Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антиокислительные свойства фосфолипидов (экспериментальное исследование)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Антиокислительные свойства фосфолипидов (экспериментальное исследование)"

РГ8 ОД

1 1 ПОП 1908 На правах рукописи

ЕГОРОВ

Константин Евгеньевич

АНТИОКИСЛИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ФОСФОЛИПИДОВ (экспериментальное исследование) 03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Чита-! 996

Работа выполнена на кафедре биохимии (заведующий кафедроР профессор Е.А.БОРОДИН) Амурской Государственной Медицинско? Академии (ректор - член-корр. ПАНИ, заслуженный деятель науки РФ профессор В.АДОРОВСКИХ)

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор Е.А.Бородин

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор В.АДоровских

доктор медицинских наук, профессор Л.С.Колесниченко

доктор медицинсхих наук, профессор Б.С.Хышиктуев

Институт физико-химической медицины МЗ РФ

Защита диссертации состоится "_"_1996г.

в_часов на заседании специализированного совета К 084.74.01

в

Читинской Государственной Медицинской Академии (672000, г.Чита, - -ул.Горького, 39а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Читинской Государственной Медицинской Академии (672000, г.Чита,ул.Горького 39а).

Автореферат разослан "__" ■___1996г. .

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

А.НЛожкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фосфолипнды являются главными компонентами липидного бислоя биологических мембран (Peeters, 1976; Avogaro et al., 1Э83; Stoffel, 1989), представляющего основу строения мембраны и выполняющего роль барьера, малопроницаемого для ионов, воды и веществ-электролитов, и матрикса, физико-химические свойства которого регулируют работу встроенных в биспой молекул белков { Singer, 1971; 1974; Singer & Nicholson, 1972). В условиях патологии, вследствие окислительной модификации нембранных липидов, действия фосфолипаз, изменения липидного состава мембран нарушаются как барьерная, так и мат-ркхская функции липидного бкелоя, что приводит к потере мембранами барьерной функции и нарушению функциональной активности мембранных белков (О.А.Владимиров, 1989; Vladiairov, 1987; Dorodin & Lopuk-hin,1987). Для восстановления структуры и функций поврежденных био-яенбран могут быть использованы фосфолмпиды (А.И.Арчаков, 1989; Г.И.Бакланова, 1983; Е.А.Бородин и соавт., 1985; Е.А.Бородин, 1987; Peeters, 1976; Avogaro et al., 1983; Archakov & Gundemann, 1989). Препараты фосфолипидов наяли применение при лечении гиперлипидеиий м атеросклероза (В.Н.Лопухин и соавт., 1983; Gurevich et al, 1993), тромбоэмболии и жировой эмболии (Archakov i Gundermann, 1989;), болезней печени (Н.П.Скакун, 1993; Е.Кунтц и соавт., 1994), токсикозов беременности и гипоксии плода (Е.К.Айламазян, 1991), заболеваний легких (М.Н.Абаджян,1990), кожных болезней (Thiele et al., 1993), хронических интоксикаций (Put et al., 1993), гериатрической клинике (Avogaro et al., 19S3) и др. Предпринимаются попытки использования фосфолипидных эмульсия для замещения сурфактанта в легких при его врожденном дефиците путем непосредственного введения в дыхательные пути (Haslan et al., 1994). Исследуется возможность применения фосфолипидов для коррекции наруоений свертывающей системы крови (Sletnes, 1993) и иммунной системы (Alving, 1992).

В водной среде плохо растворимые в воде молекулы фосфолипидов, в склу термодинакической выгодности, спонтанно образуют два типа структур - ионоколекулярные замкнутые слои (мицеллы) и бимолекулярные спои (Л.Б.Нарголис, Л.Д.Бергельсон, 1986). Последние могут замыкаться с образованием монобислойнях или мультибислойных лклосом. Липосоиы и ии-целлы могут различаться составом, размерами и физихо-химическили свойствами. Последнее немаловажно, поскольку ультраструктура и физико-химические свойства липосом и мицелл оказывают выраженное влияние на их способность устранять повреждения мембран, связанные с активацией перекисного окисления липидов (Е.А.Бородин, А.И.Арчаков, 1987) и экстрагировать из мембран избыточный холестерин (Borodin £ Lopuk-hin,1987).

Результаты ряда исследований дают основания предполагать, что наряду с основным - мембраностабнлизирующим действием, фосфолипидные ли-посоны и мицеллы могут проявлять и антиокислительные свойства (Е.А.Бородин, А.И.Арчаков,1987; Avogaro Р. et al., 1989), но сведения на этот счет противоречивы, и в литературе описаны как антиоксидантный (Komat-6U et al., 1990; 1991; Chen, Navar, 1991; Нага et al., 1992) так и прооксидантный эффекты фосфолипидов (Chen, Navar,1991) а также и их отсутствие (Н.М.Сторожок и соавт., 1994; Нага et al., 1992). Несмотря на очевидную теоретическую и практическую значимость вопроса, следует признать, что антиокислительным свойствам фосфолипидов не придавалось должного значения, они оставались незамеченными большинством исследователей и не принимались во внимание при создании препаратов антиокси-дантного действия.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование антиокислительных свойств фосфолипидов в условиях in vitro м

in vivo. Поставленная цель предопределила необходимость решения следу-юпих конкретных задач:

- разработать моделы ув систему для оценки антиохисдительных свойств фосфолипидных липосон и иицелл в условиях in vitro;

- исследовать антиокислительные свс-йства фосфолипидных лип осой и мицелл в условиях in vitro;

- выяснить зависимость антиохнедительной активности фосфолипидных липосок и мицелл от их физихо-хинических свойств;

- исследовать антиокислительные свойства препаратов фосфолипидов в условиях in vivo при активации процессов перекисного окисления липи-дов у крыс введением четыреххлористого углерода или под влиянием воздействия низких температур;

- исследовать влияние фармацевтического препарата фосфатиднпхоли-на "Липостабил" на содержание продуктов перекисного окисления липидов и состояние антиокислительной системы в крови больных о:трой пневмонией .

Научная новизна и теоретическая значимость. В результате настоящего исследования впервые обнаружено, что в условиях in vitro фосфоли-пидные липосомы и мицеллы проявляет аятиокислителыше свойства в случае быстро окисляющихся субстратов (микросомы печени) и прооксидантнке в случае медленно окисляющихся субстратов (тени эритроцитов), на основании чего предложена оригинальная гипотеза, объясняющая механизм антиокислительного действия фосфолипидов и противоречивость данных литературы в отноаении их анти- и прооксидактного эффектов. Впервые установлено, что антиокислительная активность липосом и иицелл выражена сильнее при ферментативном переписном окислении липидов, зависит от их физико-хикичесхих свойств (окисляемостъ, поверхностный заряд , размеры) и возрастает с увеличением Fe -связывающей способности. Результаты исследования свидетельствуют о способности фосфолипидов проявлять антиокислительное действие п условиях in vivo, сопровождавшееся снижа-ниеи содержания продуктов перекисного окисления липидов и активацией антиокислительной системы в крови и тканях крис, у которых процессы перекисного окисления липидоа активировали введениек чотыреххлористого углерода или воздействием низких температур. В клинических условиях выявлен антиокислительный эффект фармацевтического препарата фосфати-дилхолина "Липостабил" при лечении больных острой пневмонией.

Практическая ценность. В ходе проведенного исследования нами, совместно с И.А.Шгарбергои, предложено использовать в хачестве модельной систены скрининга актиоккслительнсй активности (АОА) соединений инициирование аскорбат(НЛЦФН)-зависимого перекисного окисления липидов в кихросонах печени, что позволяет оценивать влияние тестируемых соединений как на неферментативное, так и на ферментативное ПОЛ. Иа основании результатов исследования рекомендуется применять в клинике фармацевтические препараты фосфолипидов в качестве антиоксидантных средств.

Внедрение. Предложенный в ходе выполнения настоящей работы способ оценки антиокислительной активности соединений, разработанные модификации определения содержания продуктов перекисного окисления липидов и компонентов антиокислительной системы, адаптированные к различным тканям, внедрены в практику научных исследований ЦНИЛа и кафедр биохимии, фармакологии, пропедевтики внутренних болезней, акушерства и гинекологии, неврологии АГМА, ряда кафедр и лабораторий медицинских вузов Российской Федерации. Основные результаты иастоякей работы, вытекающие из иих положения и выводы используотся в учебном процессе на кафедрах биохимии, фармакологии, гистологии, а также ряде клинических хафедр АГ-КА.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на международных и национальных симпозиумах, конференциях и конгрессах, в той чис-

ле, "Реконструкция, стабилизация и репарация биомембран" (Благове-венсх, 1989), "Транспорт кислорода и антиоксидантные системы" (Гродно, 1989), "Биохимия и биофизика цитохрома Р-450. Структура и функции. Биотехнологические и экологические аспекты" (Москва, 1991), "Нейрофарка-кология на рубеже двух столетий" (Санкт-Петербург, 1992), "Цитохрои Р-450. Биохимия, биофизика н молекулярная биология" (Лиссабон,1993), "Методы и процессы медицинского обмена между Японией и Россией" (Осака, 1995), "Липопротеиды и атеросклероз" (Санкт-Петербург, 1995) и опубликованы в центрально» журнале "Биологические мембраны" (1992), "Bilogical Membranes" (1993).

Публикации. По тепе диссертации опубликованы 11 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах иаоинописного текста, иллюстрирована 11 таблицами и 24 рисунками и состоит иэ введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов , выводов и литературного указателя, вклгзчаощего 96 отечественных и 121 иностранных источников.

Положения, выносимые на защиту;

1. Лилосомы и мицеллы из фосфолнпидов проявляют антиокислительные свойства в условиях in vitro в случае быстро окисляющихся субстратов (мигросокы печени) и прооксиданпше в случае медленно окисляояихся субстратов (теки эритроцитов).

2. Антиокислительная активность фосфолипидных лилосон и мицелл зависит от их физико-химических свойств (оки^ляеность, поверхностный заряд, размеры) и возрастает с увеличением Ге*+-свяэывас!цей способности. Наибольшую антиокислитедьнув активность проявляет мелкие смеоанньсэ ющеялы фосфатидипхолина и деэоксихолата натрия.

3. Введение фосфолнпидов сопровождается антиокислительния эффектом в условиях in vivo, при активации процессов ПОЛ в организме живот-last введением четыреххяоркстого углерода или воздействием низких температур, и в клинике при лечении больных острой пневмонией.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ а И2Т0ДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоякеп исследовании в качестве препаратов фосфолипидоЕ использованы фосфолипидные липосомы и мицеллы из росфатчдилхолина и фоо-фатидилэтаноламина соевых бобов и яичных желтков.

В экспериментах in vivo использованы беспородные белые крысы-слп-цы весом 150-200 граммов. Животных содержали на стандартной диете вивария. В опытах использовали животных одного помета.

С цельо активации ПОЛ в организме животных использовали две экс-перикентальные модели - введегшя CCI4 (50* масляный раствор CCI4 вводили подкожно из расчета 0,4 мл на 100 г массы животного 1 раз в день в течение 3 дней (А.И.Арчаков, 1975) или воздействия низких температур (животных подвергали холодовому воздействии в течение 7 дней по 3 часа ежедневно в климатокамере "Fentron", создающей постоянный режим охлаждения -15°С) (Е.А.Бородин и coaвт., 1992). животных экспериментальных групп подвергали указанным воздействиям на фоне внутрибрюшинного вне-дения фосфатидилхолнновых липосом (200 яг фосфатидилходина/кг кассы кивотаого) ежедневно.

♦ракцио никросон иэ гоногената печени выделяли методом дифференциального центрифугирования на рефрижераторной центрифуге K24D (Германия). Тени эритроцитов получали по методу Dodge J.т. и соавт. (1963). Липиды иэ крови и тканей экстрагировали по методу Блайя-Дайера (Кейтс, 1975). Суммарные фосфолилиды нэ яичных желтков и соевых бобов

выделяли согласно Singleton W.S. и соавт. (1965). Выделение фосфати-дилхолинов из сукнарных фосфолипидов яичных желтков и соевых бобов осуществляли методом колоночной хроматографии на колонке с окисью алюминия смесью хлороформ-метанол 9:1. Нелхие фосфатидилхолиновые липосо-ны и смешанные мицеллы фосфатидилхолнна ». дезонсихолата натрия приготавливали с помощью обработки ультразвуком водных дисперсий липидов, а крупные фосфатидилхолиновые липосокы путем механического диспергирования (Е.А.Бородин, А.И.Арчаков, 1987). Поверхностный заряд липосон оценивали по соотношение флуоресценции 1,8 АНС~ в суспензии _мембран на средах с высокой и низкой ионной силой. Флуоресценцию АНС~ возбуждали при 360 ни, а регистрировали при 4 55 ни. Концентрация мембран в кювете составила 0,1-0,2 кг фосфолиг.ида мл~ . Спектры флуоресценции зонда регистрировали в интервале 350-500 ни. Окисляемость ммкрссоя, теней эритроцитов, липосон и мицелл, плазмы крови и яипопротендов яичных желтков определяли по накопление НДА в инкубационной см^си при индукции Fe2++ аскорбат-эависимого или НАДФН-зависимого ПОЛ (D.А.Владимиров, А.И.Арчаков, 1972). Антиокислительную активность фосфэтидилхогси-новых липосон и мицелл, плазмы крови, оценивали в условиях in vitro по их способности тормозить аскорбат(КАДФН)-зависимое ПОЛ в суспензии микросом и выражали в процентах. В гемолизатах крови и гомогенатах печени, легких и сердца определяли активность глюкозо-б-фосфатдегидроге-назы спектрально по изменение поглощения при 340 ни (В.С.Асатиани, 1Э69), каталазы на основе способности Н2О2 образовывать окрашенный комплекс с молибдатом аммония (И.Д.Королек и соавт., 1988) содержание церулоплазмина по окисление р-фенилендиамина (В.Г.Колб и соавт.,

1976). Содержание витамина Е в липидных экстрактах из тканей печени, легких, сердца и крови определяли по цветной реакции с дипиридилок и хлорным железом (Р.Ж.Кисилевич, С.И.Скаарко, 1972). Концентрации малонового диальдегида определяли в цельной крови, гоногенатах печени, легких и сердце, а также в микросомах печени по цветной реакции с тио-барбитуровой кислотой (Е.А.Бородин, А.И.Арчаков, 1987). Содержание диеновых коныогатов в липидных экстрактах измеряли по поглощению при 233 нм (И.Д.Стальная, 1977). Количество гидроперекисей липидов определяли на основе их способности окислять ионы Fe с последующей цветной реакцией на Fe с тцоционатон аммония (Л.А.Романова, И.Д.Стальная,

1977). Содержание фосфолипидов в липидных. экстрактах определяли по неорганическому фосфату, используя реактив 4>иске-Субарроу. Белок в препаратах микросом и гомогенатах печени, легких и сердца определяли по методу Лоури в присутствии дезоксихолата натрия (Lovry et al., 1951), железосвязьшасщую способность определяли с помощью стандартного набора репктивов "Железо" и "Общая связывающая способность" фирмы "Био-Ла-Тест" (Чехия).

Полученные результаты статистически обработаны на персональном компьютере IBM PC АТ-386 с использованием пакета программ, разработанных на кафедре патологической физиологии Амурской Государственной Медицинской Академии.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ .

В нашем исследовании в качестве препаратов фосфолипидов мы использованы мелкие (приготовленные с помощью облучения водной дисперсии фосфолипида ультразвуком) и крупные (приготовленные путем механического диспергирования) липосомы и мицеллы из фосфатидилхолина и фосфати-дилэтаноламина, выделенных из яичных желтков и соевых бобов. Введением в состав липосом катионного (цетилтриметиламмоний бромида) или анионного (дезоксихолата натрия) детергентов были получены заряженные липосомы. При исследовании антиокислительных фосфолипидов в клинических условиях использован фармацевтический препарат соевого фосфатидилхоли-

яа "Липостабия" ("Наттерианн", ФРГ), представляющий смешанные мицеллы соевого фосфатидилхолина (субстанция EPL) и деэоксихолата натрия.

Для исследования антиокислительной активности (АОА) фосфолилидных липосом и мицелл в условиях in vitro нами совместно с М.А.Штарбергом предложено использовать скрининг-систему, основаиную на инициировании аскорбат(НАДФН)-зависимого ПОЛ в никросомах печени.

При исследовании АОА фосфолилидных препаратов в предложенной нами водельной системе оказалось, что липосомы и мицеллы проявляют АОА при инициировании в микросомах как аскорбат-, так и НАДФН-зависимого ПОЛ, причем в случае НАДФН-зависимого ПОЛ АОА липосои и мицелл выражена :ильнес (табл. 1). В результате выяснения зависимости АОА фосфолилидных препаратов от их физико-химических свойств установлено, что АОА эпределяется главный образом размерами образующих препарат частиц и выражена в наибольшей мере у чрезвычайно мелких смешанных мицелл фос-|>атидидхолина и деэоксихолата натрия и в наименьшей у крупных липосом (рис. 1). Определенное значение имеет и заряд лилосон - заряженные липосомы, причем вне зависимости от знака заряда, превосходят по эффек-гивности нейтральные (рис. 2). Несколько больная АОА фосфатидилэтано-»киновых липосои по сравнению с фосфатидилхолиновыпи может быть свя-!ана с наличием незамещенной аминогруппы, а также с особенностями их гирнокислотного состава. Из литературы известно, что для фосфатидилэ-ганояанинов характерно высокое содержание полиненасыщенных жирнокис-ютных остатков (О.В.Архиленко и соавт., 1983). Еще один фактор, опре-(едяооий эффективность липосои и мицелл как антиоксидантов - их окис-1яемость. При сопоставлении АОА и окисляемости лилосон и мицелл отме-|ается отчетливая зависимость этих параметров - чей с большей ско-ххггю окисляется фосфолипмдный препарат, тем большую АОА он проявляет 'табл. 1 и 2).

При исследовании окисляемости фосфатидилхолиновых липосом и нигелл мы обратили внимание" на то обстоятельство, что скорость их описания в присутствии НАДФН на порядок ниже, чем скорость окисления мик-юсон (табл.2). В то же время, при НАДФН-зависимом ПОЛ в микросонах ■ечени липосомы и мицеллы проявляет большую АОА, нежели чем при аскор-¡ат-эависиион ПОЛ (табл. 1). Исходя из этого наблюдения, нами предло-£ена гипотеза, объяснявшая механизм антиокислительного эффекта фосфо-1ИПИДОВ. Согласно гипотезе, причиной "антиокислительного действия" юсфолипидов при_инициировании ПОЛ в смеси михросом и липосом или'ми-1елл является конкуренция микросом и фосфолилидных препаратов за кис-юрод, ионы Fe и свободные радикалы. В этих условиях, быстро окисля->щиеся микросомы окисляются медленнее, а вклад окисления относительно [едленно окисляющихся липосои незначителен. Из предложенной гипотезы 1ытекает, что препараты фосфолипидов будут проявлять антиокислительный |ффект только в быстроокисляющихся системах, к которым относятся мик-юсомы. В медленно окисляющихся системах эффект добавки липосом может >ыть "прооксидантным", на что обращали внимание другие исследователи Chen, Nawar, 1991). С целью экспериментально проверить правильность 1Ысказанного предположения мы исследовали эффект фосфатидилхолиновых ипосом на ПОЛ в мембранах теней эритроцитов.

Окисляемость теней эритроцитов в присутствии аскорбиновой кислоты ли НАДФН значительно неньае, чем микросом и сопоставима с таковой ли-осок (табл. 3). Внесение фосфатидилхолиновых липосом в инкубационную месь перед инициированием ПОЛ в суспензии мембран эритроцитов, дейс-вительно, сопровождается прооксидантным эффектом, выраженным сильнее ри аскорбат-эависимом ПОЛ и в меньшей мере при НАДФН-зависимом (табл. ). "Прооксидантный эффект" липосом в данных условиях можно объяснить рисутствием в тенях эритроцитов небольших количеств гемоглобина, вы-олняющего роль центра радикалообраэования и стимулирус^его окисление ипосомальных фосфолипидов. В этой связи интересно отметить, что про-

АОЛ фосфолипидных липосом и мицелл при ПОЛ в мембранах микросом (X) (средние значения и стандартные отклонения для 5-6 опытов)

Системы ПОЛ

У Л

Яичный ФЭ

ь т

Яичный ФХ

Р а

Соевый ФЭ

э в

Соевый ФХ

у к о Соевый ФХ+ ЦТАБ

вые Соевый ФХ+ ДОХ-На

Хэнд-шейк Соевый ФХ

Мицеллы

Соевый

ФХ+

ДОХ-На

Ы

Аскорбат-

эави- 35*7 26*4 35*8 32*5 39*3 40*2 22*6 43*3

симоа

НАДФН- 46*6 33*5 зависимое

51*0 30*8 48*6 47*5 16*4 66*в

Рис. 1 Влияние размеров фосфатидилхолиновых липосоя и мицелл isa их антиок:!сл!ГГгльнуг) активность при ПОЛ в мембранах ынкросон.

НАДФН-злв muí Аскср&ат-зав ПОЛ s НеГггрлльнькЛоложи'П'Льно Огрпцнтглыю >1 tjr »(ЧЖШКЫС

Рис. 2 Сияние j.ipnna лнпоооы на их аЕтиокислн-тельную ciKTHBiKx-ri. при ПОЛ в иембр^нах иикросол

ПОЛ в микросомах, фосфатидилхолиновых липосомах и мицеллах (нмоль ИДА мин-1 мг-1 фосфолипида) (средние значения и стандартные отклонения для 5-8 опытов)

системы Микро-ПОЛ сомы

Ультразвуковые Хэнд-

шейк

Яичный Соевый Соевый Соевый Соевый ФХ ФХ ФХ+ ФХ+ ФХ

ЦТАБ ДОХ-На

Мицеллы Соевый ФХ+ ДОХ-На

0

1

л

И

ы

к

Аскорбат

зави- 2.5±0.5 1.5*0.53 1.3*0.15 1.4*0.18 1.4*0.28 1.1*0.23 2.0*0.28

симое

НАДФН- 1.5*0.3 0.17*0.03 0.18*0.02 0.15*0.02 0.17*0.03 0.15*0.03 0.25*0.04

зависимое

- И -

жсиданткыЯ эффект экзогенных фосфодипидов отмечался канн в ряде опы-■ов с нихросомамк, когда последние в силу ряда причин окислялись мед-|еюю. По-вияииоку, противоречивость данных литературы о наличии анти-жсидактного и прооксидантного эффекта у фосфолипидов (Е.А.Бородин, ..й./>рчакоз, 1987; Brandt Р. et al., 1973; Forsseil Р. et al., 1990, looatsu I. et al., 1990; 1991; Chen, Kawar, 1991; Hara, et al., 1992) ■акже может быть преодолена с учете* предлагаемой нами гипотезы.

Таблица 3

Окисляемость теней эритроцитов я прооксидантная активность фосфатидклхолнмосых липосой при инициировании ПОЛ в тенях эритроцитов (средние значения и стандартные отклонения для 5-6 опытов)

^истеку ПОЯ Окисдяеиость теней эритроцитов (тюль ИДА пин кг фосфолкпида) Прооксидантная активность фосфатндилхолшюзих липосом при инициировании ПОЛ в тенях эритроцитов (%)

искорбат- 0,4010,04

>а виси пая 135

1КМ4Н- 0,11Ю,01 43

>авасхвая

Дополнительные экспериментальные доказательства предложенного ме-:апяэма антиокнелительного эффекта фосфолипидов получены нами при исс-гедовакии способности различных лклосом и кицеля связыяать иски Fe рис. 3).

Мелкнг » Vlfr^n -ллрчц Крупные

Л И П О Г о U Ы Мицеллы

ЕЗЗ Жсл^.К1Г1Чзм1июша1 спотбаост».

t 1 Лмтмокисяиттльна» актмпнпеп» При НАДФН-лавмсммом DOJi | Антмоъмслитмьни» акт* ми*. ik при «гкорбкт-деяисммом ПОЛ

Рис 3 Желелосвизывающа* способность липооом

н иицелл и их АСА при инициировании ПОЛ

О UKKDOCOUHX Печ«1И коые

Установлено, что дипосоны и мицеллы сорбируют ионы железз и и* Fe -связывающая способность в ряде случае коррелирует с АОА. Таким образов, захват ионов Fe липосомави и мицеллами, в самой деле, пожег вносить вклад в их АОА.

После того, как нами была показана способность фосфолипидных ли-посом и мицелл проявлять антиокислительные свойства в условиях in vit-го, и исследованы физико-химические факторы, определяющие эффективность их антиокислительного'действия, мы приступили к выяснению возможности проявления фосфолипидныии препаратами антиоксндактного эффекта в условиях in vivo при искусственной активации ПОЛ в организме жи-ботных введением ССХ4 или воздействием низких температур.

Повреждаюсее действие ССТ.^ на ткань печени сопровождается накоплением продув то в ПОЛ в ткани печени и крови (рис. -¡,5) на фоке снижения активности каталаэы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и активации церулоплазмина (табл. 4). Одновременное введение животным фосфатидил-холинобых липосон предупреждает увеличение содержание г.родуктов ПОЛ в г.ечени и крови, сььаетельствуя о способности липосом проявлять АОА в условиях in vivo. Среди исследованных нами факторов АОС только повышение активности г.аталазы в печени (тйбя.4) и тенденция к ее повышению в крови коррелирует с антиоксидантным эффектом фосфатидпчхолиновых липосом и следует признать, что их антисксидантное действие реализуется па уровне других, не исследованных каин, компонентов АОС.

Морфологическое исследование ткани г.ечени у раэличннх групп животных выявило, что введение СС14 о насих экспериментальных условиях сопровождалось развитием картины, характерной для токсической дистрофии, а фосфаткдил^элиновие дипосоны уменьшали повреждающее действие СС14.

Липосомы из фосфатндилхолииа проявляют антиокислительные свойства и предупреждают накопление в тканях продуктов ПОЛ и в условиях другой экспериментальной модели активации ПОЛ у животных, а именно - при действии холода на крис, также сопровождающимся накоплением продуктов ПОЛ в легких, сердце и крови (табл.5). Наиболее ебкее изиенениз в состоянии АОС тканей легких, сердца и крови под влияние« ьаедения животным липосои из фосфатидилколика состоит в увеличении содержания витамина Е во всех исследуемых тканях (рис.6).

В целом, результаты полученные в этих сериях экспериментов позволяют утверждать о способности фосфолипидов проявлять лнтиоккслительные свойства в условиях in vivo при актигзиии ПОЛ под влиянием введения животным CCL4 или воздействия низких температур.

В клинических услогиях мы провели исследование антиокисдительных свойств фаркацеьтического препарата фосфолкпидов "Липостабил" (Наттер— манн, ФРГ), представляющего смешанные мицеллы соевого фос$атиднлхолина (субстанция EPL) и деэоьсихолата натрия, при лечении больных острой пневмонией. Препарат вводили внутривенно. В крови больных до и после курса терапии "Липостабиг.ом" определялось содержание продуктов ПОЛ, а также содержание и активность некоторых компонентов АОС.

При развитии острой пневмонии у больных на мокенг поступления с клинику стлечается увеличение содержания продуктов ПОЛ - МДА, диеновых конъогатоа и гипроперскисей липпдов (табл. 6). Активация ПОЛ у больных острой пневмонией развивается на фоне противоположных тенденций в изменениях АОС, свидетельствующих как о напряжении АОС - увеличение содержания витамина Е (табл. 6), увеличение ЛОА плазмы крови при НЛДФН-зависимом ПОЛ в микросомах печени (рис.7), так и ее истощении -снижение содержания церулоплазмина (табл. 6), увеличение окисляемости плазмы крови и уменьшение ее АОА при аскорбат-зависимои ПОЛ в никросо-мах печени (рис.7). Изменения АОС также включают тенденцию к умеренному возрастанию активности каталазы, снижению активности глюкозо-6-фос-фатдегидрогеназы и увеличению железосвязываюцей способности плаэкы

Рис- 4 Содерж.Ж!»* мрод\ктчн ИОЛ в ппши крыс при действии чети[УХ\ пористого углсропа и на '{.»оне предварительного ти-Я' ит фосг^ггилилхолииовых лип<х-ом

{•СИ

ССИ »'М

шп п) егз «гл са як

Рис. 5. Содержание продуктов ЛОЛ в крови крыс при

действии четыреххлористого углерода и на фоне предварительного введения фосс|х;тидилхолиновыХ липосом

Содержанка к активность некоторых компонентов АОС в печени н крови кн тактных крыс при действии СС1.4 и на фоне введения фосфатидклхолиновы дилосок.

Показателя Кктактше (п-в) Получавшие ССХ4 (контрольные) <п-5) Получаввие ССТ-4 ♦ 4Х (п-6)

ПЕЧЕНЬ

ГЯ-6-+ ДГ (нмоль г с"1 ) «616 432« Р1,2<0,02 2712 Р2,Э<0.00

Каталаза (нкполь г с~ Х) 1251« 6213 Р1,2<0,001 8615 Р2,3<0,00

Царулопла эмхк (ИГ/Г) 530±131 16502142 Р1,2<0,02 13601241 Р2,3<0,05

Витамин Е (якг/г) 6724 6823 Р1,2>0,1 КРОВЬ 6716 Р2,3>0,1

Гл-6-4 ДГ (нкколь/л*с) 10.411.7 12.120.4 Р1,2>0,1 10.4Ю.8 Р2,3>0,1

Каталаза (кнодь/л*с) «213 4323 Р1,2>0,1 5015 Р2,3>0,1

Церулоплазкин (ккг/нл) Витамин Б (ккг/нл) 179114 4.910.3 237284 Р1,2>0,1 7.320.7 Р1,2<0,001 205132 Р2,3>0,1 6.НО.7 Р2,3>0,1

Р1,2 ~ достоверности различий между контрольными и интактными группам животных;

Р2,3 ~ достоверность различий между контрольными животными и животны ми^ получавшими дополнительно фосфатидилхсшиновые липосомы;

Содержание продуктов ПОЛ в крови, легких и сердце интахтных крыс, при действии холода и на фоне введения фосфатидилхолиновых яипосон.

Показатели Интактные Действие Получавоив

Холода Холод ♦ «X

(контрольна«)

(п-в) (п-6) (п-6)

КРОВЬ

Диеновые

коныэгаты 162-10 135Í14 129Í15

(нмоль/мл) Pl,2<0,05 Р2,3>0,1

Гидроперекиси 7.1±3.1

липидоа 10.3-5.0 7.012.8

(нмоль/мл) Р1.2>0,1 Р2,3>0,1

МалоновыЯ

диальдегид 1.32—0.24 2.65-0.42 1.72Í0.36

(нмоль/кл) Pl,2<0,01 Р2,3<0,05

Л Е Г К ■ 2

Диеновые

конъогаты 337±16 399±57 306Í12

(ниоль/г) Pl,2<0,005 Р2,3<0,001

Pl,3<0,05

Гидропере киси

липидоэ 84±4 90±8 69-6

(нмоль/г) Pl,2>0,l Р2,3<0,01

Т Pl,3<0,001

СЕРДЦЕ

Диеновые

коньсгаты 18Ü17 267±54 178±15

(нмоль/г) Pl,2<0,001 Р2,3<0,005

Р1,3>0,1

Гидроперекиси

липидов 43±6 87 — 20 47±7

(нмоль/г) Pl,2<0,001 Р2,3<0,001

Р1,Э>0,1

РХ,2 " достоверность различий между контрольными и интактныни группами животных;

Р2,3 ~ Достоверность различий между контрольными животными и животными, получавшими дополнительно фосфатидилхолиновые липосохы;

крови, но эти изменения статистически недостоверны (табл. 6).

Больные билм разбиты на 2 группы. Больные 1-ой группы получал! обычное лечение, включающее антибактериальные средства и симптоматическую терапис. Больные 2-ой группы получали дополнительно внутривеннс "Липостабил". После курса лечения содержание продуктов ПОЛ в крот уменьшалось в обеих группах больных, не достигая величин, характерны: для здоровых лсдсй, но уменьшение было выражено сильнее у больных второй группы, получавших фосфолипидный препарат.

Результаты исследования влияния препарата на состояние ДОС в крови больных острой пневмонией однозначно свидетельствуют о способност! препарата активировать АОС, что проявляется в возрастании активност! ферментативных компонентов АОС - каталазы и глюхозо-6-фосфатдегидроге-назы, увеличении содержания в крови церулоплазнина и особенно витамин; Е (табл.6). Интересно отметить, что ранее увеличение содержания витамина Е при введении в организм фосфатндилхолиновых липосом показан! нами при исследовании АОА фосфатидилхолина у животных в условиях действия низких текперату;-. Отмеченные изменения отдельных компонентов А0< в крови больных об". сияют изменения интегративных показателей АОС крови, а именно сккжеиие окнсляемости и возрастание АОА плазмы крови по, влияние» приема препарата (рис.7). В то же время, у больных, получав-них обычно« лечение, единственное достоверное изменение АОС по отношению к состоянио на лечения заключается в уменьшении окнсляемости плазмы крови (рнс.7).

В целок, полученное результаты позволяют утверждать о способност] препарата "Липостабил" проявлять антиокислительные свойства при лечении больных острой пневмонией, что находит отражение в снижении содер жания продуктов ПОЛ и активации факторов АОС в крови больных, получав-в их препарат.

/Г

Легки* У «.ерцш* К [м пи-

Интактные Холод Хопод-ФЛ

Рис. 6 Содержание витамина Е в тканых крыс прп

действии холода и на фоне предварительно!« введения <}хх-с}>йтипйлхалиновы\ лигкхоы

Таблица 6

Содержание продуктов ПО.1 и активность некоторых «оппонентов ДОС в крови здоровых явдей и больных острой пневмонией

указатели

Здоровые

(п-10)

Больные (до лечения)

(п-16)

После обычного лечения (п-8)

После лечения с "Липостабилои"

(п-а»

1.110.15

56.П2

«лоновый «альдегид <моль/ил)

«еновыв жъогагы

(МОЛЬ/МЛ )

|дроперекиси 6.63Ю.45

шидов

толь/ял)

|талаза

!ИОЛЬ л *с

-1с-1)

147113

1-6-Ф ДГ 5.5*0.39

|кноль я~*е '

рулоплаэмнн 135*21 1КГ/КЯ)

тамин Е кг/кя)

яезосвяэы-ощая спо-бность воротки кмоль/я)

7.1-0.33

5819

2.110.23 р1,2<0,001

140129 Р1,2<0,001

12.410.83 р1,2<0,001

155113 р1,2>0,1

4.6510.62 р1,2><3,1

89110 р1,2<0,001

9.2912.5 Р1,2<0,05

73И1 Р1.2Э0,1

I.6Ю.18

р2,3<0,05

102114 р2,3<0,005

9.110.60

р2,з<о,оог

16711« р2,3>0,1

5.26Ю.47 р2,3>0,1

97113 р2,3>0,1

II.112.75 Р2,3>0,1

8717 Р2,3>0,1

1.4210.16

Р2,4<0,001 Р3,4>0,1

9411« р2,4<0,005 Р3 ,4>0,1

8.310.55 р2,4<0,001 Р3.4>0,1

190117 р2,4<0,005 р3,4<0,02

6.4610.78 р2,4<0,005 Р3,4<0,02

12619 р2,4<0 ,001 р3,4<0,05

16.4114.6 Рг,4<0,05 Р3,4>0,1

9016 Р2,4<0,02 Р3,4>0,1

- достоверность различий между здоровыми людьии и больными острой евмонией при поступлении з клинику; р2 3 ~ достоверность различий жду больными острой пневмонией при поступлении в клинику и после ичного лечения; Рг,4 ~ достоверность различий между больными острой гвмонией при поступлении в клиник^ и после лечения, включавшего "Ли-;табил"; Рз(4 - достоверность различий между больными острой пнезно-гй, получавшими обычное лечение и с препаратов "Липостабил".

_ )ь ? 14

я \2

\

л % '

3

5 о» §ов

I 04

s 02

Г

.... /X _

/ \

V^/

\ N /

\ /

\

1доро|

Остра* пневмокиж

54

Ж «чти

после лечения

Лечения с Липосгабилом

Окмсппюстъ

АОА

Рис ? Окисляемость и актиокислительнан активность плазмы крови лцоровых людей и бальных острой Пневионией.

В К В О Д if

1. В условиях in vitro фосфолипидные липосоны и кицеляы проявляв антиокислительные свойства в случае быстро окисляющихся субстрата (нихросокы печени) и прооксидантние, в случае медленно окисдяющихс субстратов (тени эритроцитов).

2. АОА дклосом к кицеда выражена сильнее при ферментативном ПОЛ зависит от их физико-химических свойств (окисляемость, поверхностны заряд, размеры) и возрастает с увеличением Fe -связывающей способное ти. Наибольшую АОА проявляют мелкие смешанные мицеллы фосфатидилхолин и дезоксихолата натрия.

3. Предложена гипотеза, объясняющая механизм антиокислительног действия фосфолипидов, конкуренцией за кислород, ионы Fe и свободны радикалы с быстро окисляющимся субстратом.

4. Фосфолипиды проявляют антиокислительное действие в условиях i vivo, сопровождающееся снижением содержания продуктов перекисног окисления липидов и активацией антиокислительной системы (каталаза витамин Е) в крови и тканях крыс, у которых процессы ПОЛ активировал введением четыреххлористого углерода или воздействием низких темпера тур.

5. В клинических условиях выявлен антиокислительный эффект фарна цевтического препарата фосфатидилхолина "Липостабил" при лечении боль ных острой пневмонией. Проявляющийся в снижении содержания продукто ПОЛ и характерных изменениях АОС в крови больных, получавших препара (возрастание активности каталаэы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, со держания витамина Е и церулоплазкина, снижение окисляемости и увеличе ние АОА и Ре -связывающей способности плазмы крови).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Свободнорадикальн->е окисление липидо» и протеолиз в тканях к: после 3 месяцев воздействия холода. В кн. "Реконструкция, стаби-1ация и репарация биомембран". Тезисы докладов Всесооэного синпоэиу-

Благовеиенск, 1989, с.63 (соавт. Бородина Г.П.Доровских В.А., «шенко Г.Х., Зражевсхая Е.В., Киндеева С.Г., Тарасе* С.Д., Тертыч-[ Л.Г., Этманова Л.Я., Анохина Р.А., Бородин С.А.).

2. Энергетический метаболизм, антиокислительная и антипротеазная ■ивность миокарда крыс при длительном холодовок воздействии Тезисы ладов Всесоюзного симпозиума. Благовещенск, 1989, с.65 (соавт. До-енко Г.К., Бородина Г.П.).

3. Antioxidative effect of phospholipid liposomes and micelles, bilization and reactivation of cytochrome P-450 by phospholipids at lid peroxidation in microsome nembranes. In: 7-Th International con-ence "Biochemistry & Biophysics of cytochrome P-450; Structure 4 iction, Biotechnological t Ecological Aspects". Moscow, 1991, p.67 ¡authors Borodin E.A.).

4. Antioxiditive effect of phospholipid liposomes and Micelles, bilization and reactivation of cytochrooe P-450 by phospholipids at iid peroxidation in nicrosoma membranes. In: "Cytochroae P-450; Bioc-listry and Biophisics.Proceedings of the 7-th International Confe-ce."Ed.by A.I. Archakov and G.I. Bachmanova. 1992, Inco-TNC, Joint ck Company, Moscow,Russia, pp. 270-272 (coauthors Borodin E.A.).

5. Перекисное окисление липидов в мембранах эритроцитов и микропечени и антиокислительная система тканей крыс при длительном

ствии холода. Биологические мембраны, 1992,т.9,N6, с.622-627 (со. Бородин Е.А., Бородина Г.П., Доровских В.А., Дорошенко Г.К., Зра-схая Е.В., Киндеева С.Г.).

6. Антиокислитеяьный эффект фосфолипидов. В кн."Нгйрофармакологи* рубеже двух тысячелетий." Материалы международной конференции. кт-Патербург, 1992, 6-3 октября. 4.1, с.68. (соавт. Бородин Е.А.).

7. On the possible isechanisa of the antioxidant effect of exoge-s phospholipids in lipid peroxidation in microsome membranes. 8-th International Conference on Cytochrooe P-450.Biochemistry,Bi-ysics and Molecular Biology. Abstracts.Lissabon, Portugal 24-28, ober,1993,p. (coauthor- Sorodin E.A., Dorovskikh У.А., Shtarberg

8. Lipid peroxidation in erythrocyte гаешЬгапея and the antioxi-t system of rat tissues under prolonged cold stress. Bi-Hea..Vol.6(6), Harwooi Acad. Publ.GnbH, pp.809-813 (coauthors odin E.A., Borodina G.P., Dorovskikh V.A., Doroshenko G.K., Zraz-skaya E.V., Kindeeva S.O.)

9. Препараты фосфолипидоа и производные малоновой кислоты прояо-т антиокислительныо свойства и предупреждает повреждение при дейс-и на организм CCL4 и ннэкм>: температур в эксперименте В кн."Клиника я и патоморфологическая диагностика редховстрачасщихся поврежде-

и заболеваний". Выпуск 2. Благовеценск, 1994 с. 85-86 (соавт. рбпрг М.А., Штарберг с.А., Доровских D.A., Бородин Е.А.).

10. Phospholipids аз drugs. In: The Third International Symposium the JRMEF and the JRHCO. June 1995, Osaka, Japan (coauthor*, Borodin ., Dorovskikh V.A., Shtarberg M.A.).

11. Фосфолипиды как антиатеросЬлеротические лекарственные средс-Лилопротеиды и атеросклероз. Тезисы докладов симпозиума, посвя-

ного 110-летио со дня рождения ахадемика Н.Н. Аничкова. СанктПетер-г, 1995, с.33 (соавт. Доровских В.А., Бородин Е.А., Птарберг N.A.).