Создание диагностических тест-систем "Полимерная микросфера-биолиганд" медико-биологического применения

Станишевский, Ярослав Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание диагностических тест-систем "Полимерная микросфера-биолиганд" медико-биологического применения
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Создание диагностических тест-систем "Полимерная микросфера-биолиганд" медико-биологического применения"

005017446

На правах рукописи

СТАНИШЕВСКИЙ ЯРОСЛАВ МИХАЙЛОВИЧ

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ КОНЪЮГАТОВ «ПОЛИМЕРНАЯ МИКРОСФЕРА-БИОЛИГАНД» МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

1 о [.;;/*; ?г

МОСКВА - 2012

/ ^ 1

005017446

Работа выполнена на кафедре биомедицинских и фармацевтических технологий федерального государственного бюджетного образовательног учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» (МИТХТ им. М.В. Ломоносова)

Научный консультант: доктор технических наук, профессор

Кедик Станислав Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Ямсков Игорь Александрович (Зав. лабораторией физиологически активных биополимеров ИНЭОС РАН)

доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович (профессор кафедры химической технологии пластических масс РХТУ им. Д.И. Менделеева

доктор биологических наук, профессор Красильников Игорь Викторович (Заместитель генерального директора ЗАО «БИОТЕХ-интер»)

Ведущая организация: Первый Московский Государственный Медицинскг Университет имени И.М. Сеченова.

Защита диссертации состоится «28» мая 2012г. в «15» часов i заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при МИТХ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571 Москва, проспект Вернадского, д.8 ауд.М-119. ^

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХ им. М.В. Ломоносова.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ВА1 http://vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан « апреля 2012г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук * л

старший научный сотрудник Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В лабораторной практике для выявления антигенов (антител) широко применяют реакцию латексной агглютинации (РЛА) с использованием диагностических тест-систем, полученных на основе конъюгатов «полимерная микросфера-биолиганд».

Такой способ выявления антигенов (антител) отличается простотой исполнения, не требует специального оборудования и позволяет в течение короткого времени (3-7 мин.) провести визуальный учет результатов.

Преимущества полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов перед частицами биологического происхождения (бактерии, эритроциты и др.) к настоящему времени очевидны. Они состоят в возможности получения полимерных суспензий с определенным диаметром частиц, узким распределением их по размерам, наличием функциональных групп на поверхности полимерных микросфер, способных ковалентно связываться с функциональными группами биолиганда, сохраняющих устойчивость в растворе электролита на всех стадиях получения тест-систем и при хранении.

Практическое применение диагностических тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд» ограничено отсутствием систематических исследований по выявлению факторов, позволяющих обеспечивать оптимальную конформацию биолигандов при их иммобилизации на поверхность полимерных микросфер, и соответственно, высокую чувствительность РЛА.

Все это делает работы в этом направлении важными и актуальными.

Цель работы. Систематическое исследование влияния природы полимерных микросфер различного диаметра и способов иммобилизации специфических биолигандов на их поверхность, на свойства полученных конъюгатов «полимерная микросфера-биолиганд» и чувствительность реакции латексной агглютинации (тест-систем).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Синтезировать полимерные микросферы различного диаметра, оценить их пригодность для использования в качестве носителей биолигандов, и сформулировать требования, предъявляемые к полимерным микросферам, используемым для получения тест-систем.

• Выбрать способ иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер, обеспечивающий высокую активность биолиганда при выявлении антигенов (антитела) в реакции латексной агглютинации.

• Апробировать разработанные тест-системы в лабораторных и клинических условиях при диагностике заболеваний различной этиологии.

Научная новизна.

- различного диаметра, устойчивые в буферных растворах в широком интервале рН, предложены различные подходы к иммобилизации биолигандов (физической адсорбцией и ковалентным связыванием функциональных групп) на поверхность полимерных микросфер, позволяющие обеспечить высокую чувствительность РЛА.

2. Впервые проведен сопоставительный анализ методов получения полимерных суспензий, частицы которых различались составом межфазного слоя (природой полимера, ПАВ, функциональными группами, наличием красителя), и свойств тест-систем, сконструированных на их основе, по устойчивости в буферном растворе и по системе контроля их активности в биологических реакциях. Обоснованы критерии оценки свойств полимерных микросфер: средний диаметр в интервале значений

1-4 мкм, узкое распределение частиц по размерам и их индивидуальность, наличие функциональных групп, отсутствие остаточного мономера.

3. Сконструирована компьютерная модель тиреоглобулинового участка гомологичного ацетилхолинэстеразе, которая наглядно демонстрирует расположение аминогрупп остатков лизина и позволяет высказать предположение об оптимальной топохимии взаимодействия функциональных групп полимера и тиреоглобулина (ТГ), которое не будет экранировать антигенные детерминанты ТГ.

4. Предложен нетрадиционный подход к конструированию диагностической тест-системы для выявления антигенов различной природы, заключающийся в использовании промежуточного биолиганда - протеина А, аффинно взаимодействующего с Рс-фрагментом иммуноглобулина в, таким образом, обеспечивая доступность РаЬ-фрагментов для связывания с антигеном.

5. Разработана новая экспериментальная методика получения диагностических тест-систем для выявления сывороточного фибронектина, позволившая повысить чувствительность РЛА за счет регулирования концентраций тестируемого компонента и специфического биолиганда, иммобилизованного на поверхность полимерных микросфер, и экранирования свободной поверхности полимера от неспецифических белков сыворотки крови.

6. Впервые выявлено влияние природы желатина и ее конформации на диаметр частиц, заряд, устойчивость полимерных микросфер и чувствительность тест-систем. Показано, что предпочтительна иммобилизация желатины в конформации «клубка» на поверхность полимерных микросфер при 60°С. Показано влияние условий (температура, среда) и способа иммобилизации (физическая адсорбция, ковалентное связывание природы функциональных групп) на устойчивость системы и чувствительность реакции латексной агглютинации (РЛА).

Практическая значимость

1. Разработаны технологии получения диагностических тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд», наработаны опытные партии и апробированы при диагностике конкретных заболеваний.

2. Созданные диагностические тест-системы апробированы на панели сывороток с различными патологиями заболевания: иерсиниоза, лептоспироза, сальмонеллеза, инфекционного бронхита, а также заболеваний щитовидной железы (тиреоидита Хасимото, Базедовой болезни и другие), и показана их высокая чувствительность и специфичность.

3. Разработаны опытно-промышленный регламент (ОПР 04868244-05-2009) и технические условия (ТУ 9380-172-04868244-2009) на производство диагностической тест-системы «ПМ-глицин-ТГ» для выявления аутоантител к тиреоглобулину щитовидной железы методом реакции латексной агглютинации (ВНИИ лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР), г.Москва), подготовлено регистрационное досье для регистрации в Минздравсоцразвития России на разработку диагностической тест-системы для выявления аутоантител к тиреоглобулину.

4. Разработан и запатентован способ получения диагностической тест-системы для выявления антител к аденовирусам КРС методом PJIA (патент №2270449 от 20.02.2006г.). Разработан и запатентован способ получения антительной тест-системы для постановки иммуно-диагностической реакции латексной агглютинации (патент №2380708 от 24.02.2010г.). Разработана база данных диагностических тест-систем, используемых в реакции латексной агглютинации (PJ1A), и получено Свидетельство о государственной регистрации базы данных «Data Base - RLA» №2012620271 от 07.03.2012г.

5. Разработанные высокочувствительные и специфичные диагностические тест-системы для выявления аутоантител к тиреоглобулину и вирусу инфекционного бронхита кур штамма Н120, были успешно апробированы в лабораторных и клинических условиях в Медицинском Радиологическом

Научном Центре (ГУ МРНЦ РАМН), г. Обнинск; Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ), г.Москва, 1120 Центральном Военном Клиническом Госпитале (ЦВКГ), Авторской лаборатории, г.Львов.

6. Материалы диссертационной работы вошли в курсы лекций и практических занятий по дисциплинам: «Основы биомедицинских технологий» для студентов 5-го курса, обучающихся по специальности 070100 «Биотехнология», и «Полимеры в медицине и фармацевтике» для студентов 4-го курса, обучающихся по направлению 550880 «Химическая технология и биотехнология» (Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова (МИТХТ, г.Москва)).

Положения, выносимые на защиту:

1. Комплексный методологический и экспериментальный подход к разработке высокочувствительных и специфичных тест-систем, на основе полимерных микросфер и специфических биолигандов, для использования в иммунодиагностической реакции латексной агглютинации (PJIA).

2. Обоснование критериев выбора полимерных микросфер и методов их синтеза для использования в качестве носителей биолигандов при разработке тест-систем, работающих по принципу PJIA.

3. Пути иммобилизации биолигандов белковой природы с различной молекулярной массой: тиреоглобулина, иммуноглобулина G, желатина на поверхность полимерных микросфер, позволяющие обеспечить необходимое взаимодействие биолиганда с детектируемым антигеном (антителом).

фибропектиііа, и аутоантител к тиреоглобулину щитовидной железы, содержащихся в сыворотках крови с различными патологиями заболевания.

5. Опытно-промышленный регламент и технические условия на производство диагностической тест-системы для выявления аутоантител к тиреоглобулину щитовидной железы методом РЛА.

Апробация работы

Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на: Десятой и Одиннадцатой научно-технических конференциях "Молодые ученые и аспиранты МГТУ" (Мурманск - 1999г, 2000г); Международных научно-технических конференциях "Наука и образование" (Мурманск - 2002г, 2003г, 2004г, 2005г, 2006г.); VI-й Международной конференции "Наукоемкие химические технологии" (Москва - 1999г); Международных научно-практических конференциях НПО "Биомедицинские технологии" (Москва - 2000г, 2001г); 1-ой и П-ой Всероссийских научных конференциях «Биомедицинские технологии» (Москва - 2003г, 2004г); Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2001", "Ломоносов-2002" (Москва - 2001г, 2002г); XXXVIII и XXXIX Всероссийских научных конференциях по проблемам математики, информатики, физики, химии и методики преподавания естественнонаучных дисциплин (Москва - 2002г, 2003г); XII international conference surface forces (Звенигород-2002г); Международном симпозиуме «Фотография в XXI веке» (Санкт-Петербург - 2002г); Н-ой Всероссийской конференции "Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах" «ФАГРАН-2004» (Воронеж -2004г); Международной научной конференции "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология" (Минск - 2004г); И-й Международной научно-практической конференции "Науковий потенціал світу" (Днепропетровск - 2005г); Первой научно-техническая конференция молодых ученых «Наукоемкие химические технологии» (Москва -2005г); Международной научной конференции "Молекулярная и прикладная генетика" (Минск — 2005г); IX Украинском биохимическом съезде (Харьков - 2006г.); III Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Биотехнология. Образование. Наука. Практика» (Харьков - 2006г.); Международной конференции по органической химии «Органическая химия от Бутлерова и Бейльштейна до современности» (Санкт-Петербург - 2007г.); IV Всероссийской Каргинской конференции «Наука о полимерах 21-му веку» (Москва - 2007г.); 3rd International Symposium on «Reactive Polymers in Inhomogeneous Systems, in Melts, and at Interfaces» (Dresden, Germany - 2007r.); V Польско-украинская конференция «Polymers of special applications» (Radom, Poland.-2008r.); XII международной научно-технической конференции

«Наукоемкие химические технологии - 2008» (Волгоград - 2008г.); National Scientiflc-Technical Conférence with International Participation "Actual problems of synthesis and création of new biologically active compounds and pharmaceutical préparations" (Lviv - 2008г.); IV международной научно-практической конференции «Биотехнология. Наука. Образование. Практика» (Днепропетровск. - 2008г.); Украинской научно-практической конференции. (Харьков - 2009г.); Участие в Н-ой специализированной выставке нано-технологий и материалов "NTMEX-2005" (Москва - 2005г) и на VII Московском международном салоне инноваций и инвестиций (Москва -2007г) «Золотая медаль»-, Конференция «Нанотехнологии в фармацевтике и медицине (Харьков - 2011г.); Участие в международной специализированной выставке «Мир Биотехнологии» (Москва -2007г); 4,h International Summer School «Supramolecular Systems in Chemistry and Biology» (Refensburg, Germany -2011г.); II научно-практическая конференция с международным участием «Сучасні досягнення фармацевтичної технології» (Харьков - 2011г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 82 печатных работы, из них 23 статьи, 1 учебное пособие, 1 учебно-методический практикум, 2 патента, 1 свидетельство о государственной регистрации и 53 тезисов докладов. Личный вклад автора.

Автору принадлежит решающая роль на всех этапах работы - от выбора направления, постановки конкретных задач, планирования и проведения ключевых исследований до анализа, обобщения и литературного оформления полученных результатов. Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из Введения, Обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и их обсуждение», Заключения, Выводов, Списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены на 266 страницах машинописного текста, включая 60 таблиц и 80 рисунков. Список литературы содержит 300 работ.

Работа выполнена при участии НИИ вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова РАМН (лаборатория иммунологической диагностики эндокринных заболеваний), Российского Университета Дружбы Народов (кафедра микробиологии), МГУ им. М.В. Ломоносова (кафедра коллоидной

химии).

Работа проводилась при поддержке Министерства образования и науки по программе: «Государственная поддержка региональной научно-технической политики высшей школы и развитие ее научного потенциала» по темам: «Полимерные дисперсные системы медико-биологического назначения» (20002002г.); и «Нанотехнология иммобилизации биолигандов на полимерные микросферы для создания высокоспецифичных иммунореагентов» (20032004г.); а также при поддержке Министерства образования и науки РФ по аналитической ведомственной целевой программе «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)» № 2.1.1/12956 по теме: «Научные основы создания высокоспецифичных и высокочувствительных диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов для биомедицинских исследований» (20092011г.).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение. Обоснована актуальность разрабатываемой проблемы, сформулированы цель и задачи исследования, новизна полученных результатов, практическая значимость диссертационной работы, основные положения, вынесенные на защиту.

В главе 1, литературном обзоре, проведен анализ исследований, посвященных синтезу полимерных суспензий, частицы которых используются в качестве носителей биолигандов при разработке диагностических тест-систем, рассмотрены проблемы, возникающие при иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер, решение которых позволило бы создать новые высокоэффективные диагностические тест-системы для реакции латексной агглютинации.

В главе 2, объекты и методы исследования, описаны вещества и материалы, способы их получения (безэмульгаторная, затравочная и дисперсионная полимеризации), способы очистки (микрофильтрация, радиационное облучение), методы исследования полимерных суспензий

(фотон-корреляционная спектроскопия, электронная микроскопия), методы иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер, способы постановки иммунохимических реакций (реакция латексной агглютинации (РЛА), иммуноферментный анализ (ИФА), реакция непрямой гемагглютинации (РИГА) и др.).

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Синтез функциональных полимерных микросфер и изучение их физико-химических свойств

Несмотря на огромное разнообразие известных полимерных суспензий, далеко не каждая из них может быть использована для биологических и иммунохимических исследований, а те из них, которые оказываются пригодными для этой цели, иногда имеют ограниченное применение в силу присущих им свойств. Например, полистирольные микросферы, не содержащие функциональных групп, используют для получения тест-систем, только в том случае, когда биолиганд физически адсорбируют на их поверхность.

Обычно для получения диагностических тест-систем используют полимерные микросферы, содержащие на поверхности функциональные группы различной природы: альдегидные, хлорметильные, эпоксидные, хлорсульфоновые, сульфгидрильные группы, способные непосредственно реагировать с амино-, карбоксильными, сульфгидрильными группами биолигандов, а карбоксильные, гидроксильные, амино-, амидные и гликолевые группы образуют с ними химическую связь только после предварительной их активации.

Выбор метода синтеза полимерных микросфер (эмульсионная, суспензионная, дисперсионная, осадительная или затравочная полимеризации) определяется, в первую очередь, требованиями к диаметру частиц и содержанию в их межфазных адсорбционных слоях функциональных групп определенной природы и концентрации. Так, частицы диаметром до 0,2 мкм

получают эмульсионной полимеризацией мономеров, со средним диаметром до 1 мкм и выше - полимеризацией мономеров в отсутствие эмульгатора, суспензионной, дисперсионной и затравочной полимеризацией.

Жесткость требований, предъявляемых к полимерным микросферам, используемым в качестве носителей биолигандов, является причиной создания в каждом методе синтеза особых условий формирования полимерных микросфер, определяющих их необходимые свойства: узкое распределение частиц по размерам, содержание определенной концентрации функциональных групп на поверхности и их устойчивость в процессе полимеризации и модификации. Именно эти условия формирования полимерных микросфер и отличают «ноу-хау» способов их синтеза, предлагаемых различными авторами.

В данной работе синтез полимерных суспензий проводили дисперсионной, затравочной и безэмульгаторной полимеризацией, что было необходимо для получения полимерных суспензий с заданным диаметром частиц и определенными функциональными группами*.

Проводили затравочную полимеризацию стирола (СТ) и стиролсульфоната <

натрия (ССН) и метакриловой кислоты (МАК) (1), или глицидилметакрилата (ГМА) (2), или акролеина (АК) (3, 5), или в присутствии полидиметилсилоксана (ПДС) (4) на затравочных полимерных частицах, дисперсионную полимеризацию СТ и МАК (6), ГМА и МАК (7), и хлорэтилметакрилата (ХЭМА) и МАК (8) в присутствии поливинилпирролидона (ПВП), и полимеризацию СТ и ССН в отсутствие ПАВ (9).

Сопоставительный анализ свойств полимерных суспензий, полученных различными методами, приведен в табл.1.1 и на рис.1.1-1.9.

Условия проведения затравочной и безэмульгаторной полимеризации (объемные соотношения мономер/водная фаза, объемные соотношения мономеров, концентрации ПАВ и инициатора) были выбраны таким образом, чтобы диаметры частиц имели значения, равные 1-4 мкм, узкое распределение

*-работа выполнена совместно с сотрудниками кафедры ХГВМС им. С.С. Медведева МИТХТ.

по размерам, ^-потенциал, определяющий электростатический фактор устойчивости, -40 -60 мВ.

В случае дисперсионной полимеризации устойчивость частиц определяется структурно-механическим фактором стабилизации, и в качестве стерического стабилизатора использовали поливинилпирролидон (ПВП).

Таблица 1.1

Характеристика частиц полимерных суспензий

Наличие функц. групп на поверхности частиц Средний диаметр частиц, мкм. Коэффициент корреляции, % І-потен -циал, мВ. % агломератов, содержащих не более 3 частиц в расчёте на общее число частиц

№ пар- тин Частицы полпмерных суспензий (сомономер) Фосфат- ІЇО-солевой буфер (рН=7,2) (БС) БС + 0,1 мг/мл альбумин

90-100% 0%

Метод затравочной полимеризации на затравочных полимерных частицах со средним диаметром 1,13мк.и:

1 Стирол (СТ), стиролсульфонат натркя (ССН) и метакриловая кислота (МАК) -СООН 1,54±0,01 0,8 -51,1 - +

2 СТ, ССН и глицедил метакр кл ат (ГМА) -СН-СН2 \/ О 1,61±0,01 0,9 -40,3 - +

3 СТ, ССН и акролеин (АК) -СНО 1,70± 0,01 0,8 -52,4 - +

4 СТ, ССН в присутствии полидим етилс ило ксана (ПДС) -СООН 1,49± 0,01 1 -46,4 - +

5 СТ, ССН и АК на затравочных частицах со средним диаметром 3,8 мкм. -СНО 4,1 ± 0,01 0,9 -41,3 - +

Метод дисперсионной полимеризации

6 СТ и МАК в присутствии полив инил пиррол идона (ПВП) -СООН 2,34± 0,03 0,8 -5,2 + +

7 ГМА и МАК в присутствии ПВП -СООІІ 2,76± 0,03 0,9 -4,3 + +

8 Хлорэтилм етакрилата (ХЭМА) и МАК в присутствии ПВП -СООН 3,40± 0,04 0,8 -4,5 + +

Метод беззмульгаторной сополимеризации

» СТ и ССН - 1,15±0,01 1 -44,4 +

Примечание: «-» - агрегативно неустойчивы, «+» - агрегативно устойчивы.

Данными табл. 1.1 и рис. 1.1-1.9 показано, что синтезированные полимерные суспензии удовлетворяют требованиям, предъявляемым к полимерным микросферам-носителям биолигандов, используемым при разработке тест-систем. Наличие на поверхности частиц функциональных групп различной природы предполагает возможность ковалентного связывания с функциональными группами специфических биолигандов.

К®1'

■

щщ ■

тт щ ^ „ ъ

-„ -г*

Рис. 1.1. Микрофотография полимерных микросфер СТ, ССН; МАК, со средним диаметром - 1,54 мкм, и гистограмма распределения частиц по размерам (затравочная полимеризация).

........¡ИИ 1 1

• ' ■ " 1 Я

■І—щ ¿шш ■ ;___>

шт

Рис. 1.2. Микрофотография полимерных микросфер СТ, ССН, ГМА, со средним диаметром - 1,61 мкм, и гистограмма распределения частиц по размерам (затравочная полимеризация).

Рис.1.3. Микрофотография полимерных микросфер ССН, СТ, АК, со средним диаметром - 1,7 мкм, и гистограмма распределения частиц по размерам (затравочная полимеризация).

(N^N,1100.

Рис. 1.4. Микрофотография полимерных микросфер ССН, СТ, + ПДС, со средним диаметром - 1,49 мкм, и гистограмма распределения частиц по размерам (затравочная полимеризация).

Рис.1.5. Микрофотография полимерных микросфер СТ, ССН, АК, полученных

на затравочных поли(хлорэтилметакрилат-со-стирольных) частицах, и гистограмма распределения частиц по размерам. Средний диаметр - 4,1 мкм (затравочная полимеризация).

Рис. 1.6. Микрофотография полимерных микросфер СТ+МАК и ПВП, со средним диаметром - 2,34 мкм, и гистограмма распределения частиц по размерам (дисперсионная полимеризация).

Рис. 1.8. Микрофотография полимерных микросфер ПХЭМ+МАК и ПВП, со средним диаметром - 3,4 мкм, и гистограмма распределения частиц по размерам (дисперсионная полимеризация).

Рис. 1.7. Микрофотография полимерных микросфер ГМА+МАК и ПВП, со средним диаметром - 2,76 мкм, и гистограмма распределения частиц по размерам (дисперсионная полимеризация).

Рис.1.9. Микрофотография полимерных микросфер СТ и ССН, со средним диаметром -1,15 мкм, и гистограмма распределения частиц по размерам (безэмульгаторная полимеризация).

При замене водной фазы на раствор электролита, в котором проводят РЛА, оказалось, что не все полимерные суспензии ведут себя одинаково. Часть полимерных суспензий в растворе электролита образовывали агрегаты, состоящие из двух, трех... пяти и более частиц, что исключало их использование в иммунодиагностике, поскольку не соблюдается одно из основных требований, предъявляемых к ним, а именно индивидуальность частиц.

Оказалось, что индивидуальность в растворе электролита сохранили только полимерные микросферы, полученные методом дисперсионной полимеризации, стабилизированные ПВП.

Для дальнейшего использования полимерных суспензий, полученных другими методами, необходимо было повысить их устойчивость. Это оказалось возможным после адсорбции на поверхности полимерных микросфер альбумина, взятого в концентрации ~0,1мг/мл (в расчете на раствор 0,1% полимерной суспензии), который формировал в межфазном слое частиц дополнительный структурно-механический фактор устойчивости.

Одной из важнейших проблем в процессе получения полимерных суспензий является присутствие в их объеме остаточного мономера, которое негативно отражается на устойчивости полимерных суспензий, при иммобилизации биолигандов на поверхность частиц и при их хранении.

Для определения остаточного мономера в объеме частиц полимерной суспензии использовали спектрофотометрический и хроматографические методы анализа.

Для удаления остаточного мономера из синтезированных полимерных суспензий применяли химические методы (добавление реакционноспособных мономеров, и инициаторов, и радиационная дополимеризация мономера) и физические методы (дегазация и микрофильтрация).

На примере синтезированных полистиролсульфонатакролеиновой (№3) и полистиролстиролсульфонатметакриловой (№1) суспензий (табл. 1.1), показано, что в процессе очистки полимерных суспензий изменяются их коллоидно-химические свойства (табл. 1.2).

Таблица 1.2

Изменение коллоидно-химических свойств полимерных суспензий в зависимости от способов их очистки

Метод очистки мономера Массовая доля мономера, % на единицу массы полимера Устойчивость полимерной суспензии к действию №С1, моль/л

Исходные №3-№1 суспензии 0,4-0,37 0,15-0,2

Микрофильтрация полимерных суспензий: этиловым спиртом 0,1-0,09 0,1-0,15

дистиллированной водой 0,14-0,12 0,15-0,2

Радиационное облучение 0,05-0,04 0,15-0,2

При удалении остаточного мономера из объема частиц полимерных суспензий (полистиролакролеиновая/полистирол метакриловая суспензии) такими растворителями как этиловый спирт наблюдается снижение массовой доли мономера, однако, при этом снижается и устойчивость полимерных суспензий (табл.1.2).

Удалить мономер отгонкой его под вакуумом, и при этом сохранить устойчивость суспензии не удалось. Остаточный мономер удалить из объема

частиц удалось только его радиационной дополимеризацией при облучении суспензии у-лучами (в течение 6 часов, мощность дозы составляла 100 рад/с).

Полимерные суспензии сохраняли срок годности в течение 6 месяцев.

Приведенные исследования позволили разработать рецептуры синтеза частиц полимерных суспензий с различными функциональными группами на поверхности, и выбрать метод их очистки, а также сформулировать основные требования к ним, позволяющие на их основе получать тест-системы, работающие по принципу реакции латексной агглютинации.

3.2. Создание диагностических тест-систем на основе конъюгатов «полимерная микросфера-биолиганд» различного целевого назначения

Тест-системы для реакции латексной агглютинации (РЛА) представляют собой полимерную суспензию, индивидуальные частицы которой содержат на своей поверхности специфические биолиганды, способные аффинно связываться с детектируемым компонентом, образовывая при этом пространственные сетки-агломераты, которые легко визуализируются.

Наиболее ответственным этапом в создании тест-систем на основе конъюгатов «полимерная микросфера-биолиганд» является иммобилизация специфических биолигандов на поверхность полимерных микросфер и сохранение их нативной конформации, от которой зависит их иммунная активность, а следовательно, чувствительность РЛА.

Сложность сохранение нативной конформации специфического биолиганда состоит в том, что в каждом конкретном случае необходимо иммобилизовать на поверхность полимерных микросфер биолиганды различной белковой природы, размера, молекулярной массы и др.

В работе были изучены особенности иммобилизации на поверхность полимерных микросфер специфических биолигандов различной природы и молекулярной массы: тиреоглобулина (667кДа), специфического иммуноглобулина в (150кДа), и желатины (бОкДа).

Основной проблемой в этой части исследований было создание методологии и способа иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер.

3.2.1. Получение тест-системы «полимерная микросфера-тиреоглобулии» для выявления аутоантител к тиреоглобулину

Выявление аутоантител к тиреоглобулину обычно проводят как при выявлении лиц с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы, так и при мониторинге за состоянием здоровья лиц, проживающих в экологически неблагоприятных районах.

Исследования были начаты с создания тест-системы для выявления аутоантител к тиреоглобулину с использованием полимерных микросфер, содержащих на поверхности альдегидные группы, легко взаимодействующие с аминогруппами тиреоглобулина.

Тиреоглобулин выделяли из супернатанта, полученного в результате ультрацентрифугирования гомогената ткани щитовидной железы. Чистый тиреоглобулин выделяли методом гель-фильтрации на колонке с сефарозой 6В. Степень очистки тиреоглобулина перед его использованием контролировали методом электрофореза в 5%-ом полиакриламидном геле. Тиреоглобулин определялся с молекулярной массой бООкДа. Степень очистки тиреоглобулина составляла 98%.

Поскольку трехмерная структура тиреоглобулина на данный момент неизвестна, была сконструирована компьютерная модель его участка, гомологичного ацетилхолинэстеразе, на котором наглядно показано расположение аминогрупп остатков лизина (Lys), и половина известных детерминант тиреоглобулина, распознаваемых аутоантителами [Пиневич A.A., 2007, Fabrizio et al., 2004, Takagietal., 1991\ (рис.2.1, табл.2.1)**.

**-работа выполнена совместно с сотрудниками лаборатории молекулярно-графического конструирования лекарств ГУ НИИ БМХРАМН.

М4-814

/ 2376-2464

1уг2ЯЗ .Ж"

; -V

ТдР41 ^Т*

¡У--. ТкР2б » / " —

Ъуа 2447, Ьуя 2536,1у* 2602 / ---;-'

1у« 2764, Ьуя 2768

Рис.2.1. Компьютерная модель тиреоглобулинового участка гомологичного ацетилхолинэстеразе.

Таблица 2.1

Название детерминант и их аминокислотная протяженность, которые располагаются на тиреоглобулиновом участке, гомологичном ацетилхолинэстеразе

№ п/п Название детерминанты ТГ Протяженность аминокислотных остатков

1 М4-814 2188-2242

2 ТЙР15 2339-2358

3 2376-2464 2376-2464

4 Т£Р26 2471-2490

5 Т§Р41 2651-2670

Как видно из созданной модели, аминогруппы остатков лизина, концентрируются в трех местах биомолекулы, каждая из которых может прореагировать с альдегидными группами полимерных микросфер, включая и те группы, которые находятся рядом с детерминантными участками, отвечающими за связывания с активными центрами аутоантител.

Компьютерная модель позволила предположить, что взаимодействие аминогрупп, содержащихся в остатках Ьув2764 и Ьуз2768 с альдегидными группами полимерных микросфер, не будет экранировать антигенные детерминанты тиреоглобулина.

В качестве носителей тиреоглобулина изначально было предложено использовать полимерные микросферы с наибольшим диаметром 4,1 мкм, содержащие на поверхности альдегидные группы (табл.1), легко взаимодействующие с аминогруппами тиреоглобулина. Выбор полимерных микросфер обуславливался максимальной скоростью их седиментации в лунках иммунопланшеты (50-60 мин.), что позволяет обеспечить экспресность тестирования в РЛА.

Образующееся в результате взаимодействия амино и альдегидной групп основание Шиффа. является нестабильным при низких значениях рН, поэтому его восстанавливали боргидридом натрия (температура - 25°С, 30 мин.).

Количество связанного тиреоглобулина с поверхностью полимерных микросфер рассчитывали на основании данных определения содержания тиреоглобулина в растворе (метод Лоури) до процесса иммобилизации тиреоглобулина на поверхность полимера, и после процесса отмывки частиц полимерной суспензии.

Было установлено, что в течение 3 часов при температуре 37°С с поверхностью полимера связывается 80% тиреоглобулина от исходного его количества (500 мкг/мл), а при 4°С - через 12 - 14 часов (рис.2.2).

а н

—

с з К

8 =г

1 *

X о

<- з

2 и

Ё" I

и ^

а о

а с

о «

500 400 300 200 100 0

——к" /

// 4 / г; -

и/

! ГУ * / У ж

Время иммобилизации ТГ на поверхность полимерных частиц, час.

Рис.2.2. Иммобилизация тиреоглобулина (ТГ) на поверхность полимерных микросфер при разной температуре. 1 — при 4°С; 2 - при 20°С; 3 - при - 37°С.

Дальнейшая экспозиция не приводила к увеличению количества связанного тиреоглобулина, что обусловлено, по-видимому, насыщенностью молекулами белка адсорбционного слоя полимерных микросфер.

Однако протекание реакции латексной агглютинации (РЛА) разработанной тест-системой «полимерная микросфера-тиреоглобулин» не наблюдалось. Уменьшение количества молекул тиреоглобулина в межфазном слое полимерных микросфер с 80% до 4% также не привело к ожидаемому результату.

Было высказано предположение о том, что после восстановления основания Шиффа боргидридом натрия, возможно, происходит дезактивация детерминантных участков тиреоглобулина, отвечающих за связывание с активными центрами аутоантител. Нарушение нативной конформации биолигандов может происходить и в результате прочной многоточечной адсорбции тиреоглобулина на поверхность полимерных микросфер.

Было предложено вначале заблокировать альдегидные группы полимерных микросфер аминогруппами глицина, который использовался в качестве спейсера, затем ковалентно связать карбоксильные группы глицина с аминогруппами тиреоглобулина.

Иммобилизацию глицина на поверхность полимерных микросфер проводили из солянокислого раствора глицина, взятого в диапазоне концентраций 0,1-1,0 М при разных значениях рН от 3,0 до 5,0. На рис.2.3 приведены зависимости изменения концентрации альдегидных групп на поверхности полимерных микросфер от времени выдерживания полимерных микросфер в растворе глицина.

Из данных, представленных на рис.2.3 видно, что при экспозиции суспензии в течение 1 часа при температуре 37°С концентрация альдегидных групп уменьшается в 2 раза, а при выдерживании полимерных микросфер в растворе глицина в течение 2 часов наблюдается полное блокирование их глицином.

Карбоксильные группы глицина, расположенные на поверхности

полимерных микросфер, активировали карбодиимидом (Ы-этил-М'-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид) и присоединяли к ним аминогруппы тиреоглобулина, с образованием пептидной связи.

♦рН=3 арН=5

1,6

х 2

л 5 § 2

•а э к н Я и" га о о

X о.

1,2 * 0,8 0,4 0

к'

.... . 1 к

0,5

1,5

2,5

Время выдерживания полимерных частиц в 1М растворе глицина, час.

Рис.2.3. Изменение содержания альдегидных групп на поверхности полимерных микросфер от времени их выдерживания в 1М растворе глицина.

Количество тиреоглобулина, израсходованного для иммобилизации на поверхность полимерных микросфер, составило 8% от исходного его количества (500мкг/мл).

Реакция латексной агглютинации разработанной тест-системой «полимерная микросфера-глицин-тиреоглобулин» характеризовалась высокой чувствительностью и позволила выявлять аутоантитела к тиреоглобулину в образцах сывороток крови в широком диапазоне значений 20-1700 МЕ/мл.

Для оценки уровня чувствительности полученных тест-систем был проведен сравнительный анализ результатов выявления аутоантител к тиреоглобулину методом РЛА и традиционными методами тестирования -иммуноферментным анализом (ИФА); реакцией непрямой гемагглютинации (с использованием эритроцитов) (РНГА), на панели сывороток здоровых и больных аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы (АИЗЩЖ)

(табл.2.2).

Таблица 2.2

Результаты выявления аутоантител к тиреоглобулину методами РЛА, ИФА и РНГА

Группы обсле- Количество исследованных сывороток Титр РЛА Диапазон выявления аутоантител к тиреоглобулину методом РЛА, МЕ/мл Количество сывороток совпавших с данными РЛА

дованных по данным ИФА по данным РНГА

Доноры 30 1:10-1:40 10-30 28 29

10 1:40-1:120 20-100 9 10

Больные АИЗЩЖ 30 1:120-1:540 200-400 27 28

20 1:540-1:1620 600-1000 19 19

10 1:1620-1:3240 1100-1700 9 10

%-совпадений 92% 96%

Примечание: за отрицательный результат в РЛА принят титр аутоантител к тиреоглобулину равный 1:10

Совпадение результатов выявления аутоантител к тиреоглобулину методом РЛА и методами ИФА или РНГА отмечено в 92 % и 96 % случаев соответственно.

Разработанная тест-система для выявления аутоантител к тиреоглобулину была апробирована на панели человеческих сывороток здоровых (п=30) и больных аутоиммунных заболеваний щитовидной железы (тиреоидит Хасимото, Базедова) (п=70) в Медицинском Радиологическом Научном Центре (ГУ МРНЦ РАМН) (г. Обнинск) и на базе Авторской лаборатории (г. Львов, Украина).

К преимуществам разработанной диагностической тест-системы для РЛА, кроме стабильности, срока хранения, технологии получения, можно отнести и тот факт, что диапазон титра анализируемой сыворотки (обнаружения аутоантител) на порядок ниже в РЛА (1:40-1:640) в сравнении с РНГА (1:1601:10240). Это преимущество дает возможность уменьшить время постановки анализа в 2-3 раза.

Эта методология была использована при создании тест-систем, в которых биолиганды представляют собой специфические иммуноглобулины с молекулярной массой свыше 100 кДа.

3.2.2. Получение тест-системы «полимерная микросфера-снецифнческий

иммуноглобулин G» для выявления антигенов различной природы

Специфические иммуноглобулины (антитела) продуцируются р-лимфоцитами как иммунный ответа организма на присутствие в нем антигенов (патогенных микроорганизмов) и являются важным иммунологическим критерием диагностики вирусных и инфекционных заболеваний.

В качестве биолиганда при разработке тест-систем для выявления антигенов различной природы в РЛА в наших экспериментах использовали специфический иммуноглобулин G, который представляет собой гликопротеид с молекулярной массой 150кДа, состоящий из двух антигенсвязывающих Fab-фрагментов, которые являются активными центрами, и одного константного Fc-фрагмента.

Как известно из литературных данных [Кузник Б.И., 1998, Jeremy М. Berg 2003] структура иммуноглобулина G имеет нативную конформацию в виде «У»-образной формы, поэтому при его иммобилизации на поверхность полимерных микросфер сложно получить необходимую ориентацию Fab-фрагментов в водную среду.

В качестве промежуточного биолиганда по литературным данным [S«/i Я, 2006; Schramm W., 1987] был выбран протеин А (Staphylococcus aureus), который способен аффинно связываться с Fc-фрагментом молекулы иммуноглобулина G, при этом не экранируя его Fab-фрагменты. Компьютерная модель приведена на рис.2.4.

К альдегидным группам, находящимся на поверхности полимерных микросфер (0,4%-ная полимерная суспензия), присоединяли аминогруппы протеина А при температуре 37°С и определяли минимальное разведение

иммунных сывороток, при котором не происходила спонтанная агрегация конъюгатов «полимерная микросфера (ПМ) - протеин А».

Рис.2.4. Компьютерная модель иммуноглобулина О, присоединённого

к протеину А.

Использовали следующие иммунные сыворотки: иммунная кишечно-иерсиниозная сыворотка кролика; иммунная сальмонеллезная сыворотка кролика; иммунная лептоспирозная сыворотка кролика; положительная сыворотка к вирусу инфекционного бронхита кур (ИБК) штамма Н120.

В результате исследований были определены минимальные разведения сывороток (для каждой сыворотки свое разведение, при которых не происходит спонтанная агрегация частиц коньюгатов «ПМ-протеинА» в буферном растворе (табл.2.3).

Таким образом, был получен конъюгат «ПМ-протеинА», который может быть использован в качестве универсального иммуносорбента, пригодного для аффинного присоединения специфических иммуноглобулинов С (без предварительной очистки иммуноглобулинов О из иммунных сывороток крови) при конструировании тест-систем для РЛА.

К преимуществам такого способа получения диагностических тест-систем

РаЬ-фрагмент

Протеин А

относится то, что при их создании не требуется предварительного выделения и очистки специфических иммуноглобулинов в, содержащихся в у-глобулиновой фракции иммунной сыворотки.

Таблица 2.3

Минимальное разведение иммунных сывороток, при которых не происходит спонтанной агрегации частиц коньюгатов «ПМ-протеинА»

№ п/п Сыворотка крови Минимальное разведение

1 Иерсиниозная сыворотка кролика 1:800

2 Сальмонеллезная сыворотка кролика 1:400

3 Лептоспирозная сыворотка кролика 1:640

4 Положительная сыворотка к вирусу ИБК 1:640

штамма Н120

Используя иммунные сыворотки и конъюгат «ПМ-протеинА», были созданы тест-систем на иерсиниоз к Y. eníerocoliñca серотипа 03; сальмонеллез к S. Pullorum; лептоспироз к L. Conicula; инфекционный бронхит кур к вирусу штамма Н120.

Диагностическая значимость разработанных тест-систем была апробирована на панели сывороток кролика с заболеваниями: иерсиниозом (п=20), лептоспирозом (п=23), сальмонеллезом (п=21), и экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ) куриных эмбрионов, содержащей вирус инфекционного бронхита кур (п=34).

В табл.2.4 приведен сравнительный анализ по выявлению в PJIA минимальных концентраций антигенов и живых микроорганизмов тест-системами, полученными прямой иммобилизацией специфических иммуноглобулинов G на поверхность полученных микросфер «ПМ-IgG» и через спейсер-протеин А «ПМ-протеинА-IgG».

Как видно из данных табл.6, диагностические тест-системы «ПМ-протеинА-IgG» оказались на порядок выше по чувствительности в РЛА в сравнении с тест-системами «ПМ-IgG».

Таблица 2.4

Минимальные концентрации выявления антигенов и живых микроорганизмов разработанными тест-системами

Антиген Выявляемая минимальная концентрация антигена тест-системами в РЛА

«ПМ-протеин A-IgG» «ПМ-IgG»

Yersinia enterocolitica серотип ОЗ 0,061 мкг/мл 0,7 мкг/мл

Salmonella pulorum различной молекулярной массы 1,09 мкг/мл (ЗООкД*) 10 мкг/мл (ЗООкД*)

1,95 мкг/мл (100-300кД*) 20 мкг/мл (ЮО-ЗООкД*)

0,02 мкг/мл (30-100кД*) 3 мкг/мл (30-100кД*)

Leptospira canicola 4296 кл/мл ~ 100 000 кл/мл

Вирус инфекционного бронхита кур штамм HI20 Ю5 ЭИД/мл** 10' ЭИД/мл**

Примечание: »-фракция О-антигена; ** - ЭИД'мл - Эмбриональная инфекционная доза.

Разработанная диагностическая тест-система «ПМ-протеинА-IgG» для выявления вируса инфекционного бронхита кур штамм Н120 в РЛА с положительным заключением была апробирована во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) {г.Москва).

3.2.3. Получение тест-системы «полимерная микросфера-желатипа» для выявления сывороточного фибронектина

Желатина была выбрана в качестве биолиганда, способного аффинно взаимодействовать с сывороточным фибронектином, содержание которого необходимо контролировать при шоке, сепсисе, травматических, ожоговых повреждениях, острой хирургической патологии, хронических диффузных заболеваниях печени и ряде других заболеваний внутренних органов [Matsui S, Takahashi Т., 1999; Левитан Б.Н., Астахин A.B., 1993; Качалов С.Н., 1990].

В широком диапазоне pH желатина представляет собой полиамфолит со множеством гидрофобных и полярных остатков. Главным компонентом

желатины являются а-, |3- и у- полипептидные цепи и их фрагменты. Известно, что полипептидные цепи претерпевают конформационные переходы типа спираль<->клубок. Эти цепи характеризуются разным расположением функциональных групп по ходу спирали, что связано с особенностями их пространственного строения. В а-цепях функциональные группы более доступны реагентам, а в |3- и у- цепях значительное число функциональных групп оказывается внутри пространственных образований. Это и определяет различные гидрофильно-гидрофобные свойства полипептидных цепей и реакционную способность функциональных групп по отношению к реагентам различной природы.

При температурах выше 35°С макромолекула желатины в водном растворе находится в состоянии беспорядочного клубка. При понижении температуры полипептидные цепи способны частично восстанавливать коллагеноподобную спиралевидную структуру. Конформационные изменения макромолекул желатины являются следствием изменения в балансе электростатических и гидрофобных взаимодействий.

Далее, известно, что для межфазного адсорбционного слоя желатины на поверхности частиц константа Гамакера составляет величину порядка 10"21Дж и близка к соответствующей константе для воды. Это означает, что межфазный слой действует как барьер, препятствующий контакту диспергированных частиц, и они удерживаются на таком расстоянии друг от друга, при котором ван-дер-ваальсовые силы становятся незначительными, т.е. частицы индивидуальны.

Эти знания были положены в основу выбора условий иммобилизации желатины на поверхность полимерных микросфер.

Концентрация фибронектина в сыворотке крови невысока (150-800 мкг/мл) и для обеспечения аффинного связывания его с желатиной с высокой чувствительностью РЛА, концентрация желатины на поверхности микросфер должна соответствовать концентрации фибронектина. Отсюда следует, что часть желатины в межфазном адсорбционном слое микросфер необходимо

заменить другим белком, индифферентным по отношению к фибронектииу, например, альбумином, который обеспечит и устойчивость системы за счет структурно-механического барьера.

Концентрацию желатины изменяли в широком интервале значений 0,0042,5 мг/мл. В качестве носителя желатины использовали полистирольные микросферы, полученные в отсутствие ПАВ, на поверхность которых желатину физически адсорбировали (табл.2.5).

Таблица 2.5

Характеристика тест-систем полученных при различной температуре иммобилизации желатины на поверхность полимерных микросфер

Концентрация желатины при иммобилизации на поверхность полимерных микросфер мг/мл Средний диаметр полимерных микросфер, мкм 4-потен- циал полимерных микросфер, мВ Агрегативная устойчивость полимерных микросфер Тигр РЛА

в фосфатно-буферном растворе (БС), рН=7,2 концентрация добавленного альбумина в БС, мг/мл

при 50-60°С 0,004 0,035 0,15 0,62 2,5 1,18± 0,01 1,27± 0,01 -37,5 -22,4 + + + 0,025 0,012 + + + 1:8 1:256* 1:256 1:64 1:32

при 5-10 °С 0,004 0,035 0,15 0,6 2,5. 1,22± 0,01 1,38± 0,01 -20,3 -15,2 + + 0,05 0,025 0,39* 10"3 + + 1:4 1:64 1:32 отр. отр.

Полимерные микросферы без желатины 1,15± 0,01 -44,4 - 0,1 отр.

Примечание: «-» - агрегативно неустойчивы, «+» - агрегативно устойчивы. * Титры РЛА - 1:256, 1:128 и 1:64 отвечают концентрации выявляемого тест-системами фибронетина - 200, 400 и 800 мкг/мл соответственно.

Как видно из данных табл.2.5, при одинаковых концентрациях желатины ^-потенциал полимерных микросфер после иммобилизации желатины и в конформации «клубка» и спирали на их поверхность уменьшился с -44,4 мВ до -15,2 мВ (5-10°С) и -22,4 мВ (50-60°С), что говорит о частичной экранизации

молекулами желатины ионогенных групп макромолекул полимера.

При иммобилизации желатины в конформации полимерного «клубка» чувствительность тест-системы в PJTA оказалась выше (1:256), чем при иммобилизации желатины в конформации коллагеноподобной спирали (1:64).

При иммобилизации желатины в интервале концентраций 0,62-2,5 мг/мл, на поверхность полимерных микросфер, не наблюдается практически ее взаимодействия с детектируемой молекулой фибронектина, и титр PJIA составляет 1:32-1:64. Уменьшение концентрации желатины на поверхности полистирольных микросфер приводит к повышению титра PJ1A до 1:256, однако при этом снижается устойчивость тест-системы в растворе электролита. В связи с этим, дополнительно добавляли в систему альбумин в концентрации свыше 0,012 мг/мл (табл.2.5).

Более низкие и высокие концентрации желатины не использовали, поскольку при этом наблюдалось существенное снижение титров чувствительности РЛА.

Таким образом, устойчивые в буферном растворе тест-системы с высокой чувствительностью РЛА (1:256) были получены при последовательной физической адсорбции желатины в конформации полимерного «клубка» (60°С) в концентрации 0,035 мг/мл, и альбумина в концентрации - 0,012 мг/мл на поверхность полистирольных частиц.

В качестве частиц - носителей биолигандов (желатины и альбумина) были использованы полимерные микросферы, содержащие на своей поверхности функциональные группы различной природы (карбоксильные, эпоксидные, альдегидные) и не содержащие функциональные группы, полученные различными методами полимеризации, с диаметром частиц в интервале 1,5-4 мкм.

Иммобилизацию желатины на поверхность полимерных частиц проводили ковалентным связыванием функциональных групп полимера и биолиганда, и путем их физической адсорбции.

Диагностические тест-системы, полученные при ковалентном связывании функциональных групп желатины и полимерных микросфер, независимо от природы функциональных групп полимера, оказались высоко чувствительными. Титр РЛА при выявлении сывороточного фибронектина составил в диапазоне разведений 1:128-1:512 (рис.2.5).

иСТ ССН, ГМА - сополигиерные микросферы стирола {СТ), стиролсульфоната натрия (ССН) и глицидилметакрклата (ГМА).

□ СТ, ССН. АК - сополимеркые микросферы СТ; ССН и Акролеина.

□ СТ, ССН, МАК - сололимерные микросферы СТ. ССН и метакриловсй кислоты (МАК).

ОСТ, ССН, НДС - сололимериые микросферы СТ. ССН, полученные в присутствии

полидиметилсилоксана (НДС).

Примечание: титры РЛА 1:512; 1:256, 1:128 и 1:64 отвечают концентрации выявляемого фибронектина - 100, 200, 400 и 800 мкг/мл соответственно.

Рис.2.5. Чувствительность РЛА (титр) при выявлении фибронектина тест-системами, полученными способом ковалентного связывания функциональных групп желатины и функциональных групп полимерных микросфер

Наличие ковалентной связи функциональных групп желатины и полимерных микросфер контролировали путем добавления в систему ПАВ -твина 80. Титр РЛА после введения в систему твина 80 не изменялся, это свидетельствует о взаимодействии фибронектина только с ковалентно связанными молекулами желатины на поверхности полимерных микросфер.

Тест-системы, в которых желатину иммобилизовали на поверхность полимерных микросфер путем физической адсорбции, имели значительно меньшую чувствительность РЛА - 1:4-1:256 (рис.2.6).

Концентрация желатины, мг/мл

ОСТ+МАК(ПеП); ГМА+МАК (ЛВП); и ХЭМА+МАК(ПВП) -полистаролметакрклатные (СТ+МАК).

полиглицидилметакрилатныв (ГМА+МАК), и

полихлорэтилметакрилатные (ХЭМА+МАК) микросферы Полученные В ПрИС/ТСТЕИг!

полквинилпиррслидона (ПВП).

ВСТ, СОН. ПДС - сополимерные микросферы СТ, ССН полученные в присутствии, полидиметилсилоксана (ГЩС).

Рис.2.6. Чувствительность РЛА (титр) при выявлении фибронектина тест-системами, полученными способом физической адсорбции желатины на поверхность полимерных микросфер

Для всех исследованных полимерных суспензий были определены минимальные концентрации альбумина и желатины, которые необходимо ввести в систему для сохранения ее устойчивости в растворе электролита (рис.2.7-2.8).

| 0.12 I 0.1

>. 0.08 -

3 0.06 -

I 0.04

5 0,02 -| 0 -

Концентрация желатины, иг мл

Рис.2.7. Минимальные концентрации альбумина и желатины, которые необходимо ввести в систему для сохранения ее устойчивости в буферном растворе (Фосфатно-солевой буфер рН=7,2)

0,004 0.017 0.07 0,31 1.25 5

Концентрация желанны, мв'кя

Рис.2.8. Минимальные концентрации альбумина и желатины, которые необходимо ввести в систему для сохранения ее устойчивости в буферном растворе (Фосфатно-солевой буфер рН=7,2)

Было установлено, что природа поверхности частиц существенно влияет на устойчивость тест-систем, полученных на их основе. Так, полистирольные суспензии, частицы которых были стабилизированы полидиметилсилоксаном (ПДС) и поливинилпирролидоном (ПВП), либо полученные со-полимеризацией стирола (СТ) и стиролсульфоната натрия (ССН) оказались значительно более стабильными (рис.2.8), чем синтезированные сополимеризацией СТ, ССН и акролеина (АК), или метакриловой кислоты (МАК), или глицидилметакрилата (ГМА) (рис.2.7).

Как видно из данных, представленных на рис.2.7-2.8, чем выше концентрация желатины, тем меньше концентрация альбумина, которую необходимо ввести в систему для обеспечения ее устойчивости.

3.3. Разработка технологии создания диагностических тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд», работающих по принципу реакции латексной агглютинации (РЛА)

Выше приведенные результаты легли в основу создания малоотходной

технологии получения тест-систем с использованием полимерных микросфер и биолигандов, отвечающих требованиям их использования в современных клинико-диагностических лабораториях при выявлении веществ-индикаторов потенциального заболевания.

Разработана технология создания диагностических тест-систем, работающих по принципу РЛА, которая включает в себя следующие стадии:

1. Синтез полимерных суспензий;

2. Очистка полимерных суспензий от остаточных компонентов полимеризации;

3. Выделение и очистка специфических биолигандов;

4. Иммобилизация специфических биолигандов на поверхность полимерных микросфер и очистка полимерной суспензии от неприсоединившихся биолигандов.

Технологическая и принципиальная схемы создания диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер и биолигандов представлена на рис.3.1 и 3.2.

Рис.3.1. Технологическая схема создания диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер и специфических биолигандов

На основе проведенных экспериментальных исследований определены параметры нормирования качества диагностических тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд» (чувствительность, специфичность, агрегативная устойчивость) и методы их контроля (реакция латексной агглютинации,

реакция торможения латексной агглютинации, седиментация частиц в растворе электролита), и разработана технология их получения, которые вошли в нормативно-техническую документацию на их производство.

Вала Мокоиер

1 - Реактор для проведения синтеза полимерных суспензий; 2,4 - Фильтровальные ячейки с мембраной;

3 - Емкость для иммобилизации биолиганда на поверхность частиц полимерной суспензии.

Рис.3.2. Принципиальная схема создания диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер и специфических биолигандов

Лвагкосткческая тест-система

На рис.3.3 представлена схема реакции латексной агглютинации (РЛА) с использованием тест-систем.

В табл.3.1 представлены характеристики разработанных диагностических тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд», которые могут быть использованы в клинической практике при диагностике специфических антигенов (антител) в реакции латексной агглютинации.

КГГГТ*'

Буферный раствор

иг

Буферный раствор

Рис.3.3. Схема РЛА с использованием диагностических тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд»

Таблица 3.1

Характеристика диагностических тест-систем «полимерная микросфера-

биолиганд»

Диагностическая тест-система с использованием в качестве биолиганда: Молекуляр пая масса биолиганда, кДа Минимальная концентрация антигена (антитела) определяемая в РЛА Антиген (антитело) Заболевание

Тиреоглобулин 667 20-30 МЕ*/мл Аутоантитела к тиреоглобули-ну щитовидной железы Аутоиммунные заболевания щитовидной железы (тиреоидит Хасимото, Базедова болезнь и др.)

Иммуноглобулин G к Yersinia enterocolitica серотип ОЗ 150 0,061 мкг/мл Yersinia enterocolilica серотип ОЗ Иерсиниоз

Иммуноглобулин G к Salmonella pulomm 150 0,02-1,95 мкг/мл Salmonella pulorum Сальмонеллез

Иммуноглобулин G к Leptospira canicola 150 4296 кл./мл Leptospira canicola Лелтоспироз

Иммуноглобулин G к вирус инфекционного бронхита кур штамм Н120 150 105ЭИД**/мл Вирус инфекционного бронхита кур штамм Н120 Бронхит

Желатина 60 100 мкг/мл Сывороточный фибронектин Изменение уровня при шоке, сепсисе, травматических, ожогозых, хронических заболеваниях печени и др.

Примечание: *-МЕ-международная единица, "ЭИД-Эмбриональная инфекционная доза.

Диагностические тест-системы «полимерная микросфера-биолиганд» сохраняли срок годности в течение 3 месяцев при температуре 4°С.

Разработанные тест-системы «полимерная микросфера-биолиганд» могут быть масштабированы при создании тест-систем на различные виды заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. Синтезированы полимерные суспензии с диаметрами частиц в интервале 1-4 мкм и узким распределением по размерам, изучены их коллоидно-химические свойства, и на их основе созданы диагностические тест-системы для выявления конкретных заболеваний. Разработаны ОПР и ТУ на их производство, наработаны опытные партии, которые апробированы с положительным результатом.

2. Для создания диагностических тест-систем различного целевого назначения использованы полимерные суспензии двух типов: функциональные полимерные суспензии и полимерные суспензии, частицы которых содержали на поверхности вещества, аффинно связывающиеся с биолигандами. Все полимерные суспензии не содержали ассоциатов и сохраняли устойчивость в буферных растворах при хранении в течение 6 месяцев.

3. Предложена новая экспериментальная методика получения диагностической тест-системы на тиреоглобулин, которая состоит из предварительного блокирования альдегидных групп полимерных микросфер аминогруппами глицина, а затем ковалентном взаимодействии между карбоксильными группами глицина и аминогруппами тиреоглобулина. Такой способ создания тест-систем позволил повысить чувствительность реакции РЛА с расширением границ титров.

4. Предложен нетрадиционный подход к конструированию диагностических тест-систем для выявления антигенов различной природы, заключающийся в том, что молекулу иммуноглобулина в фиксируют на поверхности полимерных микросфер Рс-фрагментом; в этом случае РаЬ-

фрагменты, несущие активные центры оказываются доступными для взаимодействия с антигенами.

5. Впервые в качестве промежуточного биолиганда при создании тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд» на различные антигены, использован протеин А, который специфически взаимодействует с Fc-фрагментом иммуноглобулина G. Показано, что такой способ получения тест-систем обеспечил им высокую чувствительность в реакции латексной агглютинации и устойчивость в буферных растворах и при хранении.

6. При разработке тест-системы на сывороточный фибронектин выявлено влияние конформации желатины и способа ее иммобилизации на поверхность полимерных микросфер. Установлено, что для обеспечения устойчивости тест-системы в растворах электролитов и при хранении, необходимо использовать физически адсорбированный альбумин и ковалентно иммобилизованную желатину в конформации полимерного «клубка» в определенных массовых соотношениях.

7. Разработана технология получения диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер и специфических биолигандов для реакции латексной агглютинации и показана их пригодность на примере выявления Yersinia enterocolitica серотип ОЗ, Leptospira canicola, Salmonella pulorum, вируса инфекционного бронхита кур штамм Н120, сывороточного фибронектина, аутоантител к тиреоглобулину щитовидной железы.

8. Проведенные исследования позволяют рекомендовать разработанные тест-системы «полимерная микросфера-биолиганд» для диагностики заболеваний различной этиологии, а также использовать разработанные в работе методологические подходы для создания и масштабирования новых диагностических тест-систем для медико-биологического применения.

Основные положения диссертации опубликованы в следующих работах:

Статьи

1. Станишевский, Я.М. Полимерные суспензии для диагностической тест-системы на фибронектин / Я.М. Станишевский, И.А.Грицкова, В.Н. Измайлова,

B.А.Быков, Е.Г. Кравцов, Н.И. Прокопов, А.Е.Харлов, А.Н. Лобанов // Биотехнология теоретический и научно-практический журнал.-Москва-2001,-Вып.З.-С.71-84.

2. Грицкова, И.А. Синтез полимерных суспензий для иммунохимических исследований / И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, Я.М. Станишевский. А.Н. Лобанов, А. Ожеховски // Высокомолекулярные соединения МАИК "Наука"-Москва-2002.-Сер.А, т.44, №11.-С.1887-1893.

3. Станишевский, Я.М. Получение антительных диагностических тест-систем заданной специфичности / Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, Э.Г. Кравцов, Е.Г. Волина, А.Н. Лобанов, И.И. Григорьевская // Биотехнология теоретический и научно-практический журнал. -Москват2003.-Вып.2.-С.81-85.

4. Станишевский, Я.М. Фагоцитирование полимерных микросфер, иммобилизированных биолигандами, лейкоцитами периферической крови у больных с острым панкреатитом / Я.М. Станишевский, В.Б. Скопинцев, Э.Г. Кравцов, В.А. Быков, И.А. Грицкова // Клиническая лабораторная диагностика. -Москва-2003 .-№ 10.-С.44-47.

5. Станишевский, Я.М. Полимерные микросферы для изучения фагоцитоза при различных стадиях заболевания хроническим гломерулонефритом / Я.М. Станишевский, Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова, В.А. Быков, В.Б. Скопинцев // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. -Москва-2004.-Вып.5-б,-

C.35-38.

6. Станишевский, Я.М. Полимерные микросферы - носители биолиганда в реакции латекс-агглютинации для определения аутоантител к тиреоглобулину / Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, Н.С. Кузмина, Г.А. Кириллова, Г.И. Кузнецова // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника. -Москва-2004.-Вып.8-9.-С.61-65.

' 7. Грицкова, И.А. Исследование свойств полимерных микросфер различной природы, используемых при создании тест-систем для определения С-реактивного белка / И.А. Грицкова, А.Г. Марков, Я.М. Станишевский, В.А. Быков, Н.И. Прокопов, И.В. Хачатурян, М.А. Мягкова, А.П. Каплун, В.Б. Скопинцев // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника,- Москва-2005.-Вып.1-2.-С.69-75.

8. Станишевский, Я.М. Латексный диагностикум для выявления короновирусной инфекции / Я.М. Станишевский, Э.Г. Кравцов, В.А. Быков, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, И.И. Григорьевская // Технологии живых систем. - Москва-2005.-Том2.№3.-С.55-62.

9. Станишевский, Я.М. Перспективы синтеза полимерных микросфер и создание на их основе скрининговых тестов для детекции антител к аутоантигенам щитовидной железы. Сообщение 1. Синтез полимерных носителей / Я.М. Станишевский, Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова, В.Е. Храмович, Н.С. Кузьмина, Г.А. Кириллова, Г.И. Кузнецова // Биотехнология теоретический и научно-

практический журнал.-Москва-2005.-Вып.4.-С.78-83.

Ю.Кириллова, Г.А. Перспективы синтеза полимерных микросфер и создание на их основе скрининговых тестов для детекции антител к аутоантигенам щитовидной железы. Сообщение 2. Создание латексного экспресс-теста для определения аутоантител к тиреоглобулину / Г.А. Кириллова, Н.С. Кузьмина, Г.И. Кузнецова, Я.М. Станишевский, Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова, В.Е. Храмовичев // Биотехнология теоретический и научно-практический журнал.-Москва-2005.-Вып.5.-С.90-95.

П.Кузьмина, Н.С. Определение антител к тиреоглобулину и пероксидазе щитовидной железы в сыворотке крови человека в реакции латекс-агглютинации / Н.С. Кузьмина, Г.А. Кириллова, Н.Ф. Гаврилова, В.В. Свиридов, Г.И. Кузнецова, И.В. Яковлева, М.А. Буркин, Ю.В. Лукин, А.Н. Генералова, Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов // Аллергия, астма и клиническая иммунология (ВИНИТИ РАН). -Москва-2005.-№8.-С. 1924.

12. Станишевский, Я.М. Использование конъюгата «полимерная микросфера - Fab-фрагмент антитела» для определения столбнячного анатоксина в реакции латексной агглютинации / Я.М. Станишевский, И.И. Григорьевская, В.А. Быков, Э.Г. Кравцов, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, О.П. Лазарева // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника.- Москва-2006.-Вып.5-6,-С.80-84.

13.Станишевский, Я.М. Использование полимерных суспензий в качестве сорбента вирусов для детекции антител в сыворотках крови крупного рогатого скота / Я.М. Станишевский, Т.П. Лобова, И.А. Грицкова, Р.В. Белоусова, Н.И. Прокопов, И.В. Третьякова // Вопросы вирусологии.- Москва-2006.-№4.-С.46-49.

14. Станишевский, Я.М. Исследование коллоидной устойчивости полимерных микросфер в физиологических солевых растворах используемых в реакции латексной агглютинации (РЛА) / Я.М. Станишевский // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника,- Москва-2006.-Вып.1-2.-С.70-74.

15. Грицкова, И.А. Тест-системы на основе полимерных микросфер / И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, Я.М. Станишевский // Вестник МИТХТ -Москва-2006,-Том 1.Вып.2.-С.5-20.

16. Станишевский, Я.М. Создание тест-системы включающих полимерный носитель и биочувствительный компонент для оценки состояния рецепторного аппарата клеточной мембраны / Я.М. Станишевский // Технологии живых систем - Москва-2006,- Том.З. Вып.2,- С.37-41.

П.Федорова, О.В. Синтез полімерних суспензій для біоаналітичних досліджень / О.В. Федорова, P.O. Петріна, В.П. Новіков, Я.М. Станішевськьш, І.О. Грицкова, Н.І. Прокопов // Вісник Національного університету «Львівська політехніка» Хімія, технологія речовин та іх застосування. - м. Львів-2006- №553.-С.315-317.

18. Федорова, О.В. Вплив способу іммобілізаціі іммуноглобуліну G на стійкість полімерноі суспензіі / О.В. Федорова, P.O. Петріна, Я.М. Станішевськьш, В.П. Новіков, І.О. Грицкова, Н.І. Прокопов // Доповіді Національної академії наук Украіни-м. Киів-2006- №12.-С.146-149.

19. Григорьевская И.И. Сравнение различных способов иммобилизации специфических антител на полимерные микросферы при создании диагностикума для определения Tamm-Horsfa!l протеина / И.И. Григорьевская, И.А. Грицкова, И.Г. Крашенинникова, Э.Г. Кравцов, С.М. Левачев, Я.М. Станишевский // Биотехнология теоретический и научно-практический журнал.-Москва-2007.-Вып.2.-С.-78-83.

20. Федорова, О.В. Дослідження фагоцитозу за допомогою модифікованих і не модифікованих опсонінами полімерних мікросфер / О.В. Федорова, Я.М. Станішевський, P.O. Петріна, В.П. Новіков, І.О. Грицкова, Н.І. Прокопов // Вопросы химии и химической технологии - г. Днепропетровск -2007- №3.-С.59-63.

21. Федорова, О.В. Полімерні носії для створення діагностичних тест-систем / О.В Федорова, P.O. Петріна, Н.Л. Заярнюк, В.П. Новіков, Я.М. Станішевський, 1.0. Грицкова, Н.І Прокопов // Вопросы химии и химической технологии, г. Днепропетровск ~2007.-№6,- С. 123-126.

22. Федорова, О.В. Іммобілізація правцевого анатоксину на частинки полімерного носія. / О.В. Федорова, P.O. Петріна, Я.М. Станішевський // Вісник Національного університету «Львівська політехніка» Хімія, технологія речовин та іх застосування, -м. Львів-2008- №622.-С.!53-155.

23.Кедик С.А. Взаимосвязь чувствительности реакции латексной агглютинации и степени гидратации поверхностных групп полимерных микросфер / С.А. Кедик, И.А. Василенко, И.А. Грицкова, Я.М. Станишевский, С.М. Левачев // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии.-Москва-2012.-№2.-С.27-32.

Патенты, свидетельства, учебные и учебно-методические пособия

24. Быков В.А., Грицкова И.А., Станишевский Я.М., Прокопов Н.И. Лабораторный практикум по курсу "Полимерные микросферы в диагностике" Москва-2003. -41с.

25.Быков В.А., Грицкова И.А., Станишевский Я.М., Прокопов Н.И. Учебное пособие (Рекомендовано ФГОУ «ВУНМЦ Росздрава» и УМО по образованию) "Полимерные микросферы в диагностике" Москва-2004.-130с.

26. Способ получения латексного диагностикума для постановки реакции латекс-агглютинации / Белоусова Р.В., Грицкова И.А., Лобова Т.П., Станишевский Я.М., Третьякова И.В., Прокопов Н.И. // Пат. РФ № 2270449 от 20.02.2006г.

27.Способ получения антительной тест-системы для постановки реакции латексиой агглютинации / Станишевский Я.М., Грицкова И.А, Прокопов Н.И. // Пат. РФ № 2380708 от 24.02.2010г.

28.База данных диагностических тест-систем используемых в реакции латексной агглютинации «Data Base - RLA» / Станишевский Я.М., Гутников C.B., Грицкова И.А // Свидетельство о государственной регистрации базы данных №2012620271, РФ от 07.03.2012г.

Тезисы докладов

29. Станишевский, Я.М. Синтез функциональных полимерных суспензий с регулируемой концентрацией функциональных групп на поверхности частиц /

Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, В.Б. Ромах, Д.И. Науменко, М.В. Глазунов // Тезисы десятой научно-технической конференции,- Мурманск-1999.-С.368-369.

30. Прокопов, Н.И. Технология синтеза полимерных микросфер для изучения фагоцитоза / Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова, Я.М. Станишевский, В.Б. Ромах, М.В. Глазунов // Тезисы докладов VI Международной конференции "Наукоемкие Химические Технологии".-Москва-1999.-С.306-307.

31. Грицкова, И.А. Создание технологии синтеза полимерных суспензий медико-биологического назначения / И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, A.A. Ишков, М.В. Глазунов, В.Б. Ромах, Я.М. Станишевский, Д.И. Науменко И Тезисы докладов VI Международной конференции "Наукоемкие Химические Технологии".-Москва-1999.-С. 77-78.

32. Станишевский, Я.М. Тест-системы для исследования рецепторного аппарата фагоцитирующих клеток / Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Е.Г. Кравцов, Н.И. Прокопов, В.А. Быков, В.Б. Скопинцев // Тезисы одиннадцатой научно-технической конференции МГТУ.- Мурманск-2000.-С.458-459.

33. Прокопов, Н.И. Полимерные суспензии для проведения реакций фагоцитоза / Н.И. Прокопов, Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Е.Г. Кравцов, В.А. Быков, М.В. Далин, А.Н. Лобанов // Тезисы одиннадцатой научно-технической конференции МГТУ.- Мурманск-2000.-С.459-460.

. 34. Станишевский, Я.М. Полимерные суспензии для проведения реакций фагоцитоза / Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Е.Г. Кравцов, В.А. Быков, Н.И. Прокопов // Биомедицинские технологии. -Москва-2000.-Вып.13.-С.43-51.

35. Станишевский, Я.М. Свойства частиц полимерной суспензии, используемой в качестве носителя биолигандов, при получении тест-системы / Я.М. Станишевский // Тезисы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2001" -Москва-2001,-С.190.

36. Лобанов, А.Н. Синтез полимерных суспензий для иммунохимических исследований / А.Н. Лобанов, Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова, Е.Д. Селищева, Я.М. Станишевский // Тезисы научно-технической конференции "Молодые ученые и аспиранты МГТУ".- Мурманск-2001.-С.323-324.

37. Станишевский, Я.М. Принципы выбора полимерных микросфер для получения диагностической тест-системы на фибронектин / Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, А.Н. Лобанов, В.Н. Измайлова, А.Е. Харлов, В.А. Быков, Е.Г. Кравцов // Тезисы научно-технической конференции "Молодые ученые и аспиранты МГТУ".- Мурманск-2001 .-С.329.

38. Харлов, А.Е. Поверхностные свойства частиц полистирольного латекса модифицированного желатиной на границе водный раствор сульфата амония/воздух / А.Е. Харлов, Я.М. Станишевский, Е.С. Шведов // Тезисы научно-технической конференции "Молодые ученые и аспиранты МГТУ".-Мурманск-2001.-с.330-332.

39. Станишевский, Я.М. Влияние способа присоединения биолиганда на устойчивость иммунохимических тест-систем, основу которых составляют полимерные микросферы / Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, В.А. Быков, Е.Г. Кравцов, Н.И. Прокопов, В.Н. Измайлова, А.Н. Лобанов //

Биомедипинские технологии. -Москва-2001.-Вып. 16.-С.-107-113.

40. Онзе Урбен Боско. Использование реакции агглютинации латекса для диагностики инфекционного бронхита кур / Онзе Урбен Боско, Л.Ф. Левина, Я.М. Станишевский // Биомедицинские технологии. - Москва-2001.-Вып. 16.-С.-236-239.

41. Харлов, А.Е. Тонкие пленки латексов, модифицированных желатиной / А.Е. Харлов, Я.М. Станишевский, Е.С. Шведов, М.А. Саквапелидзе, И.А. Грицкова, С.М. Левачев, Г.П. Ямпольская, В.Н. Измайлова // Санкт-Петербургский государственный университет кино и телевидения. Сборник научных трудов. Санкт-Петербур-2001 .-Вып. 1 .-С,-14-35.

42. Станишевский, Я.М. Подходы к созданию антительного диагностикума на сальмонеллез / Я.М. Станишевский, А.Н. Лобанов // Тезисы XXXVIII Всероссийской научной конференции по проблемам математики, информатики, физики, химии и методики преподавания естественнонаучных дисциплин (Химическая секция) - Москва: Изд-во РУДН,- 2002.-С.72.

43. Григорьевская, И.И. Тонкие пленки латексов полистирола, модифицированных сывороточным альбумином человека / Григорьевская И.И., Станишевский Я.М. // Тезисы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2002"-Москва-2002-С.-245.

44. Izmailova, V.N. Periodic colloidal structures in thin films of latexes, modified by proteins. / V.N. Izmailova, I.A. Grizkova, G.P. Yampolskaya, A.E. Kgarlov, E.S. Shvedov, I.I. Grigorievskaya, Ya.M. Stanishevskiy, A.V. Grigorieva, D.S. Turygin // XII International conference surface forces. Zvenigorod, Russia. June29-July5. -2002.-p.101.

45. Сакварелидзе, М.А. Влияние формальдегидных дубителей на свойства желатины в объеме и на границе раздела фаз / М.А. Сакварелидзе, С.М. Левачев, В.В. Родин, А.Е. Харлов, Е.С. Шведов, Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, П.В. Нусс, С.Р. Деркач, З.Д. Туловская, Г.П. Ямпольская, В.Н. Измайлова // Тезисы докладов. Международный симпозиум. Фотография в XXI веке. Санкт-Петербург - 2002.-С.-98-100.

46. Станишевский, Я.М. Создание антительной диагностической тест-системы на липтоспироз / Я.М. Станишевский, А.Н. Лобанов, И.И. Григорьевская, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов // Материалы Всероссийской научно-технической конференции. "Наука и образование - 2002" Тезисы докладов - Мурманск 2002.-С.-543-544.

47. Измайлова, В.Н. Тонкие пленки латексов полистирола, модифицированных сывороточным альбумином человека / В.Н. Измайлова, И.И. Григорьевская, Я.М. Станишевский // Материалы Всероссийской научно-технической конференции. "Наука и образование - 2002" Тезисы докладов - Мурманск 2002.-С.-538.

48. Лобанов, А.Н. Способ получения антительного диагностикума на столбнячный анатоксин / А.Н. Лобанов, Я.М. Станишевский, Э.Г. Кравцов, И.И. Григорьевская, Н.И. Прокопов // Материалы Всероссийской научно-технической конференции. "Наука и образование - 2002" Тезисы докладов -Мурманск 2002.-С.-541-542.

49. Станишевский, Я.М. Использование полимерных микросфер в качестве

иммуносорбентов для конструирования антительных противостолбнячных диагностикумов / Я.М. Станишевский, А.П.Лобанов, И.И. Григорьевская // Тезисы XXXIX Всероссийской научной конференции по проблемам математики, информатики, физики, химии и методики преподавания естественнонаучных дисциплин (Химическая секция) - Москва: Изд-во РУДН.-2003.-С.52.

50. Лобанов, А.Н. Разработка новых концепций синтеза полимерных микросфер для иммунохимических реакций / А.Н. Лобанов, Я.М. Станишевский, И.И. Григорьевская, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов // Материалы Всероссийской научно-технической конференции. "Наука и образование - 2003" Тезисы докладов - Мурманск-2003.-С.-38.

51. Станишевский, Я.М. Совершенствование свойств полимерных микросфер-носителей биолигандов и методики изучения фагоцитоза полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ) с их использованием / Я.М. Станишевский, А.Н. Лобанов, И.И. Григорьевская, В.Б. Скопинцев // Материалы Всероссийской научно-технической конференции. "Наука и образование - 2003" Тезисы докладов -Мурманск -2003.-С.-134-135.

52. Станишевский, Я.М. Тесты для экспресс-диагностики на основе латекс-агглютинации / Я.М. Станишевский, И.И. Григорьевская, А.Н. Лобанов, Е.Г. Кравцов, И.А. Грицкова // Материалы 1-ой Всероссийской научной конференции "Биомедицинские технологии". Москва-2003.-Вып.20.-С.-72-80.

53. Станишевский, Я.М. Влияние остаточного мономера в объеме полимерно-мономерных частиц на свойства тест-систем, полученных на их основе / Я.М. Станишевский, Н.И. Прокопов, И.И. Григорьевская, Д.Н. Вовк // Материалы международной научно-технической конференции "Наука и образование 2004" часть 1У.-Мурманск-2004.-С. 172-175.

54. Станишевский, Я.М. Синтез полимерных суспензий медико-биологического назначения методом затравочной полимеризации мономеров / Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, А.Н. Лобанов // Материалы международной научно-технической конференции "Наука и образование 2004" часть 1У.-Мурманск-2004.-С. 175-178.

55. Станишевский, Я.М. Частицы полимерных суспензий в качестве носителей биолигандов на примере лецитина / Я.М. Станишевский, А.Г. Марков, М.А. Мягкова, В.А. Быков, Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова // Материалы II Всероссийской конференции "Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах" «ФАГРАН-2004»-Воронеж-2004.-Том. 2.-С.649-650.

56. Марков, А.Г. Полимерные микросферы, содержащие в поверхностном слое полярные липиды, для определения С-реактивного белка / А.Г. Марков, Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, А.П. Каплун, М.А. Мягкова, Н.И. Прокопов, В.Б. Скопинцев, В.В. Ветрова // Материалы И-ой Всероссийской научной конференции «Биомедицинские технологии». -Москва-2004.-Вып.22.-С.-42-51.

57. Марков, А.Г. Определение С-реактивного белка в сыворотке крови больных методом латексной агглютинации с использованием полимерных микросфер и биолигандов различной природы / А.Г. Марков, И.А. Грицкова, Я.М. Станишевский, В.А. Быков, М.А. Мягкова, А.П. Каплун, В.Б. Скопинцев, Н.И.

Прокопов // Материалы ІІ-ой Всероссийской научной конференции «Биомедицинские технологии». -Москва-2004.-Вып.22.-С.-113-121.

58. Станишевский, Я.М. Диагностическая тест-система для определения аутоантител щитовидной железы, с использованием полимерных микросфер в качестве носителей тиреоглобулина / Я.М. Станишевский, Н.С. Кузмина, И.А. Грицкова // Материалы международной научной конференции "Молекулярная генетика, геномика и биотехнология"-Минск-2004.-С.257-258.

59. Станишевский, Я.М. Получение латексных диагностикумов для выявления антител продуцированных вирусами / Я.М. Станишевский, Е.Е. Ткаля, Т.П. Лобова // Материалы II международной научно-практической конференции "Науковий потенціал світу '" -г. Днепропетровск- 2005.-Томі.-С.45-46.

60. Станишевский, Я.М. Выбор полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов при создании диагностических тест-систем для детекции антител к возбудителям аденовирусных инфекций у КРС / Я.М. Станишевский, Т.П. Лобова, И.А. Грицкова, Р.В. Белоусова, Н.И. Прокопов, И.В. Третьякова // Материалы международной научно-технической конференции "Наука и образование - 2005" часть У.-Мурманск-2005.-С.202-204.

61. Станишевский, Я.М. Получение стабильных полимерных микросфер для создания на их основе иммунодисперсных ,тест-систем / Я.М. Станишевский, Н.И. Прокопов, И.А. Грицкова, С.А. Кедик // Первая научно-техническая конференция молодых ученых «Наукоемкие химические технологии»-Москва-2005.-Том2.-С.68-69.

62. Ткаля, Е.Е. Тест-системы для диагностики вирусных инфекционных заболеваний / Е.Е. Ткаля, Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Т.П.Лобова // Первая научно-техническая конференция молодых ученых «Наукоемкие химические технологии» -Москва-2005.-Том2.-С.67-68.

63. Станишевский, Я.М. Получение и использование антигенных латексных диагностикумов для выявления инфекционных заболеваний вызванных вирусами у КРС / Я.М. Станишевский, Е.Е. Ткаля, Т.П. Лобова // Материалы международной научной конференции "Молекулярная и прикладная генетика" -г. Минск-2005.-С.247.

64. Fedorova, A. Polymeric microspheres for immobilization of immunoglobulin G / A. Fedorova, R. Petrina, Ya. Stanishevsky, V. Novikov, I. Gritskova // 20 Europeen Conference of the Colloid and Interface Society. - Budapest, Hungary - 2006.-№8. p.30.

65. Ткаля, Е.Е. Тестирование респираторно-кишечных заболеваний тест-системами, созданными на основе полимерных носителей / Е.Е. Ткаля, Я.М. Станишевский, Н.И. Прокопов, Р.В. Белоусова, Т.П. Лобова // Материалы Международной научно-технической конференции. "Наука и образование -2006" Тезисы докладов - Мурманск-2006.-С.-669-671.

66. Станишевский, Я.М. Тест-системы с использованием полимерных носителей биолигандов / Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, Н.И. Прокопов, А.Н. Лобанов, Е.В. Фёдорова, В.П. Новиков // Материалы Международной научно-технической конференции. "Наука и образование - 2006" Тезисы докладов -Мурманск-2006.-С.-667-668.

67. Петріна, P.O. Іммобілізація біолігандів та створення тест-систем на основі

полімерних мікросфер / P.O. Петріна, О.В. Федорова, Я.М. Станішевський, В.П. Новіков, І.О. Грицкова // Матеріали IX Українського біохімічного з'ізду. -м. Харків-2006.-Том 2.-С.216-217.

68. Федорова, О.В. Іммобілізація імуноглобуліну G на поверхню полімерних мікросфер / О.В. Федорова, P.O. Петріна, В.П. Новіков, Я.М. Станішевський // Материалы III Всеукраинской научно-практической конференции с международным участием «Биотехнология. Образование. Наука. Практика» -г. Харкьков-2006.-С. 133.

69. Petrina, R. Polymeric suspensions for bioanalytical study / R. Petrina, E. Fedorova, V. Novikov, Ya. Stanishevsky // Ukrainian-German Symposium on Nanobiotechnology - Kyiv-2006.-p.l 17.

70. Фёдорова, E.B. Полимерные носители для иммуноанализа / Е.В. Фёдорова, Р.Е. Петрина, В.П. Новиков, Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова // Международная конференция по органической химии «Органическая химия от Бутлерова и Бейльштейна до современности» - г. Санкт-Петербург-2007.-С.790.

71. Федорова, Е.В. Исследование фагоцитоза с помощью полимерных носителей / Е.В. Федорова, Р.Е. Петрина, В.П. Новиков, Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова // Тезисы IV Всероссийской Каргинской конференции «Наука о полимерах 21-му веку» - Москва-2007.-.Вып.2. С.438.

72. Fedorova, A. Polymeric suspensions for bioanalytical study / A. Fedorova, R. Petrina, Ya. Stanishevsky, V. Novikov, I. Gritskova, N. Prokopov // 3rd International Symposium on «Reactive Polymers in Inhomogeneous Systems, in Melts, and at Interfaces». - Dresden, Germany - 2007.-p.217.

73. Fedorova, A. Influence of surface active nature on monodisperse particles obtaining / A. Fedorova, R. Petrina, N. Zayamyuk, Ya. Stanishevsky, I. Griskova, V .Novikov // Тезисы V Польско-украинской, конф. «Polymers of special applications».-Radom, Poland.-2008.- p.34.

74. Станишевский, Я.М. Разработка научно-обоснованной технологии создания тест-систем способной выявлять аутоантитела к тиреоглобулину методом PJ1A / Я.М. Станишевский // Тезисы докладов «Наукоемкие химические технологии - 2008» XII международная научно-техническая конференция - Волгоград -2008.- С.281-282.

75. Stanishevskiy, Y.M. Computer modelling of bioligand on surface of polymer micropheres at construction of diagnostic test-system. / Y.M. Stanishevskiy, S.A. Kedik, N.S. Kuzmina, R.E. Petrina, A.V. Fedorova // National Scientific-Technical Conference with International Participation "Actual problems of synthesis and creation of new biologically active compounds and pharmaceutical preparations" -Lviv- 2008, p.C.253.

76. Gritskova, I.A. A synthesis of polymer microspheres for immunochemical studies / I.A.Gritskova, N.I. Prokopov, Y.M. Stanishevskiy // National Scientific-Technical Conference with International Participation "Actual problems of synthesis and creation of new biologically active compounds and pharmaceutical preparations" Lviv, 2008, p.247.

77. Станішевський, Я.М. Полімерні мікросфери для вивчення клітинних рецепторів / Я.М. Станішевський, О.В. Федорова, P.O.Петріна. // IV международная научно-практическая конф. "Биотехнология. Наука.

Образование. Практика" - 2008.-Днепропетровск,- С.62.

78. Федорова, О.В. Полістирольні мікросфери для створення нових діагностичних препаратів / О.В. Федорова, Я.М. Станішевський, Р.О Петріна, H.JI. Заярнюк, В.П.Новіков // Украінска науково-практична конференція, присвячена памяті проф. П.О.Петюніна. - Харків - 2009.-С.122.

79. Fedorova O.V. Adsorbtion of bioligands on spare of polymeric microsfers. O.V. Fedorova, Ya.M. Stanishevsky, N.L. Zayarnyuk, V.P. Novikov // 3rd International Summer School "Supramolecular Systems in Chemistry and BiologY". -Lviv-2010.p.74.

80.Федорова O.B. Использование нанотехнологий в иммунодиагностичнских исследованиях / О.В. Федорова, H.JI. Заярнюк, Р.Е. Петрина, Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, В.П. Новиков // Матеріали конференції "Нанотехнології в фармації і медицині", Харьков -2011-С.68.

81.Федорова О.В. Конструювання нових діагностичних препаратів на основі полістирольних носіїв / О.В. Федорова, H.JI. Заярнюк, В.П. Новіков, І.О. Грицкова, Я.М. Станішевський// Матеріали II науково-практичної конференції з міжнародною участю "Сучасні досягнення фармацевтичної технології"" -Харьков -2011-С.208.

82. Fedorova, O.V. Role of spacer in the phase-to-phase layer of polymeric microspheres at constructing of biotest-systems / O.V. Fedorova, N.L. Zayarnyuk, Ya.M. Stanishevskiy, I.A.Gritskova, V.P. Novikov // 4th International Summer School «Supramolecular Systems in Chemistry and Biology» - Refensburg (Germany)-2011-p. 10.

Подписано в печать: 24.04.2012

Заказ № 7278 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, доктора химических наук, Станишевский, Ярослав Михайлович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современное состояние проблемы диагностирования заболеваний вирусной и бактериальной природы методом реакции латексной агглютинации.

1.2. Полимерные микросферы - носители биолигандов для создания диагностических тест-систем, используемых в реакции латексной агглютинации.

1.3. Способы конструирования диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер и специфических биолигандов.

1.3.1. Диагностические тест-системы, полученные физической адсорбцией специфических биолигандов на поверхность полимерных микросфер.

1.3.2. Диагностические тест-системы, полученные при ковалентном связывании функциональных групп специфических биолигандов и полимерных микросфер.

1.3.3. Диагностические тест-системы, полученные иммобилизацией через спейсер специфических биолигандов на поверхность полимерных микросфер.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Исходные вещества.

2.2 Методы исследования.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Синтез функциональных полимерных микросфер и изучение их физико-химических свойств.

3.1.¡.Синтез полимерных микросфер в отсутствие эмульгатора.

3.1.2.Синтез полимерных микросфер методом затравочной полимеризации.

3.1.3.Синтез полимерных микросфер методом дисперсионной полимеризации.

3.2. Создание диагностических тест-систем на основе конъюгатов «полимерная микросфера-биолиганд» различного целевого назначения.

3.2.1. Получение тест-системы «полимерная микросфера-тиреоглобулин» для выявления аутоантител к тиреоглобу лину.

3.2.2. Получение тест-системы «полимерная микросфера-специфический иммуноглобулин G» для выявления антигенов различной природы.

3.2.3. Получение тест-системы «полимерная микросфера-желатина» для выявления сывороточного фибронектина.

3.2.4. Получение тест-системы «полимерная микросфера-вирус» для выявления антител к вирусам различной природы.

3.3. Разработка технологии создания диагностических тест-систем на основе конъюгатов «полимерная микросфера-биолиганд», работающих по принципу реакции латексной агглютинации.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Создание диагностических тест-систем "Полимерная микросфера-биолиганд" медико-биологического применения"

Перспективным подходом к повышению эффективности профилактики и лекарственной терапии является ранняя диагностика возбудителей потенциального заболевания. Своевременный и правильно поставленный диагноз позволяет четко оценить ситуацию и выбрать систему адекватных оздоровительных мероприятий. Именно поэтому необходима и актуальна разработка недорогих бесприборных диагностических тест-систем и применение их в экспресс диагностике заболеваний.

В настоящее время широко используют различные иммунодиагностические методы: реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментный анализ (ИФА), радиальную иммунодиффузию (РИД), реакцию нейтрализации на культуре клеток (РН) и т.д. Однако эти методы обладают рядом недостатков, а именно, отсутствие быстроты и простоты постановки реакции, стабильности при конструировании и хранении препаратов, долговременной пригодности, необходимой чувствительности и специфичности, воспроизводимости от партии к партии и т.д., что не в полной мере отвечает требованиям современных клинико-диагностических лабораторий.

В лабораторной практике для детекции антигенов (антител) широко применяют реакцию латексной агглютинации (РЛА), с использованием диагностических тест-систем «полимерная микросфера-биолиганд».

Такой способ диагностирования отличается простотой исполнения, не требует специального оборудования и позволяет в течение короткого времени (3-7 мин.) провести визуальный учет результатов. Относительная дешевизна анализа, высокая чувствительность, специфичность и воспроизводимость метода РЛА, простота и возможность постановки теста практически в любых условиях позволяют проводить экспресс диагностику заболеваний, как при одиночных, так и при скрининговых исследованиях.

Тест-системы для PJIA представляют собой полимерную суспензию, индивидуальные частицы которой содержат на своей поверхности специфические биолиганды, способные аффинно связываться с детектируемым компонентом (антигеном, антителом), образовывая при этом пространственные сетки агломераты, которые легко визуализируются.

Преимущества полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов перед частицами биологического происхождения (эритроциты) к настоящему времени очевидны. Они состоят в возможности получения полимерных суспензий с определенным диаметром частиц, узким распределением их по размерам, наличием функциональных групп на поверхности полимерных микросфер, способных ковалентно связываться с функциональными группами биолиганда, сохраняющих устойчивость в растворе электролита на всех стадиях получения тест-систем и при хранении.

На основании созданной нами базы данных диагностических тест-систем для PJIA (Свидетельство о государственной регистрации базы данных «Data Base - RLA» №2012620271 от 07.03.2012г.) показано, что существует ряд фирм [БиоМерье (Франция), ВедаЛаб (Франция), Human GmbH (Германия), "Cypress Diagnostics" (Бельгия), «ЭКОлаб» (Электрогорск), ООО «Ольвекс Диагностикум», «Алкор Био», НПФ "АБРИС+" (Санкт-Петербург)], которые выпускают диагностические тест-системы, способные выявлять ревматоидный фактор, антистрептолизин-О, и С-реактивный белок, стафилококки ауреус, стрептококки A,B,C,D,F,G, пневмококки и др. Анализ этих разработок позволил сделать вывод об эмпирическом характере получения диагностических тест-системы на основе конъюгатов «полимерная микросфера-биолиганд», что во многом связано с отсутствием систематических исследований по выявлению факторов, позволяющих обеспечивать нативную конформацию биолигандов при их иммобилизации на поверхность полимерных микросфер и, соответственно, высокую чувствительность РЛА.

При расширении области применения диагностических тест-систем, полученных на основе полимерных частицы и специфических биолигандов, стало ясно, что создать универсальные полимерные частицы различного целевого назначения, невозможно. Сложность процесса состоит в том, что в каждом конкретном случае необходимо иммобилизовать на поверхность полимерных микросфер специфические биолиганды различной природы, размера, молекулярной массой и др. (вирусы, антигены, антитела, гормоны и.т.д.).

Все это делает работы в этом направлении важными и актуальными. Цель работы. Систематическое исследование влияния природы полимерных микросфер различного диаметра и способов иммобилизации специфических биолигандов на их поверхность, на свойства полученных конъюгатов «полимерная микросфера-биолиганд» и чувствительность реакции латексной агглютинации (тест-систем).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

Научная новизна.

1. Впервые для создания конъюгатов «полимерная микросфера-биолиганд» (тест-система), работающих по принципу реакции латексной агглютинации (РЛА), использованы функциональные полимерные микросферы различного диаметра, устойчивые в буферных растворах в широком интервале рН, предложены различные подходы к иммобилизации биолигандов (физической адсорбцией и ковалентным связыванием функциональных групп) на поверхность полимерных микросфер, позволяющие обеспечить высокую чувствительность РЛА.

2. Впервые проведен сопоставительный анализ методов получения полимерных суспензий, частицы которых различались составом межфазного слоя (природой полимера, ПАВ, функциональными группами, наличием красителя), и свойств тест-систем, сконструированных на их основе, по устойчивости в буферном растворе, и по системе контроля их активности в биологических реакциях. Обоснованы критерии оценки свойств полимерных микросфер: средний диаметр в интервале значений 1-4 мкм, узкое распределение частиц по размерам, и их индивидуальность, наличие функциональных групп, отсутствие остаточного мономера.

3. Сконструирована компьютерная модель тиреоглобулинового участка гомологичного ацетилхолинэстеразе, которая наглядно демонстрирует расположение аминогрупп остатков лизина, и позволяет высказать предположение об оптимальной топохимии взаимодействия функциональных групп полимера и тиреоглобулина (ТГ), которое не будет экранировать антигенные детерминанты ТГ.

4. Предложен нетрадиционный подход к конструированию диагностической тест-системы для выявления антигенов различной природы, заключающийся в использовании промежуточного биолиганда - протеина А, аффинно взаимодействующего с Бсфрагментом иммуноглобулина в, таким образом, обеспечивая доступность РаЬ-фрагментов для связывания с антигеном.

6. Впервые выявлено влияние природы желатина и ее конформации на диаметр частиц, заряд, устойчивость полимерных микросфер и чувствительность тест-систем. Показано, что предпочтительна иммобилизация желатины в конформации «клубка» на поверхность полимерных микросфер при 60°С. Показано влияние условий (температура, среда) и способа иммобилизации (физическая адсорбция, ковалентное связывание природы функциональных групп) на устойчивость системы, и чувствительность реакции латексной агглютинации (РЛА).

Практическая значимость

2. Созданные диагностические тест-системы апробированы на панели сывороток с различными патологиями заболевания: иерсиниоза, лептоспироза, сальмонеллеза, инфекционного бронхита, а' также заболеваний щитовидной железы (тиреоидита Хасимото, Базедовой болезни и другие), и показана их высокая чувствительность и специфичность.

3. Разработаны опытно-промышленный регламент (ОПР 04868244-05

2009), и технические условия (ТУ 9380-172-04868244-2009) на производство диагностической тест-системы «ПМ-глицин-ТГ» для выявления аутоантител к тиреоглобулину щитовидной железы методом реакции латексной агглютинации ( ВНИИ лека рственных и ароматических растений (ВИЛАР), г.Москва), и подготовлено регистрационное досье для регистрации в Минздравсоцразвития России на разработку диагностической тест-системы для выявления аутоантител к тиреоглобулину.

4. Разработан и запатентован способ получения диагностической тест-системы для выявления антител к аденовирусам КРС методом PJIA (патент №2270449 от 20.02.2006г.). Разработан и запатентован способ получения антительной тест-системы для постановки иммунодиагностической реакции латексной агглютинации (патент №2380708 от 24.02.2010г.). Разработана база данных диагностических тест-систем, используемых в реакции латексной агглютинации (PJIA), и получено Свидетельство о государственной регистрации базы данных «Data Base - RLA» №2012620271 от 07.03.2012г.

5. Разработанные высокочувствительные и специфичные диагностические тест-системы для выявления аутоантител к тиреоглобулину, и вирусу инфекционного бронхита кур штамма HI20 были успешно апробированы в лабораторных и клинических условиях в Медицинском Радиологическом Научном Центре (ГУ МРНЦ РАМН), г.Обнинск; Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ), г.Москва, 1120 Центральном Военном Клиническом Госпитале (ЦВКГ), Авторской лаборатории, г.Львов.

6. Материалы диссертационной работы вошли в курсы лекций и практических занятий по дисциплинам: «Основы биомедицинских технологий» для студентов 5-го курса обучающихся по специальности 070100 «Биотехнология» и «Полимеры в медицине и фармацевтике» для студентов 4-го курса обучающихся по направлению 550880 «Химическая технология и биотехнология» (Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова (МИТХТ, г.Москва)).

Положения, выносимые на защиту:

4. Получение диагностических тест-систем для реакции латексной агглютинации, и практическую их апробацию при выявлении веществ-индикаторов: Yersinia enterocolitica серотип ОЗ, Leptospira canicola, Salmonella pulorum, вируса инфекционного бронхита, сывороточного фибронектина, и аутоантител к тиреоглобулину щитовидной железы, содержащихся в сыворотках крови с различными патологиями заболевания.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Станишевский, Ярослав Михайлович

выводы

1. Синтезированы полимерные суспензии с диаметрами частиц в интервале 1-4мкм. и узким распределением по размерам, изучены их коллоидно-химические свойства, и на их основе созданы диагностические тест-системы для выявления конкретных заболеваний. Разработаны ОПР и ТУ на их производство, наработаны опытные партии, которые апробированы с положительным результатом.

2. Для создания диагностических тест-систем различного целевого назначения использованы полимерные суспензии двух типов: функциональные полимерные суспензии, и полимерные суспензии, частица которых содержали на поверхности вещества, аффинно связывающиеся с биолигандами. Все полимерные суспензии не содержали ассоциатов и сохраняли устойчивость в буферных растворах и при хранении в течение 6 месяцев.

4. Предложен нетрадиционный подход к конструированию диагностических тест-систем для выявления антигенов различной природы, заключающийся в том, что молекулу иммуноглобулина О фиксируют на поверхности полимерных микросфер Бс-фрагментом; в этом случае РаЬ-фрагменты, несущие активные центры оказываются доступными для взаимодействия с антигенами.

5. Впервые в качестве промежуточного биолиганда при создании тестсистем «полимерная микросфера-биолиганд» на различные антигены, использован протеин А, который специфически взаимодействует с Fc-фрагментом иммуноглобулина G. Показано, что такой способ получения тест-систем обеспечил им высокую чувствительность в реакции латексной агглютинации и устойчивость в буферных растворах и при хранении.

7. Разработана технология получения диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер и специфических биолигандов для реакции латексной агглютинации и показана их пригодность на примере выявления Yersinia enterocolitica серотип OS, Leptospira canicola, Salmonella pulorum, вируса инфекционного бронхита кур штамм Hl20, сывороточного фибронектина, аутоантител к тиреоглобулину щитовидной железы.

Библиография Диссертация по биологии, доктора химических наук, Станишевский, Ярослав Михайлович, Москва

1. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни. М.: «Медицина», 2005.

2. Денисов Б.П. Демография ВИЧ. МГУ. М.: «МАКС Пресс», 2009. -Вып.2. - 130с.

3. Зрячкин Н., Цека Ю., Малугина Л., Подколзина В., Романова Е. «Полный справочник инфекциониста». Москва, из-во «Эксмо», 2004.

4. Малеев В.В., Сологуб Т.В., Ершов Ф.И., Романцов М.Г. Современный взгляд на вирусные гепатиты. М.: Миклош, 2010.-168с.

5. Казанцев А.П., Матковский B.C. Справочник по инфекционным болезням. М.: Медицина, 1979. С.46-50.

6. Хабиб О. Туберкулез: настоящее и будущее. РМЖ. 1999. - Том 7. -№5.

7. Макаров В.В. Реальная эпизоотология бешенства. // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2002.

8. Ющук Н.Д., Венгеров Ю.Я. Инфекционные болезни. М., 2003.

9. Тертон М., Бангхем Д.Р., Колкотт К.А. Новые методы иммуноанализа. М.: Мир, 1991.- 116с.

10. Фримель. Г. Иммунологические методы / М.: Медицина, 1987.- С.89-96.

11. Yalow RS. Radioimmunoassay // Annu Rev. Biophys. Bioeng. 1980. -V.9. -p.327.

12. Yalow RS, Berson SA. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man // J. Clin. Invest. V.39. p. 1157.

13. Yalow RS. Heterogeneity of peptide hormones: Its relevance in clinical radioimmunoassay. // Adv. Clin. Chem. 1978. - V.20. -p.l.

14. Yalow RS. Radioimmunoassay: Practices and pitfalls // Circ. Res. 1973. - V.32.-pp. 33-34.

15. Nussbaum SR, et al. Highly sensitive two-site immunoradiometric assayof parathyrin, and its clinical utility in evaluating patients with hypercalcemia. // Clin. Chem. 1987. - V.33. - p. 1364.

16. Егоров A. M., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Е. М. Теория и практика иммуноферментного анализа. Москва: Высшая школа, 1991.

17. Tijssen P., Practice and theory of enzyme immunoassays. Elsevier Science Pub. New York, USA, 1985.- 502 p.

18. Wennig R, Moeller MR, Haguenoer JM et al. Development and evaluation of immunochromatographic rapid tests for screening of cannabinoids, cocaine, and opiates in urine // J. Anal. Toxicol. 1998. -V.22. - pp.148-155.

19. Torlesse, H., Wurie, I.M., and Hodges, M. The use of immunochromatography test cards in the diagnosis of hepatitis В surface antigen among pregnant women in West Africa. Br.J.Biomed.Sci. 1997. - V.54. - pp.256-259.

20. Anderson, J.C., Cheng, E., Roeske, M., Marchildon, P., Peacock, J., and Shaw, R.D. Detection of serum antibodies to Helicobacter pylori by an immunochromatographic method. Am.J.Gastroenterol. 1997. - V.92. -pp.1135-1139.

21. Abe, C., Hirano, K., and Tomiyama, T. Simple and rapid identification of the Mycobacterium tuberculosis complex by immunochromatographic assay using anti-MPB64 monoclonal antibodies. J.Clin.Microbiol. 1999. -V.37.-pp.3693-3697.

22. Быков B.A., Грицкова И.А., Прокопов Н.И., Станишевский Я.М. Полимерные микросферы в диагностике // Учебное пособие. М., 2004.

23. Грицкова И.А., Прокопов Н.И., Станишевский Я.М. Биотест-системы на основе полимерных микросфер // Вестник МИТХТ. 2006.- Том 1. - Вып.2.- С.5-20.

24. Lonnie J. Lucas, Jin-Hee Han, Jennine Chesler, Jeong-Yeol Yoon. Latex immunoagglutination assay for a vasculitis marker in a microfluidic device using static light scattering detection // Biosensors and Bioelectronics. 2007.- V.22. - pp. 2216-2222.

25. Lonnie J. Lucas, Jin-Hee Han, Jennine Chesler, Jeong-Yeol Yoon. Latex immunoagglutination assay for a vasculitis marker in a microfluidic device using static light scattering detection // Biosensors and Bioelectronics. 2007 - V.22. - pp.2216-2222.

26. Theresia H. Abdoel, Henk L. Smits. Rapid latex agglutination test for the serodiagnosis of human brucellosis // Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2007. - V.57.- pp. 123-128.

27. Вorel Т., Rose A.M.C., Guillerm M., Sidikou F., Gerstl S., Djibo A.,

28. Каральник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы // Алма-Ата: Наука, 1982.

29. Каральник Б.В., Царевский Ю.П., Шамардин В.А. Эритроцитарные белковые диагностикумы // Алма-Ата: Наука, 1982.

30. Сюрин В.Н., Самойленко А.Я., Соловьев В.Б. и др. Вирусные болезни животных // Москва, ВНИТИБП, 1998.

31. Красота А.Ю. Технология тест-системы для серодиагностики парагриппа-3 крупного рогатого скота методом РИГА // Дисс. канд. вет. наук: М., 2003.

32. Юринова Г.В. Совершенствование технологии приготовления эритроцитарных иммунодиагностикумов для РПГА на основе клеточных фракций бифидобактерий с использованием синтетических полимеров// Дисс. канд. биол. наук: Улан-Удэ, 2005.

33. Singer J.M., Plotz СМ. The latex fixation test. Application to the serologic diagnosis of rheumatoid arthritis // Am. J. Med. 1956. - №21.-pp.888-893.

34. Severin W.P. Latex agglutination in the diagnosis of meningococalmeningitis //J. Clin. Path. 1972. - V.25. - pp. 1079-1082.

35. Bonacker L.,Staerk J. Latex agglutination, a rapid screening method for detection of hepatitis-assotiated antigen // Progress in immunological standartization.- Basel. 1972. - V.5.- pp.70-74.

36. Yen S., Rembaum A., Molday R., Dreyer W. Polymer particles for immunological assay // Emulsion polymerization: ACS Sumposium Series.-ACS, Washington. 1976.-pp.236-257.

37. LeinonenM., HervaE. The latex agglutination test for the diagnosis ofs meningococal and haemophilus influenzue meningitis // ScandJ.Infect.Dis. 1977.- V.9.- №3. - pp. 187-191.

38. Limet J.N., Collet-Cassart D., Magnusson C.G, Saugave P., Cambioaso C.K., Masson P.L. Particle counting immunoassay (PASIA) of ferritin. // J.Clin.Chem.Clin. Biochem. 1982. - V.20. - №3. - pp.141-146.

39. Kawaguchi H., Sakamoto K., Ohtsua Y., Ohtake Т., Sekiguchi H., Iri H. Fundamental study on latex reagents for agglutination tests.// Biomaterials. 1989. - V.10. - №4. - pp.225-229.

40. Thomas N.E., Coakley W.T. Measurement of antigen concentration by an ultrasoundenhanced latex immunoagglutination assay. // Ultrasound Med. Biol. 1996. - V.22. - №9. - pp. 1277-1284.

41. Дорохова E.A. Полимерные микросферы для реакции латекс-агглютинации // Дисс. канд. хим. наук: М., 1991.

42. Бровкина А.Н. Разработка диагностических тест-систем для ускоренной индикации энтеробактерий с помощью реакции латекс-агглютинации // Дисс. . канд. вет. наук: М., 1999.

43. Шкарлат П.Е. Латексная тест-система для экспресс-диагностики лептоспирозной инфекции у собак // Дисс. канд. биол. наук: М., 2003.

44. Chandrakesan S.D., Parija S.C. Latex agglutination test (LAT) for antigen detection in the cystic fluid for the diagnosis of cystic echinococcosis // Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 2003. - V.45 -pp. 123-126.

45. Madhusudana S.N., Saraswati S. Development and evaluation of a latex agglutination test for rabies antibodies // Journal of Clinical Virology.2003.-V.27.-pp.l29-135.

46. Марков А.Г. Полимерные микросферы для получения биотест-систем на С-реактивный белок // Дисс. канд. биол. наук: М.: 2005.

47. Vollenhofer-Schrumpf S., Buresch R., Schinkinger M. A simple nucleic acid hybridization/latex agglutination assay for the rapid detection of polymerase chain reaction amplicons // Journal of Microbiological Methods. 2007. - V.68. - pp.568-576.

48. Ganju L. et. al. A rapid latex agglutination test for detection of antibodies in tuberculosis and Hansens disease // J. Immunoassay. 1991.- V.12.-№.4.- pp.579-596.

49. Mongkolsirichaikul D. et. al. Development of a latex agglutination inhibition reaction test for amphetamines in urine // j. Immonol. Methods.- 1993. V.157.- №1-2.- pp. 189-196.

50. Zuerlein T.G. et. al. Latex agglutination detection of group В step tococcal inoculum in urine // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1991. - V.14.- №.3.- pp.191-195.

51. Зайко H.H. Патологическая физиология. М.:"Вища школа", 1977.

52. Петров Р.В. Иммунология, М., 1987.

53. Aga D.S., Thurman Е.М. Washington Immunochemical Technology for Environmental Applications // Am. Chem. Soc., ACS Symposium series. -1997.-V.657.-p.397.

54. Grundy M., Bolek W., Coakly W., Benes E. Rapid agglutination in ultrasonic standing wave // J. of Immunol. Methods. 1993.- V.165. -pp.47-57.

55. Carney J. Rapid diagnostic tests employing latex particles // Anal. Proc. -1990. V.27.-pp.99-100.

56. Lyerly D., Hahn P. An assay for elevated levels of fecal leukocytes // American Clin. Lab. 1994. - V.5.- pp. 18-20.

57. Bang L.B. Uniform latex particles. Indianapolis Seradyn Inc. 1984.-p 68.

58. Быков B.A., Грицкова И.А., Станишевский Я.М., Прокопов Н.И. Лабораторный практикум по курсу "Полимерные микросферы в диагностике" М., 2003. 41с.

59. Bangs L.B. Immunological applications of microspheres // The Latex Course. 1996. - №4.- pp. 1-29.

60. Christensen H., Thyssen H., Schebye O., Berget A. Three highly sensitive "Bedside" serum and urine tests for pregnancy compared //Clin. Chem. -1990.-V.36.- pp.1686-1688.

61. Блинов Н.П. Химическая микробиология. // М.: Высшая школа, 1984.- 294с.

62. Tsuda S., Kamayak-Iwaki М., Hanada К., Kouda Y., Hikata M. A novel detection and identification technique for plant viruses: rapid immunofilter paper assay // Plant Disease. 1992. - V.76. - pp.466-469.

63. Gibbs J., Brown C., Root D. ELIZA optimization // J. Immunol. Methods.- 1994. V.175. - pp.97-103.

64. Yang T. Drugs of abuse by immunoassay // Clin. Lab. Prod. 1992. -V.21. - №.3.- pp.8-9.

65. Analytical test devices for assay for drugs of non-protein antigens using immunochromatographic techniques. US Pat № 5238652, Sun M., Pfeifer F.R., 1993.

66. Крашенинникова И.Г. Полимерные суспензии медико-биологического назначения с узким распределением частиц по размерам // Дисс. док. тех. наук. М., 2007.

67. Прокопов Н.И. Синтез полимерных суспензий с узким распределением частиц по размерам методом гетерофазной полимеризации // Дисс. докт. хим. наук. -М., 1999.

68. Лобанов А.Н. Синтез полимерных суспензий медико-биологического назначения // Дисс. канд. хим. наук. М., 2003.

69. Грицкова И.А., Крашенинникова И.Г., Аль-Хаварин Д.И., Нусс П.В., Дорохова Е.А., Гжива Э. Устойчивые полистирол-метакриловые суспензии с узким распределением частиц по размерам // Коллоидн. ж. 1995. - Т.57. - №2. - С.182-185.

70. Грицкова И.А., Прокопов Н.И., Черкасов В.Р., Ишков А.А., Яшина Н.В., Кравцов Э.Г., Ефремова Н.Б., Гжива Э., Быков В.А. Синтез полимерных суспензий для иммунохимических исследований. // Биомедицинские технологии: Докл. конф. М.: 1994. Вып.1. - С. 62.

71. Prokopov N.I., Gritskova I.A., Cherkasov V.R., Isckov A.A. Synthesis of polymer suspensions for immunochemical studies // J. of Applied

72. Polymer Science. 1996. - V.61. - pp. 1465-1471.

73. Ugelstad J., Mfutakamba H., Mork P., Ellingsen T., Berge R., Holm L., Schinid R., Jorgedal A., Hansen F., Nustad K. Preparation and characterization of monodisperse polymer particles // J.Polym.Sci.,Polym.Symp. 1985. - V.72.- pp.225-240.

74. Ober S., Lok K., Hair M. Monodispersed, micron-sized polystyrene particles by dispersion polymerization // J. of Polym.Sci., Polym.Letters Ed. 1985. - V.23.- pp.103-108.

75. Brouwer W. The preparation of small polystyrene particles // J. of Appl.Polym.Sci. 1989. - V.38. - pp. 1335-1346.

76. Okubo M., Shiozaki M., Tsujihiro M., Tsukuda Y. Preparation of micron-size monodisperse polymer particles by seeded polymerization utilizing the dynamic monomer swelling method // Coll. Polym. Sci. -1991. V.269.- pp.222-226.

77. Van der Hoven T., Bijeterboch B. Some peculiarities in the surface charge of monodisperse polysteren particles: the effect of preparation, cleaning and handing // J. Coll. Inteface Sci. 1987.-v.l 15.- № 2.-pp.559-560.

78. Okubo M., Izumi J., Hosotani T., Yamashita T. Production of Micron-Sized Monodispersed Core/Shell Polymethyl Methacrylate Polystyrene Particles by Seeded Dispersion Polymerization // Coll.Polym.Sci. 1997. - V.275. - №8. - pp.797-801.

79. Григорьевская И.И. Антительные тест-системы на основе полимерных суспензий для мониторинга биополлютантов и биологически важных соединений // Дисс. канд. хим. наук М.: 2005.

80. Басырева Л.Ю. Создание диагностических тест-систем на основе полимерных суспензий и факторы, определяющие их чувствительность и специфичность // Дисс. канд. хим. наук. М., 1994.

81. Сапунова О.О. Тест-системы для индикации антител к брюшнотифозному ВИ-антигену на основе полимерных микросфер -Латексов // Дисс. канд. мед. наук. М., 2001.

82. Ондзе Урбен Боско. Тест-системы на основе полимерных микросфер для лабораторной диагностики инфекционного бронхита кур // Дисс. канд. вет. наук. М., 2002.

83. Schlund В., Pith Т., Lambla М. Syntheses et caracte-ristiques structurelles de latex reactifs // Macromol. Chem. Suppl. 1985.-№10/11.- pp.419-433.

84. Method of protein coupling with latex beads: Brit. Pat. №2004892, Fisher E.A., 1978.

85. Лукин Ю.В., Грицкова И.А., Праведников A.H., Бахарев В.И. Полиакролеиновые латексы: синтез, введение наполнителей и механизм формирования // ДАН СССР. 1985. - Т.285. - № 1. - С.159-161.

86. Okubo М., Shiozaki М. Production of Micron-Size Monodisperse Polymer Particles by Seeded Polymerization Utilizing Dynamic Swelling Method with Cooling Process // Polym. Int.-1993. V.30. - Iss 4. -pp.469-474.

87. Takahashi K., Nagai K. Preparation of Reactive Polymeric Microspheres by Seeded Copolymerization Using a Polymerizable Surfactant Bearingan Active Ester Group // Polymer. 1996. - V.37. - Iss.7 - pp.1257-1266.

88. Елисеева В.И. Морфология и фазовая структура частиц, ее влияние на свойства латексов и пленок. Получение синтетических латексов, их модифицирование. // М.: ЦНИИТЭ нефтехим, 1985. С.7.

89. Muroi S., Hosoi К., Hashimoto М. The Morphology of Core Shell Latex Particles. // j. Polym. Sci.: Polym. Chem. Ed. 1984.- V.22. - №.6.-pp.1365-1372.

90. Bastosgonzalez D., Hidalgoalvarez R., Delasnieves F. Electrokinetic Behavior of Polystyrene Latexes with Different Surface Groups Effect of Heat-Treatment //J. of Colloid and Interface Science. -1996. - V.177-№.2. - pp.372-379.

91. Okubo M., Shiozaki M., Tsujihiro M., Tsukuda Y. Preparation of micron-size monodisperse polymer particles by seeded polymerization utilizing the dynamic monomer swelling method // Coll. Polym. Sci. -1991.-V.269.-pp.222-226.

92. Okubo M., Izumi J., Hosotani Т., Yamashita T. Production of Micron-Sized Monodispersed Core/Shell Polymethyl Methacrylate Polystyrene Particles by Seeded Dispersion Polymerization // Coll. Polym. Sci.1997. V.275. - Iss.8. - pp.797-801.

93. Способ получения полиакролеиновых латексов: А.с. № 1565845, Бахарев В.Н., Буряков А.Н., Лукин Ю.В., Грицкова И.А., Зубов В.П., 1990.

94. Способ получения полиакролеиновых латексов: А.с. № 1565846, Бахарев В.Н., Буряков А.Н., Лукин Ю.В., Грицкова И.А., Зубов В.П., Клявиныи М.К., Роска А.С., Зицманис А.Х., 1990.

95. Ledissez С., Wong P., Mitchell К., Brooks D. Analysis of Surface Aldehyde Functions on Surfactant-Free Polystyrene/Polyacrolein Latex // Macromolecules. 1996. - V.29. - Iss.3. - pp.953-959.

96. Saito R., Ni X., Ichimura A., Ishizu K. Synthesis of core-shell type microsphere with reactive seed microspheres // J. of Applied Polymer Science. 1999. - V.69. - Iss.2. - pp.211-216.

97. Horak D., Straka J., Schneider В., Lednicky F., Pilar J. Poly(Ethylene Dimethacrylate) Particles with Poly(Glycidyl Methacrylate) Functionalities // Polymer.- 1994.- V.35. Iss.6. - pp.1195-1202.

98. Грицкова И.А., Гжива Э. Синтез полистирольных суспензий с узким распределением частиц по размерам // Polymer. 1991.- V.36. - Iss.ll-12. - рр.418-422.

99. Chern C.S., Lee С.К., Tsai Y.J. Dextran stabilized poly(methylmethacrylate) latex particles and their potential application for affinity purification of lectins// Colloid Polym. Sci. 1997.- V.275.- №9. -pp.841-849.

100. Barrett K. Dispersion Polymerization in Organic Media // Wiley, London, 1975.-456 p.

101. Ahmed S., Poehlein G. Kinetics of Dispersion Polymerization of Styrene in Ethanol. 1. Model Development// Industrial & Engineering Chemistry Research. 1997. - V.36. - Iss.7. - pp.2597-2604.

102. Ahmed S., Poehlein G.W. Kinetics of Dispersion Polymerization of Styrene in Ethanol .2. Model Validation // Industrial & Engineering

103. Chemistry Research. 1997. - V.36. - Iss.7. - pp.2605-2615.

104. Tseng C., Lu Y., El-Aasser M., Vanderhoff J. Uniform polymer particles by dispersion polymerization in alkohol // J.Polym.Sci.,Polym.Chem.Ed. 1986 .- V.24. - pp.2995-3007.

105. Tuncel A., Kahraman R., Piskin E. Monosize Polystyrene Microbeads by Dispersion Polymerization// J. Appl. Polym. Sci. 1993. - V.50. - Iss.2.-pp.303-319.

106. Dinnella C., Doria M., Laus M., Lanzarini G. Reversible Adsorption of Endopectin-Lyase to Tailor-Made Core-Shell Microspheres Prepared by Dispersion Polymerization // Biotechnology and Applied Biochemistry. -1996. V.23 -pp.133-140.

107. Kawagushi H., Koiwai N., Mita T., Ohtsuka Y., Takeuchi T., Kobayashi S. Drug-earring latices for prolonged releas of drug // J. Coll. Polym. Sci.- 1990. V.268.- pp.1167-1173.

108. Ohtsuka Y., Kawagushi H., Sugi Y. Synthesis of emulsion polymer particles with amido groups on their surface // J. Appl. Polym. Sci. 1981.- V.26.-pp.l637-1641.

109. Tamai H., Iida A., Suzana T. The syrface characterization of styrene-acrylamide copolymer latex particles and their deposition on to fibers // J. Coll. Polym. Sci. 1984. - V.262. - pp.77-83.

110. Kiminta D.M., Luckham P.F., Lenon S. The Rheology of Deformable and Thermoresponsive Microgel Particles // Polymer. 1995. - V.36.- Iss. 25. -pp.4827-4831.

111. Shirahama H., Suzava T. Adsorption of bovine serum albumin onto styrene-2-hydroxyethyl methacrylate copolymer latex // J. Coll. and Interface. Sci. 1985.-V.104. - №2. - pp.416-421.

112. Muroi S. Some physicochemical proprties of poly(ethyl acrylate)emulsion containing carboxyl groups // J. Appl. Polym. Sci. 1966.- №10. -pp.713-715.

113. Muroi S.,Hosoi K.,Ishikawa T. Characterization of carboxyl groups cntaining polymer latices // J. Appl. Polym. Sci. 1967.- №11.- pp. 19631966.

114. Способ получения полимерных суспензий с узким распределением частиц по размерам в присутствии ди-п-толил-карб-алоксифенилкарбинола: Пат. Республики Польши № 163091, Грицкова И.А., Гжива Э., 1994.

115. Грицкова И.А., Чирикова О.В., Щеголихина О.И., Жданов А.А. Необычный эффект стабилизации полимерных суспензий в присутствии карбоксилсодержащих поливинилсилоксанов // Докл.РАН. 1994. - Т.334. - №1. - С.57-61.

116. Чирикова О.В. Синтез полимерных суспензий в присутствии карбоксилсодержащих поливинилсилоксанов: Дисс. .канд.хим.наук. МИТХТ, Москва, 1994.

117. Tsai Н.А., Chen С.Н., Lee W.C. Influence of Surface Hydrophobic Groups on the Adsorption of Proteins Onto Nonporous Polymeric Particles with Immobilized Metal-Ions //J. Colloid and Interfaces Sci.-2001. -V.240. Iss. 2. - pp.379-383.

118. Zhulina E.B., Dobrynin A.V., Rubinstein M. Adsorption-Isotherms of Polyampholytes at Charged Spherical-Particles // J. Phys. Chem. B. -2001. V.105. - Iss.37. - pp.8917-8930

119. Fair B.D., Jamieson A.M. Studies protein adsorption on polystyrene latex surfaces // J. Colloid and Interfaces Sci. 1980. - V.77. - №.2. - pp.525534.

120. Грицкова И.А., Нусс П.В., Дорохова E.A., Гусев C.A., Крашенинникова И.Г., Аль-Хаварин Д.И. Адсорбция белков на полистирольных микросферах и постановка реакции латексагглютинации. // Коллоидный журн. 1994.- Т.56.- №.4. - С.491-495.

121. Грицкова И.А., Крашенинникова И.Г., Дорохова Е.А., Нусс П.В., Гусев С.А., Аль-Хаварин Д.И. Адсорбция белков на поверхности частиц полистиролметакрилатных суспензий. // Коллоидный журн. -1994. Т.56.- №.4.- С.487-490.

122. Измайлова В.Н., Ямпольская Г.П., Сумм Б.Д. Поверхностные явления в белковых системах. // М.: «Химия», 1988.

123. Toshiro Suzawa, Hiroyuki Shirahama. Adsorption of plasma proteins onto polymer latices. // Advances in Colloid and Interface Science. 1991. -V.35.- pp.139-172.

124. Гаспарян B.K. Полистирольные латексы в реакции агглютинации, приготовление и сенсибилизация // Клиническая лабораторная диагностика. Москва. -2001.- №1. С.43-45.

125. De Baillcu N., Voegel J., Sohmitt A. Adsorption of human albumin and fibrinogen onto heparin-like materials. 1. Adsorption isoterms // Colloids and Surfaces. 1985.- V.16. - pp.271-288.

126. Norde W., Fraaye J., Lyklema J. Protein adsorption at solid-liquid . interfacts: a colloid-chemical approach // AGC Symposium Series.-1987.-№343.- pp.36-47.

127. Margel S., Nov E., Fisher I. Polychloromethylstyrene Microspheres -Synthesis and Characterization// J. Polym.Sci., Polym.Chem.Ed. 1991. -V.29. - Iss 3. - pp.347-355.

128. Shahar M., Meshy lam H., Margel S. Synthesis and characteristics of microspheres of polystyrene derivatives // J. of Polym. Sci., Polym. Chem. Ed.-1986. V.24. - pp.203-213.

129. Upson D.A. Reactive functional latex polymers // J. of Polym. Sci.,

130. Polym. Symposium. 1985. - №72.- pp.45-54.

131. Suen C.H., Moravetz H. Reactive latex studies. I. Kinetics of reactions of poly(vinilbenzyl chloride) latex with water- soluble dyes // Macromol. -1984. №17.- pp.1800-1803.

132. Okubo M., Ikegami K., Yamamoto Y. Preparation of micron-size monodisperse polymer microspheres having chloromethyl group // Coll. Polym. Sci. 1989. -V.267- pp. 193-200.

133. Changhong Y.,Zhang X.,Sun Z.,Kitano H.,Ise N. Poly(styren-co-acrolein) latex particles: copolymerization and characteristics // J. of Appl. Polym. Sci. 1990. - V.40.- pp.89-98.

134. Margel S., Rembaum A. Synthesis and characterization of poly(glutaraldehyde),a potential reagent for protein immobilization and cell separation //Macromol. 1980.- №13. - pp. 19-24.

135. Margel S. Characterization and chemistry of polyaldehyde microspheres//J. of Polym. Sci., Polym. Chem. Ed. 1984. - V.22.-pp.3521-3533.

136. Schlund B., Pith T., Lambla M. Syntheses et caracte-ristiques structurelles de latex reactifs // Macromol. Chem. Suppl. 1985. -№10/11.-pp.419-433.

137. Rembaum A., Chang M., Richards J., Li M. Synthesis and characterization hydrophilic microspheres // J. Polym. Sci., Polym. Chem. Ed. 1984. - V.22. - pp.609-619.

138. Latex polymter reagent for diagnostics tests: US Pat. № 3857931 ot 11.10.1974, Hager H.J.

139. Method for covalent coupling of a protein molecules onto amide containing polymer particles: US Pat. № 4046723 ot 23.06.1977, Dorman L.C.

140. Method of a carboxylate latex producing: French. Pat. № 2 378094, Quash G., 1982.

141. Method for covalent coupling of a protein molecules onto amidecontaining polymer particles: US Pat. № 4046723, Dorman L.C., 1977.

142. Molday R.S., Dreyer W.J. New immunolatex spheres visual markers of antigen on lymphocytes for scanning electron microskopy // J. Cell. Biol. 1975.- №64. - pp.75-88.

143. Johansen L.,Nustad K.,Orstavik T.B.,Ugelstad J.,Berge A.,Ellengsen T. The new latex agglutination test kit for immunological assay // J. Immunol. Methods. 1983.-№59.-pp.255 -264.

144. Pichot C. Latex structures et functionnalises // Bulletin de la Societe Chimique de france. 1987.- №4.- pp.725-733.

145. Method for forming an amide bound between a latex and protein: US Pat. №4045384, Dorman L.C, 1976.

146. Kurzer F., Douraghi-Zadeh K. Advances in the chemistry of carbodiimides // Chem. Rev. 1967- V.67- P. 107.

147. Sundaram P. Protein carrying latices for immunoserological research// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974.- V.61. - №2.- pp.667-672.

148. Яшина Н.В. "Иммунохимические реагенты на основе окрашенных микросфер полистирольного латекса". Автореф. дис. канд. биол. наук. Москва, 1997.

149. Лабораторные методы исследования в клинике // Справочник под редакцией проф. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987. с.282-283.

150. Johansen L., Nustad К., Orstavik Т., Ugelstad J., Berge A., Ellengsen T. The new latex agglutination test kit for immunological assay // J.Immunol.Methods. 1983. - №59. - pp.255-264.

151. Wagner Т., Hsu C., Kelleher G. The preparation of immunomicrospheres for enzyme immobilization // Biochem. J.1968. -V.108. pp.892 -898.

152. Patel R., Price S. The preparation of latex particles for covalent bounding of biochemicals // Biopolymers. 1967.- Y.5.- pp.583-587.

153. Kjellqvist K. Reactive Acid Curing Waterborne Microparticles // Prog, in org. coatings. 1994. - V.24. - Iss.1-4. - pp.209-223.

154. Kitano H., Sun Z.H., Ise N. Functionalized polymer lattices. Catalitic effects of imidazole-containing lattices on hydrolyses of phenyl esters//Macromol. 1983. - V.16. - pp.1306-1310.

155. Latex polymer reagent for diagnostics tests: US Pat. № 3857931, Hager H.J., 1974.

156. Margel S. Characterization and chemistry of polyaldehyde microspheres // J. of Polym. Sci., Polym. Chem. Ed. 1984. - V.22.-pp.3521-3533.

157. Margel S., Rembaum A. Synthesis and characterization of poly(glutaraldehyde), a potential reagent for protein immobilization and cell separation // Macromol. 1980.- №13. - pp. 19-24.

158. II-Hoon Cho, Eui-Hwan Paek, Haiwon Lee, Ji Yoon Kang, Tae Song Kim, Se-Hwan Paek. Site-directed biotinylation of antibodies for controlled immobilization on solid surfaces // Analytical Biochemistry. -2007.- V.365 pp. 14-23.

159. Butler J., Nessler R., Ni L., Joshi K., Suter M., Rosenberg B., Chang J. The physical and functional behavior of capture antibodies adsorbed on polystyrene // J. Immunol. Methods. 1992. - № 24. - pp.77-90.

160. Schramm W., Paek S. Antibody-antigen complex formation with immobilized immunoglobulin // Anal. Biochem. 1992. - V.205.- pp.4756.

161. Lines R.V. Measurement of Particle Size Distribution by Autocorrelation Spectropscopy 11 Int. Conference. Polymer Latex II. London, 1985. -pp.1-10.

162. The Journal of Biological Chemistry.-1952. V.193.- pp.265-275.

163. Латекс синтетический CKC-65 ГМ (ГОСТ10564-75) // Технические условия. М: ИПК Издательство «Стандартов», 1999.

164. Вольпе Р. Аутоиммунные заболевания щитовидной железы // Болезни щитовидной железы / Пер. с англ. -М., 2000.- С.140-172.

165. Дедов И.И., Трошина Е.А., Антонова С.С. и др. Аутоиммунные заболевания щитовидной железы: состояние проблемы // Пробл. эндокринол.-2002.-№ 2.-С.7-12.

166. Справочник педиатра-эндокринолога. / Под ред. М. А. Жуковского. 1-е изд.- М.: Медицина, 1992.- С.233-235.

167. Клиническая эндокринология. Руководство / Под ред. Н. Т. Старковой. 3-е изд., перераб. и доп.- СПб.: «Питер», 2002.- С. 170176.

168. Фисфален М.Э., Де Грут Л. Болезнь Грейвса и аутоиммунный тиреоидит // Молекулярная эндокринология / Пер. с англ.; под ред. Б.Д. Вайнтрауба. -М.: Медицина, 2003.- С. 313-362.

169. Barnett L., Fujinami R. Molecular mimicry: a mechanism for autoimmune injury // FASEB J.-1992.- V.6.- pp.840-844.

170. Справочник по клинической эндокринологии // Под редакцией Холодовой Е.А. Минск, Беларусь, 1996.

171. Ruf J, Carayon Р, Lissitzky S. Various expressions of a unique antihuman thyroglobulin antibody repertoire in normal state and autoimmune disease. // Eur. J. Immunol.- 1985. V. 15. - pp268-272.

172. Gentile F., Conte M., Formisana S. Thyroglobulin as an autoantigen: what can we learn about immunopathogenicity from the correlation of antigenic properties with protein structure // Immunology. 2004.-V.112.-pp. 13-25.

173. Henry M., Malthiery Y., Zanelli E., Charvet B. Epitope mapping of human thyroglobulin. Heterogeneous recognition by thyroid pathologic sera. // J Immunol-1990. Vol.145.- pp.3692-3698.

174. Weetman A.P. Autoimmune thyroid disease: propagation and progression //Eur. J. Endocrinol. -2003. V. 148. - pp. 1-9.

175. Brix T.H., Kyvik K.O., Hegedu S.L. A population-based study of chronic autoimmune hypothyroidism in Danish twins //J. Clin. Endocrinol. Metab. -2000. V.85.-pp.536-539.

176. Brix T.H., Kyvik K.O., Christensen K., Hegedu S. L. Evidence for a major role of heredity in Graves' disease. A populationbased study of two

177. Danishcoh orts. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2001. -V.86.-pp.930-934.

178. Wan Q., Shah R, Panos J.C., Giraldo A.A., David C.S., Kong Y.M. HLA-DR and HLA-DQ polymorphism in human thyroglobulin-induced autoimmune thyroiditis. DR3 and DQ8 transgenic mice are susceptible // Hum. Immunol. 2002. - V.63. - pp.301-310.

179. Tomer Y., Greenberg D.A., Concepción E., Ban Y., Davies T.F. Thyroglobulin is a thyroid specific gene for the familial autoimmune thyroid diseases // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002. - V. 87. - pp.404407.

180. Tomer Y. Genetic dissection of familial autoimmune thyroid diseases using whole genome screening. // Autoimmun. Rev. 2002. - №.1. -pp. 198-204.

181. Nordyke R.A., Gilbert F.I., Miyamoto L.A., Fleury K.A. The superiority of antimicrosomal over antithyroglobulin antibodies for detecting Hashimoto's thyroiditis. // Arch. Int. Med. 1993. - V.153. - pp.862-865.

182. Lindberg B., Svensson J., Ericsson U.B., Nilsson P., Svenonius E., Ivarsson S.A. Comparison of some different methods for analysis of thyroid autoantibodies: importance of thyroglobulin autoantibodies. //Thyroid. 2001. - V. 11. - pp.265-269.

183. Hollowell J.G., Staehling N.W., Flanders W.D., Hannon W.H., Gunter

184. E.W., Spencer C.A., Braverman L.E. Serum TSH, T(4), and thyroid antibodies in the United States population (1988 to 1994): National Healthand Nutrition Examination Survey (NHANES III) //J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002. - V.87. - pp.489^499.

185. Dai Y.D., Rao V.P., Carayanniotis G. Enhanced iodination of thyroglobulin facilitates processing and presentation of a cryptic pathogenic peptide // J. Immunol. 2002. - V.168. - pp.5907-5911.

186. Verginis P., Stanford M.M., Carayanniotis G. Delineation of five thyroglobulin T cell epitopes with pathogenic potential in experimental autoimmune thyroiditis // J. Immunol. 2002. - V.169. - pp. 5332-5337.

187. Karras E., Carayanniotis G., Lymberi P. Induction of murine thyroiditis by a non-dominant Ek-restricted peptide of human thyroglobulin // Immunology. 2003. - V.108. - pp. 556-561.

188. Пиневич А.А. Изучение антигенных детерминант тиреоглобулина человека и животных с помощью моноклональных антител // Дисс. канд.биол. наук. Санкт-Петербург, 2007.

189. Gibney G., MacPhee-Quigleys K., Thompson В., Vedvick T. Divergence in Primary Structure between the Molecular Forms of Acetylcholinesterase // Issue of January.-1988.- V. 263, №.3. pp.11401145.

190. Cohen O., Kronman C, Velan В. Amino acid domains control the circulatory residence time of primate acetylcholinesterases in rhesus macaques (Macaca mulatta) // Biochem. J. 2004. - V.378.- pp.117-128.

191. Кузьмина Н.С., Кириллова Г.А., Гаврилова Н.Ф., Свиридов В.В., Кузнецова Г.И., Яковлева И.В., Буркин М.А., Лукин Ю.В., Генералова А.Н., Станишевский Я.М., Грицкова И.А., Прокопов

192. Змушко Е.И., Белозеров Е.С., Митин Ю.А. Клиническая иммунология. -Санкт-Петербург: «Питер», 2001. 575с.

193. Цинкернагель Рольф. Основы иммунологии. -М.: «Мир», 2008. -135с.

194. Хаитов P.M., Игнатьева Г.Л., Сидорович И.Г. Иммунология. Учебник.-М.: «Медицина», 2000. 432с.

195. Кульберг А.Я. Молекулярная иммунология. -М.: «Высшая школа», 1985.-288с.

196. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология. М.: «МИА», 1999. - 604с.

197. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Мешкова Р.Я. Клиническая иммунология и аллергология с основами общей иммунологии. -М.:, «ГЭОТАР-Медиа», 2011. 640с.

198. Коваленко А.Л., Голубев С.Ю. Иммунный ответ при вирусных инфекциях Калининград: «Калининградский государственный университет», 1998. - 67с.

199. Wasserman R.L., Capra J.D. Immunoglobulins. In: The Glycoconjugates, edited by M.I. Horowitz and W. Pigman. Academic Press, New York, 1977. - pp.323-348.

200. Hilschmann N., Craig L.C. Amino acid sequence studies with Bence Jones proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1965. - V.53. - pp. 14031409.

201. Natvig J.B., Kunkel H.G. Human immunoglobulins: Classes, subclasses, genetic variants, and idiotypes, Adv. Immunol. 1973. - V.16. - pp. 1-59.

202. Porter R.R. The hydrolysis of rabbit y-globulin and antibodies withcrystalline papain, Biochem. J. 1959. - V.73. - pp.119-126.

203. Silverton E.W., Novia M.A., Davies D.R. Three-dimensional structure of an intact human immunoglobulin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. -V.74. - pp.5140-5144.

204. Овчинников Ю. А. Биоорганическая химия. M.: «Просвещение», 1987.

205. Kusnik B.I., Tsybikov N.N. Immune mechanisms of sistem regulating the aggregate state of blood. New-York, 1998.

206. Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer, New-York, 2003.

207. Grov A. Studies on antigen preparations from Staphylococcus aureus. On the homogeneity and structure of protein A.- Acta path, microbiol. scand. 1967.-V. 69. - pp.567-575.

208. Squist J. Structure and immunology of protein A.- In: Staphylococci a. Staph. Infect./Ed. J. Jeljaszewicz. Basel: Karger, 1973. - pp.83-92.

209. Movitz J. The biosynthesis of protein A.- In: Staphylococci a. Staph. Dis./Ed. J. Jeljaszewicz.- Stuttgart: Fisher, 1976. pp.427-437.

210. Дегтева Т.К., Зубова Т.И. Характеристика препаратов белка А, выделенных из штаммов стафилококка в кн.: Физиология и биохимия микроорганизмов.- Горький, 1975. - Вып.З. - С.40-42.

211. Forsgren A. Sjoquist J. Stimulation by Staphylococcal protein A of human lymphocytes.- In: Staphylococci a. Staph. Dis./Ed. J. Jeljaszewicz.- Stuttgart: Fisher, 1976. pp.883-893.

212. Forsgren A., Nordstrom N. Protein A from Staphylococcus aureus: the biological significance of its reaction with IgG.- Ann.N.Y. Acad. Sci. -1974.-V.236. pp.252-265.

213. Тарханова И.А., Сычева И.М., Толовская K.P. и др. Сравнительный анализ взаимодействия белка А из Staphylococcus aureus с нативным, восстановленным и агрегированным IgG .- ЖМЭИ. 1979. - №6. -С.27-31.

214. Lind I. The interaction between staphylococcal protein A and IgM. In:

215. Staphylococci. Staph. Dis./Ed. J. Jeljaszewicz.- Stuttgart: Fisher, 1976.

216. Королюк A.M., Сбойчаков В.Б. Медицинская микробиология.-Учебное пособие. Санкт-Петербург, 1999.

217. Sufi R., Andrew Т., Timothy A. Specific capture of target proteins by oriented antibodies bound to tyrosinase-immobilized Protein A on a polyallylamine affinity membrane surface // Journal of Membrane Science.-2006.-V.282.-pp.311-321.

218. Schramm W., Yang T., Midgley A. Surface modification with protein A for uniform binding of monoclonal antibodies // Clin. Chem. -1987.-Vol.33.- №8. pp.1338-1342.

219. Станишевский Я.М., Грицкова И.А, Прокопов Н.И. // Способ получения антительной тест-системы для постановки реакции латексной агглютинации. Пат. № 2380708, РФ от 24.02.2010г.

220. Ребиндер П.А. Поверхностные явления в дисперсных системах.

221. Коллоидная химия. // М.: «Наука», 1978. - Т.1.

222. Измайлова В.Н., Ребиндер П.А. Структурообразование в белковых системах. М.: «Наука», 1974.

223. Gaupera Т., Selielid R. Plasma fibronectin contributes to fibronectin in tissues. Acta Chir. Scand. -1995.- V.15. №3. - pp.193-199.

224. Richards P.S., Saba T.M. Effect of endotoxin on fibronectin and Kupffer cell activitu. Hematology. -1995. -V.5. №1. - pp.32-37.

225. Matsui S, Takahashi T. Expression, localization and alternative splicing pattern of fibronectin messenger RNA in fibrosis human liver and hepatocellular carcinoma // J. Hepatol. -1999. V.27. - №5. - pp.843-853.

226. Качалов C.H. Фибронектин плазмы как показатель блокады ретикуло-эндотелиальной системы эффективность ее коррекции у больных с острыми панкреатитами. Автореф. дис. канд. мед. наук. -Хабаровск, 1990. -21 с.

227. Левитан Б.Н., Астахин А.В., Прошина П.П. Плазменный фибронектин у больных хроническим активным гепатитом и циррозом печени с признаками синдрома ДВС // Казанск. мед. журн. -1993. -№2. С.158-161.

228. Matsuda М., Yamanaka Т., Matsuda A. Distribution of fibronectin in plasma in liver diseases // Clin. Chim. Acta. -1982. -V.18. P.191-199.

229. Mosher D.F. Fibronectin and liver diseases // Hepatology. -1986. V.6. -pp.1419-21.

230. Clund C. Plasma fibronectin concentrations in patients with liver diseases // Icand. I. Clin. Lab. Invest. -1983. -V.43. -№6. pp.533-537.

231. Abdel-Rahman M.M., Nasi M.S. Plasma fibronectin and serum complement C3 levels in chronic active hepatitis following virus С infection // J. Egypt. Soc. Parasitol. -1993. -V.23. -№2. pp.579-589.

232. Васильев C.A. Плазменный фибронектин при патологии системы крови: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1988.

233. Златопольский А.Д., Мазуров В.И. Строение фибронектинов:сходство и различие. // Вопросы мед. химии.- 1985.- Т.31.-№ 6. С.2-14.

234. Титов В.Н., Сапфирова В.М. Фибронектин крови: биологическая и диагностическая значимость. Обзор // Тер. архив.- 1984.- Т.56. -С.147-149.

235. Mcdonagh J. Plasma fibronektin. Strukture and function // Hematology.-N.Y, 1985.- V.5.- pp.1-4.

236. Yamada K., Olden K. Fibronektins adhesive glycoproteins of cell surfase and blood // Nature.- 1978.- V.275.- pp. 179-184.

237. Mosseson M., Amrani D. The strukture and biological aktiveties of plasma fibronektin//Blood.-1980.- V.56. pp. 145-158.

238. Clark R., DellePella P., Manseau E. Blood vessel fibronektin increases in conjunction with endothelial cell proliferation and capillary ingrowith during wound healing // J. Invest. Dermat.- 1982.- V.79.- pp.269-276.

239. Mosseson M., Amrani D. Interactions with glicosaminoglicans "Plasma Fibronektin. Structure and function". // Hematology. N.Y, 1985.- V.5.-pp.77-98.

240. Hormann H. Iteraction with fibrinogen and fibrin "Plasma fibronektin. Strukture and funktion // Hematology.- N.Y., 1985.- V.5.- pp. 99-120.

241. Keski-Oja J., Yamada K.M. Isolation of an action-binding fragment of fibronektin // Biochem. J.- 1981.- V. 193,- pp.615-620.

242. Pande H., Shvely J. NH2 -terminal seguences of DNA-, heparin- and gelatin binding tryptic fragments from human plasma fibronectin // Arch. Biochem. Biophys.- 1982.- V.213.- pp.258-265.

243. Pierschbacher M., Ruoslahti E., Sundelin J. The cell attachment domein of fibronektin. Determination of the primary strukture // J. Biol. Chem.-1982.- V. 257.- pp. 9593-9597.

244. Protein Data Bank http://www.rcsb.org/pdb.

245. Мазуров В.И. Биохимия коллагеновых белков. М.: «Химия», 1974.

246. Вейс А. Макромолекулярная химия желатина. М.:1. Пищепромиздат», 1971.

247. Nordwig A., Hormann H., Kuhn К, Grassmann W. Waitere vergliche zum abbau des kollagens durch kollagenase. // Hoppe Seylers Z. physiol. Chem. 1961. - V. 325. - № 2. - pp. 242-250.

248. Вюстнек Р., Кречмар Г. Исследование поверхностных свойств адсорбционных слоев желатины с добавками ПАВ на границе раздела фаз воздух-раствор // Коллоид, журн. 1985. - Т.37. - №3. -С.462-470.

249. Измайлова В.Н., Ребиндер П.А. Структурообразование в белковых системах. М.: Химия, 1974.

250. Бусол Т.Ф., Письменная Г.М., Жиглецова С.К., Тарасевич Б.Н., Измайлова В.Н. Адсорбция желатины на жидких границах раздела фаз. //Коллоидн. журн. 1979.- Т. 41. - № 6. - С. 1055-1060.

251. Бусол Т.Ф. Исследование межфазных адсорбционных слоев желатины методом спектроскопии внутреннего отражения. // Дисс. . канд. хим. наук. М., 1980.

252. Измайлова В.Н., Тарасевич Б.Н., Бусол Т.Ф., Письменная Г.М. К определению межфазных адсорбционных слоев желатины методом МНПВО. // Коллоидн. журн. 1977. - Т.39. - №5. - С.958-960.

253. Измайлова В.Н. Ямпольская Г.П., Сумм Б.Д. Поверхностные явления в белковых системах. М.: «Химия», 1988. 240 с.

254. Алентьев А.Ю., Измайлова В.Н., Ямпольская Т.П. // Коллоид, журн. -1991. Т. 53. - № 4. - С.609.

255. Ребиндер П.А. Поверхностные явления в дисперсных системах. // Коллоидная химия. // Избр. тр. М.: Наука, 1978. Т.1.

256. Измайлова В.Н., Ямпольская Т.П., Туловская З.Д. // Коллоидный журнал. 1998. - Т.60. - №5. - С.598.

257. Кульман P.A. О новом пути экспериментального исследования десорбции ПАВ с жидких границ раздела фаз. // Докл. АН СССР. -1965.-Т.162.-С. 1095-1097.

258. Frisch H., Simha R. Statistical mechanics of Flexible High Polymers at Surfaces. // J. Chem. Phys. 1957. - V.27. - №13.- pp. 702-706.

259. Пчелин В.А. Поверхностные свойства белковых веществ. М.: Гизлегпром. 1951. 200 с.

260. Adams D.J., Evans М.А., Mitchell J.R., Phillips M.C., Roes P.M. Adsorption of lysozime and some acelyl derivatives at the air-water interface. // J. Polym. Sci. 1971. - Part C. - pp. 167-179.

261. Wustneck R. An experimental study of the surface rheology of adsorbed protein layers. // Colloid and Polymer Sci. 1984. - V. 262. - pp. 821-826.

262. K. Abe Vaynberg, Norman J. Wagner, and Ravi Sharma. Polyampholyte Gelatin Adsorption to Colloidal Latex: pH and Elektrolyte Effects on Acrylic and Polystyrene Latices. // Biomacromolecules. 2000. - V.l. -pp. 466-472.

263. Сакварелидзе M.A. Решающая роль природы желаьтины при химической модификации желатин-содержащих систем // Дисс. докт. хим. наук. М., 2003.

264. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. М.: «Наука», 1984.-347 с.

265. Стайер Л. Биохимия т.1. М.: «Наука», 1984. 131 с.

266. Мари Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. Т.1. М.: «Мир», 1993.-376 с.

267. Измайлова В.Н., Ямпольская Г.П., Сумм Б.Д. Поверхностные явления в белковых системах. М.: «Химия», 1988. 246 с.

268. Кабанов В.А., Петров Р.В., Хаитов P.M. Успехи использования полимеров в иммунологии. М.: «Знание», 1986. 45 с.

269. Петров Р.В., Кабанов В.А., Хаитов Р. М. и др. Способность конъюгатов бактериального полисахарида с синтетическими полиэлектролитами давать иммунизирующий эффект.-Иммунология, 1983. № 3. - С. 40-43.

270. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. // Учебник Высш. Школа. М. -1995.

271. Лобова Т.П. Усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота// Дисс. канд. биол. наук: М.- 2006.

272. Красота А.Ю. Технология тест-системы для серодиагностики парагриппа-3 крупного рогатого скота методом РИГА // Дисс. канд. вет. наук: М., 2003.

Информация о работе

Станишевский, Ярослав Михайлович
доктора химических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Создание диагностических тест-систем "Полимерная микросфера-биолиганд" медико-биологического применения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы