Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка новых биоматериалов типа "искусственная кожа" на основе фторполимерного латекса, модифицированного полисахаридами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разработка новых биоматериалов типа "искусственная кожа" на основе фторполимерного латекса, модифицированного полисахаридами"

На правах рукописи

Давыдова Галина Анатольевна

РАЗРАБОТКА НОВЫХ БИОМАТЕРИАЛОВ ТИПА «ИСКУССТВЕННАЯ КОЖА» НА ОСНОВЕ ФТОРПОЛИМЕРНОГО ЛАТЕКСА, МОДИФИЦИРОВАННОГО ПОЛИСАХАРИДАМИ

03.00.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

ПУЩИНО - 2005

Работа выполнена в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН, г. Пущино

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Гаврилюк Борис Карпович

кандидат физико-математических наук Селезнева Ирина Ивановна

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор

Берестовский Генрих Николаевич

Ведущая организация: Московский Государственный Университет,

Физический факультет

Защита диссертации состоится " 14 " декабря 2005г. в /3 часов 30 мин, на заседании Диссертационного Совета Д 002.093.01 в Институте Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московской обл., ул. Институтская, 3

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московской обл., ул. Институтская 3, ИТЭБ РАН

Автореферат разослан " 12 " Н0Я$рЯ 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор физико-математических наук Полозов Роберт Валентинович

кандидат физико-математических наук

Н.Ф. Панина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Последнее десятилетие характеризуется бурным развитием науки о биоматериалах, вследствие возросшей потребности в этих материалах для использования в медицине и трансплантологии. Динамично развивается новое направление тканевой инженерии, возникшее на стыке физики, химии и биологии. В рамках данного направления ведутся работы по созданию на основе природных и синтетических полимеров и клеток разных типов тканевых аналогов, призванных скомпенсировать утраченные функции отдельных органов или даже восстановить орган искусственно.

Данная работа посвящена разработке новых биоматериалов типа «искусственная кожа», предназначенных для закрытия ожогов, трофических и иссеченных поражений кожного покрова, а также обеспечения эффективного переноса клеточных пластов на раневую поверхность для стимулирования регенерации глубоких и труднозаживающих ран.

В настоящее время существуют раневые покрытия либо на основе синтетических полимеров, либо на основе полимеров, полученных из биологических источников. Однако, синтетические полимеры, являясь хорошим механическим каркасом, не обладают необходимой биологической активностью. Природные полимеры, обладая хорошей биологической активностью, не имеют достаточной механической прочности и отличаются высокой скоростью биодеградации. Т.о. актуальным является создание композитных материалов, объединяющих достоинства природных и синтетических полимеров. Примером таких материалов стали появившиеся в последнее время композиционные материалы типа «сэндвич», в которых на полимерную синтетическую матрицу методом пошаговой модификации нанесен природный полимер (Магу С е1 а1.,1998, Ь'.КНгще е1 а1.,2003). Эти материалы дорогостоящи, сложны в производстве, и, кроме того, входящий в их состав природный полимер при химическом связывании частично утрачивает свои биологические свойства.

Отсутствие композиционных материалов, обладающих однородными характеристиками во всем объеме, на основе смесей синтетических и природных полимеров вызвано практически полным отсутствием сведений о механизмах взаимодействия между полимерами разной природы и факторах, определяющих свойства материалов на микро и макроуровне. Данная работа, нацеленная на исследование взаимодействия полисахаридов с синтетическим фторлатексом и выявления связи структуры, физико-химических характеристик и биологической активности формируемых биоматериалов, является актуальной не только для решения ряда задач тканевой инженерии и медицины, но и для проведения фундаментальных исследований, лежащих /га стыке фнзнкн( -химии и биологии.

РОС НАЦИОНАЛЬНА"| БИБЛИОТЕКА |

Цель и задачи исследования. !

Цель данной работы заключалась в изучении механИУМин 1ШИМиДёИСЧвйя полисахаридов с фторполимерным латексом на молекулярном и надмолекулярном уровне и исследовании связи структуры с физико-химическими характеристиками и биосовместимостью материала.

В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи: 1. Исследовать взаимодействие фторсодержащего латекса с альгинатом натрия и метилцеллюлозой в растворах и в составе композитных пленочных материалов;

2. Изучить процесс структурообразования композитных материалов при разных концентрациях альгината натрия и метилцеллюлозы и различных условиях сушки;

3.Изучить влияние на эластические и прочностные характеристики и свойства поверхности композитных пленочных материалов процентного содержания альгината натрия и метилцеллюлозы;

4.0пределить зависимость сорбционной способности, паропроницаемости и устойчивости к растворению композитных пленочных материалов от процентного содержания альгината натрия и метилцеллюлозы;

5. Выявить влияние процентного содержания альгината натрия и метилцеллюлозы в составе композитных материалов на адгезию и рост субстратзависимых клеток млекопитающих.

Научная новизна работы.

В данной работе впервые применен комплексный подход к исследованию взаимодействия синтетических и природных полимеров. Исследование стабильности латексно-полисахаридной дисперсии и определение физико-химических характеристик субстрата впервые были проведены параллельно с исследованием клеточной активности.

На основе построенной фазовой диаграммы и проведенных физико-химических исследований предложена модель взаимодействия латекса с анионным (альгинат натрия) и неионогенным (метилцеллюлоза) полисахаридами. Впервые показано, что различие механизмов взаимодействия молекул заряженных и нейтральных полисахаридов с латексом приводит к различиям в структуре и физико-химических характеристиках композитных материалов.

Исследования, проведенные на молекулярном, надмолекулярном и клеточном уровнях, позволили выявить механизмы взаимодействия фторлатекса с анионным и неионогенным полисахаридами. Это является существенно новым подходом к решению фундаментальной задачи выявления взаимосвязи структуры и функций композитных материалов на микро- и макроуровнях.

Практическое значение.

Разработанные композитные пленочные материалы удовлетворяют требованиям, предъявляемым к раневым покрытиями и одновременно обладают способностью поддерживать адгезию и распластывание субстратзависимых клеток. Это делает возможным применение данных биоматериалов в качестве раневого покрытия, служащего одновременно подложкой для атравматичного переноса клеточных пластов на рану. Данное свойство обеспечивает значительное преимущество по сравнению с существующими ныне раневыми покрытиями и открывает широкие перспективы для использования разработанной нами «искусственной кожи» при лечении глубоких ожогов и трофических поражений кожи.

Апробация работы и публикации. Работа была представлена на Втором съезде биофизиков России (Москва, 1999), IV Городской научной конференции молодых ученых (Пущино, 1999),конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" ( Пущино, 2001), школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), IV Международной конференции "Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов" (Москва, 2001), конференции «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии. Теория и практика клеточных биотехнологий» (Самара, 2004), I украинской конференции «Проблеми бюлопчно1 i медично! ф1зики», (Харьков, 2004), XVII зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и микробиологии», (Москва, 2005), международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века", (Пущино, 2005), на 2-й международной конференции «Наука-Бизнес-Образование» (Пущино, 2005). По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения и 4 глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитированной литературы из Y3Q наименований. Работа изложена на //"^страницах машинописного текста и содержит рисунка и X таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования

В качестве полимерной основы использовалась водная дисперсия латекса СКФ-26. (Кирово-Чепецкий ХК, ТУ 6-05-041-352-83), представляющего собой сополимер винилиденфторида с гексафторпропиленом:

-КСН2—CF2)m-(CF2-CF)n]p

CF3

Mw-10"5 =4,53

Mn'10"5 =1,78

93 % звеньев соединены по типу «голова к хвосту» —[CH2CF2]—[CF2 CF(CF3)]

Содержание сухого вещества -30% по весу.

Коэффициент полидисперсности n= Mw/ Мп= 2,55

Средний диаметр глобул -169 нм. (Ю.И.Алексеева, 1992)

Эмульгатор - аммониевая соль перфторпеларгоновой кислоты (ПФПК) -CF3(CF2)7COONH4.

В качестве биологически активных добавок использовались водорастворимые полимеры растительного происхождения: 1. Альгинат натрия ("Sigma", USA, средней вязкости. Вязкость 2% раствора при 25°С, 3500 спз), аннионое ПАВ.

Mw=50.000

-G('c4)

a-1,4

M(C,)

P-1,4

a-L-гулуроновая кислота и ß-D-маннуровая кислота в пиранозной форме. 2. Метилцеллюлоза ("Sigma", USA, средней вязкости. Вязкость 2% раствора при 20°С; 400 спз), неионогенное ПАВ. Mw=38.000

Метилцеллюлоза

OR

OR

У

[C6H702(0H)x(0CH3)v]n х= 1.00-1.55 у = 2.00-1.45 х+у = 3.00 R = Н или СН3

Методы исследования

Латексно-полисахаридную дисперсию получали добавлением к латексу СКФ-26 рассчитанного объема 0,1-1% раствора соответствующего полисахарида таким образом, чтобы для каждой серии опытов суммарное количество СКФ-26 и полисахарида оставалось постоянным. За изменением состояния латексно-полисахаридной смеси наблюдали визуально.

Полимерные субстраты формировали на горизонтированной поверхности. Метод формирования пленок заключался в нанесении определенного объема латексно-полисахаридной дисперсии на поверхность покровных стекол или на поверхности чашек Петри при помощи автоматической пипетки-дозатора. Высушивание латексно-полисахаридной смеси проводили при температуре 15-20°С и естественной влажности. Толщину пленки определяли микрометром. Результаты усредняли по 10 измерениям.

Стерилизацию пленок проводили у-облучением на экспериментальной установке ГУБЭ дозой 2,5 Мрад при комнатной температуре или УФ-облучением на воздухе полным светом лампы БУФ 40 в течение 12 часов. Расстояние от лампы до образца составляло 65 см.

Рассеяние рентгеновских лучей анализировали на стандартном рентгеновском дифрактометре "ДРОН-3", при комнатной температуре в диапазоне углов 10-60° при скорости сканирования 1 град/мин, используя излучение СиК<* длиной волны 1=1,542А, выделенное никелевым фильтром.

Степень кристалличности определяли как отношение интегральных площадей резких дифракционных пиков к интегральным площадям аморфной и кристаллических областей, используя программу Оп£нтРго 7.0:

где Xc- степень кристалличности (%);

I,. - интенсивность рентгеновского рассеяния от кристаллической области; I - интенсивность рентгеновского рассеяния от образца (как от кристаллических, так и от аморфных областей) (Рабек Я., 1983).

Для исследования процессов набухания и выхода полисахаридов в раствор был применен метод гравиметрии. Взвешивание проводили на весах ВТ-500. Точность определения веса составила ±0,5мг. Набухание полимерных субстратов и выход полисахаридов из полимерных субстратов в раствор исследовали в бидистилированной воде при Т=37°С в течение 24, 48 и 72 часов. Степень набухания полимерных субстратов а определяли по стандартной методике (О.Н.Григорьев, И.Ф.Карпова, 1964), как количество воды, приходящееся на 1г сухого веса полимера, и рассчитывали по формуле:

м,

где М/ - масса полимера до набухания, М2 - масса набухшего полимера.

Выход полисахаридов в раствор d определяли как изменение удельной массы полимера и рассчитывали по формуле:

К

где Mi - первоначальная масса полимера, Мг - масса полимера, выдержанного в воде и впоследствии высушенного.

Определение проницаемости полимерных субстратов для паров воды

проводили по стандартной методике (ГОСТ 22900-78) с использованием метода гравиметрии. В стеклянные бюксы наливали 15 мл бидистилированной воды при Т=37°С. Образец исследуемой пленки герметично закреплялся по краю бюкса, над поверхностью воды, после чего бюкс взвешивали и помещали в термостат при относительной влажностью 48% и Т=37°С на 1 , 2 , 3 или 4 суток. Далее бюкс с закрепленным образцом снова взвешивали. Взвешивание проводили на весах ВЛКТ-500. Точность определения веса составила ±5мг. Проницаемости полимерных субстратов для паров воды Р определяли как количество воды, прошедшей через единицу площади пленки и рассчитывали по формуле:

S-t '

где Mi и М2 - первоначальный и конечный вес стаканчика с закрепленной пленкой,

S - площадь поверхности пленки, t - время испытания.

Для исследования взаимодействия латекса с полисахаридами в составе пленочных субстратов был применен метод инфракрасной спектроскопии. Пленки формировали путем нанесения латекса, раствора полисахарида или латексно-полисахаридной смеси на подложку из кварцевого стекла и высушивали на воздухе при Т=15-25°С. Измерение ИК-спектров проводили с помощью спектрофотометра Specord М80 фирмы ZEISS. Сканирование проводили в диапазоне длин волн 900 - 4000 см"', разрешение пиков составило 4 см'1.

Определение деформационно-прочностных свойств полимерной пленки проводили на универсальной испытательной машине фирмы Orientec (Япония), модель RTM-IT. Образцы в виде двухсторонней лопатки шириной 3 мм, длиной однородной части 10 мм и радиусом закругления 3 мм вырубали специальной вырубкой. Скорость растяжения составляла 50 мм/мин. Определяли следующие характеристики: прочность при растяжении (сттах,МПа) и относительное удлинение при разрыве (Ер,%).

Исследование гидрофильно-гидрофобных свойств поверхности проводили путем определения краевого угла смачивания. Применяли комплекс оборудования, включающий в себя видеокамеру Sony ХС77Е, смонтированную на окуляре горизонтированного бинокулярного микроскопа МБС-2, и компьютера IBM PC 486 AT, состыкованных с помощью видеограббера DigitEye DE-15 ("Candela", Москва). Измерения проводили при Т=20±2°С. Для исследований использовали полимерные субстраты, сформированные на поверхности покровных стекол. На поверхность субстрата с помощью пипетки наносили каплю бидистиллированной воды объемом 0, 02 мл.

Величину краевого угла определяли путем анализа изображения капли в точке трехфазного контакта с помощью программы Klimov 640. Свободную энергию поверхности субстратов определяли с использованием уравнения состояния (Кwok, 98):

cos0 = -l + 2

e-ß(T|v-rsv)2

Zsi

J* 1

где 0 -краевой угол смачивания поверхности, ук -поверхностное натяжение жидкости, ysv -свободная энергия поверхности, ß=0,0001247 -параметр, определяемый из экспериментов с различными жидкостями.

Данные импортировались в специально написанную программу для решения уравнения методом Ньютона.

В работе использовали культуры клеток: НЕР-2 - человеческие эпителиальные клетки эпидермоидной карциномы гортани (Институт вирусологии им.Д.И. Ивановского АМН СССР, Москва, Cancer Res., 1954, 14, 660) и эмбриональные фибробласты человека HF. Эмбриональные фибробласты человека выделяли по методике, разработанной в лаборатории роста клеток и тканей ИТЭБ РАН. Клетки культивировали в среде Игла в модификации Дальбекко (ДМЕМ), содержащей 10% сыворотки новорожденных телят (NSC) ("Sigma", USA), 50мкг/мл пенициллина, 50мкг/мл стрептомицина и 1% L-глутамина при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5%СОг-Ферментативное открепление клеток проводили в смеси растворов трипсина и версена (1:1). Плотность посева составляла 60-80 тыс.кл/см2. Подсчет живых клеток проводили с использованием камеры Горяева, жизнеспособность клеток определялась по исключению трипанового синего. Визуальное наблюдение за процессами адгезии и роста клеток проводили при помощи микроскопа Биолам-МПЗ. Микрофотосъемка клеток проводилась на микроскопе Peraval Interphako методом дифференциально-интерференционного контраста.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Изучение устойчивости латексных дисперсий при добавлении анионных и неионогенных полисахаридов.

Для исследования взаимодействия фторсодержащего латекса с альгинатом натрия и метилцеллюлозой в латексную дисперсию добавляли раствор соответствующего полисахарида. Состояние системы регистрировали визуально через 5 часов. Были обнаружены четыре различных состояния дисперсии:

1 Стабильная дисперсия;

2 Сенсибилизированная система, содержащая крупные куски коагулюма;

3 Стабилизированная дисперсия;

4 Седиментированая или расслоившаяся дисперсия.

На основании полученных данных о фазовом состоянии латексно-полисахаридной дисперсии в зависимости от концентрации содержащихся в ней

Рис.1. Фазовая диаграмма системы латекс-альгинат натрия

Концентрация фторполимера, т!п

Рис.2. Фазовая диаграмма системы латекс-метилцеллюлоза

компонентов, были построены фазовые диаграммы (рисЛ ,2) и предложена следующая модель взаимодействия латексных глобул с молекулами полисахарида.

При добавлении малых количеств полисахарида (участок 1) не происходит изменения устойчивости дисперсии, она остается стабильной, так как количество введенного полисахарида явно недостаточно для нарушения агрегативной устойчивости системы (рис.ЗА).

Повышение количества вводимых полисахаридов до 0,1 - 0,25% (участок 2) вызывает быструю агрегацию латекса и выпадение крупных кусков коагулюма. Это объясняется адсорбцией молекулы полисахарида на двух или нескольких латексных глобулах одновременно и связыванием глобул по «мостиковому» механизму (рис.ЗБ). Переход от устойчивой дисперсии к сенсибилизированной

сьсР сг о . □ Рис 3. А)Участок 1. Устойчивая латексно-полисахаридная дисперсия; 0-0,1% полисахарида.

Б) Участок 2. Сенсибилизированная латексно-полисахаридная дисперсия (коагуляция за счет образования мостиковых связей); 0,1-0,25% полисахарида

ООО ООО, В) Участок 3. Устойчивая латексно-полисахаридная дисперсия (стабилизация за счет адсорбции молекул полисахарида на латексных глобулах); 0,25-0,9% полисахарида

Г) Участок 4. Седиментировавшая латексно- полисахаридная дисперсия (седиментация латекса при высоких концентрациях полисахаридов). Выше 0,9% полисахарида

Дальнейшее увеличение концентрации полисахарида (участок 3) в системе приводит к стабилизации латексно-полисахаридной дисперсии (рис.ЗВ). Это объясняется тем, что сорбция молекул полисахарида на поверхности одной латексной глобулы более вероятна, чем объединение нескольких глобул «мостиковыми» связями. Переход от сенсибилизированной дисперсии к устойчивой называется порогом стабилизации.

При дальнейшем увеличении концентрации полисахарида (участок 4) начинается седиментация латексно-полисахаридной дисперсии (рис.ЗГ). Это связано с тем, что после полного адсорбционного насыщения поверхности латексных глобул молекулы полисахаридов начинают связывать латексные глобулы в гроздья, которые не могут участвовать в броуновском движении и медленно оседают. Переход от устойчивой дисперсии к седиментирующей называется порогом коагуляции. Процесс седиментации начинается не сразу, системе необходимо «вызреть». Процесс регистрации агрегатного состояния системы проводили через 5 часов после смешивания компонентов, после полного завершения процессов коагуляции и седиментации.

При сравнении фазовых диаграмм, построенных для альгината натрия/ латекса и метилцеллюлозы/латекса, обнаружено, что пороги агрегации и стабилизации дисперсий одинаковы, независимо от природы полисахарида. Видимо, эти величины связаны только с концентрациями полисахарида и вероятностью их встречи с латексными глобулами.

Процесс седиментации латекса в системе, содержащей альгинат натрия, начинается при концентрации полисахарида 0,8 - 0,9% по сухому веществу, а в системе латекс/метилцеллюлоза при концентрации полисахарида 0,4 - 0,5% по сухому веществу. Различие порогов коагуляции в данном случае мы связали с различным механизмом адсорбции молекул полисахарида разной природы на поверхности латексных глобул. Согласно имеющимся данным (Алексеева, 1992; Огаркова и др., 1996) альгинат натрия образует с перфторпеларгоновой кислотой сложные комплексы, в результате чего анионы альгиновой кислоты сорбируются на поверхности латексных глобул, вытесняя анионы перфторпеларгоновой кислоты, которые сорбируются поверх них.

Мы предложили следующий механизм взаимодействия метилцеллюлозы с латексными глобулами: гидрофобные метальные группы сорбируются на поверхности латексных глобул между анионами перфторпеларгоновой кислоты.

Несмотря на различие величин порогов коагуляции, сходство фазовых диаграмм позволяет сделать вывод о том, что, несмотря на различные типы связывания разных полисахаридов с поверхностью латексных глобул общая природа полисахаридов делает схожими взаимодействия в латексно-полисахаридной дисперсии.

2. Формирование пленок и исследование процессов структурообразования

Процесс удаления воды из латексно-полисахаридной дисперсии, как известно, проходит в три стадии (рис.4) (Б1е\уагс1.Р.А.,1995).

На первой стадии (влажная дисперсия) вода испаряется с поверхности дисперсии, концентрируя латекс, до тех пор, пока концентрация полимерной фракции не достигнет 60 -70 объемных процентов.

На второй стадии (пограничная зона), после концентрирования дисперсии, образуется промежуточный гель, возрастает число контактов между структурными элементами полимера, из полимера по межглобулярным капиллярам удаляется вода.

На третьей стадии (сухая пленка) начинается образование непрерывной пленки, вода диффундирует непосредственно через сам полимер.

Мы исследовали структуру пленок, сформированных при различных температурных режимах. При температурах ниже 0°С латексно-полисахаридные дисперсии были неустойчивы, что определило формирование неоднородных «рваных» пленок. При температурах от 0°С до 20°С, получались однородные ровные пленки. При температурах от 20°С до 45°С, формировались пленки, утолщенные по краям, что мы объясняем движением дисперсии под действием сил поверхностного натяжения. Нами был выбран температурный режим формирования однородных равнотолщинных пленочных субстратов 15 - 20°С, при котором высыхание пленок толщиной 100 мкм происходит за 3 суток.

Для приготовления субстратов были использованы стабилизированные и седиментационно-неустойчивые латексно-полисахаридные дисперсии. Мы выявили, что плотность пленки, сформированной из латексной дисперсии, составляет 1,750±0,16 г/см3, а плотность пленки, сформированной из латексной дисперсии, содержащей 20% полисахарида, составляет 1,347±0,14 г/см3. То есть плотность пленки, сформированной из устойчивой или стабилизированной дисперсии на 20% выше, чем плотность пленки, полученной из седиментационно-неустойчивой дисперсии. Мы объясняем это тем, что в случае седиментационно-неустойчивой дисперсии, содержащей более 1% полисахарида, избыточное количество молекул полисахарида мешает плотной упаковке латексных глобул, в результате чего образуется пористая структура с нарушением гексагональной упаковки глобул.

3. Изучение надмолекулярной структуры композитных материалов.

Надмолекулярную структуру латексной пленки и композитных материалов исследовали методом рентгеноструктурного анализа. На рентгенограмме латексной пленки было обнаружено наличие резких дифракционных пиков, что

По граничная

Влажная дисперсия

Рис.4. Процесс удаления воды из дисперсии.

С

характерно для полимеров, содержащих кристаллиты (рис.5). Рассчитали, что степень кристалличности фторлатексной пленки составляет 49,8%.

При исследовании пленок с содержанием метилцеллюлозы менее 0,5%, т.е. при концентрации метилцеллюлозы, не приводящей к адсорбционному насыщению поверхности глобул, наблюдалось полное исчезновение резких дифракционных пиков, соответствующих областям трехмерного порядка -кристаллитам, т.е. формировались аморфные пленки (рис.6).

3500 3000 250О 2000 1500

А

чХу

8 1500

/\

(

V

/

4-

чш

Брэгговский угол, 20. град

Брэгговский угол,20,град

Рис.5. Рентгенограмма латексной пленки.

Рис.6. Рентгенограмма пленки, содержащей 0,5% метилцеллюлозы Т.о. при данных концентрациях метилцеллюлоза, сорбируясь на поверхности глобул, нарушала их взаимодействие и процесс формирования кристаллитов. Исследование пленок, содержащих более 5 % метилцеллюлозы, показало появление резких дифракционных пиков (рис.7). Было обнаружено, что степень кристалличности пленок возрастает с увеличением концентрации метилцеллюлозы, и для пленок, содержащих 20% метилцеллюлозы, составляет 34%. Мы объясняем это тем, что несвязанные молекулы метилцеллюлозы, обладающей способностью к кристаллизации, могут служить зародышами гетерокристаллизации в полимерной матрицы.

4000-,

\

ч!

К) >

I-1-1---1-----Г-

0 _ 20 30-л 40

Брэгговский угол,28,град

^ 500-

Брэгговский угол, 20, град

Рис.7. Рентгенограмма пленки, Рис.8. Рентгенограмма пленки,

содержащей 20% метилцеллюлозы содержащей 20% альгината натрия.

При исследовании пленок, содержащих альгинат натрия, во всем диапазоне концентраций 0-20% , наблюдалось отсутствие резких дифракционных пиков, соответствующих областям трехмерного порядка - кристаллитам (рис.8), что свидетельствует об аморфной структуре данных композитных материалов.

Это можно объяснить тем, что альгинат натрия, связываясь с поверхностью латексных глобул, препятствует их взаимодействию и нарушает процесс формирования кристаллитов, а несвязанные молекулы альгината натрия, который является аморфным веществом, не обладают способностью инициировать кристаллизацию композитного материала.

Таким образом, различная природа полисахаридов приводит к различным механизмам структурообразования и различным типам формируемых структур.

4. Изучение межмолекулярного взаимодействия полимеров в составе латекс-полисахаридных субстратов было проведено методом ИК-спектроскопии.

Методом ИК-спектроскопии исследованы пленки из немодифицированного латекса, альгината натрия, метилцеллюлозы и композитные пленки, содержащие 20% полисахарида. На спектрах пленок из немодифицированного латекса, альгината натрия и метилцеллюлозы отмечены отчетливые пики в

Рис.9. ИК-спектр субстрата, содержащего 20 % метилцеллюлозы и 80%фторлатекса.

диапазонах частот резонансного поглощения соответствующих химических связей в молекулах полимеров. Полученные спектры соответствуют имеющимся литературным данным (Кочервинский, 2003; КоЬауаБЫ, 1975; Купцов, 2001).

Данные отнесения полос исходных полимеров использовали для анализа ИК-спектров пленок полимерных композитов.

В спектре субстрата, содержащем 80 % латекса и 20 % метилцеллюлозы (Рис.9) наблюдаются в основном полосы главного компонента - фторлатекса СКФ-26. Однако частоты и относительные интенсивности некоторых полос мажорного компонента изменяются из-за взаимодействия с минорным полимером.

Смещение полосы 1206 см"' в спектре латекса до 1213 см"' характерно для кристаллической а-конформации фторлатекса (Кочервинский, 2003) и говорит в пользу смешанного строения латексно-метилцеллюлозной пленки. Смещение пика 1073 см"1 в спектре мет и л целлюлозы (валентные колебания мостиковой С-О-С связи простого эфира) до 1056 см"1 указывает на гидрофобные взаимодействия между метальной группой метилцеллюлозы и фторметильной группой латекса (рис.11 А).

Рис.10. ИК-спектр субстрата, содержащего 20 % альгината натрия и 80% фторлатекса.

В спектре субстрата, содержащем 20 % альгината натрия и 80 % латекса, в основном наблюдаются полосы главного компонента - фторлатекса СКФ-26 (рис.10). Однако частоты и относительные интенсивности некоторых полос фторлатекса изменяются из-за взаимодействия с альгинатом натрия, частоты пиков которого также достоверно изменяются. Так, наблюдается смещение полосы 1026 см"' в спектре альгината натрия (валентные колебания углеродных и кислородных атомов пиранозного кольца) в область более высоких частот 1038 см"' указывает на образование водородной связи между кислородом гидроксигруппы альгината натрия и фтором три фторметильной группы латекса

н г г р С—с— с —с р н 1 н—с—н 1 ? н С н снгосн, н он н он А СООЫа V_ Ц н ? н н н р 1 р с—с—с—с Н Р Р р Б

Рис.11. А) Гидрофобные взаимодействия между метальной группой метилцеллюлозы и фторметильной группой латекса; Б) Образование водородной связи между кислородом гидроксигруппы альгината натрия и фтором трифторметильной группы латекса.

На основе полученных данных мы установили различные механизмы связывания полисахаридов с фторлатексом: молекулы анионного альгината натрия и латекса соединяются водородными связями, а между молекулами нейтральной метилцеллюлозы и латекса происходят гидрофобные взаимодействия.

5. Исследование механических характеристик композитных материалов.

Механические характеристики являются важным показателем, определяющим возможность использования биоматериалов в медицине. Мы исследовали прочностные и эластические характеристики модифицированных полисахаридами латексных пленок (табл.1). Обнаружено, что при увеличении концентрации полисахаридов прочность композита увеличивается до 1,4-1,7 МПа, и превышает прочность немодифицированного латекса. По-видимому, это связано с тем, что основную роль в улучшении прочностных свойств подобных пленок играет межфазный переходный слой, препятствующий концентрации напряжений в какой-либо одной точке системы, т.е. способствующий распределению напряжений по всему объему.

Таблица 1. Механические характеристики композитных пленок.

Наименование Прочность при Относительное удлинение

образца растяжении. МПа при разрыве, %

Латекс 1,1 ±0,2 >375

0, 1%А 1,1 ±0,2 >375

5%А 1,6±0,2 156±17

10% А 1,5±0,1 159±23

20%А 1,7±0,2 163±25

0,1%МС 1,1±0,1 365±19

5%МС 1,4±0,1 194±20

10% МС 1,6±0,2 288±20

20% МС 1,5±0,2 355±20

При исследовании деформационных характеристик пленок, модифицированных метилцеллюлозой, наблюдается заметное улучшение эластичности с ростом концентрации метилцеллюлозы в пленке. Повышение эластичности кристаллизующегося полимера, видимо, объясняется скольжением образующихся кристаллических блоков в направлении деформирования без их разрыва.

Введение анионного альгината натрия в полимерную матрицу, напротив, значительно снижает эластичность композита, по-видимому, вследствие того, что полярный полимер разрушает кристаллическую структуру латекса и снижает способность макромолекул к ориентации.

6. Изучение сорбционной способности полимерных субстратов было проведено гравиметрическим методом путем определения степени набухания композитных пленок в воде.

Было показано, что в течение двух суток субстраты достигали равновесной степени набухания, т.е. их масса далее не изменялась. При этом изотермы сорбции воды полимерами имели сигмоидальный характер (рис.12.А).

Интерполяция сигмоидной кривой и последующее дифференцирование позволило, не претендуя на численную точность данных, оценить значения, при которых происходит резкое изменение сорбционных характеристик биоматериалов (рис. 12.Б).

Рис.12. Набухание композитных субстратов в воде.

Показано, что точки перегибов графиков (0,46- для альгината натрия и 0,76 для метилцеллюлозы) достаточно точно соответствуют величинам порога коагуляции, определенным из фазовой диаграммы (рис.12.Б). Это подтверждает, что при достижении адсорбционного насыщения поверхности латексных глобул происходит резкое изменение в плотности упаковки системы. Это согласуется с предложенной нами моделью структурообразования (появление в пространстве между глобулами свободных молекул полисахаридов является причиной изменения плотности упаковки и различной сорбционной способности композитных материалов).

7. Исследование проницаемости полимерных субстратов для паров воды

Проницаемость полимерных субстратов для паров воды определяется плотностью и надмолекулярной структурой полимеров. Эта характеристика очень важна для материалов типа «искусственная кожа», так как для успешного заживления раны требуется покрытие, позволяющее поддерживать оптимальную влажность раневой поверхности.

Мы установили, что зависимость проницаемости субстрата для паров воды от концентрации полисахарида также имеет сигмоидальный характер (рис. 1 ЗА). Это связано с тем, что паропроницаемость, как и набухание связана с диффузией воды в объеме материала и определяется схожими механизмами

Рис.13. Проницаемость полимерных субстратов для паров воды

Интерполяция сигмоидальной кривой и последующее дифференцирование позволило, не претендуя на численную точность данных, оценить значения, при которых происходит резкое изменение в паропроницаемости субстрата. Показано, что точки перегибов графиков (0,44- для альгината натрия и 0,89 для метилцеллюлозы) достаточно точно соответствуют определенным из фазовой диаграммы концентрациям полисахаридов при которых происходит полное адсорбционное насыщение поверхности латексных глобул полисахаридами (рис.13 Б, В).

Т.о. разрыхление структуры, вызванное появлением в пространстве между глобулами свободных молекул полисахаридов, является причиной различий в степени проницаемости полимерных субстратов для паров воды.

При взаимодействии с водой не было обнаружено различий между необлученными пленками и пленками, стерилизованными УФ-облучением и у-облучением, по-видимому вследствие того, что при облучении не изменяется внутренняя структура образцов.

8. Определение свободной энергии поверхности

Смачиваемость поверхности, являющаяся физическим следствием специфической химической структуры поверхности, влияет на адгезию и распластывание клеток на поверхности биоматериалов.

Смачиваемость характеризуется свободной энергии поверхности субстратов. Для расчета свободной энергии поверхности мы измеряли краевой

угол методом «сидящей капли» и проводили анализ профиля капли с помощью программы «К! ¡шоу 640» (разработана А.А.Климовым).

На основе полученных данных были построены графики (рис.14) зависимости свободной энергии поверхности субстрата от концентрации полисахаридов.

Рис.14. Свободная энергии поверхности субстратов, модифицированных альгинатом натрия или метилцеллюлозой при различных типах стерилизации.

Обнаружено, что увеличение процентного содержания полисахаридов приводит к увеличению свободной энергии поверхности (рис.14). При концентрации полисахаридов выше 5%, свободная энергия поверхности лежит в диапазоне 55-59 эрг/см2, что, как известно, характерно для поверхностей, поддерживающих адгезию субстратзависимых клеток (БсЬакепгаас! 1М., 1988).

Из анализа данных, представленных на графике, можно сделать вывод, что в пределах ошибки эксперимента (около 5%), тип стерилизации (УФ-облучение, у -облучение) не влияет на величину свободной энергии поверхности. Т.о. обнаружено, что облучение не оказывает существенного влияния не только на внутреннюю структуру материала, но и на гидрофильно-гидрофобные свойства поверхности.

9. Исследование влияния полисахаридов в растворе на поведение клеточных культур.

Исследование выхода полисахаридов в раствор было проведено методом гравиметрии. Установлено, что в течение первых суток все несвязанные молекулы полисахаридов диффундируют в раствор. При этом не наблюдается нарушения целостности биоматериала.

Выявлено, что количество вышедшего в раствор полисахарида линейно возрастает с ростом его первоначального содержания (Рис. 15).

0;5 0,7

Рис.15. Растворимость пленочных субстратов

олисах>

При экстраполяции прямых, представленных на рис.15 было определено, что они пересекают ось абсцисс в точках 0,5 для метилцеллюлозы, и 0,7 альгината натрия. Данные значения с хорошей точностью совпадают с величинами порога коагуляции, связанными согласно нашей модели с количеством полисахаридных молекул, адсорбировавшихся на поверхности глобул в процессе структурообразования.

В связи с тем, что 50% альгината натрия и 70% метилцеллюлозы выходят в раствор, необходимо было исследовать влияние полисахаридов в растворе на поведение клеток. Исследование было проведено с использованием культуры эмбриональных фибробластов человека Ш7, культивируемых в среде ДМЕМ, не содержащей сывороточных факторов прикрепления. Определяли количество

Рис.16. Адгезия эмбриональных фибробластов человека НБ в бессыворочной среде, содержащей добавки полисахаридов.

клеток, прикрепившихся к поверхности культурального пластика в течение 24 и 48 часов после посева в среды с различным содержанием полисахаридов.

В качестве контроля использовали среду ДМЕМ с 10% N08 (Кс) и среду ДМЕМ, не содержащую сывороточных факторов прикрепления (Кб/с). Результаты наблюдений представлены на рис.16.

Обнаружено, что при добавлении в среду альгината натрия и метилцеллюлозы адгезионная активность клеток возрастает по сравнению с

адгезией клеток в среде, не содержащей полисахаридов. При этом в обоих случаях на вторые сутки происходит незначительное снижение числа клеток (за исключением растворов, содержащих 10'2 - 10° г/мл метилцеллюлозы), что свидетельствует о том, что добавление полисахаридов в культуральную среду способствует адгезии, но не стимулирует пролиферативную активность клеток.

Максимальная адгезия наблюдается при концентрациях альгината натрия 10'6-10"7 г/мл (составляет около 80% от посева (Рис.16А)) и при концентрациях метилцеллюлозы 10'2- 10"3 г/мл (превосходит адгезию в среде, содержащей 10% сыворотки >ГС8(Рис. 16Б)). Видимо причиной более высокой активности альгината натрия является тот факт, что входящая в его состав гулуроновая кислота является составной частью гликанов, которые играют особую роль во многих процессах жизнедеятельности клеток (Савицкая, 1999, ^Бсой, 1989).

Учитывая, что при максимальном содержании альгината натрия и метилцеллюлозы в субстрате их выход в среду на вторые сутки составляет порядка 10"4 г/мл, следует отметить, что данные концентрации полисахаридов в среде могут только стимулировать адгезию, но не влияют на пролиферативную активность клеток.

10. Исследование адгезивной активности клеток на поверхности субстратов, содержащих полисахариды.

Исследование адгезии эмбриональных фибробластов Ш7 и эпителиальных клеток человека НЕР-2 проводили среде БМЕМ, содержащей 10% сыворотки КО. Определяли количество клеток, прикрепившихся к поверхности субстрата, модифицированного полисахаридами и стерилизованного у-облучением, в течение 24 и 48 часов после посева. В качестве контроля использовали специально обработанный для культур клеток пластик. Результаты исследования адгезии фибробластов № и эпителиальных клеток НЕР-2 к

Рис. 17.Адгезия фибробластов НТ на стерилизованных у-облучением субстратах, содержащих альгинат натрия (А) и метилцеллюлозу (Б).

субстратам, содержащим альгинат натрия и метилцеллюлозу, через 24 часа представлены на рис. 17-18 соответственно.

Было обнаружено (рис. 17), что адгезия эмбриональных фибробластов слабо зависит от концентрации и природы полисахарида и, в случае умеренно гидрофобных субстратов, приближается к адгезии клеток на специально обработанном полистироле.

Рис.18. Адгезия эпителиальных клеток НЕР-2 на стерилизованных у-облучением субстратах, содержащих альгинат натрия (А) и метилцеллюлозу (Б).

При исследовании адгезии эпителиальных клеток к субстратам, содержащим полисахариды (рис.18), было обнаружено, что адгезия возрастает при увеличении концентрации полисахарида в пленке, и в случае умеренно гидрофобных субстратов со свободной энергией поверхности, соответствующей свободной энергии поверхности субстратов, оптимальной для адгезии клеток (У5= 57 эрг/см2) (БсЬакепгаас! .1.М. й а1., 1988), приближается, а в случае альгината натрия даже превосходит адгезию клеток на специально обработанном полистироле.

При анализе полученных данных мы установили, что к композитным пленкам, содержащим более 5% полисахарида, прикрепляется не менее 80% как фибробластов, так и эпителиальных клеток. Т.о. введение гидрофильных полисахаридов позволило существенно улучшить адгезивные характеристики композитных субстратов (рис.19Б, В) по сравнению со фторлатексной пленкой (рис.19А), что позволяет использовать данные субстраты для адгезии субстратзависимых клеток и атравматичного переноса клеточных пластов.

На вторые сутки количество клеток не изменяется в пределах ошибки эксперимента, т.е. в данном случае речь идет о хорошем переживании культуры на сроках, необходимых для переноса клеточных пластов.

Т.о. установлено, что, несмотря на различную природу альгината натрия и метилцеллюлозы появление адгезивных свойств у композитных материалов наблюдается при одинаковой концентрации полисахаридов и, по-видимому, определяется появлением на поверхности пленки гидрофильных групп.

12. Сравнение разработанных композитов с используемыми раневыми покрытиями.

Проведено сравнение субстратов с оптимальным соотношением латекс-полисахарид с широко используемыми в мире покрытиями Omiderm, Op-Side и с раневым покрытием «Биокол», разработанным в нашей лаборатории по основным физико-химическим параметрам, используемым при характеристике раневых покрытий (табл.2).

По показателям паропронициемости, эластичности, адсорбционной способности полученные нами композиты находятся на уровне широко используемых в мире материалов. При этом разработанные композитные материалы существенно превосходят Omiderm и Op-Side по адгезивности для субстратзависимых клеточных культур, что позволяет рекомендовать их для проведения доклинических и клинических испытаний с целью выявления возможности использования разработанных субстратов в медицине и трансплантологии.

Таблица 2. Сравнение характеристик разработанных композитов с современными раневыми покрытиями (Жирным курсивом выделены данные, полученные из литературных источников)

Тип покрытия 20% А 80% Л 20%МЦ 80% Л Латекс Биокол Огшс1егт Op-Site

Материалы Фтор- Фтор Фтор- Фторлатекс Полиуретан Поли-

латекс латекс латекс и смесь с привитым уретан

А МЦ полисахаридов акриламидом

Толщина, мкм 100 100 100 120 20 200

Относительное 163±25 355±20 >375 33,5 81,1 299

удлинение при

разрыве %

Паропрони цаемость, г/м2*24часа 670 870 40 1060 960 {1200) 480 (450)

Адсорбция воды, г/г 0,23 0,46 0,05 02(1,83) 1,70 {1,50) 0,42 (0,35)

Адгезивность 92 75 25 26 17 38

для клеток, %

от посева

Заключение

Применение спектра методов исследования материалов на различных уровнях организации позволило установить связь между свойствами, имеющими практическое значение, физико-химическими характеристиками для контроля качества и технологией приготовления материалов. Это позволяет получать материалы с заданными характеристиками, предназначенные для лечения ран различной этиологии.

Наряду с оптимизацией свойств субстратов латекс-полисахарид для целей тканевой инженерии и медицины, проведенные исследования позволили также сделать ряд выводов относительно влияния отрицательно заряженного и нейтрального ПАВ на структуру и адгезионные характеристики полученных субстратов. Найдено, что общая природа полисахаридов делает схожими взаимодействия в латексно-полисахаридной дисперсии, несмотря на различие механизмов взаимодействия разных полисахаридов с латексными глобулами. Показано, что добавление неионогенной метилцеллюлозы приводит к организации полимеров в кристаллические структуры, стабилизированные гидрофобными силами, а введение анионного альгината натрия приводит к организации полимеров в аморфные структуры, стабилизированные водородными связями. Увеличение свободной энергии поверхности, пропорциональное процентному содержанию полисахарида в субстратах,

придает поверхности способность поддерживать адгезию субстратзависимых клеток, что позволяет использовать полученные пленки в качестве подложек для переноса клеточных пластов на рану.

Главным практическим результатом проведенных исследований явилась разработка на основе латекса СКФ-26 и альгината натрия /метилцеллюлозы новых биоматериалов типа «искусственная кожа». Данные материалы по своим физико-химическим характеристикам не уступают современным раневым покрытиям, а по способности поддерживать адгезию клеток существенно их превосходят, что позволяет рекомендовать их для проведения доклинических и клинических испытаний с целью выявления возможности использования разработанных субстратов в медицине и трансплантологии.

Выводы

1. Определены диапазоны агрегативной устойчивости фторполимерной дисперсии в присутствии анионных и неионогенных полисахаридов. Разработана техника приготовления однородных латексно-полисахаридных пленок с различным соотношением компонентов.

2. Установлены механизмы взаимодействия фторполимерного латекса с альгинатом натрия и метилцеллюлозой в растворах и в составе композитных пленочных материалов.

3. Показано, что модификация латекса альгинатом натрия препятствует формированию кристаллической структуры композита, а введение метилцеллюлозы в концентрациях, превышающих адсорбционную насыщенность глобул латекса, способствует кристаллизации композита.

4. Найдена зависимость сорбционной способности и паропроницаемости композитных материалов от плотности упаковки и надмолекулярной структуры субстратов.

5. Установлено, что модификация фторлатекса альгинатом натрия и метилцеллюлозой повышает свободную энергию поверхности субстратов, что способствует адгезии и распластыванию субстратзависимых клеток.

6. Определены оптимальные концентрации полисахаридов и режимы формирования, при которых биоматериалы удовлетворяют основным требованиям, предъявляемым к раневым покрытиям и позволяют проводить культивирование субстратзависимых клеток на их поверхности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Г.А. Давыдова, И. И. Селезнева, Б.К. Гаврилюк Изучение влияния жесткости облучения на свойства фторполимерной матрицы, модифицированной полианионными биологически активными веществами. Биофизика т.49, № 5, сент,- окт. 2004, стр.809-814

2. Г.А. Давыдова, И. И. Селезнева, Б.К. Гаврилюк. Изучение влияния полианионных биологически активных веществ на свойства фторполимерной биосинтетической матрицы. Вопросы биологической, медицинской и фармакологической химии. Москва,2004, №2, стр! 1-14

3 Давыдова Г.А., Селезнева И.И., Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К. Разработка композитных пленочных биоматериалов для решения задач тканевой инженерии. Сборник тезисов второго съезда биофизиков России, Москва, 1999, т.2, с.666.

4. Давыдова Г.А. , Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К., Разработка полимерных пленочных биоматериалов для решения задач тканевой инженерии, тезисы IV Городской научной конференции молодых ученых, Пущино, 1999. с. 44.

5. Давыдова Г.А., Халкузиева Р. С., Гаврилюк Б.К. Полимерные пленочные биоматериалы для целей тканевой инженерии. Тезисы конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" Пущино 2001, с.50

6. Давыдова Г.А., Селезнева И.И., Гаврилюк Б.К. Разработка полимерных пленочных биоматериалов для решения задач тканевой инженерии. Тезисы докладов IV Международной конференции "Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов" Москва 2001, с. 119.

7. Давыдова Г.А., Селезнева И.И., Гаврилюк Б.К. Модификация полимерных пленочных биоматериалов для решения задач тканевой инженерии. Тезисы конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" Пущино 2002, с.65

8. Г.А. Давыдова, Б.К. Гаврилюк, Разработка полимерных пленочных биоматериалов для решения задач тканевой инженерии Тезисы конференции «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии. Теория и практика клеточных биотехнологий» Самара, 2004, с. 124

9. Г.А.Давыдова, А.П. Жамбалова , Б.К. Гаврилюк, Создание матричных систем для решения задач тканевой инженерии. Устный доклад. Тезисы I украинской конференции «Проблеми бюлопчно1 1 медично1 ф1зики» , Харьков, 20-22 сентября 2004 г., с. 145

10. А.П. Жамбалова, Г.А. Давыдова, Создание матричных систем для решения задач тканевой инженерии, тезисы XVII зимней молодежной научной школы, «Перспективные направления физико-химической биологии и микробиологии», Москва, 2005, с.

11. А.П. Жамбалова, Г.А. Давыдова, Разработка новых биоматериалов для решения задач тканевой инженерии, тезисы 9-ой Международной Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века", Пущино, 2005, с. 114.

12. А.П. Жамбалова, Г.А. Давыдова, Б.К. Гаврилюк, Изучение влияния добавок полисахаридов на физико-химические характеристики и биосовместимость полимерных пленок, тезисы второй международной конференции «Наука -бизнес - образование», Пущино, 2005, с. 175.

Список цитируемой литературы

1. Алексеева Ю.И.// Автореферат диссертации к.х.н. - М. - МИТХТ, 1992.

2. О.Н.Григорьев, И Ф.КарповаН Руководство к практическим работам по коллоидной химии. М. Химия,-196,420.

3. Купцов.А.Х., Жижин Г.Н. Фурье-спектры комбинационного рассеяния и инфракрасного поглощения полимеров. Справочник III - М. Физматлит - 2001,582.

4. В.В. Кочереинский, Н.Н. Кузьмин, А.Н. Задорин II Высокомолекулярные соединения - 1996(A)- 38 - 11,1822-1827

5. В.В.Кочевринский // Высокомолекулярные соединения - 2003 - 45(Б) - 11,19221964

6. М.В. Огаркова, А.Г. Снежко, Г.А. Симакова, Э.Г. Розанцев.//Пластические массы -1996-4,

7. Савицкая И.М., Фурминов Ю.А. // Клиническая хирургия - 1999 - 1,17-19

8. Шаповалов С.Г.//ФАРМиндекс-Практик - 2005-8,38-46

9. Dawlee S, Sugandhi A, Balakrishnan В, Labarre D, Jayakrishnan Ay/Biomacromolecules-2005 - 6(4), 2040-2048.

10. Kobayashi M, Tashiro K, Tadokoro H //Macromolecules - 1975- 8,158

11. U.Klinge et al.,2003Klinge U, Junge K, Spellerberg B, Piroth C, Klosterhalfen B, Schumpelick V. J Biomed Mater Res. 2002;63(6) p.765-71

12. Kwok D.Y., Lam C.N.C., Li A., Wu L.R., Mok E., Neumann A.W Colloids and Surfaces. A. -1998-V.142., p.219-235.

13. Mary C, Marois Y, King MW, Laroche G, Douville Y, Martin L, Guidoin R. ASAIO J 1998, v 44, p.199-206

14. Schakenraad J.M., Busscher H.J, Wildevuur CH, Arends J Cell Biophysics- 988-13, 75-91

15. Scott J.//Ciba Found. Symp. - 1989- 143, 248—264.

16. Steward.P. A.//http://www.initium.demon.co.uk/abstract.htm -1995

17. Van der Valk P., van Pelt A.W.J., Busscher H.J., Jong H.P., Wildevuur Ch.R.H. and Arends J. //J. Biomed.Mater.Res. 1983. V.17. P.807-817.

18. Veimeulen H, Ubbink DT, Goossens A, de Vos R, Legemate DA.// Br J Surg.- 2005 -Jun-92

19. Winnik M.A., Wang Y„ Haley F.//. J. Coatings Technology - 1992 - 64 (811), 51-61

•22855

РНБ Русский фонд

2006-4 26776

Принято к исполнению 10/11/2005 Заказ №1210

Исполнено 14/11/2005 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975-78-56 (095)747-64-70 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Давыдова, Галина Анатольевна

Введение

Глава I. Обзор применяемых в медицине полимерных материалов и раневых покрытий и механизмов процесса пленкообразования из латексных дисперсий.

1.1. Применение полимерных материалов в медицинских целях.

1.2. Обзор современных раневых покрытий

1.3. Механизмы процесса пленкообразования из латексных диспер- 33 сии

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Методы исследования взаимодействия фторсодержащего латекса 43 с альгинатом натрия и метилцеллюлозой в растворах и приготовление композитных субстратов на их основе

2.2. Методы исследования надмолекулярной структуры и физико- 46 химических характеристик субстратов

2.3. Культура клеток: экспериментальные среды, методы культивиро- 52 вания, подсчета, определения адгезионной, пролиферативной активности и жизнеспособности клеток

Глава 3. Исследование механизмов взаимодействия латекса с полисахаридами. Определение влияния концентрации и природы полисахарида на процессы структурообразования.

3.1. Изучение устойчивости латексов при добавлении анионных и не- 55 ионогенных полисахаридов

3.2. Формирование пленок и исследование процессов структурообра- 61 зования.

3.3. Исследование надмолекулярной структуры полимерных пленок, 64 модифицированных полисахаридами

3.4. Изучение межмолекулярного взаимодействия полимеров в соста- 70 ве латекс-полисахаридных субстратов

Глава 4. Изучение влияния микроструктуры композитных материалов на характеристики, определяющие возможность их использования в качестве субстратов для роста клеток и раневых покрытий.

4.1. Исследование механических свойств композиционных материа- 78 лов

4.2. Изучение сорбционной способности композитных материалов

4.3. Исследование проницаемости композитных субстратов для паров 82 воды

4.4. Определение свободной энергии поверхности композитных пле- 85 нок.

4.5. Определение выхода полисахаридов из биосинтетического суб- 90 страта.

4.6. Исследование влияния полисахаридов в растворе на поведение 91 клеточных культур

4.7. Исследование адгезивной активности клеток на поверхности суб- 96 стратов, содержащих полисахариды

4.8. Сравнение разработанных композитов с используемыми раневы- 101 ми покрытиями

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка новых биоматериалов типа "искусственная кожа" на основе фторполимерного латекса, модифицированного полисахаридами"

Последнее десятилетие характеризуется бурным развитием тканевой инженерии, нового направления, возникшего на стыке физики, химии и биологии. В рамках данного направления ведутся работы по созданию на основе природных и синтетических полимеров и клеток разных типов тканевых аналогов, призванных скомпенсировать утраченные функции отдельных органов или даже восстановить орган искусственно. Настоящая работа посвящена разработке новых биоматериалов типа «искусственная кожа», предназначенных для закрытия ожогов, трофических и иссеченных поражений кожного покрова, а также обеспечения эффективного переноса клеточных пластов на раневую поверхность для стимулирования регенерации глубоких и труднозаживающих ран. Данные материалы представляют собой пленку, сформированную на основе синтетических и природных полимеров, защищающую раневую поверхность от проникновения бактерий, поддерживающую оптимальный паро- и газообмен и физиологическую влажность раны, а также создающую условия для обеспечения миграции клеток.

Несмотря на то, что в последние годы в мире появилось множество раневых покрытий, существенно ускоривших процесс заживления ожогов II - III А степени, для успешного заживления более серьезных ран (глубоких и обширных ожогов, трофических и радиационных язв) требуется применение клеточных культур. Следовательно, необходима разработка подложек, обеспечивающих атравматичный перенос клеточных пластов на рану. Т.о., в настоящее время наиболее актуальным направлением в области создания эффективных аппликаций на раны и ожоги является разработка композитных полимерных покрытий, обеспечивающих атравматичный перенос клеток и создающих оптимальные условия для заживления глубоких и обширных поражений кожи.

Существующие на сегодняшний день покрытия не пригодны для решения данной задачи. Это связано с тем, что существующие в настоящее время раневые покрытия созданы на основе либо синтетических полимеров, либо полимеров, полученных из биологических источников. Однако, синтетические полимеры, являясь хорошим механическим каркасом, не обладают необходимой биологической активностью для обеспечения адгезии клеток. Природные полимеры, обладая хорошей биологической активностью, не имеют достаточной механической прочности и отличаются высокой скоростью биодеградации. Т.о., для обеспечения адгезии клеток и оптимальных условий для миграции клеток и регенерации кожи необходимым становится создание композитных материалов, объединяющих достоинства природных и синтетических полимеров. Примером таких материалов стали появившиеся в последнее время композиционные материалы типа «сэндвич», в которых на полимерную синтетическую матрицу методом пошаговой модификации нанесен природный полимер (Магу С et al.,1998, U.Klinge et al.,2003). Эти материалы дорогостоящи, сложны в производстве, и, кроме того, входящий в их состав природный полимер при химическом связывании частично утрачивает свои биологические свойства.

Практически полное отсутствие композитных материалов на основе смесей синтетических и природных полимеров вызвано, прежде всего, объективными трудностями, возникающими при формировании композитных материалов, вследствие того, что синтетические полимеры обычно формируются из растворов в органических растворителях или из высокотемпературных расплавов, что абсолютно исключает смешивание их с природными компонентами. Кроме того, следует отметить недостаток фундаментальных исследований механизмов взаимодействия между синтетическими и природными полимерами, а также отсутствие данных о факторах, определяющих свойства материалов на микро и макроуровне и их взаимодействии с клетками. Это вызвано тем, что исследования в области разработки биоматериалов носят в основном прикладной характер и, возможно, связано с тем, что при решении прикладных задач разработки новых биоматериалов, разработчики не интересуются фундаментальными исследованиями процессов взаимодействия компонентов на микро и макроуровне.

Мы применили новый подход к созданию биосинтетических композиционных материалов, заключающийся в использовании водных дисперсий синтетического фтор-каучука, позволяющих вводить в состав полимерных пленочных материалов водные растворы биологически активных полимеров без нарушения их структурной и функциональной целостности.

Основу разработанных нами субстратов составляет сополимер винилиденфторида с гексафторпропиленом, химически инертный, обладающий высокой химической стабильностью и хорошими механическими характеристиками. При работе с его латекса-ми нет необходимости пользоваться токсичными растворителями. Но при этом сформированные на основе фторлатекса субстраты практически не набухают, имеют малую паропроницаемость, гидрофобны, не поддерживают адгезию и пролиферацию клеток млекопитающих, что является важным требованием, предъявляемым к современным биоматериалам.

Для гидрофилизации субстрата, т.к. именно с этой характеристикой связаны малая паропроницаемость и неадгезивность фторлатекса, в него были введены полисахариды, т.к. именно эти молекулы являются компонентом, обеспечивающим взаимодействие с водой и гидратационное окружение клеток. Было решено изучить взаимодействие с латексом анионных и нейтральных полисахаридов. Исследование взаимодействия фторлатекса с положительно заряженными полисахаридами не проводилось, т.к. добавление к отрицательно заряженному латексу положительно заряженного полисахарида вызывало агрегацию латексно-полисахаридной дисперсии. Преимуществом полисаха-ридных материалов по сравнению с белковыми полимерами животного происхождения (коллагеном, желатином), является их доступность и неиммуногенность. Кроме того, известно что альгинаты оказывают заметное иммуномодулирующие действие, стимулируют фагоцитоз, восстанавливают активность клеточных рецепторов (В.В.М'ясоедов, 2001). Входящая в состав альгинатов гулуроновая кислота является составной частью гликанов, которые играют особую роль во многих процессах жизнедеятельности клеток (J.Scott, 1989). Метилцеллюлоза служит субстратом для переноса клеток при травмах головного мозга и для культивирования различных типов клеток (M.Tate et al., 2001; de Silva, 2005; R.C. Ganassin 2000) и является ускорителем мускульной регенерации в периферийных нервных каналах (Мясников А.Д и др, 2003).

Цель данной работы заключалась в изучении механизмов взаимодействия полисахаридов с фторполимерным латексом на молекулярном и надмолекулярном уровне и исследовании связи структуры с физико-химическими характеристиками и биосовместимостью материала для разработки биоматериалов типа «искусственная кожа», способных кроме защитных функций обеспечить адгезию клеток и атравматичный перенос клеточных пластов на рану

В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи:

1. Исследовать взаимодействие фторсодержащего латекса с альгинатом натрия и метил целлюлозой в растворах и в составе композитных пленочных материалов;

2. Изучить процесс структурообразования композитных материалов при разных концентрациях альгината натрия и метилцеллюлозы и различных условиях сушки;

3.Изучить влияние на эластические и прочностные свойства и характеристики поверхности композитных пленочных материалов процентного содержания альгината натрия и метилцеллюлозы;

4.0пределить зависимость сорбционной способности, паропроницаемости и устойчивости к растворению композитных пленочных материалов от процентного содержания альгината натрия и метилцеллюлозы;

5. Выявить влияние процентного содержания альгината натрия и метилцеллюлозы в составе композитных материалов на адгезию и рост субстратзависимых клеток млекопитающих.

6. Определить оптимальные концентрации полисахаридов и режимы формирования, при которых биоматериалы удовлетворяют основным физико-химическим требованиям, предъявляемым к раневым покрытиям, и позволяют проводить культивирование субстратзависимых клеток на их поверхности.

Основная трудность формирования пленок заключалась в чрезвычайной неустойчивости латексно-полисахаридной дисперсии. В процессе нашей работы было проведено исследование взаимодействия латекса с полисахаридами в растворах, в результате которых были построены фазовые диаграммы, на основании которых определены режимы агрегативной устойчивости системы. Найдены режимы сушки, при которых стало возможно формирование однородных цельных пленок с любым соотношением концентраций компонентов.

На основании проведенных исследований методами ИК- и рентгеновской спектроскопии, измерений механических характеристик образцов и данных об агрегативной устойчивости системы сделаны выводы о механизмах взаимодействия латекса с полисахаридами, предложена схема процесса формирования структуры полимерных пленок и механизмы влияния полисахаридных добавок на физико-химические характеристики биоматериалов. Для выявления связи микроструктуры с биоактивностью материала были проведены исследования адгезионных свойств поверхности полимерных пленок с различным содержанием полисахаридов. На основании вычисленных значений свободной энергии поверхности и данных по исследованию взаимодействия субстратзависимых клеток человека с поверхностью материала определены оптимальные концентрации полисахаридов, обеспечивающие адгезию и распластывание клеток на поверхности композитных пленок.

Исследование взаимодействия разработанных материалов с водным окружением позволило определить диапазоны концентрации полисахаридов, при которых композиционные материалы по своей сорбционной способности и паропроницаемости не уступают современным раневым покрытиям, например Omiderm и Op-Site.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственного экспериментального материала, выводов и библиографического списка использованной литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Давыдова, Галина Анатольевна

106 Выводы

1. Определены диапазоны агрегативной устойчивости фторполимерной дисперсии в присутствии анионных и неионогенных полисахаридов. Разработана техника приготовления однородных латексно-полисахаридных пленок с различным соотношением компонентов.

2. Установлены механизмы взаимодействия фторполимерного латекса с альгинатом натрия и метилцеллюлозой в растворах и в составе композитных пленочных материалов.

3. Показано, что модификация латекса альгинатом натрия препятствует формированию кристаллической структуры композита, а введение метилцеллюлозы в концентрациях, превышающих адсорбционную насыщенность глобул латекса, способствует кристаллизации композита.

4. Найдена зависимость сорбционной способности и паропроницаемости композитных материалов от плотности упаковки и надмолекулярной структуры субстратов.

5. Установлено, что модификация фторлатекса альгинатом натрия и метилцеллюлозой повышает свободную энергию поверхности субстратов, что способствует адгезии и распластыванию субстратзависимых клеток.

6. Определены оптимальные концентрации полисахаридов и режимы формирования, при которых биоматериалы удовлетворяют основным физико-химическим требованиям, предъявляемым к раневым покрытиям, и позволяют проводить культивирование субстратзависимых клеток на их поверхности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Г.А. Давыдова, И. И. Селезнева, Б.К. Гаврилюк Изучение влияния жесткости облучения на свойства фторполимерной матрицы, модифицированной полианионными биологически активными веществами. Биофизика т.49, № 5, сент.- окт. 2004, стр.809-814

2. Г.А. Давыдова, И. И. Селезнева, Б.К. Гаврилюк. Изучение влияния полианионных биологически активных веществ на свойства фторполимерной биосинтетической матрицы. Вопросы биологической, медицинской и фармакологической химии. Москва,2004, №2, стр 11 -14

3. Давыдова Г.А., Селезнева И.И., Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К. Разработка композитных пленочных биоматериалов для решения задач тканевой инженерии. Сборник тезисов второго съезда биофизиков России, Москва, 1999, т.2, с.666.

4. Давыдова Г.А. , Рочев Ю.А., Гаврилюк Б.К., Разработка полимерных пленочных биоматериалов для решения задач тканевой инженерии, тезисы IV Городской научной конференции молодых ученых, Пущино, 1999. с. 44.

5. Давыдова Г.А., Халкузиева Р. С., Гаврилюк Б.К. Полимерные пленочные биоматериалы для целей тканевой инженерии. Тезисы конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" Пущино 2001, с.50

6. Давыдова Г.А., Селезнева И.И., Гаврилюк Б.К. Разработка полимерных пленочных биоматериалов для решения задач тканевой инженерии. Тезисы докладов IV Международной конференции "Современные подходы к разработке и клиническому применению эффективных перевязочных средств, шовных материалов и полимерных имплантатов" Москва 2001, с.119.

7. Давыдова Г.А., Селезнева И.И., Гаврилюк Б.К. Модификация полимерных пленочных биоматериалов для решения задач тканевой инженерии. Тезисы конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" Пущино 2002, с.65

8. Г.А. Давыдова, Б.К. Гаврилюк, Разработка полимерных пленочных биоматериалов для решения задач тканевой инженерии Тезисы конференции «Клинические и фундаментальные аспекты тканевой терапии. Теория и практика клеточных биотехнологий» Самара, 2004, с. 124

9. Г.А.Давыдова, А.П. Жамбалова , Б.К. Гаврилюк, Создание матричных систем для решения задач тканевой инженерии. Устный доклад. Тезисы I украинской конференции «Проблеми бюлопчно1 i медично1 ф1зики» , Харьков, 20-22 сентября 2004 г., с. 145

10. А.П. Жамбалова, Г.А. Давыдова, Создание матричных систем для решения задач тканевой инженерии, тезисы XVII зимней молодежной научной школы, «Перспективные направления физико-химической биологии и микробиологии», Москва, 2005, с.

11. А.П. Жамбалова, Г.А. Давыдова, Разработка новых биоматериалов для решения задач тканевой инженерии, тезисы 9-ой Международной Путинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века", Пущино, 2005, с.114.

12. А.П. Жамбалова, Г.А. Давыдова, Б.К. Гаврилюк, Изучение влияния добавок полисахаридов на физико-химические характеристики и биосовместимость полимерных пленок, тезисы второй международной конференции «Наука - бизнес - образование», Пущино, 2005, с.175.

Заключение

Была разработана технология получения биоматериалов типа «искусственная кожа» на базе фторполимеров и природных полисахаридов, которая исключает использование органических растворителей и высоких температур и позволяет получать композитные материалы с различным соотношением компонентов.

На основании проведенного исследования агрегативной устойчивости в водных дисперсиях и данных ИК-спектроскопии была предложена схема взаимодействия ионных и неионогенных полисахаридов с латексом и формирования различных уровней устойчивости латексной дисперсии, модифицированной полисахаридами. Показано, что общая природа полисахаридов делает схожими взаимодействие в латексно-полисахаридной дисперсии, несмотря на различие механизмов взаимодействия полисахаридов различной электростатической природы с латексными глобулами.

На основании данных рентгеноструктурного анализа . и ИК-спектроскопии установлены механизмы взаимодействия латекса и полисахаридов и выявлено влияние полисахаридов на процессы структурообразования композитных материалов. Показано, что добавление неионогенной метилцеллюлозы приводит к организации полимеров в стабилизированные гидрофобными силами кристаллические структуры, а введение анионного альгината натрия приводит к организации полимеров в стабилизированные водородными связями аморфные структуры.

Выявлена связь между структурой композитных материалов и физико-химическими характеристиками, определяющими потенциальную возможность использования данных биоматериалов в качестве раневых покрытий. Показано, что увеличение эластичности композитов с ростом концентрации метилцеллюлозы и снижение ее при введении анионного альгината натрия в полимерную матрицу связаны с изменением кристаллической структуры латекса. Оба полисахарида оказывают одинаковое действие на прочность композитных пленок - ведут к повышению способности материала сопротивляться разрушению за счет усиления физических взаимодействий между макромолекулами. Установлено увеличение сорбционной способности, паропроницаемости и адгезивности композитов при повышении концентрации полисахаридов, причиной которых является разрыхление структуры, вызванное появлением в пространстве между глобулами свободных молекул полисахаридов. При концентрациях полисахарида в полимерной пленке 10-20%, физико-химические характеристики композитов соответствуют параметрам, оптимальным для раневых покрытий. При этом установлено, что стерилизация материала с использованием рентгеновского и ультрафиолетового облучения не изменяет внутреннюю структуру и свойства поверхности образцов. Т.о. впервые показана возможность управления такими свойствами биоматериала как паропронициемость, сорбционная способность, эластичность, адгезивность при изменении концентрации и природы полисахарида, что позволяет получать материалы с заданными характеристиками.

На основании измерения краевых углов смачивания и проведенных расчетов установлено увеличение свободной энергии поверхности при увеличении процентного содержания полисахаридов в субстратах. Рассчитанная свободная энергия поверхности фторлатекса с 20% содержанием полисахарида (57,9-59,7мДж/м2) соответствует энергии л поверхности специально обработанного для роста клеток полистирола (ysv =58,6 мДж/м ). Установлено, что композитные материалы, содержащие более 5% полисахарида, в течение двух суток адгезивны для клеток. Найдено, что при 20% содержании альгината натрия и метилцеллюлозы в разработанных нами материалах их выход в среду составляет величину порядка 10*3 г/мл. Показано, что данные концентрации полисахаридов в среде могут только стимулировать адгезию, но не влияют на пролиферативную активность клеток. Гидрофобизация поверхности, происходящая в результате выхода несвязанных с латексом полисахаридов в среду, определяет изменение характеристик материала: обеспечив эффективный перенос клеток, материал, теряющий свои адгезионные свойства, атравматично отделяется от раневой поверхности.

Т.о. применение широкого спектра физико-химических методов исследования материалов на различных уровнях организации позволило установить механизмы взаимодействия полисахаридов разной электростатической природы с синтетическим латексом. Выявлена связь между структурой композитных материалов и физико-химическими характеристиками, определяющими потенциальную возможность использования данных биоматериалов в качестве раневых покрытий и субстратов, обеспечивающих перенос клеток на раневую поверхность. Впервые показана возможность управления такими свойствами биоматериала как паропронициемость, сорбционная способность, эластичность, смачиваемость, адгезивность для клеток при изменении концентрации и природы полисахарида, что позволяет получать материалы с заданными характеристиками.

Главным практическим результатом проведенных исследований явилась разработка на основе латекса СКФ-26 и альгината натрия /метилцеллюлозы новых биоматериалов типа «искусственная кожа». Данные материалы по своим физико-химическим характеристикам не уступают современным раневым покрытиям, а по способности поддерживать адгезию клеток существенно их превосходят.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Давыдова, Галина Анатольевна, Пущино

1. Алексеева Ю.И., Модификация синтетических латексов полисахаридами. // Автореферат диссертации к.х.н., МИТХТ, М., 1992.

2. Буянов В.М., Егиев В.Н., УдотовО.А.Хирургический moB//http://www.laparoscopy.ru/article/01216-suturs lhtml

3. А.И. Вайтенков, О.Е. Коваленко Изготовление пьезо- и пирочувствительных пленок поливинилиденфторида вакуумным испарением в электрическом поле. // Журнал технической физики, 1998, том 68, № 12 стр

4. Гаврилюк Б.К., Рочев Ю.А., Николаева Т.И., Культура клеток и реконструкция ткани. // Пущино, ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1988, 123с.

5. Галил-Оглы Ф.А., Новиков А.С., Нудельман З.Н .// Фторкаучуки и резины на их основе. М. Химия - 1966,236с

6. Гальбрайх JI.C. Целлюлоза и ее производные. // Соросовский образовательный журнал, 1996,11 , с 47-53

7. Геча Э.Я., Ларин Ю.Т. Водопоглощение твердых полимеров. // "Радиоэлектроника и Телекоммуникации" № 2 (20), 2002 , 14-19.

8. В.А.Глембоцкий. Основы физико-химии флотационных процессов. // М.:Недра-1980.-C.86-87,251-252,354-3 59,379-393,430-439

9. О.Н.Григорьев, И.Ф.Карпова. Руководство к практическим работам по коллоидной химии. // М. Химия. 1964. 420с.

10. Добыш С. В. Разработка и изучение нового поколения перевязочных средств на основе модифицированных полимерных материалов. // Диссертация Добыш С.В.; Всерос. науч.-исслед. и испытат. ин-т мед. техн. М., 1999. - 68 с.

11. Иванова JI.A., Сычеников И.А., Кондратьева Т.С. Коллаген в технологии лекарственных форм. // М: Медицина, 1984: 87-91.

12. Кабанов В.А., Зезин А.Б. Водорастворимые нестехиометричные полиэлектролитные комплексы новый класс синтетических полиэлекгролитов // Итоги науки и техники. М., 1984. Сер. Органическая химия. Т. 5. С. 131-189..14.