Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полимерные микросферы для получения биотест-систем на С-реактивный белок

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Полимерные микросферы для получения биотест-систем на С-реактивный белок"

МАРКОВ АЛЕКСАНДР ГРИГОРЬЕВИЧ

ПОЛИМЕРНЫЕ МИКРОСФЕРЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОТЕСТ-СИСТЕМ НА С-РЕАКТИВНЫЙ БЕЛОК.

Специальность: 03.00.23 - биотехнология

02.00.06 - высокомолекулярные соединения

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005г.

Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова (в. лаборатории биомедицинских технологий) и в Московской Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова (на кафедре «Химия и технология высокомолекулярных соединений»).

Научные руководители: академик РАМН и РАСХН, профессор

Быков Валерий Алексеевич доктор химических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Грицкова Инесса Александровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Василов Раиф Гаянович доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович

Ведущая организация: ГУП ГНЦ РФ Физико-Химический институт им. Л.Я. Карпова

Защита диссертации состоится 200^£г. в мин. на

заседании диссертационного Совета Д.212.204.13 в РХТУ им. Д.И. Менделеева по адресу: 125407 г. Москва, Миусская площадь, дом 9.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-информационном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

диссертационного Совета ДМ.212.204.13

кандидат технических наук И.В. Шакир

-ч

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы определяется необходимостью разработки отечественных биогест-систем для экспресс-диагностики, ориентированной на массовое применение в медицинской практике и конкурентоспособных на мировом рынке. Цель работы: синтез полимерных суспензий, частицы которых могут быть использованы в качестве носителей биолигандов при создании биотест-систем для "*" определения С-реактивного белка методом реакции латексной агглютинации.

• Определить условия синтеза полимерных суспензий с различным диаметром частиц, содержащих карбоксильные группы на поверхности.

• Исследовать коллоидно-химические свойства фосфолипидов различного происхождения для выбора условий синтеза полимерных суспензий, частицы которых содержат фосфолипиды на поверхности.

• Определить условия иммобилизации у-глобулиновой фракции 1дС и фосфолипидов на поверхность полимерных микросфер и выбрать их оптимальную концентрацию.

• Провести оценку качества биотест-систем в зависимости от природы биолиганда и полимера и их активности в реакции латексной агглютинации.

Научная новизна.

1. Сопоставлены свойства полимерных микросфер, содержащих на поверхности карбоксильные группы, полученных сополимеризацией стирола и метакриловой кислоты, и полимеризацией стирола в присутствии карбоксилсодержащего полидиметилсилоксана, НДС. Показано, что полимерные суспензии, полученные в присутствии ПДС характеризуются большей устойчивостью в процессе их синтеза, замене водной фазы на раствор буфера, при иммобилизации биолиганда и при хранении.

2. Установлено, что полимер в сочетании с фосфолипидами различного происхождения формирует межфазные слои высокой прочности на границе полимер, фосфолипиды/вода.

3. Определены условия синтеза полимерных суспензий с различными значениями диаметров частиц (0,6-2мкм) и узким распределением по размерам, устойчивых в процессе полимеризации и при хранении, частицы которых содержат на поверхности фосфолипиды различной природы.

4. Установлено, что биотест-системы, представляющие собой полимерные микросферы с физически адсорбированным на их

Задачи исследования.

поверхности фосфолипидами, определяют СРБ в биологических средах, в присутствии СаС12 и в его отсутствие, в широком интервале концентраций.

5. Впервые проведен сопоставительный анализ тест-систем, полученных с использованием полимерных микросфер различной природы, содержащих на поверхности фосфолипиды различного происхождения и у-глобулиновую фракцию 1дЭ для определения С-реактивного белка. Показано, что тест-системы, в которых полимерные микросферы содержат на поверхности яичный фосфотидилхолин, характеризуются наибольшей активностью в РЛА. Практическая значимость.

Созданы новые биотест-системы для определения С-реактивного белка методом реакции латексной агглютинации. Тест-системы представляют собой полимерные микросферы различного диаметра, на поверхности которых содержатся карбоксильные группы для связывания с функциональными группами антител к С-реактивному белку, и фосфолипиды, непосредственно взаимодействующие с С-реактивным белком. Выбраны оптимальные условия проведения реакции латексной агглютинации. Проведена апробация метода определения С-реактивного белка в сыворотках крови больных с различными патологиями. Автор защищает:

1. Синтез и свойства карбоксилсодержащих полимерных микросфер с диаметром в интервале значений 0,6-2мкм, соответствующих требованиям, предъявляемым к ним при использовании в качестве носителей биолигандов в тест-системах.

2. Коллоидно-химические свойства фосфолипидов различного происхождения.

3. Синтез полистирольных микросфер в присутствии фосфолипидов различного происхождения в качестве ПАВ со свойствами, соответствующими требованиям, предъявляемым к синтетическим носителям биолигандов.

4. Результаты изучения чувствительности РЛА при использовании биотест-систем, полученных при различных способах иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер.

5. Тест-системы для определения С-реактивного белка. Апробация работы.

Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и

обсуждены на Международной научно-технической конференции «Наука и

образование 2005» (Мурманск 6-14 апреля 2005г.)

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 113 страницах машинописного текста, включая 19 таблиц, 43 рисунка. Список литературы содержит 206 работ.

Во введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и сформулирована её цель.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ, в которой рассмотрены особенности синтеза полимерных суспензий с узким распределением частиц по диаметрам, принцип проведения реакции латексной агглютинации, основные способы иммобилизации биолигандов на поверхность полимерных микросфер, современные подходы к созданию биотест-систем для определения различных антигенов и антител в биосредах с помощью реакции латексной агглютинации.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Исходные вещества.

Стирол, технический продукт, очищали от стабилизатора по известной методике. Метакриловая кислота (МАК), стиросульфонат натрия, ССН, использовали продукты марки «ЧДА». а-(карбоксиэтил)-ш-(триметилсилокси) полидиметилсилоксан (ПДС), получен в ИНЭОС РАН. Динитрилазоизомасляной кислоты (ДАК), инициатор, очищали перекристаллизацией из метанола. T„n=101oC. Персульфат калия (ПК) - инициатор, применяли марки «ХЧ». Карбодиимид, импортный продукт фирмы «Мегск», альбумин лиофилизированный (из человеческой сыворотки), серия 89041631 фирмы Reanal.

Липиды: яичный фосфатидилхолин (ЯФХ) фирмы Биолек (Харьков), ЯФХ-липоид (Lipoid ЕЗ-100) яичный гидрогенезированный ЯФХ фирмы Липоид (Германия) и цереброзид из мозга свиньи (92%), выделенный хроматографией на силиконе, предоставлен кафедрой "Биотехнологии" МИТХТ им. М.В.Ломоносова.

С-реактивный белок, СРБ - глобулиновая фракция, полученная из козьей антисыворотки к С-реактивному белку человека с добавлением 0,02% азида натрия. Представлен МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.

Хлорид кальция (СаС12), использовали марки "ЧДА". Фосфатно-солевой буфер (ФСБ рН=7,2), готовили путем смешивания 720мл раствора (11,876г) Na2HPC>4 в 1000мл дистиллированной воды и 280мл раствора (9,078г) КН2РО4 в 1000мл дистиллированной воды. К общему объему раствора фосфатных солей (1000мл) добавляли 9г NaCI.

Вода - бидистиллат.

Методы исследования.

Полистирольные затравочные частицы получали методом безэмульгаторной полимеризации стирола при 70°С в стеклянном реакторе объемом 120 мл, снабженным теплообменной рубашкой, двухрядной стеклянной мешалкой и системой для продувки инертным газом. Скорость полимеризации изучали методом гравиметрии, точность метода 10%.

Затравочную полимеризацию мономеров проводили в том же реакторе.

Загружали в реактор полистирольную затравочную суспензию, проводили дегазацию системы, добавляли смесь мономеров, содержащую растворенный инициатор (ДАК) и набухали полистирольные частицы в мономере в течение 24 часов, затем поднимали температуру до 70° ± 0,5°С, отмечали время начала полимеризации и проводили ее 24 часа. Все эксперименты проводили до воспроизводимости результатов.

Полимерные суспензии очищали от неизрасходованных компонентов реакции методом осаждения на центрифуге с последующим диспергированием осадка в дистиллированной воде. Время центрифугирования и число оборотов подбирали индивидуально для каждого вида микросфер.

Воспроизводимость результатов оценивали по сопоставлению скорости полимеризации, средних диаметров частиц, распределению частиц по размеру и потенциалу.

Средние размеры частиц полимерных суспензий определяли методом электронной сканирующей микроскопии на электронном микроскопе S-570 «HITACHI» (Япония) и фотон-корреляционной спектроскопии на приборе Malvern 7032N (Англия). Точность измерения ± 5%.

Тест-системы "lgG-ПСТ-МАК", "lgG-ПСТ-ССН" получали по описанным в литературе методикам.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

С-реактивный белок (СРБ) — это полифункциональное соединение, выполняющее в организме функцию белка-переносчика, иммуномодулятора, является надежным индикатором ряда заболеваний, сопровождающихся острофазным ответом.

В норме содержание СРБ в сыворотке крови человека не превышает 6 мг/л. Однако при бактериальной инфекции концентрация этого белка может возрастать в сто и более раз за короткий промежуток времени (2-3 суток).

Содержание СРБ четко коррелирует с активностью процесса заболевания. Последовательное определение концентрации СРБ рекомендуется применять для наблюдения за результатами антимикробной терапии, а также для контроля возникновения послеоперационной инфекции.

В клинической практике СРБ выявляют с помощью иммуноферментного, иммунофлюоресцентного, нефелометрического или турбидиметрического методов. Все перечисленные методы, используемые для определения СРБ, требуют наличия дорогостоящего оборудования, специальных химических реагентов, в ряде случаев для выполнения анализа необходимо провести предварительную обработку исследуемых образцов.

Среди многочисленных способов тестирования сывороточных белков (иммуноглобулинов, фибронектина, альбумина и т.д.) в лабораторной экспресс-диагностике все больше внимания привлекает метод реакции латексной агглютинации (РЛА) с использованием полимерных микросфер в качестве носителей биолиганда. Относительная дешевизна такого анализа, высокая чувствительность, специфичность и воспроизводимость, простота и возможность постановки теста практически в любых условиях делают латексные диагностикумы очень удобными как при одиночных, так и при массовых исследованиях даже в небольших клинических мало оборудованных лабораториях.

Синтез полимерных суспензий с карбоксильными группами на поверхности.

При создании тест-систем часто используют полимерные микросферы с карбоксильными группами на их поверхности, которые после предварительного активирования ковалентно взаимодействуют с амино-группами биолиганда. Их широкое использование для этой цели лимитируется малым временем хранения, увеличением гидрофильности поверхности, из-за повышения содержания карбоксильных групп вследствие диффузии ионогенных фрагментов полимерных цепей к границе раздела фаз, приводящей к уменьшению адсорбции белка на их

поверхность. Для того, чтобы выбрать способ синтеза полимерных микросфер, лишенных этих недостатков, были получены полимерные микросферы, которые по способу синтеза принципиально отличались друг от друга.

3.1. Сополимеризация стирола с метакриловой кислотой.

Сополимеризацию стирола с МАК проводили при объемном соотношении мономеры/вода, равном 1:9 соответственно, в присутствии инициатора, персульфата калия, концентрация которого составляла 1% масс в расчете на стирол.

Концентрацию МАК изменяли в интервале 0,2-3% масс в расчете на стирол. Было показано, что полимерные суспензии с узким распределением по размерам, устойчивые в процессе синтеза можно получить только при проведении сополимеризации стирола с МАК, добавленной в стирол, при концентрации 0,2% в расчете на стирол.

Частицы имели сферическую форму, средний диаметр 0,65 мкм, узкое распределение по размерам и содержали на поверхности карбоксильные группы (рис.1).

Рис.1. Микрофотография частиц полимерной суспензии (ПСТ-МАК) со средним диаметром частиц, равным 0,65 мкм.

3.2.Полимеризация стирола в присутствии карбрксилсодержащего кремний-органического ПАВ.

Вторая полимерная суспензия была получена полимеризацией стирола в присутствии карбоксилсодержащего кремнийорганического ПАВ а-(карбоксиэтил)-ш-(триметилсилокси)полидиметилсилоксана, ПСТ-ПДС. ПДС нерастворим в воде и несовместим с образующимся в процессе полимеризации полистиролом, поэтому с ранних конверсий мономера он вытесняется в поверхностный слой частиц, образуя "оболочку". Методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии было показано, что на поверхности частиц содержится в 37 раз больше ПДС, чем в их объеме. Устойчивость частиц в процессе полимеризации и их узкое распределение

по размерам свидетельствуют о формировании в их межфазных слоях факторов стабильности (электростатического и структурно-механического) уже на ранних стадиях процесса (рис.2). Данные по исследованию зависимостей скорости полимеризации, диаметров частиц, их распределения по размерам и ^-потенциалу, молекулярных масс полимеров, от концентрации ПДС и инициатора позволили выбрать условия получения полимерных суспензий с требуемыми свойствами. Были получены полимерные суспензии со средним диаметром частиц (при концентрации ПДС, равной 1 и 3 % масс в расчете на стирол) равным 0,45 и 0,64мкм. Частицы имели структуру "ядро-оболочка" и содержали карбоксильные группы молекул ПДС на поверхности. Определены условия синтеза полимерных суспензий, не содержащих остаточного мономера.

В процессе полимеризации реакционная система была устойчивой, распределение частиц по размерам было узким. Полимерные суспензии сохраняли свои свойства при хранении и в буферных растворах со значениями рН в интервале 5.0-8.5, т.е. отвечали требованиям, предъявляемым к полимерным микросферам, которые используются в качестве носителей биолигандов. Свойства полимерных суспензий приведены в таблице №1.

Таблица 1.

Свойства полимерных микросфер.

№ Суспензия Средний диаметр частиц, мкм ^-потенциал Полидисперсность

1 ПСТ-МАК (0,2 % масс МАК) 0,65 -39,6 0,183

2 ПСТ-ПДС (1% масс ПДС) 0,45 -42,9 0,0133

3 ПСТ-ПДС (3% масс ПДС) 0,64 -44,3 0,118

Рис.2 Микрофотография частиц полистирольньной суспензии стабилизированной ПДС, средний диаметр частиц 0,45 мкм.

Полистирольные микросферы большего диаметра получали затравочной полимеризацией стирола, содержащего растворенный ПДС, на затравочных

полистирольных частицах со средним диаметром 1 мкм и узким распределением по размерам (рис.ЗА), синтезированных в отсутствие эмульгатора. Условия синтеза затравочных частиц и проведения затравочной полимеризации

приведены в табл.2 и табл.3.

Таблица 2.

Рецепт проведения затравочной полимеризации стирола в присутствии ПДС.

№ Компоненты Количество, масс, части

1 Полистирольная суспензия (на массу полимера) 100

2 Стирол 20

3 Вода 2,400

4 ПДС 0,906

5 Динитрил азоизомасляной кислоты, ДАК 0,72

Таблица 3.

Рецепт синтеза затравочной полистирольной суспензии.

№ п/п Наименование Количество, масс, часть

компонента

1 Стирол 100

2 Вода 500

3 Персульфат калия 0,2% масс в расчете на в.ф.

Затравочную полимеризацию инициировали динитрилом азоизомасляной кислоты и проводили в течение 22-24 часов. Распределение частиц по размерам и ^-потенциалу практически не изменилось, средний диаметр частиц увеличился до 1,4 мкм (рис.ЗВ).

Полистирольные суспензии были устойчивы в процессе синтеза, при хранении и в буферных растворах. Они были предложены для использования в качестве носителей биолигандов при создании биотест-систем.

Рис.3. Микрофотографии частиц полистирольных суспензий:

А - Затравочные полимерные частицы, полученные методом бвзэмульгаторной полимеризации, В - полимерные микросферы, полученные затравочной полимеризацией стирола в присутствии ПДС.

3.3. Коллоидно-химические свойства липидов различной природы.

Известно, что липиды являются поверхностно-активными веществами и используются в качестве эмульгаторов для синтеза полимерных суспензий.

В то же время, фосфатидилхолины (ФХ), входящие в состав полярных липидов, обладают способностью специфически взаимодействовать с С-реактивным белком.

Эти два свойства липидов интересно было объединить при синтезе полимерных микросфер, используемых при создании тест-систем для определения С-реактивного белка методом реакции латексной агглютинации, РЛА. В этом случае необходимо, чтобы липиды, как ПАВ, стабилизировали полимерные микросферы, и в то же время, чтобы на поверхности полимерных микросфер липид содержался в конформации, удобной для аффинного взаимодействия с биолигандом.

Для исследований были выбраны липиды, представляющие собой смесь фосфолипидов растительного происхождения (ЛР), смесь фосфолипидов растительного происхождения и рапсового масла (ЛРМ), яичный фосфатидилхолин (ЯФХ), гидрогенизированный ФХ (яг ФХ), цереброзид из мозга свиньи (ЦБ).

Известно, что липиды, несмотря на их структурное многообразие, построены по единому принципу. В состав липидных молекул входят длинные углеводородные остатки, отличающиеся низким сродством к воде, липофильные радикалы, и компактные группы, полярные головки молекул липидов, которые и формируют границу раздела между гидрофобной фазой и водой.

Для выбора условий синтеза полистирольных суспензий в присутствии липидов, прежде всего необходимо было знать их коллоидно-химические свойства, которые в литературе представлены ограничено.

Исследования были начаты с изучения поверхностно-активных свойств

липидов. На рис.4 приведены изотермы межфазного натяжения с*^ на границе

ксилольный раствор липида / вода.

Видно, что межфазное натяжение на границе ксилольный раствор липида/вода понижается при увеличении концентрации липида и достигает минимального значения, равного 29,2мН/м - 24,9мН/м в зависимости от природы липида.

По изотермам адсорбции были определены критические концентрации ассоциации (ККА), поверхностная активность(С) и рассчитаны величины предельной адсорбции, Гтах, площади, занимаемые одной молекулой липида в насыщенном адсорбционном слое, Бть Из данных, приведенных в табл.4, видно, что эти значения существенно различны для исследованных видов липидов. Наименьшим

значением ои2 характеризуются ЯФХ и ЯгФХ, они же отличаются более высокой поверхностной активностью.

Таблица 4.

Эффективные адсорбционные характеристики липидов.

Название Характеристика

ат|„, мН/м (при С=1,1%масс) ККА, %масс вш, мН*мг/ моль Гш,х*Ю0, моль/м 8т1„*10го, м

Гидрогенизированный ЯгФХ 25,1 0,02 10,0 4,8 35

Липид из рапса (ЛР) 28,4 0,34 2,4 3,0 50

Липид из рапса, содержащий масло (ЛРМ) 29,4 0,68 0,91 2,0 80

Яичный фосфатидилхолин (ЯФХ) 24,9 0,03 14,2 4,6 35

Цереброзид 26,0 - - - -

■ Все липиды были нерастворимы в воде, а эмульсии стирола, полученные в их присутствии, мгновенно расслаивались после прекращения перемешивания.

Было высказано предположение о том, что образующийся в процессе полимеризации в межфазном слое частиц полимер, будет упрочнять межфазный слой.

Рис 4. Изотермы межфазного натяжения ксилольных растворов липидов на границе с водой. (1 - пипид из репса и рапсового масла (ЛРМ); 2 - липид из рапса (ЛР), 3 -яичный фосфатидилхолин (ЯФХ), 4 - гидрогенизированный ягФХ, 5 - цврвброзид)

В условиях, моделирующих межфазную границу раздела фаз в полимерно-мономерных частицах, были изучены реологические свойства межфазных слоев липидов. Для этого в статических условиях (без перемешивания) на водный раствор осторожно поочередно наслаивали толуольные растворы липидов различной концентрации и толуольный раствор липида и полистирола молекулярной массы Mw=3,8-105. Концентрация полистирола в ксилоле составляла 4% масс. Время формирования межфазного слоя было равно 120 мин.

Результаты по изучению кинетики нарастания предельного напряжения сдвига межфазных слоев липидов на границе ксилольный раствор липида разной концентрации/вода и ксилольный раствор липида и полимера/вода на примере межфазного адсорбционного слоя ЯФХ приведены на рис.5.

При малых временах существования межфазной поверхности предельное напряжение сдвига MAC низкое и составляет величину порядка 10"3 мН/м.

При увеличении концентрации липида до 4 % масс, величина предельного напряжения сдвига межфазных слоев заметно возрастает (до 1,80-10"1 мН/м), что обусловлено структурированием в межфазном слое. Еще более существенное возрастание предельного напряжения сдвига MAC (более чем на 2 порядка), наблюдается в присутствии полимера. Зависимости предельного напряжения сдвига межфазных слоев липидов от времени в присутствии полимера (рис. 5) приведены для одной скорости деформирования (¡=0,015 с'1).

-М-I"

—1-ф**

.....

/«"T

„•ет-ггг 3 д

i У

—;--N

V)

Рис. 5. Кинетика нарастания прочности межфазного адсорбционного слоя ЯФХ на границе ксилольный раствор ЯФХ/вода при различных концентрациях ЯФХ и ксилольный раствор ЯФХ и полимера/вода. 1. 0,5% масс; 2. 1,0% масс., 3. 4,0% масс, 4. 4,0% масс + 4,0% полистирола

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что при использований липида в качестве ПАВ, они совместно с полимером будут формировать прочные межфазные адсорбционные слои на поверхности полимерно-мономерных частиц, обеспечивая им стабильность в процессе гетерофазной полимеризации мономеров и узкое распределение по размерам.

Подтверждением этих предположений являются приведенные ниже данные (рис.6) по распределению частиц по размерам в ходе гетерофазной полимеризации стирола в присутствии липида (на примере ЯФХ). Видно, что размеры частиц практически не изменяются в процессе синтеза.

1 2 3

Рис.6. Изменение размеров частиц полистирольной суспензии, полученной при полимеризации стирола в эмульсии, стабилизованной яФХ, взятом в количестве 1% масс в расчете на мономер, от конверсии стирола. Конверсия стирола,%: 1 -15%; 2-50%; 3-100%.

3.4.Полимеризация стирола в присутствии липидов различного происхождения.

Полимеризацию стирола проводили при объемном соотношении стирол/вода, равном 1:9 соответственно, и концентрации КгЭгОв и фосфолипида, равной 1% масс в расчете на стирол. В присутствии всех выбранных для исследований фосфолипидов полимеризация стирола протекала практически с одинаковой скоростью (0,32-0,5%/ мин) до полной конверсии мономера за 8 часов в дилатометре и за 20 часов в реакторе емкостью 1л.

Независимо от природы фосфолипида, в процессе полимеризации образовывались полимерные микросферы с узким распределением по размерам и близкими значениями диаметров (0,5-0,6мкм) (рис.7), которые сохраняли свои свойства в слабых растворах электролитов и при хранении в течение 6 месяцев.

Полистирольные микросферы с большим диаметром 1,56 мкм и узким

распределением по размерам, получали затравочной сополимеризацией стирола со стиролсульфонатом натрия на полистирольных затравочных частицах, инициированной динитрилом азоизомасляной кислоты, в присутствии липидов в качестве ПАВ.

Затравочную полимеризацию проводили в присутствии яичного фосфатидилхолина, липоида и цереброзида, выбор которых был основан на том, что они содержали в своем составе в большем количестве, чем другие липиды, фосфатидилхолин, аффинно взаимодействующий с С-реактивным белком.

Рецепты проведения затравочной полимеризации стирола приведены в табл. 5, а коллоидно-химические свойства суспензий - в табл. 6, распределение частиц по диаметру и ^-потенциалу - на рис.7.

Таблица 5.

Рецепты проведения затравочной полимеризации стирола.

№ Компоненты Количество, масс, части

1 Затравочная полистирольная суспензия (на массу полимера) 100,0

2 Стирол 20,0

3 Вода 2400,0

4 Цереброзид 1,428

5 Липоид 1,428

6 Яичный фосфатидилхолин 1,428

7 Динитрил азобисизомасляной кислоты 0,72

8 Додецилсульфат натрия 2,4

9 Стиролсульфонат натрия 1,0

10 Поливинилпирролидон 1,0

11 Персульфат калия 0,31

Частицы всех полимерных суспензий были использованы для получения биотест-сисистем.

Таблица 6.

Коллоидно-химическая свойства полимерных суспензий.

Полимерная суспензия, полученная в присутствии: Средний диаметр частиц, мкм [МаС1], при которой полимерные суспензии устойчивы

Цереброзида 1,342 0,10

Липоида 1,308 0,25

ЯФХ 1,354 0,20

; Detector Angle (deg). 90.00 Wavelength (nm). 633 0

Result

Quality Factor Pass

X Average Mean(nm)- 1566 4 Po.yii.speisity 0.16

Intensity Mean (nm). 152,9.6 Volume Mean (nm). 1639 1 Analysis Mode. Exponential

intensity

Volume

Siio datnbul-on(3)

Sbo (£stnlxition[s1

:1л ^"сДПй1;;

м )'■ • -■ -у, - i..

50100 50010» Pfametef (nm)__

5 10 50 100 5001000 Diamatsr (nm)

Рис.7а. Распределение по размерам частиц полистирольной суспензии, полученной в присутствии ЯФХ.

S'ZCi.-m) ' Intpnsily Volume Numbo

707 ' OD 00 00

/59 0 00 00 00

8« 0 00 00 0.0

073 0 0.0 0.0 0.0

936 Э 0 0 00 00

!Q04 I 0.0 00 00

1076 а 00 00 01

11650 04 05 10

1238 7 26 5,2 7,8

1328 6 64 11 4 15 8

1424 8 КО 19,9 21 8

1528 0 62 8 20 0 27 4

1038 8 8.5 23 0 19 3

1757 6 3.6 76 65

1884 9 1 4 1 8 1 0

2021 8 00 06 03

21681 оо 00 0.0

2325 2 00 00 00

2493 8 со 00 0.0

2674 5 0,0 0.0 00

2868,4 00 0.0 00

3076 3 0.0 00 00

3293 3 0.0 00 00

3536 4 00 00 i 0 0

Result

Quality rector. Poss Z Average Mean(nm)' 1582. <1

Polydispersity. 0 20

Peak Analysis by Intensity

Peak Агез Moan Wialli 1 100 0 1616 3 130 6

1 Peak Analysis by volume

Peak Area Mean Width J 1 100 0 1520 0 333.1 I

| Peak Analysis by г

i Peak Area Mean Width 1 1 100 0 1466.3 301 8

System

Instrument Type Temperature (X)' Count rate (kCps) Coll Тура.

Oetector Angle (deg) Wavelength (nm)

ZetBSize-25.7 41 0

ZET5110 90 00

6330

Intensity Mean (nm). 1515 3 Volume Mean (nm). 1520.0 Analysis Mode: Exponential

Intensity

Volume

Size distributors)

Size distritnrtjoiiis)

, . .. Ч-'МДЗГ^-'Ч''-

':-W'fÄKv ■! PVJiiv l-

V' \

i'.t',vi"i-;i •» " 1 «v. «<

t . 4.«. r . n««» i,- . y «f.?¡.^ ..,1.4

1 < -.'J*'

■ ■ Л-:,:«

I ■ i:

i^v.tq.

________,____________,.v.a ¿¿га

■ ■ ■ . .^Y^i; ¡V -• •,<.;. >; .«fc; >; >; -, ->i : чл-)" «".fcsiO, у-.' f ;

■t!i.v,r \i '1.1 1 i^rr^Att-,;''

1 'l^S!;!

,'ь ),| у ,i,.,i?It|—1„,■„,.'.. ,..,,:),,■,;„,|,ft,i«,Y.. 5 to 50 ICO 5001 COO 0,amotw (nm)

fi'As -->i SttSt',--'•'"г. ¡t • r■; -'¡\А - г 1 Uv'"'i,i \о."V''f't

v > > .'i;,,' '¡г-» « . 1 ' , 1

5 10 и too Diametc (nni)

Рис.76. Распределение по размерам частиц полистирольнои суспензии, полученной в присутствии цереброзида.

3.5.Получение тест-систем с использованием в качестве носителей биолигандов полимерных микросфер с карбоксильными группами на поверхности.

Конъюгаты 1д6-ПСТ-МАК и 1дЗ-ПСТ-ПДС получали при концентрации 1дв в широком диапазоне значений: от 10"9 до 2 мг/мл, что было необходимо для нахождения оптимальных условий проведения РЛА.

на поверхность полимерных микросфер ПСТ-МАК и ПСТ-ПДС иммобилизировали путем ковалентного связывания функциональных групп полимера и биолиганда. Оптимальная концентрация биолигандов во всех случаях составляла 1 мг/мл.

Результаты определения СРБ с использованием полученных тест-систем приведены в таблице 7. Видно, что во всех случаях СРБ можно было определить в широком интервале концентраций: 380-1,5мкг/мл.

Концентрация ПДС, использованного при синтезе полимерных микросфер не влияет на чувствительность РЛА, практически не оказывает сильного влияния на ^-потенциал, хотя и заметно влияет на средний диаметр частиц.

Таблица 7.

Результаты исследования биотест-систем в РЛА.

мкм Тест-системы Концентрация СРБ, мкг/мл

380 190 100 50 25 13 6 3 1,5 0,7 0.3 0,15 0,07 0.03

0,65 ДО-ПСТ-МАК + + + + + + + + +

0,45 1дО-ПСТ-ПДС (1% масс ПДС) + + + + + + + + +

0,65 1дЗ-ПСТ-ПДС (3% масс ПДС) - + + + + + + + +

1,4 1дв-ПСТ-ПДС - - + + + + + + + + + + + -

Примечание. Наличие агглютинации отмечено знаком"+", ее отсутствие -

Для установления диагностической значимости биотест-систем была проведена их апробация при определении СРБ в сыворотках крови больных с различными патологиями. Тестирование данных сывороток на наличие СРБ проводили также рутинным методом радиальной иммунодиффузии (РИД). Оказалось, что результаты определения концентрации СРБ в сыворотках крови больных методом РЛА хорошо коррелируют с данными рутинного метода РИД, причем коэффициент корреляции колеблется от 0,91 до 0,97 (р<0,001).

Предпочтительными оказались тест-системы, полученные с использованием в качестве носителя биолиганда полимерных микросфер ПСТ-ПДС, так как они сохраняют свои свойства при хранении более 6 месяцев.

Таким образом, биотест-системы, включающие полимерные микросферы ПСТ-МАК и ПСТ-ПДС разного диаметра и 1дв-фракцию к СРБ, могут быть рекомендованы для определения СРБ в крови человека.

Получение тест-систем для определения СРБ с использованием полимерных микросфер, содержащих на поверхности фосфолипиды различного происхождения.

Биотест-системы получали непосредственно в процессе синтеза полимерных микросфер в присутствии липида (1 вариант) или путем физической адсорбции липида на поверхность ранее синтезированных полимерных микросфер (2 вариант). Исследовали 6 типов тест-систем полимерная микросфера-липид, «ЛМ-липид»: по 2 варианта для каждого лиганда (яФХ, ягФХ и цереброзид).

Было показано, что полимерные микросферы, полученные при добавлении ЯФХ и цереброзида в процессе их синтеза, определяют СРБ в интервале концентраций 6-25 мкг/мл, а полученные в присутствии ягФХ и лилоида-СРБ не выявляли.

Все биотест-системы, в которых полимерные микросферы содержали на поверхности физически адсорбированный липид, определяли СРБ в диапазоне его концентраций 1,56 - 100 мкг/мл.

СРБ является кальций-зависимым белком. Каждая его субъединица связывает два иона Са2+ (молекула СРБ состоит из пяти субъединиц), при этом изменяется его конформация, что облегчает взаимодействие ее с лигандом. Поэтому, все тест-системы исследовали и в присутствии соли кальция.

Предварительно было показано, что добавление 0,01 М СаСЬ в ФСБ не отражается на устойчивости исследуемой системы.

Полученные результаты, показали, что первый вариант конъюгатов «ПМ-липид» (добавление липида в процессе синтеза) дает значительно худшие результаты при выявлении СРБ нежели второй (физическая адсорбция липида на поверхность полимерных микросфер). Тест-системы полимерные микросферы-яФХ были наиболее эффективными в сравнении с тест-системами полимерные микросферы-ягФХ и полимерные микросферы-цереброзид. Добавление ионов Са2+ при получении биотест-систем во всех случаях расширяет диапазон обнаружения СРБ.

Проведенные исследования показали, что эффективность РЛА зависит от количества и природы липидов на поверхности полимерных микросфер, возможных

стерических препятствий к взаимодействию липида с СРБ и сродства липида к связывающему центру СРБ. Так, при получении биотест-систем полимерная микросфера-биолиганд в процессе полимеризации стирола в присутствии липида в качестве ПАВ, липидные молекулы распределяются между поверхностью и объемом полимерных микросфер, поэтому их поверхностная концентрация меньше, чем при физической адсорбции лигандов на готовые полимерные микросферы. Кроме того, поверхностная концентрация липидов может уменьшатся из-за возможного гидролиза сложноэфирных и гликозидных связей в условиях полимеризации (70°С, рН=2). При получении тест-систем путем физической адсорбции биолиганда на поверхность микросфер важную роль играют коллоидно-химические свойства липидов. Так, ненасыщенный яФХ обладает большей поверхностной активностью к поверхности полистирольных микросфер, чем молекулы насыщенного ягФХ, следовательно, концентрация яФХ на поверхности полистирольных микросфер больше, чем ягФХ. Не исключено, что важную роль играет разница в температуре фазового перехода у этих лигандов. Так, для яФХ она лежит в районе 0°С, и поэтому при физиологических температурах этот фосфолипид образует надмолекулярные структуры, находящиеся в жидкокристаллическом состоянии, в котором молекулы способны к латеральной диффузии, с возможной подстройкой к активным центрам белка. Температура фазового перехода насыщенного ягФХ выше 50°С, т.е. при температуре проведения опытов его молекулы в составе надмолекулярных комплексов образуют плотные структуры, в которых полярные фосфорилхолиновые головки молекул липидов плотно прилегают друг к другу, что, создает стерические препятствия к их взаимодействию с СРБ.

Так как константа связывания СРБ с галактозсодержащими лигандами меньше, то и тест-системы с цереброзидом продемонстрировали меньшую чувствительность в титрах по сравнению с яФХ.

Таким образом, яФХ, ягФХ и цереброзид при иммобилизации их на поверхность полистирольных микросфер образуют тест-системы, способные в присутствии СаС12 определять СРБ в широком интервале концентраций. Наилучшие результаты показали тест-системы, полученные физической адсорбцией ненасыщенного яФХ на полистирольные микросферы.

выводы

1. Созданы биотест-системы для определения СРВ в широком диапазоне концентраций в биологических жидкостях (1:64-1:1042). Биотест-ситемы обладают высокой чувствительностью, нижний предел определения СРВ составляет менее 1мкг/мл. Это дает возможность использовать в микроколичествах анализируемую биологическую жидкость и применять высокое разведение, уменьшая неспецифичность реакции.

2. Определены условия синтеза полимерных суспензий с заданным комплексом свойств (узкое распределение по размерам, устойчивость в буферных растворах, в процессе иммобилизации биолиганда и при хранении) с различным диаметром частиц, содержащих в межфазном слое карбоксильные группы и полярные фосфолипиды - для ковалентного связывания и специфического взаимодействия с С-реактивным белком.

3. Показано, что полистирольные микросферы, полученные в присутствии карбоксилсодержащего кремнийорганического ПАВ, характеризуются более высокой устойчивостью в процессе синтеза, при иммобилизации биолиганда и при хранении, чем синтезированные сополимеризацией стирола и метакриловой кислоты.

4. Изучение коллоидно-химических свойств липидов различного происхождения показало, что наиболее высокой поверхностной активностью характеризуется яичный фосфатидилхолин, прочность межфазных слоев липидов существенно возрастает с повышением их концентрации и в присутствии полимера.

5. Выбраны оптимальные концентрации у-глобулина и фосфолипида, иммобилизированных на поверхности полимерных микросфер, обеспечивающие высокую чувствительность биотест-систем. Показана эффективность фосфолипидов в качестве биолигандов при создании тест-систем на С-реактивный белок.

Список работ, опубликованных по теме.

1. Грицкова H.A., Марков А.Г., Станишевский Я.М., Быков В,А.,, Прокопов H.H., Хачатурян И.В., Мягкова М.А., Каплун А.П., Скопинцев В.Б. Исследование свойств полимерных микросфер различной природы, используемых при создании тест-систем для определения С-реактивного белка // Журнал биомедицинские технологии и радиоэлектроника. - Москва - 2005. -Вып.1-2'2005, стр. 69-75.

2. Марков А.Г., Грицкова И.А., Станишевский Я.М., Быков В.А., Мягкова М.А., Каплун А.П., Скопинцев В.Б., Прокопов Н.И. Определение С-реактивного белка в сыворотке крови больных методом латексной агглютинации с использованием полимерных микросфер различной природы// Биомедицинские технологии. - Москва -2004. - Вып. 22. - С.113-121.

3. Марков А.Г., Станишевский Я.М., Грицкова И.А., Каплун А.П., Мягкова М.А., Прокопов Н.И., Скопинцев В.Б., Ветрова В.В. Полимерные микросферы, содержащие в поверхностном слое полярные липиды, для определения С-реактивного белка II Биомедицинские технологии. - Москва - 2004. - Вып. 22.

' - С.42-51.

4. Григорьевская И.И., Сидоренко С.Н., Левачев С.М., Марков А.Г., Грицкова И.А. Изучение свойств полимерных суспензий для создания тест-систем. // Актуальные проблемы экологии природопользования. Выпуск 6. 4.1. Сборни* научных трудов. Москва. Издательство РУДН 2004. С 397-399. [П/,

Принято к исполнению 02/09/2005 Исполнено 06/09/2005

Заказ № 1011 Тираж: 100 экз

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

РНБ Русский фонд

2007-4 11792

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Марков, Александр Григорьевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 СИНТЕЗ ПОЛИМЕРНЫХ МИКРОСФЕР

ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1.2. РЕАКЦИЯ ЛАТЕКСНОЙ АГГЛЮТИНАЦИИ.

1.3. ИММОБИЛИЗАЦИЯ БИОЛИГАНДОВ

НА ПОВЕРХНОСТЬ ПОЛИМЕРНЫХ МИКРОСФЕР

ГЛАВА 2.0БЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1.ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА.

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 37 2.2.1 .ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИМЕРНЫХ СУСПЕНЗИЙ И ОЦЕНКА ИХ СВОЙСТВ. 37 2.2.2. ИММОБИЛИЗАЦИЯ БИОЛИГАНДОВ

НА ПОВЕРХНОСТЬ ПОЛИМЕРНЫХ МИКРОСФЕР.

2.2.3 РЕАКЦИЯ ЛАТЕКСНОЙ АГГЛЮТИНАЦИИ (РЛА).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1.СОПОЛИМЕРИЗАЦИЯ СТИРОЛА С МЕТАКРИЛОВОЙ КИСЛОТОЙ.

3.2. ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ СТИРОЛА В ПРИСУТСТВИИ

КАРБОКСИЛСОДЕРЖАЩЕГО КРЕМНИЙОРГАНИЧЕСКОГО ПАВ.

3.3. КОЛЛОИДНО-ХИМИЧЕСКИЕ

СВОЙСТВА ЛИПИДОВ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ.

3.4. ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ СТИРОЛА

В ПРИСУТСТВИИ ЛИПИДОВ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ.

3.5. ПОЛУЧЕНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

В КАЧЕСТВЕ НОСИТЕЛЕЙ БИОЛИГАНДОВ ПОЛИМЕРНЫХ

МИКРОСФЕР С КАРБОКСИЛЬНЫМИ ГРУППАМИ НА ПОВЕРХНОСТИ.

3.6. ПОЛУЧЕНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СРБ

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИМЕРНЫХ МИКРОСФЕР, СОДЕРЖАЩИХ НА ПОВЕРХНОСТИ ФОСФОЛИПИДЫ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ. 90 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Полимерные микросферы для получения биотест-систем на С-реактивный белок"

В настоящее время в клинической практике широкое применение находят методы иммунохимического анализа с использованием тест-систем, работающих на основе реакции латексной агглютинации. Это прежде всего связано с возможностью быстрого определения биологически активных молекул, играющих значимую роль в патогенезе различных заболеваний и контроле эффективности проводимой терапии.

Биотест-системы, представляющие собой конъюгат полимерная макросфера-биолиганд, просты в исполнении, не требуют специального оборудования и обладают высокой чувствительностью.

Преимущества полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов перед частицами биологического происхождения (бактерии, эритроциты и др.) к настоящему времени очевидны. Они состоят в возможности получения полимерных суспензий с определенным диаметром частиц, узким распределением их по размерам, функциональными группами на поверхности, способных ковалентно связываться с функциональными группами биолиганда, в сохранении устойчивости и свойств в растворе электролита, на всех стадиях получения тест-систем и при хранении.

Их практическое применение намного опередило научные исследования в области синтеза полимерных микросфер, пригодных для использования в этом качестве, что и до сих пор, к сожалению, является причиной их выбора методом эмпирического поиска, то есть методом проб и ошибок. Кажущаяся на первый взгляд простота перехода от биологических носителей к синтетическим в реальности не подтвердилась. В первую очередь не подтвердилось мнение об универсальности полимерных бионосителей, то есть возможности их использования для различных назначений. Многочисленные исследования как в области синтеза полимерных микросфер, так и их использования в качестве носителей биолигандов, позволяют думать, что очень важную роль в их применении в этом качестве играет строение межфазного слоя частиц. Поэтому актуальны новые исследования в области синтеза полимерных суспензий с определенным строением межфазного слоя частиц, включающих функциональные группы на поверхности полимерных частиц или специфические лиганды для взаимодействия с биолигандом.

Данная работа является частью фундаментальных исследований, проводимых в этом направлении, и ставит своей целью создать полимерные суспензии, частицы которых могут быть использованы в качестве носителей биолигандов для определения С-реактивного белка методом реакции латексной агглютинации.

С-реактивный белок (СРБ) - это полифункциональное соединение, выполняющее в организме функцию белка-переносчика, иммуномодулятора [1], является надежным индикатором ряда заболеваний, сопровождающихся острофазным ответом. Это - бактериальная инфекция, воспалительные заболевания (ревматоидный артрит, системный васкулит и.т.д.), инфаркт миокарда, травмы и другие заболевания. Как правило, в начале возникновения патологического процесса концентрация СРБ в сыворотке крови резко повышается. В этом случае важно использовать методы экспресс-определения белка. В клинической практике СРБ выявляют с помощью иммуноферментного [2], иммунофлюоресцентного [3], нефелометрического или турбидиметрического [4] методов. Все перечисленные методы, используемые для определения СРБ, требуют наличия дорогостоящего оборудования, специальных химических реагентов, в ряде случаев для выполнения анализа необходимо провести предварительную обработку исследуемых образцов. Указанные недостатки затрудняют использование перечисленных методов для скрининговой клинической практики. В этом плане перспективны биотест-системы, представляющие собой полимерные микросферы с иммобилизованными на их поверхности биолигандами.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Марков, Александр Григорьевич

выводы

1. Созданы биотест-системы для определения СРВ в широком диапазоне концентраций в биологических жидкостях (1:64-1:1042). Биотест-ситемы обладают высокой чувствительностью, нижний предел определения СРВ составляет менее 1мкг/мл. Это дает возможность использовать в микроколичествах анализируемую биологическую жидкость и применять высокое разведение, уменьшая неспецифичность реакции.

2. Определены условия синтеза полимерных суспензий с заданным комплексом свойств (узкое распределение по размерам, устойчивость в буферных растворах, в процессе иммобилизации биолиганда и при хранении) с различным диаметром частиц, содержащих в межфазном слое карбоксильные группы и полярные фосфолипиды - для ковалентного связывания и специфического взаимодействия с С-реактивным белком.

3. Показано, что полистирольные микросферы, полученные в присутствии карбоксилсодержащего кремнийорганического ПАВ, характеризуются более высокой устойчивостью в процессе синтеза, при иммобилизации биолиганда и при хранении, чем синтезированные сополимеризацией стирола и метакриловой кислоты.

4. Изучение коллоидно-химических свойств липидов различного происхождения показало, что наиболее высокой поверхностной активностью характеризуется яичный фосфатидилхолин, прочность межфазных слоев липидов существенно возрастает с повышением их концентрации и в присутствии полимера.

5. Выбраны оптимальные концентрации у-гл°булина и фосфолипида, иммобилизированных на поверхности полимерных микросфер, обеспечивающие высокую чувствительность биотест-систем. Показана эффективность фосфолипидов в качестве биолигандов при создании тест-систем на С-реактивный белок.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По способу синтеза полимерные суспензии, используемые для получения тест-систем, принципиально отличались друг от друга. Первая, ПСТ-МАК полимерная суспензия, была получена сополимеризацией стирола с метакриловой кислотой. Фрагменты сополимерных цепей, содержащие звенья метакриловой кислоты, диффундировали к границе раздела фаз и ориентировались карбоксильными группами в сторону водной фазы. Из-за высокой молекулярной массы сополимера (Мг|=500000) диффузия сополимерных цепей к границе раздела фаз протекала во времени. Частицы имели сферическую форму, средний диаметр 0,65 мкм, узкое распределение по размерам и содержали на поверхности карбоксильные группы.

Вторая полимерная суспензия, ПСТ-ПДС, была получена полимеризацией стирола в присутствии карбоксилсодержащего кремнийорганического ПАВ. ПДС нерастворим в воде и несовместим с образующимся в процессе полимеризации полистиролом, поэтому с ранних конверсий мономера он вытесняется в поверхностный слой частиц, образуя "оболочку". Устойчивость частиц в процессе полимеризации и их узкое распределение по размерам свидетельствуют о формировании в их межфазных слоях факторов стабильности (электростатического и структурно-механического) на ранних стадиях процесса. Средний диаметр частиц при концентрации ПДС, равной 1 и 3 % масс в расчете на стирол, составлял 0,45 и 0,64 мкм соответственно.

Полимерные микросферы третей полимерной суспензии, ПСТ-ССН, были получены затравочной полимеризацией стирола и стиролсульфоната натрия, на затравочных полистирольных частицах со среднем диаметром 1,56 мкм. На поверхность полимерных микросфер адсорбировали биолиганд.

Все синтезированные полимерные микросферы отвечали требованиям, предъявляемым к полимерным носителям биолигандов:

• узкое распределение по размерам (РЧР), что делает возможным определять площадь поверхности носителя и устанавливать степень иммобилизации биолигандом;

• содержание функциональных групп на поверхности полимерных частиц для ковалентного связывания с функциональными группами биолига нда;

• индивидуальность частиц в буферных растворах (отсутствие спонтанной агрегации частиц).

Оптимальную концентрацию 1дв определяли по чувствительности РЛА при использовании тест-систем с разной концентрацией биолиганда на поверхности полимерных микросфер и во всех случаях составляла 1 мг/мл.

Результаты определения СРВ с использованием всех полученных конъюгатов приведены в табл.1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Марков, Александр Григорьевич, Москва

1. Yen S.P.S.,Rembaum A., Molday R.W., Dreyer W. Polymer particles for immunological assay // In: Emulsion polymerization; ACS Sumposium Series.-ACS, Washington.- 1976.-p.236-257.

2. The method for preparation of functional polymer lattices and their using for immunological assay: US Pat. 4 060 597, МКИ С 08 F 116/34, 2/22, L 89/00 / Sato Y„ Weda 5.-заявл.9.03.1977, опубл. 14.11.1977.

3. Margel S., Rembaum A. Synthesis and characterization of poly(glutaraldehyde), a potentol reagent for protein immobilization and cell separation // Macromol -1980. -N13-p. 19-24.

4. Margel S., Polyaldehyds microspheres as probes for cell membrane //J.Eng.Chem.Prod.Res. -1982.-v.21.-N3.-p.343-348.

5. Nustad K. Johansen L., Schmid R., Ugelstad J., Ellingsen Т., Berge A. Preparation of polymer latex particles carriers of a biochemicals and enzymes // A. Agents Actions Suppl.-1982.-v.9.-p.207-212.

6. Rembaum A., Chang M., Richards J., Li M. Synthesis and characterization hydrophilic microsoheres//J. Polym.Sci., Polym.Chem.Ed.-1984- Vol. 22-pp.609-619.

7. Bang L.B.Uniform latex particles.-lndianapolis:Seradyn lnc.,1984-68 p.

8. Margel S. Characterization and chemistry of polyaldehyde mi его spheres// J. of Polym.Sci.,Polym.Chem.Ed.-1984.-v.22.-p.3521-3533.

9. Ugelstad J., Mfutakamba H.R., Mork P.C., Ellingsen Т., Berge R., Holm L., Schinid R., Jorgedal A., Hansen F.K., Nustad K. Preparation and characterization of monodisperse polymer particles // J.Polym.Sci.,Polym.Symp.-1985.-v.72.-p.225-240.

10. Ober S.K., Lok K.P., Hair M.L. Monodispersed, micron-sized polystyrene particles by dispersion polymerization // J.of Polym.Sci., Polym.Letters Ed.-1985.-v.23.-p.103-108.

11. Upson D.A. Reactive functional latex polymers // J.of Polym.Sci.,Polym.Symposium.-1985.-N72.-p.45-54.

12. Лукин Ю.В., Грицкова И.А.,Праведников А.Н.,Бахарев В.И. Полиак -ролеиновые латексы: синтез, введение наполнителей и механизм формирования //ДАН СССР. -1985.-T.285.-N1.-C.159-161.

13. Tseng C.M.,Lu Y.Y.,E1-Aasser M.S.,Vanderhoff J.W. Uniform polymer particles by dispersion polymerization in alkohol // J.Polym.Sci.,Polym.Chem.Ed.-1986.v.24.-p.2995-3007.

14. Shahar M.,Meshylam H.,Margel S. Synthesis and characteristics of microspheres of polystyrene derivatives // J.of Polym. Sci.,Polym.Chem.Ed.-1986.-v.24.-p.203-213.

15. Ferrabochi P.,Azandi M.N.,Santaniella E.,Trave S. Preparation of aldehyde containing latex particles by oxydation of chloromethyl-containing latices // Synth. Commun. -1986.- v.l6.-p.43-45.

16. Van der Hoven T.J.J., Bijeterboch B.H. Some peculiarities in the surface charge of monodisperse polysteren particles: the effect of preparation, cleaning and handing //J.Coll.lnteface Sci.-1987.-v.115.-N 2.-p.559-560.

17. Brouwer W.M. The preparation of small polystyrene particles // J.of Appl.Polym.Sci.-1989.-v.38.-p.l335-1346.

18. Бахарев B.H., Буряков A.H., Лукин Ю.В., Грицкова И.А., Зубов В.П. Способ получения полиакролеиновых латексов: А.с. 1 565 845, 1990г.

19. Бахарев В.Н., Буряков А.Н., Дукин Ю.В., Грицкова И.А., Зубов В.П., Клявиньш М.К., Роска А.С., Зицманис А.Х. Способ получения полиакролеиновых латексов: А.с. 1 565 846, 1990г.

20. Okubo M.,Shiozaki M.,Tsujihiro M.,Tsukuda Y. Preparation of micron-size monodisperse polymer particles by seeded polymerization utilizing the dynamic monomer swelling method // Coll.Polym. Sci.-1991.-v.269.-p.222-226.

21. Дорохова E.A. Полимерные микросферы для реакции латекс-агглюти нации: Дис. канд.хим.наук.-М.,1991.-108 с.

22. Бакеева И.В., Грицкова И.А., Басырева Л.Ю., Повалий Т.М. Синтез полистирольных латексов в присутствии углеводов в качестве поверхностно-активных веществ // VIII Всесоюзная научно-техническая конференция "Латекс-90":Тез.докл.-М.,1991 .-с.20.

23. Черкасов В.P. Полимерные суспензии, модифицированные серусодержащими аминокислотами, для иммунохимических исследований. Дис. канд.хим.наук.М., 1992.

24. Okubo М., Kondo Y., Takahashi М. Studies on Suspension and Emulsion .136.

25. Production of Submicron-Size Monodisperse Polymer Particles Having Aldehyde Groups by Seeded Aldol Condensation Polymerization// Coll.Polym.Sci.-1993- Vol 271-Iss 2-pp. 109-113.

26. Okubo M., Shiozaki M. Production of Micron-Size Monodisperse Polymer Particles by Seeded Polymerization Utilizing Dynamic Swelling Method with Cooling Process// Polym. Int. -1993, -v.30. -Iss 4. -p.469-474.

27. Hosaka S., Murao Y., Tamaki H., Masuko S., Miura K., Kawabata Y. Monodisperse Microspheres of Copolymers of Glycidyl Methacrylate and Its Derivatives as Materials for Biomedical Application//Polym. Int. -1993. -v.30. -Iss 4. -p.505-511.

28. Tuncel A., Kahraman R., Piskin E. Monosize Polystyrene Microbeads by Dispersion Polymerization// J. Appl. Polym. Sci. -1993. -v.50. -Iss 2. -p.303-319.

29. Грицкова И.А., Гжива Э. Способ получения полимерных суспензий с узким РЧР в присутствии диптолилкарбалкоксифенилкарбинола: Пат. 163091, Республика Польша. -1994

30. Грицкова И.А., Чирикова О.В., Щеголихина О.И., Жданов А.А. Необычный эффект стабилизации полимерных суспензий в присутствии карбоксилсодержащих поливинилсилоксанов // Докл.PAH-1994-т.334 -N1-с. 57-61.

31. Шиков А.А., Прокопов Н.И., Грицкова И.А. Синтез полимерных суспензий для иммунохимических исследований. Биомедицинские технологии М, 1994, вып.2, стр. 15.

32. Грицкова И.А., Крашенинникова И.Г., Аль-Хаварин Д.И., Нусс П.В., Дорохова Е.А. Гжива Никсиньска И. Устойчивые полистирол-метакриловые суспензии с узким распределением частиц по размерам //Коллоидн. ж.1995, -т.57. -N2. -с.182-185.

33. Прокопов H.И.Грицкова И.А.,'Черкасов В.Р., Чалых А.Е7/ Успехи химии.1996,t.65,N2,c. 178-192.

34. Okubo М., Izumi J., Hosotani Т., Yamashita T.Production of Micron-Sized Monodispersed Core/Shell PolymethylMethacrylate Polystyrene Particles by Seeded Dispersion Polymerization// COLLOID AND POLYMER SCIENCE-1997-Vol.275-lss.8-pp.797-801

35. Polymeric Dispersions : Principles and Applications (NATO Asi Series. Series E, Applied Sciences, Vol 335.)// Ed.by Asua L.M.-N.-Y.: Kluwer Academic Pub.-1997-349 p.37.

36. Polymer Latexes : Preparation, Characterization, and Applications (ACS Symposium, №492) // Ed.by Daniels E.S., Sudol E.D., El-Aasser M.S.- .-N.-Y.: Kluwer Academic Pub-1998-437 p.

37. Киселев E.M. Полимерные материалы на основе гидропероксидного мономера 2- гидроперокси 2-метилгексен-5-ин-3 : Дисс. докт. хим. наук. М, 1998.

38. Прокопов Н.И. Синтез полимерных суспензий с узким распределением частиц по размерам методом гетерофазной полимеризации : Дисс. докт. хим. наук. -М., 1999.

39. Генералова А.Н. Получение биоаналитических реагентов на основе полимерных дисперсий. Дисс. канд. хим.наук.М.,2000.

40. Крашенинникова И.Г. Синтез полистирольных суспензий для иммунохимических реакций. Диссертация канд. хим. наук. М. 1991

41. Лобанов А.Н. Синтез полистирольных суспензий медико-биологического назначения. Диссертация канд. хим. наук. М. 2003

42. Ишков А.А. Синтез полиглицидилметакрилатных суспензий с узким распределением частиц по размерам. Диссертация канд. хим. наук. М. 1999

43. Лукин Ю.В. Синтез и исследование полимерных дисперсных систем для иммуноанализа. Диссертация канд. хим. наук. М. 1986

44. Шуманский С.М. Синтез и свойства полимерных микросфер сфункциональными группами на поверхности. Диссертация канд. хим. наук. М. 1992.

45. Буряков А.Н. Синтез магнитвосприимчивых полимерных дисперсий биомедицинского назначения. Диссертация канд. хим. наук. М. 2000

46. Григорьевская И.И. Антительтные тест-системы на основе полимерных суспензий для мониторинга биополлютантов и биологически важных соединений. Диссертация канд. хим. наук. М. 2005

47. Станишевский Я.М. Полимерные дисперсные системы медико-биологического назначения. Диссертация канд. биолог, наук. М. 2001

48. Иванчев С.С. Полифункциональные компоненты при радикальной полимеризации и получении полимерных композиций//Успехи химии.- 1991.-т.60.-вып.7.-с.1368-1390.

49. Елисеева В.И.,Асламазова Т.Р., Эмульсионная полимеризация в отсутствие эмульгатора и латексы на ее основе//Успехи химии,- 1991.-т.60.-вып.2.-с.398-428.

50. Bon S.A-F., Vanbeek Н., Piet P., German A.L.Emulsifier-Free Synthesis of Monodisperse Core-Shell Polymer Colloids Containing Chloromethyl Groups//J.OF APPLIED POLYMER SCIENCE-1995-Vol.58-lss.l-pp. 19-29

51. Милицкова E.A. К вопросу стабилизации размеров гранул суспензионных полимеров//Пластические массы.-1961.-М.8.-с.6-8.

52. Reinhardt H.I., Thiele R. Untersuchungin zur dishontinuirlichen suspensions polymerisations von styrol // Plaste b Kautsch.-1972.- Bd.l9.-N.9.-s.645-648.

53. Munzer M., Trommsdorff E. Polymerizations in suspension // In : Polymer Processes. -New York.-p. 106-142.

54. Суспензионная полимеризация винилхлорида. Стабилизаторы полимеризующейся эмульсии. Сб. обзорной информации.-М.; НИИТЭХИМ, 1975.-е. 63.

55. Суспензионная полимеризация метилметакрилата. Сб. обзорной информации. -М.: НИИТЭХИМ, 1975.-c.59.

56. Митюк Д.Ю.Роль структуры и свойств межфазных адсорбционных слоев в процессе регулирования дисперсности систем типа вода/масло,стабилизированных алюминиевыми мылами синтетических жирных кислот//Диссертация канд.хим.наук- М, 1985-122 с.

57. Шалыт С .Я. Условия формирования межфазных адсорбционныхслоев олеорастворимых мыл синтетичеческих жирных кислот и пути регулирования их стабилизирующего действия.//Дисс. докт.хим.наук-Москва, 1987-264 с.

58. Борт Д.Н. Физико-химические аспекты гетерофазной рдикальной полимеризации виниловых мономеров. Автореферат диссертации док. хим. наук М. 1976.

59. Dinnella C.,Doria M.,Laus M., Lanzarini G.Reversible Adsorption of Endopectin-Lyase to Tailor-Made Core-Shell Microspheres Prepared by Dispersion Polymerization//BIOTECHNOLOGY AND APPLIED BIOCHEMISTRY-1996-Vol.23 -Iss.APR-pp. 133-140

60. Capek I.On the Kinetics of Heterogeneous Free-Radical Cross- Linking Polymerization//J OF DISPERSION SCIENCE AND TECHNOLOGY- 1996-Vol.17-lss.2-pp. 139-244

61. К. E. J. Barrett. Dispersion Polymerization in Organic Media// Wiley, London-1975-456 p.

62. Ahmed S.F., Poehlein G.W. Kinetics of Dispersion Polymerization of Styrene in Ethanol .1. Model Development// INDUSTRIAL & ENGINEERING CHEMISTRY RESEARCH. -1997. -v.36. -Iss 7. -p.2597-2604.

63. Ahmed S.F., Poehlein G.W. Kinetics of Dispersion Polymerization of Styrene in Ethanol .2. Model Validation// INDUSTRIAL & ENGINEERING CHEMISTRY RESEARCH. -1997, -v.36. -Iss 7.-p.2605-2615.

64. Li W.-H., Li K., Stasver H.D.H Monodisperse poly(chloromethy!styrene-co-divinylbenzene) microspheres by precipitation polymerization//J of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry-1999-Vol.37-lss. 14-pp.2295-2303

65. Грицкова И.А., Крючков С.Б. Способ получения дисперсии полипарааминостирола. А.с. 1616927 1990г.

66. Имнадзе Е.Г. Модификация водной дисперсии синтетического цис-1,4- полиизопрена серусодержащими аминокислотами: Дис. канд.хим.наук.-М., 1987.-175C.

67. Лукин Ю.В., Буряков А.Н., Егоров В.В., Туркин СИ., Зубов В.П., Грицкова И.А., Заиченко А.С., Воронов С.А., Пучин В.А. и Праведников А.Н. Способполучения магнитных латексов. А.с.СССР N1290690,-1986.

68. Подойницин С.Н., Бахарев В.Н., Лукин Ю.В., Туркин СИ., Грицкова И. А., Зубов В.П., Буряков А.Н. Высокоградиентная магнитная сепарация клеток, меченных магнитными латексными частицами. 1. Осаждение меченых клеток. Биотехнология,-1989.-т.5.-с.371-375.

69. Елисеева В.И., Титова Н.В., Чалых А.Е., Слонимский Г. Д. Структурно-морфологические превращения латексных частиц в процессе двухстадийной эмульсионной полимеризации. //ДАН СССР,-1981.-Т.261 .-N.2.-C.402-405.

70. Елисеева В.И. Морфология и фазовая структура частиц, ее влияние на свойства латексов и пленок. Получение синтетических латексов, их модифицирование. //М, 1985, ЦНИИТЭ нефтехим,-с.7.

71. Murai S., Hosoi К., Hashimoto M. The Morphology of Core Shell Latex Particles. // j.Polym. Sei. : Polym. Chem. Ed.,-1984.-v.22.-N.6.-p. 1365-1372.

72. Muroi S., Hosoi К. Внутренняя структура латексных частиц, полученных полимеризацией с двухстадийной нагрузкой мономера. Н\. Chem. Soc. Jap. Chem. Ind. Chem.,-1984.- N.6.-p.954-958, РЖХ,-1985,1С-235.

73. Гаевой В.H. Эмульсионная полимеризация стирола и хлоропрена. // Дисс. канд.хим. наук., М.-1984.

74. Takahashi K.,Naga¡ K.Preparation of Reactive Polymeric Microspheres by Seeded Copolymerization Using a Polymerizable Surfactant Bearing an Active Ester Group//POLYMER-1996-Vol.37-lss. 7-pp. 1257-1266

75. Гринфельд E.A. Эмульсионная сополимеризация диеновых и виниловых мономеров при пониженном содержании эмульгаторов. Дисс. канд.хим. наук., М.-1985.

76. Стрелец Р.В. Синтез малоэмульгаторных латексов методом затравочной полимеризации на карбоксил содержащих частицах. Дисс. канд.хим. наук., М.-1990.

77. Саков Э.М. разработка технологии двухстадийного синтезамолоэмульгаторного бутадиен метил метакрилаткарбоксилатного латекса. Дисс. канд.тех. наук., М.-1989.

78. Muroi S. Some physicochemical properties of poly(ethyl acrylate)emulsion containing carboxyl groups// J.Appl.Polym.Sci. -1966.-N 10.-p.713-715.

79. Muroi S.,Hosoi K.,lshikawa T. Characterization of carboxyl groups containing polymer latices // J.Appl.Polym.Scl.-1967.-N 11 .-p. 1963-1966.

80. Huang Y.-H.,Li Z.-M.,MoravetzH.The kinetics of the attachment of reactive latex particlesand the resulting latex stabilization//J.of Polym.Sci.,Polym.Chem.Ed.-1985.-v.23.- N 3.-p.795-799.

81. Suen C.-H.,Moravetz H. The kinetics and retention of enzymatic activity in the covalent protein bonding to a polymer latex // Macromol.Chem.-1985.-N 186.-p.255-260.

82. Maehara Т., Eda Y., Mitani K., Matsuzawa S. Glycidyl Methacrylate Styrene Copolymer Latex-Particles for Immunological Agglutination Tests //Biomater.-1990-Vol 11- Iss 2- pp. 122-126.

83. Changhong Y.,Zhang X.,Sun Z.,Kitano H.,lse N. Poly(styren-co-acrolein) latex particles: copolymerization and characteristics // J.of Appl.Polym.Sci.-1990.-v.40.-p.89-98.

84. Verweij P.D., Sherrington D.C. High-Surface-Area Resins Derived from 2,3-Epoxypropyl Methacrylate Cross-Linked with Trimethylolpropane Trimethacrylate// J.of Mater.Chem.-1991-Vol 1-lss3-pp.371-374.

85. Arshady R. Beaded Polymer Supports and Gels .2. Physicochemical Criteria and Functionalization// J.of Chromat-1991-Vol 586-lss 2-pp.l99-219.

86. Margel S., Nov E., Fisher I. Polychloromethylstyrene Microspheres Synthesis and Characterization//J.Polym.Sci., Polym.Chem.Ed.-1991-Vol 29- Iss 3-pp.347-355.

87. Magnet S., Guillot J., Guyot A., Pichot C. Cross-Linking Ability of Styrene Butyl Acrylate Copolymer Lattices Functional ized with Glycidyl Methacrylate// Prog.organ.coating-1992-Vol 20-lss 1-pp.73-80.

88. Moberg C., Rakos L. Functionalization of Polystyrene Particles with Monochiral Epoxy Groups Potent Precursors for Chiral Polyfunctional Polymers //React.Pol.-1992-Vol 16-lss 2-pp.171-179.

89. Walenius M., Kulin L.I., Flodin P. Synthesis and Characterization of Copolymers Trimethylolpropane Trimethacrylate and Glycidyl Methacrylate in Toluene ЛИ React.Pol.-1992- Vol 17-155 3-pp.309-323.

90. Tuncel A., Kahraman R., Piskin E. Monosize Polystyrene Latices Carrying

91. Functional-Groups on Their Surfaces// J.Appl.Polym.Sci.-1994- Vol 51- Iss 8- pp. 1485-1498.

92. Horak D., Straka J., Schneider B., Lednicky F.Pilar J. Poly(Ethylene Dimethacrylate) Particles with Poly(Glycidyl Methacrylate) Functionalities //Polymer-1994- Vol 35- Iss 6-pp.1195-1202.

93. Kling J.A., Ploehn H.J. Synthesis and Characterization of Epoxy-Functional Polystyrene Particles//J. OF POLYMER SCIENCE PART A-POLYMER CHEMISTRY-1995-Vol.33-lss.7-pp.1107-1118

94. Hoshino M., Arishima K. Survey of Preparation Techniques of Monodispersed Microspheres of Glycidyl Methacrylate and Its Derivatives//J.OF APPLIED POLYMER SCIENCE-1995-Vol.57-lss.8-pp. 921-930.

95. Sarobe J., Forcada J.Synthesis of Core-Shell Type Polystyrene Monodisperse Particles with Chloromethyl Groups//COLLOID AND POLYMER SCIENCE-1996-Vol.274-lss.1-pp.8-13

96. Gauthier M., Frank P.C.Submicron Pellicular Resins as Polymer Supports// REACTIVE&FUNCTIONAL POLYMERS-1996-Vol.31-lss.1-pp.67-79

97. Miraballesmartinez I., Martinrodriguez A., Hidalgoalvarez R.Chloroactivated Latex-Particles for Covalent Coupling of Antibodies Application to lmmunoassays//J.OF BIOMATERIALS SCIENCE-POLYMER EDITION-1997-Vol.8-lss.10-pp.765-777

98. Saito R., Ni X., Ichimura A., Ishizu K. Synthesis of core-shell type microsphere with reactiveseed microspheres//J.of Applied Polymer Science-1999-Vol.69-lss.2-pp.211-216

99. Petro M., Svec F., Frechet J.M-J. Monodisperse Hydrolyzed Poly(Glycidyl Methacrylate-Co-Ethylene Dimethacrylate) Beads as a Stationary-Phase for Normal-Phase HPLC//ANALYTICAL CHEMISTRY- 1997-Vol.69-lss.160-pp.3131-3139

100. Patel R.P.Price S. The preparation of latex particles for covalent bounding of biochemicals//Biopolymers.-1967.-v.5.-p.583-587.

101. Cuatrecasas P. Using of hydroxyl-containing latex particles for IgG bounding //J.Biol. Chem. -1970.-v.245.-p.3059-3063.108109110,111112113114115116117118119120121

102. Bethell G.S.,Ayers J.S., Hancock W.S.,Hearn M.T.W. Using of imydazole derivatives for covalent coupling of antibody onto polymer particles surface // J.Biol.Chem.-1979.-v.254.-p.2572-2574.

103. Nilsson K.,Mosbach K. Hydroxyl-containing latices: using for proteins immobilization // Eur.J.Biochem.-1980.-v.12.- p.397-402.

104. Nilsson K.,Mosbach K. Preparation of hydroxyl-containing polymer particles and their using for enzyme fixation //Biochem. Biophis.Res.Commun.-1981.-v.102-p.449-457.

105. Kawaguchi H., Amagasa H., Hagiya Т., Kimura N., Ohtsuka Y. Interaction between proteins and latex particles having different surface structures // Colloids and Surfaces.-1985.-v.l3.-p.295-311.

106. Pichot C. Latex structures et fimctionnalises // Bulletin de la Societe Chimique de France.-1987.-N 4.-p. 725-733.

107. Kitano H.,Yan C.,Maeda Y.,lse N. Covalent bounding of bioligands onto polymer latices: a direct and undirect methods //Biopolymers.-1989.-v.28.- p.693-699.

108. Kasuya Y., Fujimoto K., Miyamoto M., Jujit T.,Otala A. Preparation of Peptide-Carrying Microspheres with bioactivity on Platelets // j. Biomater Sci-Polym. Ed.-1993. -v. 4. -N.4. -p.369-380.

109. Fair B.D., Jamieson A.M. Studies protein adsorption on polystyrene latex surfaces //j.Colloid and Interfaces Sci.-1980.-v.77.N.2.-p.525-534.

110. Камышный А.Л. Адсорбция глобулярных белков на твердых носителях: некоторые физико-химические характеристики// ж. физ. химии.-1981.т.55.-Вып.З.с.562-580.

111. Bagchi P. Birnbaum S.M. Effect of рН on the adsorption of immunoglobulin G on anionic polyvinyltoluene model latex particles //j.Colloid and Interface Sci.-1981.-v.83.-N.2.-p.460-478.

112. De Baillcu N., Voegel J.C., Sohmitt A. Adsorption of human albumin and fibrinogen onto heparin-like materials.1. Adsorption isoterms // Colloids and Surfaces.-1985.-v.l6.-p.271-288.

113. Shirahama H.,Suzava T. Adsorption of bovine serum albumin onto styrene-2-hydroxyethyl methacrylate copolymer latex //J.Coll.and Interface. Sci.-1985 -V.104.-N 2.-p.416-421.

114. Norde W., Mac Ritchie F., Nowicka G., Lyklema J. Protein adsorption at solid-liquid interfacts: reversibility and conformation aspects // j. Colloid and Interfaces Sci.-1986.-v.N.2.N.2.-p.447-456.

115. Norde W. Adsorption of proteins from solution at the solidiquid interface // Advan.135136137138139140141142143144145146147148149

116. Colloid and Interface Sci.-1986.-v.25.-N.4.-p.267-340.

117. Bale M.D., Danielson S.J.,Goppert R.E., Sutton R.C. Influence of copolymer composition on protein adsorption and structure rearragements at the polymer surface // Coll.lnterface Sci. 1989.-v.132.-N 1 .-p. 176-187.

118. Грицкова И.А., Нусс П.В., Дорохова E.A., Гусев C.A., Крашенинникова И.Г., Аль-Хаварин Д.И. Адсорбция белков на полистирольных микросферах и постановка реакции латекс-агглютинации.// Коллоидный журн.,1994.-т.56.-N.4.-C.491-495.

119. Грицкова И.А., Крашенинникова И.Г., Дорохова Е.А., Нусс П.В., Гусев С.А., Аль-Хаварин Д.И. Адсорбция белков на поверхности частиц полистиролметакрилатных суспензий. //Коллоидный >KypH.,1994.-T.56.-N.4.-с.487-490.

120. Басырева Л.Ю. Создание диагностических тест-систем на основе полимерных суспензий и факторы, определяющие их чувствительность и специфичность: Дис.канд. хим. наук. -М.,1994.

121. Препаративная органическая химия под ред. Вульфсона Н.С. М. Химическая литература, 1959.

122. Вейганд-Хильгетаг. Методы эксперимента в органической химии. М. Химия, 1968.

123. Kawaguchi H.,Hochino H.,Ohtsuka Y. The reactional polymer latexes preparation // J.Appl.Polym.Sci.-1981 .-v.26.-p.2015-2019. Петров P.В. Иммунология.- M: Медицина.- 1983.

124. Martin F.J., Kung T.V. Enhanced agglutination method and kit. US Pat 4,636,479 1987.

125. Bamgi L.B.Immunological agglutination assay with dyed or colored latex and kits: US Pat.4 419 543, 1984.

126. Johansen L.,Nustad K.,Orstavik T.B.,Ugelstad J.,Berge A.,EllengsenT. The new latex agglutination test kit for immunological assay//J.Immunol.Methods.-1983.-N 59.-p.255 -264.

127. Ganju L. et. al. A rapid latex agglutination test for detection of antibodies in tuberculosis and hansen's disease // J. Immunoassay -1991.-v.12.-iss.4-p.579-596.

128. Mongkolsirichaikul D. et. al. Development of a latex agglutination inhibition reaction test for amphetamines in urine // j.lmmonol. Methods. -1993.-v.l57.-N 1-2.-p.l89-196.

129. Brikley J., Haugland R., Singler V. Fluorescent microparticles with controllable stokes shifts: US Pat 7,882,299,1992.

130. Takeuchi K. Scintillation proximity assay // Anal. Letters.- 1992- v.23.- p. 13421345.

131. Horak D.Uniform Polymer Beads of Micrometer Size//ACTA POLYMERICA-1996-Vol.47-lss. 1 -pp.20-28

132. Иммунология. Практикум.-К.: Высшая школа.-1989.-с.302.164.165.166.167,168.169.170,171,172,173,174175176177178

133. Grundy M.A., Bolek W.E., Coakly W.T., Benes E. Rapid agglutination In ultrasonicstanding wave//j. of Immunol. Methods.-1993.-v.l65.-p.47-57.

134. Particle agglutination immunoassay apparatus: US Pat 4,913,883 MKN С 08 F 2

135. Imai К., Tokinaga D., YoukogawaK.-ony6n.-3.09.1990.

136. Christensen H., Thyssen H.H., Schebye O., Berget A. Three highly sensitive

137. Bedside" serum and urine tests for pregnancy compared //Clin. Chem.-1990.v.36.-p.1686-1688.

138. Tsuda S., Kamayak-lwaki M., Hanada K.p Kouda Y., Hikata M. A novel detection and identification technique for plant viruses: rapid immunofilter paper assay //Plant Disease.-1992-v.76.-p.466-469.

139. Gibbs J., Brown C., Root D. ELIZA optimization //J. Immunol. Methods.-1994.-v.175.-p.97-103.

140. Drugs of abuse by immunoassay //Clin. Lab. Prod.-1992.-v.21 .-N.3.-p.8-9. Analytical test devices for assay for drugs of non-protein antigens using immunochromatographic techniques. US Pat 5,238,652 MKN G 01 N33/54 / Sun M., Pfeifer F.R.-опубл. 1993.

141. Yamada T., Muzamatsu N.,Kondo T. Phagocytosis of monosac coharide-Binding latex particles by buinea-Pig polimor-phonuclear leucocytes // j. Biomater Su-Polym. Ed.-l993.-v.4-N.4.-p.347-355.

142. Станишевский Я.М., Грицкова И.А., Измайлова В.Я., Быков В.А., Кравцов Э.Г.,

143. Прокопов H.И., Харлов А.Е., Лобанов А.Н. Полимерные суспензии для диагностической тест-системы на фибронектин // Биотехнология теоретический и научно-практический журнал.-Москва-2001 Вып.З.-С.71-84.

144. Лобанов А.Н., Прокопов Н.И., Грицкова И.А., Селищева Е.Д., Станишевский Я.М.-Синтез полимерных суспензий для иммунохимических исследований // Тезисы научно-технической конференции "Молодые ученые и аспиранты МГТУ".- Мурманск-2001. -С.323-324.

145. A.M. Королюк, В.Б. Сбойчаков Медицинская микробиология. Уч. пособие С-Пб 1999г.

146. Чирикова О.В. Дис. канд. хим. Наук. М.: МИТХТ им. М.В. Ломоносова, 1994.

147. Герасимов В.К., Чалых А.Е., Алиев А.Д., Травкина Е.С., Грицкова И.А. Высокомолекулярные соед. А.2001.Т43.№11.С.1887

148. Елисеева В.И. Полимерные суспензии М.: Химия, 1980, 295с.

149. Иванчев С.С. Полифункциональные компоненты при радикальной полимеризации и получении полимерных композиций. Успех и химии, 1991, т.60, вып. 7. с. 1368-1390.

150. М. Джейкок, Дж. Парфит Химия поверхностей раздела фаз. М., «Мир», 1984, 266с.

151. Грицкова И.А., Чирикова О.В., Жданов A.A. Необычный эффект стабилизации полимерных суспензий в присутствии карбоксил содержащихполисилоксанов. ДАН РАН 1994, т.344, с.57-61.

152. Каминский В.А., Грицкова И.А. Межфазные явления и формирование частиц эмульсионной полимеризации. Ж. Ф. X. РАН, 1996, 70, 8 1516-1520.

153. Гжиева-Никсиньска И. Синтез полимерных суспензий для иммунохимических исследовании. Автореф. . канд. Хим. Наук. Варшава, 1982.

154. Януль Ю.Б. Синтез функциональных полимерных суспензий в присутствии олигомерных пироксиэфиров. Дисс.канд. хим. наук. МИТХТ, М., 1992

155. Dorota Wilson-Polit Autoreferat Bezemulgatowa polimeri3acia styrene. Warsawa, 2001.

156. Апь-Хаварин Джибриль Ибрагим Синтез функциональных полимерных суспензий для иммунологических исследований. Автореф. канд. хим. наук. МИТХТ, М„ 19940

157. Крашенинникова И.Г., Апь-Хаварин Д.И., Грицкова И.А., Дорохова Е.К. Устойчивые полистиролметакриловые суспензии с узким распределением по размерам. Коллоиды, 1995 т.57 №2 182-185

158. Воробьева Н.И. Синтез полистирольных суспензий с узким распределением частиц по размерам. Автореферат Дис. канд.химнаук М., МИТХТ, 1982

159. Басырева Л.Ю. Создание диагностических тест-систем на основе полимерных суспензий и факторы, определяющие их чувствительность и специфичность. Автореф. Дис. Канд.хим.наук М., МИТХТ, 1994

160. Грицкова И.А. Эмульсионная полимеризация малорастворимых в воде мономеров Автореф. Дис. Док. Хим. Н. М. МИТХТ, 1978.

161. В.К. Герасимов, А.Е. Чалых, А.Д. Алиев, Е.С. Транкина, И.А. Грицкова. Фазовое равновесие и морфология системы полистирол-полидиметилсилоксан-стирол. Высокомолек.соед. А, т.43, №11 с 1941-1949.

162. В.Г. Ивков, Г.Н. Берестовский. Динамическая структура липидного бислоя. М., Наука, 1981, с.80-84.

163. Yamaguchi, S. Watanabe, S. Nakahama. Emulsion polymerization of styrene using phospholipids as emulsifier. Immobilization of phospholipids on the latex surface. Macromol.Chem. №196, 1989, p.1195-1205.

164. Черкасов В.Р. Полимерные суспензии, модифицированные серосодержащими аминокислотами, для иммунохимических исследований. Дис. Канд.хим.наук М., 1992

165. Bang L.B. Uniform latex particles.-lndianapolis:Seradyn Inc.,1984.-68 p.

166. Mold C, Gewürz H. Inhibitory effect of C-reactive protein on alternative С pathway activation by liposomes and Streptococcus pneumoniae. // J Immunol. 1981 Nov; 127(5): 2089-92.

167. Volanakis JE, Narkates AJ. Interaction of C-reactive protein with artificial phosphatidylcholine bilayers and complement. // J Immunol. 1981 May; 126(5): 1820-5.