Создание диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер

Волкова, Екатерина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Создание диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Создание диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер"

На правах рукописи

Волкова Екатерина Владимировна

СОЗДАНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИМЕРНЫХ МИКРОСФЕР

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 02.00.06 — Высокомолекулярные соединения

- 6 МАР 2014

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2014

005545734

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» на кафедре химии и технологии высокомолекулярных соединений имени С.С. Медведева и в ФГБУН «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины ФМБА России» в лаборатории морфологии

Научные доктор медицинских наук, профессор

руководители: ГУСЕВ Сергей Андреевич

заслуженный деятель науки РФ, доктор химических наук, профессор ГРИЦКОВА Инесса Александровна

Официальные доктор биологических наук

оппоненты: КОЛЫШКИН Владимир Михайлович

заместитель директора по производству НПО «Биоцентр»

доктор химических наук, профессор ШТИЛЬМАН Михаил Исаакович,

руководитель УНЦ «Биоматериалы»

ФГБОУ ВПО «Российский химико-технологический

университет имени Д.И. Менделеева»

Ведущая организация:

ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Защита состоится 24 марта 2014 г. в 16— на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 86

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова»

С авторефератом можно ознакомиться на интернет-сайте ВАК РФ: http:// vak. ed .gov.ru

Автореферат разослан 19 февраля 2014 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 212.120.01, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В области практической медицины находят широкое применение диагностические тест-системы для проведения полуколичественного анализа методом реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). Работа гемагглютинационных диагностикумов основана на протекании иммунохимической реакции между фиксированными на поверхность эритроцитов антигенами (антителами) и специфическими антителами (антигенами), содержащимися в исследуемых образцах. Эта реакция сопровождается образованием визуально детектируемого агглютината на поверхности дна и-образной лунки.

Широкое распространение эритроцитарных диагностикумов связано с тем, что они имеют высокую чувствительность и специфичность и отличаются простотой постановки исследования, быстротой получения результатов, отсутствием необходимости в дорогом аппаратурном оснащении и невысокой стоимостью проводимого анализа.

Однако производство РПГА тест-систем и обеспечение их устойчивости во время хранения сопряжено с рядом трудностей, вызванных применением в качестве носителей биолигандов эритроцитов. Эритроциты получают из крови млекопитающих или птиц, содержание которых на специализированных фермах является трудоемким и дорогостоящим. Свойства эритроцитов часто зависят от источника и способа их выделения, сезона их взятия и многих других факторов, поэтому при изготовлении диагностикумов эритроциты трудно поддаются стандартизации.

Современным и актуальным решением существующих проблем является замена эритроцитов на полимерные микросферы и создание на их основе диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации (РПЛА). Для замены эритроцитов на полимерные микросферы необходимы знания кинетики и топохимии реакции пассивной гемагглютинации, без которых невозможно сформулировать требования к частицам полимерного носителя, поскольку поведение полимерных микросфер в ходе реакции может существенно отличаться от поведения эритроцитов из-за разной природы их поверхности.

Цель и задачи работы

Создание высокочувствительных диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации, путем замены эритроцитов на полимерные микросферы.

Для достижения поставленной цели было необходимо:

— изучить кинетику и топохимию образования агглютината при протекании реакции пассивной гемагглютинации;

— сформулировать критерии выбора полимерных микросфер для применения их в качестве носителей биолигандов (вместо эритроцитов) при постановке реакции пассивной латексной агглютинации и на их основе выбрать полимерные микросферы для исследования;

— разработать диагностические тест-системы, работающие по принципу реакции пассивной латексной агглютинации, путем замены эритроцитов на полимерные микросферы и сравнить их чувствительность и специфичность с аналогичными параметрами эритроцитарных диагностикумов;

— провести испытания диагностических тест-систем, созданных на основе полимерных микросфер, по основным клинико-диагностическим параметрам.

Научная новизна

Сформулирован научный подход к созданию высокочувствительных диагностических тест-систем, работающих по принципу РПЛА, путем замены эритроцитов на полимерные микросферы, основанный на выборе природы полимерных частиц, их диаметра и количества, обеспечивающих сохранение индивидуальности частиц в процессе их седиментации в объеме лунки и формирование агглютината на поверхности дна и-образной лунки при постановке РПЛА.

Разработан новый метод визуализации протекания реакции пассивной агглютинации в и-образных лунках, позволивший впервые проанализировать кинетику и топохимию реакции пассивной гемагглютинации. Впервые показано, что независимо от содержания специфических антител в образце эритроциты в объеме лунки седиментируют индивидуально, а формирование агглютината происходит в процессе их перемещения по поверхности дна IX-образной лунки.

Сформулированы требования к полимерным микросферам для замены ими эритроцитов в диагностических тест-системах, работающих по принципу реакции пассивной гемагглютинации.

Созданы новые композиционные полимерные частицы с высокой удельной поверхностью, применение которых в качестве носителей биолигандов позволяет на порядок увеличить чувствительность реакции пассивной латексной агглютинации.

Практическая значимость работы

Создана диагностическая тест-система с использованием полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов для определения уровня антител к столбнячному анатоксину в сыворотках крови человека методом реакции пассивной латексной агглютинации, чувствительность которой сопоставима с чувствительностью существующего гемагглютинационного диагностикума.

Создана диагностическая тест-система с использованием полимерных микросфер в качестве носителей биолигандов для определения уровня антител к дифтерийному анатоксину в сыворотках крови человека методом реакции пассивной латексной агглютинации, которая на верифицированном банке сывороток показала высокую чувствительность и специфичность.

Получены новые композиционные полимерные частицы с высокой удельной поверхностью, применение которых в качестве носителей биолигандов позволяет на порядок повысить чувствительность диагностических тест-систем по сравнению с наблюдаемой при использовании эритроцитов или индивидуальных полимерных микросфер.

Полученные результаты могут стать основой при разработке тест-систем для диагностики различных заболеваний методом реакции пассивной латексной агглютинации.

Автор защищает:

- новый метод наблюдения и анализа протекания реакции пассивной агглютинации;

- особенности протекания РПГА в и-образных лунках;

- требования к полимерным микросферам, используемым в качестве носителей биолигандов в РПЛА;

- результаты определения специфической активности столбнячного и дифтерийного латексных диагностикумов;

- результаты исследования РПЛА тест-системы для определения уровня антител к дифтерийному анатоксину в сыворотках крови человека;

- композиционные полимерные частицы с развитой удельной поверхностью в качестве носителей биолигандов в РПЛА.

Личное участие автора являлось основополагающим на всех этапах работы и состояло в постановке цели исследования, разработке экспериментальных и теоретических подходов при выполнении экспериментов и обобщении полученных результатов.

Апробация работы. Результаты исследований и основные положения диссертации докладывались и обсуждались на научной секции ПАВ Научного совета по коллоидной химии и физико-химической механике РАН «Поверхностно-активные вещества в технологических процессах» (Москва, 2010), ХУШ-ой международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2011 (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 4 статьи по теме диссертационной работы опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 111 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждений, выводов и списка литературы, включающего 98 источников. Диссертация содержит 38 рисунков и 12 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование кинетики и топохимии реакции пассивной гемагглютинации

Наибольшее применение в качестве носителей биолигандов при производстве диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной гемагглютинации, нашли эритроциты баранов, имеющие округлую форму и средний диаметр 3-4 мкм (рис. 1А), и эритроциты кур, имеющие продолговатую форму размером 8 — 12 мкм (рис. 1Б). Согласно данным литературы плотность используемых эритроцитов находится в диапазоне от 1,11 до 1,13 г/см3.

Соотношение размеров и плотностей эритроцитов, используемых в РПГА тест-системах, влияет на скорость их седиментации и, тем самым, определяет время считывания результатов реакции пассивной гемагглютинации.

Скорость седиментации эритроцитов в воде,

gd2

рассчитанная по формуле: V = — (р — р0) (е - . „

г г [ V 18г1 чг ги^ Рисунок 1. Эритроциты:

ускорение свободного падения, с! - диаметр сферы, А - баранов. Б - кур

эквивалентной по объему частице носителя, г| - вязкость воды, р0 - плотность воды, р - плотность частицы носителя), составила для эритроцитов баранов 2,9 мм/час, а для эритроцитов кур 8,5 мм/час.

Для оценки скорости седиментации эритроцитов был использован метод «в капилляре». Скорость седиментации эритроцитов барана в физиологическом растворе составила 3,0 ± 0,2 мм/час, а скорость седиментации эритроцитов кур - 8,0 ± 0,3 мм/час. Видно, что значения скоростей, полученные расчетным путем, хорошо согласуются с результатами эксперимента.

При изучении процесса формирования агглютината при протекании РГТГА важной задачей было установить различие в поведении эритроцитов в образцах, содержащих и не содержащих специфические антитела. Изучение процессов, протекающих от момента внесения диагностикума в и-образную лунку иммунологического планшета до момента считывания результатов, было проведено в условиях, моделирующих протекание РПГА. Для этого были изготовлены кюветы и создана установка, состоящая из инвертированного микроскопа, гониометра, системы видеорегистрации и программного обеспечения, позволившая отслеживать состояние РПГА-системы на различных её этапах: в процессе седиментации эритроцитов в объеме лунки, в момент касания ими поверхности дна лунки и в процессе их накопления в центре дна лунки.

Анализ седиментации эритроцитов в течение 2 часов после внесения диагностикума в образцы, содержащие и не содержащие специфические антитела, показал, что в объеме всех исследованных образцов эритроциты седиментировали индивидуально. Учитывая, что в образце, содержащем специфические антитела, агглютинации эритроцитов зафиксировать не удалось, можно предположить, что процесс их седиментации сопровождается только реакцией специфического связывания антиген-антитело, протекающей на поверхности отдельных эритроцитов.

Покадровый анализ видеозаписи седиментации эритроцитов на поверхность дна модельной кюветы показал, что независимо от содержания специфических антител в образце эритроциты седиментировали индивидуально. Формирование агглютината происходило на поверхности модельной кюветы в процессе движения эритроцитов к центру дна лунки. Распределение эритроцитов по поверхности дна модельных кювет в зависимости от степени их агглютинации приведено на рисунке 3: при наличии специфических антител в образце эритроциты равномерно выстилают поверхность дна и-образной лунки, с уменьшением концентрации специфических антител - эритроциты собираются в центре дна лунки в виде компактного осадка.

4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 2+

Рисунок 3. Распределение эритроцитов на поверхности дна лунок в зависимости от степени их агглютинации: А — вид и-образных лунок сверху, Б - вид и-образных лунок сбоку, В — микрофотографии дна модельных кювет

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при постановке реакции пассивной гемагглютинации в и-образных лунках процесс седиментации эритроцитов в объеме лунки сопровождается образованием иммунохимических комплексов антиген-антитело на поверхности отдельных эритроцитов, а процесс формирования агглтотината протекает на поверхности дна и-образной лунки.

Таким образом, по результатам изучения протекания реакции пассивной гемагглютинации нами были сделаны следующие выводы:

1. Критерием выбора полимерного материала и размера полимерных частиц является скорость их седиментации. При замене эритроцитов могут быть использованы полимерные микросферы, скорость седиментации которых находится в диапазоне от 3 до 8 мм/час.

2. Условием протекания реакции пассивной агглютинации, приводящей к получению визуально детектируемых результатов, является сохранение индивидуальности частиц на стадии их седиментации в объеме лунки и формирование агглютината носителя на поверхности дна и-образной лунки в процессе его движения к центру дна лунки.

Применение в качестве носителей биолигандов полимерных частиц, седиментирующих со скоростью более 8 мм/час, может повлиять на чувствительность реакции пассивной латексной агглютинации, так как при высокой скорости седиментации носителя не будет успевать протекать реакция антиген-антитело. Применение в качестве носителей биолигандов полимерных частиц, седиментирующих со скоростью менее 3 мм/час, будет приводить к значительному увеличению времени от момента постановки реакции до момента считывания результатов.

Подбор размеров и плотностей частиц полимерного носителя был проведен по выше приведенной формуле с учетом требуемых скоростей седиментации. На рисунке 2 представлена зависимость скорости седиментации частиц носителя от их диаметров и плотностей для полимерных частиц, наиболее часто используемых в качестве носителей биолигандов: полистирольных (1,050 - 1,070 г/см3), полиметилметакрилатных (1,130 - 1,190 г/см3), полиглицидилметакрилатных (1,150 - 1,170 г/см3), полиакролеиновых (1,180 — 1,200 г/см3). При замене эритроцитов млекопитающих, например, на полистирольные микросферы с плотностью 1,050 г/см3 их диаметр должен колебаться в интервале от 5,0 до 8,0 мкм.

мкм 4 г/см3

Для обеспечения условий индивидуальной седиментации частиц носителя в объеме лунки и формирования агглютината на поверхности дна лунки в процессе движения частиц к его центру была определена максимальная концентрация частиц в суспензии, при которой сохраняется их индивидуальность. Для расчета было использовано уравнение Смолуховского:

* 1 /I

¡2 ~ м ~ ~згГ ' ~ численная концентрация частиц; кБ - константа

Больцмана; Т - температура; г] - вязкость раствора). Расчетные данные показали, что суспензия полистирольных частиц со средним диаметром 8,0 мкм сохраняет устойчивость в воде в течение не менее 120 минут, если массовая доля частиц в единице объема суспензии не превышает 0,5%мпсс, а суспензия полистирольных частиц со средним диаметром 5,0 мкм сохраняет устойчивость в течение этого же времени при массовой доле частиц не более 0,1%масс.

Полученные данные были использованы для замены эритроцитов на полимерные микросферы при разработке диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации.

2. Выбор полистирольных микросфер для разработки диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации

Согласно сформулированным требованиям к размеру и плотности полимерных частиц, определяющим скорость их седиментации, были использованы полистирольные суспензии, синтезированные методом затравочной полимеризации в присутствии функциональных кремнийорганических гемини-ПАВ, что позволило получить полистирольные микросферы, содержащие в поверхностном слое аминогруппы - АГ(КО), карбоксигруппы - КГ(КО) и эпоксигруппы - ЭГ(КО) (рис. 4).

Рисунок 4. Полистирольные микросферы, полученные методом затравочной полимеризации в присутствии кремнийорганических гемини-ПАВ, содержащих: А - аминогруппы, Б - карбоксигруппы, В - эпоксигруппы.

Полистирольные микросферы имели средний диаметр 5 мкм и узкое распределение частиц по размерам. При анализе полимерных суспензий в световом микроскопе было обнаружено, что полистирольные микросферы в фосфатно-солевом буферном растворе агрегированы. Анализ углов смачивания показал, что поверхность полистирольных микросфер сильно гидрофобна, угол смачивания > 90° (таблица 1).

Таблица 1. Характеристики полистирольных суспензий, полученных методом затравочной полимеризации в присутствии кремнийорганических гемини-ПАВ. содержащих различные

функциональные группы.

Тип частиц О, мкм Ош/Оп <;,мВ Количество функц. групп, ммоль/г Устойчивость в ИаС1. М Угол смачивания

АГ (КО) 4,9 ± 0,3 1,025 10,6 ±7,2 0,044 ± 0,004 0,05 128° ±2°

КГ (КО) 4,9 ± 0,3 1,027 -37,6 ± 11,1 0,038 ±0,004 0,05 134° ±3°

ЭГ (КО) 4,8 ± 0,3 1,024 -11,2 ± 9,4 0,013 ±0.005 0,05 123° ±2°

Существенно понизить агрегацию полимерных микросфер удалось путем гидрофилизации их поверхности при проведении затравочной полимеризации стирола в присутствии смеси кремнийорганического гемини-ПАВ и полимерного ПАВ (поливиниловый спирт) и при модификации полистирольных микросфер аминосодержащими веществами.

На рисунке 5 представлены микрофотографии полимерных суспензий, полученные методом оптической микроскопии, и гистограммы распределения частиц по их агрегативному состоянию.

А.

В.

6,6% 4.9%

76.2% Г4

а 28.9%

„ , л 1,

агрегат ы х 1 \2

I 12,2%

Г _ 5,0% .ШЯттт............... 0,0%

Рисунок 5. Полистирольные микросферы, полученные: А - методом затравочной полимеризации в присутствии аминосодержащего кремнийорганического гемини-ПАВ, Б -методом затравочной полимеризации в присутствии смеси аминосодержащего кремнийорганического и полимерного ПАВ, В - методом затравочной полимеризации с последующей модификацией аминосодержащими веществами. х1, х2, хЗ - доля частиц, находящихся в одиночном состоянии или входящих в состав дуплетов и триплетов; агрегаты - доля частиц, находящихся в агрегированном состоянии.

Таблица 2. Характеристики полистирольных суспензий, полученных методом затравочной полимеризации в присутствии смеси кремнийорганического гемини-ПАВ и полимерного ПАВ (АГ(КО+ПВС)), и полистирольных суспензий, модифицированных аминосодержащими модификаторами (АГ(ХМ)).

Тип частиц Э, мкм 0\УД)П С, мВ Количество функц. групп, ммоль/г Устойчивость в №С1, М Угол смачивания

АГ (КО+ПВС) 4,9 ± 0,3 1,024 -4,5 ± 5,5 0,031 ± 0.004 0,15 107° ±2°

АГ (ХМ) 4,9 ± 0,3 1,025 43,6 ±8,1 0,820 ± 0.007 0,25 52° ±3°

Наибольшей агрегативной устойчивостью в буферных растворах характеризовались полистирольные микросферы со средним диаметром 5 мкм, модифицированные аминосодержащими веществами (таблица 2). Данная полимерная суспензия была использована при создании диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации.

3. Создание диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации

Разработка диагностикумов, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации, была проведена на примере получения тест-систем для оценки напряженности поствакционного иммунитета человека к дифтерии и столбняку.

В качестве специфического биолиганда, иммобилизуемого на поверхность частиц полимерного носителя, были использованы столбнячный и дифтерийный анатоксины, получаемые путем обработки соответствующих токсинов раствором формальдегида. По данным литературы известно, что в процессе инактивации токсинов происходит образование внутримолекулярных и межмолекулярных сшивок в молекулах токсинов, при этом основными центрами реагирования формальдегида являются аминогруппы остатков лизина. Количество образующихся внутримолекулярных и межмолекулярных сшивок в молекулах анатоксинов зависит от технологии их обработки.

По этой причине выбор аминогрупп в качестве целевых функциональных групп молекулы анатоксина представлялся нерациональным. Согласно базе данных ШкРгоЖВ молекулы столбнячного и дифтерийного токсинов содержат 88 (6,7% от общего количества аминокислотных остатков) и 28 (4,9%) остатков аспарагиновой аминокислоты и 70 (5,3%) и 37 (6,5%) остатков глутаминовой кислоты, соответственно. Ковалентную иммобилизацию анатоксинов на поверхность полимерного носителя было решено проводить, используя в качестве целевых функциональных групп белка карбоксильные группы (рис. 6).

Рисунок 6. Схема иммобилизации акатоксина на поверхность полимерных микросфер, содержащую аминогруппы.

Особенностью приведенной схемы иммобилизации анатоксинов является активация на первой стадии карбоксильных групп белка с помощью карбодиимида и последующее добавление полученного производного к полистирольным микросферам, содержащим в поверхностном слое аминогруппы.

3.1.Создание диагностической тест-системы для определения уровня антител к столбнячному анатоксину в сыворотках крови человека

В качестве специфического биолиганда, иммобилизуемого на поверхность полистирольных микросфер, был использован столбнячный анатоксин, характеристика которого приведена в таблице 3.

Таблица 3. Характеристика столбнячного анатоксина

Источник получения Clostridium tetani 471

Метод очистки - экстракция 0,25% гуанозинмонофосфата натрия + 2N трихлоруксусная кислота

Удельная активность 1063.8 Lf/мг белкового азота

Антигенная активность 500 Lf/мл

Содержание остаточного формальдегида 680 мкг/мл

Согласно базе данных ф UnitProtKB молекула столбнячного

токсина имеет молекулярную массу 150,7 кДа и состоит из двух субъединиц: энзиматического

домена А с молекулярной массой ~ 50 к Да и рецепторного домена В с

Molecular Weightjfcd)

молекулярной массой ~ 100 кДа,

соединенных между собой 165 105 52 ,

дисульфиднои связью.

Методом гель-электрофореза в

денатурирующих условиях было

показано, что кроме основного

компонента с высокой молекулярной

массой (165 кДа) образец

столбнячного анатоксина содержит

ещё некоторое количество

компонентов с более низкой

молекулярной массой (105 кДа и 52 кДа) (рис. 7).

Номер фракции Молекулярная масса, кДа Доля в образце

№1 165 73%

№2 105 22%

№3 52 5%

Рисунок 7. Электрофореграмма столбнячного анатоксина.

Можно предположить, что обе фракции белков с низкой молекулярной массой соответствуют А и В-домену исходного токсина. Высокая интенсивность полосы фракции белков с высокой молекулярной массой позволяет предположить, что большая часть А и В-доменов молекул столбнячного токсина в процессе его инактивации «сшиваются».

Иммобилизацию столбнячного анатоксина на поверхность полистирольных микросфер вели без предварительного разделения его на фракции по схеме, представленной на рисунке 6. Был проведен поиск оптимальных условий иммобилизации столбнячного анатоксина, по результатам которого был получен латексный диагностикум, специфическая активность которого с контрольной противостолбнячной сывороткой с активностью 4 МЕ/мл составила 1:2560 (рис.8).

Ав/ АБ/ Ав/ АБ/ АБ/ А&/ А5/ АБ/ АБ/ к

80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480

Рисунок 8. Результаты определения специфической активности столбнячного латексного

диагностикума.

Полученный латексный диагностикум характеризовался одинаковой чувствительностью со столбнячным эритроцитарным диагностикумом по отношению к контрольной противостолбнячной сыворотке.

3.2.Создание диагностической тест-системы для определения уровня

антител к дифтерийному анатоксину в сыворотках крови человека

В качестве специфического биолиганда, иммобилизуемого на поверхность полистирольных микросфер, был использован дифтерийный анатоксин, характеристика которого приведена в таблице 4.

Таблица 4. Характеристика дифтерийного анатоксина

Штамм Corynebacterium diphtheria PW-8 вариант Massachusetts

Метод очистки - экстракция 0,25% гуанозинмонофосфата натрия + 2N трихлоруксусная кислота

Удельная активность 1528 Lf/мг белкового азота

Антигенная активность 590 Lf/мл

Содержание остаточного формальдегида 680 мкг/мл

ф с 3 Ф

А /* Л 1 \ / \ / \

1 I | | |

Молекула дифтерийного токсина (58,3 кДа) также состоит из энзиматического домена А и рецепторного домена В, молекулярная масса которых согласно базе данных ШкРгоЖВ составляет 21 и 37,3 кДа соответственно.

Методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях было показано, что образец дифтерийного анатоксина содержит как минимум три фракции белков с разной молекулярной массой (рис. 9). Удалось зафиксировать фракцию белков (45 кДа), соответствующую по молекулярной массе домену В. Наличие фракции белков (123 кДа) с молекулярной массой выше молекулярной массы дифтерийного токсина свидетельствует о наличии димерных форм белка. Было проведено разделение дифтерийного анатоксина на фракции, содержащие белки с высокой (>100 кДа) и низкой (<100 кда) молекулярной массой.

Иммобилизацию дифтерийного анатоксина, а также двух выделенных

фракций белков с различными молекулярными массами вели по схеме,

представленной на рисунке 6. Чувствительность полученных тест-систем

оценивали с помощью контрольной противодифтерийной сыворотки с

активностью 10 МЕ/мл. Оказалось, что наибольшей чувствительностью

обладает тест-система, полученная на основе нефракционированного

анатоксина. На рисунке 10 приведены результаты определения специфической

активности полученной тест-системы, которая составила 1:12800.

АБ/ АЭ/ АЭ/ АБ/ аэ/ Ав/ АЭ/ АЭ/ 400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200

123 66 45

Номер фракции Молекулярная масса, кДа Доля в образце

№1 123 18%

№2 66 4%

№3 45 78%

Рисунок 9. Электрофореграмма дифтерийного анатоксина.

К К

ЯЯ(!1:

ГШ ш

Рисунок 10. Результаты определения специфической активности дифтерийного латексного

диагностикума.

Полученный латексный диагностикум характеризовался одинаковой чувствительностью с дифтерийным эритроцитарным диагностикумом по отношению к контрольной противодифтерийной сыворотке.

4. Клинико-лабораторные испытания латексного диагностикума для определения уровня антител к дифтерийному анатоксину

Для определения возможностей и ограничений применения разработанных диагностических тест-систем, в которых в качестве носителей биолигандов были использованы полистирольные микросферы с аминогруппами на поверхности, требовалось провести сравнение результатов определения уровня специфических антител в сыворотках крови человека методом РПГА и РПЛА. Оценка уровня чувствительности и специфичности была проведена на примере дифтерийного латексного диагностикума.

Как было указано выше, результаты определения специфической активности методом РПЛА и РПГА с помощью контрольной противодифтерийной сыворотки, имеющей активность 10 МЕ/мл, показали, что оба диагностикума имеют одинаковую чувствительность (агглютинация на два креста наблюдается при разведении антисыворотки в 12800 раз).

Для оценки чувствительности и специфичности дифтерийного латексного диагностикума был проведен сравнительный анализ результатов выявления антител к дифтерийному анатоксину методами РПГА и РПЛА на панели из 32 сывороток. Предварительно исследуемые сыворотки крови инактивировали при 56°С в течение 30 минут. Перед постановкой РПГА исследуемые сыворотки дополнительно истощали формалинизированными эритроцитами в течение 24 часов при 4°С для удаления гемагглютининов. Перед постановкой РПЛА данной процедуры проводить не требовалось, что значительно упрощало постановку реакции и сокращало время анализа. Полученные результаты

Таблица 5. Результаты определения

уровня антител к дифтерийному анатоксину методом РПГА и РПЛА

п/н код РПГА РПЛА

¡111-::; 107 <10 : < Ю

2 48 < 10 20

3 102 <10 10

4 25 < 10 10

5 481 < 10 10

6 59 <10 <10

7 41 < 10 10

8: 245 < 10 ' < ю

9 82 : <10 160

10 523 <10 160

11 501 < 10 <10

12 415 < 10 10

13 241 < 10 10

14 1.56 10 10

15 106 10 20

16 496 10 160

17 149 20 20

18 18 20 20

19 449 20 10

20 Б2 40 40

21 ВЗ 40 40

22 38 40 40

23 Лб 80 80

24 5 80 80

25 Л8 80 80

26 А10 160 160

27 Б4 160 80

28 А8 320 320

29 Б5 320 320

30 А5 640 320

31 АН 1280 1280

32 А1 > 1280 1280

испытаний образцов сывороток на наличие антител к дифтерийному анатоксину приведены в таблице 5.

Сравнение полученных результатов определения уровня специфичных антител в сыворотках методами РПГА и РПЛА было проведено методом корреляционного анализа. Для вычисления коэффициента корреляции была использована формула, применимая на малых выборках (п<100):

_ПЕ*у-1>ХЕУ_

- О»2 - (£У)2

где х - значение титра, определенного методом РПГА; у - значение титра, определенного методом РПЛА; п — количество испытуемых сывороток.

Корреляционный анализ между титрами одного и того же образца сыворотки, определенными методами

РПГА и РПЛА, показал линейную зависимость

полученных результатов с коэффициентом корреляции г = 0,83 (рис. 11).

Известно, что защитным титром в крови по решению ВОЗ [2009] считается уровень специфических антител в сыворотке не ниже 0,01 МЕ/мл, что соответствует титру в РПГА 1:10. Поэтому все исследованные сыворотки

были разделены на две группы по результатам определения титра антител к дифтерийному анатоксину методом РПГА: отрицательная группа - сыворотки с титром специфических антител ниже защитного уровня (титры < 1:10) и положительная группа - сыворотки с титром специфических антител выше защитного уровня (титры > 1:20).

При исследовании образцов положительной группы сывороток методом РПЛА во всех случаях были выявлены специфические антитела, что полностью согласуется с результатами исследования этих же сывороток методом РПГА. Ни в одном из случаев в сыворотках положительной группы не было зарегистрировано ложноотрицательных результатов. При исследовании

РПЛА, титры г = 0,83

2560

#> i

н>4>

5 10 20 40 Si) 160 .120 640 1280 2560 РПГА. титры

Рисунок 11. Корреляционный анализ результатов определения уровня антител к дифтерийному анатоксину методами РПГА и РПЛА.

сывороток положительной группы различия выявлялись лишь по уровню регистрируемого титра. При этом совпадение титров одного и того же образца сыворотки, определенных методами РПГА и РПЛА, наблюдалось в 75% случаев. Коэффициент корреляции титров в положительной группе сывороток составил г = 0,98.

Сравнительный анализ результатов определения уровня антител к дифтерийному анатоксину в сыворотках отрицательной группы показал, что в 3 образцах из 16 сывороток, исследованных методом РПЛА, были выявлены антитела к дифтерийному анатоксину в титрах 1:80 - 1:160. В остальных 13 образцах наблюдалось полное совпадение (31 %) или отклонение на один титр (50%).

Для характеристики степени восприимчивости иммунитета к дифтерии в зависимости от уровня антител к дифтерийному анатоксину использовали следующие критерии, предложенные ВОЗ [2009]: менее 0,01 МЕ/мл -отсутствие защитного уровня антител (в РПГА соответствует титрам < 10), 0,01 -ь 0,1 МЕ/мл - низкий защитный уровень антител (в РПГА соответствует титрам 20 80), более 0,1 МЕ/мл (в РПГА соответствует титрам > 160) - уровень, обеспечивающий стойкую и длительную невосприимчивость к дифтерии. Испытанные образцы сывороток были разделены на три группы согласно описанным критериям (таблица 6).

Таблица 6. Распределение исследованных сывороток в зависимости от уровня антител к дифтерийному анатоксину, выявленных методами РПГА и РПЛА.

Уровень защиты РПГА РПЛА

Отсутствие защитного уровня, Титры <10 16 (50,0%) 12 (37,5%)

Относительный защитный уровень, Титры 20-80 9(28,1%) 11 (34,4%)

Защитный уровень, Титры>160 7(21,9%) 9(31,2%)

Общее количество 32(100%) 32 (100%)

Сравнительный анализ полученных результатов определения уровня антител к дифтерийному анатоксину был проведен методами математической статистики, применяемыми в клинических исследованиях диагностических препаратов. Полученные результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7. Сравнение результатов определения уровня антител к дифтерийному анатоксину методами РПГА и РПЛА.

РПГА

Титры <10 Титры 20-80 Титры >160 Всего (п=32) к„ 95% ДИ

Титры <10 11 1 0 12

< е Титры 20-80 2 8 1 11 0,64 0,36-0,93

С р. Титры >160 3 0 6 9

Всего (п=32) 16 9 7

ДИ - доверительный интервал

Анализ согласованности результатов разделения исследуемых сывороток на группы по уровню защиты показал, что коэффициент корреляции составляет к„ = 0,64, что означает хорошее соответствие результатов классификации сывороток по группам методом РПЛА с результатами, полученными методом РПГА.

Характеристика диагностической работы тест-системы, полученной на основе полимерных микросфер, приведена в таблице 8.

Таблица 8. Диагностическая характеристика дифтерийного латексного диагностикума.

ДЧ, % ДС, % ПЦ+ ПЦ- К 95% ДИ для К

Граница между титрами < 10 и > 20

93,8% 68,8% 3,0 11,0 0,62 ±0,27

Граница между титрами < ! 50 и > 160

85,7% 88,0% 7,1 6,2 0,68 ±0,30

ДЧ - диагностическая чувствительность, ДС - диагностическая специфичность, ПЦ+/— прогностическая ценность положительных/отрицательных результатов, К — коэффициент корреляции, ДИ — доверительный интервал

Результаты анализа данных, полученных при испытании латексного диагностикума на сыворотках крови человека, имеющих различный уровень антител к дифтерийному анатоксину, показали, что полученная тест-система обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Только в 3 из 32 случаях наблюдалось значительное отклонение титров, определенных методом РПЛА, от титров, определенных методом РПГА. Наблюдаемое отклонение титров может быть объяснено или протеканием реакции латексной агглютинации за счет неспецифического связывания, или занижением

действительных титров специфических антител методом РПГА, которое описывается в литературе. Для определения действительных причин наблюдаемого отклонения титров следует провести расширенное исследование с применением метода реакции нейтрализации на клетках Vero, рекомендованного ВОЗ в качестве золотого стандарта.

В целом, результаты испытаний показали перспективность применения диагностической тест-системы, разработанной на основе полимерных микросфер, для выявления уровня антител к дифтерийному анатоксину при оценке качества поствакционного иммунитета у людей.

5. Разработка нового типа частиц носителя биолигандов для реакции пассивной латексной агглютинации

Созданные диагностические тест-системы, в которых в качестве носителей биолигандов были использованы полимерные микросферы, имели чувствительность и специфичность, сопоставимые с аналогичными параметрами существующих гемагглютинационных диагностикумов. В перспективе при разработке диагностических тест-систем, работающих по принципу РПЛА, с использованием предложенных принципов замены эритроцитов на полимерные микросферы может оказаться необходимым увеличить чувствительность реакции. Этого можно достичь при увеличении удельной поверхности полимерных частиц за счет уменьшения их размеров, что, однако, приведет к увеличению времени протекания РПЛА из-за уменьшения скорости седиментации частиц носителя.

Был предложен принципиально новый подход к созданию частиц полимерного носителя, позволяющий увеличить как удельную поверхность, так и скорость их седиментации. Суть данного подхода заключалась в получении композиционных полимерных частица путем формирования на поверхности полимерных микросфер большого диаметра оболочки из полимерных частиц малого диаметра за счет химического связывания функциональных групп,

содержащихся в их поверхностном слое (рис. 13).

• „

Активация функциональных групп Химическое связывание

Рисунок 13. Получение полимерных частиц с развитой удельной поверхностью

Для этого были использованы полимерные частицы двух размеров. Первые — со средним диаметром 5 мкм — были получены методом затравочной полимеризации стирола в присутствии функциональных кремнийорганических гемини-ПАВ и содержали в поверхностном слое амино-, карбокси- и эпоксигруппы (пункт 2). Несмотря на это их поверхность была гидрофобна (угол смачивания ~ 130°), по-видимому, из-за экранирования функциональных групп в надмолекулярных структурах, образованных гемини-ПАВ в поверхностном слое частиц.

Вторые частицы — со средним диаметром 0,4 — 0,7 мкм - были синтезированы методом гетерофазной полимеризации стирола в присутствии тех же функциональных кремнийорганических гемини-ПАВ (рис. 14).

Рисунок 14. Полистирольные частицы, полученные методом гетерофазной полимеризации в присутствии кремнийорганических гемини-ПАВ, содержащих: А - аминогруппы, Б-карбоксигруппы, В - эпоксигруппы.

В этом случае поверхность частиц была гидрофильной (угол смачивания ~ 50°) (таблица 9), что, видимо, объясняется иным механизмом формирования поверхностного слоя и образования надмолекулярных структур гемини-ПАВ, в которых функциональные группы не экранированы.

Таблица 9. Характеристики полистирольных суспензий, полученных методом

гетерофазной полимеризации в присутствии кремнийорганических гемини-ПАВ.

Тип частиц Б, мкм ОУУЛЗП С,, мВ Количество функц. групп, ммоль/г Устойчивость в ЫаС1, М Угол смачивания

АГ (КО) 0,49 ± 0,05 1,041 -23.1 ±7,6 0,465 ± 0,005 0.25 51° ± 3°

КГ (КО) 0,46 ±0,04 1,037 -27,6 ±8,1 0,520 ± 0,005 0.25 0 и 55 ±2°

ЭГ (КО) 0,65 ± 0,04 1,025 - 21,9 ± 3,7 0,185 ±0,015 0.25 0 п 49 ±2°

Первые частицы были устойчивы в воде, но агрегировали в буферных растворах высокой ионной силы, поэтому не могли быть использованы в качестве носителей биолигандов. Вторые - были использованы при получении

диагностических тест-систем для постановки реакции латексной агглютинации «на стекле». В качестве специфических биолигандов были использованы сывороточный альбумин человека, иммуноглобулин в человека и столбнячный дифтерийный анатоксины. Полистирольные частицы сохраняли агрегативную устойчивость на всех этапах получения диагностических тест-систем. Наблюдаемая высокая чувствительность реакции латексной агглютинации на стекле подтверждала наличие на поверхности полимерных частиц функциональных групп и химических связанных с ними биолигандов в достаточных количествах.

Полистирольные частицы со средним диаметром 0,4 - 0,7 мкм были использованы при формировании оболочки на поверхности полистирольных микросфер со средним диаметром 5 мкм путем химического связывания их функциональных групп по известным методикам (рис. 15). Для исключения агрегации частиц большого диаметра активацию их функциональных групп и иммобилизацию полимерных частиц малого диаметра на их поверхность проводили в воде.

А Б В Г

Рисунок 15. Полистирольные частицы с развитой удельной поверхностью, полученные путем фиксации:

А - полистирольных частиц со средним диаметром 0,5 мкм, содержащих в поверхностном слое аминогруппы, на поверхность полистирольных микросфер со средним диаметром 5 мкм, содержащую аминогруппы;

Б - полистирольных частиц со средним диаметром 0,7 мкм, содержащих в поверхностном слое эпоксигруппы, на поверхность полистирольных микросфер со средним диаметром 5 мкм, содержащую аминогруппы;

В — полистирольных частиц со средним диаметром 0,5 мкм, содержащих в поверхностном слое аминогруппы, на поверхность полистирольных микросфер со средним диаметром 5 мкм, содержащую карбоксигруппы;

Г - полистирольных частиц со средним диаметром 0,5 мкм, содержащих в поверхностном слое аминогруппы, на поверхность полистирольных микросфер со средним диаметром 5 мкм, содержащую эпоксигруппы.

Композиционные частицы характеризовались устойчивостью в буферных растворах высокой ионной силы и не меняли своих свойств во времени.

Согласно расчетным данным удельная поверхность полученных частиц в среднем в 3,5 раза больше удельной поверхности исходных полистирольных микросфер со средним диаметром 5 мкм.

На основе композиционных частиц, содержащих в поверхностном слое аминогруппы, была создана диагностическая тест-систем для определения уровня антител к дифтерийному анатоксину методом реакции пассивной латексной агглютинации. В качестве специфического биолиганда был использован дифтерийный анатоксин, иммобилизацию которого проводили по схеме, представленной на рисунке 6.

Специфическая активность полученной диагностической тест-системы была на порядок выше специфической активности диагностической тест-системы на основе полимерных микросфер со средним диаметром 5 мкм (пункт 3.2) (рис. 16).

АБ/ Ав/ Ав/ АБ/ да АБ/ ая АБ/ ^ к

400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200

Рисунок 16. Результаты определения специфической активности тест-системы, полученной на основе полимерных микросфер с развитой удельной поверхностью.

Наблюдаемое увеличение специфической активности может быть связано как с увеличением количества белка, иммобилизуемого на поверхность частиц, за счет увеличения их удельной поверхности, так и с увеличением точек контакта поверхностей частиц при образовании агглютината.

Таким образом, полученные полимерные микросферы с высокой удельной поверхностью характеризуются агрегативной устойчивостью в буферных растворах высокой ионной силы, наличием функциональных групп на поверхности и высокой стабильностью свойств во времени. Эти свойства позволяют их использовать при создании высокочувствительных диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации.

Можно предположить, что полученные полимерные микросферы с развитой удельной поверхностью могут найти своё применение и в других областях биотехнологии: при создании новой технологии цветового кодирования полимерных микросфер для мультиплексного дисперсионного иммуноферментного анализа, при исследовании и моделировании мембранных структур клеток, при получении тканеинженерных конструкций, обладающих временной программой высвобождения биологически активных веществ.

ВЫВОДЫ:

1. Сформулирован научный подход к созданию высокочувствительных диагностических тест-систем, работающих по принципу РПЛА, в которых в качестве носителей биолигандов вместо эритроцитов использованы полимерные микросферы, и показано, что условием создания таких тест-систем является обеспечение сохранения индивидуальности частиц в процессе их седиментации в объеме лунки и формирования агглютината на поверхности дна и-образной лунки.

2. Разработан новый метод визуализации и анализа кинетики и топохимии реакции пассивной агглютинации, который позволил установить, что при протекании реакции пассивной гемагглютинации эритроциты в объеме образца, содержащего и не содержащего специфические антитела, седиментируют индивидуально, а формирование агглютината происходит в процессе перемещения эритроцитов по поверхности дна и-образной лунки.

3. Сформулированы требования к полимерным микросферам для замены ими эритроцитов при создании диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации: скорость седиментации 3-8 мм/час, агрегативная устойчивость в воде и буферных растворах высокой ионной силы, наличие в поверхностном слое функциональных групп, доступных для ковалентного связывания с функциональными группами белков.

4. Показано, что полистирольные микросферы со средним диаметром 5 мкм, модифицированные аминосодержащими веществами, соответствуют сформулированным требованиям и могут быть использованы при создании диагностических тест-систем для определения уровня антител к столбнячному и дифтерийному анатоксинам в сыворотках крови человека методом реакции пассивной латексной агглютинации.

5. Созданы диагностические тест-системы с использованием полимерных микросфер вместо эритроцитов для определения уровня антител к столбнячному и дифтерийному анатоксинам в сыворотках крови человека методом РПЛА, чувствительность которых сопоставима с чувствительностью существующих гемагглютинационных диагностикумов и составляет 1:2560 и 1:12800, соответственно.

6. Установлена высокая корреляция (г = 0,83) результатов определения уровня антител к дифтерийному анатоксину методами РГГГА и РПЛА, что свидетельствует о перспективности применения диагностической тест-системы, созданной с использованием синтезированных полистирольных микросфер (вместо эритроцитов), для оценки качества противодифтерийного поствакционного иммунитета у людей.

7. Показано, что полистирольные частицы с диаметрами 0,4 — 0,7 мкм, полученные методом гетерофазной полимеризации в присутствии функциональных кремнийорганических гемини-ПАВ, обладают агрегативной устойчивостью в воде и буферных растворах высокой ионной силы и содержат в поверхностном слое функциональные группы, доступные для проведения ковалентного связывания с функциональными группами белков, что позволяет их использовать в качестве носителей биолигандов при разработке диагностических тест-систем.

8. Получены новые композиционные частицы полимерного носителя, представляющие собой полистирольные микросферы со средним диаметром 5 мкм с фиксированными на их поверхности полистирольными частицами со средним диаметром 0,4 - 0,7 мкм, и характеризующиеся высокой удельной поверхностью и агрегативной устойчивостью в воде и буферных растворах.

9. Показано, что применение в качестве носителей биолигандов композиционных полимерных частиц с высокой удельной поверхностью позволяет на порядок увеличить чувствительность реакции пассивной латексной агглютинации.

Список печатных работ

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Грицкова И.А. Полимеризация метилметакрилата в присутствии кремнийорганических ПАВ / И.А. Грицкова, П.Н. Чадаев, Д.И. Шрагин, E.H. Левшенко, Л.А. Злыднева, Е.В. Волкова, Н.В. Рассоха // Известия ВУЗов. - Химия и химическая технология. -2011. - Т. 54. — № 9. — С. 70-73.

2. Волкова Е.В. Разработка полистирольных микросфер для иммунофлуоресцентного анализа / Е.В. Волкова, И.А. Грицкова, С.А. Гусев, А.Д. Лукашевич, A.A. Гусев, E.H. Левшенко, Л.А. Злыднева, К.О. Сочилина // Биотехнология. — 2012. - № 4. - С. 74-77.

3. Левшенко E.H. Полимерные микросферы в качестве носителей флуоресцентной метки при построении трехмерной модели сосудистого русла экспериментальных животных / E.H. Левшенко, И.А. Грицкова, С.А. Гусев, A.A. Гусев, Е.В. Волкова // Биотехнология. — 2013. - № 6. - С. 65-70.

4. Волкова Е.В. Выбор полимерных микросфер для проведения реакции латексной агглютинации в плашечном формате / Е.В. Волкова, А.Д. Лукашевич, И.С. Левачева, С.М. Левачев, С.А. Гусев, И.А. Грицкова // Вестник МИТХТ. - 2013. - Т. 8. - № 6. - С. 68-72

Тезисы докладов:

5. Злыднева JI.A. Полимеризация стирола в присутствии кремнийорганических поверхностно-активных веществ для создания полимерных носителей биолигандов / Л.А. Злыднева, Е.В. Волкова, E.H. Левшенко, Н.В. Рассоха, И.А. Грицкова, С.А. Гусев // Поверхностно-активные вещества в технологических процессах: тез. докл. науч. секции ПАВ науч. совета по коллоид, химии и физико-химич. механике РАН. 2122 сентября 2010 г. - Москва, 2010. - С. 12.

6. Волкова Е.В. Получение диагностических тест-систем на основе полимерных микросфер / Е.В. Волкова, А.И. Свириденко // Ломоносов-2011: тез. докл. международ, молодеж. науч. форума. 11-15 апреля 2011 г. -Москва, 2011.-С. 177.

Волкова Екатерина Владимировна СОЗДАНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИМЕРНЫХ МИКРОСФЕР Формат 60^90/16 Тираж 150 экз. Подписано в печать 12.02.2014. Заказ № 152 Типография ООО «Генезис» 8(495)434-83-55 1 19571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Волкова, Екатерина Владимировна, Москва

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова»

На правах рукописи

04201456520

Волкова Екатерина Владимировна

СОЗДАНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИМЕРНЫХ МИКРОСФЕР

Специальности: 03.06.01 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 02.00.06 - Высокомолекулярные соединения

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: д.х.н., проф. Грицкова И.А. д.м.н., проф. Гусев С.А.

Москва-2014

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................8

1.1. Вакцинопрофилактика - эффективный метод борьбы с заболеваниями дифтерией и столбняком....................................................................................8

1.2. Диагностические тест-системы, работающие по принципу реакции агглютинации.....................................................................................................15

1.3. Полимерные микросферы в качестве носителей биолигандов для иммунодиагностических тест-систем.............................................................27

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..........................................................36

2.1. Исходные реагенты............................................................................................36

2.2. Исследование реакции пассивной гемагглютинации.....................................39

2.3. Синтез полимерных суспензий.........................................................................41

2.4. Исследование коллоидно-химических свойств полимерных суспензий.....43

2.5. Ковалентная иммобилизация белков на поверхность полистирольных частиц..................................................................................................................48

2.6. Постановка реакции пассивной гемагглютинации и реакции

пассивной латексной агглютинации ...............................................................51

2.7. Определение уровня антител к дифтерийному анатоксину в сыворотках крови человека..............................................................................55

2.8. Получение композиционных полимерных частиц с высокой удельной поверхностью.....................................................................................................56

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................59

3.1. Исследование кинетики и топохимии реакции пассивной

гемагглютинации...............................................................................................59

3.2. Выбор полистирольных микросфер для разработки диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной

агглютинации.....................................................................................................66

3.3. Создание диагностических тест-систем, работающих по принципу реакции пассивной латексной агглютинации................................................75

3.4. Клинико-лабораторные испытания латексного диагностикума для определения уровня антител к дифтерийному анатоксину..........................83

3.5. Разработка нового типа частиц носителя биолигандов для реакции пассивной латексной агглютинации...............................................................89

ВЫВОДЫ...................................................................................................................98

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................100

ВВЕДЕНИЕ

Широкое распространение гемагглютинационных диагностикумов связано с тем, что они имеют высокую чувствительность и специфичность и отличаются простотой постановки исследования, быстротой получения результатов, отсутствием необходимости в дорогом аппаратурном оснащении и невысокой стоимостью проводимого анализа.

Однако производство РПГА тест-систем и обеспечение их устойчивости во время хранения сопряжено с рядом трудностей, вызванных применением в качестве носителей биолигандов эритроцитов. Эритроциты получают из крови млекопитающих или птиц, содержание которых на специализированных фермах является трудоемким и дорогостоящим. Свойства эритроцитов часто зависят от источника и способа их выделения, сезона их взятия и многих других факторов, поэтому при производстве диагностикумов эритроциты трудно поддаются стандартизации.

частицам полимерного носителя, поскольку поведение полимерных микросфер в ходе реакции может существенно отличаться от поведения эритроцитов из-за разной природы их поверхности.

Цель и задачи работы

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- изучить кинетику и топохимию образования агглютината при протекании реакции пассивной гемагглютинации;

- сформулировать критерии выбора полимерных микросфер для применения их в качестве носителей биолигандов (вместо эритроцитов) при постановке реакции пассивной латексной агглютинации и на их основе выбрать полимерные микросферы для исследования;

- разработать диагностические тест-системы, работающие по принципу реакции пассивной латексной агглютинации, путем замены эритроцитов на полимерные микросферы и сравнить их чувствительность и специфичность с аналогичными параметрами эритроцитарных диагностикумов;

- провести испытания диагностических тест-систем, созданных на основе полимерных микросфер, для определения основных диагностоических параметров их работы.

Научная новизна

сохранение индивидуальности частиц в процессе их седиментации в объеме лунки и формирование агглютината на поверхности дна и-образной лунки при постановке РПЛА.

Разработан новый метод визуализации протекания реакции пассивной агглютинации в И-образных лунках, позволивший впервые проанализировать кинетику и топохимию реакции пассивной гемагглютинации. Впервые показано, что независимо от содержания специфических антител в образце эритроциты в объеме лунки седиментируют индивидуально, а формирование агглютината происходит в процессе их перемещения по поверхности дна и-образной лунки.

Практическая значимость работы

Автор защищает:

- новый метод наблюдения и анализа протекания реакции пассивной агглютинации;

- особенности протекания РПГА в И-образных лунках при постановке микрометодом;

- свойства полимерных микросфер, позволяющие их использовать в качестве носителей биолигандов при разработке РПЛА тест-систем;

- результаты определения специфической активности столбнячного и дифтерийного латексных диагностикумов;

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вакцинопрофилактика — эффективный метод борьбы с заболеваниями

дифтерией и столбняком

На протяжении всей истории человечества эпидемии таких острых инфекционных заболеваний, как дифтерия и столбняк, уносили множество человеческих жизней. Единственным эффективным методом борьбы с инфекционными заболеваниями, предложенным ещё в 1796 году английским врачом Э. Дженнером, но масштабно внедренным в широкую медицинскую практику только в конце XIX - начале XX века, является вакцинопрофилактика.

Согласно Федеральному Закону № 157-ФЗ «Об иммунопрофилактике инфекционных болезней», принятому Государственной Думой, одобренному Советом Федерации и утвержденному президентом РФ 17.09.98, в России обязательными являются 9 видов прививок, в том числе и против дифтерии и столбняка [1].

Несмотря на это в настоящее время, согласно данным ВОЗ, дифтерия и столбняк все также имеют повсеместное распространение. Уровень заболеваемости в значительной степени зависит от социальных условий, постановки профилактических мероприятий, географической зоны и т.д. Данные Всемирной организации здравоохранения по уровню заболеваемости дифтерией в ряде крупных стран мира представлены в таблице 1 [2].

В конце XX века тяжелая эпидемия дифтерии разразилась на территории Российской Федерации и стран СНГ. Пик эпидемии пришелся на 1994 год, когда на территории РФ было зафиксировано 39703 случая заболевания из 56965 во всем мире, 1004 из них имели смертельный исход [2].

Одной из причин возникшей на территории Российской Федерации эпидемии стал низкий уровень серологического мониторинга напряженности специфического иммунитета к дифтерии среди населения, что может быть связано с отсутствием современных диагностических препаратов.

Таблица 1. Уровень заболеваемости дифтерией (количество зарегистрированных случаев) в

ряде крупных стран мира

страна годы

1980 1990 1995 2000 2005 2010

Россия 243 1211 35631 771 353 9

США 3 4 0 2 0 0

Китай 9767 421 85 19 0 0

Индия 39231 8425 2123 5125 5826 3223

Япония 66 5 нет данных 1 нет данных 0

В мире 97511 23864 56965 11625 8338 4234

Возбудитель дифтерии - грамположительная. палочковидная бактерия Corynebacterium diphtheriae, являющаяся патогенной только в организме человека. Основной фактор патогенности — дифтерийный экзотоксин, относящийся к сильно действующим бактериальным ядам (уступает лишь ботулиническому и столбнячному токсинам) [3]. Дифтерийный токсин состоит из двух полипептидных цепей с молекулярными массами 37 и 25 кДа. Токсин с помощью связывающего домена фиксируется на поверхности мембраны клетки хозяина, после чего каталитический домен токсина проникает сквозь оболочку внутрь клетки, где катализирует реакцию инактивации фактора элонгации. Из-за того, что каталитический домен является ферментом, одной его молекулы достаточно для инактивации всех имеющихся молекул, что приводит к смерти клетки. Домены по отдельности нетоксичны, токсическое действие проявляется только при их совместном действии. Резистентность многих животных к дифтерийному токсину объясняется тудностью проникновения токсина через мембрану их клеток [4, 5, 6].

Возбудитель столбняка - облигатно анаэробная грамположительная спорообразующая палочковидная бактерия Clostridium tetani, образующая сильнодействующий экзотоксин (тетаноспазмин) [3]. Столбнячный токсин

состоит из двух полипептидных цепей с молекулярными массами 100 и 50 кДа. Токсин фиксируется на поверхности отростков нервных клеток, проникает в них и попадает в центральную нервную систему. Механизм действия связан с подавлением высвобождения тормозных нейромедиаторов в синапсах, что вызывает местные тетанические сокращения мышц [7, 8].

Французский иммунолог Г. Рамон в 1923-1926 годах разработал метод получения дифтерийного и столбнячного анатоксинов, применяемый до настоящего времени при профилактике заболеваний [3, 9, 10]. Он основан на хорошо в настоящее время изученной реакции взаимодействия формальдегида с аминокислотными остатками молекулы токсина. Основными центрами реагирования формальдегида являются первичные аминогруппы аминокислот, а именно лизиновые остатки. Реакция начинается с образования обратимых метальных аддуктов на аминогруппах, которые затем частично дегидрируются с образованием неустойчивых оснований Шиффа, способных к образованию сшивок с несколькими аминокислотными остатками. Такая обработка токсина приводит к образованию внутримолекулярных и межмолекулярных сшивок в молекуле белка. Обработка токсина формальдегидом имеет большое влияние на токсические, антигенные и иммуногенные свойства токсина. Формальдегид переводит токсин в его нетоксическую форму, называемую анатоксином, сохраняя при этом его иммуногенные свойства.

Концентрация анатоксина выражается в единицах флоккуляции (Ы} и устанавливается как количество анатоксина, которое флоккулирует одну единицу международного эталонного антитоксина, а активность анатоксина измеряется в международных единицах (МЕ), определяемых путем измерения количества нейтрализующего анатоксина у предварительно иммунизированных морских свинок.

Как столбнячный, так и дифтерийный анатоксины могут быть использованы в виде моновакцины или в виде комплексных вакцин, например АКДС-вакцины (адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная). Введение вакцины в организм вызывает образование специфических антител

(IgG), играющих основную роль в защите от инфекций. Следует отметить, что вакцинация является единственным способом формирования иммунной защиты от столбняка, так как переболевшие столбняком не приобретают стойкого иммунитета, а потому нуждаются в иммунизации для защиты от повторного заболевания [11]. Напротив, люди, переболевшие средней формой дифтерией, не подлежат дополнительной прививке после заболевания, так как у них вырабатывается антитоксический иммунитет [12].

Согласно рекомендациям ВОЗ минимальным защитным титром противостолбнячных и противодифтерийных антител считается 0,01 МЕ/мл сыворотки крови [13, 14]. Однако существуют данные о случаях заболевания человека как дифтерией, так и столбняком при содержании специфических антител в крови от 0,01 до 0,09 МЕ/мл, а в некоторых случаях и выше [15]. Поэтому при проведении серологической диагностики используют следующие критерии, характеризующие степень восприимчивости к дифтерии или столбняку в зависимости от уровня специфических антител: менее 0,01 МЕ/мл - обследуемый восприимчив к инфекции (рекомендуется вакцинация); 0,01 — ОД МЕ/мл - низкий уровень защиты (рекомендуется вакцинация); 0,1-1 МЕ/мл - защитный уровень антител достаточен; 1 МЕ/мл - уровень, обеспечивающий стойкую и длительную невосприимчивость к дифтерии или столбняку [13, 14].

Первый способ оценки противодифтерийного иммунитета у людей был предложен в 1913 году австрийским врачом Бэл ом Шиком (Bela Schick), ставший позднее известным как реакция Шика. Небольшое количество дифтерийного токсина вводится под кожу. Припухлость и покраснение места инъекции свидетельствуют об отсутствии у человека иммунитета к дифтерии и указывают на необходимость проведения иммунизации. Недостатком данного метода является ненадежность его результатов при наличии у пациента кожной анергии (характерна для новорожденных и младенцев), так как в этом случае

Информация о работе

Волкова, Екатерина Владимировна
кандидата химических наук
Москва, 2014
ВАК 03.01.06

Диссертация

Создание диагностических тест-систем с использованием полимерных микросфер - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы