ю4. Та-агл образом, константа ассоциации компязгса и указанных пределах раана прззлзрно (4 ♦ 5) ■ 105 ЕГ1. До<5евлзеиэ ЕДТА или одвовалзнтки катионов приводит к распаду вогаьяакса.

Рис. 1. Кривая адсорбции [3Н]декстрая сульфата на больших шноламеллярных везикулах (1 о маМ по фосфолипиду) в присутствии 2,5 ь«1СаС12 в координатах Скзтчарда. н= [полисахарид связанный]/[фосфатидилхолин], где [полисахарид связанный] -концентрация связанного [-^Юдекстран сульфата, [фосфатидилхолин] -концентрация липида. м = н/[полисахарид свободный],

где [полисахарид свободный] - концентрация [Зн1деястран сульфата, не связавшегося с липидом.

Представляет интерес организация слоя адсорбированных полисахаридов , - происходит распластцваниэ полимерная молекул па поверхности кембрслы или они сохраняют в той или 12102 степени трехмер:гув структуру свободных молекул? Ответ на этот вопрос, впршвдше, могно получить, определив при заданном числа адсорбировали:тх молекул распределение Заряда в пр^генб-рплттой области. С стой целъэ били проведена кгмэрсгага потенциалов поверхности мембрана прч адсорбщэт аянопквХ полисахаридов .

1Гр1!вгя зависимости с-сотсгапгала суспензия кодах ионол^зл-лчетк Л!Поссм (при постоятстойкояцентрацпв дёзстр?н суяьф».-тп )от ::спцепгрй1вш [СгС101 гсшдагг на плато при 1сг.сг21 «5 • • ю-5 М. )"\-сс"-"-.л1-пг-? стргцатольпое значение С-по?тсгалз созг—чттвг спело - Юг.'В. По результатамтгзгмреякяС-потснци-ала трупа судить о године адсорбированного слоя, поэтому были проведени эзспсрз'зптп на плосзоЗ лшидной кзмбрапэ.

Односторонняя адсорбция (в 1-см отселе) катионов и поли-рлиопсз яаг:г."5ргло приводите ксмекгшя) разности граничтах потенциалов л* (1). При нй-эренпи сорбции полисахаридов в присутствии двувалептпых катионов полисахариды добавлял:! з цис-отсеккрмзргг, а соли металлов-в цис-отсе:: (или симметрично в оба отсека в ряде экспериментов, - в этом случае для определения £?г (цис) из полученных в эксперименте вычитали потенциал, связанный с сорбцией Са2+ в транс-отсеке). Компенсируя поверхностный потенциал мембраны нпепнэз разностью потенциалов ¿и, определяли(цис). Результаты измерения Д?г(цис) приведены на рис. 2. В этом эксперименте иацяс-по-верхности мембраны сорбируются дек стран сульфат и кони Са2+. Величина Д->г (цис) достигает максимальное отрицательное значение при концентрации СаС10 ополо 5 • 1 о-5 М (рис. 2). Дальней-сее уменькенке разности граничных потенциалов связано, по-видгеасму, с двумя процессами: сорбцией са на мембрану и связыванием Са2+ с декстран сульфатом. В соответствии с результата.® измерения сорбции [?Шдехстран сульфата на БЛМ и

электрофоретическими данными можно предлолоаить, что десорбции полисахарида при увеличении концентрации Саг+ не происходит. Как показывает эксперименты и проведанные расчеты, при достижении концентрации СаС12 в растворе (0.4*1) »¿Л (в зависимости от концентрации декстран сульфата) происходит перезарядка цис-поверхности БЛМ.

Рис. 2. Зависимость разности граничных потенциалов БЛМ ¿¿г(цис) при разных концентрациях декстран сульфата: 0,8(1), 2 (2), 6 и 40мкМ (3) и с-потенциала везикул (0,1 ьйЛпофос-фолипиду, 30 мкМ декстран сульфат - кривая 4) от логарифма концентрации СаС12.

В предположении качественно сходного характера адсорбции полимеров на больших моноламеллярных везикулах и плоской мембране сравним кривые зависимости с-потенциала и (цис) от концентрации СаС12. Отметим, что л*р(цис) достигает максимума при [СаС1„ •]« 5 • 10~5 М и изменяет знак в области милли-

молярных кони.ентраиийСаС12. Кривая С-потенциала выглядит иначе: С-потенциал достигает предельного значения при {СаС1„ ]

с с

около 5-ю э М и относительно слабо меняется вплоть до милли-ыоляршхкопцзнтршлЛСйС 12 (рис. 2). Цозаопродполоаить, что на поверхности мембраны имеется зарязеншй объемный"слой с

толщиной, сопоставимой с дебаевской длиной х"1 изо А. В этом случае катионы Са2+, адсорбированные на липидной поверхности, не даггг непосредственного вклада в величину С-потеициала.

Мезлипоссмпые взеишдействия.

Агрегация везикул. Образование комплекса полисахаридов, со-дераазих анионные группы, с фосфатидилхо.штовкми везикула-да сопровоздается существенным увеличением светорассеяния системы. Корреляция кривой зависимости светорассеяния образца с декстроз сульфатом и больлм! мояоламэлляршми везикулами от понцентрацш! Са2+с кривой адсорбции указывает, что увеличение светорассеяния связано с адсорбцией полисахарида на везикулах. По-видимому, могет происходить агрегация везикул в результате взанмодействия одной молекулы декстран сульфата с более чем одной везикулой. То есть, декстран сульфат в присутствии ионов Са2+ индуцирует агрегацию фосфатндилхолиновых везикул.

Рис. з. Зависимость оптического поглощения образца (А-,--),

содержащего малые моноламеллярные везикулы (0,2 мМ по фосфо-липиду) (1-4), декстрансульфат (1), гепарин (2), гиалурояо-пуокислоту (3), от концентрации соотьетстБушихполисахари-дов. [СаС12 ]=2,2 Ш. 4 - уменьыеше (по сравнению с кривой: 1) оптического поглощения образца с докстран сульфатом в присутствии 4,7 мМ ЭДТА.

Велзгчила светорассеяния достигает максимального значения при определенной концентрации декстран сульфата и но меняется при дальнейшем увеличении концентрации полисахарида в растворе. Несколько иначе выглядит картина агрегации для малых к;о-ноламелляршх везикул на ркс. 3. Кривая светорассеяния содержит максимум при эквимолярных соотнесениях декстрдн сульфата и липидов поверхности везикул. Поскольку доли липидов поверхности везикул оценивали ко геометрических соображений, {диаметр больших липоссм, по данным электронной микроскопии около

4000 А, а малых «<350 А), то оценка аквкиодяраости декстран сульфата и липидов поверхности везикул являете« пркблигешгой. Добавление декстран сульфата в избытке к липидш поверхности Ее приводит к агрегации везикул. В этом эксперименте малые моноламеллярные везикулы инкубировали с декстран сульфатом разной концентрации. Если декстран сульфат последовательно добавлять к суспензии малых моноламеллярных везикул, то при избытке декстран сульфата полная дезагрегация везикул не происходит.

Гепарин и гиалуроновая кислота такие изменяют светорассея-

р+

ше суспензии везикул при наличии в растворе Са , но 31|фек-тивность действия этих полисахаридов существенно ниже (рис. 3). Добавление ЭДТА приводит к уменьсенгаэ светорассеяния, однако , в случае декстран сульфата исходный уровень не достигается (рис. 3). Возможной причиной подобнойнеобратимостимо-я:ет быть слияние везикул.

Слияние везикул. Слияние мембран везикул, индуцированное взаимодействием с полисахаридами, регистрировали по методу бе-зызлучательного.переноса энергии. Везикулы, содержащие по 0.6ЖНБД-ФЭ (фосфатидилэтанола\мн, содержащий 7-нитро-1 ,2,3,

ССЕЗСПСаДГ{330Л-4-}«23уЭ ГруППТфОЕКУ ) и Рд-£3 ($ОС.*ЗТИДйЛЭГЗ-гол-т.2:, содзргсггЗосмгс.*: 7о/.:»-.за) , с:.'с ю-г-рслит:!

.•лГЭГГГ.гу СйуоуЗСЕХЗГЛПД-'та. ™Г0 С5?ГЛО-

ц-аоС^сЗ-гггузглзо.г-гпог.ггПЕЭ-::тлстгстял с-?* путгот!? к с»».,:к=:.'эг:1?,.';5г"л гст ?:;/.;. ¡тггпшэ соотгггтп-

'г г.у.^ухы:." т:".;г-~ гт2пэ]ксястягзс!к?лггг;

- гхгс.с:?.-:- ^лггг г (г:'С. 4), таги, згггг^Пстз-

:. г '.. /.г ::: л : г ' г-.-.' • •.....г:.:::-.;:.-:. ?" ..-;с:г;г"г%

ггл с.:ст:сс?ь с. пгпг::: д- >сгстса?са я усгсглэтс г:т»::с::-наглпсП ГССГ-;--.-.. Огг:.тс"*:с, что г: тольпопз-

л.гг.-! скорссл, ::окг.г;;"т.".глдо.п глгпгпхс.т гг-'Гргл

ГГ-.".

"7 -Г) -4 [Полисахарид! (;*)

сес:';-;':: (С, 1С::' Г с с .'-с.-:.Т":.т) (1. 2), слпег::хс./: засд-

гулс-Сс-та (1! г.:: Г2л:;р:7:з, (2), [С-С12]=2 «¿5.

/н&лэгичгаэ бал:: прогэдзи о .срукг -г -

•тср:»дглг! - гопсргггом, гиат/ропоЕоЗкислотсй. для гопсргза сусэстееппохпет, а гиалурояовглгяслзта, кз-смотря па способность нядукгровать вгрэгацяз везияуд, 1:;- :;.-::-водит 1с сл1я1лш мембрзн вэз!с:ул (рис. Л).

Перенос флуоресцентных производных липидов не является достаточным доказательством слияния везикул, таге как мозет быть следствием обратимого полу слияния везикул. Поэтому, состояние везикул после Са2+-зависимого взаимодействия с декстран сульфатом было проанализировано методом электронной микроскопии. На рис. 5 приведено распределение везикул по размерам. Изменение среднего размера везикул после добавления в раствор определенного количе ства декстран сульфата и сас12 наблюдали и для малых и для больаих моноламелляршх везикул.

Средний размер больших монолаиеллярных везикул изменялся от • •

3000 А до 5600 А при избытке декстран сульфата по сравнению с концентрацией липидов поверхности везикул.

Для малых моноламеллярных везикул данные, приведенные на рис. 5. получены в следующих условиях: при отсутствии декстран сульфата-кривая 1, при эгаимолярности декстран сульфата и везикул поверхности (условия максимальной агрегации вези-

Рис. 5. Изменение диаметра малых ыоволамелпярвых везикул при взаимодействии с декстран сульфатом, по данным электронной микроскопии. 1 -контрольные образцы, 2, 3 - после добавления к суспензии везикул (0,9мМпофосфолипиду), соответственно

о, 8 или 1, б мкМ декстран сульфата в присутствии 4,5 мМСаС12. По оси у• й^2, где Ыд^ - число лило сом диаме т-ром

кул) -кривая 2, и двукратном избытке декстран сульфата (условия, при которых взаимодействие с полисахаридом происходит, но агрегации везикул нет-рис. 3) -криваяз. Модно видеть, что добавление к малым моноламеллярным везикулам декстран сульфата в эквимолярном соотношении по сравнению с концентрацией липидов поверхности везикул приводит к изменению средне-

• «

го размера везикул от 200 ♦ 400 А до 800 ♦ 900 А. Молярный избыток декстран сульфатане изменяет размера везикул по сравнению с контрольными (кривые 2 и 3 на рис. 5). Таким образом, при взаимодействии с сульфатированными полисахаридами в присутствии Са2+ происходит слияниечвезикул. Можно предположить, что необходимым условием для слияния, кроме адсорбции молекул полисахарида на мембране, является агрегация везикул.

Мопно было ожидать, что следствием слияния мембран будет и слияние внутренних объемов везикул. Однако, эксперименты с флуоресцентной парой ТЪ®+ - дипиколиновая кислота дали отрицательный результат. Такой результат возможен при слиянии внутренних объемов липосом и одновременном выходе ионов тъ3+ и дипиколиновой кислоты наружу за счет возрастания мембранной проницаемости.

Физико-химические свойства фосфатидилхолинового бислоя.

Проницаемость везикул. Для изучения влияния адсорбции анионных полисахаридов на фосфатидилхолиновых везикулах на мембранную проницаемость использовали везикулы, содерзащие во внутреннем объеме 50 мМ карбсясифлуоресцеин. Декстран сульфат и гепарин значительно изменяют проницаемость везикул, а гиа-луроновая кислота такого воздействия не оказывает. Таким образом, по-видимому, внсская скорость выхода водорастворимых молекул при адсорбции полисахаридов затрудняет анализ слияния водных объемов фосфолипндных везикул. Поскольку, в пользу того, что при образовашш тройного комплекс а происходит слияние везикул говорят результаты совокупности экспериментов, пред-

стаыкот интерес вопрос о шхсаизм-э сллгшяя.

Согласно о,с:о£ ез с:ро:-со обсгадклаж коделэ£ гатер.тдаато. сдкоть- ьзз;:;:".': ликзтся обрадовав» шла^олдаргих структур. >;спольоое£;~с 31 Р-ЛГлР-спс^трос^огъ:::позволяетрс-гистргфоьахь • ?;;~-дч>;." сгруктур по г.аргсл ор;г. ;у шп:.;' I

сп'^гтрся&згмклзчо, орг 12Пт:гроьг„;ко:ль слгЛп пола. В . (■гэ ртгшссго отсутстаиз - акого с.этк-ч-. Го от. г ¡пиу^и.:,;.: V- -г: .-гул г г.жсф^цсххщжь'ьщпхутсг&иСсг не: -

с:,;. с::.т.вэо по;::. С;:'.::г" .:.-(:■ .'." сьяс с;, с-------; г .та:, с: -

*;1 -¡ги^ск ро2:.-,ороъ ь^^л-улпрл с; с.:....... с

лс.тсра.-лЕо^по»«ка1зс1;:л;;'.3|Д01> при ой»ллс,у ^с ж .'аса. с яаскхд . Скзэтральноо плзчо, ор с с.\;.:>и->

полз ост&2Тся бог издавши*. По сзоморсг

Е«лг;1алл.эрнле структура гозго зарегистрировал-, есл; ое; счк-.-ташкэ? около 55 от поверхности бислэ»:. о и г -

ло~:ть, что в указашгомприбдигаши шзаи'.'.одеисть:» сульфата с фосфагвдгл::олинова'лп; ыхпхум.к- крйьодлк г: £орйПфовЕв;ззустсйятнхЕЗЛ£^элляр1Лг; С -3 и: кэ» ру-гкстродш Я^-спактроз Еа.-£.\:эдл.'1рд::э С^си клу? йсчооау**/'

Росткгкбравнойпровода.гостиьэгзг сип сиазш с ъо;.,:^:..-Еоганяеу лолашшх дефектов кэмбркпи. Яж прогзр&г«нг> прзглоло^ешаз ислсльооЕали плоскуэК"п;а;::з'л , истори;

а'эт доподштелыаге вогказюсти длл с^влйьь.

Прокицслгюст«. Бтй1. Енло покссгдо, что сорацкпо^сахс.::.,-на шт.; соярозагдаэтсг ус?«« тякоу г:-; прссзд:^;;::-

г.т; р.-<.'г.'.•■.,.: ,

- когптсл с1Карр.с*гх.ор;-.) ^¡кс^т.с-м^ь'о.'г.г..;:: -

., (Ю «• 2010} рэг;:с.:р оди^-и-*:;,-¡~:-

»,^с."_"(..з..;брат:ого Iояс проводя.«» ста,*» 10 * --'О ¡■•Ой;, пз-Е55Д1п.;оау, с локслькс-З! до$.октс.\21 ллгкдао; структуру Щ>-; адсорбции полиссхсрадзв. Сорбщш полисахаридов на плоской у.г.;,:ЗрЕ£:з (БСЛ) определяли по кзмзезепэ разности грг^окгпл: похешааяов№ . Экспвр^гкзяга прово;зшг с рлдоглполлсахар::-дакстран сульфатом, гепаршом, гиалуроповоИ кислотой,

дсзсстраясч, дтилаупноэтиддэкстргяом (pic- 6). Добйап?:ггэ гепард»по ода? сторсзу кг^р^зя до дсиоттретя 1 -10"5 Нгз внетвасо икяЕегая проводагости. Посяэяггто довсзгжтэ по оба сторона теубрспа до зса^атрзцгя Ш-Jпргзо-;л::э к я 15-'йратпс!чг П0В!Г!ОГш>!«?:брг::жой провог-яста. Елто пс^гэгго, что зпочосхиродстг.шпгпя, по вэсугхояr.'í3cto сзгльфогруппзср-бсхсаяьпаз группа гналурояозая зиелота прз гспЕ-нграет» 2,2-10-5 Ma присутствии 11 г Л CeCl, тггг-з уг-зл^ЕЕгэт прсво-дпиостьпр:ггзртоз 10ргз (ряс. 6). СсоСетгосгякгсозоэдза-cteks na!fî»:<5prir/ оябянейл дзястраз су.т?'-с"с.*:зрптл единица которого отличсятся от гспарета я гаадурсгогоЗккслоп! (50+ юо-тгрзтпсо увеличение проэодгаста). Пзз'грлпог^.а дзхстрзп « поггхзр, secymjd полсгятольпо э.^ргпзпп::? группа -днэтилг^-:5к0"тилдекстрсяиз сказшзалн влнпг.'Япа правод;Г!эс?ь rcnöprJTJ.

Тс,™;"! сбргзсм, narrera отрицательно огря2?ннах групп лзлл-зтс1 облз&толыкм усложнен из: ягевап провод:-ïocth кгг;бргпя из Г-эс^лтндилхо.-шэ з присутствии ¡газов саг+. Мсгсо гндзть, что э условиях, допусхасцнхобразовегда тройногоесгзкзясапояя-сах£р;гд-Саг+-^осГ\атндилхол::псЕая происходит су^эст-

г.9Епое увеличение проводимости. В присутствия lîsCl ига ЭДТА ^с^л.-екс днссошструет а это приводит к воссгапоагантэ огэят-ричесзих характеристик В.?! (рис. 6).

з

а, Жл i

Рис. б. Уменьсенне сопротивления Б£МRпри адсорбцииполиса-

харидовг 1 - декстран сульфата (8-10"^ М), 2 - гепарина (1 -10-5 М),з-гиалуроновой кислота (2-10-5М)4-декстрана (4мкг/мл) илидиэтиламиноохилдекстрана (4мкг/мл). Стрелками обозначены моменты добавления полисахарида (1); 11 мМСаС]^ (2), 15 ьй! ЭДТА (3); указаны конечные концентрации.

Сравнение кинетики роста мембранной проводимости и измене/ ния разности граничных потенциалов Д*г при сорбции полисахаридов на БЛМ показывает, что рост мембранной проводимости про-доляается около 10 минут, изменение же величины, связанное с сорбцией полисахаридов на мембрану, происходит гораздо быстрее и составляетне более 1 минуты. Таким образом, можно предположить, что адсорбция полисахаридов необходима, ноне достаточна для увеличения мембранной проводимости.

Поверхностный потенциал Фг (1}, по-видимому, играет существенную роль в процессе увеличения мембранной проводимости. При подаче на плоскую мембрану внешнего напрягения треугольной формы (с периодом 2 минуты) рост проводимости БЛМ происходит неравномерно. Это - периодический процесс с частотой внешнего треугольного напрягения. При отрицательном граничном потенциале «г (1) < о прирост приходится на фазу ли (1) <о, при половительном *г(1) - на фазу ди(1) > о.

Для изучения интегральной проводимости БЛМ были сняты циклические вольт-амперные характеристики мембран. Эксперименты _ проводились в 10 трис-нс1-буфере, рН 7,6, при добавлении

с _о

СаС1„с одной стороны до концентрации -5-10 М, 1-ю М, 2 • 10 М и декстран сульфата с одно» стороны до концентрации 6-10~®Ы. При симметричном добавь 'чии декстран сульфата и СаС12 регистрировали линейную волет-амперную характеристику с точностью не менее 1*. Для интерпретации полученных вольт-шл-перных характеристик необходимо определить ионную селективность.

Для определения анион-катионной селективности БЛМ в комплексе с полисахаридами измеряли потенциал нулевого тока одновременно с разностью граничных потенциалов мембраны. В цис-отсек камеры добавляли декстран сульфат до концентрации б-«Г^м. Затем различное количество СаС12 добавляли в цис- и

гранс-отсеки. Компенсируя мембранный ток внешней разностью ютенциалов, измеряли потенциал нулевого тока. Анализ результатов показывает, что при концентрации СаС12 50 кеН БЛМ облапает катионной селективностью, при концентрации [СаСЬ, ] и Ю, 35^ мембрана слабоселективна и, наконец, при высоких кон-дентрациях СаС12 (выше о,4иИ) - становится анионселективной. Таким образом, асюлие тричный характер вольт-амперных кривых, ю всей видимости, можно отнести к наличию на цис-поверхности мембраны поверхностного заряда в соответствии с данными ри-зункаг. Это подтверждает также сопоставление эксперименталь-зых вольт-амперных кривых с расчетными, выполненными в приближении постоянного поля.

Как было указано выше, адсорбция полианионов на фосфати-цилхолиновых мембранах приводит к возникновению зарягенного поверхностного слоя. Величиной, характеризующей избыточную энергию поверхностного слоя является поверхностное натягение мембраны о'. В условиях термодинамического равновесия в* мож-ао определить из баланса сил поверхностного натяжения и избыточного гидростатического давления др. Намерение поверхностного натяжения БЛМ проводили гидростатическим методом. При добавлении гепарина в присутствии сась, поверхностное натяае-аие мембраны уменьшалось с 9 ■ 10-4 до 7 • 10-4 Н/м. При добавлении декстран сульфата я присутствии хлористого кальция в контрольном эксперименте (в отсутствие декстран сульфата) а' = = (2,0*0,5) дин/см, в присутствии декстран сульфатам' = = (2,2*0,5) дин/см. Таким образом, в пределах экспериментальной ошибки изменение с при адсорбции декстран сульфата на БЛМ не превышает ю + 20

Дополнительную информацию о свойствах модифицированного полисахаридами липидного бислоя можно получить, изучая поведение БШ в высоких электрических полях. При подаче на мембрану значительной внешней разности потенциалов (обычно более 200 мВ) мембрана разрушается. Показано, что этот процесс связано возникновением в липидном бислое инвертированных пор. Достижение порами критиче ского размера приводит к необратимому повреждению мембраны. В этих экспериментах после формиро-

вания стабильной БЛ5.1 шгл.йтрнчпо в оба отсека камеры добавляли 4кг.1СаС12идакстрансульфат (1,2-Ю-5Ы). В контрольных

огытах дакстран сульфатно добавляли. Величину т определял;! из 10+15 измерений времени гизни БЛ!.! при данном №. Б присут-ствки дскстран сульфата наблюдали более чем 1 о-кратное уменьшение г. Пренебрегая измененном поверхностного натя^йнля с (относительноеизмененная'/а' ь (0,1 +0,2) дазтнзбольсо:; вклад в величину т (лшюйко-э натягеше пор)), а тахгз, учз:т -вал, что ¿»>г = 0 (дакстран сульфат добавляли с:п.г-зтрзчло г. обаотсезакслзрц), оцешишвелдояу т: в контрольных зкепар.г-моптах у 1,1 дш, а после добавления дсг.страп сульфатг- - г-«0,7 дин. Подобноз мзмозюшю влазтрсыэхеличоскоГ; ста&:ль;.о ти коабраа щы смлатрачной адсорбции докстр-л судьд^та».-..;5- ••-би-гь связеяо с укзш&ОЕием парад;©гра .тяг^лого (дз£ектов) т. Нэльзяполностью 1:склп"з;ть текгзвэздзаясл.• возшашовепва на поверхности ыз^Зракн зна*шгааьЕ^л лакали^. здо£тр;;чесЕИХ полгйпра адсорбцси зарлггптх поласахар;ц..;1ь. Б этом случао уузшеение времени гьяши мо»фНЕ1ровькно& поллсь-харлд£.'.'л ЕС.! при нако^эки шзензй разности потенциалов мопз^' бить связано с суперпозицией указсашх потенциалов. На во_-когхость подобной суперпозицщг указшзаэт 3£лзис!а:ость рос?& ^¿¡бранной проводимости от знала внеЕнзй разности потенциалам при односторонней адсорбц;:;1 декстроп сульфата.

Ке:: Сило показало, высокая конная сила раствора блокирует Со-завпадлую адсорбциюполнспхаржов на мембране. Концзхлра-цпякалыцшв биологичеезшх средах - около 3 к'.!, тем на мэ-кзе, в этих условиях «осто огзщать бз и е,: о дэП с тви э указанного ткпа с л:яп!дн -> частью мембран клзток.

Взаимодействие гепарина с эритроцитами.

Вностоядзе время установлено соответствие медду концент-ргцпай гепарина в растворе и поверхностном зарядом эритроцитов . БИлн провзденц измерения провод:а:ости мембран эритроцитов человека. Клэрзшт прбводлмэсти по постоянному току были биполнзнн наковдуктомэтрической установке, разработанной для слализараспродалзниСклоток по объемам. К про бе цельной кро-

ел человека добавляли раствор гепарина, поале 5-?,ашутноЗ на кубации полученную смесь вводили в рабочую камеру л проЕо™-^ измерение нормированных откликов датчика ДИ/И при прахсгденга эритроцитов через канал. С возрастанием концентрации гепарина спектр смещался влево. Наибольшему смещению спектров в эксперименте соответствует увеличение мембранной проводимости в <* =* 70 раз. Приведенная оценка получена в приближения равенства удельных величин сопротивления цитоплазм эритроцитов в прп-сутотвии и отсутствие гепарина и, по-Епдимсму, представляет собой наименьшую оценку реальной величины. Добавление к пробе цельной крови ЭДТА до концентрации 40 ¡,¿1 блокировало рост ороводилости мембраны при последущем добавлении гепарина. '.Ьжрофотосъемка суспензии эритроцитов в присутствии гепарина юказала отсутствие изменений размеров и форкы эритроцитов.

ВЫВОДЫ

I). С целью изучения взаимодействия гликокалякса с природными лембранами создана модельная система, состоящая из искусственных фосфатидилхолиновых мембран и полианионных полисахаридов. Показано-, что полианионные полисахариды образуют стабильные комплексы с фосфолиггадными мембранами в присутствии даувалентных катионов. Нейтральные и положительно заряженные голисахариды в аналогичных условиях с фосфатидилхолиновыми гембранами не связываются.

!)• Обнаружено, что прочность связывания анионных полисахаридов с мембраной меняется в зависимости от заполнения говерх-юсти везикул: процесс связывания носит кооперативный харак-■ер для малых степеней заполнения поверхности молекулами по-¡исахарида.

(). Установлено, что взаимодействие анионных полисахаридов с юноламеллярными фосфатпдилхолшювыми везикулами в присутст-'.ии катионов , вызывает агрегацию, слияние везикул и енс-¡обождение внутреннего содержимого липосом. Нормирование не-¡амелярных структур не наблюдается.

). Показано, что взаиглодействие данных полисахаридов с плос-ой липидной мембраной приводит к увеличению ионной проницае-ости мембран, возникновению дефектов липидного бислоя диа-

метром не менее 15 А и уменьшению электромеханической ста бильности БЛМ.

5). Обнаружено, что плоские литтидные мембраны в комплексе с анионными полисахаридами обладают катион-анионной избирательностью. Тип ионной селективности определяется знаком мембранного поверхностного потенциала.

6) Установлено, что катионзависимое взаимодействие анионного полисахарида гепарина с природными мембранами приводит к некоторым аффектам, обнаруженным в искусственных мембранах: гепарин увеличивает ионную проницаемость эритроцитов человека в присутствии двувалентных катионов.

Основные результаты опубликованы в следующих работах:

1. Будкер В.Г., Маркушин Ю.Я., Сушев В.А. Изменение электрических характеристик БЛМ при адсорбции гепарина в присутствии СаС12//Биофизика.-1986-Выд. 2-С. 359-360.

2. Будкер В.Г., Маркушин Ю.Я., Ратушняк A.C., Суюиев В.А., Штарк М.Б. Алгоритм комплексного исследования влияния биологически активных веществ (полисахаридов) на свойства липидной Ывыбраны//Автометрия.-1986.-й З.-С. 93-100.

3. Маркушин Ю.Я., Суюшев В.А., Чернов Ю.П. Изменение мембранно! проводимости эритроцитов в присутствии гепарина//Биофизика.-1988.-Т. 33.-й З.-С. 523-525.

4. Будкер В.Г., Маркушин Ю.Я., Аракелян В.В., Ратушняк A.C. Изменение проницаемости фосфолипидных»мембран при катионзавк-стай адсорбции анионных полисахаридов. - В кн.: Тез. докл. Всесоюзного симпозиума: "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах".-Кара-Даг.-1989.-С. 19.

5. Будкер В.Г., Наркупшн Ю.Я., Аракелян В.Б., Ратушняк A.C. Взаимодействие анионных полисахаридов с липидной мембраной из фэсфатиднлхолпна в присутствии ионов Са2+//Биол. мембраны.-1990.-Т. 6.-й 11.-С. 1175-1184.

6. Будкер В.Г., Маркушин Ю.Я., Вахрушева Т.Е., Киселева Е.В., Мальцева Т.В., Сидоров В.Н. Взаимодействие анионных полисахаридов с фосфатидилхолиновыми везикулами в присутствии ионов

Са2+//Биол. мембраны.-1990.-Т. 7.-й 4.-С. 419-427.