Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Материалы к характеристике полимерной фракции столбнячного анатоксина

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Карсанова, Ирина Батырбековна

Введение

Глава L Особенности эпидемиологии и профилактики столбняка при плановой вакцинации населения фор-мольным дериватом столбнячного токсина (СТ) и современные подходы к изготовлению очищенного столбнячного анатоксина (СА). (Обзор литературы).

I. Особенности эпидемиологии столбняка.

II. Особенности профилактики столбняка.

III. СТ, его характеристика и структура.

IV. Получение СА.

V. Методы очистки СА.

V-1. Использование хроматографических методов для очистки

СТ, С А и изучения их фракционного состава.

V-2. Метод мембранной диафильтрации для очистки СА.

VI. Полимерные микросферы биомедицинского назначения.

VII. Применение полимерных микросфер в биоанализе.

Глава II. Материалы и методы исследования.

I. Материалы.

1.1. СТ

1.2. Очищенный СА.

1.3. Лабораторные животные.

1.4. Стандартная лошадиная противостолбнячная сыворотка.

1.5. Сыворотка противостолбнячная лошадиная очищенная концентрированная жидкая 3000 ME.

1.6. Человеческий и бычий сывороточные альбумины (ЧСА и БСА).

1.7. Эритроцитарный антигенный столбнячный диагностикум (ЭАСД).

1.8. Полимерные микросферы (латексы).

1.9. Фосфатно-солевые буферные растворы (ФСБ).

1.10. ФСБ, содержащий ЧСА.

1.11. Раствор формальдегида.

1.12. Хроматографические носители и гелеобразователи.

1.13. Оборудование.

II. Методы.

II. 1. Культивирование Cl.tetani. II.2. Диафшьтрация. П.З. Спектрофотометрия.

11.4. Хроматография.

11.5. Определение белка и общего (белкового) азота.

11.6. Иммунохимическая характеристика препаратов.

11.7. Определение удельной антигенной активности препаратов.

11.8. Получение латексых антигенных столбнячных диагно-стикумов.

11.9. Постановка реакции пассивной агглютинации латекса (РПЛА).

11.10. Постановка реакции торможения пассивной агглютинации латекса (РТПЛА).

11.11. Постановка реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с ЭАСД.

11.12. Биологическое тестирование токсина.

11.13. Статистические методы обработки результатов экспериментов.

Глава III. Результаты исследований и их обсуждение

III. 1. Очистка С А методом ступенчатой мембранной диафильт-рации.

111.2. Разделение образцов СА методом эксклюзионной хроматографии.

111.3. Изучение сенситивных и иммунохимических свойств ре-хроматографированных образцов из серий СА, доочищенных методом диафилътраци.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Материалы к характеристике полимерной фракции столбнячного анатоксина"

Столбняк - это токсикоинфекция, с трудом поддающаяся лечению, но специфическая его профилактика с помощью анатоксина эффективна и проводится в законодательном порядке в РФ в течение последних 40 лет.

При столбнячной токсикоинфекции основным фактором патогенности является столбнячный токсин (СТ) - нейротоксин. Это единая полипептидная цепь с молекулярной массой 150 кД. Тох+-ген, ответственный за синтез бел-ка-нейротоксина (тетаноспазмина) локализован в особой плазмиде и одновременно кодирует синтез активной группы цинксвязывающего фрагмента с протеолитической активностью, а также специфический фрагмент, ответственный за фиксацию нейротоксина на рецепторах клеток=мишеней [90, 108]. Таким образом, препарат для профилактики столбняка должен индуцировать в первую очередь выработку антител (AT) к рецепторсвязывающему фрагменту молекулы СТ.

Изготовление прививочного препарата, для профилактики столбняка, основано на методе Ramon G. [114]. В период формольной детоксикации возможно закручивание молекулы СТ за счет формирования шифовых мостиков, в результате чего инактивируется токсофорный центр, а обработанный формалином белок переходит в анаформу и становится столбнячным анатоксином (СА). При этом сохраняется конформация рецепторсвязывающего фрагмента молекулы СТ и после обезвреживания она проявляет такую же иммунохимическую активность, как и в составе исходной белковой молекулы. Помимо конформационной перестройки детоксикация может сопровождаться частичной сополимеризацией СТ с другими белковыми комплексами токсин содержащего фильтрата.

В некоторых странах Европы, в том числе и в России, резкое снижение случаев болезни началось после введение в практику здравоохранения плановой иммунизации населения против столбняка. Так по данным В.Ф. Рудниченко и соавторов снижение заболеваемости столбняком в 4,6 раза произошло в России за период с 1970 по 1980 годы [51].

Массовая иммунизация против столбняка поставила на повестку дня вопрос о чистоте прививочного препарата. Производимые в РФ СА должны соответствовать требованию ВОЗ и содержать не менее 1000 ЕС/мг белкового азота. Действующие же производственные регламенты не всегда позволяют получать С А, удовлетворяющий этим требованиям. Образцы выпускаемой в настоящее время продукции могут существенно различаться по иммуно-генным свойствам и степени очистки. При изучении их фракционного состава было показано, что они неоднородны, было также подтверждено наличие в них высокомолекулярных компонентов [61], которые по данным Ермолаева А.В. с соавторами [22, 23] и Бинима Сагу [8] могут проявлять защитную способность. В частности, этими исследователями было показано, что приготовленный из полимерной фракции, выделенной методом ступенчатой мембранной диафильтрафии, прививочный препарат не уступал по удельной протек-тивной способности обычным фармакопейным образцам.

Тема настоящей диссертационной работы "Материалы к характеристике полимерной фракции столбнячного анатоксина" является продолжением выше указанных работ. Связано это с тем, что в процессе производства СА в период с 1995 по 2000 годы отечественные производители столкнулись с рядом трудностей, одна, из которых заключалась в отсутствии на фармацевтическом рынке РФ отечественных образцов казеина, с маркой "для микробиологических целей", а гидролизат последнего, как известно, является основной составляющей при изготовлении жидких питательных сред, на которых ведется культивирование столбнячной палочки. Прежние внутри государственные связи с поставщиками из-за распада СССР оказались разрушенными, а попытки использовать казеин с маркой "технический" или "пищевой" не привели к желаемым результатам. На предприятии АО "Биомед" с февраля по сентябрь 2000 года попытались работать на казеинах молокозаводов городов Суздаль Владимирской области, Фурманов Ивановской области и Милославский Рязанской области. Свою производственную программу предприятию при этом удалось выполнить, но производство шло неритмично и у производителя скопилось весьма существенное количество материала, удельная специфическая активность которого (нагрузка ЕС на 1 мг белкового азота) не соответствовала требованиям ВОЗ. Эти серии мы попытались до-очистить методами мембранной диафильтрации и тем самым улучшить технико-экономические показатели производства. В процессе работы выяснилось, что образцы СА полученные на средах, основу которых составили гид-ролизаты казеина разных производителей, вели себя при диафильтрации по-разному из-за различного соотношения в них полимерных и олигомерных компонентов.

В связи с обнаружением этого феномена целью работы стала адаптация различных вариантов использования ступенчатой мембранной диафильтрации для доочистки серий СА, при изготовлении которых на этапе культивирования CI. tetani использовали гидролизаты казеина от различных отечественных производителей, выделить из очищенных методом диафильтрации серий хроматографически - однородные фракции СА и испытать их пригодность для создания тест-систем, обеспечивающих контроль за ходом токси-нообразования CI. tetani.

По ходу достижения этой цели последовательно решались следующие задачи:

1. Предложить варианты ступенчатой мембранной диафильтрации, обеспечивающие очистку серий СА, произведенных при использовании гидроли-затов казеина от отечественных производителей но имеющих показатели удельной специфической активности (нагрузку ЕС/мг белкового азота) не соответствующие требованиям ВОЗ (менее 1000 ЕС/мг белкового азота).

2. Исследовать фракционный состав доочищенных препаратов С А методом эксклюзивной жидкостной хроматографии.

-83. Изучить иммунохимические и антигенные свойства полимерной и олигомерной фракций СА.

4. Дать оценку в опытах на мышах иммунизирующей активности очищенных препаратов с преобладанием в одних полимерной, а в других - олигомерной фракции СА.

5. Получить латексные диагностикумы на основе олигомерной и полимерной фракций для постановки реакции пассивной латексной агглютинации (РПЛА) в производственных условиях с целью экспресс-контроля за ходом токсинообразования.

Научная новизна

Впервые при помощи диафильтрационных полых волокон и диафильт-рационных мембран очищали согласно разработанной схеме не только концентраты СА, не удовлетворяющие требованиям ВОЗ, но и получившийся после доочистки диализат (пермеат ХМ-300). В процессе ступенчатой диа-фильтрации пермеат ХМ-300 после его концентрирования и доочистки на полых волокнах марки МВ-100 приобретал специфическую активность, соответствующую требованиям ВОЗ по удельным показателям. Впервые были получены латексные диагностикумы на основе олигомерной и полимерной фракций СА с целью постановки РПЛА для контроля за токсинообразовани-ем в производственных условиях.

Практическая значимость

С помощью разработанных модификаций ступенчатой мембранной диа-фильтрации осуществлена доочистка СА, в составе которых превалировали полимерные компоненты специфического антигена и удельная активность которых не соответствовала требованиям ВОЗ. Полученные после такой диафильтрации образцы СА, имели очистку в пределах от 1000 до 1255 ЕС/мг белкового азота.

Введение этапа дополнительной очистки пермеата ХМ-300 позволило уменьшить потери специфического столбнячного антигена до 10,0-11,0% и вернуть из объема потерь свыше 20,000 МЕС СА с удельной специфической активностью от 1008 до 1587 ЕС/мг белкового азота.

Разработанный на основе высокоочищенной олигомерной фракции СА антигенный латексный диагностикум оказался весьма чувствительным индикатором для процесса контроля за ходом накопления СТ в фильтратах культуры CI. tetani.

Положения, выносимые на защиту

1. При помощи предложенных вариантов ступенчатой мембранной диа-фильтрации возможна доочистка серии СА с удельной специфической активностью, не соответствующей требованиям ВОЗ (менее 1000 ЕС/мг белкового азота).

2. В процессе ступенчатой диафильтрации пермеат ХМ-300 после его концентрирования и доочистки на полых волокнах марки MB-100 может быть освобожден от антигенно-неактивных примесей, а его удельная специфическая активность при этом достигает показателя в 1000 ЕС/мг белкового азота.

3. Полученные в результате доочистки препараты СА с преобладанием полимерной фракции проявляют высокую иммунизирующую активность в опытах на белых мышах.

4. При помощи латексных диагностикумов на основе олигомерной фракции СА возможна постановка РПЛА в производственных условиях с целью экспресс - контроля за ходом токсинообразования.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на Всероссийской научной конференции "Биомедицинские технологии" (Моеква, 2003) и на заседаниях кафедры микробиологии медицинского факультета РУДН (Москва, 1999, 2000, 2001).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 работы:

1. Карсанова И.Б., Ермолаев А.В., Далин М.В., Гусев В.К., Яшина Н.В., Якушевич Ю.Е. "Использование реакции нейтрализации антител для контроля токсинообразования Clostridium tetani.". М. "Биомедицинские технологии", 2000 г., выпуск 13, стр. 32-36.

2. Карсанова И.Б., Гусев В.К., Попаденко Р.В. "Получение препаратов столбнячного анатоксина, состав которых варьирует по соотношению в них полимерной и олигомерной фракций". М. "Биомедицинские технологии", 2001 г., выпуск 16, стр.231-235

3. Карсанова И.Б., Кравцов Э.Г., Кулак В.Г., Гусев В.К. "Материалы к характеристике полимерной фракции столбнячного анатоксина". М. "Биомедицинские технологии", 2002 г., выпуск 19, стр.86-91.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 131 источник. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 9 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Карсанова, Ирина Батырбековна

-67-Заключение

Профилактика столбнячной токсикоинфекции была и остается актуальной проблемой государственного масштаба. СА, обеспечивая высокую эффективность специфически активной иммунизации, может, применяется и как монопрепарат, и как компонент АДС и АКДС-вакцин. Постоянная потребность в профилактическом препарате не снижает требований к его качеству, которые регламентируются критериями ВФС и ВОЗ. Действующий в настоящее время регламент оговаривает величину удельной специфической активности прививочного препарата на уровне не менее 1 ООО ЕС/мг белкового азота.

В процессе производства СА в период с 1995 по 2000 год отечественные производители столкнулись с рядом трудностей, одна из которых заключалась в отсутствии на фармацевтическом рынке РФ отечественных образцов казеина с маркой "для микробиологических целей". Если раньше основным его поставщиком был завод в г. Каунас (Литва), то после развала Союза, продукция этого предприятия перестала поступать на российский рынок. Какое-то время в работе использовался казеин американской фирмы "Ледерле", поставлявшийся в Россию в качестве гуманитарной помощи. Применяя этот полупродукт для изготовления питательной среды, удавалось вести производство СА без сбоев. Получающийся СА удовлетворял требованиям ВОЗ.

После того, как гуманитарная помощь перестала поступать в РФ, американские экспортеры потребовали оплачивать поставку казеина в валюте. У отечественных производителей такой возможности не нашлось и перед предприятиями, производящими СА для российского здравоохранения, со всей остротой встал вопрос о поиске отечественного поставщика казеина. Попытки использовать казеин с маркой "технический" или "пищевой" не привели к желаемым результатам. И тогда на предприятии АО "Биомед" с февраля по сентябрь 2000 года была предпринята попытка работать на казеинах трех молокозаводов из городов Суздаль Владимирской области, Фурманов Ивановской области и Милославский Рязанской области. Производственный план за этот период предприятие выполняло, но в отделении, производящем СА, скопились серии, удельная специфическая активность которых была ниже 1 ООО ЕС/мг белкового азота.

На базе предприятия АО "Биомед" им. И.И. Мечникова в период 1994-1998 г.г. велись работы по доочистке подобного рода серий СА с помощью диафильтрации на картриджах МВ-100 и мембранах ХМ-300. Этот методический прием позволял увеличивать нагрузку специфического антигена на 1,0 мг белкового азота в таких сериях С А до 1000 ЕС и более.

Учитывая вышеизложенное, мы попытались использовать ту же методику по ранее отработанной схеме для доочистки производственных серий, скопившихся в отделении после 2000-2001 г.г. В частности, с ее помощью из 4-х не удовлетворяющих требованиям ВОЗ серии СА, при производстве которых использовался гидролизат казеина, изготовленного на Суздальском молокозаводе, только одну удалось выпустить с нагрузкой 1000 ЕС/ мг белкового азота. Точно также, из 9 не удовлетворяющих требования ВОЗ серий СА, при производстве которых использовали гидролизат казеина, произведенного на молокозаводе г. Фурманов, ранее отработанные приемы диафильтрации позволили доочистить до удельной специфической активности в 1000-1100 ЕС на 1 мг белкового азота всего 3 препарата. В тоже время, из 8 серий СА, при изготовлении которых использовался гидролизат казеина, полученного от молокозавода г. Милославский, отличавшийся от образцов других производителей низкой жирностью за счет хорошо проведенной сепарации, 6 удалось доочистить до показателей, требуемых ВОЗ. В связи с вышесказанным, АО "Биомед" перевело производство на использование казеина Милославского молокозавода и в результате получило гарантию возможности доочистки серий СА, при изготовлении которых регламентным способом не был достигнут лимит, требуемый ВОЗ по удельной специфической активности, с помощью ранее апробированных вариантов диафильтрации.

В тоже время, после сложного опытно-технологического эксперимента по подбору поставщика казеина из числа отечественных производителей для нужд отделения по изготовлению СА, на предприятии АО "Биомед" оказалось значительное количество производственных серий СА, удельная специфическая активность которых была ниже требований ВОЗ, а ранее использовавшиеся варианты ступенчатой диафильтрации не обеспечивали успеха в их доочистке. В этой связи, по предложению руководства АО "Биомед" с целью улучшения технико-экономических показателей предприятия была апробирована модификация мембранной диафильтрации, предусматривавшая использование на втором этапе батареи из 4-х ячеек Амикон ёмкостью 2,0 л, при условии, что в каждую из них будет вноситься не более 0,5-0,6 МЕС СА, а число промывок концентратов ХМ-300 будет увеличено до 6-15. В таком режиме доочистки удалось в опытах с 12-ю сериями С А получить материал, удельная специфическая активность которого составила 1000-1250 ЕС/мг белкового азота.

После столь интенсивной ступенчатой диафильтрации на производстве вновь скопилось большое количество отработанного пермеата, содержащего специфический антиген, подлежащий выбросу. Памятуя о желательности максимального улучшения технико-экономических показателей производства, мы на заключительном этапе этой части работы предприняли попытку доочистить диализаты ХМ-300 до значений, удовлетворяющих требованиям ВОЗ. Для этого диализат ХМ-300 повторно интенсивно промывали на картриджах МВ-100 и в результате удалось получить еще 23,200 МЕС СА с удельной специфической активностью в пределах 1008-1587 ЕС/мг белкового азота.

На следующем этапе работы методом эксклюзивной хроматографии исследовали фракционный состав ряда серий СА. Полученные в результате хроматографии образцы олигомерной и полимерной форм после концентрирования и дополнительной очистки на мембране РМ-30 подвергали рехро-матографии.

Сопоставление результатов рехроматоргафии с калибровочной кривой показало, что серии исследованных СА имеют в своем составе полимерные компоненты, молекулярная масса которых варьирует от 600 кД до 400 кД, а также олигомер, молекулярная масса которого была в пределах 150-180 кД. Лучше всего эти субкомпоненты были представлены в СА серии 878, в связи с чем для дальнейшего анализа в качестве базовой был выбран именно этот препарат.

Изучение сенситивных свойств рехроматографированных порций СА проводили на полистирольных макросферах с активными эпоксидными группами. На их поверхности были иммобилизованы рехроматографирован-ные полимерные и олигомерный субкомпоненты СА. В опытах по изучению специфической активности таких латексных диагностикумов было выявлено, что минимальная и оптимальная сенсибилизирующая дозы зависели от размера иммобилизуемых молекул.

При достижении оптимальной сенсибилизации частиц создается ситуация, когда реакционно-активные эпоксидные группы носителя полностью связываются сенситином, т.е. количество присоединенного белка в данном случае определяется числом эпоксидных групп на поверхности носителя.

Мы предположили, что если через одну эпоксидную группу присоединяется одна молекула сенситина, то в полимерной форме СА для AT оказывается доступным ряд эпитопов, тогда как в случае мономера - единичные их варианты. Из предлагаемой гипотетической модели следует, что антигенные детерминанты олигомера более доступны для связывания AT. Действительно, при выборе оптимальной сенсибилизирующей дозы оказалось, что для молекул с массой в пределах 150 кД она выше, чем для полимерных фракций. Отсюда следует, что такая форма анатоксина должна более активно связывать антитоксическую сыворотку. Для подтверждения этого допущения были поставлены опыты по нейтрализации стандартного количества AT различными формами СА. В результате было выявлено, что для связывания стандартного количества AT необходимо существенно меньше белка олигомерной формы СА, чем полимерной. Все изложенное приводит к заключению об экранированности эпитопов полимера. Для проверки этого допущения была проведена сорбция антитоксической сыворотки микросферами с иммобилизованным на них полимером массой 600 кД. После постановки РТПЛА в параллельной раститровке с сорбированной и несорбированной сыворотками, а также в РДД было установлено, что в процессе получения С А образуются гетерогенные по молекулярной массе его варианты. Конфор-мационные их изменения ассоциируются с изменением плотности специфических эпитопов, расположенных на поверхности молекул. Не исключено, что именно этот феномен и послужил причиной отсутствия стандартности антигенных противостолбнячных диагностикумов в биотехнологической практике, в связи с чем, на заключительном этапе мы попытались использовать диагностикумы на основе олигомерных форм СА для оценки токсино-продукции CI. tetani. В РТПЛА были изучены образцы нативных ТС-содержащих культуральных фильтратов CI. tetani. с различной активностью, которую определяли на мышах путем титрования по Бехеру с соавторами (1925) и выражали в единицах Lt. Исследовали образцы СТ с активностью от 10 до 20 Lt. РТПЛА разрешали диагностикумами на основе полимеров 600 кД, 400 кД и олигомера 150 кД. В случае разрешения реакции диагностику-мом на основе полимерной фракции СА, зависимость величины торможения от токсической активности отсутствовала, тогда как в случае диагностикума на основе олигомерной фракции эта связь была выражена.

Таким образом, приведенные данные позволяют заключить, что РТПЛА в общем виде при оценке продукции СТ можно отнести к тому же порядку, что и реакцию флокуляции, а применение диагностикумов на основе олигомерной формы СА в большей степени приближает РТПЛА к тесту нейтрализации СТ.