Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Серологическая индикация и дифференциация ботулинических токсинов-анатоксинов типов А,В и Е

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Серологическая индикация и дифференциация ботулинических токсинов-анатоксинов типов А,В и Е"

^^ На правах рукописи

ПЕТРОВСКИХ ВАЛЕНТИНА ПЕТРОВНА

¿О?

СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ИНДИКАЦИЯ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ БОТУЛИНИЧЕСКИХ ТОКСИНОВ-АНАТОКСИНОВ ТИПОВ А, В и Е

03.00.07. - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 1998

Работа выполнена в Пермском научно-исследовательском институте вакцин и сывороток НПО «Биомед»

Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ, доктор

медицинских наук, профессор Райхер Л.И.

доктор медицинских наук, академик РЭА и МАНЭБ Петров В.Ф. Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, академик

МАНЭБ Пшеничнов P.A. Кандидат биологических наук, доцент Карпунина Т.И.

Ведущее учреждение - Институт микробиологии МО РФ, г. Киров

Защита состоится "^ЬГ" 1998 года в /¿^часов на заседании

диссертационного ученого совета К 200.46.01 Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614 081, г. Пермь, ул. Голева, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и Генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан "-/¿Г" Щь/и^-гл.-^--1998 года

Ученый секретарь диссертационного

совета д.б.н., с.н.с. —^ ■— И.Б. Ившина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Экспрессная индикация антигенов возбудителя эотулизма необходима в условиях производства профилактических препаратов, ^де специфическая детекция проводится постоянно и связана с большими трудовыми и материальными затратами, а также в системе санэпиднадзора для жстренной диагностики этиологии тяжелых пищевых интоксикаций, их :воевременной терапии и организации эффективного контроля за 1роизводством и хранением определенных групп пищевых продуктов, что особенно актуально в настоящее время в связи с проводимой приватизацией )бъектов общественного питания и торговли, расширением изготовления и )еализации различных пищевых продуктов (в том числе консервированных и в ¡акуумной упаковке) мелкими производителями и частными лицами. По щнным литературы (А.А.Иванов, Н.Н.Трушкина,1996; И.С.Каздобина с соавт., 995) в России с 1992 года наблюдается рост заболеваемости ботулизмом при ;мертности 8,2% (в 1992 году) - 10,5% (в первое полугодие 1996 года).

Классическим методом индикации ботулинических антигенов является ¡иопроба и ее варианты (реакция нейтрализации токсина на мышах). Этот метод юка не имеет альтернативы. Несмотря на высокую чувствительность, есть ряд юментов, которые сильно снижают его диагностическую ценность — это [еобходимость использования для постановки реакции большого количества бсолютно здоровых животных определенной массы и возраста, а также тдаленность учета результатов реакции (до 4 суток). К тому же постановка [етода может проводиться лишь в хорошо оснащенных лабораториях при аличии соответствующих специалистов. В последнее время для лабораторной иагностики ботулизма применение биологической пробы стало зтруднительным в связи с дефицитностью и высокой стоимостью абораторных животных. В условиях производства бактерийных препаратов аиболее ярко проявляются такие негативные качества этого метода, как рудоемкость и регроспективность, что делает невозможным применение его

на отдельных стадиях производства, требующих немедленного получения результата (например, на стадии ультрафильтрации).

Кроме того, сейчас по чисто этическим соображениям ставится задача максимального исключения животных из контроля бактерийных препаратов и высказываются сомнения в корректности распространения результатов тестов на животных непосредственно на человека (С.Непс1пксеп, 1995).

Учитывая чувствительность серологических методов индикации микробных антигенов, можно полагать, что они могут с успехом заменить существующий метод. Очевидно, что эти методы должны в полной мере отвечать высоким требованиям современного серологического анализа по уровню чувствительности и специфичности, а также должны быть оперативными, экспрессными, экономичными и легко воспроизводимыми.

В этом отношении реакция коагглютинации (РКОА) и иммуноферментный анализ (ИФА) являются наиболее перспективными, так как отвечают всем вышеперечисленным требованиям.

Диагностические реагенты для РКОА представляют собой взвесь инактивированных стафилококковых клеток, на которых за счет белка А иммобилизованы иммуноглобулины (антитела) класса в и обозначаются как специфически направленные стафилококковые реагенты (СНСР). Благодаря экспрессности, экономичности и простоте воспроизведения РКОА предлагается для идентификации большой группы микроорганизмов и их растворимых антигенов (В.Г.Асеева, 1993; О.Ф.Белая, 1997; И.К.Мазурова,1993; В.Р.МтзЬечу, 1985). Однако данных по использованию этого метода для индикации токсинов ботулизма мы не обнаружили.

Одним из наиболее активно развивающихся направлений иммунохимических методов является иммуноферментный анализ (ИФА). Это обусловлено такими его достоинствами, как высокая специфичное! и чувствительность, удобство и скорость выполнения, безопасность и хорошая воспроизводимость. ИФА хорошо зарекомендовал себя в разнообразных

аналитических определениях и, в частности, для определения антигенов в биологических субстратах (Л.М.Егоров, 1987; В.И.Покровский с соавт., 1983; ЕЛ.ЯеПсег е1 а!., 1996). Можно полагать, что ИФА может стать альтернативным методом для распознавания ботулизма и выявления источников инфекции.

В Пермском НИИВС уже имелся большой опыт по разработке серологических микротестов и конструированию иммуноферментных тест-систем для определения бактериальных растворимых антигенов (Л.Ю.Смурова, 1988; В.Н.Сперанская, 1987). Эти исследования продолжены применительно к ботулиническим токсинам-анатоксинам типов А, В и Е.

Работа базируется также на опыте исследований, проводившихся в институте в области иммунохимии антител, являющихся основными специфическими составляющими стафилококковых диагностикумов и иммуноферментных тест-систем (Л.И.Райхер, И.И.Райхер, 1995), и выполнялась в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пермского НПО «Биомед» (№ гос. регистрации 01.90.0014562).

Цель работы: Изучить возможность серологической индикации и дифференциации ботулинических токсинов-анатокинов типов А, В и Е в реакции коагглютинации и иммуноферментном анализе.

Основные задачи исследования:

1. Получить противоботулинические антительные препараты типов А, В и Е на основе аффинноочищенных антител и их Р(ав);-фрагментов для конструирования противоботулинических специфически направленных стафилококковых реагентов (СНСР) и иммуноферментных тест-систем (ИФТС).

2. Разработать стабильные противоботулинические СНСР типов А, В и Е.

3. Оценить в экспериментах чувствительность и специфичность РКОА для определения ботулинических токсинов-анатоксинов типов А, В и Е в условиях производства бакпрепаратов.

4. Разработать иммуноферментные тест-системы для экспрессного определения видо- и типоспецифичности ботулинических токсинов-анатоксинов

типов А, В и Е.

5. Исследовать в модельных экспериментах и клинико-эпидемиологических наблюдениях возможность выявления бытового ботулизма с помощью разработанных иммуноферментных тест-систем.

Научная новизна и практическая ценность.

1.Впервые разработаны высокочувствительные специфически направленные стафилококковые реагенты для детекции ботулинических токсинов-анатоксинов типов А, В и Е в РКОА, в которых для сенсибилизации клеток стафилококка использованы кроличьи аффинноочищенные специфические антитела.

2. Впервые разработаны модифицированные противоботулинические СНСР с использованием специфических лошадиных антител, генуинно не обладающих аффинитетом к белку А золотистого стафилококка. Получены стабильные лиофилизированные препараты.

3. Впервые получены стабильные цветные СНСР для детекции ботулинических токсинов-анатоксинов типов А, В и Е.

4. Установлена перспективность использования РКОА с противоботулиническими СНСР в условиях производства токсинов-анатоксинов.

5. Получены разновидовые противоботулинические антительные препараты для конструирования иммуноферментных тест-систем.

6. Впервые получены антительные препараты, дифференцирующие типы токсинов А и В. Разработана методика комбинированной аффинной очистки иммунных противоботулинических сывороток, включающая перекрестную очистку антител на гетерологическом антигенном иммуносорбенте.

7. Все антительные препараты для иммуноферментных тест-систем разработаны в виде Р(ав)2 — фрагментов аффинноочищенных антител, что позволяет устранить неспецифические реакции, обусловленные

-х-рецеицией, характерной для ннтактных иммуноглобулинов.

8. Получены и оценены в модельных опытах оригинальные высокочувствительные иммуноферментные тест-системы для детекции зотулинических токсинов типов А, В и Е.

9. Впервые с помощью тест-систем проведена индикация эотулинических токсинов в крови, моче, патологоанатомическом материале, в эстатках пищи и исходных продуктах, рвотных массах, промывных водах, а также в посевах этих материалов на питательных средах после подращивания.

10. Иммуноферментные тест-системы для индикации ботулинических токсинов типов А, В и Е используются Пермским областным центром Госсанэпиднадзора с 1991 года для диагностики ботулизма в г. Перми и Пермской области.

11. На основании проведенных исследований разработана технология производства иммуноферментных тест-систем для определения антигенов ботулинических токсинов типов А, В и Е. Оформлена нормативно-техническая документация: экспериментально-производственный регламент, проект временной фармакопейной статьи и инструкция по применению тест-систем, утвержденная НТС НПО «Биомед» и направленная на рассмотрение и утверждение в ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на итоговых научных конференциях Пермского НИИВС (1990, 1991,

к

1994), научной конференции, посвященной 85-летию Томского НИИВС «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии» (Томск, 1991).

Диссертационная работа прошла экспертизу и апробирована на расширенном заседании Научно-технического совета Пермского НПО «Биомед» (25 февраля 1998 года).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Серологическая индикация ботулинических токсинов-анатоксинов типов А, В и Е в реакции коагглютинации и иммуноферментном анализе.

2. Принципы, получения стабильных противоботулинических СНСР различных модификаций. РКОА с СНСР - информативный, экспрессный и экономичный тест оперативной оценки ботулинических антигенов в производственных условиях.

3. Технология изготовления иммуноферментных тест-систем с использованием антительных препаратов, дифференцирующих ботулинические токсины типов А, В и Е. Индикация ботулинических токсинов типов А, В и Е в иммуноферментном анализе для клинико-эпидемиологического выявления бытового ботулизма.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, описания материалов и методов, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и приложения. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, включая 16 рисунков и 27 таблиц. Указатель цитируемой литературы содержит 170 источников, из них 80 отечественных и 90 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе использованы следующие бактерийные препараты, сыворотки, штаммы микроорганизмов и питательные среды.

Анатоксины и токсины: ботулинические анатоксины и токсины (типов А, В и Е) (производства Уфимского НПО «Иммунопрепарат»); столбнячный, стафилококковый, гангренозные (перфрингенс, эдематиенс, вибрио септикум) анатоксины (производства Пермского НПО «Биомед»).

Сыворотки: Сыворотки очищенные противоботулинические лошадиные типов А, В и Е коммерческие (производства Уфимского НПО «Иммунопрепарат»), сыворотки нативные противоботулинические лошадиные типов А, В и Е

(полуфабрикат производства Уфимского НПО «Иммунопрепарат»); экспериментальные гипериммунные противоботулинические сыворотки кроликов; сыворотки крови больных с подозрением на ботулизм (получены из бактериологической лаборатории ОЦГСЭН), сыворотки крови здоровых доноров (из донорского отделения НПО «Биомед»), диагностические сыворотки против белков крови и иммуноглобулинов лошади, кролика, человека (производства ИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи; С-Петербургского НИИВС, Нижегородского НИИЭМ).

Штаммы микроорганизмов: В работе использованы штаммы S. aureus Cowan 1 и Wood 46; штаммы CI. sporogenes № 272 (из ГИСК им. Л.А.Тарасевича); штаммы патогенных и условно патогенных энтеробактерий (из коллекции бактериологической лаборатории Пермского ОЦГСЭН).

Питательные среды: Для культивирования CI. sporogenes и подращивания исследуемого материала использовали среды Китта-Тароцци (производства НПО "Биомед"); штаммы энтеробактерий культивировали на мясо-пептонном бульоне (из бактериологической лаборатории Пермского ОЦГСЭН).

Методы:

Методы оценки и фракционирования сывороток.

Содержание белка в сыворотках и выделенных антительных препаратах определяли спектрофотометрическим методом.

Антительные препараты выделяли с помощью иммуносорбции с использованием специфических иммуносорбентов на основе цианбромированной сефарозы 4В («Pharmacia», Швеция), согласно инструкции фирмы-изготовителя.

Специфическую активность противоботулинических сывороток и антительных препаратов определяли в реакции флокуляции и в РНГА в микроварианте по общепринятой методике с антигенными эритроцитарными диагностикумами (P.E. Коникова с соавт., 1981), приготовленными в лабораторных условиях.

Иммуноэлектрофорез в агаровых или агарозных пластинах проводили по П.Г.Грабарю (1957).

Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААП - по методическим рекомендациям фирмы «Reanal» (Венгрия).

Гельхроматографию вели на сефадексе С-200 («Pharmacia», Швеция) на установке для жидкостной хроматографии фирмы «LKB» (Швеция) с использбванием автоматического коллектора фракций Multirak и УФ-детектора Uvicord S 2.

Концентрацию белковых растворов в малых объемах проводили в диализных трубках « Visking» («Meide» , ФРГ); в относительно больших объемах — на установке фирмы «Amicon» (Голландия) с использованием фильтрующих мембран.

Получение специфически направленных стафилококковых реагентов и техника выполнения реакции коагглютинации. При получении СНСР оптимальные концентрации антител подбирали опытным путем по белку в мг на 1 мл 10 %-ной суспензии стафилококка. Стафилококковые реагенты использовали в виде 1 %-ной суспензии. РКОА выполняли на стекле (или в чашках Петри) в каплях объемом по 10 мкл.

Подробное описание методики приготовления реагентов, постановки и учета результатов РКОА приведено в экспериментальной части диссертации.

Приготовление конъюгатов с пероксидазой хрена производили периодатным методом по P.K.Nakane, A.Kawaoi (1974).

Постановку иммуноферментной реакции проводили в соответствии с А.Voller, D.Bidvell (1975).

Лабораторные животные. Экспериментальные исследования проведены на кроликах породы шиншилла массой 2,5-3,0 кг, беспородных белух мышах массой 16-18 г.

Статистические методы. Статистическая обработка результатов исследований проведена методами вариационной статистики по И.П.Ашмарину, А.Воробьеву (1962) и В.С.Асатиани (1965).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что специфичность и чувствительность серологических методов исследования в большой степени зависит от качества иммунологических эеагентов. Такими основными реагентами должны были быть антительные трепараты, поэтому их получению было уделено особое внимание. Во-первых, в :воих исследованиях мы пошли по пути максимальной очистки антительных гампонентов реагентов, так как именно этот путь, по нашему мнению и дан-ным штературы (А.М Егоров с соавт.,1991; .Г.0.81еЬ(1з, М.\У.Тшпег, 1986), ве-дет к юстижению наиболее высокой чувствительности анализов. Во-вторых, мы толагали, что для детекции токсинов должны быть использованы толиклональные антитела, реагирующие с наибольшим количеством их :пецифичес-ких детерминант.

Для реализации цели исследований предполагалось наличие кро-личьих I лошадиных специфических антительных препаратов. Следовательно, в :ачестве сырья должны были быть использованы лошадиные и кроличьи ги-1ериммунные сыворотки. Если лошадиные антитоксические сыворотки были тиболее доступны (производства Уфимского НПО «Иммунопрепарат»), то для юлучения кроличьих сывороток был проведен специальный цикл исследований. В результате иммунизации кроликов очищенными ботулиническими натоксинами были получены высокоактивные специфические сыворотки.

Для получения антительных противоботулинических препаратов из [ммунных кроличьих и лошадиных сывороток использовали метод аффинной »чистки с помощью специфических иммуносорбентов. Было показано, что та-:ая очистка антител и их Р(ав)2-фрагментов значительно повышает удельную ктивность. Так нативные аффинноочищенные противоботулинические анти-

тела в 5-8 раз, а Р(ав)2-фрагменты в 16-35 раз активнее исходной нативной сыворотки. Эти препараты были использованы при конструировании стафилококковых реагентов для РКОА и иммуноферментных тест-систем (ИФТС) для ИФА.

При приготовлении обычных СНСР прежде всего необходимо было отработать условия сенсибилизации клеток стафилококка кроличьими аффин-ноочищенными нативными антителами. В ряде экспериментов было установлено, что сенсибилизирующей дозой является колйчество антител, равное 0,4-1,0 мг на 1 мл 10%-ной стафилококковой суспензии. Полученные реагенты обладали довольно высокой чувствительностью: противоботулинические СНСР типа А и В выявляли 0,03-0,06 ЕС/мл, типа Е - 0,03-0,12 ЕС/мл гомологичных по типу ботулинических анатоксинов или Ь+ нативных токсинов.

В научном плане нам представлялось интересным исследовать возможность повышения чувствительности диагностикумов за счет увеличения числа специфических активных центров связывания и укрупнения реагирующих агрегатов. С этой целью ввели дополнительное звено в конструкцию реагента - спейсер, за счет которого .увеличивается реакционноспособная «площадь» поверхности бактериальной клетки. В качестве спейсера был использован иммуноглобулин в кролика, т.к. именно кроличий обладает высоким аффинитетом к белку А стафилококка. Этот иммуноглобулин направлен против белков сыворотки лошади, поэтому мы могли использовать в качестве специфических - лошадиные нативные антитела или их Р(ав)2-фрагменты, не обладающие аффинитетом к белку А стафилококка. Была отработана методика приготовления таких «модифицированных» СНСР, состоящая из двух стадий. Полученные реагенты обладали приблизительно такой же чувствительностью, как и обычные стафилококковые реагенты. Таким образом, повышения чувствительности реакции не удалось добиться. Но главный результат заключается в том, что впервые удалось приготовить СНСР с использованием специфических (лошадиных антител), генуинно не обладающих аффинитетом к белку А

стафилококка.

Для большей визуализации РКОА и учитывая, что мы имеем дело с реагентами трех разных типов (А, В и Е), которые внешне выглядят одинаково, впервые были приготовлены цветные СНСР различной окраски для каждого типа.

Установлена высокая специфичность СНСР, то есть отсутствие реакции с гетерологичными по виду анатоксинами - стафилококковым, столбнячным, дифтерийным, гангренозными (перфрингенс, эдематиенс, вибрио септикум).

Получены стабильные лиофилизированные препараты всех модификаций для детекции ботулических токсинов-анатоксинов типов А, В и Е в РКОА.

Изучение возможности использования разработанных СНСР было проведено на базе цеха анатоксинов Уфимского НПО «Иммунопрепарат». Исследовали возможность применения РКОА, как экспрессивного метода для оперативного слежения за целевыми продуктом в биотехнологическом процессе. Была показана возможность динамического слежения за токсинообразованием при стационарном (рис. 1) и реакторном (рис. 2) культивировании Cl. botulinum. Данные РКОА хорошо согласуются с результатами биопробы. Причем, следует подчеркнуть, что результат, полученный in vivo, «запаздывал» на 4 суток, в то время как с помощью предложенных реагентов ответ можно было получить в течение 5 минут. РКОА может быть использована и для предварительной оценки очищенных анатоксинов, т.е. на заключительном этапе их производства. При оценке специфической активности анатоксинов использовали «тормозной» вариант реакции, при котором в реакционную среду вводили определенную дозу (в МЕ) стандартной противоботулинической сыворотки соответствующего типа. Результаты определения специфической активности анатоксинов в РКОА и реакции нейтрализации на мышах совпадали (рис. 3). Коэффициент корреляции составил 0,97.

Таким образом, оценка РКОА с противоботулиническими СНСР показала принципиальную возможность ее использования в условиях производства бо-тулинических токсинов-анатоксинов. В этом случае нет необходимости в очень

Рис. 1 Сравнительная оценка девятисуточных. культур Ci. botulinum типа Е в РКОЛ и биопробе на мышах.

Рис.2. Динамика токсинообразования Cl. botulinum типа В в промышленном реакторе.

Тип Л.

Ги гр I ООО

123456789 10 Серия .

□ Титр в РКОА О Титр в реакции нейтрализации

Рис. 3. Определение специфической активности ботулинических анаток-нов типов А, В, Е в РКОА и в реакции нейтрализации на мышах.

высокой видо- и типоспецифичности метода детекции, поэтому данному вопросу не уделяли большого внимания в вышеприведенном разделе работы.

Однако нас интересовали вопросы не только «промышленной» индикации ботулинических токсинов, но и в особой мере - возможности диагност-ки бытового ботулизма, как главной задачи медико-профилактического плана.

В этой связи была проведена серия исследований по возможности определения при помощи РКОА с противоботулиническими СНСР типов А, В и Е ботулинических токсинов в пищевых продуктах. Но тут мы встретились с рядом существенных трудностей. Прежде всего - это наличие неспецифической агглютинации при исследовании ряда продуктов. Именно этот факт накладывает ограничение на использование РКОА для диагностики ботулизма.

Итак, для распознавания бытового ботулизма необходимо применение другого метода анализа. Мы полагали, что ИФА может стать альтернативным способом определения ботулизма и контроля за источниками инфекции. Был выбран твердофазный «сэндвич»-вариант, в котором антительные препараты используются в качестве «подложки» и в составе специфического коньюгата.

В проведенных исследованиях отработаны оригинальные компоненты ИФТС для выявления токсинов возбудителя ботулизма типов А, В и Е.

Получены разновидовые аффинноочищенные антительные препараты для сенсибилизации планшетов (кроличьи) и для синтеза коньюгатов (лошадиные). Это позволило исключить неспецифические реакции за счет протеина А стафилококка и подобных ему метаболитов, которые могут присутствовать в обсемененном исследуемом продукте или материале, взятом от больного.

Все антительные препараты для тест-систем разработаны в виде Р(ав)2-фрагментов антител. Это позволяет устранить неспецифические реакции, обусловленные Рс-рецепцией , характерной для интактных иммуноглобулинов. Показано, что наибольшая чувствительность метода может быть достигнута именно при использовании аффинноочищенных специфических Р(ав)2-фрагментов антител. Причем следует отметить, что наиболее заметное

на чувствительность тест-систем оказывает степень очистки антительных препаратов для сорбции на планшетах.

При получении препаратов подложки из экспериментальных кроличьих сывороток был использован вариант щадящего ферментолиза с использованием пепсина. Антительные препараты, используемые для синтеза специфических противоботулинических коньюгатов, получали из коммерческих лечебных лошадиных сывороток.

Чувствительность ИФТС для индикации ботулинических токсинов типов А, В и Е при использовании в качестве хромогена 5-аминосалициловой кислоты оказалась близкой по значениям для всех трех типов и составила 0,0010,012 ЕС/мл для типа Е, 0,003-0,025 ЕС/мл для типа А и 0,005-0,015 ЕС/мл для типа В при использовании в качестве референс-препаратов очищенных анатоксинов. Во всех экспериментах были использованы именно анатоксины, так как они являются антигенными аналогами токсинов, а работа с ними безопасна.

Следующая группа опытов посвящена оценке специфичности ИФТС. В данном случае перед нами стояло две задачи: во-первых, важно было добиться межвидовой специфичности каждой из тест-систем; во-вторых, добиться межтиповой специфичности, т.к. при диагностике ботулизма очень важно не только определить наличие токсина, но и точно установить его тип. Если с первой задачей проблем не возникло, так как аффинная очистка и ферментолиз уже обеспечили удовлетворительную межвидовую специфичность, то решение второй задачи оказалось особо трудным. Типоспеиифичность ИФТС с использованием вышеуказанных компонентов не была удовлетворительной - отмечались значительные перекрестные реакции между типами А и В. Так как такие перекрестные взаимодействия присутствовали на уровне аффинноочищенных Р(ав)2-фрагментов, было принято решение подвергнуть их дополнительной очистке, которая заключалась в истощающей сорбции уже аффинноочищенных Р(ав)2-фрагментов антител гетерологичными по типу антигена иммуносорбентами. Такое истощение препарата подложки не оказало ' существенного влияния

на межтиповую специфичность ИФТС. Но перекрестная очистка антительных компонентов коньюгатов позволила добиться удовлетворительной внутривидовой специфичности тест-систем типов А и В. В каждой из них определялся только анатоксин гомологичного типа. Таким образом, можно утверждать, что на специфичность ИФА оказывает большое влияние степень очистки антительных составляющих коньюгатов.

Были отработаны основные стадии технологического процесса изготовления ИФТС, определена комплектация полных диагностических наборов, включая препараты для «положительного» и «отрицательного» контролен.

Далее разработанные ИФТС для определения ботулинических токсинов были подвергнуты всесторонним испытаниям. Часть таких исследований бйла проведена в Кировском НИИ микробиологии МО РФ. При этом оценивалась возможность внутривидовых перекрестных реакций с токсинами и анатоксинами Cl. botulinum типов А, В, Е и С и межвидовых реакций с токсинами Cl. perfringens, Cl. septicum, Cl. histolyticum, Cl. oedematiens, Cl. tetani; а также антигенным токсическим комплексом Е. coli 803. Показано, что разработанные тест-системы обладают высокой специфичностью - перекрестных реакций не отмечено ни в одном случае. Чувствительность метода по нативным токсинам составила 200-250 LD50.

Так как пищевые отравления могут вызываться различными видами энтеробактерий, были проведены специальные эксперименты в этом направлении. В ИФА исследовали культуры патогенных и условно патогенных штаммов энтеробактерий. Перекрестных реакций не было отмечено.

Специально был рассмотрен вопрос о возможном влиянии белка А золотистого стафилококка на результаты серодиагностики ботулизма в ИФА, так как известно, что обсеменение продуктов питания стафилококком встречается значительно чаще, чем возбудителем ботулизма. Показано отсутствие подобных ложноположительных реакций.

Также было проведено изучение возможности перекрестных реакций с С1. Броп^епез, имеющим антигенное сходство с возбудителем ботулизма. В ИФА с использованием предложенных ИФТС были получены отрицательные результаты. В то же время была показана возможность неспецифических реакций с С!. Брогс^епеэ с нативными противоботулиническими сыворотками (как кроличьими, так и лошадиными). Полученные данные еще раз подтвердили эффективность включения в ИФТС аффинноочищенных Р(ав)2 -фрагментов антител.

Далее предстояло оценить Информативность и диагностическую ценность разработанных тест-систем при исследовании натур-—'ного материала. В качестве такого материала при расследованиях случаев заболевания ботулизмом очень часто оказываются продукты питания. Поэтому была проведена серия модельных опытов по испытанию тест-систем с «интактными» и искусственно «обсемененными» продуктами. Данные этих экспериментов показали пригодность предлагаемого метода для непосредственного исследования пищевых продуктов.

Оценку эффективности практического использования иммунофер-ментного анализа для диагностики ботулизма проводили совместно с Пермским ОЦГСЭН. Было исследовано наличие ботулинического токсина более 410 проб натурного материала из 25 очагов с подозрениемна заболевание (табл. 1). Параллельно с ИФА ставилась биопроба на мышах и проводился бактериологический анализ (важно подчеркнуть, что на постановку иммуноферментного метода требуется 3 часа, а биопроба занимает 4 суток). Ботулинический токсин был обнаружен в 7 очагах: в одном случае типа А, в пяти случаях типа В и одном случае типа Е. Причем, в четырех случаях токсин найден в продуктах питания, а в трех - в крови больных (в одном из них непосредственно в сыворотке). В четырех случаях токсин был обнаружен в исходном материале и в трех —в посевах. Следует отметить эффективность сочетания исследования исходного материала и посевов. При обогащении проб посевом на элективные

Таблида I

Оценка эффективности практического использования ИФЛ для детекции ботулпнических токсинов

Результаты определения

№ ИФЛ : ;

Очага Нс\. :: - Крозь ;: Исх. По- Крот. По- Заключенно |

проба сс11 се б проба сев сев 1

1 - + - - + + - - Бот. токс. Н

1 - + - _ . + - - 1эот. токе. В

4 - - - - - - - -

5 - - - - - - - -

6 - - - - - - - -

7 - - + + - - + + Бот. токе. В

8 - - - - - - - -

9 - - - - - - - -

10 - - - - - - - -

11 - - - - - - - -

12 - - - + - - - + Бот. токе. В

13 - - - - - - - -

14 - - - - - - - -

15 - - - - - - - -

16 - + - - - + - - Бот. токе. В

17 - - - - - - - -

18 + + - - + - - Бот. токе. В

19 - - - - - - - -

20 - - - - - - - -

21 - - - - - - - -

22 - - - + - - - + Бот. токе. А

23 - - - - - - - -

24 - - - - - - - -

25 — — - — -

среды токсин может быть обнаружен уже через сутки, что особенно важно для быстрой диагностики заболевания.

Расхождений положительных и отрицательных результатов биопробы и ИФА не было. Результаты по определению типа токсина также полностью совпадали.

Таким образом, решены вопросы серологического определения видо- и типоспецифичности ботулинических токсинов-анатоксинов типов А, В и Е в РКОА и ИФА, имеющего важное значение для здравоохранения.

Определены пути практического использования предлагаемых методов, благодаря чему может быть существенно повышена результативность специфической индикации антигенов ботулизма.

Разработана технология изготовления ИФТС для детекции ботулинических токсинов типов А, В и Е, которые вполне могут восполнить острый дефицит в средствах распознавания ботулизма и контроля за источниками инфекции.

ВЫВОДЫ

1. Получены аффинноочищенные антительные препараты из кроличьих и лошадиных противоботулинических сывороток типов А, В и Е на основе нативных и Р(ав)2-фрагментов специфических антител, исключающих неспецифические реакции за счет Рс-рецепции и использованы при конструировании диагностииеских тестов для серологической индикации и дифференциации ботулинических токсинов-анатоксинов типов А, В и Е.

2. Разработаны и получены стабильные препараты специфически направленных стафилококковых реагентов (СНСР) различных модификаций зля реакции коагглгатинации (РКОА) с использованием специфических 1ффинноочищенных кроличьих, а также лошадиных антител, генуинно не збладающих аффинитетом к белку А золотистого стафилококка; получены цветные стабильные СНСР для детекции ботулинических токсинов-анатоксинов типов А, В и Е.

3. В экспериментальных и производственных условиях изучена и подтверждена высокая информативность, экспрессность и экономичность РКОА с СНСР для оперативной оценки специфической активности ботулинических токсинов-анатоксинов типов А, В и Е на различных стадиях технологического процесса приготовления ботулинического трианатоксина.

4. Разработана технология изготовления иммуноферментных тест-систем (ИФТС) на основе аффинноочищенных Р(ав)2-фрагментов специфических антител, дифференцирующих типы токсинов А, В и Е. Разработана и оформлена нормативно-техническая документация на ИФТС для индикации ботулинических токсинов типов А, В и Е, утвержденная научно-техническим советом НПО «Биомед».

5. На большом экспериментальном и натурном материале показана диагностическая ценность иммуноферментного анализа с разработанными ИФТС для определения ботулинических токсинов типов А, В и Е. С 1992 года ИФА с разработанными тест-системами является основным методом лабораторной диагностики ботулизма в г. Перми и Пермской области.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 .К разработке стафилококковых реагентов различной специфической направленности./в соавт. с В.Н.Сперанской, З.Ц.Айнбиндер, Р.Н.Жикиной// Тезисы докладов научной конференции ПНИИВС, Пермь, 1988.-С.104.

2. Модификация способа аффинной очистки ботулинического анатоксина типа В, использованного для получения иммунных спленоцитов мыши, /в соавт. с В.Н.Абызовым // Тезисы докладов научной конференции ПНИИВС, Пермь, 1990. - С.26.

3. Изучение особенностей взаимодействия иммуноглобулинов Т лошади (антитоксинов) с протеином А стафилококка, /в соавт. с С.И.Челпановой, В.Н.Сперанской // Тезисы докладов научно-практической конференции молодых ученых, Пермь, 1990. - С.12-13.

4. Усовершенствованные методы иммуноспецифической детекции актериальных токсинов и антитоксических антител./в соавт. с Л.И.Райхером. [.И.Райхером, Е.Х.Хазиной и др.//Сб.статей: «Состояние, проблемы и ерспективы развития диагностики бактериальных инфекций». Материалы абочего совещания. Оболенск, 1990. - С.25.

5. Детекция ботулинических токсинов-анатоксинов в реакции оагглютинации и реакции бактериосорбции иммунных комплексов./в соавт. с .Х.Хазиной, В.Н.Сперанской // Экспериментальная и прикладная ммунология: Тезисы докладов научной конференции. Пермь, 1991.-С.30.

6. Специфически направленные стафилококковые реагенты -э!Сокочувствительные диагностикумы для реакции коагглютинации./в соавт. с .И.Райхером, Е.Х.Хазиной, В.Н.Сперанской и др.//Материалы научной энференции, посвященной 85-летию Томского НИИВС «Актуальные вопросы едицинской биотехнологии». Томск, 1991 .-Т. 1.-С. 145-146.

7. Аффинноочищенные и фрагментированные антитела как основа >временных высококачественных диагностических препаратов и тест-систем./в >авт. с Л.И.Райхером, И.И.Райхером, Е.Х.Хазиной и др.// Тезисы докладов 4 сероссийского съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов. .Новгород, 1991 .-Т.2.-С.229-230.

8. Реакция бактериосорбции иммунных комплексов, перспективы жменения в иммуноанализе. /в соавт. с Л.И.Райхером, Е.Х.Хазиной, Н.Сперанской и др. // Тезисы ВНИИ прикладной иммунологии. Москва, 1991.

9. К разработке иммуноферментной тест-системы для определения ггулинических токсинов: Сообщение 1. Серологическая дифференциация пгулинических токсинов типов А и В. /в соавт. с Л.И.Райхером, Н.Сперанской // Материалы докладов научно-практической конференции ьктуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии". Пермь, 94,- С.55-57.

10. К разработке иммуноферментной тест-ситемы для определения ботулинических токсинов: Сообщение 2. Исключение неспецифической реакции с белком А стафилококка, /в соавт. с Л.И.Райхером, В.Н.Сперанской// Материалы докладов научно-практической конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии". Пермь, 1994. - С. 5859.

11. Серологический мониторинг в производстве бактерийных препаратов, /в соавт. с Л.И.Райхером, Л.Ю.Пагнуевой, Т.А.Клюевой и др. // Материалы конференции, посвященной 95-летию Томского НИИВС. Томск, 1996.

12. Серологическая индикация ботулинических токсинов-анатоксинов. /в соавт. с Л.И.Райхером, Л.Ю.Пагнуевой, В.Н.Сперанской и др. // Международная конференция, посвященная 200-летию открытия Дженнера. Екатеринбург, 1996. - С. 48.

13. Экспериментальные и эпидемиологические наблюдения по серологической диагностике ботулизма. /Л.И.Райхер, В.Н.Сперанская, Т.К.Шилоносова // Материалы научно-практической конференции, посвященной 55-летию кафедры эпидемиологии ПГМА. Пермь, 1996. - С. 6568.

ООО "Техника к Качество", шр МЮ эк