Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тест-системы для индикации антител к капсульным полисахаридам менингококков на основе полимерных микросфер (латексов)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Тест-системы для индикации антител к капсульным полисахаридам менингококков на основе полимерных микросфер (латексов)"

РГб од

На правах рукописи

ХАРИТОНОВА Анжела Владимировна

ТЕ£ГГ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ АНТИТЕЛ К КАПСУЛЬНЫМ ПОЛИСАХАРИДАМ МЕНИНГОКОККОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРНЫХ МИКРОСФЕР (ЛАТЕКСОВ).

03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-1997

Работа выполнена на кафедре микробиологии медицинского факультета Российского университета дружбы народов.

Научные руководители:

кандидат медицинских наук * старший научный сотрудник А. П. Аллилуев

доктор медицинских наук М. В. Далии

!

Официальные оппоненты: академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор И. В. Домарадский доктор медицинских наук, профессор А. К. Токмалаев

Ведущая организация: Московская медицинская академия

им. И. М. Сеченова.

Защита диссертации состоится 1997 г. в ¿Гчас.

на заседании диссертационного совета К 053. 22.16 ■ Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов.

Автореферат разослан С.в-МГ 1997 г.

Ученый секретарь /7

диссертационного совета

кандидат биологических наук, доцент""^/ О. Б.

Гигани

Актуальность проблемы. Менингококковая инфекция (МИ) представляет серьезную проблему для многих стран мира. Пандемия менингококкового менингита (ММ) серогруппы А, зарегистрированная на земном шаре в конце 60-х и начале 70-х годов двадцатого века, была обусловлена вирулентным представителем этой инфекций, появившимся впервые в Китае, и обозначенным впоследствии как «клон Ш-1» группой исследователей нз института Молекулярной Генетики им. М. Планка в Берлине.

В настоящей момент этот клон-Ш серотипа А к;;к возбудитель МИ снова активизировался : обнаруженный в 1980-е годы в Непале и Китае, сн был занесен мусульманскими паломниками в Мекку, после чего стал причиной вспышек инфекции на Ближнем Востоке, в Африке, США и Канаде. Особо следует отметить вызванную им недавнюю эпидемию в Нигерии, где в 1995 году заболеваемость ММ составила 350/100000.

Проблема заноса МИ в сьязн с миграцией паломников имеет конкретный интерес для России не только потому, что в ней проживает много мусульман, но и в связи с тем, что Российская Федерация (РФ) является центром буддизма, а верующие этой конфессии совершают длительные переходы в Тибет, Лхасу. В перибд подъема МИ в конце 70-х годов от 80-95 % больных из регнона Бурятии выделялись менингококки серогруппы А, которые продолжают доминировать в этиологии генерализованных форм МИ в этой автономии.РФ и до настоящего времени, при некотором увеличении числа числа заболеваний, обусловленных возбудителями серогрупп В и С.

В свете изложенного особую актуальность приобретает вопрос о т ех диагностических системах, которые используются для уточнения клинико-бактериологического диагноза МИ и для выявления уровня коллективного иммунитета к МИ как до проведения активной профилактики, так и после применения вакцинных препаратов по эпндпоказаниям. Именно в этих последних случаях возникает потребность в диагностических тест-системах, пригодных для массового использования в полевых условиях, а опыт отечественной и зарубежной практики свидетельствует о приоритете, принадлежащем в этом случае латексным диагностикумам.

Простота реакции латекс-агглютинации (РЛА) с антигенными диагностикумами при скрининговых обследованиях больших коллективов позволяет быстро и без существенных затрат установить тех, кто благодаря высокому уровню противоменишококков,ых антител «защищен» от МИ и не подлежит вакцинации. Эта же тесг-система позволяет выявить сдвиги, а также подтверждать серологический диагноз МИ по нарастанию циркулирующих аититгл

-2в сыворотках больных с клинической симптоматикой ММ.

Одновременно при подобного рода исследованиях выявляются группы риска, т.е. группы люд^й, в сьшоротках которых или нет противомешшгококкоиых антител, или же титр последних столь незначителен, что такие лица могут стать как носителями Neisseria meningitidis, так и экологической нишей для интенсивного размножения- патогенных менингококков, т.е. говоря иными словами, заболеть геи ализованной формой (ГФ) эпидемического ММ.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось конструирование антигенной тест-системы для индикации антнтел к капсульным полисахаридам (КП) менингококков на основе полимерных микросфер (латексов). .

При достижении этой цели последовательно решались следующие задачи.

1. Проводился подбор партий микросфер для приготовления латексных диагностикумов (в этой части исследований мы ориентировались на материалы, полученные Яшиной Н.В. (1997) при создании антигенных кншечно-иерсиниозного и бруцеллезного латексных диагностикумов).

2. Отрабатывались методы иммобилизации КП менингококка на полимерных микросфсрах, осуществлялась оценка чувствительности, стабильности полученных серий иммунохимических латексных тест-систем (ТС) в сравнении с аналогичной антигенной ТС для реакции пассивной геммагглютинации (РПГА).

3. Оценивались возможности новых ТС при определении уровня антител у здоровых людей, у люден, привитых менингококковыми вакцинами, а также в сыворотках больных при динамическом наблюдении за течением ММ.

Научная новизна. Впервые разработан метод получения ТС для индикации антител к КП менингококков на полимерных микро. сферах с реакцнонноспособными эпоксидными группами. Применение таких модифицированных полимерных суспензий позволило связать молекулы бнолиганда за счет образования ковалентной связи, обеспечивающей необратимую фиксацию на поверхности частиц и получить стабильные и высокочувствительные ТС для диагностики ММ.

Практическая значимость. Разработаны антигенные ТС для серологической диагностики ММ, вызванного возбудителями серогрунп А, В, С, X, У и Z на основе окрашенных частиц

полистирольных суспензий, химический состав, структура и размер частиц которых позволил «привязать» к ним и удержать очищенные КГ1 менингококков с последующей возможностью использования полученных 'ГС для выявления указанных антимикробных антител в сыворотках люден и экспериментальных животных . для диагностических, прогностических и экспериментальных целен.

Положения йыносимые на защиту:

1. Разработана ТС на основе полимерных микросфер (лагексов) для индикации1 противоменннгококковых антител серогрупповой принадлежности.

2. Латексная ТС при выявлении серогрупповых прознпомепннгокок-ковых антител в РЛА обладает высокой специфичностью и чувствительностью, превышая по этим показателям РИГА с коммерческими эритроцитарными дпапюстикумамн.

3. ТС за счет простоты постановки РЛА, высокой воспроизводимости и быстроты оценки результатов титрования пригодна для проведения скрй'нинговых обследований широких комитентов людей при эпидемическом неблагополучии, обусловленном ММ, п целях выявления круга лиц, подлежащих прививкам менингококковыми вакцинами.

4. РЛА может быть использована для уточнения серологического диагноза ММ: почти у 80% больных МИ на 7-10 день болезни в сыворотках обнаруживаются в диагностическом титре серофуп-повые антитела, причем практически у 90% больных в динамике болезни отмечается положительная сероконверсия. При исследовании сывороток больных с клиническим диагнозом ММ, но без лабораторного уточнения диагноза, у 77-100% больных удается в РЛА установить серогруппу возбудителя менингита.

5. Практическое здравоохранение получает дополнительный серологический метод выявления серогруппы возбудителя МИ и простой тест для массовой оценки уровня коллективного протнвоменингокок-кового иммунитета, столь необходимый противоэпидемическим службам для принятия решений о профилактических прививках против возбудителя МИ установленной серогруппы.

Апробация работы. По ходу выполнения исследования результаты представлялись для обсуждения на научно-практических конференциях НПО «Биомедицинские технологии», в 1995, 1996, 1997 гг, на научно-практической конференции молодых ученых медицинского факультета РУДН, на международной конференции «Ломоносов-96» а

МГУ, на . 1-ой Национальной конференции Российской Ассоциации аллергологов и клинических иммунологов в 1997 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, перечень которых представлен в конце автореферата. Объем и структура работы. Диссертация итожена на стр. машинописною текста н состоит in введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения экспериментальных исследований, выводов и библиографического указателя, включающего источников. Работа проиллюстрирована рисунками н таблицами.

Материалы и методы.

В работе использовали КП менингококков cepoipynn Л, В, С, X, У, Z, любезно предоставленные цехом но производству мснинго-

■ кокковых вакцин предприятия МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского. Групповые А- и С-КГ1 отвечали требованиям, предъявляемым к полуфабрикатам менингококковой А+С вакцины на этот препарат. В качестве препарата сравнения при оценке серологической специфичности использовали Ви-антиген S. typhi , приготовленный по модифицированному / А.П.Аллилуев / методу Уэбстер с соавторами (1952).

В работе использовали мы ней линии CBA/Ca.Lac.Sto/ , так как именно эта линия является оптимальной для оценки иммуноген-ности мепингококковых вакцин.

Серологическая активность препаратов КП изучалась в РПГА и PJ1A с мышиными и кроличьими иммунными гомологичными и гетерологичными антимешшгококковыми сыворотками.

Для изучения чувствительности, и специфичности антигенных латсксных мепингококковых диагност икумов исследовались сыворотки, полученные от клинически здоровых доноров, от привитых людей и от пациентов клиники инфекционных болезней, возраст

■ которых варьировал от 7 до 72 лет. Сыворотки от доноров и привитых забирались однократно, а от больных МИ на 1-2-й, 7-10-й, 20-й и 25-й день с момента госпитализации заболевших. Собранные образцы были разделены на 7 групп. В первую вошли сыворотки от 40 здоровых лиц (контрольная группа). Во-вторую -сыворотки 38 привитых, в третью-сыворотки 39 больных ГФ МИ, у которые диагноз МИ подтвержден бактериологически и серологически ( встречный иммуноэлек-Tpi рорез-В11ЭФ, антнтельная латексагглютинацня, рост культуры, бактериоскопия) и установлена серогруппа менингококков,

вызвавшнх заболевание. Четвертую группу составили сыворотки 12 больных с клинической картиной гнойных менингитов и установленной лабораторпо неменингококковой этиологией инфекции. Пятая группа была представлена сыворотками 10 больных, у которых диагноз ГФ МИ, ММ, менннгококюмин (МК) ц их сочетания базировался на клинических проявлениях болезни при отсутствии положительных результатов лабораторного анализа (переведены и! других больниц). В шестую группу вошли сыворотки 13 больных с: Клиникой МИ, но с отрицательным результатом лабораторного анализа. Титровались также 13 сывороток больных (седьмая группа), предварительный диагноз которым поставлен по микроскопическому исследованию препарата «толстая капля», где были обнаружены клетки менингококков.

Для приготовления латексных диагностикумов в качестве носителя использовали окрашенные жирорастворимыми красителями (Sudan II solvent orang 7) .микросферы из полимеризопанного полистирола размером от 0,95 до 2,0 микрон и неокрашенные полиглицидийметакрилатные суспензии частиц размером от от 2,3 до 3,4 мкм и плотностью 1,225 г/см} с концентрацией эпоксидных реакцнонноспособных групп на поверхности от 46,6 до 92,6 мкмоль/ Г полимера.. Все полимерные микросферы (латексы) были любезно предоставлены сотрудниками МГАТХТ нм. М.В.Ломоносова*. Всего изготовлено более 50 образцов латексных менингококковых антигенных диагностикумов.

Анализ фракционного состава антигенов осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе HPLC модели 3500 (фирма «Спектра-Физнкс», США), укомплектованном колонками Ultropack TSKG 3000 (голубыми); получение молекулярно-однородных препаратов осуществляли методом эксклюзивной хроматографии на колонках с гелем Sephacryl S-200.

Мышей линий СВА/Са. Lac.Sto/ вакцинировали .внутривенно препаратами АВС-тривакцины в дозе 2 мкг на мышь в пересчете на КП.

При приготовлении латексных диагностикумов и контрольного латекса для каждого из указанных КП вначале определялась минимальная активная концентрация (МАК), с тем чтобы установить

•Приносим глубокую благодарность профессору Грицкоаой И.А. и доценту Прокопову Н.И. за постоянную помошь при провслечии настоящей работы.

-6. «рабочую» сенсиоилнзируюшую до «у, обычно превышающую МАК в четыре раза. Сенситивную активность препаратов) определяли путем установления оптимальной сенсибилизирующей дозы с использованием полпстирольных суспензий.

Процесс иммобилизации антигенов на латексы осуществляли следующим образом. В качестве агентов, сенсибилизирующих латексы были использованы КГ1 менингококков серогрупп А, В, С, X, У, Z , выделенные по модифицированному методу Готшлиха (1969). Перед сенсибилизацией микробными антигенами частицы латекса отмывали центрифугированием 2 раза фосфатно-солевым буфером (ФСБ) рН=8,0, доводили их концентрацию до 1% и смешивали с равным объемом раствора антигена в отработанной концентрации, которая для разных серогрупповых КП варьировала в пределах от 5 до 25 мкг/мл. После инкубации при 37"С в течение 1,5 часов взвесь отмывали ФСС и инкубировали в глициновом буфере рН=7,8 еще I час. Для получения контрольной суспензии латекса вместо раствора антигена использовали ФСБ. После изготовления и апробации «экс-темпоре» рабочие образцы латексов были заложены на хранение при различных температурах (+4"С , +20"С, +37°С).

В качестве ' поддерживающей среды, с целью исключения спонтанной агглютинации, использовали ФСБ, содержащий 1% нормальной кроличьей сыворотки или 0,5 мкг/мл человеческого или сывороточного альбумина. Работая концентрация диагностикума и контрольного латекса для РЛА в планшетах составляла 0,05%. В качестве образцов сравнения при оценке чувствительности и специфичности латексиых ТС использовались коммерческие эритроцитлрные менингококковые диагностикумы серогрупп А, В, С и эр;процитарный брюшнотифозный Ви-диагностикум, выпускаемые Предприятием МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского. В сериях экспериментов сравнения сыворотки изучали одномоментно в РЛА и РИГА с помощью микротитраторов в планшетах.

Расчет величин средних титров X, их стандартного отклонения и доверительные интервалы, достоверность различий между сравниваемыми группами определялись с помощью критерия I Стьюденга.

Для объективизации процедуры выбора диагностического титра Т С в РЛА на МИ применен способ ОКстап (1978).

Результаты исследований и их обсуждение Разработка тест-систем: для обнаружения антител к КП менннгококков серогрупп А, В. С, X, У и Ъ.

При оценке серологической активности менингококковых КП пу1ем определения их \1аК было установлено': латексные диагностикумы не уступал^!по '^ «етвительноспгэртггроцитарным. Изученные на бараньих эритроцит4!'дозы антигенов! стали ориентиром для сенсибилизации лаУекс|!|1|1Х частиц. Было показано, что закономерности, выявленные у1 эрнтроцитарных диагностикумов, сохранились и дня латекс-ных ТС.

Для определения оптимальной концентрации эпоксидных групп на поверхности частиц полистирольных суспензий, обеспечивающей максимальную чувствительность к специфичность теста, использовали неокрашенные полимерные суспензии".

Анализ полученных данных (см. Таблица I.) показывает, что максимальный титр в РЛА с г-мологачной референс-А-сывороткой, равный 1:128, был достигнут при использовании микрофер 147-й серии латексов. МЬжнгококковый А-диагностикум на оаюне этой полимерной суспензии с максимальной концентрацией эпоксидных

Таблица 1.

Сравнение полистирольных. суспензий с различной концентрацией эпоксидных групп по чувствительности латексных диагностикумов на основе КП менингококков серогрупп А, В и С.

Полимерные суспензии с1, мкм Концеятрация эпоксидных групп МК МСТЛЬ/Гпсшшер» Чувствительность (титр сыворотки в РЛА)

А В С

85СЫ47 1,85 18,9 128 16 32

ББСЫбг 12,3 16 16 16

БЗСЫ46 -«- 10,8 32 128 32

55СЫ48 -«- б;7 32 128 8

85СЫ49 -«- 4,5 16 16 16

БЬ-145 -«- | 32 32 16

Примечание: Сравнение полимерных суспензий осуществляли по титру стандартной референс-сыворотки в РЛА с полученными диа-гностикумами. Титр референс-сыворотки в РПГА с эри\, лип арными днагностакумами на основе А, В и С-КП составил 1:16.

групп .18,9 » уоль/г„ооказался чувствительнее по сравнению с эритроцнтарнымн препарашми.

Диагностическая ценность -А-днагностикумн на основе частиц, содержащих на новсрхносгн от нмальную концентрацию эпоксидных групп, оказалась значительно ш.иие эффективности тссюп на основе неактнвированных микросфер из полистирола. Н-диагностикум проявил самую высокую чувствительность при концентрации

эпоксидных групп* 10,8 и 6,7 мкмоль/г,......„«■,«. Диагпостнкумы,

полученные на основе других образцов суспеншн, имели более низкую чувствительность, но не уступали эршроци гарным аналошм.

Были также апробированы 2 функциональные суспензии на основе полихлорэтилметакрилата (ПХ')МА). однако им.мунохпмнческне исследования покачали их нестабильност ь.

На основе полн(стнрол-со-глиц1|дилметакрнла1ных) сусцепзип с диаметром частиц от 2,3 до 3,4 мкм и плотностью 1,225 1/см* были изготовлены латексные менннгококковые днагностикумы (таблниа.2.) . Дня обеспечения оптимальной адсорбции бнолшандов, которая гарантирует максимальную чувствительность и специфичность диагностических ТС, существенное значение имеет концентрация функциональных групп на поверхности микросфср.

Таблица 2.

Сравнение поли(стнрол-со-глицндилмегакрилатных) сусиеншй с рахшчнон концентрацией эпоксидных групп по чувствительности яатексных диагностикуыов на генове Л-, В- и С-КГ1 менингококков.

Пол>шсрные СуШЯШ1И Л, мкм ! Концентрация эпоксидных групп мкыоль/г,.>ШШ1м. Чувствительность (титр сыворотки в РЛА)

А В С

СМ-46 ' 1 2.36 92,9 0 0 0

1С2М-160 2,4 82,6 32 32 64

2,52' 73.4 ' 32 32, 32

СКАМ? 2,94 60,8 16 16 16

| СШ472 3,36 | 46,6 256 256 256

Цршйсаецше: Сравнение полимерных суспензий осуществляли лр титру стандартной референс-сьшороткн в РЛА с полученными диагно-■ггахкумдоа.

Макснмальный показатель титра сыворотки в РЛА был достигну чри использовании диагносгикума на основе глицндилметакрнлатных суспензии с концентрацией эпоксидных групп 46, 6 мкмоль/гт.Ми<т., а спонтанная агглютинация наблюдалась при концентрации эпоксидных групп 92,6 мкмоль/гпо.шмли Анализ данных показал, что все три (А, I) и С) диагност икума, изготовленные. на основе микрссфер 472-оЛ серии, продемонстрировали высокий тнтр =1:256 в РЛА. Проведенные исследования позволили заключить, что для получения антигенных менингококковых диагностнкумов целесообразно использовать глицидилметйкрнлатные суспензии.

Ддя каждой вновь разрабатываемой ТС требуется установить ее стабильность, специфичность и чувствительность прл хранении. После изготовления и апробации изготовленные «экс-темпоре» рабочие ТС были заложены на хранение при различных температурных режимах. Установлено, что лагексные диагностикумы, приготовленные на основе менингококковых К11, обладала достаточно высокой стабильностью при хранении их в холодильнике (+4"С) с добавлением азида натрия в качестве консерванта. Серии латекса NN 148,152 и 10 сохраняют способность агглютинироваться А-антитсламн (АТ) в течение более «юлутора лет. Такой же способностью обладают серии 472, 47 м 471 с концентрацией эпоксидных групп от 46,6 до 73,4 мкмол!>/гГКм„ч.сГ«. При их' концентрации в 82,6 мшоль/гм,™^« (серия N 460), а также у ПХЭМА латекса серии N З-ХЗМ менингококковый А-КП фиксируется на последних образцах не долго,- от одной недели до трех, максимум - шести месяцев. Способность :вязывать микробные КП у полистирольных латекеов, по видимому, универсальна, поскольку те же серии латекеов, которые оказались высоксстабильнымн в качесгпе ноенз¿лей менингококковых группы А-КП, обнаруживали также при сенсибилизации антигенами иной специфичности способность а!глю-тиниропачЪся в течение полутора лет менннгококковыми йиС-А'Г и брюшнотифозными Ви-АТ.' ТС на основе полимерных микросфер более специфична, так как присутствие в составе формалннизирован-ного эритроцита перекрестно-реагирующих антигенов обеспечш.ае; п невысоком титре положительную РПГА С-диагносгикума с В-ан-тисывороткой л В-диагносгикума с С-антисывороткой, а также У-диагностикума с г-аягисывороткой , в то время как латгкеные '1С. в которых перекрестно-реагирующие антигены отсутствуют, гакмх неспецифических реакций не обнаруживают. Эти результаты по1.ноля ют ожидать, что именно латексы станут наиболее перспективны:»! субстратом для создания ТС с универсальными возможностями г;ри проведении иммунологической диагностики и мониторинга.

Сравиительная оценка чуасттпелыюсти латексных

Ме№<111 «КОККОВЫХ ЯНТИЩИПЫХ ДКШ.ИОСТНКуМОВ.

Более высокая чувствительность <!Л А и сравнении с РИГА выяв-лена при совместном титровании сывороток людей и- лабораторных животных одновременно в обеих реакциях (табл. 3). Наиболее высокие

Таблица 3

Сравн:ггельная оценка чувствительности латексных и эритроци-тарных менингококковых диагностикумов серогрупп А, В и С.

серо- Сыво- Титр сыворотки в Л А превышает (+) равен

груп- ротка (0) или усту пает (-) Титру сыворотки в РПГА

па для тит- (+) с эритроцитарными диагностикумами ($).

рования

-Зи -2 -1 0 + 1 +2 +3 +4 Все- Среднее

ме- и го превы-

нее I бо- тит- шение+

лее ро- ошибка

- ва-

нии

А • 2 6 16 36 32! 30 25 5 165 1.104),21

А 5 14 27 34; 24 19 4 125 1,09-4),33

А 8 4 12 20 22; ;18 28 8 . 128 1,40*0,36

В » 8 16 16 28 | 8 76 1,12*0,40

В *» 6 9 30 27' 15 9 6 96 0,92*0,19

В ***' ■2 2 3 :14| ■37 27 21 106 2,39*0,54

С * 4 4 40 4 ; 8 12 16 92 1,0±0,20

С ** 6 6 30 6 3 9 9 72 0,83*0,22

€ »** 3 9 15 17! 30 20 8 102 1,52*0,43

•-иьтлишая; миши иммунизировались менлнгококковыми А, В, С и

А +В+-С ¡вакцинами

"•-кроличья производственная гипериммунная сыворотка для ■серогрутшровакия

"""•-неловеиеские сыворотки добровольцев (рекруты 18-25 лет) перед ■вакцинацией

(5Ьирек1.ш1с;те на 1 соответствует одному разведению, т.е. титр РЛА рвмше ъ даа раза; лрд 2+ в четыре раза и т.д.

тнтры выявляемых в PJ1A A-, В- и С-АТ показаны при параллельном титровании человеческих сывороток: PJIA была на I разведение чувствительнее РГ1ГА при выявлении А- и С-АТ, и на 2 разведения -при титровании В-АТ. Продемонстрированное повышение чувствительности РЛА в сравнении с РПГА (РПГА с использованием КП позволяет выявлять 0,003-0,006 мкг азота АТ) ставит РЛА в некоторой степени непосредственно следом за иммуноферментным анализом (ИФА), но постановка РЛА несравненно проще и дешевле последнего.

Полученные лаТексные ТС были использованы для выявления уровня фоновых А'! в сыворотках, взрослых здоровых людей при оценке коллективного противоменингококкового иммунитета. Из результатов этого титрования следует, что в сыворотках взрослых здоровых людей призывного возраста присутствуют не только АТ к КП менингококков ceporjjynn А, В и С, как это было многократно показано ранее, но и АТ практически ко всем циркулирующим на территории нашей страны серогруппам менингококков Наиболее часто и в больших титрах встречаются АТ к КП серогруппы У, затем А. В, С, X, Z. Можно полагать, что с помощью разработанных латексных диаг-ностикумов за несколько часов, прошедших после взятия пробы крови, обработки сыворотки, оттитровкн ее микроколнчеств з микротит-раторе и визуальной оценки получаемых результатов, - будут получены п]- ктически' в любой лаборатории данные, позволяющие органам здравоохранения установить истинный размер групп риска и других коллективов, подлежащих прививкам менингококковыми вакцинами. Созданная ТС на основе полимерных микросфер позволяет проводить оценку эффективности противоменингококковых вакцинных препаратов в эксперименте, что было продемонстрировано при испытании иммуногенности КП в моно-_(А, В, С), ди-(А+С) и трех-компонентуом (А+В+С» варианте, каждый из которых вызывал у иммунных мышей линии -CBÁ/Ca.Lac.Sto/ нарастание титров групповых А, В и С-АТ в сыворотках, выявленное в РЛА с помощью разработанных диагносшкумов.

При оценке степени защиты различных групп населения от МИ после введения моновакцины на основе КП-А или дивакцины, содержащей КП А+С выяснилось, что A-вакцина у привитых индуцирует отчетливые иммунологические сдвиги ¿"рис. 1): в сыворотках регистрировалось нарастание А-АТ в РЛА и в РПГА, но в первом случае средний титр составлял 6,25±0,26, в то время как в РГ1ГЛ средний титр не превышал 4,66±0,?.6. Различие между результатами РПГА и РЛА повторилось при параллельном титровании С-АТ,

1 -

л { и Ь——

—^ * г

Ркс.1. Частотное распределение титров А-АТ у привитых А-менингококковой вакциной и в контрольной группе.

4,08±0,26 и 5,26^,19 соответственно (см. Табл. 4). Таким образом,

Таблица 4 •

Содержание антнменингококковых АТ в сыворотках привитых А-менингококковой вакциной.

г

4

Серо-группа Реакция количество сывороток с титром А'Г Ь X @ ш

2;| 4 1 8 16 32 64 12 8 256

А рла 0 0 0 3 4 4 10 3 24 6,25 1,26 0,26

А рпга 0 1 4 4 10 3 2 0 24 4,66 1,26 0.26

В рла 0 0 0 0 11 7 4 2 24 5,87 0,99 0,2

В рпга 0 4 1 11 6 1 1 0 . 24 4,08 1,25 0,26

С рла 0 0 0 1 9 6 1 24 5,26 0,95 0,19

с рпга 0 3 4 9 4 4 0 0 24 4,08 1,25 0,26

можно заключить, что РЛА обладает высокой чувствительностью и специфичностью, но в огличие от других методов упрощает процедуру анализа, что свэдетельствует о ее перспективности.

Выявление АТ к КП менингококков в РЛА как дополнительный тест для установления диагноза МИ в клинике.

Проведено изучение в динамике сывороток больных с диагнозом

МИ, подтвержденным лабораторно выделением и группированием менингококков (в данном случае серогрупп А, В и С) или положительными результатами обнаружения А, В и С - полисахаридов л тесте ВИЭФ. Оказалось, что в группе больных МИ серогруппы А в первые два дня с момента поступления в клинику А-АТ обнаруживаются в довольно низких разведениях: в среднем в РПГА был получен титр 1:17,3+.0,87, а в РЛА - 1:42,83+Г,71. В этой серии опытов чувствн--тельность РЛА была выше, чем у РПГА. Необходимо отметить, что АТ в разведении 1:128 и выше при титровании с помощью РЛА редко встречается в в первые дни болезни в сыворотках ■ больных с лабораторно подтвержденным диагнозом МИ серогруппы А, а также менингитами другой этиологии, но доминирует у больных на 7-10 день болезни; названный и более высокий уровень А-АТ встречался в эти сроки у 16 больных из 20-н, т.е. в 80% случаев. При титровании сывороток больных МИ серогруппы В на 7-10 день поступления в клинику, средний титр В-АТ в РЛА составил 334±220,,3, а в РПГА 76,9±22,5. Напротив, при оценке уровня С-АТ на 7-10 день чувствительность РПГА оказалась более высокой; средний титр С-АТ этим диагносгикумом определялся в пределах 128,0±78,6, в то время как в РЛА он составил 96,0^32,1. Этиологически диагноз МИ возможно подтвердить с А-латексным диагносгикумом в 86,4% случаев, с В- и с С-латексными диагностикумами ь 100% случаев. Поэтому можно предположить, что именно благодаря высокой чувствительности и специфичности РЛА позволит в более ранние сроки заболевания ММ обнаруживать групповые АТ, необходимые для серологического подтверждения ММ.

В 'следующем разделе этой части. работы была предпринята попытка ретроспективно серологически диагносцировать серогруппу возбудителя ММ у больных на основании выявления п сыворотках се-рогрупповых А, В и С-АТ по их значимому приросту или при выявлении «диагностического титра».

Анализ серологических результатов с учетом 4-х кратного нарастания уровня АТ и диагностического титра приведен в таблицах 5 и 6, откуда следует, что при титровании сывороток группы больных с клиническим диагнозом, но с отрицательным лабораторным результатом исследования на МИ в динамике болезни, положительная се-роконверсия, т.е. повышение титра А-АТ в 4-е и более раз, и наличие диагностического титра обнаруживается в РЛА у 77,5 % обследованных. Таким образом, в данной конкретной выборке диагноз МИ дополнительно уточнен серологически у 10 человек.

Таблица 5.

Данные серологического подтверждения диагноза МИ в РЛА у больных с клиникой менингита, но с отрицательными результатами лабораторных анализов. !

Серогруппа количество больных % Постановка серологического диагноза РЛА ,

А 4 31 Диагностический титр !

В 3 23,1 -«- |

ВС 2 15,4 -«- 1

С 1 8,0 сероконверсия

Всего 13 77,5

Диагностическая ценность А, В и С диагностикумов для РЛА была продемонстрирована' при титровании сывороток от больных с выраженной клинической картиной менингита, но без результатов лабораторного анализа (переведены из других больниц);

Таблица 6.

Данные серологической диагностики группы больных с клиникой МИ, но без результатов лабораторного анализа.

серогруппа число случаев ■ % Постановка диагноза

А 2 20 Диагностический титр +сероконверсия

А В 4 40 -«-

АС I 10 -«-

В 3 30

Всего 10 100

Получено 100% серологическое подтверждение диагноза МИ по диагностическому титру и положительной сероконверсии в сыворотках 10 больных, у которых диагноз был поставлен на основании клинических проявлений менингита, но отсутствовал лабораторный

анализ.

Учитывая полученные данные о диагностической ценности латек-сных днагностнкумов на основе группоспецифических полисахаридов N.0x110 считать, что эти диагностические препараты могут быть использованы как дополнительные при серологической диагностике МИ.

выводы

1. Разработана ТС на основе полимерных мнкросфер (латексов) для выявления противоменингококковых АТ различной серо-групповой принадлежности.

2. Новая латексная ТС высоко специфична и обладает в этом отношении преимуществом перед широко применяемой в настоящее время РПГА, поскольку в отличие от эризроцитарной основы в латексных частицах отсутствуют перекрестно-реагирующие антигены.

3. При выявлении противоменингококковых АТ различных серофупп чувствительность РЛА с разработанными латекснымн днагностикумами превышает чувствительность РПГА с коммерческими диагностикумами не менее чем в два раза.

4. Простота постановки РЛА, воспроизводимость результатов титрования и минимальные количества необходимой для этого сыворотки (взятие крови из пальца) позволяют использовать разработанный тест в микромодификацин для скрининговых обследований широких контннгентов при изучении коллективного иммунитета к МИ, а также для оценки эффективности профилактических прививок населения против ММ и для экспериментальных

целей.

5. Использование разработанной РЛА для выявления специфических АТ в сыворотках больных ММ показало, что РЛА может найти применение в качестве дополнительного серологического метода уточнения диагноза ММ: в динамике болезни более чем у 80 % больных титры серогрупповых АТ возрастают в четыре и более раз, а начиная с седьмого дня болезни диагностический титр обнаруживается у 78 % заболевших.

Публикацни. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

1. Аллилуев А.П., Котельникова О.В., Харитонова A.B., Яшина Н.В., Кричевец С.Г.

«Оценка уровня коллективного иммунитета к возбудителям ме-шшгококкового менингита с помошью диагностикумов, основанных па использовании полимерных микросфер.» // Бномеднцинскне технологии. - 1995. - Вып. 2. - С. 79-83.

2. Харитонова A.B., Яшина Н.В., Котельникова О.В., Аллилуев А.П., Артемов И.Д., Кричевец С.Г., Прокопов Н.И.

«Полимерные окрашенные микросферы ( латексы ) для индикации антител к капсульным полисахаридам менингококков различных серогрупн.» // Биомедицинские технологии. - 1996. - Вып. 4. -С.77-81.

3. Аллилуев А.П., Венгеров Ю.Я., Харитонова A.B., Шарова О.О., Котельникова О.В., Королева И.С.

«Латекс-агглютинации для серологической диагностики менинго-кокковон инфекции.« Биомедицинскиетехнологии. - 1996. - Вып. 4. -С. 82-86.

4. Аллилуев А.П., Харитонова A.B., Венгеров Ю.Я., Королева И.С., Котельникова О.В.

«Латекс-агглютинация в диагностике менингококкового менингита.» Сб. Трудов 1-ой Нац. конф. Росс. Асе. аллергологов и клинических иммунологов. Москва. 28-31 января 1997, М: Ичц-во ВИНИТИ РАН, 1997. С. 230.

Харитонова Анжела Владимировна ( Россия )

«Тест-системы для индикации антител к капсульным полисахаридам менингококков с помощью полимерных мнкросфер (латексов).

В диссертации разработан метод выявления противоменингококко-вых антител с помощью полимерных окрашенных микросфер (латексов) па основе полистирола и глицидилметакрилата.

После их сенсибилизации специально очищенными капсульными полисахаридами менингококков серогрупп А, В, С, X, У и Ъ латексы приобретают способность агглютинироваться сыворотками лабораторных животных и людей, содержащими соответствующие антитела.

Показано, что при сравнении вновь разработанных латексиых тест-систем и обычно используемых для выявления ■ противомснинго-кокковых антител производственных зритроцитарных диагности-кумов серогрупп А, В и С, как и специально приготовленных зритроцитарных диагностикумов X, У и Ъ, именно латексы обладают более высокой чувствительностью и специфичностью, чем эритроцитарные диагностикумы, что делает первые предпочтительными для экспериментаторов и работников практического здравоохранения.

Просота постановки реакции латекс-агглютинации (РЛА), стабильность результатов, микроколичества сыворотки, требуемые для постановки теста и отсутствие прецизионной аппаратуры - все это удешевляет процедуру выявления противоменннгококковых антител и делает ее возможной для любой лаборатории или клиники. РЛ А может быть использована для оценки противоменннгококковых вакцин в опытах на животных и после прививок челопеческих коллективов, для проведения скрининговых обследований населения при установлении уровня коллективного противоменингококкового иммунитета и, наконец, для уточнения серологического диагноза менингококковой инфекции.

Работа выполнена на высоком методическом уровне, представляет несомненный теоретический интерес и практически значима.

-18-

Anjela V. Kharitonova (Russia) «Test-systems for the indication of antibodies against in capsular poly-sacharidas meniiigococcs, with the help of polumer microsphei (latex).

The thesis contains the developing of a method LAR (Latexs agglutination reaction), which help to reveal the antimeningococcal antibodies by using polymerous coloured microspheres (latexs) based upon po-lysterol and glicidilmetacrilat.

After sensibilization with especially purified capsule polysaccharides from meningococci groups A, B, C, X, Y, Z, the latexs gain the ability to be agglutinated by animals and human sera, which contain the adequate antibodies. The autor showed that in comparison to the commonly used for antimeningococci antibodies identification erythrocytical diagnosticums serogroups A, B, C and to the specifically produced en throcyti-cal diagnosticums X and Y, the newly developed latex test-system reveales a much higher sensitivity and specificity and are therefore more reliable and andvantageous for using them in experimental work and clinic.

The simplicity of LAR method, of e;*pressed results, the need of small quality of serum for investigation and absence of r.eed in equipment - all this makes the procedure inexpensive and is for any clinic or laboratory. That LAR could be used for evaluatiatioa of antimeningococcal vaccines activity in experiments on animals and during human contingents vaccination, for earning out the scrining of population to detect the collective immy-nity, and of last for carrecting of serological diagnosis of meningococcal infection.

The whole study was done on a high methodic interest and practical significance.