Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимосвязь между перекисным окислением липидов и активностью фосфолипаз в модельных системах и митохондриях

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь между перекисным окислением липидов и активностью фосфолипаз в модельных системах и митохондриях"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ

1 'о

2 1 ^^ п',авах РУКОПИСИ

УДК 577.352.547.554.

МАРЕНИНОВА Ольга Алексеевна

ВЗАИМОСВЯЗЬ МЕЖДУ ПЕРЕКИСНЫМ ОКИСЛЕНИЕМ ЛИПИДОВ И АКТИВНОСТЬЮ ФОСФОЛИПАЗ В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ И МИТОХОНДРИЯХ

Специальность 03.00.02. — биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент 1997

Работа выполнена в Институте физиологии и биофизики АН РУз.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук О. Н. ВАГИНА Научный консультант:

доктор биологинеских наук, профессор М. М. РАХИМОВ Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Б. А. САЛАХУТДИНОВ

кандидат биологических наук И. Т, ЯКУБОВ.

Ведущая организация: Институт биохимии АН РУз.

Защита диссертации состоится « » _

1997 г. в ^' часов на заседании специализированного совета Д 015.01.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте физиологии и биофизики АН РУз по адресу: 700095, Ташкент, ул. Ниязо-ва, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии и биофизики АН РУз.

Автореферат разослан «.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

Д. КАЛИКУЛОВ

ОБЩАЯ . ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность теш.

В настоящее.время показано, что кроме, "внешних" эффекторов (гормоны, мембраноактивные соединения) в рр^уляции функционального состояния мембран огромная роль принадлежит эндогенным мембранным системам, осуществляющим ферментативные и неферментативные превращения мембранных фосфолипидов. К этим системам относятся липолитические ферменты, катализирующие' гидролиз и трансэтерификацию мембранных липидов, а также системы ферментативного и неферментативного перекисного окисления липидов (БОЛ). Процессы ферментативного гидролиза и ПОЛ являются универсальными, они обнаружены практически во всех типах мембран. Показано, что как эндогенные фосфолипа-зы, так и система'ПОЛ играют важную роль во многих функциональных процессах: транспортных, энергетических, сигнальных. Важнейшую и во многом определяющую роль играют липолиз и ПОЛ в патологических процессах. Ясно, что системы липолиза и ПОЛ, локализованные в одной и той же мембране, действующие на один и тот же субстрат И' участвующие в одних и тех же функциональных процессах, должны'быть взаимосвязаны и взаимозависимы. -Однако литературные данные об этой взаимосвязи противоречивы. Так, например, одними авторами был продемонстрирован стимулирующий эффект фосфолипазы Аг на скорость ПОЛ, другими же - ингибированиё ПОЛ в результате гидролиза мембранных фосфолипидов фосфолипазой Аг. Многими авторами показано, что фосфолипазы,предпочтительнее гидролизуют окисленные фосфолипиды, однако есть и прямо противоположные данные. Большая часть работ посвящена изучению взаимосвязи ПОЛ и фосфолипазы Аг,- связь других фосфолипаз: С, 0 и лизофосфо-липазы А, играющих не менее важную роль в регуляции мембранных функций, - с процессами ПОЛ практически не изучена.

Основной целью диссертационной работы явилось изучение взаимосвязи между ПОЛ и' ферментативным, липолизом в модельных системах и в биологических мембранах на примере митохондрий.

Для достижения указанной цели в работе были поставлены конкретные задачи, решение которых выносится на защиту:

■ 1. Изучение взаимосвязи между ПСШ и активностью фоефолипаз Аг, С, 0 и лизофосфолипазы А в модельных системах: липо-сомах и мицеллах из яичных фосфолипидов..

2. Изучение взаимосвязи между индуцированным ПОЛ и .активностью эндогенных фоефолипаз Аг, С , С й лизофосфолипазы . А в митохондриях печени крыс.

Научная новизна.

Впервые изучена на молекулярном уровне взаимосвязь между ПОЛ и активностью фоефолипаз разной позиционной специфичности. В модельных системах показано ингибирующее влияние фоефолипаз Аг и й на скорость Рег+- индуцированного ПОЛ. Гидролиз фосфолипидов фосфолипазой С, напротив, существенно увеличивает подверженность фосфолипидов перекисному окислении. Фосфолипаэы С и 0 предпочтительнее гидролизуюг «еокиеленные фосфолипиды. Показано,- что окисленные фосфолилиды являются конкурентными ингибиторами фосфолипазы С..

Впервые изучена взаимосвязь между ПОЛ и активностью эндогенных фоефолипаз в митохондриях. Показано, что продукты перекисного окисления митохондриальных фосфолипидов, образующиеся под действием Ре2+ и аскорбата, а такке гидроперекиси кумола, существенно влияют на активность митохондриальных фоефолипаз: активируют фосфолипаэы Аг. С, Б и лизофосфолипа-эу А . Гидролиз.митохондриальных фосфолипидов как экзогенными. так и эндогенными фосфолипазаш приводит к резкому снижению скорости ПСШ, индуцированного в системе аскорбат и гидроперекисью кумола после гидролиза.

Практическое значение.

Ревультагы изучения взаимосвязи между ПОЛ и активностью эндогенных'фоефолипаз в-.митохондриях могут иметь важное значение в понимании, механизмов повреждения митохондриальных. мембран при окислительном стрессе и патологических состояниях. а также в. разработке способов защиты от окислительного повреждения мембран.

Установленные.факты активации митохондриальных фоефолипаз.. продуктами ПОЛ, а также усиления фосфолипазами эффекта ПОЛ на состояние мембран дают основание полагать, что именно активация фоефолипаз является главной причиной деградации ■ мембран при различных.патологиях, сопровождающихся ПСШ. С другой стороны, обнаруженный эффект резкого снижения подвер-

ценности митохоидриальных фосфолипидов перекисному окислению в результате их гидролиза экзогенными'и эндогенными фосфоли-пазой Аг и лизофосфолипазой А, свидетельствуют о том, что мембранные фосфолипазы в определенных условиях могут играть защитную роль в предотвращении, окислительного стресса.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы докладывались и . обсуждались на конференции посвяценной 60-летию Ташмухамедова Б.А.(1995 г.), на обг-едияенном'заседании кафедр биофизики, биотехнологии и физиологии человека и животных биологического факультета ТаыГУ (1995 г.).

Публикации.

Основные результаты работы опубликованы в 3 печатных работах.

Структура и обьем работы.

Диесертационая работа состоит из введения,. трех глав, заключения, выводов, списка литературы и содержит 115 страниц основного текста, 13 рисунков, 10 таблиц. Список цитированной литература включает 93 наименований. '

Список сокращений.

PLA2 - фосфолипаза Аг, PLC - фосфолипаза С, PLD - фосфолипаза D, LPLA - лизофосфолипаза А, ФХ'- фосфатидилхолин, ЛФХ - лизофосфатидилхолш, ФЭА - фосфатидилзтаноламин, ЛФЭА - лизофоефатндилэтаноламин, КЛ - кардиолилин, ЛКЛ - лизокар-диолипин, ФИ - фосфатидшшнозит, ФС - фосфатидилсерин, СМ -сфингомиелин, ФК - фосфатидная кислота, СЖК. - свободные жирные кислоты, Ж - жирные.кислоты, ЩА - малоновый диальде-гид, ДК - диеновые коньюгаты, ПСД- перекисное окисление ли-пидов, Ds-Na - додецилсульфат натрия, Vmax - максимальная скорость ферментативной реакции, Km - константа Михазлиса.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы.

В работе использованы: РЬАг из яда кобры (Sigma), бифер-ментный комплекс (PLA2 + LPLA) из яда пчелы, любезно предоставленный к.б.н. И.Т. Якубовнм, PLC из Bacillus cereus (ШО "Фермент",Вильнюс) и PLD из Rafanus sativus, любезно предос-

тавленную к.О.н. О. Сагатовой. Б диссертации описаны методы исследований: выделения митохондрий из печени крыс и'фосфо-липидов из яичного желтка/ приготовления липосом, экстракции митохондриальных фосфолипкдов, -определения их общего содержания и фосфолипидного . состава, определения активностей PLA2, PLD, PLC и LPLA, • индукции процесса ПОЛ. определения продуктов ПОЛ.

Результаты и их обсуждение.

1. Изучение взаимосвязи пожду ПОЛ к активностью очнщса-шх PLAz. PLC, PLD и LPLA в модальных системах.

Изучение взаимосвязи мояду ПОЛ и активностью, очищенных PLA2. PLC, . PLD и LPLA проводилось на липосомах и мицеллах.-Для изучения влияния фосфолипазного гидролиза на ПШ фосфолипиды в"составе лилосом иди мицелл гидролизовали с помощью определенной фосфолипазы. Б процессе гидролиза отбирали аликвоты _ инкубационной среды, фосфолипиды экстрагировали, готовили из них липосош или мицеллы, используя при этом ту же среду инкубации, в'которой проводился гидролиз. Затем индуцировали ПСЯ добавлением FeS04 и аскорбиновой кислоты (Ю-5 и 2х10-4 М соответственно).

. Для изучения влияния процесса ПОД,-на активность фосфоли-паз фосфолипиды окисляли в системе Ге2+-аскор0ат. Окисленные . фосфолипиды экстрагировали и использовали для приготовления •

липосом или мицелл ..(в соответствующей среде инкубации), ко. торые подвергали затем действию очищенных фосфолипаз.

1.1. Взаимосвязь между ПОЛ и активностью PLAz и LPLA в модельных системах.

■Обработка фосфолипидов PLA2 приводила к 30% гидролизу фосфолипидов. Сравнение скорости ПОЛ, индуцированного до и после гидролиза показало, что гидролизованные фосфолипиды окисляются хуже, чем иегидролизованные. Накопление МДА, ДК и гидроперекисей липидов было в 3-4 раза ниже, чем в контроле. Снижение эффективности индуцированного ПОЛ яичных фосфолипидов было обнаружено также при использовании биферментного коплекса из яда пчелы, содержащего помимо PLA2 также и LPLA. Скорость накопления МДА при индукции ПОЛ после гидролиза была в 15 раз, а ДК - в 5 раз ниже, .чем в контроле. Причиной

ингибирующего действия Р1Лг и и1_А на скорость ПОЛ, ка наш взгляд, является связывание ионов Ре2+ с СЯК.-

Перекисное окисление -фосфолипидов не изменяло степени подверженности гидролитическому действию РЬАг: скорости гидролиза окисленного и неокисленногй субстрата были равны.

Таким.образом, гидролиз фосфолипидов РЬАг л ЬРЬА приводит к снижению их подверженности индуцированному ПОЛ. Активность РЬАг не зависит от степени окисленности фосфолипидов.

1.2. Взаимосвязь между ПОЛ и активностью РЮ.

■ Известно, что РШ практически не действует на ламелляр-ный субстрат в отсутствие активаторов (органических расвори-тёлёй, детергентов, адсорбентов). В качестве активаторов РШ в настоящей работе были выбраны диэтиловый эфир, в присутствии которого образуются мультидамеллярные дисперсии фосфолипидов, и детергент ЯБ-На,' образующий с фосфолипидами смешанные мицеллы. В этих двух системах было изучено влияние гидролиза фосфолипидов под действием РШ на индукцию. ПОЛ. В мицёллярной. системе гидролиз фосфолипидов приводил к снижению скорости индуцированного ПОЛ более, Чем в 4 раза (рис.1), а-в-ламеллярной - в 3 раза. Причиной снижения скорости индуцированного ПОЛ, вероятнее всего, является образование ФК, которая связывает ионы железа. .

РШ лучше гидролизует неокисленные фосфолипиды: образование ФК при гидролизе неокисленного субстрата более, чем в 3 раза выше, чем при гидролизе окисленного. Известно, что. ПОЛ сопровождается структурными изменениями в модельных и биологических мембранах, с другой стороны, установлено, что активность РШ в большей степени зависит от характера упаковки фосфолипидов, чем от химического строения молекулы фосфолйпида. Однако, поскольку опыты поставлены в' присутствии детергента Оз-На, накопление небольшого количества продуктов ПОЛ не должно- силт.но изменять строение мицелл и, соответственно, ' снижать скорость липолиза. Более заманчивым является предположение о том, что липиды с окисленной улево-дородной цепью являются эффективными конкурентными ингибитора}.™ РШ.

Таким образом, установление, что между процессами ПОП и липолиза под действием РШ) существует отрйцательная обратная связь. С одной стороны, гидролиз-фосфолипидов РШ в модельных системах приводит к снижению скорости их индуцированного

ыик

во МИН

Рис. 1.'Влияние преипкубации фосфолппидов о фосфотшааой О на скорость образования мДА (а) и ¿Ж (б) при индукции ПОД в системе Ре - аскорбат в мицелпярной системе

1 - до гидролиза; 2 - 2ч гидролиза.

1ерекисного окисления. С другой стороны, перекисное окисление фосфолипидов уменьшает их подверженность гидролизу PL0.

1.3. Взаимосвязь ПОЛ и .тполиза. поя действием PLC.

Гидролиз фосфолипидов под действием PLC (степень гндро-низа. фосфолипидов, оцененная по отношению убыли фосфора к эго исходному содержанию в липидной фракции, составляла за 1 i - 24X, за 2 ч -UX) приводил к увеличению скорости индуци-эованного ПОЛ в. 1,5 раза. Причиной активирующего влияния 4.0, вероятно, является накопление диглицеридов. Процессы I0JI чувствительны к структурной организации мембран, а диг-(шцериды, как известно, являются "мебислойными" липидами, цаже при низком их содержании в модельных и биологических мембранах образуются участки обращенной гексагональной фазы.

Было изучено влияние ПОЛ на активность PLC. Для этого Зыла исследована зависимость активности PLC от степени окис-пенности субстрата, которая показала, что окисленные произ-' водные фосфолипидов оказывают ингибирукиций эффект на PLC.

Для того, чтобы выяснить причины ингибирующего влияния окисленных продуктов, были изучены субстратные зависимости 3LC и вычислены по ним кинетические параметры ферментативной эеакции (V,nax и К™) в отсутствие ингибитора и при 3-х разных ганцентрациях ингибитора (ингибитор - окисленные производные фосфолипидов).• Определенные концентрации ингибитора задавали, меняя соотношение частично окисленных и неокисленных фосфолипидов. При этом, учитывая низкое содержание ингибито-• за; В/ частично окисленном субстрате (0,18Х), за общую концентрацию субстрата принимали суммарную концентрацию неокис-иеиных и частично окисленных фосфолипидов.

Зависимости активности PLC or концентрации субстрата в координатах Лайнуивера - Бэрка (прямые 1-4, рис.2) свидетельствуют о том, что продукты окисления не влияют на максимальную скорость фосфолипазной реакции, но увеличивают зна-1ение Km (рис.2,. табл.1), то есть являются конкурентными ингибиторами. ■ Об этом же свидетельствует и зависимость актив-юсти PLC от концентрации частично окисленных фосфолипидов, содержащих гидрокси-производные в количестве 2,5 нмоль/мг. 1рямая, отражающая эту зависимость, параллельна субстратной зависимости для неокисленного субстрата (прямые 1 и 5, зис.2). Известно, что подобная картина характерна, в част-

- а-

0.8 Г

4 в

1/3 , ил/иг

Рис. 2» Субстратные зависимости, фосфолипаоы С при разных концентрациях частично окисле-ного субстрата : 1 - пеокиеленные пипиды; 2, 3, 4—смесь неокисленных и частично окисленных фосфолипидов(хонцентрация гидроперокс-скдоа 0,50; 0.88 и 1,25 мкМ соответственно); 5-частячно окисленные ф'осфопипиды(сбдерасание пвдропероксидов-2,6 вмоль/мг фосфолшшдов)

- Г) -

ности, для случая наличия примеси ингибитора в препарата субстрата.

Было изучено влияние водорастворимых продуктов ПОЛ- на активность PLC. Для этого водно-метанольный слой, полученный после экстракции окисленных фосфолкпидов, упаривали•в вакууме для удаления метанола. Полученный таким образом водный раствор Продуктов ПОЛ добавляли в среду с неокисленным субстратом и определяли активность PLC. Водорастворимые продукты ПОЛ при концентрации МДА 10,6 нмоль/мг фосфолипидов снижали скорость фосфолипазной реакции вдвое (2,20 мкмоль "мин ~г •мт по сравнению с 4,39 мкмоль 'мин-1 'мг-1 в контроле).

Таблица 1

Значения кинетических параметров (Km и Vmax) для реакции, катализируемой .фосфолипазой С,при различных концентрациях частично окисленных фосфолипидов." .

N Концентрация Vmax. Km, мг/мл

гидролероксидов мкмоль*мин"1*мг-1

1 0 9,71 ± 1,19 0,85 ± 0,11

2 0,50 мкМ 8,85.± 1,06 1,17 ± 0,14

3 0,88 мкМ 8,78 ± 0,79 1,54 ± 0,19

4 1,25 мкМ 8,85 ± 1,77 1,93 ± 0,13

5 0 - 1,75 мкМ 2,54 i 0,06 0,20 ± 0,01

(2,5 нмоль/мг)**

Примечание.

" - Значения . кинетических параметров рассчитывали с использованием метода наименьших квадратов. В таблице указаны доверительные интервалы для р - 0,05, п - 6.

"* - Зависимость активности фосфолипазы С от концентрации частично окисленного субстрата в отсутствие неокислен-ного.

Таким образом, PLC ингибируется как водорастворимыми продуктами ПСШ, так и самими окисленными липидами, причем

- 10 -

последние являются конкурентными ингибиторами.

С другой стороны, гидролиз яичных фосфолипидов под действием PLC приводит к ускорению их Fei+ - индуцированного пе-рекисного окисления. .

Подводя итоги изучения взаимосвязи между ПОД и липолизом в модельных системах, • сравним полученные нами данные с результатами других авторов. -

Гидролиз фосфолипидов PLD, PLÄ2 и LPLA приводит к снижению уровня Fe2+-индуцированного ПОЛ, что связано, на наш взгляд, с комплексованием железа продуктами лилолиза - СЖК и ФК.' Это -подтверждается данными других авторов (Balasybramanlan et al.,1992) об антиокислительной способности СЖК, а также данными (Viani et al.,1000), согласно которым дипальмитоил-ФК оказывает сильный ингибируюший эффект на Fe2+-индуцированное ПОЛ за счет связывания ионов железа с ФК; PLC, в отличие от PLA2 и'PLD, оказывает стимулирующий эффект на ПОЛ, что связано, на наш взгляд, с образованием небислойных участков. К сожалению, мы не можем сравнить наши данные с результатами других авторов, так как этот вопрос ранее не изучался.-

Фосфолипиды, подвергнутые ПОЛ, хуже гидролизуютсл PLD и PLC, PLA2 гвдролизует окисленные и неокисленные фосфолипиды с одинаковой скоростью. Эти наши данные находятся в соответствии с некоторыми данными других авторов, например о полном ингибировакии PLC из Clostridium perfrlngens окисленным ФЭА (Gamashe et al.,1988). С другой стороны, имеется большое число прямо противоположных данных о предпочтительном фосфолипавном гидролизе окисленных фосфолипидов и о стимулирующем влиянии ПОЛ на активность фосфолипаз. Тщательный анализ этих данных • показал что. все данные об ингибирующем влиянии ПОЛ на фосфолипазы получены в модельных системах, а об активирующем - в биологических'мембранах. Это позволило нам предположить, что важную роль в проявлении взаимосвязи между ПОЛ и активностью фосфолипаз играет структурное состояние мембраны. В связи с этим следующим этапом исследований было изучение взаимного влияния ПОЛ и эндогенных фосфолипаз в биологических мембранах на примере митохондрий.

- 11 -

2. Изучение взаимосвязи между ПОЛ и активностью эпдогеп-ш фосфолипаз ннтохонлрнй.

2.1.Влияние аддукторов ПОЛ «а активность митохоядриаль-ных фосфолипаз.

Влияние индукторов ПОЛ изучали, добавляя их в среду инкубации митохондрий. Смесь инкубировали при 37°С при перемешивании. По мере инкубации, отбирали аликвоты, ПОЛ останавливали добавлением ЭДГА (только в случае индукции ПОЛ в системе Fe2* - аскорбат), фосфолипиды экстрагировали, определяли содержание продуктов ПОЛ и фосфолипидный состав, по-изменению которого судили об активности митохондриальных фо'сфо-липаз.

Активности митохондриальных фосфолипаз оценивались .по предложенной нами.ехеме ферментативных превращений митохондриальных фосфолипидов, представленной на рис.3. Согласно-этой схеме активность PLAj может быть оценена по накоплению лизофосфолипидов (реальная активность этого фермента.вше, чем экспериментально регистрируемое накопление лйзофосфоли-пидов, поскольку часть образующихся лизофосфолипидов гидро-лизуется под действием LPLA). Активность PLD может быть оценена' по накоплению СК (реальная' активность PLD тоже выше, так как часть образующейся ФК может быть гидролизована РЬАг и PLC). Суммарная активность PLC и LPLA может быть оценена по снижению содержания общего липидного фосфора. Уменьшение• содержания основных митохондриальных фосфолипидов (ФХ, ФЭА, КЛ, ФИ и ФС) отражает суммарную активность всех митохондриальных фосфолипаз. Данный подход, позволяющий оценить активности митохондриальных фосфолипаз в различных условиях и был использован нами далее при изучении влияния индукторов ПОЛ на активность митохондриальных фосфолипаз.

Как видно из рис.4, при добавлении Fe21" и аскорбата.в среду инкубации активность PLAg' возрастает, поскольку более интенсивным становится снижение основных фосфолипидов и.накопление их лизопроизводных. Активность PLD также возрастает: накопление ФК в присутствии Fe2'1" и аскорбата больше. Активность PLC и LPLA, по-видимому, не изменяется, поскольку снижение общего липидного фосфора практически одинаково как в присутствии, так и в отсутствие индукторов ПОЛ (табл.2).

йос&натща 4х. сэа. кл. «а, ее

-■40,4

FU) / J

J

/

СООЭАТЦЩШ! КИСЛОТА

• ш

I

FLC

Ч RLA2 Ч

ч

лззшсФолишда JÍSX. ®ЭА. ЛКД

+•1,4

У +22.8 /

/ LPLA

/

/»

водо-

РАСТВОРКЫЬЕ Рл-ООДЕРадНБ ПРОДУКТЫ

+21,0

р,-;с. 3. Схема ферментативных превращения юггохощ&агаяьнш фосфалипвдов в гипотонической средо с Са (числами указано изменение содержания фосфолипвдов за 120 юш, имоль/мг белка)

Рис. 4. Влияние Ге - индуцированного ПОЛ на . изменение содержания митохондриальньде фосфошшидов в гипотонической среде о С а

Таблица 2

Влияние Ре2 и аскорбата на фосфолипидньш состав митохондрий (в 7. к Рл - общему лигощюму фосфору) и содержание продуктов ПОЛ при инкубации в гипотонической среде в присутствии 2 мМ Саг*.

Фосфолипиды Контроль Инкубация митохондрий при 37° в течение 120 мин

без инд.ПОЛ с инд. ПОЛ с инд. ПОЛ после экстр. с инд. ПОЛ в прис.ионола

Фосфатидилхолин Лизофосфатидилхолин Фосфаткдидэтанолаюш Лизофосфатидилэтаноламин Кардйолшшн Лизокардколипин Фосфатшшлинозит Фосфатицилсерин Сфингомиелин Фосфатидяая кислота 44 3 ± 1,06 2;з ± 0,28 27,2 ± 1,41 2,6 ± 0,14 13,1 ± 0,69 0,3 ± 0,07 5,5 ± 0,57 2,0 + 0,71 2,4 ± 0,28 0,3 ± 0,28 41,5 х 2,12 5.2 t 1,27 20,9 ± 1,93 9,0 ± 0,99 .9,6 ± 0,14 2,6 ± 0,14 5.3 i 0,42 2,8 ± 0,28 1,6 ± 0,14 1.4 ± 0,28 39.5 ± 1,98 6.5 ± 0,28 15,0 * 0,14 13,4 ± 0.14 9.6 ± 0,42 3,4 ± 0,28 5,4 ± 0,42 3.0 ± 0,28 1,9 ± 0,42 2,3 ± 0,14 45,0 + 2,40 2.4 ± 0,42 28.0 ± 1,98 2.5 ± 0.28 12.1 ± 0.14 0,0 5,0 ± 0.42 2.4 + 0.57 2,4 ± 0,14 0,2 ± 0,28 41,5 ± 2,40 4,8 ± 0,28 21,5 4 1,98 9.1 ± 0.42 9.8 ± 0.28 2,3 ± 0,28 5,1 ±0,71 . 3,0 ± 0.28 1.6 1 0.42 .1,3 ± 0,00

Рл, нмоль/мг белка 250 ± 6,6 229 ± 3,7 231 ± 2.9 247 ± 2,7 226 ± 4,3

ЩА, ммоль /моль фосф-дов 0,29 ± 0,005 0,46 ± 0,04 5,63 ± 0,10 5,71 ± 0,22 0,33 ± 0,05

Примечание.

инд. - индуцированный

Изменение гЧ-сфолипидного состава в присутствии активатороа ПОЛ связано о их влиянием на митохондриальные фосфолипазы, а не с какими-либо неферментативными процессами, так как индукция перекисного окисления фосфолипидов, экстрагированных из митохондрий, не привела к изменению фосфолипидного состава. Влияние Ге2+ и аскорС'ата на активность митохондриальных фосфолипаз не является непосредственным, оно связано с дейс■ твием продуктов ГШ, поскольку антиоксиданг ионол полностью предотвращал эффект Ге24" и аскорбата на фосфолипидный состав митохондрий (табл.2). Если причиной активации митохондриаль-ных фосфолипаз действительно являются продукты ЛОЛ, то эта активация должна происходить при перекисиом окислении мито-хондриальных фосфолипидов независимо от способа индукции. Для того, чтобы проверить это предположение, в качестве индуктора ПСЛ была испольЕосана гидроперекись купола (4 'Ю-3 Ы). В результате также наблюдалось повышение активности ми-тохондриальных фосфолипаз. Это еще раз доказывает то, что влияние на фосфолипазную активность оказывают не индукторы ПОЛ, а продукты перекисного окисления митохондриальных фосфолипидов. .

Отметим, что - данные об активации Р1Аг под действием ПОЛ подтверждают полученные ранее результаты для митохондрий и других мембран. Причиной активации считают структурные изменения в мембране под действием продуктов ПОД, а также предпочтительный гидролиз окисленных фосфолипидов под действием РЬАг. Влияние ПОЛ на митохондриальную Р10, а также на другие мембранные Р1Л ранее не изучалось.

Описанный выше активирующий эффект продуктов ПОЛ на активность митохондриальных фосфолипаз был обнаружен в присутствии Са2+ - известного активатора подавляющего большинства как секреторных, так и мембранных фосфолипаз. Вопрос об активации мембранных фосфолипаз ионами Са2+ на протяжении нескольких десятилетий является предметом для дискуссий. Митохондриальные фосфолипазы, так же, как и.другие, мембранные фосфолипазы, проявляют незначительную активность и в отсутствие экзогенного Са2+\ однако их активность резко возрастает при добавлении Са2+, достигая максимума при 1-2 мМ. Факт активации мембранных фосфолипаз миллимолярными концентрациями Са2+ является твердо установленным и никем не скуривается.

Подзоргаетса, однако, сомнению физиологическое значеилз ta-, кой активации, поскольку концентрация Са2+ в клетке на несколько порядков ниже как в норме, так й при патологических состояниях, когда активность фосфолипаз резко увеличиваемся. Таким образом вопрос о механизме "запуска" мембранных фоСфот липаз ln vivo до сих пор оотается открытым.

Таблица 3

Активности митояондриальных фосфолипаз в гипотонической среде, нмоль фосфолипидов/мг белка за 2 ч*

1 ' 1 | Фосфолипазы Среда инкубации --- с Са2+ ... о Fe2+ |Са2+ +Fez+|

| Фосфолипаза Аг >2,8 >22,85 >16,03 I >37.41 |

| Фосфолипаза D >0,S >1.4 >1,2 1 >2,3 |

| фосфолипаза С 1 и | лизофосфолипаза А 10.0 21.0 17,5 | 18,25 |

I Суммарная актив-I ность фосфолипаз 21,0 48,4 35.5 1 58.2 | j-1

Примечание.

* - здесь и в табл.4 активность митохондриальных фосфолипаз оценивалась по изменению содержания: лизофосфоли-пидов - ЛФХ, ЛФЭА, ЛКЛ- (фосфолипаза Аг); ФК (фосфолипаза Э); общего лииидного фосфора (фосфолипаза С и лизофосфо-липаза А). Суммарная активность фосфолипаз оценивалась по убыли основных фосфолипидов (ФХ, ФЭА. КЛ, ФИ, ФС).

Исходя из вышеизложенного в настоящей работе было изучено влияние и аскорбата. на фосфолипидный состав мито-

ховдрий в огутсдаке экзогенного Са2+. Показано, что индукция ПСШ в отсутствие Са2* приводит к активации всех мито-хоядриальних фосфолипаз (PLA2. PLD. PLC и LPLA). Активирующий эффект ионов железа сравним с активирующим эффектом Са2+ (табл.3).

Обнаруженный нами эффект активации ыитохондриалышх фосфолипаз продуктами ПСЛ может иметь важное значение в понимании механизмов регуляции мембранных фосфолипаз. Процессы ПОЛ реально протекают в клетке. Индукторами ПОД могут служить ионы переменной валентности, органические гидроперекиси и др. Среди ионов переменной валентности лишь ионы железа присутствуют в биологических жидкостях и внутри клеток в заметных количествах. Наличие ионов железа является достаточным условием появления в клетке цитотоксических радикалов липи-дов.. Содержание радикалов может сильно меняться в ходе процессов метаболизма и таким образом может осуществляться регуляция активности фосфолипаз.

Описанные выше эксперименты по изучению влияния Fez+ и аскорбата на митохондриалыше фосфолипазы были проведены в • гипотонической среде.

Для того, чтобы выяснить, имеет ли место активирующий эффект Fe2+ и аскорбата .в условиях, близких к фиэиологичес- . ким, была проведена серия экспериментов в изотопической среде. Из таблицы 4 видно, что в этих условиях продукты ПСЯ вызывали активацию всех митохондриальных фосфолипаз, при этом активирующий эффект ПОЛ на суммарную активность фосфолипаз был в. 1,5 раза больше, чем в гипотонической среде.

Приведенные выше данные свидетельствуют об активирующем влиянии Fe2*-индуцированного ПОЛ на мигохондриальные фосфо-, липазы. Активация фосфолипаз проявлялась как в гипотонической, так и в изотонической среде, как в присутствии, так и в отсутствие ионов Са2+.

Таблица 4

Активности митохондриальных фосфолипаз .. в изотоническом среде, нмоль фосфолшшдов/мг белка эа 1ч

( . . | Фосфолипаэы Г 1 1 Среда | | инкубации | с Са2+ 1 о Ре2+ |

I Фосфолипаза Аг 1 >6,9 | >30,11 >12,61. |

I Фосфолипаза Б 1 >3,8 | >4,17 >5,1 |

I Фосфолипаза С | и | лизофосфолипаза А 1 6.6 | 30;3 2^,0 |

I Суммарная актив- I ность фосфолипаз | 1 18,8 | 1 ._,..,_.! 68,0 52,32: | |" '

2.2. Влияние фосфолипазного гидролиза ттохондриальных фосфолитдов на их подверженность лерокисному окислению.

Била изучена подверженность митохондриальных фосфолипи-дов индуцированному ЕСЛ до и после их фосфолипазного гидролиза. Для этого митохондриальные фосфолипиды гидролизовали с помощью экзогенных и эндогенных митохондриальных фосфолипаз. Зндогешше фосфолипаэы митохондрий были активированы с помощью операции многократного замораживания-оттаивания. В качестве. экзогенных фосфолипаз был использован бйферментный комплекс из яда пчелы (РЬАг + ЬРЬА).

При сравнении влияния фосфолипазного гидролиза на скорость ПОД, индуцированного гидроперекисью кумола и Ре2+ -аскорбатом, использовали Р1.Аг из яда кобры.

После инкубации митохондрий с экзогенным биферментным комплексом (РУ\2 + 1ЛА), к митохондриальным фосфолипидам

бщи доба&к.н индукторы ПОЛ. Образование ЩА'в этом случаа било в 10 раз меньше, а ДК - в 6 раз меньше, чем в контроле.

Активация фосфолипаа митохондрий замораживанием-оттаиванием привела к существенным изменениям фосфолипидного состава митохондрий: содержание основных фосфолипидов снизилось в сумме в 3,5 раза, повысилось содержание лизофосфолипидов и уменьшилась концентрация общего лилидного фосфора. В этой случае наибольшему гидролизу подвергался ФЭА. Гак же, как и после гидролиза экзогенными фосфолипаэами, образование МДА и ДК после индукции ПСИ в этом случае было существенно ниже (в 21 и 8 раз), чей в контроле.

Таким образом, гидролиз митохондриальных фосфолипидов как экзогенными, так и эндогенными фосфолипаэами приводит к резкому снижению скорости ПОЛ. Ш предположили, что так же, как и в случае гидролиза фосфолипидов в модельных системах РЬАг и РЮ, снижение! скорости ПОЛ связано с комплексованием ионов железа продуктами липолиза. Для проверки данного предположения в качестве индуктора ПОЛ вместо ионов Го2+ и ас-корбата была использована гидроперекись кумола.

В случае индукции ПОЛ гидроперекисью кумола предварительный гидролиз митохондриальных фосфолипидов под действием РЬАг также приводил к снижении скорости ПОЛ, хотя степень ингибирования ПОЛ в этом случае, была ниже, чем при индукции окисления в системе ■ Ре2+-аскорбат. Это свидетельствует о том, что комплексование Го2* с С®, по-видимому, действительно имеет место в случае Гв2+-индуцированного ПОЛ, однако этот фактор не является единственной причиной снижения скорости ПОЛ после липолиза. Другой причиной, по-видимому, являются структурные изменения в мембране, происходящие в результате липолиза.'

Суммируя результаты, приведенные в настоящем разделе, можно заключить, что продукты ПОЛ увеличивают активность митохондриальных фосфолипаа. Гидролиз митохондриальных фосфолипидов под, действием экзогенных и эндогенных фосфолипаа уменьшает их подверженность индуцированному перекисиому окислению.

Гипотеза о ■¡аашосвяаи иеаду КОЛ и аюиянсстьп фаоф<шя~ паз в ыитохаилрмяк.

Учитывая вышеизложенное, можно предложить следующую гипотетическую схему взаимосвязи между ПОЛ и Р1Аг в мембранах митохондрий. Индукция ПОЯ в мембране вызывает активацию РЬАг и образующиеся при этом продукты - СЯК.и лизофосфолипиды - в зависимости, от глубины происшедшего гидролиза вызывают либо изменение функциональных параметров мембраны (увеличение проницаемости для катионов, падение мембранного потенциала, разобщению окислительного фосфорилирования, образованию пор) либо ее повреждение и полный лизис. В первом случае это выражается в определенном функциональном ответе, во втором -фосфолнпазы выполняют роль "санитаров", разрушая мембраны, поврежденные окислением. При этом активация РЬАг является* мощным усилителем эффекта ПСЛ на состояние мембран. Если в результате ПОЛ окислению подвергается менее проценту -фосфо-ЛЙПИД1ШХ молекул, то последующая активация.эндогенных фосфолипаз приводит к 30% гидролизу основных фосфолипидов митохондрий, из лих наибольшему гидролизу (49£) подвергается ФЭА '(табл.2). На наш взгляд! именно этот эффект-усиления является главной причиной деградации мембран при различных патологиях,. сопровождающихся усилением ПОЛ. -Окислительное повреждение мембран связано не только, и не столько с окислением мембранных липвдов самим по себе, а с активацией эндогенных фосфолипаз продуктами ПОЛ, в результате которой накапливаются лизопродукты, приводящие к деградации мембран.

С другой стороны, активация РЬАг при ПОЛ может играть и защитную, роль в предотвращении окислительного повреждения мембран за счет образования ОКК, оказывающих разобщающий эффект и снижающих тем самым продукцию свободных радикалов в дыхательной цепи. РЬАг предохраняет мембрану от повреждения, предпочтительно гидролизуя окисленные фосфолипиды и удаляя И8 них окисленные ЖК, свободные гидроперекиси которых далее гидролизуются глутатион-пероксидазой. Защитный эффект РЬАг может проявляться тагане за счет комплексования СЖК с железом или других катионов переменной валентности, являющихся индукторами ПОЛ.

Активация 1РЬА под действием ПОЛ также может играть за-

цитную роль б предотвращении окислительного повреждения митохондрий, во-первых, за счет образования'СЕК и. во-вторых, за счет гидролиза и удаления из мембраны лизофосфолипидов. называющих детергентное действие.

Функциональные последствия активации PLD и PLC под действием ПОЛ трудно предсказать ввиду недостаточного изучения IX роли в митохондриях. Не исключено, однако, что PLD маг.ет увеличивать проницаемость внутренней митохондриальиой мемб-занц для ионов Са2+, так как показано, что образующаяся в результате ее активации ФК является кальциевым ионофором.

С другой стороны, показано, что ФК образует комплексы с гонами Ге2+, в результате активации PLD, таким образом, монет повышаться устойчивость митохондриальных липидов к 7е2+-индуцируемому БОЛ. Кроме того, возможно,- что митохонд-зиальные PLD и PLC, подобно фосфолипазам плазматической мембраны, участвуют в передаче и усилении внутриклеточного :игнала вовнутрь митохондрий. Е этом случае, регуляция их активности продуктами.ПОЛ может иметь существенное значение.

ВЫВОДЫ.

1. Гидролиз яичных фосфоляпидов очищенными PLA2 и PLD ■ фиводит к снижению -их подверженности Ре2+-индуцированному ЮЛ. Причиной является связывание Fez+ продуктами фосфоли-газного гидролиза - CffiC и ФК.

2. Гидролиз яичных фосфолипидов очищенной PLC увеличива-!т их подверженность Ре2+-индуцированному ПОЛ.. Стимулирующее ¡лияние на скорость ПОЛ оказывают продукты фосфолилазного ■идролиза - диацилгдицериды, образующие дефекты в бислойной 'паковке лилосом.

3. Очищенная PLA2 с одинаковой эффективностью гидролизу->т неокисленные и. окисленные фосфолипвды, PLC и PLD с боль-гей скоростью гидролизуют неокисленные фосфолипвды. Для PLC юказано ингибирующее действие как гидрофильных, так и липо-щьных продуктов ПОЛ, причем последние являются конкурентными ингибиторами фермента. ....

4. Продукты перекисного окисления митохондриальных фос-)олипидов активируют эндогенные PLA2, PLD, PLC и 'PLA, при-

чем активирующий эффект сравним с эффектом классического активатора фосфолипаз - ионов Са2+. Этот эффект проявляется как в отсутствие, так и в присутствии экзогенного Са2+, предотвращается антиоксидантом ионолом и не зависит от способа индукции ПОЛ.

5. Гидролиз митохондриальных фосфолипидов под действием экзогенных PLA¿ и LPLA, а также в результате активации эндогенных фосфолипаз уменьшает их подверженность индуцированному перекисному окислению.

6. Предложена гипотеза о взаимосвязи между ПОЛ и активностью фосфолипаз в митохондриях, согласно которой продукты ПСМ являются регуляторами активности митохондриальных фосфолипаз, приводя, в зависимости от глубины происшедшего липо-лиза, либо к изменению функционального состояния митохондрий, либо к повреждению и деградации митохондриальных мембран, либо к защите митохондрий от окислительного стресса.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ.ДИССЕРТАЦИИ

1. Вагина О.Н., Замараева М.В., Гевантмачер C.B., Маре-нинова O.A., Таимухамедов Б.А. Взаимосвязь перекисного окисления фосфолипидов и их гидролиаза фосфолипазой D в модельных системах // Биохимия. -. 1995. - Г.60. - N 10. -С. 1596-1599.

2. Маренинова O.A., Гевантмахер C.B., Вагина О.Н., Га-гельганс А.И. Влияние поливалентных катионов на активность митохондриальной фосфолипазы A¿ // Научная конференция, посвященная 60-летию со дня рождения Ташмухамедова Б.А.: Тезисы дсчладов. - Ташкент, 19S5. - С.83.

3. Vagina O.N., Gçvantmakher S.V., Mareninova O.A., Zamaraova M.V., Rakhintov M.M., Tnslimukhanedov B.A. The relationship between lipid peroxidation and enzymatic llpolysis of egg phospholipids // Physical Chemical Biology & Medicine. - 1096. - V.3. - Ni. - P. 15.-18.

МТОХОИДРШЛР В А МОШЬ . СИСТЕМАЛАРДА ПЕРЕКИСЛИ ОКСЩЯАНШ ВА ФООКШПАЗЛЛАР АКТИВДИГЮМНГ J3AP0 ЕОРЛЩЛИГИ

Ыаренинова О. А.

Митохондриялар ва модель системаларда ЛПО билан хар хил позицион специфик фосфолипазалар активлиги уззро борлириги урганютан. Тозаланган фосфолипаза Аг ва фосфолипаза D нинг Fe2+ Оилан индуцирланган ЛПО тезлигига лнгибирловчи таъсири модель системаларда курсатилди. Аксиьча, тозаланган фосфолипаза С ёрдамидатидролизланган фосфолипидлар ЛПО ни сезилар-ли даражада кучайтиради. Тозаланган фосфолипаза Аг е'рдамида-ги фосфолипидлар гидролизининг' тезлиги фосфолипидлар оксид-ланиш даратасига богли^ змаслиги ^айд этилди. Тозаланган фосфолипаза С ва фосфолипаза D купрок оксидланмаган фосфоли-пидларни гидролизлайди. Диссертацияда курсатилишича, оксид-ланган фосфолипидлар фосфолипаза С нинг конкурент ингибитор-лари >;исобланади.

Митохондриялар эндоген фосфолипазалари активлиш ва ЛПО . орасидаги боглшушги урганилди. Курсатилишича, Fe2+ ва ос-корбат, кумол гидроперекиси таъсирида митохондриал фосфоли-пидларининг перекисли оксидланиши натияасида ^осил б?лган махсулотлар митохондриал фосфолипазалар активлигига сезилар-ли таъсир этар экан:- фосфолипаза Аг, фосфолипаза С, фосфоли-' ■ паза D ва лизофосфолипаза А ни активлигини оширади. Митохондриал фосфадипидларни эндоген ва экзоген фосфолипазалар' билан гидролизлаш ЛПО дарахасини камайшлига олиб келади, бу х;олат Fe2+-acKop6a? ва кумол гидроперекиси бидан индуцирлан-гал системада гидролизлангандан сунг руёбга читали.

THE RELAT10HSHIP BETWEEN LIPID PEROXIDATION AND PH0SPI10LIPASE ACTIVITY IN THE MODEL SYSTEMS AND MITOCHONDRIA

Mareninpva O.A. . .

The relationship between lipid peroxidation and " the activity of phospholipa-ses of different positional speclflty .

In the model systems and mitochondria has been studied. Inhibition effect of isolated phospholipase A2 anc phospholipase D on.Fe2+-in'duced lipid peroxidation rate has been shown In the model systems. Hydrolysis, of phosphoHpic by isolated phospholipase C, in contrast, essencially Increases thu succeptibility of phospholipids to the peroxidation. The. rate of ■ hydrolysis of phospholipids by Isolated phospholipase A2 doesn't-depend on the degree of oxidation of phospholipids. It has been shown that oxidizec .phospholipids are competative inhibitors of phospholipase C.

The relationship between lipid peroxidation and the activity of endogenous phospholipase? in ■ mitochondrlr. has been studied. It has been shown that mitochondrial phospholipid peroxidation products formed under action of Fe-+ and ascorbate, as well as 'cumene hydroperoxide, essencially influence on the activities of mitochondrial phospholipases: activate phospholipase A2, phospholipase C, phospholipase D and lisophospholipase. A. Hydrolysis of mitochondrial phospholipids by exogenous . and endogenous phospholipases leads to the • increase in the lipid peroxidation rate, induced by Fe2+-as'corbate system and by cumene hydroperoxide after the hydrolysis.

J(€

.' • p, « Подписано к печати

зАк.- U.I- f/6{; Тираж CJC 199 Уi-.OЬ. 'С Отпечатано в АН ТПК

Ташкент, Навои, УО.